CN1896738A

CN1896738A - 表面生物功能化的荧光纳米粒子及其制法和应用

Info

Publication number: CN1896738A
Application number: CN 200610025985
Authority: CN
Inventors: 沈鹤柏; 周丽佳; 陈伟; 朱龙章
Original assignee: Shanghai Normal University
Current assignee: Shanghai Normal University
Priority date: 2006-04-24
Filing date: 2006-04-24
Publication date: 2007-01-17

Abstract

本发明涉及一种表面生物功能化的核壳型荧光纳米粒子及其制备方法和应用。该粒子具备核壳型结构，内核层中包裹荧光物质；外壳层由荧光通透物质构成；并且在外壳层表面修饰有机官能团。通过反相微乳液法合该纳米粒子，继而在其表面进行化学修饰使其成为生物功能化纳米粒子。该纳米粒子在细胞生物学、超微化学、生物大分子检测和医学体内诊断等领域具有重要应用前景。

Description

表面生物功能化的荧光纳米粒子及其制法和应用

背景技术

近年来，生物检测技术迅猛发展，其中超敏感荧光检测技术的发展为在复杂环境中进行生物分子的研究提供了条件。而超敏感荧光检测技术的建立又有赖于无毒和生物相容性发光材料的成功研制。

有机荧光物质是经典的荧光物质，虽然有机荧光物质由于其固有的性质有其缺点，如荧光效率问题等等，但作为经典的荧光物质相对于目前的无机荧光物质仍有其广泛应用的领域，如应用于流式细胞术、应用于抗体标记等等。

生物功能化材料一直是材料研究学领域的热门领域，在生物功能化材料中，纳米材料自从上个世纪80年代以来由于其特殊的物理化学性质，越来越受到科学家们的重视，因而利用纳米技术研究和解决生物领域的重大问题也成为重要的前沿研究领域之一。

然而将有机荧光材料和纳米材料结合起来作为功能化材料应用于生物领域却没有较多的深入研究，国外已有研究将此类型的荧光材料通过化学的方法修饰在纳米材料的表面。然而将荧光物质包裹于纳米材料之内却没有相关的报道，更没有将纳米粒子的表面活化，或称“表面生物功能化”，即使表面可以连接核酸、蛋白质、核苷酸、氨基酸、抗体、多肽、动植物细胞、亚细胞结构、病毒、细菌等等生物大分子或者生物体本身的能力的研究。

发明内容

所要解决的技术问题

本发明需要解决的技术问题是提供一种表面生物功能化的核壳型荧光纳米粒子及其制备方法和应用，以克服现有技术中荧光物质仅修饰于纳米材料表面，以及无法使荧光纳米材料同时具备生物分子结合功能的缺陷。

技术方案

本发明的内容之一是提供一种表面生物功能化的核壳型荧光纳米粒子，具备内核和外壳的核壳型结构：其内核层中含荧光物质；外壳层由荧光通透物质构成；外壳层表面为有机官能团的修饰层。

上述的生物功能化荧光纳米粒子的一种优选方案为，所说的有机官能团为氨基、羧基或者巯基，或者其组合。

上述的生物功能化荧光纳米粒子的另一种优选方案为，所说的荧光物质为异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、藻红蛋白，或者其组合，较佳地选择异硫氰酸荧光素FITC。

上述的生物功能化荧光纳米粒子的另一种优选方案为，所说的外壳层成分为二氧化硅、琼脂糖、烯烃聚合物、聚丙烯腈或环氧化合物，或者其组合。

本领域的普通技术人员无需特别的实验即可理解，制备所说的外壳层成分可以是无机包裹层，例如氨基硅烷、巯基硅烷，还可以是有机包裹层，例如糖苷、蛋白质等。无机包裹层优选氨基硅烷，有机包裹层优选糖苷。较佳地，其成分选自二氧化硅、琼脂糖、烯烃聚合物、聚丙烯腈、环氧化合物、或其组合；最佳地，所述内核层的外壳成分是二氧化硅。

