CN100469854C

CN100469854C - 一种磁性荧光纳米微球及其制法和应用

Info

Publication number: CN100469854C
Application number: CNB2006100291996A
Authority: CN
Inventors: 李兴玉; 李静; 程呈
Original assignee: Shanghai Normal University
Current assignee: Shanghai Normal University
Priority date: 2006-07-21
Filing date: 2006-07-21
Publication date: 2009-03-18
Anticipated expiration: 2026-07-21
Also published as: CN1888007A

Abstract

本发明涉及一种磁性荧光纳米微球及其制备方法和应用。该粒子具备核壳型结构：内核成分为Eu³⁺γ-Fe₂O₃复合物；外壳层为SiO₂内核层中包裹荧光物质；并且在外壳层表面修饰有机官能团。通过反相微乳液法合成该纳米粒子，继而在其表面进行化学修饰使其成为能够结合探针的磁性纳米粒子。该纳米微球是集荧光指示和磁性分离为一体的生物学研究工具，在生物大分子检测和医学诊断等领域具有重要应用前景。

Description

一种磁性荧光纳米微球及其制法和应用

技术领域

本发明属纳米材料技术领域，更具体地，是涉及一种可以用于生物学的纳米材料。

背景技术

纳米科技是20世纪80年代末、90年代初发展来的前沿、交叉性新兴学科领域。它是在0.1—100nm尺度上对物质运动规律或其特性进行研究的技术，由于该技术的目标是使人类能够按照自己的意愿操纵微观世界并使他服务于人类，所以被认为是21世纪一系列高新技术的产生和发展有极具重要影响的热门学科之一，纳米材料的迅猛发展更是涉及到人类生活的各个方面。

纳米材料，又称纳米粒子(nanoparticles)，具有一些独特效应，表现出特殊的光、热、力和磁学等特性。而磁性纳米微粒除了具有高分子微粒子的特性，如共聚合、表面改性等化学反应在微球表面引入多种反应性功能基团(如—OH、—COOH、—CHO、—NH₂等)外，还可以通过共价键合生物活性物质；更重要的是，因其具有磁性，可在外加磁场的作用下方便地分离靶物质。它给目标生物产品的分离带来了革命性的发展，而且由于其在磁场环境可以快速富集，因此为实现靶向性给药提供了可能。

目前在众多关于纳米材料产品中，功能都是单一的，要么具有磁性，要么具有荧光，二种特性兼有者，或者说在本申请的专利中所用荧光金属铕与Y—Fe₂O₃经过处理形成的Eu³⁺Y—Fe₂O₃复合物的磁性荧光纳米微球还未见报道。

从相关资料检索结果看，已有较多的磁性纳米粒子的报道，也有荧光粒子的制作方法，但用金属铕与铁混合制成的既有荧光也有磁性的双功能磁性荧光纳米微球还未见报道。更没有将纳米粒子的表面活化，或称“表面生物功能化”，使表面可以连接核酸、蛋白质、核苷酸、氨基酸、抗体、多肽、动植物细胞、亚细胞结构、病毒、细菌等等生物大分子能力的研究。

发明内容

所要解决的技术问题

本发明需要解决的技术问题是提供一种磁性荧光纳米微球及其制备方法和应用，以克服现有技术中缺乏既有荧光也有磁性的双功能磁性荧光纳米微球，无法通过荧光物质来示踪磁性纳米材料的缺陷。

技术方案

本发明的内容之一是提供一种磁性荧光纳米微球，具备内核和外壳的核壳型结构，其组成包括：内核成分为Eu³⁺Y-Fe₂O₃复合物；外壳层为SiO₂。

上述的磁性荧光纳米微球的一种优选方案为，所说的微球外壳层表面为氨基或巯基的修饰层。

上述的磁性荧光纳米微球的另一种优选方案为，所说的微球粒径为50-100nm。最优选为所说的微球平均粒径为97.5nm。

本领域的普通技术人员无需特别的实验即可理解，制备所说的外壳层成分除了SiO₂外还可以是其它无机包裹层，例如氨基硅烷、巯基硅烷，也可以是有机包裹层，例如糖苷、蛋白质等。较佳地，选用外壳成分是二氧化硅。

