CN109444251B - 纳米基质在核酸检测中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于质谱检测技术领域，涉及一种纳米基质在核酸检测中的应用。本发明的纳米基质在核酸检测中的应用，所述纳米基质的结构为核层/中间壳层/外壳层；其中，所述核层为磁性氧化物，所述中间壳层为硅氧化物，所述外壳层为铂。本发明的核壳结构纳米基质易于被制备分离纯化，可以改善有机基质结晶不均匀的状况，同时通过贵金属的等离激元效应增加寡核苷酸的解吸电离效果，增加核酸质谱检测的灵敏度。本发明作为一种简单、快速、高通量检测寡核苷酸样本的手段，具有良好的应用前景，值得推广应用。

Description

纳米基质在核酸检测中的应用

技术领域

本发明属于质谱检测技术领域，尤其涉及一种纳米基质在核酸检测中的应用。

背景技术

基质辅助激光解吸电离(MALDI)作为一种“软电离”方式，能利用较少能量产生稳定的气态离子，是难挥发性高分子量化合物最重要的电离方式之一。这项电离技术和飞行时间质谱相结合(TOF－MS)，可以实现生物大分子的快速高效可靠的检测。研究表明，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI－TOF－MS)能被有效应用到寡核苷酸的检测上，例如单核苷酸多态性(SNP)和胞嘧啶甲基化的标志物的分析；尤其对于SNP的检测在生物、医学、农学等众多领域发挥着重要作用。相较于其他研究方法，MALDI－TOF－MS是一种具备高通量、高精度，又相对简单便捷的一个分析方式，因而得到广泛应用。

在激光解吸电离过程中，DNA片段的碎裂化是一种常见的现象，DNA的碎裂化能被碱基的质子化所诱导，导致碱基的丢失，最终导致完整DNA片段的信号强度的丢失。而DNA的碎片化主要取决于所使用基质的性质，在该过程中，基质发挥着吸收、传递激光能量给待测样品并使待测样品离子化的作用。MALDI－TOF－MS传统的基质一般为有机基质。阿魏酸，2，5－二羟基苯甲酸(2，5－DHB)是曾用于核酸质谱分析的基质，但由于灵敏度低，很少被实际应用。2，4，6－三羟基苯乙酮(2，4，6－THAP)和3－羟基砒啶甲酸(3－HPA)是常用于核酸质谱分析的基质，但由于结晶不均匀，只有在高浓度的时候才能发挥作用，又因为基质的过量会导致吸收激光能量后能量过剩，致使核酸片段的碎裂。目前，所有传统有机基质的共同问题是存在“有效点”的问题，导致实验结果重复性很差；同时因为对核酸样品解吸电离作用效果不够理想，只能检测特定分子量范围内的核酸分子，一般在10000Da以下。

此外，随着MALDI－TOF－MS的基质的研究开发，一些无机纳米材料开始被探索作为MALDI－TOF－MS的基质或作为有机基质的增强材料，比如碳纳米管、石墨烯、多空硅、硅纳米颗粒、金纳米颗粒等，已经表现出一定的应用前景。但在核酸样品中，由于样品的复杂性，待测样品的离子化效率会被严重干扰，上述基质仍难以满足在核酸质谱检测的应用。所以，对于MALDI－TOF－MS的核酸分析，所期望的是提供一种具有更高效，更灵敏，重复性更好的基质材料，能够解决上述问题中的至少一个。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种纳米基质在核酸检测中的应用，具有灵敏度高、重复性好，操作简单、快速、高效等特点，可以克服上述问题或者至少部分地解决上述技术问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