本发明的内容之二是提供一种制备所说的表面生物功能化的核壳型荧光纳米粒子的方法，包括如下步骤：

(1)提供异丙醇和荧光物质的水溶液；

(2)将氨水和正硅酸乙酯分别先后加入步骤(1)所说的水溶液中，在室温的条件下反应3～5个小时得到荧光粒子；

(3)在步骤(2)的荧光粒子的醇溶液中加入氨基化、羧基化或者巯基化试剂，在25～60℃下反应1～6小时，即获得表面生物功能化的荧光纳米粒子。

本发明同时提供上述的表面生物功能化的核壳型荧光纳米粒子的另一种制备方法，包括如下步骤：

(1)提供TritonX-100、正己醇、环己烷和荧光物质的微乳液；

(2)将氨水和正硅酸乙酯分别先后加入步骤(1)所说的水溶液中，在室温的条件下反应8～15个小时得到荧光粒子；

上述的两种表面生物功能化的核壳型荧光纳米粒子的制备方法的优选方案为，所说的氨基化、羧基化或者巯基化试剂分别为N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-巯基丙基三甲氧基硅烷、3-巯基丙基三甲氧基硅烷，也可以是巯基乙酸或者巯基丙酸。

本领域的普通技术人员无需特别的实验即可理解，所说的修饰剂为硅烷类修饰剂，但并不限于上述的几种。对于选定的外壳成分，一般技术人员可根据现有技术选用合适的外壳层形成剂。例如当外壳成分为二氧化硅时，可选用正硅酸乙酯或其它合适的外壳层形成剂。

上述的生物功能化荧光纳米粒子制备方法的一种优选方案为，所说的微乳液体系中含有TritonX-100、正己醇、环己烷按，其体积比为1∶1～3∶4～6。

本发明的内容之二是提供上述的生物功能化荧光纳米粒子的应用，所说的有机化官能团通过化学键与核酸、蛋白质、核苷酸、氨基酸或者其衍生物结合。

上述的生物功能化荧光纳米粒子的另一种应用为，所说的有机化官能团与动植物细胞或者亚细胞结构或者病毒颗粒结合。

有益效果

1、本发明的生物功能化荧光纳米粒子与现有技术中荧光物质仅修饰于纳米材料表面相比，可以使纳米材料不但具备荧光标记能够方便地指示的性能之外，还具备有机官能团，通过化学键与核酸、蛋白质、核苷酸、氨基酸或者其衍生物结合，乃至与动植物细胞或者亚细胞结构或者病毒颗粒结合的生物应用功能。

2、本发明的实验表明，将荧光物质包裹于纳米颗粒后，其发光性质稳定、颗粒分布均匀、表面光滑，是一种新型的超微检测纳米材料。

3、本发明的生物功能化荧光纳米粒子其外壳层采用二氧化硅、琼脂糖等无毒、具有生物相容性的材料，使应用于生物化学领域成为可能。

4、本发明的制备方法采用成本低廉的有机荧光物质、外壳形成剂等，使得实际大规模生产具有可行性。

5、采用纳米颗粒包裹荧光物质和生物功能基团，可以有效的发挥纳米材料的表面积优势，提高生物反应的效率、加快反应时间，同时减小反应体系的总量，使得进行微量检测和微量反应简便易行。

6、生物功能化的纳米粒子对于纳米水平上的生物材料的理化性质的研究提供了基础，同时进一步提供了扩大应用的可能性。

7、在本发明的纳米粒子上连接核酸、蛋白质、核苷酸、氨基酸、抗体、多肽、动植物细胞、亚细胞结构、病毒、细菌等等，可以广泛应用于各类分子的检测和疾病的示踪治疗。

附图说明

图1是二氧化硅包裹荧光纳米粒子的透射电子显微镜照片。从图中可以看出，包裹了荧光物质的纳米粒子具有很规则的形态，具有很好的单分散性，表明二氧化硅已经很好的将荧光物质包裹于其中。