本发明的内容之二是提供一种磁性荧光纳米微球的制备方法，依次包括如下步骤：

(1)将二价铁离子与金属铕离子溶液混合，搅拌滴加NaOH溶液，其中铁离子、铕离子和NaOH的摩尔比为3：2：5，所得沉淀经陈化、过滤、洗涤、干燥、研磨，获得Eu³⁺Y-Fe₂O₃复合物；

(2)Triton X-100、正己醇和环己烷按1：1：4摩尔数比例混合，超声处理成均匀透明稳定的微乳液，加入Eu³⁺Y-Fe₂O₃复合物，超声处理后在上清中依次滴加氨水、加入正硅酸已脂，搅拌反应12小时，静置，所得沉淀的粒子经反复清洗后煅烧，即得磁性荧光纳米微球；

上述的磁性荧光纳米微球的制备方法的一种优选方案为，所说的步骤还包括：

(1)将权利要求5制得的磁性荧光纳米微球加入醇溶液中，超声处理；

(2)将N-(2-胺乙基)-3-氨基丙基三甲基硅烷加入混合液中，超声处理反应；

(3)将反应获得的粒子洗涤、干燥即得。

上述的磁性荧光纳米微球的制备方法的另一种优选方案为，所说的步骤还包括：

(1)将权利要求5制得的磁性荧光纳米微球加入到乙酸和乙醇的缓冲液中，超声处理；

(2)将3-巯基丙三基甲氧基硅烷加入到混合液中，混匀反应；

(3)将反应获得的粒子洗涤、干燥即得。

上述的磁性荧光纳米微球的制备方法的又一种优选方案为，所说的二价铁离子为硫酸亚铁或氯化亚铁或两者组合，铕离子为氯化铕。优选所说的二价铁离子为FeSO₄.7H₂O和FeCl₂.6H₂O。

本领域的普通技术人员无需特别的实验即可理解，所说的修饰剂为硅烷类修饰剂，但并不限于上述的几种。对于选定的外壳成分，一般技术人员可根据现有技术选用合适的外壳层形成剂。例如当外壳成分为二氧化硅时，可选用正硅酸乙酯或其它合适的外壳层形成剂。

本发明的内容之三是提供一种上述的磁性荧光纳米微球在生物材料检测和分离纯化中的应用上述的磁性荧光纳米微球的应用。

优选将所说的羧基或者巯基通过化学键与核酸、蛋白质、核苷酸、氨基酸或者其衍生物结合，制备纳米荧光探针进行示踪，并且利用该探针的磁性进行生物分子的分离纯化。

上述的磁性荧光纳米微球的另一种应用为，所说的氨基或者巯基与动植物细胞或者亚细胞结构或者病毒颗粒结合，制备纳米荧光探针进行示踪，并且利用该探针的磁性进行细胞或亚细胞结构的分离纯化。

有益效果

1、本发明通过在磁荧光纳米球(magnetic fluorescence nanometerbeads，MFNB)表面修饰连接某些化学活性集团(—OH、—COOH、—CHO、—NH2等)，键合生物活性分子(抗体、核酸等)，通过这些活性分子的靶向性到达目标位点，起到探针的作用，然后通过外磁场作用，即可将目标物质分离出来。所以MFNB的优点是集指示和分离为一体的生物学研究工具。在实际应用过程中，先以荧光特性确定生物材料中有无所需的物质，再用外加磁场加以分离靶物质，进而深入研究。

2、本发明的磁性荧光纳米微球与现有技术中荧光示踪物质相比，可以使材料不但具备荧光标记能够方便地指示，还具备强顺磁性，通过氨基或者巯基化学键与核酸、蛋白质、核苷酸、氨基酸或者其衍生物结合，乃至与动植物细胞或者亚细胞结构或者病毒颗粒结合，其生物应用功能大大扩展。

3、本发明的磁性荧光纳米微球其外壳层采用二氧化硅这一无毒、具有生物相容性的材料，使应用于生物化学领域成为可能。

4、本发明的制备方法采用成本低廉的有机荧光物质、外壳形成剂等，使得实际大规模生产具有可行性。

5、采用纳米颗粒包裹荧光物质和修饰羧基或者巯基，可以有效的发挥纳米材料的表面积优势，提高生物反应的效率、加快反应时间，同时减小反应体系的总量，使得进行微量检测和微量反应简便易行。

