CN1781934A - Her－2模拟抗原表位及含有该表位的肽 - Google Patents

Abstract

本发明通过噬菌体展示技术分离了一种HER－2模拟抗原表位小肽(通式I)。本发明还对该表位小肽进行了突变修饰，鉴定了几种仍然保持免疫原性的这种抗原表位的衍生物。含有这种表位或其衍生物的肽或肽与其它蛋白的融合可以用作疫苗用于诱导产生针对HER－2的体液和细胞免疫反应，进而发挥对肿瘤的预防及治疗作用。本发明还合成了编码这些肽的寡核苷酸、构建了含有该寡核苷酸或该寡核苷酸与编码其它蛋白基因重组的表达载体并转化细胞。本发明提供了一种寡核苷酸、载体或细胞可以治疗肿瘤的方法和药物组合物。

Description

HER-2模拟抗原表位及含有该表位的肽

技术领域

本发明涉及针对HER-2的主动免疫的诱导和增强，具体地，本发明涉及一种通过噬菌体展示技术分离的HER-2模拟抗原表位模拟肽及经过修饰，但仍然保持免疫原性的这种抗原表位肽的衍生物。本发明还涉及含有这种表位肽或其衍生物的疫苗。该疫苗通过诱导产生针对HER-2的体液和细胞免疫反应而用于对肿瘤的预防和治疗。本发明还涉及编码这些肽的核苷酸、核苷酸与其它分子的重组融合蛋白、含有该核苷酸的载体和细胞，以及利用这些肽、核酸、或细胞治疗肿瘤的方法和药物组合物。

背景技术

HER-2受体属于表皮生长因子受体(Epidermal growth factorreceptor，EGFR)家族成员。在结构上，它包括糖基化的胞外区，水化穿膜区和胞内酪氨酸激酶区[1]。目前尚未发现HER-2的配体。在以EGFR家族为起始的信号通路中，HER-2发挥了重要的调节作用。HER-2是通过与EGFR，ErbB-3，ErbB-4形成异源二聚体而发挥作用的[2]。异源二聚体可与EGF样配体形成高亲和力结合，同时激活下游多种信号通路[3]。原癌基因HER-2/c-erbB2/neu在多种恶性肿瘤中有基因扩增及过表达，特别是在乳腺癌、卵巢癌、胃腺癌、结肠癌中其表达水平升高更为明显。HER2过表达与癌症患者预后不良、易复发、存活率低有关[4]。

近十年来，HER-2被认为是肿瘤免疫治疗的理想靶点之一。这不仅是因为HER-2的过表达见于多种人类肿瘤，而且其过表达与恶性肿瘤(如乳腺癌)预后不良有关。此外，在正常成人组织HER-2表达很低，而在肿瘤原发灶和转移灶中均有HER-2的稳定表达[5，6]。因此抗HER-2免疫治疗可产生针对肿瘤的特异性疗效。

在被动免疫治疗中，人们获得了多种针对HER-2胞外区的单克隆抗体，一些抗体可抑制肿瘤生长。其中一株抗体——Herceptin(Trastuzumab)目前已经过临床评估，并于1998年9月被美国FDA批准用于临床治疗[8]。Herceptin是第一个用于乳腺癌治疗的生物学制剂，它可单独用药或与化疗药联合应用[7，8]。由于Herceptin的价格昂贵，用药量大，需反复多次使用，致使一般病人在经济上难以承受。

除了上述被动免疫治疗，使病人产生针对HER-2的主动免疫反应也是有效的免疫治疗方法。HER-2作为潜在的肿瘤疫苗具有许多优势。首先，一些HER-2表达阳性的肿瘤病人体内有针对HER-2的免疫反应，这就提示机体可以克服针对自身蛋白的免疫耐受。其次，由于HER-2在肿瘤细胞过表达，而在正常组织低表达，使得病人产生的针对HER-2的免疫反应具有肿瘤组织特异性，而对正常组织毒性很小或没有毒性。最后，HER-2作为一个重要的生长因子受体，病人体内产生的针对HER-2的体液免疫反应可通过多种机制诱导肿瘤细胞死亡。

Pupa等人于1993年首次报道，HER-2过表达的乳腺癌患者体内存在针对HER-2的血清抗体和T细胞反应[10，11]。此外，其它报道也证明乳腺癌患者体内存在针对HER-2的内源性体液和细胞免疫反应。

Disis等人研究发现在127个乳腺癌患者中，14人(11％)血清抗HER-2抗体滴度大于1∶100，而100个正常女性中无一例检测到抗HER-2抗体。特别是其中处于乳腺癌早期的5名患者体内存在强烈的体液免疫反应，血清抗体滴度大于1∶5000[12]。血清中高滴度抗HER-2抗体的出现与早期原发癌HER-2过表达相关[12，13]。而在晚期乳腺癌患者没有发现这种相关性，病人血清中可检测到HER-2胞外区蛋白(ECD)[14]，但其体内的抗体检出率明显低于早期肿瘤患者[12]。结肠癌患者血清中也可检测到抗HER-2抗体[13]。此外，在不同类型上皮恶性肿瘤患者体内可检测到针对所有EGFR受体的抗体反应[74]。

针对HER-2的辅助性T细胞免疫反应一般可与抗HER-2抗体一起检测到[10]。血清中的抗HER-2抗体主要是IgG或IgA[12，13，65]，抗体从IgM到IgG或IgA的转型反应需要T细胞的辅助作用，这一过程需要HER-2含有辅助性T细胞表位。潜在的辅助性T细胞表位一般是通过计算机程序算法(computer algorithms)选择的。通过合成这些表位相对应的肽并检测它们诱导产生细胞因子或刺激外周血淋巴细胞增殖的能力来评估小肽的活性[10，16，18]。Kobayashi等人研究发现了一系列具有HLA-DR结合特性的辅助性T细胞表位。其中一个肽在体外可诱导HER-2特异的HLA-DR限制型辅助性T细胞反应。此外，小肽激活的辅助性T细胞可识别抗原递呈细胞表面天然递呈的HER-2蛋白[17]。

在HER-2过表达的肿瘤病人体内还可检测到HER-2反应性细胞毒T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocytes，CTL)[19，20，21]。这些CTL细胞可在体外被分离培养，通过用自身固有的肿瘤细胞进行刺激，CTL细胞得到扩增[19，22，23]。由于诱导HER-2特异性CTL细胞需要小肽的递呈和在细胞表面的暴露，目前已发现一些HLA种型限制性HER-2CTL小肽表位。这些肽段具有结合特定HLA种型的同源序列。这些潜在的CTL表位可激发树突状细胞，并进一步产生CTL细胞，这些CTL细胞可裂解HER-2转染的永生化细胞或自身固有的肿瘤细胞[23，24，25，26]。表1详细列出了目前已发现的HER-2CTL表位和辅助性T细胞表位。

HER-2特异性CTL细胞可裂解自身固有的肿瘤细胞，这一作用提示多种HER-2来源的表位可通过天然递呈作用暴露在细胞表面。实际上，通过用酸性洗脱液洗涤肿瘤细胞，可得到肿瘤细胞表面HLA-I类分子上暴露的HER-2抗原肽[20，27]。一些肿瘤，如乳腺癌[20]、卵巢癌[20，24]、非小细胞肺癌[27]、胰腺癌[75]、肾细胞癌[23，26]和结肠癌[23]，都可检测到HER-2CTL表位表达。此外，一些完全不同类型的上皮性肿瘤拥有相同的HER-2CTL表位[20，23]。

总之，这些研究提示HER-2不仅可被呈递在肿瘤细胞表面，还可引起肿瘤患者的体液和细胞免疫反应。

在发现病人体内免疫反应的同时，人们提出了一个重要问题：这种免疫反应是否具有抗肿瘤作用？一些研究提示病人体内的免疫反应是有益的。

针对1000例以上乳腺癌患者的研究发现，在原发癌有淋巴浆细胞浸润(Lymphoplasmacytic Infiltration，LPI)的I期病人，HER-2过表达提示有较好的预后[28]。最近的研究发现，同是淋巴结未受肿瘤侵袭的病人，如果没有LPI反应，HER-2过表达提示预后不良；而具有LPI的病人则预后较好[29]。在原发乳腺癌肿瘤内部可检测到T细胞，但并没有检测到HER-2过表达，这是因为在HLA-A2阳性的乳腺癌患者，宿主的免疫反应可去除HER-2过表达的肿瘤细胞，因此HER-2检测呈阴性反应[30，31]。这些发现均提示在肿瘤发生早期，免疫反应可延缓肿瘤发展进程。

表1 HER-2的辅助性T细胞(helper T cell)表位和细胞毒T细胞(cytotoxic T cell)表位

辅助性T细胞	细胞毒T细胞	HLA分型	显示CTL表位的肿瘤
				42-56396-406474-487	48-5663-72106-114369-377435-443654-662665-673689-697754-762767-775773-781	N/AHLA-A2.1HLA-A24HLA-A2.1HLA-A2.1HLA-A2.1HLA-A2.1HLA-A2.1HLA-A2.1HLA-A3HLA-A2.1HLA-A2.1	-N/A卵巢癌胃癌卵巢癌一系列肿瘤(胃癌、肾细胞癌、结肠癌、卵巢癌、黑色素瘤)-卵巢癌、黑色素瘤、肾细胞癌-乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、肾细胞癌、结肠癌卵巢癌胃癌、卵巢癌、黑色素瘤、肾细胞癌-N/A一系列肿瘤

777-789783-797883-892884-899

780-788785-793952-960971-980

HLA-DR4       -HLA-A2402     N/AN/A           -HLA-A2.1      N/AHLA-DR1、HLA-DR4、     -HLA-DR52、HLA-DR53-HLA-A2.1      卵巢癌卵巢癌

数字代表HER-2蛋白的氨基酸所在位置；

N/A代表未进行评估。

然而，目前的研究结果只反应了小部分病人的免疫反应情况。自身固有的T细胞和特异性抗体反应是否真正有益，还需要大量流行病学研究和长时间的随访来验证。

病人体内抗HER-2免疫反应的存在提示疫苗可诱导并增强针对HER-2的免疫反应。近几年，许多动物模型均证实疫苗可引起针对HER-2的免疫反应。应用于动物体内的抗HER-2疫苗被证明具有免疫原性，而且是安全有效的。

肿瘤疫苗的主要目的是引起针对肿瘤抗原的特异性免疫反应，这种免疫反应可避免肿瘤发生，并建立长期的免疫记忆。设计疫苗和免疫方式时应考虑免疫原的应用形式。由于HER-2是自身蛋白，因此对于抗HER-2疫苗还应考虑耐受性和自体免疫毒性。应用转基因鼠可评估疫苗针对HER-2的免疫耐受性。目前已建立两种neu转基因鼠，一种是基因组中导入由鼠源性乳腺肿瘤病毒(Murine mammary tumourvirus，MMTV)3’长末端重复启动子调控的野生型鼠neu cDNA[32]。由于鼠neu的过表达，雌性鼠出现自发性原位乳腺癌。这些肿瘤在组织学上与人乳腺癌相似，因此转基因鼠为评估疫苗能否克服免疫耐受提供了一个良好的模型。另一种转基因鼠基因组中导入具有一个点突变的活化形式的neu[32，33]，由于neu原癌基因活化导致小鼠发生自发性乳腺癌。对于这两种转基因鼠，可通过检测动物是否自发肿瘤来评估疫苗的效果。

Bernards等人首先报道，给小鼠注射表达突变的大鼠neu蛋白的成神经细胞瘤细胞系，小鼠不再发生肿瘤。这一研究应用了表达大鼠neu胞外区的牛痘病毒重组体作为疫苗。然而，同样的方法应用于大鼠，注射大鼠肿瘤细胞系后，大鼠仍可发生肿瘤，这说明大鼠对自身neu蛋白产生了耐受性[34]。与此相同，Disis等人也报道应用完整的neu蛋白不能引起鼠的抗neu免疫反应[15]。