图2是二氧化硅包裹荧光物质的纳米粒子的荧光显微镜照片。图中可以看出，包裹荧光物质纳米粒子具有很好的荧光性质，同时也进一步证明二氧化硅已经成功地将荧光物质包裹于其中。

图3是二氧化硅包裹荧光物质的纳米粒子的荧光光谱。从图谱中可以看出，包裹荧光物质纳米粒子具有较好的荧光强度，同时也进一步证明二氧化硅已经成功地将荧光物质包裹于其中。

图4是修饰巯基的纳米粒子的拉曼光谱。从图谱中可以看出，2167cm^-1处是SH的拉曼光谱。1328cm^-1归属为CH₂的面外摇摆振动谱，1388cm^-1和1464cm^-1是CH₂的伸缩振动峰位，而1594cm^-1可指认为C-C链的伸缩振动峰位，2934cm^-1附近的谱带则归属于CH₂的反对称的伸缩振动，395cm^-1处的峰是C-C链变形振动所产生的。(CH₂)n和Si-O^-的局域模的对称伸缩振动出现在1075cm^-1附近。在1003cm^-1和502cm^-1处有相应的^-O-Si-O^-局域模的对称伸缩振动。1231cm^-1处的峰位是C-Si的伸缩震动，668cm^-1和730cm^-1两处的拉曼峰位则是因为C-S键伸缩振动而产生。碳硅键、硅氧键、碳碳键、碳氢键以及碳硫键的拉曼峰的出现，表明了巯基化合物已被成功地连接到纳米粒子的表面上，并且有部分有效的巯基暴露在纳米粒子的表面上。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如：化工产品手册，或按照制造厂商所建议的条件。所有无机化学试剂和有机溶剂购自上海化学试剂厂，异硫氰酸荧光素、N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷、巯基乙酸、3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPTS)购自Sigma公司。

实施例1

核壳型荧光纳米粒子的制备方法一

将异丙醇和水按照5∶1的比例均匀混合，超声5min。称取0.1～0.8mg的荧光物质异硫氰酸荧光素FITC，配置成水溶液，超声处理10min。取上层清夜倒入三颈烧瓶中，不断搅拌使其保持分散状态。取1mL的浓氨水，将其缓慢加入到不断搅拌的溶液体系中。接着取1～3mL的正硅酸乙酯，同样将其缓慢加入到不断搅拌的溶液体系中。体系在室温的条件下反应3～5个小时。将反应产物倒出，用二次蒸馏水洗涤粒子3～5次。清洗后的粒子在20～50℃的温度下真空干燥5小时，收集粒子备用。从图1中我们可以看出二氧化硅已经很好地将荧光物质包裹在其中。

实施例2

核壳型荧光纳米粒子的制备方法二

将TritonX-100、正己醇、环己烷按1∶2∶5的比例均匀混合，形成透明稳定的微乳液体系。将上述微乳液体系置于超声波中处理30～60分钟，向其中加入荧光物质异硫氰酸荧光素FITC 0.5mg，用超声波处理6分钟后取出上层液倒入三颈烧瓶中，搅拌30分钟使之均匀。取1mL浓氨水用2mL二次蒸馏水稀释，30分钟后将其缓慢加入到不断搅拌的微乳液中，持续搅拌30分钟使氨水均匀分散在微乳液中。1小时后，向微乳液中滴加1～3mL的正硅酸乙酯，同时不断地搅拌10小时，并将体系的温度保持在15～30℃之间。向体系中加入丙酮使粒子沉淀，或者将体系静置过夜使粒子自然沉淀，使用乙醇清洗粒子。在真空的条件下干燥粒子样品。