根据本发明的一个方面，本发明提供一种纳米基质在核酸检测中的应用，所述纳米基质的结构为核层/中间壳层/外壳层；

其中，所述核层为磁性氧化物，所述中间壳层为硅氧化物，所述外壳层为铂。

作为进一步优选技术方案，所述纳米基质具有粗糙的表面；

和/或，所述纳米基质的粒径＜1000nm，优选为≤900nm，进一步优选为≤800nm，进一步优选为200～700nm。

作为进一步优选技术方案，所述核层为球形或类球形颗粒，颗粒的粒径为100～400nm，优选为120～380nm，进一步优选为150～350nm；

和/或，所述中间壳层的厚度为20～200nm，优选为50～180nm，进一步优选为80～160nm；

和/或，所述外壳层的厚度为5～80nm，优选为10～50nm，进一步优选为20～30nm。

作为进一步优选技术方案，所述磁性氧化物包括四氧化三铁、三氧化二铁或铁氧体中的一种或多种，优选为四氧化三铁；

和/或，所述硅氧化物包括一氧化硅和/或二氧化硅，优选为二氧化硅。

作为进一步优选技术方案，所述纳米基质的制备方法包括：

将磁性氧化物颗粒加入至用于生成硅氧化物的溶液体系中进行反应，得到硅氧化物包覆磁性氧化物的颗粒；

将所述硅氧化物包覆磁性氧化物的颗粒加入至用于反应生成铂的溶液体系中进行反应，得到磁性氧化物/硅氧化物/铂结构的核壳结构纳米基质。

作为进一步优选技术方案，所述核酸检测的方法包括：

将核酸样品以及共基质，在基质辅助激光解吸电离质谱仪的靶板上进行复合点样，干燥后进行质谱分析检测；

其中，所述共基质包括有机基质以及所述的纳米基质；

优选地，所述有机基质包括2，4，6－THAP和/或3－HPA；

优选地，在复合点样之前对靶板进行预处理，预处理的方式包括：依次用低碳醇溶液和水对靶板进行超声清洗，清洗的时间为30～90min，优选为50～60min。

作为进一步优选技术方案，所述复合点样的方式包括：

先将纳米基质水溶液点样在质谱靶板上，然后将核酸样品点样在已干燥的纳米基质表面，最后将有机基质溶液点样在已干燥的核酸样品表面，干燥。

作为进一步优选技术方案，所述复合点样的方式包括：

先将纳米基质水溶液点样在质谱靶板上，然后将核酸样品与有机基质溶液混合均匀，得到混合物，将所述混合物点样在已干燥的纳米基质表面，干燥。

作为进一步优选技术方案，核酸样品包括生物提取DNA片段、PCR产物和寡核苷酸片段中的至少一种。

作为进一步优选技术方案，核酸检测方法的检测分子量在30000Da以下；

和/或，基质辅助激光解吸电离质谱仪的检测条件包括：正离子检测，检测到的信噪比大于6的质谱信号为可进行分析的有效信号。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明将核壳结构的纳米基质应用在核酸检测领域中，该纳米基质以磁性氧化物为核层，以硅氧化物包覆形成中间壳层，以铂纳米粒子进一步包覆形成外壳层结构，其由于磁性氧化物的磁特性便于其被设备分离纯化，又由于该纳米基质具有稳定的结构、较大的表面积以及铂纳米颗粒提供的独特的表面等离子共振和热载流子，一方面缓解了现有的有机基质结晶不均匀的问题，另一方面促进了核酸样品的解吸电离效果。

(2)检测的灵敏度提高、重复性好：本发明提出的核壳结构的纳米基质，可以显著提高核酸样品的解吸电离效果，实现对于样品的精准识别，大幅提高了检测的灵敏度和重复性。

(3)检测样品的消耗量少：由于采用了本发明的纳米基质使得核酸样品的解吸离子化大幅提高，结合质谱检测的特点，可以显著减低样品的消耗量，并实现低浓度样品的检测。

(4)检测方法简单、高效：该检测过程操作简便，十分快速，整个检测过程，只需要几分钟就可以得到最后的检测结果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一种实施例提供的Fe₃O₄/SiO₂/Pt核壳结构纳米颗粒的表征图；图1(a)为SEM图，图1(b)为TEM图；

图2为本发明一种实施例提供的Fe₃O₄/SiO₂/Pt核壳结构纳米基质与有机基质共结晶时的表征图；

图3为本发明一种实施例提供的Fe₃O₄/SiO₂/Pt核壳结构纳米颗粒为共基质检测序列为GCAGACGATCCTGGGGGG的一段寡核苷酸标准品(分子量为5605.7)得到的质谱图；