为了克服免疫耐受性，有人应用与大鼠neu高度同源的重组人HER-2胞外区免疫大鼠，并推论这种免疫方法将引起针对大鼠neu的交叉免疫反应，从而使动物注射肿瘤细胞后不再发生肿瘤。结果大鼠产生了针对HER-2和大鼠neu的交叉免疫反应。然而，诱导产生的交叉免疫反应非常微弱，皮下注射neu转染的大鼠肿瘤细胞后大鼠仍可发生肿瘤[35]。

最近，应用转基因动物得到了一些可喜的结果。Esserman等人报道应用neu胞外区蛋白进行免疫可诱导动物产生针对自身蛋白的免疫反应[36]。此研究应用了过表达野生型大鼠neu基因的N202转基因鼠系。用neu胞外区免疫转基因鼠可产生抗neu体液和细胞免疫反应，经免疫的转基因鼠有50％没有发生肿瘤[36]。Reilly等人也报道，应用相似的转基因鼠模型，尽管小鼠对转基因产生了明显的耐受性，小鼠在免疫前产生的neu特异性免疫反应类似于乳腺癌病人体内观察到的免疫反应。更重要的是应用经放射线照射的完整细胞和重组的牛痘病毒作为neu特异性疫苗可加强转基因鼠针对neu的特异性体液和细胞免疫，注射neu表达的肿瘤细胞后转基因鼠不再发生肿瘤，同时自发肿瘤形成延迟[37]。在另一个研究中，具有活化大鼠neu基因的转基因鼠模型应用异源细胞疫苗，尽管转基因鼠可产生neu特异的抗肿瘤反应，而且没有产生自发肿瘤或形成移植瘤，但应用疫苗对已形成的自发性肿瘤没有影响[38]。

总之，尽管机体具有对HER-2的耐受性，但同时通过免疫，诱导并加强HER-2特异性免疫反应也具有可行性。免疫耐受是否可被克服并不明确，但在特定的转基因鼠免疫耐受并不完全存在。此外，应用HER-2或细胞疫苗的主要困难是疫苗的生产和保存，疫苗污染的可能性较大，这将阻碍此类疫苗的临床应用。

合成肽的应用为疫苗策略提供了新的前景。合成肽作为疫苗有多种优势：肽非常简单、合成过程经济并可诱导特异的免疫反应。此外，研究提示合成肽可避免耐受性的发生[15]。目前，多种肽疫苗正处于评估阶段。

肽抗原在体内的运输方式对其免疫原性有很大影响。目前应用的方法有：肽疫苗与免疫佐剂合用[39]，构建多聚糖-肽复合物或将肽直接附着在脾细胞或树突状细胞表面[40]。Gu等人构建了疏水多聚糖/原癌蛋白复合物疫苗，使机体更容易运输147个氨基酸长的HER-2蛋白片断，这一肽段包括针对MHC I类分子途径的一个或多个T细胞表位[72]。

目前已发现的可被辅助性T细胞或CTL细胞识别的肽表位是设计抗HER-2疫苗的主要依据。Disis等人研究发现，尽管整个的大鼠neu蛋白不具免疫原性，但应用来源于大鼠neu蛋白的多种辅助性T细胞表位肽免疫大鼠可引发强烈的体液和辅助性T细胞反应[15]。最近，研究发现应用多种人HER-2蛋白辅助性T细胞表位肽，乳腺癌和卵巢癌患者可产生针对肽和HER-2特异的辅助性T细胞反应[76]。

多种肿瘤可能具有相同的CTL表位，因此以CTL表位为基础的肽疫苗可应用于更广泛的人群。Nagata等人研究发现，应用CTL表位肽疫苗可成功诱导CTL反应，从而抑制小鼠肿瘤形成，但不引起任何自身免疫毒性[40]。进一步研究提示相同的肽，如p63或p780可使肿瘤患者或正常人的外周血淋巴细胞(PBMC)在体外致敏[41，73]。诱导产生的HER-2特异性HLA-A24限制性CTL反应可裂解HER-2过表达的肿瘤细胞。目前肽p63已被用于临床实验[73]。

Dakappagari等人研究发现应用B细胞表位也可引起肿瘤抑制性免疫反应。应用位于HER-2胞外区最接近穿膜区的肽段足以诱导产生肿瘤抑制性抗体反应[9，77]。Herceptin作用表位也位于近膜区[23]，由此推测这一区域可有效增强保护性免疫反应。

DNA疫苗包括直接接种表达质粒。注射的DNA一但被细胞吸收，可穿过核膜并作为非复制游离基因分子长期存在，从而导致外源蛋白较长时间的表达。因此，DNA疫苗对于诱导针对表达抗原的长期免疫反应具有潜在优势[78]。

一些研究小组应用这一方法成功诱导了抗HER-2免疫反应[42，43，44]。Concetti等首先报道，将大鼠neu全长DNA注射至小鼠体内可产生抗鼠neu自身抗体[45]。neu转基因荷瘤小鼠应用neu DNA疫苗可阻止乳腺肿瘤生长，并降低转移能力[42]。在另一研究中，转基因鼠应用编码大鼠neu穿膜区和胞外区质粒的DNA疫苗可引起抗neu抗体反应，尽管只是部分抑制肿瘤细胞成瘤，但肿瘤进程得到明显控制[46]。

然而，DNA疫苗的效应也受到一定限制[42]。研究发现DNA疫苗不能突破CTL耐受性[77]。此外，DNA疫苗是否具有突变整合的可能性，以及应用质粒DNA后对肿瘤发展是否会产生影响，这些均缺乏系统的评估[47]。

近些年来，人们应用复杂的动物模型对HER-2疫苗进行体内免疫学评估。研究结果提示诱导抗HER-2免疫反应是可能而且有效的。尽管Disis等人，及其它一些研究小组发现用完整的HER-2蛋白或胞外区进行免疫可导致免疫耐受的出现[15，34]，但应用与临床条件非常接近的转基因鼠模型进行研究发现应用较大的HER-2分子可克服免疫耐受性[36，37，38]。实际上，具有内源性抗HER-2免疫的肿瘤病人已经克服或部分克服了针对HER-2的耐受性[10，62]。有效的抗HER-2免疫包括针对一系列自身表位的内源性天然免疫反应的活化。Cefai等人进一步研究提示抗HER-2疫苗可诱导产生针对自发HER-2表达肿瘤的特异性免疫反应。

显然，如果抗HER-2免疫反应已经产生，应对潜在的自身免疫毒性进行评估。HER-2在正常组织的低表达使得免疫反应只针对肿瘤细胞而不会产生自身免疫毒性。截止目前，所有的研究均提示机体产生的neu特异性免疫在动物不会引起自身免疫反应[15，40，42，45]。然而，由于HER-2在胎儿组织广泛表达，因此对胎儿是否有毒性需进行评估[48]。

动物实验结果表明，疫苗足以引起动物产生抑制移植瘤或自发性肿瘤形成的能力[37，38]，并延缓增生性病变的进程[42，46]。而对于机体已经形成的肿瘤，疫苗不能发挥以上作用[46]。这就提示已经形成的肿瘤有着特殊的性质，它们可逃避免疫监控。免疫逃逸机制可通过肿瘤的微环境进行调节[49，50]。此外，HLA-I类分子在许多乳腺癌[51]和其它肿瘤[52，53]的表达下调可能限制了依赖CTL反应的疫苗发挥作用[37，54，55]。

实验证明，针对肿瘤细胞HER2/neu的治疗可有效逆转HER-2/neu过度表达引起的肿瘤恶性表型。HER-2人源化抗体Herceptin已被美国FDA批准用于治疗HER-2过度表达的转移性乳腺癌，并获得较好的临床效果。Herceptin目前已在国内临床试用，但其价格相当昂贵，绝大部分病人在经济上难以承受。

虽然通过被动免疫方法应用肿瘤抑制性抗体有较好的临床疗效，但同时也存在一些问题，如：产生抗同型抗体(idiotypic antibody)，组织分配不足，用药量大，价格昂贵等，这些均限制了被动免疫治疗。

与此相比，应用疫苗诱导机体产生内源性肿瘤抑制性抗体，并刺激免疫记忆，这种方法可能更容易使病人产生长期有效的作用，而且更为经济。

发明内容

发明人利用已上市的Herceptin抗体，通过筛选噬菌体12肽库得到能与Herceptin特异性结合的小肽。

噬菌体展示技术是近年发展起来的一种技术，它在抗原表位分析、蛋白质分子结合特性研究及先导化合物的发现等领域有广泛的应用前景，利用噬菌体展示技术获得活性肽也是近年用于肽药开发的常用方法[7]。噬菌体肽库技术是研究大分子相互作用的理想工具。人们可以在对结构-功能关系缺乏了解的情况下，利用噬菌体肽库技术，筛选可以同受体、酶、DNA结合蛋白、细胞因子、抗体等结合的多肽或蛋白质，用于研究天然蛋白质的结合特性，鉴定具有高亲和力与特异性的酶作用底物，定位抗体结合表位等。其中利用抗HER-2抗体N21从HER-2基因片断噬菌体库分离到的55个氨基酸的肽段EP531可诱导小鼠产生针对HER-2的主动免疫反应，且产生的抗体可有效抑制肿瘤细胞增殖[60]。

本研究利用已上市的Herceptin抗体，通过筛选噬菌体12肽库得到能与Herceptin特异性结合的小肽。由于常规的靶蛋白包被过程中，蛋白质通过疏水作用吸附在塑料表面，这种吸附可以导致蛋白质的部分变性[71，58，59]；而且固相吸附可能筛选到一系列富含酪氨酸与色氨酸的短肽，它们可与塑料结合，并且不能被BSA封闭阻断[79]。因此在筛选过程中发明人应用了Protein A-Sepharose 4B珠子对抗体吸附后进行液相Bio-panning过程，比较以往的固相吸附过程，这种方法大大增强了噬菌体展示小肽与抗体的接触机会，从而能有效筛选到阳性克隆。同时为减少Bio-panning过程中的非特异吸附，增加筛选阳性率，发明人用正常人血清IgG对原始噬菌体肽库进行了预吸附，以达到去除部分非特异性结合噬菌体的目的。此外，为了避免常规洗脱步骤不能将与目的蛋白结合亲和力的噬菌体洗脱下来，发明人省略了洗脱步骤，而是将Protein A-Sepharose 4B、Herceptin与噬菌体三者混合物一并加入大肠杆菌中进行扩增。通过对Bio-panning技术路线的改进，筛选阳性率由一般固相吸附的2-8％[60]，达到13.7％。

通过对Herceptin的筛选发明人仅得到两种小肽序列，其中一种经原核表达后不与Herceptin结合。得到的阳性序列单一可能与文库倾向性有关。目前文库倾向性产生的原因尚未完全阐明，但是在同一文库中某些重组后噬菌体感染能力增强或降低的情况确实存在。例如Burritt等人发现蛋白的展示少于预计值[61]，Blond-Elguindi的研究表明文库中含有Gly的克隆易于被选择，而含有Cys的克隆不易被选择[62]。

发明人通过筛选噬菌体12肽库得到能与Herceptin特异性结合的小肽H98，该肽具有以下序列：

LLGPYELWELSH

发明人筛选到的小肽H98含一个Gly，而没有Cys参与。Kay等的研究发现外源性短肽中含有单数半胱氨酸的克隆难以被扩增。原因在于这一半胱氨酸可能与pIII的8个天然的半胱氨酸中的任意一个形成二硫键，从而影响噬菌体的感染能力[63]。

