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CN1864738A - 一种治疗冠心病心绞痛的药物 - Google Patents

一种治疗冠心病心绞痛的药物 Download PDF

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CN1864738A
CN1864738A CNA200510011743XA CN200510011743A CN1864738A CN 1864738 A CN1864738 A CN 1864738A CN A200510011743X A CNA200510011743X A CN A200510011743XA CN 200510011743 A CN200510011743 A CN 200510011743A CN 1864738 A CN1864738 A CN 1864738A
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Abstract

一种治疗冠心病心绞痛的药物，由黄芪、丹参、葛根、淫羊藿、姜黄组成。制备方法是：a)将黄芪、丹参和葛根加乙醇提取，合并醇提液，滤过，滤液回收乙醇至无醇味；b)姜黄用水蒸汽蒸馏提取挥发油，滤过，水溶液留用；挥发油用β－环糊精包结，搅拌1－2小时，静置、滤过、干燥；c)步骤b滤过的药渣和淫羊藿混合后加水煎煮，合并煎液，滤过；d)步骤c中的滤液和步骤b中经过提取发油后的水溶液混合，浓缩，放置至室温，取上清液；e)步骤a的滤液和步骤d的上清液合并，浓缩，干燥，粉碎成细粉，与挥发油包结物混合后加入甜味剂和稀释剂混匀。

Description

一种治疗冠心病心绞痛的药物
技术领域
本发明涉及一种药物，具体地涉及一种治疗心绞痛的药物。
本发明还涉及上述药物的制备方法。
本发明还涉及上述药物在制备治疗冠心病心绞痛的药物中的应用。
背景技术
冠心病是临床最常见的疾病之一，在国内一直占据疾病引起死亡的前三位，根据流行病学调查，近年来我国冠心病发病率和病死率有有明显升高趋势。因此，冠心病的预防和治疗的研究一直被我国列入国家重点医学科技攻关项目。冠心病是在诸如高血压、高血脂等多种危险因素作用下，冠状动脉发生并形成粥样硬化病灶，使冠状动脉腔径狭小或阻塞，而引起心肌缺血至坏死的严重疾病。冠心病心绞痛是冠心病的主要疾病类型，因此，冠心病的治疗中最主要的是冠心病心绞痛。冠心病心绞痛目前的临床治疗主要是西药治疗，如扩张血管药物、钙拮抗剂、抗血小板集聚等治疗和预防药物为主，但多数是缓解临时症状的药物，不能起到从根本上治疗冠心病心绞痛的作用，而治疗冠心病心绞痛的中成药多数为单纯活血化瘀或益气活血的药物，但实际临床上冠心病心绞痛患者除了表现有气虚血瘀表现外，往往还兼有肾虚的表现，尤其是冠心病心绞痛多数是中老年人，因此，在治疗用药上应该兼顾肾虚表现的用药，而市场上缺乏此类药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗冠心病心绞痛的药物。
本发明的又一目的在于提供制备上述药物的方法。
本发明的还一目的在于提供上述药物在制备治疗冠心病心绞痛的药物中的应用。
为实现上述目的，本发明提供的治疗冠心病心绞痛的药物，是由下述重量配比的原料制成的药剂：
黄芪550-700；丹参350-430；葛根350-430；淫羊藿240-320；姜黄120-220。优选各原料的重量配比是：黄芪667；丹参400；葛根400；淫羊藿300；姜黄200g。
所述的药剂是任何一种药剂学上所说的剂型。优选的药剂是颗粒剂。
本发明提供的上述药物的制备方法，步骤有：
a)将黄芪、丹参和葛根加50-70％的乙醇4-6倍量提取2-4次，每次1-1.5小时，合并醇提液，滤过，滤液回收乙醇至无醇味；
b)按姜黄的重量加水6-8倍，水蒸汽蒸馏2-6小时提取挥发油，滤过，水溶液留用；挥发油用β-环糊精包结，其中挥发油∶β-环糊精＝1∶6-1∶8体积比，40-60℃包结，搅拌1-2小时，静置、滤过、35-40℃干燥；
c)步骤b滤过的药渣和淫羊藿混合后加水煎煮1-3次，每次加水10-14倍量，煎煮0.5-1.5小时，合并煎液，滤过；
d)步骤c中的滤液和步骤b中经过提取发油后的水溶液混合，于50-60℃浓缩至相对密度在50℃时为1.05-1.10，放置至室温，取上清液；
e)步骤a的滤液和步骤d的上清液合并，于50-60℃浓缩至相对密度在50℃时为1.25-1.30，70-80℃干燥，粉碎成细粉，与挥发油包结物混合后加入细粉重量1.0-2.0％的甜味剂和细粉重量0.5-1倍量的稀释剂，混匀。
所述为甜叶菊苷、甜菜碱、阿司帕坦、甘草甜素或糖精钠；优选阿司帕坦。
所述为淀粉、糊精或乳糖；优选糊精。
所述步骤a中的乙醇浓度为50％。
所述步骤a中的乙醇加入量为6倍。
所述步骤a中的乙醇提取时间为1.5小时。
所述步骤b中水蒸汽蒸馏时间为5-6小时。
所述步骤b中挥发油∶β-环糊精＝1∶8体积比。
所述步骤c中加水量为12倍。
所述步骤c中煎煮次数为3次。
所述步骤c中每次煎煮时间为0.5小时。
所述步骤d中的上清液是经过10000rpm离心的澄清液。
所述步骤e中加入的甜味剂量是细粉重量的2.0％。
所述步骤e中加入的稀释剂量是细粉重量的1倍。
所述步骤e得到的产品用浓度为80-90％的乙醇制粒，干燥，得颗粒剂产品。
本发明提供的上述药物可以用来制备治疗冠心病心绞痛的药物。
附图说明
图1为本发明制备工艺流程示意图。
图2为实施例三各给药组犬急性心肌缺血程度(∑-ST)的比较示意图。
图3为实施例三各给药组犬急性心肌缺血范围(N-ST)的比较示意图。
图4为实施例三各给药组犬冠脉血流量变化比较示意图。
图5为实施例三各给药组犬动脉血氧含量变化比较示意图。
图6为实施例三各给药组犬静脉血氧含量变化比较示意图。
图7为实施例三各给药组犬心肌耗氧量变化比较示意图。
图8为实施例三各给药组犬血清肌酸激酶(CK)的比较示意图。
图9为实施例三各给药组犬血清乳酸脱氢酶(LDH)的比较示意图。
图10为实施例三各给药组犬血浆内皮素(ET)含量的比较示意图。
图11为实施例三各给药组犬血浆TXB2活性的比较示意图。
图12为实施例三各给药组犬血浆6-Keto-PGF1a活性的比较示意图。
图13为实施例三各给药组犬血浆6-Keto-PGFa/TXB比值变化比较示意图。
图14为实施例五各给药组犬动脉收缩压变化的比较示意图。
图15为实施例五各给药组犬心率变化比较示意图。
图16为实施例五各给药组犬冠脉流量变化比较示意图。
图17实施例五各给药组犬冠脉阻力变化比较示意图。
图18为实施例五各给药组犬左室收缩力变化比较示意图。
图19为实施例五各给药组犬左室作功变化比较示意图。
图20为实施例五各给药组犬左室内压变化比较示意图。
图21为实施例五各给药组犬左室内压最大上升速率(dp/dtmax)变化比较示意图。
图22为实施例五各给药组犬心输出量变化比较示意图。
图23为实施例五各给药组犬外周阻力变化比较示意图。
图24为实施例五各给药组犬动脉血氧含量变化比较示意图。
图25为实施例五各给药组犬静脉血氧含量变化比较示意图。
图26为实施例五各给药组犬心肌耗氧量变化比较示意图。
图27为实施例五各给药组犬心肌耗氧指数变化比较示意图。
图28为实施例五各给药组犬心肌氧利用率变化比较示意图。
具体实施方式
以下详细介绍本发明治疗冠心病心绞痛的药物的原料、制备方法，以及病理实验及结果来说明其在制药领域中的用途。
一、药物原料
黄芪：购于和义南苑药材批发部，经鉴定为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch)Bge.干燥根的饮片，符合《中国药典》2000年版一部黄芪项下有关规定。
丹参：购于和义南苑药材批发部，经鉴定为唇形科植物丹参Salviamitrowhiza Bge.干燥根及根茎的饮片，符合《中国药典》2000年版一部丹参项下有关规定。
葛根：购于和义南苑药材批发部，经鉴定为豆科植物甘葛藤Puerariathomsonii干燥根的饮片，符合《中国药典》2000年版一部葛根项下野葛的有关规定。
淫羊藿：购于和义南苑药材批发部，经鉴定为小檗科植物箭叶淫羊藿Epimedium sagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim.干燥地上部分。符合《中国药典》2000年版一部淫羊藿项下有关规定。使用时应除去粗梗与杂质。
姜黄：购于和义南苑药材批发部，经鉴定为姜科植物姜黄CurcumaLonga L.的干燥根茎的饮片。符合《中国药典》2000年版一部姜黄项下的各项规定。
本发明的药物中以黄芪为君药，味甘微温，归脾肺经，善于补气升阳，气行则血行，气滞则血凝，故补气又能行滞。黄芪以其益气升阳兼行血滞，针对阳气不足，心血瘀阻而设，故为本方君药。现代研究表明黄芪对心血管系统作用：1)正性肌力作用：临床研究表明黄芪有显著强心作用。能提高心排量，心脏指数，每搏量及，每搏指数。黄芪强心作用机制可能在于对心肌磷酸二酯酶(PDE)的抑制，从而升高cAMP量，激活了依赖cAMP的蛋白激酶，使钙通道膜蛋白磷酸化，导致内流增加；同时细胞内cAMP的增加也能促进肌浆网释放Ca++，导致心肌细胞的兴奋—收缩偶联过程增强，使心肌收缩增加。2)降压作用：黄芪降压作用较缓慢，持久，其机制主要对血管的直接扩张。3)抗心肌缺血，心率失常及心肌保护作用：黄芪可扩张冠脉，增加心肌血流。黄芪能抑制急性坏死心肌之血清肌酸磷酸激酶(Cpk)的升高，而表明对心肌缺血坏死有保护作用。黄芪能拮抗氯化钙及氯仿诱发大鼠的心率失常。黄芪还有显著的心肌保护作用，增强心肌细胞对损伤的耐受力。4)黄芪能抑制血小板功能，特别是黄芪和丹参和用能协同抑制血小板凝集。最新文献报道黄芪有较好的促进血管生成作用。这对冠心病心肌缺血治疗有很好的前景。
丹参：功能活血祛瘀，而性较平和，能祛瘀生新而不伤正。是治疗冠心病的常用药。现代药理研究表明丹参对心血管系统的功能：1)扩张冠状动脉，增加冠脉血流量。2)丹参能改善微循环，使血流速度及流量增加。3)丹参能使全血粘度和血清、血浆、纤维蛋白比粘度降低，红细胞电泳速度加快。4)用ADP诱导血小板聚集，丹参有抑制和解聚作用。5)耐缺氧作用：以心电图变化为指标，丹参能预防和对抗垂体后叶素引起的心肌急性缺氧性T波高耸和S-T段抬高。6)抗脂质过氧化和清除自由基的作用：临床上冠心病患者经丹参治疗后血清LPO含量明显降低。因此，清除有害的自由基，防止或减轻脂质过氧化反应，是丹参防治心脑血管病的作用机制之一。7)对缺血心肌保护作用，丹参对缺血心肌保护作用机制：增加冠脉血流，改善微循环，促进侧枝循环开放，抗血小板聚集，促进纤溶，降低血液粘稠度，提高缺氧耐受力，抗脂质过氧化，清除有害自由基，同时能调节血液在体内重新分布，有利于心脏血液供应。实验证明：丹参可使心肌毛细血管内皮变性，坏死，血流瘀滞，血栓形成等病变明显减轻；吞噬细胞活跃，坏死心脏残片减少，成纤维细胞分裂程度和间质增生程度明显，并促进梗死区心肌细胞再生。