实施例3

荧光纳米粒子表面的氨基修饰

取20mg实施例1或2中制得的荧光纳米粒子，加入30～50mL的甲醇和丙三醇按5∶3比例组成的混合液中，用超声波处理20～60分钟；称取1～3mL AEAPS[N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷]，用超声波处理10～60分钟；将这两种溶液混合均匀，在60℃的条件下反应5小时，然后取出粒子并用甲醇清洗3次，接着在40～80℃真空干燥2小时，收集粒子得到表面修饰有氨基的生物功能化的荧光纳米粒子。

实施例4

荧光纳米粒子表面的羧基修饰

取实施例1或2中制得的荧光纳米粒子加入到组成为乙酸乙醇的缓冲溶液中(pH＝4.5)，超声混合均匀；3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPTS)加入到同样的缓冲溶液中。将两种缓冲溶液混合，在常规的温度条件下反应2～4个小时，离心分离粒子，用同样的缓冲溶液洗涤三次后，在60℃下真空干燥，收集粒子。

将收集的粒子分散于同样的缓冲溶液中，向溶液体系中加入巯基乙酸，将溶液分散均匀，体系在常温下反应2～4个小时后，离心分离收集粒子，洗涤数遍后真空干燥，得到表面修饰羧基的生物功能化的荧光纳米粒子。

实施例5

荧光纳米粒子表面的巯基修饰

取实施例1或2中制得的荧光纳米粒子加入到乙酸乙醇缓冲液中(pH＝4.5)，超声混和均匀；同时，将3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPTS)加入到另一乙酸乙醇缓冲液中。混合上述两种溶液，在25℃的情况下反应1h后，取出粒子，用乙酸乙醇的缓冲液(pH＝4.5)清洗三次后，在60℃时真空干燥2h，收集表粒子得到表明修饰有巯基的生物功能化荧光纳米粒子。从图4的拉曼表征图谱中可以看出，巯基已经被修饰到荧光纳米粒子的表面。

实施例6

氨基修饰的荧光纳米粒子应用于蛋白分离

取1～3mg如实施例3制备的表面修饰氨基的生物功能化荧光纳米粒子，加入到pH为7.0～8.0的磷酸盐缓冲体系中，加入用量为50～200μL交联剂如戊二醛等等，形成混合溶液。所述的混合溶液用超声波处理10～30分钟。在适当的温度条件下，反应4～6小时。离心分离去除上清后，然后用磷酸盐缓冲液超声洗涤2～3次后，重新将粒子分散于磷酸缓冲溶液。

称取一定量的中药(灵芝、当归、黄芪等等)，按照传统中药的煎药方法进行处理，离心分离去除溶液中的杂质，收集含蛋白成分的上清备用。

取一定量的上清溶液，向其中加入一定量的粒子溶液，振荡混匀，在室温下反应1～3小时，离心分离去除上清液，用磷酸缓冲溶液洗涤1～2次，最后将所得的连有蛋白的粒子重新分散于磷酸缓冲溶液中备用。

将上述连有蛋白的粒子溶液，加入到体外培养的癌细胞或者正常细胞中，观察各种不同中药中不同蛋白成分对于癌细胞的凋亡和正常细胞的增殖能力的作用。

实施例7

羧基修饰的荧光纳米粒子应用于RNA干扰

取一定量上述实施例4中制备的已修饰好羧基的生物功能化荧光纳米粒子，加入到pH为7.0～8.0的磷酸盐缓冲体系中，形成混合溶液。所述的混合溶液用超声波处理10～30分钟。

取足够量的修饰有氨基的特定序列的双链干扰的小RNA(siRNA)，加入到含约2mL的上述粒子的混合溶液中。在室温下反应3小时，并保持不断振动，从而将siRNA上的氨基与外壳层上的羧基在固定剂的作用下进行反应，并直接连接于外壳层。反应结束后，超滤分离出所述的粒子，用磷酸盐缓冲液洗涤3次。这样得到的连接有双链干扰的小RNA的荧光纳米粒子置于磷酸盐缓冲液中保存。