图4为本发明一种实施例提供的Fe₃O₄/SiO₂/Pt核壳结构纳米颗粒为共基质检测新生儿耳聋基因相关的34个SNP位点的多重PCR产物寡核苷酸样品得到的质谱图。

具体实施方式

下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

第一方面，在至少一个实施例中提供一种纳米基质在核酸检测中的应用，所述纳米基质的结构为核层/中间壳层/外壳层；

其中，所述核层为磁性氧化物，所述中间壳层为硅氧化物，所述外壳层为铂(Pt)。

鉴于现有的MALDI－TOF－MS的基质在核酸检测中存在的缺陷，限制了MALDI－TOF－MS在核酸样品分析检测中的应用，有必要提出一种新型的基质，并将其应用在核酸样品的检测中，以改善现有技术的缺陷。基于此，本发明提出了一种新的基质，以及相关的获取方法、应用。

本发明提供的核壳结构的纳米基质主要应用在对核酸样品进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测中，可以克服传统基质的不足。进一步地讲，本发明通过改变纳米基质的材料结构，以磁性氧化物为核层，以硅氧化物连续包覆形成中间壳层，以铂纳米颗粒连续包覆形成外壳层结构，由于磁性氧化物的磁特性便于其被设备分离纯化，又由于稳定的结构、较大的表面积以及铂纳米颗粒提供的独特的表面等离子共振和热载流子，一方面缓解了现有的有机基质结晶不均匀的问题，另一方面促进了核酸样品的解吸电离效果。

因此，该核壳结构纳米基质易于被制备分离纯化，可以改善有机基质结晶不均匀的状况，同时通过贵金属的等离激元效应增加寡核苷酸的解吸电离效果，增加核酸质谱检测的灵敏度。本发明作为一种简单、快速、高灵敏度、重复性好、高通量检测核酸样品的手段，具有良好的应用前景，值得推广应用。

需要说明的是，本发明的核层/中间壳层/外壳层的核壳结构纳米基质，也可以表示为核层@中间壳层@外壳层的核壳结构纳米基质。

以下针对本发明实施例的纳米基质材料及其在核酸检测中的应用方法进行具体说明：

本发明的纳米基质，其含有核壳结构的颗粒物，该颗粒物为多层的核壳结构；进一步的，颗粒物大体上具有三层结构，即包括核层、中间壳层和外壳层，并且中间壳层包覆核层，外壳层包覆中间壳层。需要说明的是，在一些示例中，中间壳层包覆在核层外，并非意在限定中间壳层必须完全地包裹在核层外。例如，构成的中间壳层的硅氧化物颗粒也可以适量被混杂于核层的磁性氧化物中；对于包覆在中间壳层外的外壳层同样如此。

本发明的纳米基质一般为球形(或类球形)的纳米颗粒，整体上而言，本发明实施例提供的纳米基质材料是纳米尺度的颗粒物，颗粒度均一；核层、中间壳层、外壳层均为颗粒，进一步的，核层、中间壳层、外层也均为纳米尺度。

在本发明的一些示例中，所述纳米基质具有粗糙的表面；

和/或，所述纳米基质的粒径＜1000nm，优选为≤900nm，进一步优选为≤800nm，进一步优选为200～700nm。

根据本发明，纳米基质具有粗糙的表面，换言之，外壳层具有粗糙的表面。所述“粗糙的表面”可以理解为不精细、不光滑或不细致的表面。在本发明的一些示例中，构成外壳层的铂纳米颗粒是以松散的形式推积在中间壳层外，铂纳米颗粒之间形成适当的纳米尺度的间隙。该纳米基质采用金属铂纳米颗粒构成外壳层，并有粗糙的表面，将其应用在核酸质谱检测中，可以使得纳米颗粒与寡核苷酸分子接触过程中，最大限度的促进解吸电离过程。

该纳米基质的粒径小于1μm，且颗粒粒度均一，纳米基质(纳米球形颗粒)的粒径优选为≤900nm，进一步优选为≤800nm，进一步优选为200～700nm；典型但非限制性的例如可以为200nm、30nm、400nm、500nm、600nm、700nm或800nm。

在本发明的一些示例中，所述核层为球形或类球形颗粒，颗粒的粒径为100～400nm，优选为120～380nm，进一步优选为150～350nm；典型但非限制性的例如可以为100nm、120nm、150nm、180nm、200nm、250nm、300nm、350nm、380nm或400nm。