目前，噬菌体展示肽库技术被广泛地应用于鉴定抗体结合表位的研究中。抗体的结合表位即抗原决定簇大体上可以分为连续性表位与非连续性表位两种。连续性表位又称为线性表位或序列性表位。这类表位一般由在一级结构上连续排列的数个氨基酸构成。针对这种表位的抗体可以识别变性蛋白或天然抗原的连续性表位。非连续性表位又称为构象性表位，可以由在一级结构上相距较远，但经过一系列折叠后相互靠近的氨基酸残基构成，这类表位一般是由多个氨基酸分子构成的裂隙或沟、槽等空间结构。从噬菌体展示文库中一般无法筛选到真正同天然表位一致或同源的非连续性表位，而只能筛选到可以模拟原有天然表位结合特性的所谓的“mimotope”[64]。发明人将筛选获得的阳性噬菌体克隆H98进行测序及Blast比较，结果表明：H98小肽与HER-2无明显序列同源性，因此小肽模拟的是HER-2的天然构象“mimotope”，即三级结构，而不是HER-2的某一段氨基酸序列。发明人根据文献报道[80]和PDB数据库中获得的Herceptin与HER-2相互作用的三维结构1N8Z，并利用InsightII软件包中的Homology模块构建了H98小肽与Herceptina相互作用的三维结构。由模拟的H98与Herceptin的活性部位的相互作用情况也可以看出H98与Herceptin的活性部位中的重要残基具有静电相互作用，氢键作用，(-(共轭相互作用。根据文献报道，Herceptin针对的HER-2抗原决定簇是由分散在不同区域的三个环状结构经在空间折叠组成的，而并非是肽链上的一段连续肽。小肽H98可模拟其中2个环状结构的重要氨基酸HER-2₅₆₀D和HER-2₅₇₃F、HER-2₅₇₂P。如果将H98₁L突变为Q，即第3个环状结构中与Herceptin形成氢键相互作用的HER-2₆₀₂Q，可使H98₁Q与Herceptin A30N形成氢键相互作用。通过这种突变可能会加强H98小肽与Herceptin的亲和力。

进一步地，发明人通过基因技术，将上述小肽进行突变得到一系列的衍生物。各衍生物的结构如下：

H98N10N8N6C10C8C6M8M6MutN3-4MutC1-2MutN1-2MutN1CyclicH98

LLGPYEL WELSHLLGPYEL WELLLGPYEL WLLGPYEGPYEL WELSHYEL WELSHLWELSHGPYEL WELPYEL WELL VAYEL WELSHLLGPYEL WEL GA GAGPYEL WELSHQLGPYEL WELSHCLLGPYEL WELSH C

发明人将突变的小肽进行与GST的融合表达，ELISA结果提示突变体C10，MutN1-2，MutN1和CyclicH98具有与Herceptin的亲和力。其中，MutN1将H98₁L突变为Q，可加强H98小肽与Herceptin的亲和力。

此外，发明人对H98的截断体与GST融合形式的分段表达，结果提示羧基末端的2个氨基酸和氨基端的第3、4位氨基酸在小肽与Herceptin的结合中发挥重要作用，去除这几个氨基酸的小肽片段与Herceptin均不结合。这与软件分析的小肽H98可与Herceptin形成静电相互作用，氢键作用，(-(共轭相互作用的氨基酸并不完全一致。

本发明的一个方面是作为HER-2模拟抗原表位的肽，它以正向或反向连续地或间隔地包含多个或只包含一个以下通式(I)所示的氨基酸序列的肽：X9X1X2GPX3X4X5X6X7X8SHX10，(I)

其中，

X1可以存在或不存在，为天然的氨基酸残基，

X2可以存在或不存在，为疏水性氨基酸残基。

X3为极性氨基酸，

X4为极性氨基酸，

X5为疏水性氨基酸，

X6为极性氨基酸

X7为极性氨基酸，可以与X4相同或不同，

X8为疏水性氨基酸，可以与X5相同或不同，

其中，X9和X10为天然氨基酸，可以存在或不存在，式(I)的肽可以是线形的或环化的。

优选地，

其中，X1可以存在或不存在，为L，I，V，M，A，F，G，Q或N，

X2可以存在或不存在，为L，I，V，M，A或F，G

X3为Y，W，F，T或S

X4为E或D，

X5为L，I，V，M，A或F

X6为W，Y或F，

X7为E或D，可以与X4相同或不同，

X8为L，I，V，M，A或F，可以与X5相同或不同，

X9和X10可以存在或不存在，为C或S。

更优选地，

其中，X1可以存在或不存在，为L，G或Q，

X2可以存在或不存在，为L或A，

X3为Y，

X4为E，

X5为L，

X6为W，

X7为E，

X8为L，

X9和X10可以存在或不存在为C。

其中，几个在实施例中验证的式I的氨基酸序列是

H98         LLGPYEL WELSH

C10         GPYEL WELSH

MutN1-2     GAGPYEL WELSH

MutN1       QLGPYEL WELSH或

CyclicH98   CLLGPYEL WELSH C。

通常，含有1-10个氨基酸的氨基酸序列称作寡肽，多于10个氨基酸，但分子量在1万道尔顿以下的氨基酸序列称为多肽，而分子量在1万道尔顿以上的氨基酸序列称为蛋白质。而寡肽和较短的多肽经常称为小肽。为叙述方便，在本文中，寡肽，小肽，多肽和蛋白统称为肽。

本发明所述天然氨基酸包括极性氨基酸：丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)和组胺酸(His)；疏水性氨基酸：甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Try)和甲硫氨酸(Met)。

本领域技术人员会认识到，上述的肽的保守性替换的突变体完全具有其能与Herceptin特异性结合的生物学活性。所谓的保守性替换，是指用相似的物理化学性质的氨基酸替换现有的氨基酸。

优选的，每个氨基酸可以用最相近似的氨基酸替换，如下表所述：

原始残基	保守性替换	最保守的替换
			A	V，L，I	V
R	K，Q，N	K
			N	Q，H，K，R	Q
D	E	E
			C	S	S
Q	N	N
			E	D	D
G	A	A
			H	N，Q，K，R	N
I	L，V，M，A，F	L
			L	I，V，M，A，F	I
K	R，Q，N	R
			M	L，F，I	L
F	L，V，I，A，Y，W	W
			P	A	A
S	T	T
			T	S	S
W	Y，F	Y
			Y	W，F，T，S	F
V	I，L，M，F，A	L

本发明的一个重要方面是包含上述本发明的拟表位肽的肽，该肽因为拟表位肽的递呈而得以与Herceptin特异性结合，诱导针对HER-2的体液和细胞免疫，因此可用于肿瘤治疗，其中，本发明的拟表位肽在肽中以正向或反向连续地或间隔地出现多次或只出现一次。

本发明的肽可以按本领域技术人员已知的常规固相合成方法合成。例如本发明肽可以按Steward and Young(65)描述的方法用AppliedBiosystem合成仪或PioneerTM肽合成仪按固相化学技术合成。也可以先合成多个片段，然后连在一起形成更大的片段。对于固相肽合成可参见(66)中可以找到许多技术的介绍。一般，这些方法包括向生长的肽链上依次添加一个或多个氨基酸或适当保护的氨基酸。一般，第一个氨基酸的氨基或羧基用适当的保护基保护，然后将保护的氨基酸连在惰性固相载体上，随后在适于形成酰胺键的条件下加入相应氨基或羧基被适当保护的序列中的下一个氨基酸。然后从新加入的氨基酸残基上除去保护基，再加入必要时适当保护的下一个氨基酸，如此重复操作。当所有氨基酸以正确的顺序连接后，相继或同时除去任何剩余的保护基和固相支持物，得到最终的多肽。通过简单修改此一般程序，可以一次向生长链添加一个以上的氨基酸。

本发明的肽还可以用含有本发明肽或融合蛋白编码序列的多核苷酸在适当宿主中表达，然后纯化所表达的肽产物来获得。编码本发明小肽的核苷酸序列正、反义链可以按本领域熟知的固相亚磷酸酰胺三酯法在DNA合成仪上合成。将合成得到的互补的正、反义链在适当缓冲液中退火得到编码本发明小肽的寡核苷酸。在该合成过程中，可以在寡核苷酸两侧引入用于克隆的粘性末端序列。然后，可以将编码本发明小肽的寡核苷酸与用相应限制性核酸内切酶消化的含另一多肽或蛋白编码序列的适当载体用T₄连接酶连接，得到编码融合蛋白的DNA序列。所述另一多肽或蛋白的编码序列一般是已知的，有些可以以载体形式购买得到，或者可以按常规方法合成或从已知生物体中克隆得到。如上所述得到的本发明的基因，或者各种DNA片段的核苷酸序列的测定可用常规方法如双脱氧链终止法(67)。这类核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。当然，在表达载体中应含有适当的启动子、核糖体结合位点、终止子等。为了表达产物在细胞腔室中的定位，在多肽编码序列上游可加入适当的前导序列。合适载体和启动子的选择为本领域普通技术人员周知。细菌适用的有效表达载体可以这样来构建：将编码目的蛋白的结构DNA序列随同适当的翻译起始和终止信号被插入到带有一个功能启动子的可操纵的阅读框中。本领域普通技术人员周知用于构建含有本发明核苷酸序列以及合适的转录及翻译调控元件之载体的方法。本领域技术人员知晓，根据本发明DNA序列所插入的表达载体或构建体的种类和特性选择合适的宿主以表达目的蛋白质。适于表达本发明的多肽的宿主包括但不限于：原核宿主，诸如大肠杆菌、芽孢杆菌属、链霉菌属等；真核宿主，诸如：酵母属、曲霉属、昆虫细胞，诸如果蝇S2和草地夜蛾Sf9；动物细胞，如CHO、COS(猴肾成纤维细胞系)，及其它的能表达相容载体的细胞系。将构建体导入上述宿主细胞的方法为本领域技术人员周知，包括但不限于：氯化钙介导的转化、磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔、显微注射、粒子轰击法或基因枪方法(68，68，69)。在适当的培养条件与培养基中培养经转化的宿主菌株或细胞，使其生长到恰当的细胞密度之后，用适当的方法(例如温度转变或化学药品诱导)诱导所选择的启动子，并将细胞再培养一段时间。针对不同的宿主菌株或细胞选择以及所表达的目的蛋白质的性质相应的培养条件和培养基在本领域技术人员知识范围之内。所表达的多肽或融合蛋白按常规方法从培养物中分离和纯化，如离心、沉淀、各种色谱、HPLC等。

本发明的肽有可能诱导产生比自身HER-2更强的体液和细胞免疫反应，这种具有Herceptin特异性结合小肽与HER-2具有相似的抗原表位，作为HER-2抗原模拟表位诱导免疫反应。本发明的肽可用于治疗例如下列器官的原发或转移的实体肿瘤和癌：乳腺、结肠、直肠、肺、口咽、喉咽、食管、胃、胰腺、肝、胆囊、胆管、小肠、肾、膀胱、泌尿道上皮宫颈、子宫、卵巢、绒毛膜癌和妊辰营养层病男性生殖道、包括前列腺、精囊和睾丸、甲状腺、肾上腺和垂体血管生成性瘤、黑素瘤、从骨或软组织发生的肉瘤和卡波济肉瘤；脑、神经、眼和脑膜的肿瘤，包括星形细胞瘤、胶质细胞瘤、成胶质细胞瘤、成视网膜细胞瘤、神经瘤、成神经细胞瘤、神经鞘瘤和神经膜瘤；从造血恶性疾病如白血病发生的实体肿瘤，包括绿色瘤、浆细胞瘤、和皮肤性T-细胞瘤/白血病；淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。本发明的肽还可用于防止上述肿瘤的转移。

本发明的肽用作药物组合物，特别是用作疫苗时，与本领域常用的增强免疫的细胞因子或蛋白、其它肿瘤常用疫苗或常用的载体相混合或形成重组蛋白。其中的细胞因子是白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-12(IL-12)、集落刺激因子(GM-CSF)、CCL2、CCL5、CCL7、CCL19、CCL21、CCL20、CXCL9、CXCL10、CXCL12、CXCL15、XCL1、FTL3L、CD40L等，其中的蛋白是热休克蛋白等，其中的肿瘤常用疫苗主要指的是癌基因、突变的抑癌基因、肿瘤相关抗原，其中的载体是钥匙孔戚血蓝蛋白，血清白蛋白，灭活的细菌毒素等。其中的癌基因如CEA等、突变的抑癌基因如p53等、肿瘤相关抗原如黑色素瘤相关抗原等，其中的血清白蛋白可以是牛血清白蛋白或人血清白蛋白等，细菌毒素是破伤风、白喉毒素或结核菌素等。