将上述连有siRNA的粒子溶液，加入到体外培养的具有吞噬作用的细胞中，观察不同siRNA序列对于细胞特异基因抑制作用，也可以用于细胞的转染示踪和实时监测。

实施例8

修饰氨基的荧光纳米粒子应用于细胞监测

取1～3mg如实施例3制备的表面修饰氨基的生物功能化荧光纳米粒子，加入到pH为7.0～8.0的磷酸盐缓冲体系中，加入用量为50～200μL交联剂，形成混合溶液。所述的混合溶液用超声波处理10～30分钟。在适当的温度条件下，反应4～6小时。离心分离去除上清后，然后用磷酸盐缓冲液超声洗涤2～3次后，重新将粒子分散于磷酸缓冲溶液。

取约3微克的单克隆抗体，加入到含约2mL的上述粒子的混合溶液中。在2～10℃的反应温度下反应3小时，从而将抗体上的氨基与外壳层上的氨基在固定剂的作用下进行反应，使抗体通过Schiff Bond(席夫键)直接连接于外壳层。反应结束后，离心分离出所述的粒子，用磷酸盐缓冲液洗涤3次。这样得到的修饰有单克隆抗体的荧光纳米粒子置于磷酸盐缓冲液中保存，利用含有抗体分子的荧光纳米颗粒，可以快速、精确地检测极微量有害细菌。这种纳米粒子加入检测样本的溶解液里，就会与细菌粘着在一块；然后通过离心方法，根据纳米粒子与细菌细胞之问的大小的不同，可以使细菌与纳米颗粒一起沉淀下来；分离下来的细菌上附着有从纳米颗粒，根据这些粒子的发光现象就可以确定所要检测的细菌是否存在。该检测法使用抗目标细菌的特异性抗体制作荧光粒子，使检测的特异性很高；另外，由于同时有数千个荧光粒子附着细菌，所以即使单个细胞也可以检测到。

Claims

1.一种表面生物功能化的核壳型荧光纳米粒子，具备内核和外壳的核壳型结构：其内核层中含荧光物质；外壳层由荧光通透物质构成；外壳层表面为有机官能团的修饰层。

2.根据权利要求1所述的表面生物功能化的核壳型荧光纳米粒子，其特征在于，所说的有机官能团为氨基、羧基或者巯基，或者其组合。

3.根据权利要求1所述的表面生物功能化的核壳型荧光纳米粒子，其特征在于，所说的荧光物质为异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、藻红蛋白，或者其组合。

4.根据权利要求1所述的表面生物功能化的核壳型荧光纳米粒子，其特征在于，所说的外壳层成分为二氧化硅、琼脂糖、烯烃聚合物、聚丙烯腈或环氧化合物，或者其组合。

5.根据权利要求4所述的表面生物功能化的核壳型荧光纳米粒子，其特征在于，所说的外壳层成分为二氧化硅。

6.一种权利要求1所述的表面生物功能化的核壳型荧光纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：

(1)提供异丙醇和荧光物质的水溶液；

7.一种权利要求1所述的表面生物功能化的核壳型荧光纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：

(1)提供TritonX-100、正己醇、环己烷和荧光物质的微乳液；

8.根据权利要求6或7所述的表面生物功能化的核壳型荧光纳米粒子的制备方法，其特征在于，所说的氨基化、羧基化或者巯基化试剂分别为N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-巯基丙基三甲氧基硅烷、3-巯基丙基三甲氧基硅烷，也可以是巯基乙酸或者巯基丙酸。

9.权利要求1所述的表面生物功能化的核壳型荧光纳米粒子的应用，其特征在于，所说的粒子表面的有机化官能团通过化学键与核酸、蛋白质、核苷酸、氨基酸或者其衍生物结合。

10.权利要求1所述的表面生物功能化的核壳型荧光纳米粒子的应用，其特征在于，所说的粒子表面的有机化官能团与动植物细胞或者亚细胞结构或者病毒颗粒结合。