和/或，所述中间壳层的厚度为20～200nm，优选为50～180nm，进一步优选为80～160nm；典型但非限制性的例如可以为20nm、50nm、80nm、100nm、120nm、150nm、160nm、180nm或200nm。

和/或，所述外壳层的厚度为5～80nm，优选为10～50nm，进一步优选为20～30nm；典型但非限制性的例如可以为5nm、10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm或80nm。

适宜的核层颗粒的粒径，以及适宜的中间壳层和外层的厚度，可以对球形颗粒的核起到较好的保护作用，还能具有更高的热电子产生率，同时促进热载流子效应。

在本发明的一些示例中，所述磁性氧化物包括四氧化三铁、三氧化二铁或铁氧体中的一种或多种；

和/或，所述硅氧化物包括一氧化硅和/或二氧化硅；

优选地，所述磁性氧化物为四氧化三铁；

优选地，所述硅氧化物为二氧化硅。

可以理解的是，构成本发明的核层的磁性氧化物存在多种可选的材料，例如四氧化三铁、三氧化二铁或铁氧体中的一种或几种的混合物，但并不限于此，在本发明的其他实施例中，磁性氧化物还可以存在其他的各种选择。优选地，构成本发明的核层的磁性氧化物选用的是来源广泛、易于获得、与上述中间壳层、外壳层配合应用效果更好的四氧化三铁(Fe₃O₄)。

可以理解的是，构成本发明的中间壳层的硅氧化物存在多种可选的材料，例如一氧化硅或二氧化硅中的一种或两种的混合物，但并不限于此，在本发明的其他实施例中，硅氧化物还可以存在其他的各种选择。优选地，构成本发明的中间壳层的硅氧化物选用的是来源广、成本低、与上述核层、外壳层配合应用效果更好的二氧化硅(SiO₂)。

在本发明的一种优选实施例中，该纳米基质的结构为四氧化三铁/二氧化硅/铂，即Fe₃O₄/SiO₂/Pt。

根据本发明，该核壳结构纳米基质颗粒物的核层、中间壳层以及外壳层是通过逐层(逐次)反应获得。如首先通过反应生成构成核层的磁性氧化物，再基于核层在核层的表面上生长中间壳层，进一步的基于中间壳层在中间壳层的表面上生长外壳层。

在本发明的一些示例中，所述纳米基质的制备方法包括：

将制得的磁性氧化物颗粒加入至用于生成硅氧化物的溶液体系中进行反应，得到硅氧化物包覆磁性氧化物的颗粒；

将所述硅氧化物包覆磁性氧化物的颗粒加入至用于反应生成铂的溶液体系中进行反应，制得磁性氧化物/硅氧化物/铂结构的核壳结构纳米基质。

需要说明的是，本发明的纳米基质的制备方法可采用本领域常用的方法，对于其具体制备过程本发明不做过多的限制。下面主要以四氧化三铁/二氧化硅/铂结构的纳米基质为例对其制作方法进行更详实的阐述，然而应当理解的是，该制作方法同样适用于类似结构例如三氧化二铁/二氧化硅/铂结构的纳米基质的制备。

在一种优选的实施方式中，纳米基质的制备方法，包括以下步骤：

S1、以FeCl₃·6H₂O作为铁源，同时加入柠檬酸三钠和乙酸钠改性，以乙二醇为溶剂进行热反应，制得单分散性Fe₃O₄纳米颗粒；反应条件包括：温度为200℃，时间为8h～72h。

其中，乙二醇作为溶剂以及还原剂；柠檬酸三钠和乙酸钠可增加体系的稳定性、分散性。柠檬酸三钠可作为稳定剂，与铁离子络合，从而阻止铁离子团聚；乙酸钠可以增加磁性氧化物粒子的静电稳定性，阻止其团聚。

获得的Fe₃O₄纳米颗粒的粒度可通过调整铁源和/或柠檬酸三钠的用量进行调节，以满足实际的需求。

S2、将S1得到的Fe₃O₄纳米颗粒分散在水和乙醇的混合溶剂中，用氨水催化正硅酸四乙酯水解缩聚成核，常温下反应2h～8h，以在Fe₃O₄纳米颗粒表面形成不同厚度的二氧化硅层，得到Fe₃O₄/SiO₂核壳结构纳米颗粒。