本发明的肽用于免疫接种时，与本领域常用的载体相混合。可用于本发明的载体例如但不限于：钥匙孔戚血蓝蛋白(KLH)，血清清蛋白如牛血清白蛋白(BSA)，灭活的细菌毒素如破伤风(TT)或白喉毒素(DT)或结核菌素(PPD)，也可以细胞因子或其它肿瘤抗原作为载体蛋白，发挥多功能疫苗作用。

本发明的肽用于免疫接种时，与本领域常用的佐剂相混合，其中的佐剂包括但不限于弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂铝或钙的氢氧化物或磷酸盐。

本发明的免疫原可以包含前述的肽，即本发明的免疫原是以包含本发明的拟表位或其衍生物的肽或与其它分子的重组蛋白。

本发明还包括基因治疗，即通过将编码本发明多肽或多肽融合蛋白的基因转移到患者体内，以在体内表达本发明的多肽或多肽融合蛋白，从而产生治疗效果。本领域中已知各种各样的将DNA转移或传递到细胞来表达基因产物蛋白质的方法，例如《体内哺乳动物体细胞中的基因转移》(70)中所述。基因治疗包括将DNA序列掺入体细胞或者生殖细胞用于离体或体内治疗。

本发明还包括基因治疗，即通过将编码本发明肽的核苷酸转移到患者的细胞中，以在体内表达本发明的多肽，从而产生治疗效果。，该核苷酸可以独立存在，也可以与编码本领域常用的增强免疫的细胞因子或蛋白、其它肿瘤常用疫苗或常用的载体的基因相混合或形成重组核酸分子。其中的细胞因子是白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-12(IL-12)、集落刺激因子(GM-CSF)、CCL2、CCL5、CCL7、CCL19、CCL21、CCL20、CXCL9、CXCL10、CXCL12、CXCL15、XCL1、FTL3L、CD40L等，其中的蛋白是热休克蛋白等，其中的肿瘤常用疫苗主要指的是癌基因、突变的抑癌基因、肿瘤相关抗原，其中的载体是钥匙孔戚血蓝蛋白，血清白蛋白，灭活的细菌毒素等。其中的癌基因如CEA等、突变的抑癌基因如p53等、肿瘤相关抗原如黑色素瘤相关抗原等，其中的血清白蛋白可以是牛血清白蛋白或人血清白蛋白等，细菌毒素是破伤风、白喉毒素或结核菌素等。

本领域中已知各种各样的将DNA转移或传递到细胞来表达基因产物蛋白质的方法，例如《体内哺乳动物体细胞中的基因转移》(70)中所述。基因治疗包括将DNA序列掺入体细胞或者生殖细胞用于离体或体内治疗。

基因治疗的基因转移方法分成三大类：(1)物理的(例如电穿孔，直接基因转移和粒子轰击)，(2)化学的(例如基于脂质的载体和其它非病毒载体)和(3)生物的(例如病毒载体)。例如，像包被有DNA的脂质体这样的非病毒载体可以静脉注射入患者体内。载体或者“裸露”DNA的基因也可以直接注入期望的器官、组织或者肿瘤来靶向转移治疗性DNA。

基本转移基因的方法包括离体基因转移、体内基因转移和体外基因转移。在患者体内时把DNA导入到患者的细胞内。

因此，本发明进一步涉及含有本发明多核苷酸的质粒或病毒载体，以及含有本发明多核苷酸或载体的细胞。

因此，本发明涉及作为基因治疗药物的本发明多肽的多核苷酸、载体或细胞。

相应地，本发明涉及一种治疗癌症的药物组合物，其含有本发明的核苷酸、核苷酸编码的多肽及多肽与其它分子重组的融合蛋白、载体或细胞，和必要时药物可接受、特别是基因治疗适用的赋形剂。

最后，本发明涉及治疗癌症的方法，包括给予需此治疗的患者治疗有效数量的本发明所定义的多肽、多肽融合蛋白、核苷酸、载体或细胞。

以下实施例用于说明本发明，而对本发明范围没有任何限制意义。

附图说明

图1 Herceptin结合GST融合蛋白或GST的Western blot分析。

图2蛋白或小肽对Herceptin结合HER-2的抑制作用。

图3 HER-2或小肽H98抑制Herceptin与GST-H98的结合。

图4小肽对Herceptin抑制细胞增殖的影响。

图5经GST-H98或GST免疫后小鼠的体液免疫反应。

图6免疫沉淀-Western blot检测免疫血清中的HER-2抗体。

N.正常鼠血清1∶100稀释；1-5.经GST-H98免疫的不同小鼠血清1∶100稀释；6.经GST免疫的小鼠血清1∶100稀释。由图可知2号GST-H98免疫鼠血清可与变性的HER-2蛋白反应。

图7 T cell增殖实验。

图8应用Insight II(2000)的结构分析，其中，

A.Herceptin与HER-2结合的三维结构。B.Herceptin与小肽H98结合的三维结构。

图9重组质粒pGEX-4T1-X酶切鉴定图。M.marker；1为pGEX-4T1-H98经EcoRV/HindIII双酶切；2-10，分别为pGEX-4T1-N10，N8，N6，C10，C8，C6，M8，M6，MutN1经EcoRV单酶切；11为pGEX-4T1经EcoRV/HindIII双酶切。由图可知重组pGEX-4T1-X小肽载体经酶切后均可释放1700bp的片段，而pGEX-4T1原始载体酶切后没有片段释放。

图10融合蛋白GST-X在大肠杆菌BL21中表达的SDS-PAGE分析。M，marker；图中单数泳道均为转染质粒后未经诱导的菌体总蛋白，偶数泳道均为经IPTG诱导的菌体总蛋白。依次两两一对，1与2(GST)，3与4(GST-H98)，5与6(GST-N10)，7与8(GST-N8)，9与10(GST-N6)，11与12(GST-C10)，13与14(GST-C8)，15与16(GST-C6)，17与18(GST-M8)，19与20(GST-M6)，21与22(GST-MutN1)。由图中可知，目的蛋白均有较高水平表达。

图11 SDS-PAGE分析纯化的融合蛋白GST-X，其中，M，marker；1，GST；2，GST-H98；3，GST-N10；4，GST-N8；5，GST-N6；6，GST-C10；7，GST-C8；8，GST-C6；9，GST-M8；10，GST-M6；11，GST-MutN1。

图12 ELISA检测Herceptin与GST-X的结合。其中，1，GST；2，GST-H98；3，GST-N10；4，GST-N8；5，GST-N6；6，GST-C10；7，GST-C8；8，GST-C6；9，GST-M8；10，GST-M6；11，GST-MutN3-4；12，GST-MutC1-2；13，GST-MutN1-2；14，GST-MutN1；15，GST-CyclicH98.

图13 Western blot检测Herceptin与GST-X的结合。其中，1，GST；2，GST-H98；3，GST-N10；4，GST-N8；5，GST-N6；6，GST-C10；7，GST-C8；8，GST-C6；9，GST-M8；10，GST-M6；11，GST-MutN3-4；12，GST-MutC1-2；13，GST-MutN1-2；14，GST-MutN1；15，GST-CyclicH98.

以下实施例仅为更好地说明本发明，而非限制本发明。

具体实施方式

一、实验材料

(一)表达载体，菌株及分子克隆试剂

谷胱甘肽巯基转移酶原核表达载体pGEX-4T1、大肠杆菌菌株BL21均由北京市肿瘤防治研究所生化室保存。分子克隆所用的各种限制性内切酶，T4 DNA连接酶为New England Biolabs公司产品。

(二)抗体、实验动物及相关材料

HRP-羊抗人IgG抗体(1∶2500)购于中山公司。辣根过氧化物酶标记小鼠抗M13噬菌体单克隆抗体(1∶5000)为Amersham Biosciences公司产品。

实验用动物：昆明鼠购自中国医学科学院实验动物中心，由北京大学临床肿瘤学院动物室饲养。

(三)噬菌体展示随机12肽库及其操作试剂

1.噬菌体展示随机12肽库

噬菌体展示12肽随机短肽库试剂盒为New England Biolabs公司产品，包括12-mer噬菌体展示文库100μl(1.5×10¹³pfu/ml)，保存在50％甘油-TBS，多样性为2.7×10⁹。M13噬菌体宿主ER2738为F因子阳性大肠杆菌，购自New England Biolabs公司。

-28gIII测序引物：5’gtatgggatttgctaaacaac 3’

-96gIII测序引物：5’ccctcatagttagcggaacg 3’

2.噬菌体操作试剂

(1)(1)(1)LB液体培养基：细菌用胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 5g，高压灭菌后室温保存。

(2)(2)(2)四环素：用无水乙醇配成20mg/ml的储存液，分装后，-20℃储存。

(3)LB(Tet⁺)固体培养平板：每升上述LB培养基内加入15g琼脂，高压灭菌，待温度降至70(C以下，加入1ml四环素储液(20mg/ml)，4℃避光保存。

(4)IPTG/Xgal：25ml二甲基甲酰胺中加入1.25g IPTG与1g Xgal，-20℃避光保存。

(5)LB(Tet⁺)/IPTG/Xgal平板：

将30ul IPTG/Xgal加入300ul LB培养液中，混匀后加至LB(Tet⁺)固体培养平板，用玻璃棒涂匀，吹干后4℃避光保存。

(6)顶层琼脂(Agarose Top)：1000ml

细菌用胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 5g，MgCl₂(6H₂O1g，agarose 7g。

(7)TBS溶液：50mmol/L Tris-HCl pH 7.5，150mmol/L NaCl。高压灭菌后，保存于4(C。

(8)PEG/NaCl：20％(w/v)PEG8000，2.5mol/L NaCl。高压灭菌后保存于室温。

(9)NaI Buffer：10mmol/L Tris-HCl pH 8.0，1mmol/L EDTA，4mol/L NaI。

(四)大肠杆菌表达蛋白质纯化用试剂

1.细菌裂解液：含1mmol/L PMSF，1mg/mL Lysozyme的PBS溶液。

2.Glutathione-Sepharose 4B亲和层析洗脱缓冲液：15mmol/L GSH(还原型谷胱苷肽)，50mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，120mmol/L NaCl。

二.实施例：

实施例1

(一)Herceptin对噬菌体展示12肽库的筛选

1.ER2738菌株的保存与复苏

ER2738菌液保存加入50％甘油，保存于-70℃冰箱。复苏时菌种接种于LB(Tet⁺)琼脂平板，37℃孵箱培养10h后保存于4℃冰箱。保存时间不宜超过3周。

2.12-mer噬菌体展示短肽库滴度及重组率的测定

挑取新复苏的ER2738单个菌落，接种于2ml LB(Tet⁺)，扩增至对数中期备用(OD₆₀₀＝0.5-0.6)。将短肽库原始库分别做10^-8，10^-9，10^-10，10^-11稀释。每一稀释度加入上述菌液200μl。室温静置5min，加入3ml预温至45℃的Agarose Top，迅速混匀，倾倒在预温至37℃并涂有30μl IPTG/X-gal的LB(Tet⁺)平板上。晃动平皿使Agarose Top涂布均匀。37℃培养约10h后，计数蓝色噬菌斑，计算原始库滴度及外源片段重组率。

滴定结果显示，噬菌体滴度约为1.5×10¹³pfu/ml。所有噬菌体均呈蓝色，外源片段重组率100％。

3.噬菌体展示短肽库的Bio-panning

挑取ER2537单菌落，分别扩增于2ml及20ml LB(Tet⁺)培养基中用于洗脱物的滴定与扩增。

取正常人血清IgG 100μg，Herceptin 50μg分别与ProteinA-Sepharose 4B珠子4℃摇3h，TBST(0.1％Tween-20)洗3遍。原始库噬菌体(1.5×10¹¹pfu)加入正常人IgG与Protein A-Sepharose 4B珠子的混合物中进行非特异性吸附。4℃摇2h，离心取上清加入Herceptin与Protein A-Sepharose 4B珠子的混合物中进行特异性吸附。4℃摇1h，离心，反应混合物用TBST(0.1％Tween)洗5遍，取少量反应混合物(约1μl)，加入200μl扩增至对数中期的ER2537菌液中，室温放置5min，加入3ml预温的Agarose Top，迅速混匀并将该混合物倾倒在LB(Tet⁺)/IPTG/Xgal平板上，晃动平皿使Agarose Top分布均匀。37℃孵育10h，计数噬菌斑并计算第一轮Output滴度。