丹参能显著降低血清胆固醇三酰甘油，高密度脂蛋白，低密度脂蛋白和主动脉壁胆固醇含量，减少主动脉粥样硬化病灶面积和降低动脉内膜通透性。
葛根：能升发阳气，鼓舞脾胃清阳之气，又有活血功能。现代药理研究：1)对循环系统作用：(a)扩张冠状动脉，增加冠脉血流量。(b)降低心肌耗氧量。改善急性心肌梗死区心肌的氧代谢，降低梗死区的心肌氧消耗，增加心肌对缺血的耐受性。(c)抗心律失常作用：葛根能预防氯化钡所致的心律失常。(d)降压作用：葛根有显著的降压作用的β受体阻断药。2)降血糖作用。葛根的作用较广泛，可降低心肌耗氧量，使冠脉血流量增加，明显缓解心绞痛，抗心律失常，抗氧化，增强机体免疫力，降血糖作用。
淫羊藿：补肾壮阳，益精健骨，以其补益肾阳以充养心阳，可达通阳宽胸，缓解疼痛作用，配伍丹参，宁心安神，可治疗心悸不宁。现代药理研究：1)增加冠脉血流量，改善心肌供血作用。2)降低血脂、血糖、抑制血小板聚集，降低血液粘稠性作用。
姜黄：能活血行气，使瘀滞通而痛解，用于血瘀气滞，胸阳不通，心脉闭阻，心胸闷痛或刺痛。现代药理研究：1)姜黄有保护缺血心肌作用。2)降低血液粘滞性，抑制血小板聚集，增加纤溶性作用。3)显著的降血脂作用。
综上述，本方黄芪为君药，丹参、姜黄为臣药，葛根、淫洋藿为佐药。相互配伍，益气活血，补肾助阳，治疗胸痹，阳气不足，心血瘀阻证。结合现代研究，发挥中药多途径、多环节治疗冠心病、心绞痛优势。1)对冠心病发病危险因素有预防和治疗作用，如高血压、高血脂糖尿病等。2)从改善心功能方面：增加冠脉血流量，改善心肌供血，降低心肌耗氧量，降低血液粘滞。3)从冠心病病理方面：阻止冠心病病变血管发展，促进侧枝循环建立。
二、制备工艺的确定
黄芪其醇溶性比水溶性好，故确定用乙醇提取。
丹参溶于醇，为保证疗效，采用醇提。葛根的醇提取物、总异黄酮、大豆苷元和葛根素均有明显的扩张冠状动脉的作用(《范礼理等，中华医学杂志，1975；55(10)：724》、《范礼理等，药学学报，1984；19(11)：801》)、根醇提取物、总异黄酮、大豆苷元和葛根素均有明显的对抗垂体后叶素引起的急性心肌缺血(《中国医学科学院药物研究所，医学研究通讯，1972；(2)：14》)和具有明显的预防乌头碱和氯化钡诱发的心律失常作用(《范礼理等，第二届全国心血管药理学术会议会议资料，武汉；1983：11》)。故确定葛根用乙醇提取。
淫羊藿主要含有淫羊藿苷等黄酮苷类化合物，溶于水。药理研究表明：淫羊藿水煎液能明显提高性机能，并增加附性器官重量，提高血浆睾酮含量(《牛锐，中国中药杂志，1989；(9)：18》)。还能提高大鼠尿中17-酮含量，提示可能具有提高肾上腺皮质功能的作用(《刘宝庆等，中草药，1980；11(5)：201》)。故淫羊藿宜用水煎提取，醇沉精制。
姜黄主要含有挥发油等成分，而且含量较高，应提取姜黄挥发油，挥发油用β-环糊精包结后，加入制剂中。为保证疗效，提油后的药渣再和淫羊藿共同煎煮提取。
三、制备工艺条件的优选
1.黄芪等药醇提工艺参数的优选：
上述药物采用混合醇提，鉴于醇提时间和醇提次数相关：如每次提取1.5小时，提取2次总时间即为3小时，提取3次总时间即为4.5小时，实际相当于一个因素。如果把提取时间和提取次数作为两个因素，放在一个正交表中进行试验进行优选，交互作用太大，则结果就不可信了。故固定提取时间为1.5小时，优选提取次数，采用三因素三水平正交试验。
称取黄芪20g、丹参12g、葛根12g，混合，共称9个样品，分别按照表1的因素水平、表2的正交试验安排进行回流提取，提取液分别浓缩、干燥，得9个醇提物，分别按下述方法测定黄芪甲苷的含量：
含量测定：照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VI B)测定。
取提取物约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加2％氢氧化钾甲醇溶液50ml，轻轻摇匀，称定重量，加热回流3小时，放置至室温，再称定重量，补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25ml，蒸干，残渣加水25ml使溶解，并转移至分液漏斗中，用氯仿-正丁醇(2∶1)混合溶液提取4次，每次25ml，合并提取液，以1％磷酸二氢钾水溶液洗涤2次，每次30ml，弃去，合并提取液，蒸干，放冷，残渣用甲醇溶解并转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另精密称取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VI B)试验，精密吸取供试品溶液5ul，对照品溶液1ul与3ul，分别交叉点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水(13∶6∶2)10℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在100℃加热至斑点显色清晰，取出，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定，照薄层色谱法(《中国药典》2000年版一部附录VI B薄层扫描法)进行扫描。波长：λS＝530，λR＝700，测定供试品峰面积与对照品峰面积，计算每个干膏中黄芪甲苷的含量，换算成相当于黄芪生药中的含量，并对结果进行方差分析，结果见表2、3。
表1、因素水平表
  水平   A(醇浓度％)   B(提取次数)   C(加醇倍数)
  123   506070   234   456
注：每次提取时间固定为1.5小时。
表2、黄芪等药醇提正交试验数据表
  试验号   A   B   C   D   黄芪甲苷含量％(g/100g黄芪)
  123456789   111222333   123123123   123231312   123312231   0.130.120.150.090.110.110.110.110.11
  K1   0.4   0.33   0.35   0.35
  K2K3   0.310.33   0.340.37   0.320.37   0.340.35   CT＝0.12018
  RjSj   0.090.00149   0.040.00029   0.050.00042   0.010.00002
表3、方差分析表
  来源   Sj   自由度   均方差   F比   显著性
  ABCE   0.001490.000290.000420.00002   2222   0.0007450.0001450.000210.00001   74.514.521   **
*：F1-0.05(2，2)＝19.0    **：F1-0.01(2，2)＝99.0
表3结果表明：A、C因素对结果有显著影响，选A1C3，B对结果无明显影响，结合直观分析和生产实际，选B2，故最佳条件为：A1B2C3，也即：加50％的乙醇提取3次，每次1.5小时，加醇6倍量。
2.姜黄挥发油的提取与β-环糊精的包结
1)挥发油提取条件的优选：
A.粉碎度对挥发油提取的影响试验：称取姜黄200g，共三个样品，其中两个分别粉碎为8目的粗颗粒和20目的细颗粒，三个样品分别进行水蒸气蒸馏8个小时，每小时计录一次出油量，结果见表4。
表4  不同粉碎度的药材挥发油出油量数据表
  粉碎度   1hr   2hr   3hr   4hr   5hr   6hr   7hr   8hr
  饮片粗颗粒(8目)细颗粒(20目)   3.14.24.8   4.25.05.5   5.15.86.3   5.86.56.7   6.36.86.9   6.76.97.0   6.86.97.0   6.86.97.0
由表4可知：粉碎度对挥发油的提取影响不大，考虑到实际生产中细粉多易糊锅、过滤难等因素，确定以饮片直接提取挥发油。
B.浸泡时间对提取挥发油的影响试验：称取姜黄200g，共三个样品，各加8倍量水分别浸泡0、2、4小时，再提取6小时，结果见表5。
表5：浸泡对挥发油提取的影响数据表
  实验号   样品重(g)   浸泡时间(h)   挥发油得量(ml)
  123   200200200   024   6.96.97.0
实验结果表明：浸泡对提取挥发油有影响不大，故工艺中采用不浸泡的方法提取挥发油。
C.挥发油提取时间考察试验：称取姜黄200g，加8倍量水，进行水蒸汽蒸馏提取挥发油，并记录每小时的出油量。结果见表6。
表6：挥发油提取时间优选数据表
  提取时间(h)   1   2   3   4   5   6   7
  出油量(ml)   3.1   4.5   5.7   6.2   6.7   6.8   6.8
以上结果表明，药材提取6小时，挥发油已基本提尽，因此，挥发油的提取时间定为6小时。
D.挥发油提取率考察试验：
按处方比例取五药共600g，按上述方法进行水蒸汽蒸馏试验，共三批，计算挥发油收率，结果见表7。
表7：挥发油收率试验数据表
  批次  投料量(g)   得油量(ml)   挥发油收率(‰)
  123   600600600   17.216.817.5   2.872.802.92
由表7可知，挥发油的收率一般为2.8％以上。故暂定挥发油的收率应不低于2.5％。
2)β-环糊精包结挥发油的正交试验
按L9(34)正交表进行试验，考察了挥发油与β-CD的比例、包结温度、搅拌时间3个因素每个因素3个水平(见表9)，采用水蒸馏法，以包结物的挥发油回收率为指标，优选最佳包结条件，实验结果及分析见表9、10。
A.包结物的制备：按L9(34)正交试验设计方案(见表8、9)的要求，分别称取β-CD9份，加入适量蒸馏水，在水浴中加热溶解，制成9个不同浓度的β-CD饱和水溶液，分别放至表8中各自水平的温度后，在不断地搅拌下各加入挥发油2ml，继续搅拌规定时间后，取出，冷藏24小时，抽滤，干燥(35-40℃)，得白色粉末状包结物。
B.包结物中挥发油的测定：取9个包结物，分别置圆底烧瓶中，加入蒸馏水，连接挥发油测定器。按《中国药典》2000年版一部附录挥发油测定项下操作，放置30分钟，读取挥发油体积，以下式计算包结物中挥发油回收率。
C.空白对照：精密量取挥发油2ml，置圆底烧瓶中，加入蒸馏水300ml，按上法蒸馏挥发油，计算空白回收率。空白对照共蒸馏出挥发油1.8ml，故空白回收率为90％。
表8：因素水平表
表9：试验安排与结果