6、本发明的磁性荧光纳米微球对于纳米水平上的生物材料的理化性质的研究提供了基础，同时进一步提供了扩大应用的可能性。

7、在本发明的纳米粒子上连接核酸、蛋白质、核苷酸、氨基酸、抗体、多肽、动植物细胞、亚细胞结构、病毒、细菌等等，具有应用于各类分子的检测和疾病的示踪治疗的前景。

附图说明

图1是扫描电子显微镜放大3万倍的MFNB

图2是扫描电子显微镜放大2万倍的MFNB

图3是扫描电子显微镜放大3万倍测得MFNB大小

图4是扫描电子显微镜放大4万倍测得MFNB大小。从扫描电镜所测的MFB平均粒径为97.5。提示本申请在实施方案中所用共沉法制作的磁性荧光纳米微球粒径已达比较标准的纳米级。

图5是MFNB-NH2对牛血清白蛋白的分离效果曲线图，纵座标为吸光值，横座标为MFNB-NH2浓度。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如：化工产品手册，或按照制造厂商所建议的条件。所有无机化学试剂和有机溶剂购自上海化学试剂厂，RE₂O₃(>99.95％)购自上海跃龙有色金属有限公司，N-(2-胺乙基)-3-氨基丙基三甲基硅烷(AEAPS)、3-巯基丙三基甲氧基硅烷(MPTS)购自Sigma公司。

实施例1

Eu³⁺Y-Fe₂O₃的制备配制：

0.2mol/L FeSO₄.7H₂O、0.2mol/L FeCl₂.6H₂O和0.2mol/L EuCl₂.6H₂O的混合溶液，边搅拌边向其中滴加2.5mol/L的NaOH溶液(终浓度为FeCl₂：FeSO₄.：EuCl₂：NaOH＝1：2：2:5)。所得沉淀在65℃下陈化2.5h。过滤并反复用ddH₂O洗涤，65℃下干燥24h，置于玛瑙研钵中研磨，所得产物为Eu³⁺Y-Fe₂O₃复合物。

SiO2包裹Eu³⁺Y-Fe₂O₃：

Triton X-100，正己醇，环己烷按1：1：4比例混合，超声处理成均匀透明稳定的微乳液，加入0.1g的Eu³⁺Y-Fe₂O₃复合物，超声30min后，取上清液置三角烧瓶中，置于25℃的恒温水浴中搅拌30min.依次向体系中滴加28％的氨水1ml，搅拌30min，加入正硅酸已脂1ml，搅拌反应12h，静置过夜。所得沉淀的粒子在外磁场中用乙醇反复清洗后，650℃煅烧2小时。此产物为磁荧光纳米微球(magnetic fluorescence nanometer beads，MFNB)。

在磁荧光微球表面修饰氨基(MFNB-NH₂的制备)：

取20mg二氧化硅包裹的磁荧光纳米微球，加入到30ml的甲醇和20ml丙三醇的混合液中，超声处理40min，再取1.5ml AEAPS[N-(2-胺乙基)-3-氨基丙基三甲基硅烷]加入混合液中，超声处理40min，使溶液混合均匀。在90℃的反应条件下反应4小时。然后取出粒子分别用甲醇和水洗涤3-4次，在150度下真空干燥约2小时，收集粒子并将其配制为2μg/ml的悬液。

在磁荧光微球表面修饰巯基(MFB-SH的制备)：

将20mg的MFNB加入到的乙酸和乙醇(1：1)的缓冲液(pH＝4.5)中，超声处理混匀，再取1ml的3-巯基丙三基甲氧基硅烷(MPTS)加入到1：1乙酸和乙醇缓冲液中混匀。将上述两种混合液合为1体，在22℃反应1.5h，取出粒子，用乙酸和乙醇缓冲液清洗三次后，150℃真空干燥2h.收集表面已加有巯基的MFNB。

实施例2

实施效果

经过实施例1中几个步骤进行处理的Eu³⁺Y-Fe₂O₃复合物，经过扫描电子显微镜观察，测定磁性荧光纳米球的粒径相对均匀，粒子表面光洁。可作为载体和探针用于研究。见图1-4。