其余洗脱物加入20ml对数早期(OD₆₀₀＝0.3-0.4)的ER2738菌液中，37℃，225rpm扩增4.5h。离心沉淀细菌，取80％上清加入1/6体积的PEG/NaCl沉淀过夜(或4℃沉淀1h以上)。10,000rpm，4℃离心15min。弃上清，再次短暂离心弃去残余上清。以1mlTBS悬浮沉淀，加1/6体积的PEG/NaCl再次冰上沉淀15-60min。4℃离心10min，弃上清，再次短暂离心弃去残余上清。以200μl TBS悬浮沉淀。离心1min，沉淀残余不溶物。上清移入另一无菌离心管内，即为扩增后洗脱物，用于下一轮Bio-Panning。取少量上清稀释后测定第一轮扩增滴度，即第二轮Input滴度。

重复Bio-Panning过程3次。由第二轮起，逐步缩短噬菌体库与包被受体结合的时间并将洗液中Tween-20的浓度提高到0.5％。

经过3轮Bio-Panning后，短肽库得到了逐步富集(表1)，但富集现象并不明显。

表1 Herceptin筛库过程中12肽库的富集

Roundpanning	ofInput phages(pfu)	Output phages(pfu)	Relative yield(pfu)
				1st2nd3rd	1.5×10113.7×10123×1012	8.2×1049×1053.7×106	5.5×10-72.4×10-71.2×10-6

4.高滴度单克隆噬菌体的制备

滴定最后一轮Bio-Panning洗脱物，选择噬菌斑少于100个的培养平皿，挑选分隔良好的单克隆噬菌斑。挑取噬菌斑时，用剪头塑料枪头插入LB平板中，将完整的噬菌斑吸出，吹到1ml对数生长早期的ER2537菌液中，37℃，225rpm扩增4.5h。离心沉淀细菌，上清为高滴度单克隆噬菌体溶液，4℃保存。

实施例2 阳性噬菌体克隆的筛选与鉴定

1.ELISA法初步筛选阳性克隆

分别以5μl/ml Heceptin和正常人IgG包被96孔板，4℃过夜。弃去包被液，每孔加200μl封闭液，4℃过夜。弃去封闭液后以TBST(0.1％Tween-20-)洗板4次，每孔加入40μl含噬菌体的扩增后细菌上清(每一克隆设两个平行孔)。室温结合1-2h，洗板6次后加入酶标抗M13单抗(1∶5000)，室温结合1h，洗板6次。每孔加入100μl OPD底物液，室温显色10-30min，终止反应后于OD₄₉₂读数。

对300个第三轮Bio-Panning后的噬菌体克隆进行了扩增及ELISA鉴定。先后共获得41个阳性噬菌体克隆，可特异地结合Herceptin，而与正常人血清IgG不结合，表2列出了其中8个阳性克隆。阳性率约为13.7％。

表2 ELISA检测噬菌体克隆与Herceptin的结合

克隆序号	与Herceptin的结合OD492	与正常人IgG的结合OD492
			H15H22H31H57H63H70H75H98原始库phage	1.5521.6201.5121.5761.6921.6871.5931.6770.253	0.2330.2340.2710.2430.2470.2400.2980.2510.243

2.阳性克隆的测序

制备阳性噬菌体克隆测序模板。将新鲜扩增的1ml噬菌体上清，10,000rpm离心15min，取0.5ml噬菌体上清移入另一无菌离心管中，加入200μl PEG/NaCl溶液，颠倒混匀，室温放置10min，沉淀噬菌体。10,000rpm离心10min，弃上清，再次短暂离心，小心将残余上清全部吸弃。沉淀以100μl NaI Buffer彻底悬浮，加入250μl乙醇，室温放置10min，这一过程中噬菌体的单链DNA将获得优先沉淀，而噬菌体蛋白质会保留在溶液中。离心沉淀噬菌体DNA，10,000rpm，10min。沉淀以70％乙醇洗一次。吹干后沉淀加20μl TE Buffer悬浮。为充分悬浮沉淀，可以在加入TE后反复震荡，离心3-5次。取10μl模板样品送上海申友公司进行DNA测序，其余保存在-20℃。测序使用-96gIII测序引物。

在41个阳性克隆中，对其中26个噬菌体克隆进行测序鉴定。其中25个克隆序列完全一致，只有一个克隆序列与其它不同。将25个序列一致的克隆命名为H98。

其中，H98为：LLGPYEL WELSH

实施例3GST-H98融合蛋白的原核表达及纯化

1.GST-H98融合蛋白表达载体pGEX-4T1-H98的构建

1.1小肽序列的退火反应

根据从噬菌体12肽库筛选到的与Herceptin结合的阳性小肽H98的测序结果设计小肽H98正义和反义单链DNA片段，并于引物两端分别引入用于克隆的BamHI及SalI粘性末端序列，并在小肽序列末端引入终止密码子和HindII酶切位点用于重组质粒的酶切鉴定(表3)。

表3 编码小肽的寡核苷酸序列

小肽名称	所含氨基酸	引物方向	引物序列
				H98	H98 12个氨基酸	正义引物反义引物	5′-GATCC(H98)TGA  AAGCTTG5′-TCGAC AAGCTT TCA(H98)G
N10	H98氨基端10个氨基酸	正义引物反义引物	5′-GATCC(N10)TGA  GATATCG5′-TCGAC GATATC TCA(N10)G
				N8	H98氨基端8个氨基酸	正义引物反义引物	5′-GATCC(N8)TGA  GATATCG5′-TCGAC GATATC TCA(N8)G
N6	H98氨基端6个氨基酸	正义引物反义引物	5′-GATCC(N6)TGA  GATATCG5′-TCGAC GATATC TCA(N6)G
				C10	H98羧基端10个氨基酸	正义引物反义引物	5′-GATCC(C10)TGA  GATATCG5′-TCGAC GATATC TCA(C10)G
C8	H98羧基端8个氨基酸	正义引物反义引物	5′-GATCC(C8)TGA  GATATCG5′-TCGAC GATATC TCA(C8)G
				C6	H98羧基端6个氨基酸	正义引物反义引物	5′-GATCC(C6)TGA  GATATCG5′-TCGAC GATATC TCA(C6)G

M8	H98第3-10位氨基酸	正义引物反义引物	5′-GATCC(M8)TGA  GATATCG5′-TCGAC GATATC TCA(M8)G
				M6	H98第4-9位氨基酸	正义引物反义引物	5′-GATCC(M6)TGA  GATATCG5′-TCGAC GATATC TCA(M6)G
MutN3-4	H98氨基端第3、4位氨基酸突变的小肽	正义引物反义引物	5′-GATCC(MutN3-4)TGA  AAGCTTG5′-TCGAC AAGCTT TCA(MutN3-4)G
				MutC1-2	H98羧基端第1、2位氨基酸突变的小肽	正义引物反义引物	5′-GATCC(MutC1-2)TGA  GATATCG5′-TCGAC GATATC TCA(MutC1-2)G
MutN1-2	H98氨基端第1、2位氨基酸突变的小肽	正义引物反义引物	5′-GATCC(MutN1-2)TGA  GATATCG5′-TCGAC GATATC TCA(MutN1-2)G
				MutN1	H98氨基端第1位氨基酸突变的小肽	正义引物反义引物	5′-GATCC(MutN1)TGA  GATATCG5′-TCGAC GATATC TCA(MutN1)G
CyclicH98	H98氨基端、羧基端分别加入半胱氨酸的小肽	正义引物反义引物	5′-GATCC(CyclicH98)TGA  GATATCG5′-TCGAC GATATC TCA(CyclicH98)G

下划线处为酶切为点，方框处为终止密码子，括号内黑体为小肽序列。

将引物分别溶于TE buffr，终浓度为1μg/ml。取1ul正义和反义引物加入18μl H₂O中，混匀。75℃水浴5min，使DNA变性，缓慢降至室温使DNA复性。

1.2载体pGEX-4T1的酶切及其与H98小肽DNA片段的连接

内切酶BamHI/SalI消化载体pGEX-4T1，经QIAGEN凝胶DNA纯化试剂盒回收酶切片断，将30ng退火H98片断与载体pGEX-4T1连接并转化BL21氯化钙感受态细菌，最后小提质粒并以HindIII/EcoRV酶切鉴定重组质粒pGEX-4T1-H98。

结果：由于H98寡核苷酸片断中引入了HindIII酶切位点，pGEX-4T1载体没有HindIII酶切位点，但具有EcoRV酶切位点，因此重组质粒pGEX-4T1-H98经HindIII/EcoRV双酶切可释放出1700bp大小的片段；而没有克隆片段插入的空载体pGEX-4T1经HindIII/EcoRV双酶切，质粒被切开但无释放片段，结果与预测相符(图9)。

2.小批量重组蛋白的诱导及表达

(1)无菌吸头从转化盘中挑取一单克隆，接种于2ml LB(Amp⁺)培养液中，225rpm 37℃震荡培养过夜；

(2)次日取上述菌液300μl稀释至3ml(1∶10或1∶5)LB(Amp⁺)继续培养2h，至OD₆₀₀＝1左右，吸出1.5ml做未诱导的阴性对照，另1.5ml加IPTG至终浓度为0.5mmol/L或1mmol/L，继续培养3h；

(3)台式离心机离心30秒(12,000-15,000rpm)，弃上清，沉淀加PBS 50μl及2×SDS-PAGE上样buffr 50μl，混匀，沸水煮3-5min；

(4)上述样品10μl行12％SDS-PAGE电泳，100V，2-3h；

(5)将胶取下在考马斯亮兰染液中染45min-1h，脱色液脱色30min，观察重组蛋白的表达情况。

3.重组蛋白的大量表达

(1)无菌吸取已用小样表达鉴定的阳性菌少许(10-20μl)，加到100ml LB(Amp⁺)培养液，37℃振摇培养过夜；

(2)用LB(Amp⁺)1∶10稀释上述培养液，继续培养2-3h，至OD₆₀₀＝1左右；

(3)加IPTG至终浓度为0.5mmol/L，30℃继续培养5-6h；

(4)5,000rpm，4℃离心10分钟；

(5)沉淀用PBS洗涤后，分装，-20℃存放备用。

4.Glutathione-Sephorose 4B凝胶纯化融合蛋白GST-H98

(1)大量诱导表达菌体沉淀加入细菌裂解液20ml(10ml细菌裂解液/100ml菌液)，冰上静置30min；

(2)加入Triton-X 100至浓度为1％，冰浴10-30min；

(3)冰上间歇超声裂解，18KHz，超声15s，停15s，反复6次，至液体变清亮。

(4)4℃，12,000rpm离心20min，收集上清；

(5)取200μl Glutathione-Sepharose 4B凝胶用PBS洗3次，加入超声后上清，4℃轻摇2h；

(6)4℃，5,000rpm离心5min，沉淀用PBS洗3次；

(7)加入200(1洗脱缓冲液，4℃轻摇20min；

(8)4℃，12,000rpm离心20s，重复洗脱2-3次，收集的上清即为纯化的融合蛋白；

(9)行12％SDS-PAGE蛋白电泳，定量后-20℃保存。

结果：

重组质粒pGEX-4T1-H98转化大肠杆菌BL21，在30℃，0.5mmol/L IPTG诱导5-6h的条件下表达融合蛋白GST-H98，分子量约为26KD左右，与预测相符；转化了空质粒pGEX-4T1的大肠杆菌BL21表达26KD的GST蛋白(图10)。由于诱导温度和诱导剂的浓度均较低，融合蛋白为可溶性表达，超声后均在上清中，不形成包涵体。GST-H98融合蛋白经Glutathione-Sepharose 4B凝胶纯化，获得纯度＞95％的GST-H98可溶性蛋白(图11)。