其中，水和乙醇促进正硅酸四乙酯水解形成凝胶，碱性氨水作为催化剂可促进二氧化硅微球的形成。一般而言，在Fe₃O₄纳米颗粒表面形成的二氧化硅层的厚度比较一致，但在一些示例中，二氧化硅层的厚度会略有差异，可通过调控反应条件将该层厚度控制在优选范围内。

S3、将S2得到的Fe₃O₄/SiO₂核壳结构纳米颗粒超声均匀分散在无水乙醇中，加入3－氨丙基三乙氧基硅烷搅拌6h～12h，以形成Fe₃O₄/SiO₂－NH₂纳米颗粒；

S4、将聚乙烯呲咯烷酮溶解在氯铂酸溶液中，得到铂源溶液；

其中的聚乙烯呲咯烷酮可使体系稳定，不发生团聚。

S5、将S3形成的Fe₃O₄/SiO₂－NH₂纳米颗粒分散在S4的铂源溶液中，搅拌2h，使铂离子均匀分布在纳米颗粒表面，得到Fe₃O₄/SiO₂－NH₂纳米颗粒分散溶液；

S6、在S5得到的Fe₃O₄/SiO₂－NH₂纳米颗粒分散溶液中加入还原剂硼氢化钠，常温搅拌8h～12h，得到Fe₃O₄/SiO₂/Pt核壳结构纳米颗粒；

S7、用乙醇和去离子水反复洗涤S6得到的Fe₃O₄/SiO₂/Pt核壳结构纳米颗粒，于60℃烘箱中干燥成粉末状。

上述方法简单，容易操作，易于控制，制得的产品性能稳定性好，还是实现了对核层、中间壳层和外壳层的结构、厚度等的调控，产率高，易于实现规模化生产。

本发明提供的Fe₃O₄/SiO₂/Pt核壳结构纳米颗粒可作为基质在质谱分析中进行应用。例如在基质辅助激光解吸电离质谱检测分析仪中被应用。在应用中，上述纳米基质被分散在(重悬于)分散液中，作为质谱基质；其中，所述分散液优选为水。

因此，本发明还提供了一种检测方法，通过采用上述的纳米基质，利用基质辅助激光解吸电离质谱仪进行检测。鉴于上述纳米基质的特殊性，该检测方法中的目标检测物主要为核酸样品，因此，本发明提供了上述Fe₃O₄/SiO₂/Pt核壳结构纳米颗粒在核酸质谱检测中的应用。

在本发明的一些示例中，所述核酸样品包括生物提取DNA片段，PCR产物，以及及其他途径来源的寡核苷酸片段。

进一步地，核酸样品质谱检测中，分子量范围小于等于30000Da。

进一步地，激光解吸电离质谱仪为bruker autoflex^TM speed MALDI－TOF(TOF)质谱，采用smartbeam－II激光器，波长为355nm，或者bruker microflex MALDI－TOF(TOF)质谱，采用氮气激光器，波长为337nm。

进一步地，采用flexAnalysis进行数据的分析处理。

由以上可以看出，应用本发明的纳米基质进行核酸样品质谱分析，拓宽了检测的分子量范围，缓解了现有只能检测特定分子量(一般在10000Da以下)范围内的核酸分子，应用范围更广。

在本发明的一些示例中，将上述核壳结构纳米基质作为基质应用在核酸质谱分析检测中，其具体的分析检测方法包括以下步骤：

(a)：仪器与试剂的准备：激光解吸电离质谱仪，采用脉冲电场延时提取信号，正离子线性模式，并且只采用信噪比大于6的信号用于分析；

(b)：将所述的核壳结构纳米基质，重悬于去离子水中，作为共基质；

(c)：制备核酸样品，寡核苷酸样品经过除盐处理后作为被分析物；

(d)：将有机基质(如2，4，6－THAP或3－HPA)按照不同方式配成溶液，作为共基质；

这里需要说明的是，有机基质的配制方法为现有技术，本发明在此不再详细阐述。

(e)：将所述核壳结构纳米基质，寡核苷酸样品以及有机基质溶液，在靶板上进行复合点样；

(f)：分析质谱检测结果，得出结论。

进一步地，上述质谱靶板必须使用洁净的靶板，该靶板在使用前需要进行预处理，例如可以依次用无水乙醇、去离子水超声清洗共60min左右，进而去除靶板上的杂质的干扰。

进一步地，所述复合点样包括可选的两种点样方式，分别为：

第一种点样方式：先将纳米基质水溶液用移液枪点样在质谱靶板上，室温下干燥，然后核酸样品用移液枪点样于纳米基质表面，室温下干燥，最后将有机基质溶液点样于干燥的核酸样品表面，室温下干燥。