试验号   1A   2B   3C   4空白   挥发油回收率(％)
  12345678   11122233   12312312   12323131   12331223   77.870.877.877.872.286.166.786.1
  9   3   3   2   1   81.9
  K1K2K3   226.4236.1234.7   222.3229.1245.8   250.0230.5216.7   231.9223.6241.7 CT＝54009.8
  Sj   18.3   97.4   186.6   54.7
由于SA＜Se，故SA与Se合并计算误差项，方差分析结果见表10。
表10：方差分析表
  方差来源   离差平方和   自由度   均方差   F比   显著性
  BC误差(A+e)   97.4186.673.0   224   48.793.318.3   2.75.1   P＞0.05P＞0.05
注：F1-0.05(2，4)＝6.94；F1-0.01(2，4)＝18.00。
由表10可知，A、B、C三因素对结果均无显著性影响。
结论：根据直观分析和上述方差分析的结果，结合实际生产中可操作性的具体情况，确定挥发油-β-CD的比例为1∶8，包结温度60℃(若再高，挥发油易挥发)，搅拌1小时即可。
3、淫羊藿等药水煎工艺参数的优选
称取淫羊藿90g，和60g姜黄提油后的药渣混合，共9个样品，分别按表10的因素水平和表11的正交试验设计参数进行煎煮、滤过、浓缩、干燥，得9个水提物，按下述方法测定水提物中淫羊藿苷的含量：
含量测定：按照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(30∶70)为流动相；检测波长270nm。理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备：精密称取110℃干燥至恒重的淫羊藿苷对照品适量，加甲醇制成每ml含0.1mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取提取物约0.2g，研碎，精密称定，置100ml锥形瓶中，精密加70％乙醇25ml，称定重量，超声处理60分钟，放置至室温，再称定重量，用70％乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密吸取续滤液10ml，蒸至1ml通过聚酰胺柱(内径1.5cm，长9cm，聚酰胺13-30目4g，以水100ml预洗)，先以水150ml洗脱，弃去，再以70％乙醇150ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇定量转移至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液5μl；供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，计算提取物中淫羊藿苷的含量，换算为相当于淫羊藿生药中的含量，进行方差分析，结果见表11、表12、表13。
表11.因素水平表
  水平   A(提取时间)  B(煎煮次数)  C(加水倍数)
  123   0.5h1.0h1.5h  123  101214
表12.淫羊藿等药水煎正交试验数据表
  试验号   A   B   C   D   淫羊藿苷含量％(g/100g淫羊藿)
  123456789   111222333   123123123   123231312   123312231   0.250.490.520.220.390.480.250.350.48
  K1K2K3   1.261.091.08   0.721.231.48   1.081.191.16   1.121.221.09 CT＝(∑Yi)2/9＝1.3072
  RjSj   0.180.0068   0.760.1000   0.110.0022   0.130.0031
因为C因素的S值比D因素的S值还小，故采用二者联合估计误差。
表13.方差分析表
  来源   Sj   自由度   均方差   F比   显著性
  ABE   0.00680.10000.0053   224   0.00340.05000.0013   2.6238.46 **
*：F1-0.05(2，4)＝6.94；**：F1-0.01(2，4)＝18.0
结果表明：B因素对结果有极显著影响，选B3，A和C因素对结果无明显影响，结合直观分析和生产实际，选A1C2，最佳条件为A1B3C2。也即：加水12倍量，煎煮3次，每次煎煮0.5小时。
四、浓缩、干燥方法的研究：
1.浓缩方法：减压浓缩，条件为：压力-0.06mpa温度：60℃。
2.干燥方法：减压干燥，条件为：压力-0.1mpa温度：80℃，8小时。
3.干膏收率考察试验：
为了考察醇提、水提后出膏率的情况，按制法项下方法进行了三批提取试验，结果见表14。
表14.三批出膏率考察试验数据表
  批号   投料量(Kg)   出膏量(Kg)   出膏率(％)
  001126001128001130   5.95.95.9   1.5351.5011.485   26.0225.4425.17
根据上述结果，暂订出膏率不应低于24％。
五、成型工艺的研究：
1.辅料类型的选择：
(1)稀释剂的选择：中药制剂常用的稀释剂为淀粉、糊精、乳糖等。由于本颗粒剂为水溶性颗粒剂，故不能用淀粉(不溶于水)。乳糖虽然具有热水中溶解度好，但价格太高；而糊精溶于热水，吸湿性小，且价格低廉，故选糊精为稀释剂。
(2)甜味剂的选择：常用的甜味剂有：甜叶菊苷、甜菜碱、阿司帕坦(Aspartrame)、甘草甜素和糖精钠等。由于甜菜碱呈碱性，恐对成分有影响，甘草甜素为类肾上腺皮质激素类，长期服用恐影响人体电解质代谢；糖精为合成甜味剂，而甜叶菊苷甜味不正，有一点怪味，故选用阿司帕坦为甜味剂。
2.辅料用量的选择：
(1)糊精：按处方量称取药材，根据制法项下方法处理，将所得β-CD包结物和减压干燥后所得药粉混合，然后分别加入二者混合物量的1/2、1、1.5倍的糊精，混匀，分别用适当浓度的乙醇制粒，干燥。结果表明：加糊精1和1.5倍量者软材粘度适宜，易成型，颗粒性状好；而加糊精1/2倍量者，软材太粘，制粒时粘筛，颗粒吸湿变软，故确定加入药粉1倍量左右的糊精，做成10g/袋，3袋/日的颗粒剂。
(2)阿司帕坦：取按上述工艺制备的未加甜味剂的颗粒三等份，分别加入成品制剂1.0％、1.5％、2.0％量的阿司帕坦，开水冲后，1.0％量的与1.5％量的口感较苦，2.0％量的尚可，故选用加入成品制剂的2.0％量的阿司帕坦。
3.成型参数：用82％的乙醇适量(乙醇浓度和用量可根据当时实际的温、湿度作具体调整)作为湿润剂制粒，粒度16目。
4.制剂吸湿性考察试验：按处方量称取药材，按制法项下方法制备颗粒，干燥、分装后在相对湿度为85％、40℃的条件下放置一个月，测定其水分含量和外观性状，结果见表15。
表15.制剂吸湿性考察试验数据表
  样品   水分含量(％)   性状   溶散性
  试验前试验后   3.53.6   棕黄色颗粒棕黄色颗粒   符合规定符合规定
表15结果表明：水分含量未见明显增加，外观未见明显变化，说明其吸湿性不强，稳定性良好，制剂工艺可行。
表16：三批中试数据
  批号   010815   010818   010821
  投料量(Kg)姜黄量(Kg)   19.672.0   19.672.0   19.672.0
  挥发油得量(ml)出油率(％)倍他环糊精用量(g)包结物得量(g)包结物收率(％)干膏粉得量(Kg)出膏率(％)糊精加入量(Kg)阿司帕坦加入量(g)颗粒得量(Kg)颗粒收率(％)成品袋数成品收率(％)粒度水分溶化性装量差异黄芪甲苷含量(mg/袋)   56.02.80448.0445.588.45.1726.284.182009.8598.597997.93.13.0符合规定符合规定5.02   58.82.94470.4470.989.05.0825.834.252009.7897.897297.23.42.9符合规定符合规定4.79   57.52.86460.0450.287.04.9825.324.372009.7597.596896.83.63.0符合规定符合规定4.01
实施例一、
(本发明制备的药物在以下的实施例中又称为葛仙丹)
请结合图1，为本发明制备工艺流程示意图。
姜黄200g加水8倍量，水蒸汽蒸馏6小时，提取挥发油，滤过，水溶液留用；挥发油用β-环糊精包结(挥发油∶β-环糊精＝1∶8，60℃包结，搅拌1小时，搅拌速度3000rpm)，冷藏过夜，滤过，低温干燥(40℃)；过滤的药渣和淫羊藿300g混合后加水煎煮三次，每次加水12倍量，每次煎煮0.5小时，合并煎液，滤过，滤液和上述提取挥发油后的水溶液混合后浓缩至相对密度为1.05-1.10(50℃)，放置至室温，取上清液高速离心(10000rpm)，澄清液备用。黄芪667g、丹参400g、葛根400g加入6倍重量的浓度50％的乙醇提取三次，每次1.5小时，合并醇提液，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，和药渣与淫羊藿的澄清液合并后继续浓缩至相对密度为1.25-1.30(50℃)，减压干燥，粉碎成细粉，与挥发油包结物混匀。
由于该药每日服用生药量为59g，经提取、精制、干燥后出膏率为26.3％，即每日服用提取物量为15.5g。另外还需加适量辅料才能制成稳定的制剂。鉴于服用量过大，制成片剂或胶囊剂等剂型时不如颗粒剂方便，因此再加入药粉重量2.0％的阿司帕坦和药粉1倍量的糊精，混匀，用浓度82％的乙醇制粒，干燥，得到颗粒剂1000g，分装成10g/袋、3袋/日的包装。
实施例二、葛仙丹颗粒大鼠长期毒性试验
本实施例的目的是观察大鼠长期口服葛仙丹颗粒后对机体是否产生蓄积性及迟缓性中毒反应，为临床的安全用药提供依据。
为了临床用药的安全，根据中药新药研究的有关规定，应用SD种大鼠80只，分为对照组及葛仙丹颗粒10.5g生药/kg、21g生药/kg、42g生药/kg剂量组(临床用量为59g生药/日，三个剂量组分别为临床用量的12.5、25、50倍)，连续灌胃给药三个月，观察葛仙丹颗粒对动物各项指标的影响。
1.试验材料
1-1.试验药物：葛仙丹颗粒，试验用其提取清膏，4.16g生药/ml。
1-2.试验动物：SD种大鼠(II级)80只，雌雄各半，体重85.76±5.27g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号SCXK11-00-0008。