实施例4：GST-H98融合蛋白的生物学活性鉴定

1.ELISA检测Herceptin与GST-H98的结合活性

分别用5μg/ml GST-H98、GST包被96孔板，4℃过夜。弃去包被液，每孔加200(1封闭液，4℃过夜。弃去封闭液后以PBST(0.05％Tween)洗板4次，每孔加入0、0.1、0.5、1、5μg/ml浓度的Herceptin50μl(每个浓度设两个平行孔)，室温结合1-2h，洗板6次后加入HRP-羊抗人IgG二抗(1∶2500)，室温结合1h，洗板6次。每孔加入100(1OPD底物液，室温显色10-30min，终止反应后于OD₄₉₂读数。

Herceptin可与GST-H98结合，随Herceptin浓度增加结合力逐渐增强，而Herceptin不与GST结合(图12)。提示Herceptin可与GST-H98特异性结合。

2.Western blot检测Herceptin与GST-H98的结合活性

GST蛋白、GST-H98、GST-HER-2、DHFR-H98融合蛋白各2μg加2(SDS-PAGE凝胶上样缓冲液混匀，煮沸3-5min，使蛋白变性，行12％SDS-PAGE蛋白电泳，转膜后以抗体Herceptin为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG(1∶2500)为二抗，进行Western blot检测蛋白与Herceptin的结合情况。

结果表明Herceptin与GST-H98和DHFR-H98在分子量大约为26KD处有一特异性反应条带，与阳性对照GST-HER-2在分子量大约为44KD处有一特异性反应条带，而与GST无相应反应。抗GST单抗与GST蛋白、GST-H98、GST-HER-2均有特异性结合反应；而正常人血清IgG同上述四种蛋白均无反应(图1)。

3.竞争抑制实验

应用ELISA方法，检测小肽H98是否可阻断Herceptin与HER-2的结合，换言之，Herceptin与GST-H98的结合位点是否可被HER-2占据。

分别用5μg/ml NIH3T3-erbB2细胞膜蛋白(溶膜缓冲液为1％TritonX-100，1mM EDTA，1mM PMSF，1μg/ml aprotinin)，或5μg/mlGST-H98包被96孔板，4℃过夜。弃去包被液，每孔加200μl封闭液，4℃过夜。将0、0.5、5、10、50μg/ml浓度的H98、F56、GST、GST-H98和NIH3T3-erbB2细胞膜蛋白分别与0.5μg/ml的Herceptin 50μl混合，室温预孵育1h后加入封闭后的96孔板(每个反应浓度设两个平行孔)，室温结合1-2h，洗板5次后加入HRP-羊抗人IgG(1∶2500)，室温结合1h，洗板5次。每孔加入100μl OPD底物液，室温显色10-30min，终止反应后于OD₄₉₂读数。根据公式计算抑制百分率：(OD_Herceptin-OD_{Herceptin with Protein})/OD_Herceptin×100％。

ELISA结果提示GST-H98和小肽H98均可阻断Herceptin与HER-2的结合，且随GST-H98、H98的浓度增加，这种阻断作用逐渐加强。然而，GST和小肽F56对Herceptin与HER-2的相互作用没有影响(图2)。

此外，结果提示HER-2和小肽H98均可阻断Herceptin与GST-H98的结合，且随HER-2浓度增加，这种阻断作用逐渐加强(图3)。上述结果进一步证明H98与HER-2拥有相似的表位。

4.小肽H98对Herceptin抑制肿瘤细胞生长作用的影响

用MTT比色法检测H98小肽对Herceptin抑制肿瘤细胞生长作用的影响。SKBR3细胞1×10⁴/孔铺96孔板，培养24h使细胞贴壁，分别加入1μg/ml Herceptin与0、3、30、60、120μg/ml H98小肽或F56小肽的混合液，阴性对照孔加入1μg/ml正常小鼠IgG。继续培养72h后加10mg/ml MTT 5μg/孔，培养4h后轻轻吸去上清，加二甲基亚砜150μl/孔，摇匀，于波长492nm处测光密度OD₄₉₂，取两个平行孔的平均值，并计算细胞生长抑制率。细胞抑制率(％)＝(OD_{正常人 IgG}-OD_{Herceptin+H98/F56})/OD_正常人IgG×100％。

实验证明Herceptin浓度为1μg/ml时即对SKBR3细胞有生长抑制作用，小肽H98可阻断Herceptin对细胞生长的抑制作用，这种作用随H98浓度的逐渐增加而加强，当小肽H98浓度为60μg/ml时，Herceptin对SKBR3细胞的增殖抑制作用降低了12.5％。相同浓度的无关小肽F56对Herceptin的细胞增殖抑制作用没有影响(图4)。

实施例5：动物实验

5.1动物免疫

从中国医学科学院动物中心购买6-8周龄的雌性昆明鼠，初次免疫将40ug纯化抗原GST-H98、GST与等体积完全福氏佐剂(CFA)充分混匀至取一小滴在水中不扩散，皮下多点免疫小鼠。每隔3周进行1次加强免疫，等量纯化抗原与不完全福氏佐剂(IFA)等体积混匀乳化，同样皮下多点免疫小鼠。共免疫5次。免疫前，及第3次，第5次免疫后7-10天取小鼠尾静脉血用ELISA方法检测抗体效价。

5.2ELISA检测免疫血清中的抗体活性

ELISA方法检测免疫小鼠血清中的抗H98和抗HER-2免疫反应。构建pQE40-H98表达载体，并表达纯化DHFR-H98融合蛋白，用于检测免疫血清中抗H98小肽的体液免疫反应。以5μg/ml DHFR-H98包被96孔板，封闭后加入1∶1000稀释的免疫小鼠血清，用HRP酶标羊抗鼠IgG进行常规ELISA检测，并以DHFR板作为阴性对照。

NIH3T3-erbB2细胞1×10⁴/孔铺96孔板，培养24h使细胞贴壁，用0.25％戊二醛固定细胞，封闭后加入1∶100稀释的免疫小鼠血清，用HRP酶标羊抗鼠IgG进行常规ELISA，检测免疫血清中抗HER-2蛋白的体液免疫反应，并以NIH3T3细胞板为阴性对照。

结果：5只小鼠在第5次免疫后都产生了抗H98小肽(图5A)和抗HER-2蛋白(图5B)的免疫反应。其中一只小鼠抗HER-2反应较弱，这与小鼠的个体差异有关。其中抗H98小肽的免疫反应在第3次免疫后就可检测到，即第3次免疫后GST-H98免疫鼠血清抗H98反应与GST免疫鼠血清抗H98反应相比有显著性差异(P＜0.05)。而第5次免疫后才可在小鼠血清中检测到抗HER-2反应，即第5次免疫后GST-H98免疫鼠血清抗HER-2反应与GST免疫鼠血清抗HER-2反应相比有显著性差异(P＜0.05)。单纯免疫GST蛋白的小鼠血清中没有检测到抗H98小肽和抗HER-2的免疫反应。

5.3免疫沉淀-Western blot检测免疫血清中的抗体活性

50μg Herceptin与50μl Protein A-Sepharose 4B珠子4℃摇3h，反应混合物用PBST(0.05％Tween)洗3遍，再与1.5×10⁷ NIH3T3-erbB2细胞中提取的细胞膜蛋白(细胞裂解液：1％TritonX-100，1mM EDTA，1mM PMSF，1μg/ml aprotinin)4℃作用4h，沉淀复合物用PBST(0.05％Tween)洗3遍，变性后行8％SDS-PAGE电泳，转NC膜后以1∶100稀释的不同免疫小鼠血清为一抗，HRP-羊抗鼠IgG为二抗进行Western blot，检测免疫小鼠血清中是否有抗HER-2的体液免疫反应。正常小鼠血清IgG为阴性对照。

结果：可见其中一只免疫小鼠血清在分子量大约为185KD处有一特异性反应条带，与人HER-2基因表达产物大小相似，而以GST免疫小鼠血清和正常小鼠IgG为一抗，在185KD处未见反应条带(图6)。说明5只小鼠中其中一只产生的抗HER-2免疫反应可与变性的HER-2反应。

5.4H98小肽对T细胞增殖的作用

小肽H98以0，1，10，100μg/ml浓度溶于无菌PBS，包被96孔板，37℃包被2h。弃包被液，用无菌PBS洗板2遍。随机取2只分别经GST-H98和GST-无关小肽免疫4次的小鼠，末次免疫后第7天无菌取脾细胞，以2×10⁵/孔细胞浓度接种至已包被H98小肽的96孔板中，37℃继续培养72h后加入10mg/ml MTT 5μl/孔，培养4h后轻轻吸去上清，加二甲基亚砜150μl/孔，摇匀，于波长492nm处测光密度OD₄₉₂，取两个平行孔的平均值，并计算细胞增殖率。细胞增殖率(％)＝(OD_H98-OD_未处理孔)/OD_未处理孔×100％

结果提示小肽H98可刺激GST-H98免疫鼠T细胞增殖，但这种增殖刺激作用比较弱，只有当小肽浓度达到100μg/ml时，与GST-无关小肽免疫鼠T细胞增殖相比才具有显著性差异(P＜0.05)。而GST-无关小肽免疫鼠没有出现明显的T细胞增殖反应(图7)。

实施例6 小肽H98的立体结构分析

根据文献报道[56]和PDB数据库中获得的Herceptin与HER-2相互作用的三维结构，利用Insight II软件包中的Homology模块构建了H98小肽与Herceptin相互作用的模拟结构图。

文献报道[56]和PDB数据库中获得的Herceptin与HER-2相互作用的三维结构1N8Z提示，HER-2上几段不连续的肽可与Herceptin轻(A)，重(B)链相互作用。Herceptin A，B链的活性部位的表面用溶液可及性表面表示，HER-2部分采用二级结构表示，其中具有活性作用的残基采用球棍模型表示(图8A)。由图可知：(1)HER-2蛋白HER-2₅₅₇P-HER-2₅₆₁Q中的HER-2₅₆₀D与A，B链的A94T，B50R有氢键相互作用。A，B链的活性部位(B33Y，B50R，B59R，B52Y，B54T，B55N，B57Y)形成一活性口袋，HER-2₅₅₈E直接伸入活性口袋中，与B50R，B59R形成氢键相互作用。(2)A，B链的活性部位(B102-103G，B105Y，A92Y，A93T，A94T)形成的活性口袋与HER-2₅₇₀D-HER-2₅₇₃F(DPPF)序列形成的环状结构相互作用，环状结构中HER-2₅₇₃F苯环直接插入活性口袋中，与B33Y，B105Y侧链的苯环形成(-(共轭相互作用。(3)HER-2₆₀₂Q与A₃₀N形成氢键相互作用(具体氢键相互作用见表4)。(4)从作用顺序上看，从HER-2的HER-2₅₆₀D-HER-2₅₆₇H是一段卷曲结构，HER-2₅₆₈Y-HER-2₅₇₀D是β折叠片层，末端是HER-2₅₇₀D，之后是DPPF序列形成的回转环状结构，此环的走向使得HER-2₅₇₃F与HER-2₅₆₀D相互靠近，从三维结构上看HER-2₅₆₀D，HER-2₅₇₃F，HER-2₅₇₂P相互靠近，形成一活性部位。

利用InsightII软件包中的Homology模块构建了H98小肽的结构。利用Docking模块将H98小肽作用到Herceptin的活性部位中，得到如图8B所示的结合构象。其中H98小肽的结构用线型飘带图表示，NH3-端为LEU，COOH-端为HIS，与Herceptin有相互作用的残基H98₅Y、H98₆E、H98₉E用球棍图表示。Herceptin部分，兰色线条表示A链，紫色线条表示B链。根据据文献报道，Herceptin的活性部位是由Herceptin的A、B两条链所形成的四段loop(A90-A96，B96-B109，B25-B35，B50-B60)结构构成。Herceptin的活性部位中B33Y，B105Y，B50R，A94T，A30N等残基具有非常重要的作用，这些残基与受体HER-2形成较强的静电相互作用，氢键作用，(-(共轭相互作用等[56]，由模拟的H98与Herceptin的活性部位相互作用的情况也可以看出H98与Herceptin的活性部位中的这些残基具有相似的作用情况。其中H98的H98₆E、H98₅Y、H98₄P这三个残基作用到Herceptin A，B链的活性口袋中形成类似于上面所描述的HER-2“DPPF”与Herceptin A，B链的三维作用形式(H98₆E对应HER-2₅₆₀D，H98₅Y对应HER-2₅₇₃F，H98₄P对应HER-2₅₇₂P)，其中H98₆E可替换HER-2₅₆₀D，H98₆E的侧链比HER-2₅₆₀D长一个甲基，可与Herceptin A，B链中A94T，B50R形成氢键相互作用；H98₅Y可替换HER-2₅₇₃F，H98₅Y的苯环直接插入活性口袋中，与B33Y，B105Y的苯环形成(-(共轭相互作用。H98₉E可能作用于A，B链形成的活性口袋中，形成类似HER-2₅₅₈E和B50R，B59R之间的氢键相互作用(表5)。此外如果将H98₁L突变为Q，即对应HER-2₆₀₂Q，可使H98₁Q与A30N形成较强的氢键相互作用。通过这种突变可能会加强小肽H98与Herceptin的亲和力。