第二种点样方式：先将纳米基质水溶液用移液枪点样在质谱靶板上，室温下干燥，然后将核酸样品与有机基质溶液均匀混合，用移液枪点样于已干燥的纳米基质表面，室温下干燥。

下面结合具体实施例、对比例和附图，对本发明作进一步说明。

实施例1

一种纳米基质在核酸检测中的应用，包括：

1、纳米基质的制备：

S1、以FeCl₃·6H₂O作为铁源，同时加入柠檬酸三钠和乙酸钠改性，以乙二醇为溶剂进行热反应，制得单分散性Fe₃O₄纳米颗粒；反应条件包括：温度为200℃，时间为8h～72h；

S2、将S1得到的Fe₃O₄纳米颗粒分散在水和乙醇的混合溶剂中，用氨水催化正硅酸四乙酯水解缩聚成核，常温下反应2h～8h，以在Fe₃O₄纳米颗粒表面形成不同厚度的二氧化硅层，得到Fe₃O₄/SiO₂核壳结构纳米颗粒；

S3、将S2得到的Fe₃O₄/SiO₂核壳结构纳米颗粒超声均匀分散在无水乙醇中，加入3－氨丙基三乙氧基硅烷搅拌6h～12h，以形成Fe₃O₄/SiO₂－NH₂纳米颗粒；

S4、将聚乙烯呲咯烷酮溶解在氯铂酸溶液中，得到铂源溶液；

S5、将S3形成的Fe₃O₄/SiO₂－NH₂纳米颗粒分散在S4的铂源溶液中，搅拌2h，使铂离子均匀分布在纳米颗粒表面，得到Fe₃O₄/SiO₂－NH₂纳米颗粒分散溶液；

S6、在S5得到的Fe₃O₄/SiO₂－NH₂纳米颗粒分散溶液中加入还原剂硼氢化钠，常温搅拌8h～12h，得到Fe₃O₄/SiO₂/Pt核壳结构纳米颗粒；

S7、用乙醇和去离子水反复洗涤S6得到的Fe₃O₄/SiO₂/Pt核壳结构纳米颗粒，于60℃烘箱中干燥成粉末状；

S8、将S8得到的纳米颗粒重悬于去离子水中，作为质谱基质使用。

基质的表征：

表征所用的仪器包括：产物的尺寸和形貌表征在JEOL JEM－2100F透射电镜(TEM)，JEOL JEM－2100F高分辨透射电镜(HRTEM)以及Hitachi S－4800扫描电镜(SEM)上完成。

表征结果为：

如图1所示，图1(a)为纳米颗粒的SEM表征图，图1(b)为TEM表征图。Fe₃O₄/SiO₂/Pt核壳结构纳米颗粒为纳米球形颗粒，颗粒粒度均一，平均粒径为400nm左右。高分辨扫描电镜结果显示颗粒表面粗糙不光滑。透射电镜结果表明表面的粗糙由直径约为5～10nm的纳米小球组成。

2、核酸样品的检测

检测序列为GCAGACGATCCTGGGGGG的一段寡核苷酸标准品

利用上述Fe₃O₄/SiO₂/Pt核壳结构纳米颗粒作为共基质对寡核苷酸标准品进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测，检测的步骤如下：

(a)仪器与试剂的准备：激光解吸电离质谱仪，只有信噪比大于6的质谱信号用于分析。采用bruker microflex MALDI－TOF(TOF)质谱，采用氮气激光器，波长为337nm。采用脉冲电场延时提取及线性的工作方式，正离子模式进行检测。采用flexAnalysis观察、处理、分析数据。

(b)Fe₃O₄/SiO₂/Pt核壳结构纳米颗粒的制备。

(c)寡核苷酸标准样品的准备：委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，HPLCCE方法纯化。