1-3.试验仪器：ECG-6511型Cardiofax心电图机(上海)；Sysmex-F820型血球计数仪(日本)；RA-1000型全自动生化分析仪(美国)。
1-4.动物饲料配方及营养成份
大鼠饲料，由北京市朝阳区九江口饲料厂生产[京动许字(2000)第007号，总052号]。
主要成分：粗灰分8.0％食盐0.54％粗蛋白26.7.％粗脂肪6.8％粗纤维3.7％钙：1.40％总磷：0.92％。
1-5.动物的饲养条件
中国中医研究院西苑医院实验动物中心为二级动物饲养设施，京动许字(1999)第044号；北京医动字(1999)第01-4010号。室温：22～23℃，相对湿度：45～60％。
2.试验方法
2-1.动物分组、剂量，给药时间
动物随机分为四组，雌雄各半，每组20只，对照组，灌服同体积常水；葛仙丹颗粒低剂量组10.5g生药/kg；中剂量组21g生药/kg；高剂量组42g生药/kg。葛仙丹颗粒临床用量为59g生药/人/日，即0.84g生药/kg(人以70kg体重计算)，三个试验剂量组分别为临床用量的12.5、25、50倍，给药量均为10ml/kg。连续灌胃给药三个月，每周称体重并调整药量，每月最后一周连续称饲料四天，计算100克大鼠日平均摄食量。
2-2.检测项目及方法
每日观察动物给药后的反应，包括精神状态，行为活动，毛色、摄食、二便等情况。药后三个月，各组动物取10只，雌雄各半，戊巴比妥钠麻醉，心电图机记录标准II导联心电图(定标电压1∶10)，计算PR间期、QRS间期、QT间期、T波波幅、心率等指标。腹主动脉取血，全自动型血球计数仪测定血红蛋白(Hb)、红细胞总数(RBC)、白细胞总数(WBC)及分类、血小板(PLT)等血液学指标；测定凝血时间；分离血清，全自动生化分析仪测定天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、肌酐(Crea)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血糖(GLU)、总胆红素(T-Bil)、总胆固醇(TCH)等十项生化指标；解剖取心、肝、脾、肺、肾、胃、十二指肠、大肠、脑、垂体、甲状腺、胸腺、胰腺、肾上腺、子宫、卵巢、睾丸、前列腺做病理学检查，其中心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、脑、垂体、子宫、卵巢、睾丸称重，计算脏器指数。试验结果进行统计学处理，组间比较，t检验判断其显著性。各组剩余动物(10只)，于停药二周后(恢复期)同前处理。
3.试验结果
3-1.葛仙丹颗粒对动物一般状况及体重的影响
动物一般状况：给药三个月及停药两周后，各组动物食欲、二便正常，活动及精神状态良好，毛色白且有光泽，均未出现死亡。
表17结果显示，各给药组体重与对照组比较均无显著性差异。
 表17.给药前后各组体重变化        (g， x±SD)
给药时间 N   组别
  对照组   低剂量组   中剂量组   高剂量组
  药前   20   86.60±5.43   85.40±4.87   85.90±5.40   85.15±5.64
药后三个月   1周2周3周4周5周6周7周8周9周10周11周12周   202020202020202020202020   144.70±11.50214.20±33.44246.35±42.63267.80±49.59289.50±60.78320.25±68.7333.9.25±80.66350.40±90.03364.05±95.37378.75±101.88391.70±107.20399.30±107.06   144.40±11.55216.70±35.11259.55±58.15289.90±73.06304.45±75.92331.20±91.98339.05±97.05349.40±96.60364.05±106.63375.80±113.48386.10±118.30392.20±118.26   145.4±13.12221.10±36.33252.15±45.85284.50±64.67302.70±76.66319.65±85.86334.00.±92.74343.60±94.10354.25±103.74365.95±109.31378.50±115.74378.10±112.08   139.30±12.03216.50±31.21248.70±46.30273.75±55.16286.30±60.23305.85±71.64324.55±74.74337.55±79.99346.15±87.79353.90±94.05360.50±98.93372.70±101.52
  恢复期   10   411.30±127.16   407.40±123.36   409.20±114.18   410.10±114.61
3-2.葛仙丹颗粒对动物摄食量的影响，见表18。
表18.葛仙丹颗粒给药不同时间各组动物摄食量的比较
                                                             (g/100g/d， x±SD)
  分组   笼数   动物数   药后一个月   药后二个月   药后三个月
  对照组低剂量组中剂量组高剂量组   4444   24242424   7.44±1.737.25±1.377.08±0.397.61±0.28   6.41±0.845.91±1.156.21±1.836.24±1.56   5.78±0.765.57±1.205.99±1.695.85±1.55
试验结果表明，各给药组摄食量与对照组比较无显著性差异。
3-3.葛仙丹颗粒对凝血时间的影响，见表19。
表19.各给药组凝血时间的比较( x±SD)
  组别   动物数   凝血时间(s)
  药后三月   对照组低剂量组中剂量组高剂量组   10101010   118.0±3.698.40±12.66117.50±13.18118.80±9.58
恢复期   对照组低剂量组中剂量组高剂量组   10101010   117.10±12.36118.40±9.09117.30±6.96118.10±6.89
凝血时间测定结果表明，给药三个月及恢复期(停药二周)各给药组与对照组比较凝血时间无显著性差异。
3-4.葛仙丹颗粒对血液学指标的影响，见表20。
表20.各给药组血液学指标的比较         (n＝10， X±SD)
分组   RBC1012/L   WBC109/L   WBC分类(％)   HbG/L   PLT109/L
  中性   淋巴
  药后三月   对照组低剂量组中剂量组高剂量组   5.53±0.606.25±0.80*6.05±0.936.06±0.50*   7.01±2.206.79±1.487.16±1.356.56±1.43   31.61±3.6627.68±4.4328.63±3.6029.40±5.55   68.39±3.6672.32±4.43*71.37±3.6070.60±5.55   114.00±10.80113.90±11.93110.50±16.41110.70±8.93   590.00±90.09565.50±109.84572.90±105.66529.70±81.45
恢复期   对照组低剂量组中剂量组高剂量组   6.57±1.106.74±0.546.40±0.635.62±0.71   6.60±1.137.03±1.717.20±1.726.36±1.29   30.30±5.3530.18±5.1229.21±1.8129.18±3.54   69.70±5.3569.82±5.1270.79±1.8170.82±3.54   123.80±9.10121.90±7.81117.90±7.61119.30±4.27   636.30±72.50563.10±60.37606.10±43..93597.60±69.03
注：与对照组比较*P＜0.05
血液指标测定结果表明，给药三个月低剂量组RBC、中性、淋巴及恢复期PLT(停药两周)测量值在正常生理范围内波动，虽与对照组比较有显著性差异，无临床意义。给药三个月高剂量组及恢复期(停药两周)动物RBC测量值与对照组比较均亦有显著性，但为正常生理范围。
3-5.葛仙丹颗粒对血液生化指标的影响，见表21、22、23、24。
表21.各组生化指标(药后三个月)的比较(n＝10， X±SD)
分组   ALT(IU/L)   AST(IU/L)   ALP(IU/L)   BUN(mMol/L)   Cre(uMol/L)
  对照组低剂量组中剂量组高剂量组   49.50±14.2147.50±10.0953.20±18.1057.30±14.01   131.00±36.06139.80±26.02156.20±31.64154.40±34.37   67.70±33.9874.70±34.1772.10±45.8390.20±26.20   8.36±1.538.44±1.318.13±2.169.09±1.84   144.13±12.72142.18±14.92132.15±15.39132.35±11.38
表22.各组生化指标(药后三个月)的比较(n＝10， X±SD)
分组   Chol(mMol/L)   GLU(mMol/L)   T-Bili(uMol/L)   TPg/L   Albg/L
  对照组低剂量组   1.29±0.321.30±0.21   6.37±1.695.70±1.57   5.22±1.344.43±1.18   64.38±5.7364.19±3.20   31.11±4.0730.50±2.02
  中剂量组高剂量组   1.31±0.261.46±0.28   5.49±1.115.73±1.33   4.21±1.174.24±0.74   64.39±3.1465.10±2.92   30.81±2.0631.00±2.62
表23.各组生化指标(恢复期)的比较    (n＝10， X±SD)
分组   ALT(IU/L)   AST(IU/L)   ALP(IU/L)   BUNmMol/L   CreaUMol/L
  对照组低剂量组中剂量组高剂量组   47.60±11.7458.70±18.3850.60±15.2246.10±10.21   142.30±32.44164.40±45.29162.30±32.88156.10±35.03   70.90±14.4281.10±32.2684.70±37.0385.20±29.33   8.40±1.399.64±1.469.04±2.179.32±1.90   129.72±15.03129.89±16.82132.68±7.29129.53±14.46