表4 HER-2与Herceptin之间的氢键相互作用

Table 4 H bonds between HFR-2 and Herceptin

Donor	Acceptor	Distance	Angle
				1N8Z:B50R:HH111N8Z:A94T:HG11N8Z:B50R:HH211N8Z:A30N:HD221N8Z:A30N:HD221N8Z:C602Q:HE22	1N8Z:C558E:OE11N8Z:C560D:OD21N8Z:C560D:OD21N8Z:C602Q:OE11N8Z:C602Q:NE21N8Z:A30N:ND2	2.471.841.922.452.132.23	121.08158.94120.99131.5160.13143.86

表5 H98与Herceptin之间的氢键相互作用

Table5 H bonds between H98 and Herceptin

Donor	Acceptor	Distance	Angle
				H98:6:HN1N8Z:B33:HH1N8Z:B50:NEH98:5:HH1N8Z:B50:HH11H98:9:HE21N8Z:B102:HD21N8Z:B105:HH	1N8Z:A94:OG1H98:1:OXTH98:5:OH1N8Z:B50:NEH98:9:OE11N8Z:B57:OH98:1:OH98:1:OXT	2.161.612.911.951.941.91.581.65	154.2167.73NA167.75173.05142.55163.45170.29

实施例7H98小肽截短体的活性分析

1.H98小肽的分段表达

1.1GST-X融合蛋白表达载体pGEX-4T1-X的构建

根据从噬菌体12肽库筛选到的与Herceptin结合的阳性小肽H98的测序结果设计小肽X正义和反义单链DNA片段，并于引物两端分别引入用于克隆的BamHI及SalI粘性末端序列，并在小肽序列末端引入终止密码子和EcoRV酶切位点用于重组质粒的酶切鉴定(表3)。X分别代表N10、N8、N6、C10、C8、C6、M8、M6、MutN3-4、MutC1-2、MutN3-4、MutN1、CyclicH98。

将引物分别溶于TE buffr，终浓度为1μg/ml。正义和反义引物退火后与内切酶BamHI/SalI消化的载体pGEX-4T1片段连接并转化BL21氯化钙感受态细菌，最后小提质粒并以EcoRV酶切鉴定重组质粒pGEX-4T1-X。

结果：根据阳性小肽H98的DNA序列和H98三维结构分析结果，合成截短小肽(下述小肽均用X表示)N10、N8、N6、C10、C8、C6、M8、M6等的正义和反义单链DNA片段，退火后插入pGEX-4T1载体中。由于X寡核苷酸片段中引入了EcoRV酶切位点，载体pGEX-4T1中也有EcoRV酶切位点，因此重组质粒pGEX-4T1-X经EcoRV酶切可释放出1700bp大小的片段；而没有克隆片段插入的空载体pGEX-4T1经EcoRV酶切，质粒被切开但无释放片段，结果与预测相符(图9)。

1.2GST-X融合蛋白的诱导表达及纯化方法同前述

2.GST-X融合蛋白与Herceptin的结合活性鉴定

2.1 ELISA检测Herceptin与GST-X的结合活性

分别用5μg/ml GST、GST-H98、GST-N10、GST-N8、GST-N6、GST-C10、GST-C8、GST-C6、GST-M8、GST-M6、GST-MutN3-4、GST-MutC1-2、GST-MutN1-2、GST-MutN1、GST-CyclicH98包被96孔板，4℃过夜。弃去包被液，每孔加200μl封闭液，4℃过夜。弃去封闭液后以PBST(0.05％Tween)洗板4次，每孔加入0、0.1、0.5、1、2、5μg/ml浓度的Herceptin 50μl(每个浓度设两个平行孔)，室温结合1-2h，洗板6次后加入HRP-羊抗人IgG(1∶2500)，室温结合1h，洗板6次。每孔加入100μl OPD底物液，室温显色10-30min，终止反应后于OD₄₉₂读数。

2.2 Western blot检测Herceptin与GST-X的结合活性

GST、GST-H98、GST-N10、GST-N8、GST-N6、GST-C10、GST-C8、GST-C6、GST-M8、GST-M6、GST-MutN3-4、GST-MutC1-2、GST-MutN1-2、GST-MutN1、GST-CyclicH98融合蛋白各2μg加2(SDS-PAGE凝胶上样缓冲液混匀，煮沸3-5min，使蛋白变性，行12％SDS-PAGE蛋白电泳，转膜后以抗体Herceptin为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG(1∶2500)为二抗，进行Western blot检测融合蛋白与Herceptin的结合情况。

ELISA和Western blot结果表明：Herceptin可与GST-H98(原始小肽)、GST-C10(含H98羧基端10个氨基酸的小肽)、GST-MutN1-2(氨基端第1、2位突变的小肽)、GST-MutN1(氨基端第1位氨基酸突变的小肽)和GST-CyclicH98(氨基端和羧基端分别引入一个半胱氨酸的小肽)结合。它们与Herceptin的亲和力由强至弱依次为：GST-MutN1＞GST-H98＞GST-MutN1-2＞GST-C10＞GST-CyclicH98。而Herceptin与其它多种GST小肽融合蛋白均不结合(图12，13)。结果提示羧基末端的2个氨基酸和氨基端的第3、4位氨基酸在小肽与Herceptin的结合中发挥重要作用，这与软件分析的结果并不完全一致。此外，通过将H98₁L突变为Q，加强了H98小肽与Herceptin的亲和力，说明软件分析对实验设计具有一定指导意义。

以下参考文献由于引用而全文引入本发明。

参考文献

1.Coussens L，Yang-Feng TL，Liao YC，Chen E，et al(1985)Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptorshares chromosomal location with neu oncogene.Science 230：1132

2.Tzahar E，Pinkaskramarski R，Moyer JD，Kapper LN，et al(1997)Bivalence of EGF-like ligands drives the ErbB signaling network.EMBOJ 16：4938

3.Olayioye MA，Neve RM，泳道HA，Hynes NE(2000)TheErbB signaling network：receptor heterodimerization in development andcancer.EMBO J 19：3159

4.Klapper LN，Kirschbaum MH，Sela M，Yarden Y(2000)Biochemical and clinical implications of the ErbB/HER signalingnetwork of growth factor receptors.Adv Cancer Res 77：25

5.Cirisano FD，Karlan BY(1996)The role of the HER-2/neuoncogene in gynecologic cancers.J Soc Gynecol Investig 3：99

6.Niehans GA，Singleton TP，Oykoski D，Kiang DT(1993)Stability of HER-2/neu expression over time and at multiple metastaticsites.J Natl Cancer Inst 85：1230

7.Shak S(1999)Overview of the trastuzumab(Herceptin)anti-HER2 monoclonal antibody clinical program inHER2-overexpressing metastatic breast cancer.Herceptin MultinationalInvestigator Study Group.Semin Oncol 26：71

8.Schaller G，Bangemann N，Becker C，Buhler H，et al(1999)Therapy ofmetastatic breast cancer with humanized antibodies against the HER2receptor protein.J Cancer Res Clin Oncol 125：520

9.Yip YL，Smith G，Koch J，Dubel S，et al(2001)identification ofepitope regions recognized by tumor inhibitory and stimulatoryanti-erbb-2 monoclonal antibodies：implications for vaccine design.JImmunol 166：5271

10.Disis ML，Calenoff E，McLaughlin G，Murphy AE，et al(1994)Existent T-cell and antibody immunity to HER-2 Neu protein inpatients with breast cancer.Cancer Res 54：16

11.Pupa SM.Menard S，Andreola S，Colnaghi MI(1993)Antibodyresponse against the c-erbB-2 oncoprotein in breast carcinomapatients.Cancer Res 53：5864

12.Disis ML，Pupa SM，Gralow JR，Dittadi R，et al(1997)High-titerHER-2/neu protein-specific antibody can be detected in patients withearly-stage breast cancer.J Clin Oncol 15：3363

13.Ward RL，Hawkins NJ，Coomber D，Disis ML(1999)Antibodyimmunity to the HER-2/neu oncogenic protein in patients withcolorectal cancer.Hum Immunol 60：510

14.Visco V，Bei R，Moriconi E，Gianni W，et al(2000)ErbB2 Immuneresponse in breast cancer patients with soluble receptor ectodomain.Am J Pathol 156：1417

15.Disis ML，Gralow JR，Bernhard H，Hand SL，et al(1996)Peptide-based，but not whole protein，vaccines elicit immunity toHER-2/neu，an oncogenic selfprotein.J Immunol 156：3151

16.Fisk B，Hudson JM，Kavanagh J，Wharton JT，et al(1997)Existentproliferative responses of peripheral blood mononuclear cells fromhealthy donors and ovarian cancer patients to HER-2 peptides.Anticancer Res 17：45

17.Kobavashi H，Wood M，Song Y，Appella E，et al(2000)Definingpromiscuous MHC class II helper T-cell epitopes for HER2/neutumor antigen.Cancer Res 60：5228

18.Tutde TM，Anderson BW，Thompson WE，Lee JE，et al(1998)Proliferative and cytokine responses to class II HER-2/neu-associatedpeptides in breast cancer patients.Clin Cancer Res 4：2015

19.Ioannides CG，Fisk B，Fan D，Biddison WE，et al(1993)Cytotoxic Tcells isolated from ovarian malignant ascites recognize a peptidederived From the HER-2/neu proto-oncogene.Cell Immunol 151：225

20.Peoples GE，Goedegebuure PS，Smith R，Linehan DC，et al(1995)Breast and ovarian cancer-specific cytotoxic T lymphocytes recognizethe same HER2/neu-derived peptide.Proc Natl Acad Sci USA 92：432

21.Yoshino I，Peoples GE，Goedegebuure PS，Maziarz R，et al(1994)Association of HER2/neu expression with sensitivity totumor-specific CTL in human ovarian cancer.J Immunol 152：2393

22.Kono K，Rongcun Y，Chard J，Ichihara F，et al(1998)Identificationof HER2/neu-derived peptide epitopes recognized by gastriccancer-specific cytotoxic T lymphocytes，Int J Cancer 78：202

23.Yoshino L，Goedegebuure PS，Peoples GE，Parikh AS，et al(1994)HER2/Neu-derived peptides are shared antigens among humannon-small cell lung cancer and ovarian cancer.Cancer Res 54：3387

24.Lustgarten J，Theobald M，Labadie C，Laface D，et al(1997)Identification of HER-2/Neu CTL epitopes using double transgenicmice expressing HLA-A2.1 and human CD8.Human Immunol 52：109

25.Rongcun Y，Salazar-Onfray F，Charo J，Malmberg KJ，et al(1999)Identification of new HER2/neu-derived peptide epitopes that canelicit specific CTL against autologous and allogeneic carcinomas andmelanomas.J Immunol 163：1037

26.Seliger B，Rongcun Y，Atkins D，Hammers S，et al(2000)HER-2/neuis expressed in human renal cell carcinoma at heterogeneous levelsindependently of tumor grading and staging and can be recognized byHLA-A2.I-restricted cytotoxic T lymphocytes，Int J Cancer 87：349

27.Peoples GE，Smith RC，Linehan DC，Yoshino L，et al(1995)SharedT cell epitopes in epithelial tumors.Cell Immunoll 64：279

28.Rilke F，Colnaghi MI，Cascinelli N，Andreola S，et al(1991)Prognostic significance of HER-2/neu expression in breast cancer andits relationship to other prognostic factors.Int J Cancer 49：44

29.Tagliabue E，Menard S，Robertson JF，Harris L(1999)c-erbB-2expression in primary breast cancer.Int J Biol Markers 14：16

30.Nistico P，Mottolese M，Cascioli S，Benevolo M，et al(1990)Hostimmunosurveiliance contributes to the control of erbB-2overexpression in HLA-A2-breast-cancer patients，Int J Cancer84：598

31.Nistico P，Mottolese M，Mammi C，Benevolo M，et al(1997)Lowfrequency of ErbB-2 proto-oncogene overexpression in humanleukocyte antigen-A2-positive breast cancer patients.J Natl CancerInst 89：319

32.Guy CT，Webster MA，Schaller M，Parsons T J，et al(1992)Expression of the neu protooncogene in the mammary epithelium oftransgenic mice induces metastatic disease.Proc Natl Acad Sci USA89：1057.