(d)依次用无水乙醇、去离子水超声清洗质谱靶板共1h。

(e)将Fe₃O₄/SiO₂/Pt核壳结构纳米颗粒超声分散于去离子水中，将其用移液枪点样于质谱靶板上，室温下干燥。

(f)将寡核苷酸标准样品点样于已干燥的纳米基质表面，室温下干燥。

(g)将有机基质溶于按比例配比的溶剂中，点样于已干燥的寡核苷酸标准样品表面，使三者形成重结晶，用于激光解吸电离质谱分析。

质谱检测结果如图3所示，从图3中可以看出，本发明可以得到高质量的质谱信号。

另外，图2显示了Fe₃O₄/SiO₂/Pt核壳结构纳米基质与有机基质共结晶时的表征图，从图2可以看出，本发明的核壳结构纳米基质可以使有机基质结晶更均匀。

实施例2

一种纳米基质在核酸检测中的应用，包括：

1、纳米基质的制备，与实施例1相同。

2、核酸样品的检测

检测新生儿耳聋基因相关的34个SNP位点的多重PCR产物样品寡核苷酸片段

利用上述Fe₃O₄/SiO₂/Pt核壳结构纳米颗粒作为共基质对PCR产物样品进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测，检测的步骤如下：

(a)仪器与试剂的准备：激光解吸电离质谱仪，只有信噪比大于6的质谱信号用于分析。采用bruker microflex MALDI－TOF(TOF)质谱，采用氮气激光器，波长为337nm。采用脉冲电场延时提取及线性的工作方式，正离子模式进行检测。采用flexAnalysis观察、处理、分析数据。

(b)Fe₃O₄/SiO₂/Pt核壳结构纳米颗粒的制备。

(c)制备寡核苷酸生物样品：包括提取DNA，对目标片段PCR，对SNP位点作单碱基延伸。

(d)依次用无水乙醇、去离子水超声清洗质谱靶板共1h。

(e)将Fe₃O₄/SiO₂/Pt核壳结构纳米颗粒超声分散于去离子水中，将其用移液枪点样于质谱靶板上，室温下干燥。

(f)将寡核苷酸生物样品点样于已干燥的纳米基质表面，室温下干燥。

(g)将有机基质溶于按比例配比的溶剂中，点样于已干燥的寡核苷酸生物样品表面，使三者形成重结晶，用于激光解吸电离质谱分析。

质谱检测结果如图4所示，从图4中可以看出，本发明能够对多重PCR产物得到高质量谱图，能够测出全部34个SNP位点。

对比例1

一种纳米基质在核酸检测中的应用，与实施例1的区别在于：

该纳米基质的结构为四氧化三铁/二氧化硅/银，即Fe₃O₄/SiO₂/Ag。

检测的方法同实施例1。

对比例2

一种纳米基质在核酸检测中的应用，与实施例1的区别在于：

该纳米基质的结构为四氧化三铁/二氧化硅/银铂合金，即Fe₃O₄/SiO₂/Ag－Pt。

检测的方法同实施例1。

将对比例1、对比例2与上述实施例进行对比，或者将其他的纳米基质与上述实施例进行对比，大量的实验验证结果均显示了本发明的纳米基质在核酸质谱检测中效果最佳。除Pt以外的其他贵金属可能对核酸本身会造成影响，难以解吸电离，以至于得到的质谱信号质量不佳。

由以上可以看出，本发明的纳米基质应用在核酸质谱检测中，主要具有以下特点：

灵敏度提高：与有机基质的协同作用，提高了寡核苷酸的解吸电离效果，实现低浓度样本的检测。

重复性好：帮助有机基质结晶更均匀，使检测结果重复性更好。

样品检测全过程十分快速：整个检测过程，只需要几分钟就可以得到最后的检测结果。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (23)

1.一种纳米基质在核酸检测中的应用，其特征在于，所述纳米基质的结构为核层/中间壳层/外壳层；

其中，所述核层为磁性氧化物，所述中间壳层为硅氧化物，所述外壳层为铂；

所述的核酸检测方法的检测分子量在30000Da以下；

核酸样品包括生物提取DNA片段、PCR产物和寡核苷酸片段中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的纳米基质在核酸检测中的应用，其特征在于，所述纳米基质具有粗糙的表面；