表24.各组生化指标(恢复期)的比较 (n＝10， X±SD)
分组   Chol(mMol/L)   GLU(mMol/L)   T-Bili(uMo l/L)   TPg/L   Albg/L
  对照组低剂量组中剂量组高剂量组   1.27±0.241.47±0.251.41±0.491.50±0.34   6.95±2.216.64±2.166.68±1.636.77±1.47   5.00±1.945.19±3.605.21±2.664.97±1.15   67.03±3.9167.99±3.8969.86±9.4570.21±4.14   31.94±2.3932.17±3.3631.97±5.6233.63±2.33
血液生化学十项指标测定结果表明，给药三个月高剂量组CRE值低于对照组但在正常范围内，恢复期(停药两周)各给药组与对照组比较无显著性差异，其它各项指标均在正常范围内。
3-6.葛仙丹颗粒对心电图的影响，见表25。
表25.各组心电图的比较                                  (n＝10， X±SD)
分组   HRBeat/min   PR间期S   QRS间期S   QT间期S   T波Mv
  药后三个月   对照组低剂量组中剂量组高剂量组   362.60±50.67361.60±58.33369.10±27.57360.30±32.50   0.042±0.0060.041±0.0060.044±0.0050.042±0.008   0.027±0.0050.028±0.0040.029±0.0060.029±0.006   0.035±0.0070.037±0.0070.041±0.0060.039±0.007   0.10±0.010.10±0.010.10±0.010.10±0.01
  恢复期   对照组低剂量组中剂量组   360.10±34.67360.90±30.06360.50±36.88   0.042±0.0040.042±0.0040.044±0.005   0.028±0.0060.027±0.0050.028±0.004   0.041±0.0060.039±0.0030.041±0.006   0.10±0.010.10±0.010.10±0.01
  高剂量组   366.40±50.06   0.043±0.005   0.029±0.003   0.038±0.004   0.10±0.01
对照组与葛仙丹颗粒三个剂量组及恢复期(停药两周)各组标准II导联心电图PR间期、QRS间期、QT间期、T波波幅、心率等指标比较均无显著性差异。
3-7.葛仙丹颗粒对各组动物脏器指数的影响，见表26、27。
解剖大体观察各组动物脏器未发现异常改变，各组脏器指数无显著性差异。
表26.各组脏器指数的比较    (g/100g体重，n＝10， X±SD)
  分组   心   肝   脾   肺   肾   肾上腺
药后三个月   对照组低剂量组中剂量组高剂量组   0.314±0.0550.301±0.0410.319±0.0610.295±0.025   2.244±0.3592.244±0.2993.393±0.3802.357±0.239   0.164±0.0300.168±0.0480.162±0.0280.171±0.032   0.536±0.1280.513±0.1430.503±0.1210.478±0.073   0.297±0.0480.315±0.0400.303±0.1200.320±0.029   0.013±0.0070.010±0.0050.014±0.0080.010±0.005
恢复期   对照组低剂量组中剂量组高剂量组   0.308±0.0510.286±0.0400.300±0.0270.299±0.054   2.153±0.2612.343±0.2632.404±0.2882.265±0.231   0.168±0.0440.166±0.0230.169±0.0280.169±0.026   0.470±0.0960.424±0.1130.501±0.1120.474±0.102   0.317±0.0790.360±0.0770.314±0.0350.316±0.044   0.010±0.0050.010±0.0050.009±0.0040.010±0.004
表27.各组脏器指数的比较    (g/100g体重， X±SD)
  分组   脑   垂体   动物数   子宫   卵巢   睾丸
  药后三个月   对照组低剂量组中剂量组高剂量组   0.362±0.0670.643±0.8340.415±0.1200.399±0.097   0.002±0.0010.002±0.0010.003±0.0030.002±0.001   5555   0.175±0.0350.177±0.0480.217±0.0850.198±0.036   0.026±0.0050.028±0.0090.024±0.0070.023±0.005   0.380±0.0400.313±0.0850.371±0.0460.375±0.028
恢复期   对照组低剂量组中剂量组高剂量组   0.366±0.1070.353±0.0940.355±0.0840.359±0.087   0.002±0.0010.002±0.0010.002±0.0010.002±0.001   5555   0.164±0.0370.192±0.0620.235±0.1120.175±0.020   0.024±0.0040.030±0.0090.024±0.0070.026±0.010   0.325±0.0360.336±0.0290.333±0.0280.322±0.019
实施例三、本实施例的目的是观察葛仙丹颗粒对麻醉犬心肌缺血、心肌梗塞及相关冠脉血流量、心肌耗氧量和血液生化指标的影响。
本实施例采用心外膜电图标测心肌缺血范围及程度，定量组织学(N-BT染色法)测定心肌梗塞范围，同时测定冠脉血流量、心肌耗氧量及血清CK、LDH和血浆ET、TXB2、6-Keto-PGF1α活性的变化，研究了葛仙丹颗粒消化道给药对实验性犬急性心肌缺血、心肌梗塞及相关指标的影响。
1、实验材料
1)实验动物：健康成年犬25只，雌雄兼用，体重12.52±1.40kg，由北京市通利实验动物养殖厂提供[京动许字(2000)第010号]。
2)实验药物：葛仙丹颗粒提取清膏，4.16g生药/ml膏；合心爽(盐酸地尔硫
Figure A20051001174300261
片)，30mg/片，天津田边制药有限公司生产(批号：0010107)；0.9％氯化钠注射液，北京双鹤药业股份有限公司生产(批号：010607122)；内皮素(ET)放免药盒，北京福瑞生物工程公司(批号：0106)；血浆血栓素B2(TXB2)和6-酮-前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)放免药盒，北京福瑞生物工程公司(批号：0106)。
实验共分五组：(1)空白对照组，生理盐水3ml/kg，n＝5；(2)合心爽组，5mg/kg，n＝5；(3)葛仙丹颗粒1.0g/kg剂量组，n＝5；(4)葛仙丹颗粒2.0g/kg剂量组，n＝5；(5)葛仙丹颗粒4.0g/kg剂量组，n＝5。
上述实验药物，均在实验前用生理盐水配制成等体积(3ml/kg)，经十二指肠给药。
2、实验方法
动物经戊巴比妥钠(30mg/kg)静脉麻醉，气管插管，连接SC-3型电动呼吸机；左侧第四肋间开胸，暴露心脏，剪开心包，做心包床；分离冠状动脉左旋支，放置电磁流量计(MF-1100型，日本光电株式会社)探头，测定心脏冠脉血流量；分离冠状动脉前降支中段，穿线以备结扎，造成急性实验性心肌缺血模型；缝置多点固定式心外膜电极，连接RM-6100型多道生理记录仪，描记心外膜电图(《中医研究院西苑医院基础室药理组：心外膜心电图方法的改进。新医药学杂志(11)：53，1978.》)。结扎冠脉15min，进行记录，作为给药前对照值，经十二指肠给予实验药物或生理盐水，于药后15、30、45、60、90、120、180min记录30个标测点心外膜电图，以S-T段升高大于2mv为判断标准，计算心肌缺血程度(S-T段升高总mv数∑-ST)及心肌缺血范围(S-T段升高总点数N-ST)。经颈外静脉插管至冠状静脉窦，于缺血前、缺血15min(药前)、药后30、60、90、120、180min抽血，以AVL912型(瑞士产)血氧测定仪测定冠状静脉血氧含量；以SECOMAM S.500P生化分析仪(法国产)测定血清肌酸磷酸激酶(CPK)、乳酸脱氢酶(LDH)，按放免药盒使用说明书测定ET、TXB2和6-Keto-PGF1α；颈总动脉插管，按上述时间点取血测定动脉血氧含量，与冠状静脉血氧含量、冠脉血流量共同计算心肌耗氧量：
心肌耗氧量＝(动脉血氧含量-冠状静脉血氧含量)×冠脉血流量/100
药后180min记录完毕，立即取下心脏，生理盐水冲洗，称量全心重，在心脏结扎线以下，平行于冠状沟均匀地将心室部分横断切成5片，然后，置于硝基四氮唑兰(N-BT)染液中，常温染色15min。以多媒体彩色病理图象分析系统(MPIAS-500)测量每片心肌双侧的梗塞区(N-BT非染色区)与非梗塞区(N-BT染色区)，计算每片心肌的面积，心室总面积和梗塞区总面积。计算梗塞区占心室及占全心脏的百分比。
实验结果进行统计学处理，以t检验判断其显著性。
3、实验结果
(一)对犬心肌缺血(心外膜电图标测)的影响
1)对犬心肌缺血程度(∑-ST)的影响见图2。
经十二指肠给药，葛仙丹颗粒2g生药/kg剂量组、4g生药/kg剂量组均有减轻心肌缺血程度(∑-ST)的作用，且4g生药/kg剂量组优于2g生药/kg剂量组。药后120min和180min，葛仙丹颗粒2g生药/kg剂量组动物∑-ST由药前245.60±38.55mv降至139.40±46.53mv及120.80±38.70mv，分别下降了40.40±25.68％及48.59±20.77％，与药前及与对照组比较均差异显著(P＜0.05和P＜0.01)，4g生药/kg剂量组动物∑-ST从给药后15min起开始下降，药物作用随给药时间的延长而增加，180min时，动物∑-ST由药前326.80±55.63mv降至128.60±58.68mv，下降了61.17±17.58％，与药前及与对照组比较均差异显著(P＜0.01)。
(二)对犬心肌缺血范围(N-ST)的影响
结果见图3。对照组给入生理盐水后，心肌缺血范围(N-ST)无明显改变。合心爽可明显减小心肌缺血范围(N-ST)，葛仙丹颗粒也有部分减小心肌缺血范围(N-ST)的作用。