实施例3

氨基修饰的荧光纳米粒子应用于核酸分离

取1～3mg如实施例1制备的表面修饰氨基的磁性荧光纳米微球，加入到pH为7.0～8.0的磷酸盐缓冲体系中，加入用量为50～200μL交联剂如戊二醛等等，形成混合溶液。所述的混合溶液用超声波处理10～30分钟。在适当的温度条件下，反应4～6小时。离心分离去除上清后，然后用磷酸盐缓冲液超声洗涤2～3次后，重新将粒子分散于磷酸缓冲溶液。

取一定量的Oligo(dT)，按照常规方法与上述微球进行交联反应。磁性分离去除上清液，用磷酸缓冲溶液洗涤1～2次，最后得到连有Oligo(dT)的磁性荧光纳米微球备用。

将上述纳米微球，加入到正常人类白细胞裂解液中，在RNase存在下进行常规Oligo(dT)和mRNA的杂交反应。停止反应后充分洗涤，利用磁性分离带有mRNA的纳米微球，以核酸染色剂染色，在荧光显微镜下观察分离效果。并且利用RT-PCR检测mRNA的磁性纯化效果。

结果显示，显微镜下荧光与核酸染色剂位置一致，表明mRNA分离效果良好；RT-PCR检测mRNA结果显示纯化后的核酸纯度大于80％，纯化效果达到预期。

实施例4

MFNB-NH₂对牛血清白蛋白的分离效果

将同一浓度(20μg/ml)的牛血清白蛋白加入不同浓度(10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml)的MFNB的分离管中，37℃温度孵箱中反应15min后，在外磁场的作用下，用PBS洗涤3次，酶标仪上测280nm的吸收值(见附图5)。实验结果提示，A280nm的光吸收值随MFNB吸附的牛清白蛋白的量的多少，A值也在不断增加，二者呈现正比关系。经相关分析，具有显著相关性(r＝0.996，p<0.001)。为了排除MFNB的对蛋白质分离效果的干扰，本次实验中另设MFNB实验组以资对照。从附图5可知，MFNB在280nm处，确有一定的紫外吸收作用，但不影响MFNB对蛋白质的分离功能。

Claims

1.一种磁性荧光纳米微球，具备内核和外壳的核壳型结构，其组成包括：内核成分为Eu³⁺Y-Fe₂O₃复合物；外壳层为SiO₂。

2.根据权利要求1所述的磁性荧光纳米微球，其特征在于，所说的微球外壳层表面为氨基或巯基的修饰层。

3.根据权利要求1或2所述的磁性荧光纳米微球，其特征在于，所说的微球粒径为50-100nm。

4.根据权利要求2所述的磁性荧光纳米微球，其特征在于，所说的微球平均粒径为97.5nm。

5.一种磁性荧光纳米微球的制备方法，依次包括如下步骤：

(2)曲拉通X-100、正己醇和环己烷按1：1：4摩尔数比例混合，超声处理成均匀透明稳定的微乳液，加入Eu³⁺Y-Fe₂O₃复合物，超声处理后在上清液中依次滴加氨水、加入正硅酸己酯，搅拌反应12小时，静置，所得沉淀的粒子经反复清洗后煅烧，即得磁性荧光纳米微球。

6.根据权利要求5所述的磁性荧光纳米微球的制备方法，其特征在于，所说的步骤还包括：

(2)将N-(2-氨乙基)-3-氨基丙基三甲基硅烷加入混合液中，超声处理反应；

(3)将反应获得的粒子洗涤、干燥即得磁性荧光纳米微球。

7.根据权利要求5所述的磁性荧光纳米微球的制备方法，其特征在于，所说的步骤还包括：

(2)将3-巯基丙三基甲氧基硅烷加入到混合液中，混匀反应；

(3)将反应获得的粒子洗涤、干燥即得磁性荧光纳米微球。

8.根据权利要求5所述的磁性荧光纳米微球的制备方法，其特征在于，所说的二价铁离子来自硫酸亚铁或氯化亚铁或两者组合，铕离子来自氯化铕。

9.根据权利要求5所述的磁性荧光纳米微球的制备方法，其特征在于，所说的二价铁离子来自FeSO₄.7H₂O和FeCl₂.6H₂O。

10.一种权利要求1或2所述的磁性荧光纳米微球在生物材料检测和分离纯化中的应用。