和/或，所述纳米基质的粒径＜1000nm。

3.根据权利要求2所述的纳米基质在核酸检测中的应用，其特征在于，所述纳米基质的粒径为≤900nm。

4.根据权利要求3所述的纳米基质在核酸检测中的应用，其特征在于，所述纳米基质的粒径为≤800nm。

5.根据权利要求4所述的纳米基质在核酸检测中的应用，其特征在于，所述纳米基质的粒径为200～700nm。

6.根据权利要求1所述的纳米基质在核酸检测中的应用，其特征在于，所述核层为球形或类球形颗粒，颗粒的粒径为100～400nm；

和/或，所述中间壳层的厚度为20～200nm；

和/或，所述外壳层的厚度为5～80nm。

7.根据权利要求6所述的纳米基质在核酸检测中的应用，其特征在于，所述核层为球形或类球形颗粒，颗粒的粒径为120～380nm。

8.根据权利要求6所述的纳米基质在核酸检测中的应用，其特征在于，所述核层为球形或类球形颗粒，颗粒的粒径为150～350nm。

9.根据权利要求6所述的纳米基质在核酸检测中的应用，其特征在于，所述中间壳层的厚度为50～180nm。

10.根据权利要求6所述的纳米基质在核酸检测中的应用，其特征在于，所述中间壳层的厚度为80～160nm。

11.根据权利要求6所述的纳米基质在核酸检测中的应用，其特征在于，所述外壳层的厚度为10～50nm。

12.根据权利要求11所述的纳米基质在核酸检测中的应用，其特征在于，所述外壳层的厚度为20～30nm。

13.根据权利要求1～12任一项所述的纳米基质在核酸检测中的应用，其特征在于，所述磁性氧化物包括四氧化三铁、三氧化二铁或铁氧体中的一种或多种；

和/或，所述硅氧化物包括一氧化硅和/或二氧化硅。

14.根据权利要求13所述的纳米基质在核酸检测中的应用，其特征在于，所述磁性氧化物为四氧化三铁。

15.根据权利要求13所述的纳米基质在核酸检测中的应用，其特征在于，所述硅氧化物为二氧化硅。

16.根据权利要求1～12任一项所述的纳米基质在核酸检测中的应用，其特征在于，所述纳米基质的制备方法包括：

将磁性氧化物颗粒加入至用于生成硅氧化物的溶液体系中进行反应，得到硅氧化物包覆磁性氧化物的颗粒；

将所述硅氧化物包覆磁性氧化物的颗粒加入至用于反应生成铂的溶液体系中进行反应，得到磁性氧化物/硅氧化物/铂结构的核壳结构纳米基质。

17.根据权利要求1～12任一项所述的纳米基质在核酸检测中的应用，其特征在于，所述核酸检测的方法包括：

将核酸样品以及共基质，在基质辅助激光解吸电离质谱仪的靶板上进行复合点样，干燥后进行质谱分析检测；

其中，所述共基质包括有机基质以及所述的纳米基质。

18.根据权利要求17所述的纳米基质在核酸检测中的应用，其特征在于，所述有机基质包括2,4,6-THAP和/或3-HPA。

19.根据权利要求17所述的纳米基质在核酸检测中的应用，其特征在于，在复合点样之前对靶板进行预处理，预处理的方式包括：依次用低碳醇溶液和水对靶板进行超声清洗，清洗的时间为30～90min。

20.根据权利要求19所述的纳米基质在核酸检测中的应用，其特征在于，所述清洗时间为50～60min。

21.根据权利要求17所述的纳米基质在核酸检测中的应用，其特征在于，所述复合点样的方式包括：

先将纳米基质水溶液点样在质谱靶板上，然后将核酸样品点样在已干燥的纳米基质表面，最后将有机基质溶液点样在已干燥的核酸样品表面，干燥。

22.根据权利要求21所述的纳米基质在核酸检测中的应用，其特征在于，所述复合点样的方式包括：

先将纳米基质水溶液点样在质谱靶板上，然后将核酸样品与有机基质溶液混合均匀，得到混合物，将所述混合物点样在已干燥的纳米基质表面，干燥。

23.根据权利要求17所述的纳米基质在核酸检测中的应用，其特征在于，基质辅助激光解吸电离质谱仪的检测条件包括：正离子检测，检测到的信噪比大于6的质谱信号为可进行分析的有效信号。

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