以上结果表明，葛仙丹颗粒对实验性急性犬心肌缺血有明显的改善作用，可显著减轻心肌缺血程度(∑-ST)，部分减小心肌缺血范围(N-ST)。
(三)对犬急性心肌梗塞范围(N-BT染色法测定)的影响
结果见表28，
表28.各给药组对犬急性心肌梗塞范围的影响(n＝5， X±SD)
注：与对照组比较：*P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001。
以定量组织学N-BT染色法显示心肌梗塞范围，生理盐水对照组动物心肌梗塞区分别占心脏及心室的7.39±1.03％和19.01±2.04％；葛仙丹颗粒三个剂量组可减少动物心肌梗塞区面积，其中4g生药/kg组心肌梗塞区面积分别占心脏及心室的2.90±1.56％、7.40±2.72％，分别较生理盐水对照组降低60.76％和61.07％，与生理盐水对照组比较均有非常显著性差异(均P＜0.001)。
(四)对实验性心肌缺血犬冠脉血流量的影响
结果见图4，结扎麻醉犬冠状动脉形成心肌缺血后，冠脉血流量有短时间代偿性增加，增加幅度10％左右。合心爽和葛仙丹颗粒药后有显著增加缺血心脏冠脉血流量的作用，4g生药/kg剂量组药后30～180min冠脉血流量均有增加，其中120min时冠脉血流量增加了20.60±8.73％，与药前及生理盐水组比较，均有明显差异(均P＜0.01)。
(五)对实验性心肌缺血犬动、静脉血氧含量及心肌耗氧量的影响
结果见图5、图6、图7，对照组生理盐水给药前后动脉、冠状静脉窦血氧含量及心肌耗氧量均无显著变化；合心爽可明显增加静脉窦血氧含量；葛仙丹颗粒药后有不同程度的增加静脉窦血氧含量的作用趋势，而无统计学意义。葛仙丹颗粒三个剂量组动物心肌耗氧量亦未见明显变化，合心爽则显著降低心肌耗氧量。
(六)对实验性心肌缺血犬血液生化学指标的影响
1)对血清肌酸激酶(CK)及乳酸脱氢酶(LDH)活性的影响
结果见图8、图9，心肌缺血前血清CK、LDH含量分别为314.28±116.46u/L和66.56±23.67u/L(n＝25)，结扎冠脉形成急性心肌缺血后，血中CK、LDH含量明显升高，分别为443.96±171.79u/L和91.28±44.05u/L。与缺血前比较CK含量增加了41.75％，LDH含量增加了30.03％；CK、LDH活性随着冠脉结扎时间的延长进一步增加，生理盐水组药后30、60、90、120、180min与药前相比较，CK分别增加96.24％、265.23％、339.90％、399.84％及534.96％；LDH分别增加141.83％、153.76％、200.15％、217.15及455.37％；葛仙丹颗粒能部分抑制心肌缺血、心肌梗塞引起的LDH活性升高，对CK活性升高亦有一定的抑制作用。
2)对血浆内皮素(ET)、血栓素(TXB2)及6-酮-前列腺素(6-Keto-PGF1a)活性的影响。
结果见图10、图11、图12、图13，持续结扎犬冠状动脉过程中，生理盐水对照组动物血浆内皮素(ET)、血栓素B2(TXB2)含量明显升高；6-酮-前列腺素(6-Keto-PGF1a)及6-酮-前列腺素/血栓素B2比值明显下降。葛仙丹颗粒对心肌缺血、心肌梗塞引起的血浆血栓素(TXB2)活性有明显抑制作用，同时可明显升高6-酮-前列腺素(6-Keto-PGF1a)及6-酮-前列腺素/血栓素B2的比值。
结论：本实施例采用心外膜电图标测心肌缺血范围及程度，定量组织学(N-BT染色法)测定心肌梗塞范围，同时测定冠脉血流量、心肌耗氧量及血清CPK、LDH和血浆ET、TXB2、6-Keto-PGF1α活性的变化，研究了葛仙丹颗粒消化道给药对实验性犬急性心肌缺血、心肌梗塞及相关指标的影响。
实验结果证实，葛仙丹颗粒具有明显改善犬急性心肌缺血和心肌梗塞的作用，减轻由心外膜电图标测的心肌缺血程度(∑-ST)，减小通过N-BT染色所显示的梗塞区。
由不同病因造成局部冠状动脉狭窄或冠状动脉闭塞形成心肌缺血或心肌梗塞时，其它冠状动脉分支代偿性扩张和开放，可使心肌缺血或心肌梗塞得到缓解。当心肌发生大面积缺血和广泛性梗塞、这种代偿能力“得不偿失”时，则造成心肌坏死和不可逆损伤，发生生命危险。实验观察到葛仙丹颗粒可明显增加心肌缺血和心肌梗塞时的冠脉血流量，表明其可促进侧支循环开放和建立，同时增加心肌的供氧。
肌酸磷酸激酶(CK)广泛存在于胞浆中，尤以心肌细胞为多。当心肌细胞损伤时CK溢出，使其在血清中活性提高，血清CK活性越高，反映心肌损伤越重。乳酸脱氢酶(LDH)在心肌梗塞时从组织细胞内大量释放于体液中，测定冠状静脉窦血中其活性，亦反映心肌损伤的程度。本实验观察到持续结扎犬冠状动脉CK和LDH活性持续增加。实验证明葛仙丹颗粒能部分抑制心肌缺血、心肌梗塞引起的LDH活性升高，对CK活性升高也有一定的抑制作用。
前列环素(prostacyclin，PGI2)、内皮素(endothelin，ET)、血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)均为内皮细胞分泌的血管活性物质，其中PGI2为舒血管物质，ET和TXA2为缩血管物质。本实验通过测定ET、PGI2的终末代谢产物6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)及TXA2的代谢产物TXB2等活性物质，观察持续结扎犬冠状动脉形成心肌缺血和心肌梗塞过程中的变化以及观察药物对其影响。结果表明，葛仙丹颗粒对心肌缺血、心肌梗塞引起的血浆血栓素(TXB2)活性有明显抑制作用，同时可明显升高6-酮-前列腺素(6-Keto-PGF1a)及6-酮-前列腺素/血栓素B2的比值。
上述结果表明，葛仙丹颗粒可明显改善犬急性心肌缺血和心肌梗塞的病理表现，减轻心肌缺血程度，减小心肌梗塞区域；还可增加心肌缺血和心肌梗塞时的冠脉血流量，促进侧支循环开放和建立，增加心肌的供氧；抑制LDH活性升高及TXB2的释放；同时可明显升高6-酮-前列腺素(6-Keto-PGF1a)及6-酮-前列腺素/血栓素B2的比值。
实施例四、本实施例的目的是观察葛仙丹颗粒对缺血再灌注所致心肌梗塞范围及血清CK、LDH、MDA、SOD含量的影响。
以大鼠心肌缺血再灌注损伤模型观察到，葛仙丹颗粒能够明显减轻心肌损伤程度，心肌梗塞面积缩小，梗塞区重量减轻，并明显降低血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)含量，增加血清超氧化歧化酶(SOD)活性。
1.试验材料
1)动物Wistar种大鼠48只，雄性，体重240～260g，北京医科大学动物部提供，合格证号：医动字第01-3056号。
2)药物葛仙丹颗粒提取清膏，4.16g生药/ml膏；合心爽片(盐酸地尔硫缓释片)，30mg/片，天津田边制药有限公司，批号0010107。超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒，南京建成生物工程研究所提供，批号：20010423；丙二醛(MDA)试剂盒，南京建成生物工程研究所提供，批号：20010419。
3)仪器分光光度计(UV-120-02型)，岛津公司生产；全自动生化分析仪(RA-100，美国)。
2.试验方法动物随机分为6组：假手术组(取血清作正常对照)，模型组，合心爽16mg/kg组，葛仙丹颗粒10.0、5.0、2.5g生药/kg组。药物以生理盐水稀释至所需浓度，给药体积为3ml/kg，给药途径为十二指肠。
动物以戊巴比妥钠腹腔麻醉(45mg/kg)，仰位固定，心电图机(CardiofaxECG 6511型，上海)以标准II导联心电图监测；切开气管，插入气管插管，接呼吸机(SC-3型，上海医疗设备厂)行人工呼吸(32次/分，呼吸比值1∶3)；开胸，断3～5肋，打开心包膜，暴露心脏，于冠状动脉左前降支根部穿线(0号缝合线)，备结扎用；分离十二指肠准备给药；穿线后稳定10分钟，将一塑料凹管与血管并列，结扎(无ST段及T波改变者淘汰)，给入受试药物；40分钟后，沿凹槽剪断结扎线，使前降支实现再灌注；缝合胸壁，恢复自主呼吸。
打开结扎2小时后，腹主动脉取血，测定血清CK、LDH、SOD、MDA含量；心脏结扎线以下横切5片，N-BT染色，采用多媒体彩色病理图文分析系统(MPIAS-500)，以固定象距测量正常心肌及梗塞心肌面积，观察心肌梗塞程度；结果进行统计学处理(t检验)。
3.试验结果
1)葛仙丹颗粒对心肌梗塞程度的影响，见表29。
表29.葛仙丹颗粒对心肌梗塞程度的影响
分组 n 剂量/kg   正常心肌面积mm2   梗塞心肌面积mm2   梗塞区重量G   梗塞区占心室％   梗塞区占心脏％
  模型组   8   347.37±32.86   120.89±18.83   0.320±0.052   34.8±3.7   29.5±3.6
  合心爽组葛仙丹组葛仙丹组葛仙丹组   8888   16mg10.0g5.0g2.5g   337.55±20.31363.15±12.82340.80±17.92339.68±30.40   71.14±15.93.**86.58±21.61**95.45±18.63*100.36±10.80*   0.182±0.043**0.208±0.053**0.242±0.050**0.250±0.035**   21.2±5.0**23.9±6.0**27.9±4.8**29.9±4.9*   18.0±4.2**20.2±5.0**23.6±3.9**25.0±4.2*
*、**：与模型组比较P＜0.05、P＜0.01.
实验结果证实，模型组梗塞区占心室及心脏百分比分别为34.8及29.5％；对照药合心爽组梗塞面积明显减小，梗塞区重量减轻，梗塞区占心室及心脏百分比降低，与模型组比较均有显著性差异(P＜0.01)；葛仙丹颗粒10.0、5.0、2.5g/kg组心肌梗塞程度明显减轻，梗塞面积减小，梗塞区重量减轻，梗塞区占心室及心脏百分比降低，与模型组比较均有显著性差异(P＜0.05～P＜0.01)。
2)葛仙丹颗粒对血清LDH及CK含量的影响。见表30。
表30.葛仙丹颗粒对血清LDH及CK含量的影响
  分组   n   剂量/kg   LDH(IU/L)   CK(IU/L)
  假手术组模型组合心爽组葛仙丹颗粒葛仙丹颗粒葛仙丹颗粒   888888 16mg10.0g5.0g2.5g   243.1±122.63939.9±1094.7##2666.8±1221.9*3077.1±1083.23600.0±1595.62729.3±567.6*   267.3±59.23705.4±1071.1##2429.6±630.2*3729.4±963.42430.0±866.6*3058.1±661.8
注：##与正常对照组比较P＜0.01；*与模型组比较P＜0.05、P＜0.01.
实验结果证实，模型组LDH及CK含量明显增加，与假手术组比较有显著性差异(P＜0.01)；合心爽组LDH及CK值降低，与模型组比较有显著性差异(P＜0.05)；葛仙丹颗粒2.5g/kg组LDH降低，5.0g/kg组CK值降低，与模型组比较有显著性差异(P＜0.05)。
3)葛仙丹颗粒对血清SOD及MDA含量的影响。见表31。
表31.葛仙丹颗粒对血清SOD及MDA值的影响
  分组   n   剂量/kg   MDA(nmol/ml)   SOD(U/L)
  假手术组   8   13.44±1.07   210.15±19.34
模型组合心爽组葛仙丹颗粒葛仙丹颗粒葛仙丹颗粒     88888 16mg10.0g5.0g2.5g     19.72±3.25##20.61±3.0420.45±3.5418.91±5.0120.25±4.98     172.66±27.03##210.33±13.22**206.06±21.076*197.79±15.36*214.32±25.69**
注：##与正常对照组比较P＜0.01；*、**与模型组比较P＜0.05、P＜0.01。
实验结果证实，模型组SOD值明显降低，MDA明显升高，与假手术组比较均有显著性差异(P＜0.01)；合心爽及葛仙丹颗粒三个剂量组SOD值均有升高，与模型组比较有显著性差异(P＜0.05～P＜0.01)；本试验未能观察到各给药组对MDA值的影响。
结论：心肌缺血后再灌注损伤，临床常发生于冠脉搭桥术后及溶栓术治疗心梗后。研究证实，心肌缺血一定时间造成心肌损伤后，再灌注不仅无益于心脏功能的恢复，反而加重已有的心肌损伤，从而导致心肌梗塞的发生或进一步加重。
本实验以大鼠心肌缺血再灌注损伤模型观察药物作用。实验观察到，心肌缺血再灌注导致心肌梗塞，N-BT染色后心梗斑块明显，心梗面积占心室总面积的34.8％；同时SOD活性明显降低，MDA含量明显增高，间接反映了氧自由基的产生对心肌损伤的进一步加重。
葛仙丹颗粒明显减轻心肌梗塞程度，心梗面积缩小，梗塞区重量减轻，LDH及CK值降低，SOD值升高，对心肌缺血再灌注损伤有明显的保护作用。
实施例五、本实施例的目的是观察葛仙丹颗粒对麻醉开胸犬心脏血流动力学及心肌耗氧量的影响，研究其对心脏功能的药理作用及作用机制。
1.实验材料
1)动物：健康成年杂种犬25只，体重15.38±0.54kg，雌雄兼用。由北京市通利实验动物养殖厂提供[京动许字(2000)第010号]。
2)药物：葛仙丹颗粒提取清膏，4.16g生药/ml膏；合心爽(盐酸地尔硫片)，30mg/片，天津田边制药有限公司生产(批号：0010107)；0.9％氯化钠注射液，北京双鹤药业股份有限公司生产(批号：010607122)。
上述实验药物，均在实验前用生理盐水配制成等体积(3ml/kg)，经十二指肠给药。
2.实验方法
实验动物用戊巴比妥钠(30mg/kg)静脉麻醉，气管插管，连接电动人工呼吸机(SC-3型，上海)。施左侧第四肋间开胸术，暴露心脏，剪开心包，做心包床，分离冠状动脉左旋支及主动脉根部，放置电磁流量计(MF-1100型，日本光电)探头，分别测量冠脉血流量及心输出量。左心室尖部插管，连接压力换能器(MPU-0.5A)，经载波放大器(AP-601G)测定左室内压，再经微分器(ED-601G)计算左室内压上升最大速率(dp/dtmax)。颈外静脉插管至冠状静脉窦，颈动脉插管，以血氧仪(AVL912型，瑞士)分别测定冠状静脉窦血氧含量及动脉血氧含量，计算心肌耗氧量。股动脉插管测定动脉血压，以肢体导联观测标准II导心电图计算心率及相关心电图参数。公式计算其它血流动力学指标：心搏出量、耗氧指数、冠脉阻力、总外周阻力及氧利用率等。将上述各项指标同步记录于多道生理记录仪(RM-6000型，日本光电)。
施腹部手术，分离十二指肠，插管，以备给予所试药物。
实验共分五组：(1)空白对照组，生理盐水3ml/kg，n＝5；(2)合心爽组，5mg/kg，n＝5；(3)葛仙丹颗粒1.0g/kg剂量组，n＝5；(4)葛仙丹颗粒2.0/kg剂量组，n＝5；(5)葛仙丹颗粒4.0g/kg剂量组，n＝5。
手术完毕，待所观察指标稳定后，记录药前值，十二肠给入所试药物。并于药后15、30、45、60、90、120分钟进行记录。将各项观测指标及推导参数进行统计学处理，以不同观察时间的实测值进行给药前后自身比较，其变化百分率进行组间比较，以t检验判断其显著性。
3.实验结果
1)对犬动脉血压、心率及心电图的影响
结果见图14、图15。合心爽药后有明显降低血压和减慢心率的作用；葛仙丹颗粒组试验犬动脉血压及心率无明显变化。药后动物标准II心电图PR间期、QRS间期、QT间期及T波等参数均无明显改化。
2)对犬冠脉血流量及冠脉阻力的影响
结果见图16、图17。生理盐水给药前后冠脉血流量、冠脉阻力均无明显变化。葛仙丹颗粒4g生药/kg组药后45min冠脉血流量开始有所增加，作用持续至药后120min，120min时冠脉流量由药前91.25±26.92ml/100g·min-1，增加到107.38±33.22ml/100g·min-1，增加幅度为18.60±3.54％，与药前及对照组相比有显著性差异(P＜0.05)。同时葛仙丹颗粒能不同程度的降低冠脉阻力(P＜0.05～0.001)，幅度在20％左右。钙拮抗剂合心爽亦可明显增加冠脉血流量和降低冠脉阻力。
3)对左室收缩力、左室作功的影响
结果见图18、图19。各实验组药后动物左室收缩力未见明显变化，葛仙丹颗粒4g生药/kg组可增加45min时动物左室作功；而合心爽可部分抑制动物左室作功。
4)对犬左室内压、左室内压最大上升速率的影响
结果见图20、图21。葛仙丹颗粒三个剂量组对左室内压无明显影响。各组动物药后左室内压最大上升速率(dp/dtmax)与对照组比较均无显著性差异。
5)对犬心输出量、心搏出量及总外周阻力的影响
结果见图22、图23。葛仙丹颗粒4g生药/kg组给药后，动物心输出量和心搏出量有明显增加，同时总外周阻力显著下降。
6)对犬动脉血氧含量、静脉血氧含量的影响
结果见表图24、图25。葛仙丹颗粒各动物药后，与药前比较动脉血氧含量无明显变化。合心爽组动物冠状静脉窦血氧含量均明显增加，与生理盐水对照组比较均有明显差异(P＜0.05-0.001)。葛仙丹颗粒组动物药后，冠状静脉窦血氧含量无明显变化。
7)对犬心肌耗氧量、耗氧指数及氧利用率的影响
结果见图26、图27、图28。阳性对照药合心爽经十二指肠给药后，心肌耗氧量、耗氧指数和氧利用率均明显降低；葛仙丹颗粒组动物心肌耗氧量有所增加，耗氧指数和氧利用率均无明显变化。
结论：本实验观察了葛仙丹颗粒对正常麻醉犬心脏血流动力学、心肌耗氧量的影响，用合心爽口服片做为阳性对照药，证实实验方法及所取指标的可靠及灵敏性。
实验结果显示：葛仙丹颗粒可明显扩张冠脉血管及外周血管，增加冠脉流量和心输出量，降低冠脉阻力和总外周阻力；改善左室作功，调整心脏血管的顺应性，对心血管系统起到调整和改善作用，为临床治疗缺血性心脏病提供了实验依据。
实施例六、本实施例的目的是观察葛仙丹颗粒对大鼠体外血栓形成及血液粘度的影响，研究该药的药理作用。
1.试验材料：
1)药物：葛仙丹颗粒颗粒提取清膏，4.16g生药/ml膏；阿司匹林肠溶片(25mg/片)，北京市燕京制药厂生产，批号：991014；试验时均用蒸馏水配成所需浓度。
2)动物：健康雄性Wistar大鼠(贰级)50只，体重242.1±8.7g，由中国医学科学院实验动物研究所繁育场提供，合格证号：SCXK 11-00-0006。
3)仪器：体外血栓形成仪，SDZ-A1型，江苏无锡县电子仪器厂产品。血液粘度测定仪，LG-R-20型，北京世帝科学仪器公司产品。
2.试验方法
将大鼠随机分为5组(每组10只)：①对照组(蒸馏水，10ml/kg)，②葛仙丹颗粒10g生药/kg剂量组，③葛仙丹颗粒5g生药/kg剂量组，④葛仙丹颗粒2.5g生药/kg剂量组，⑤阿司匹林50mg/kg剂量组。各给药组按所述剂量灌胃给药，对照组灌胃等体积蒸馏水，每日一次，连续给药7日，末次给药后1h，用水合氯醛(0.35g/kg)腹腔注射麻醉，切开腹腔暴露腹主动脉，取血2ml用于体外血栓形成测定，取血3ml(肝素抗凝)用于血液粘度测定。
体外血栓形成测定：按照Chandler体外法，立刻将血注入旋转环内，注入的血量充满旋转环1/2以下(1.8ml)，迅速密封，置血栓形成仪上，旋转10min(实验温度为37℃)，倾出血栓，生理盐水洗涤，测量长度，称量湿重，将血栓条置80℃烘箱3h，恒重后称其干重。
血液粘度测定：从3ml血(肝素抗凝)中取0.8ml用于全血粘度测定，余血于650×g离心10min，取上清0.8ml用于血浆粘度测定。
3.试验结果
1)对体外血栓形成的影响，见表32。
表32.葛仙丹颗粒对大鼠体外血栓形成的影响( X±SD)
组别   剂量(/kg)   鼠数(只)   血栓
  长度(mm)   湿重(mg)   干重(mg)
  对照组葛仙丹颗粒组葛仙丹颗粒组葛仙丹颗粒组阿司匹林组 10g生药5g生药2.5g生药50mg   1010101010   21.4±2.417.6±1.0***19.3±2.0*20.4±2.717.6±1.6***   107.8±12.783.8±6.6***94.8±11.8*115.9±20.591.8±10.2**   20.4±2.016.9±1.3***18.7±1.4*20.9±2.917.9±1.9*
注：与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
由表32可见，与对照组比较，葛仙丹颗粒10g生药/kg剂量组的血栓长度显著缩短(P＜0.001)，血栓湿重和干重显著减轻(P＜0.001)；葛仙丹颗粒5g生药/kg剂量组的血栓长度明显缩短(P＜0.05)，血栓湿重和干重明显减轻(P＜0.05)，葛仙丹颗粒2.5g生药/kg剂量组的血栓长度、湿重及干重均无明显变化；阿司匹林组的血栓长度显著缩短(P＜0.001)，血栓湿重和干重显著减轻(P＜0.05～0.01)。
2)对血液粘度的影响，见表33。
表33.葛仙丹颗粒对大鼠血液粘度的影响(n＝10， X±SD)
组别   剂量(/kg)   全血粘度CP)   血浆粘度(CP)
  高切(200S-1)   中切(100S-1)   中切(30S-1)   低切(5S-1)
  对照组葛仙丹颗粒组葛仙丹颗粒组葛仙丹颗粒组阿司匹林组 10g生药5g生药2.5g生药50mg   5.24±0.553.87±0.76***4.14±0.83**4.18±0.78**4.24±0.68**   6.30±0.844.56±1.26**5.04±1.36*4.98±1.24*5.01±1.11**   9.25±1.846.51±2.77*7.48±2.877.21±2.626.97±2.21*   15.17±4.129.81±5.15*11.62±5.2811.68±5.6310.25±3.84*   1.25±0.551.46±0.781.61±0.691.46±0.781.29±0.57
注：与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
由表33可见，与对照组比较，葛仙丹颗粒10g生药/kg剂量组大鼠的全血粘度在切变率5S-1、30S-1及100S-1下均明显降低(P＜0.05～0.01)，在切变率200S-1下显著降低(P＜0.001)；葛仙丹颗粒5g生药/kg、2.5g生药/kg剂量组大鼠的全血粘度在切变率100S-1和200S-1下均明显降低(P＜0.05～0.01)，在切变率30S-1和5S-1下有降低趋势。阿司匹林组大鼠的全血粘度在各切变率下均明显降低(P＜0.05～0.01)。各给药组大鼠的血浆粘度与对照组比较均无明显差异。
结论：实验结果表明，续7天给大鼠灌胃给药，葛仙丹颗粒10g生药/kg、5g生药/kg剂量明显缩短血栓长度(P＜0.05～0.001)，明显减轻血栓湿重和干重(P＜0.05～0.001)；葛仙丹颗粒10g生药/kg剂量明显降低切变率200S-1、100S-1、30S-1及5S-1下的全血粘度(P＜0.05～0.001)，葛仙丹颗粒5g生药/kg、2.5g生药/kg剂量均明显降低切变率200S-1、100S-1下的全血粘度(P＜0.05～0.01)。提示葛仙丹颗粒具有抑制血栓形成、降低血液粘度的作用。
实施例七、本实施例的目的是观察葛仙丹颗粒对家兔血小板聚集的影响，研究该药的药理作用。
本试验采用Born氏比浊法，观察葛仙丹颗粒对家兔血小板聚集的影响。
1.试验材料
1)药物：葛仙丹颗粒提取清膏，4.16g生药/ml膏；阿司匹林肠溶片(25mg/片)：北京市燕京制药厂生产，批号：991014；试验时均用蒸馏水配成所需浓度。二磷酸腺苷(ADP)二钠盐：中国科学院上海生物化学研究所生产，批号：9209258，用生理盐水配制成1.0mM/L的溶液，4℃保存备用。花生四烯酸(AA)：Fluka AG产品，临用时用1.0M/L NaOH配制成钠盐，浓度为5.0g/L。胶原(100μg/ml)：KOKEN公司产品。
2)动物：40只健康雄性日本大耳白家兔，体重2.24±0.15kg，由北京通利实验动物养殖场提供，合格证号：京动许字(2000)第024号总069号
3)仪器：血小板聚集仪，BS634型，北京生化仪器厂产品。
2.试验方法
给药前穿刺耳中动脉取血测定血小板聚集率，根据血小板聚集率水平及体重将40只家兔随机分为5组(每组8只)：①对照组(蒸馏水，2.0ml/kg)，②葛仙丹颗粒6g生药/kg剂量组，③葛仙丹颗粒3g生药/kg剂量组，④葛仙丹颗粒1.5g生药/kg剂量组，⑤阿司匹林25mg/kg剂量组。给药组按所述剂量灌胃给药，对照组灌胃等体积蒸馏水，每日一次，连续给药7日，末次给药后1h，穿刺耳中动脉取血，测定血小板聚集率。
血小板聚集率测定方法：用硅化注射器穿刺耳中动脉取血，3.8％枸橼酸钠溶液抗凝(血∶抗凝剂＝9∶1)，200×g离心8分钟，取上清部分即富血小板血浆(PRP)，剩余部分2200×g离心10分钟，取上清部分即贫血小板血浆(PPP)。PRP中血小板计数为4.0×105/mm3左右。按照Born氏比浊法，将盛有200ulPRP及1小磁棒的比浊管置于血小板聚集仪中，37℃保温1分钟，经PPP标定后，在搅拌情况下加入诱导剂诱导聚集。所用诱导剂的终浓度为：ADP(47.6μM/L)、AA(782.0μM/L)、胶原(4.8mg/L)。根据仪器自动打印出来的聚集曲线及最大聚集率分析药物对血小板聚集的影响。最大聚集率计算公式如下：
Figure A20051001174300391
3.试验结果，见表34。
表34.葛仙丹颗粒对家兔血小板聚集率的影响(n＝8)
诱导剂 组别 剂量(/kg)   聚集率(％， X±SD)
  药前   药后   差值
胶原   对照组葛仙丹颗粒组葛仙丹颗粒组葛仙丹颗粒组阿司匹林组 6g生药3g生药1.5g生药25mg   69.11±9.2070.66±4.1072.00±3.3069.33±7.0568.20±7.97   70.74±8.8060.36±9.8463.03±12.3265.76±7.0145.71±9.94   1.62±6.57-10.30±9.79*-8.97±13.30-3.58±5.21-22.49±12.87***
ADP   对照组葛仙丹颗粒组葛仙丹颗粒组葛仙丹颗粒组阿司匹林组 6g生药3g生药1.5g生药25mg   69.35±6.7066.66±10.1267.71±8.2770.28±5.2568.51±10.66   68.52±7.2863.31±8.5263.16±6.0766.12±7.2856.62±8.83   -0.82±7.23-3.35±4.62-4.54±9.21-4.16±7.52-11.88±9.44*
AA   对照组葛仙丹颗粒组 6g生药   69.55±10.2570.31±4.49   66.76±7.3658.08±5.07   -2.79±6.04-12.23±7.82*
  葛仙丹颗粒组葛仙丹颗粒组阿司匹林组   3g生药1.5g生药25mg   68.20±6.1768.71±6.6265.50±10.76   56.74±7.5859.92±8.2117.79±17.66   -11.46±6.74*-8.79±7.64-47.71±17.00***
注：1.与对照组比较：*P＜0.05，***P＜0.001。
2.差值＝给药后聚集率-给药前聚集率。
由表34可见，①当胶原诱导聚集时，给药前各组间血小板聚集率无明显差异；给药后葛仙丹颗粒6生药/kg剂量组的血小板聚集率明显低于对照组(P＜0.05)，葛仙丹颗粒3生药/kg、1.5g生药/kg剂量组的血小板聚集率与对照组比较有降低趋势，阿司匹林组的血小板聚集率显著低于对照组(P＜0.001)。②当ADP诱导聚集时，给药前各组间血小板聚集率无明显差异；给药后葛仙丹颗粒各剂量组的血小板聚集率与对照组比较均无明显差异，阿司匹林组血小板聚集率与对照组比较明显降低(P＜0.05)。③当AA诱导聚集时，给药前各组间血小板聚集率无明显差异；给药后葛仙丹颗粒6生药/kg、3生药/kg剂量组的血小板聚集率均明显低于对照组(P＜0.05)，葛仙丹颗粒1.5g生药/kg剂量组的血小板聚集率与对照组比较有降低趋势，阿司匹林组的血小板聚集率显著低于对照组(P＜0.001)。
结论：上述结果表明：连续7天给家兔灌胃给药，葛仙丹颗粒6g生药/kg剂量明显降低胶原、花生四烯酸(AA)诱导的家兔血小板聚集率(P＜0.05)，葛仙丹颗粒3g生药/kg剂量明显降低AA诱导的家兔血小板聚集率(P＜0.05)。提示葛仙丹颗粒具有抑制血小板聚集的作用。

Claims (20)

1、一种治疗冠心病心绞痛的药物，是由下述重量配比的原料制成的药剂：
黄芪550-700；丹参350-430；葛根350-430；淫羊藿240-320；姜黄120-220。
2.权利要求1的药物，其中各原料的重量配比是：黄芪667；丹参400；葛根400；淫羊藿300；姜黄200g。
3.权利要求1或2的药物，其特征在于，所述的药剂是任何一种药剂学上所说的剂型。
4.权利要求3的药物，其特征在于，所述的药剂是颗粒剂。
5.权利要求1所述药物的制备方法，步骤有：
a)将黄芪、丹参和葛根加50-70％的乙醇4-6倍量提取2-4次，每次1-1.5小时，合并醇提液，滤过，滤液回收乙醇至无醇味；
b)按姜黄的重量加水6-8倍，水蒸汽蒸馏2-6小时提取挥发油，滤过，水溶液留用；挥发油用β-环糊精包结，其中挥发油∶β-环糊精＝1∶6-1∶8体积比，40-60℃包结，搅拌1-2小时，静置、滤过、35-40℃干燥；
c)步骤b滤过的药渣和淫羊藿混合后加水煎煮1-3次，每次加水10-14倍量，煎煮0.5-1.5小时，合并煎液，滤过；
d)步骤c中的滤液和步骤b中经过提取发油后的水溶液混合，于50-60℃浓缩至相对密度在50℃时为1.05-1.10，放置至室温，取上清液；
e)步骤a的滤液和步骤d的上清液合并，于50-60℃浓缩至相对密度在50℃时为1.25-1.30，70-80℃干燥，粉碎成细粉，与挥发油包结物混合后加入细粉重量1.0-2.0％的甜味剂和细粉重量0.5-1倍量的稀释剂，混匀；
所述为甜叶菊苷、甜菜碱、阿司帕坦、甘草甜素或糖精钠；
所述为淀粉、糊精或乳糖。
6.权利要求5的制备方法，其特征在于，所述甜味剂为阿司帕坦。
7.权利要求5的制备方法，其特征在于，所述稀释剂为糊精。
8.权利要求5的制备方法，其特征在于，步骤a中的乙醇浓度为50％。
9.权利要求5的制备方法，其特征在于，步骤a中的乙醇加入量为6倍。
10.权利要求5的制备方法，其特征在于，步骤a中的乙醇提取时间为1.5小时。
11.权利要求5的制备方法，其特征在于，步骤b中水蒸汽蒸馏时间为5-6小时。
12.权利要求5的制备方法，其特征在于，步骤b中挥发油∶β-环糊精＝1∶8体积比。
13.权利要求5的制备方法，其特征在于，步骤c中加水量为12倍。
14.权利要求5的制备方法，其特征在于，步骤c中煎煮次数为3次。
15.权利要求5的制备方法，其特征在于，步骤c中每次煎煮时间为0.5小时。
16.权利要求5的制备方法，其特征在于，步骤d中的上清液是经过10000rpm离心的澄清液。
17.权利要求5的制备方法，其特征在于，步骤e中加入的甜味剂量是细粉重量的2.0％。
18.权利要求5的制备方法，其特征在于，步骤e中加入的稀释剂量是细粉重量的1倍。
19.权利要求5的制备方法，其特征在于，步骤e得到的产品用浓度为80-90％的乙醇制粒，干燥，得颗粒剂产品。
20.权利要求1或2所述药物在制备治疗冠心病心绞痛的药中的应用。
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