33.Mailer WJ，Sinn E，Pattengale PK，Wallace R，et al(1988)Single-step induction of mammary adenocarcinoma in transgenicmice bearing the activated c-neu oncogene.Cell 54：105

34.Bernards R，Destree A，McKenzie S，Gordon E，et al(1987)Effectivetumor immunotherapy directed against an oncogene-encoded productusing a vaccinia virus vector.Proc Natl Acad Sci USA 84：6854

35.Taylor P，Gerder M，Moros Z，Feldmann M(1996)Humoral andcellular responses raised against the human HER2 oncoprotein arecross-reactive with the homologous product of the newproto-oncogene，but do not protect rats against B104 tumorsexpressing mutated neu.Cancer Immunol Immunother 42：179

36.Esserman LJ，Lopez T，Montes R，Bald LN，et al(1999)Vaccinationwith the extracellular domain of p 185neu prevents mammary tumordevelopment in neu transgenic mice.Cancer Immunol Immunother47：337

37.Reilly RT，Gottlieb MB，Ercolini AM，Machiels JP，et al(2000)HER-2/neu is a tumor rejection target in tolerized HER-2 neutransgenic mice.Cancer Res 60：3569

38.Cefai D，Morrison BW，Sckell A，Favre L，et al(1999)TargetingHER-2/neu for active-specific immunotherapy in a mouse model ofspontaneous breast cancer.Int J Cancer 83：393

39.Disis ML，Bernhard H，Shiota FM，Hand SL，et al(1996)Granulocyte-macoph-age colony-stimulating factor-an effective adjuvant for protein andpeptide-based vaccines.Blood 88：202

40.Nagata Y，Furugen R，Hiasa A，Ikeda H，et al(1997)Peptides derivedfrom a wild-type murine proto-oncogene c-erbB-2/HER2/neu caninduce CTL and tumor suppression in syngeneic hosts.J Immunol159：1336

41.Ikuta Y，Okugawa T，Furugen R，Nagata Y，et al(2000)AHER2/NEU-derived peptide，a K(d)-restricted murine tumor rejectionantigen，induces HER2-specific HLA-A2402-restricted CD8(+)cytotoxic T lymphocytes.Int J Cancer 87：553

42.Amici A，Venanzi FM，Concetti A(1998)Genetic immunizationagainst neu/erbB2 transgenic breast cancer.Cancer ImmunolImmunother 47：183

43.Chen Y，Hu D，Eling DJ，Robbins J，et al(1998)DNA vaccinesencoding full-length or truncated Neu induce protective immunityagainst Neu-expressing mammary tumors.Cancer Res 58：1965

44.Wei WZ，Shi WP，Galy A，Lichlyter D，et al(1999)Protection againstmammary tumor growth by vaccination with full-length，modifiedhuman ErbB-2DNA.Int J Cancer 81：748

45.Concerti A，Amici A，Petrelli C，Tibaldi A，et al(1996)Autoantibodyto p185(Erbb2/Neu)oncoprotein by vaccination with xenogenicDNA.Cancer Immunol Immunother 43：307

46.Rovero S，Amici A，Carlo ED，Bei R，et al(2000)DNA vaccinationagainst rat her-2/Neu p185 more effectively inhibits careinogenesisthan transplantable carcinomas in transgenic BALB/c mice[InProcess Citation].J Immunol 165：5133

47.Mahon BP，Moore A，Johnson PA，Mills KH(1998)Approaches tonew vaccines，Crit Rev Biotechnol 18：257

48.Quirke P，Pickles A，Tuzi NL，Mohamdee O，et al(1989)Pattern ofexpression of c-erbB-2 oncoprotein in human fetuses.Br J Cancer60：64

49 Costello RT，Gastaut JA，Olive D(1999)Mechanisms of tumor escapefrom immunologic response.Rev Med Interne 20：579

50.Hersey P(1999)Impediments to successful immunotherapy.Pharmacol Ther 81：111

51.Cabrera T，Angustias Fernandez M，Sierra A，Garrido A，et al(1996)High frequency of altered HLA class I phenotypes in invasive breastcarcinomas.Hum Immunol 50：127

52.Cabrera T，Collado A，Fernandez MA，Ferron A，et al(1998)Highfrequency of altered HLA class I phenotypes in invasive colorectalcarcinomas.Tissue Antigens 52：114

53.Cabrera T，Salinero J，Fernandez MA，Garrido A，et al(2000)Highfrequency of altered HLA class I phenotypes in laryngealcarcinomas[in Process Citation].Hum Immunol 61：499

54.Algarra I，Cabrera T，Garrido F(2000)The HLA crossroad in tumorimmunology.Hum Immunol 61：65

55.Hicklin DJ，Marincola FM，Ferrone S(1999)HLA class I antigendownregulation in human cancers：T-cell immunotherapy revives anold story.Mol Med Today 5：178

56.Baselga J，Norton L，Albanell J，et al(1998)Recombinant humanizedanti-HER2 antibody(Herceptin)enhances the antitumor activity ofpaclitaxel and doxorubicin against(Herceptin)enhances theantitumor activity of paclitaxel and doxorubicin against HER2/neuoverexpressing human breast cancer xenografts.Cancer Res 58：2825

57.Li J，Wang Y，Li QX，et al(1998)Cloning of 3H11 mAb variableregion gene and expression of 3H11 human-mouse chimeric lightChain.World J Gastroenterol 4：41

58.Cwirla SE，Peters EA，Barret RW，et al(1990)Peptides on phage：avast library for identifying ligands.Proc Natl Acad Sci U.S.A.87：6378

59.Devlin JJ，Panganiban LC，Devlin PE(1990)Random peptidelibraries：a source of protein binding molecules.Science 404-406

60.安平，孟麟，董志伟，寿成超(2001)短肽库中VEGF受体Flt-1拮抗剂筛选条件的改进。北京大学学报(医学版)33：398

61 Burritt JB，Bond CW，Doss KW，et al(1996)Filamentous phagedisplay of oligopeptide libraries.Anal Biochem 238：1

62.Blond-Elguini S，Cwirla SE，Dower WJ，et al(1993)Affinity panningof a library of peptides displayed on bacteriophages reveals thebinding specificity of BiP.Cell 75：717

63.Kay BK，Adey NB，He YS，et al(1993)An M13 phage librarydisplaying random 38-amino-acid peptides as a source of novelsequences with affinity to selected targets.Gene 128：59

64.Stephen PW，Helminen P，泳道DP(1995)Characterization ofepitopes on human p53 using phage displayed peptide libraries：insights into antibody-phage interactions.J Mol Biol 248：58

65.Steward，J.M.and Young，J.D.，Solid Phase Peptide Synthesis，2nd Ed.，Pierce Chemical Company，Rockford，I 11.，(1984))

66.Steward，J.M.and Young，J.D.，Solid Phase Peptide Synthesis，W.H.Freeman Co.(San Francisco)，1963和J.Meienhofer，HormonalProteins and Peptides，vol.2，p.46，Academic Press(New York)，1973

67 (Sanger等人，PNAS，1977，74：5463-5467)

68 Sambrook，J.(1989)，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press；

68 Plainview，N.Y.；Ausubel，F.M.(1989)Current Protocols inMolecular Biology，

69 John Wiley & Sons，N.Y.；Hobbs，S.等人，McGraw HillYearbook of Science and Technology(1992)，

70.N.Yang，Crit.Rev.Biotechn.12(4)：335-356(1992)

71.Smith GP(1985)Filamentous fusion phage：vovel expression vectorsthat display cloned antigens on the viron surface.Science 228：1315

72.Gu XG，Schmitt M，Hiasa A，Nagata Y，et al(1998)A novelhydrophobized polysaccfiaride/oncoprotein complex vaccine inducesin vitro and in vivo cellular and humoral immune responses againstHER2-expressing murine sarcomas.Cancer Res 58：3385

73.Okugawa T，Ikuta Y，Takahashi Y，Obata H，et al(2000)Anovel human HER2-derived peptide homologous to the mouseK(d)-restricted tumor rejection antigen can induce HLA-A24-restrictedcytotoxic T lymphocytes in ovarian cancer patients and healthyindividuals.Eur J Immunol 30：3338

74.Bei R，Masuelli L，Moriconi E，Visco V，et al(1999)Immuneresponses to all ErbB family receptors detectable in serum of cancerpatients.Oncogene 18：1267

75.Peiper M，Goedegebuure PS，Linehan DC，Ganguly E，et al(1997)The HER2/neu-derived peptide p654 662 is a tumor-associatedantigen in human pancreatic cancer recognized by cytotoxic Tlymphocytes.Eur J Immunol 27：1115

76.Disis ML，Grabstein KH，Sleath PR，Cheever MA(1999)Generationof immunity to the HER-2/neu oncogenic protein in patients withbreast and ovarian cancer using a peptide-based vaccine.ClinCancer Res 5：1289

77.Dakappagari NK，Douglas DB，Triozzi PL，Stevens VC，et al(2000)Prevention of mammary tumors with a chimeric HER-2B-cellepitope peptide vaccine.Cancer Res 60：3782

78 Minev BR，Chavez FL，Mitchell MS(1998)New trends in thedevelopment of cancer vaccines，In Vivo 12：629

79.Lowman HB，Bass SH，Simpson N，et al(1991)Selectinghigh-affinity binding proteins by monovalent phage display.Biochemistry 30：10832

80.Cho HS，Mason K，Ramyar KX，Stanley AM，et al(2003)Structure ofthe extracellular region of HER2 alone and in complex with theHerceptin Fab.Nature 421：756

CID042510.序列表

序列表

<110>Chengchao，Shou

     Beihai，Jiang

<120>HER-2模拟抗原表位及含有该表位的肽

<130>CID042510

<160>5

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

Leu Leu Gly Pro Tyr Glu Leu Trp Glu Leu Ser His

1               5                   10

<210>2

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

Gly Pro Tyr Glu Leu Trp Glu Leu Ser His

1               5                   10

<210>3

<211>12

 <212>PRT

<213>人工序列

<400>3

Gly Ala Gly Pro Tyr Glu Leu Trp Glu Leu Ser His

1               5                    10

<210>4

<211>12

CID042510.序列表

<212>PRT

<213>人工序列

<400>4

Gln Leu Gly Pro Tyr Glu Leu Trp Glu Leu Ser His

1               5                   10

<210>5

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<400>5

Cys Leu Leu Gly Pro Tyr Glu Leu Trp Glu Leu Ser His Cys

1               5                   10

Claims (23)

1.以正向或反向连续地或间隔地包含多个或只包含一个以下通式(I)所示的氨基酸序列的肽：X9X1X2GPX3X4X5X6X7X8SHX10，(I)

其中，

X1可以存在或不存在，为天然的氨基酸残基，

X2可以存在或不存在，为疏水性氨基酸残基，

X3为极性氨基酸，

X4为极性氨基酸，

X5为疏水性氨基酸，

X6为极性氨基酸

X7为极性氨基酸，可以与X4相同或不同，

X8为疏水性氨基酸，可以与X5相同或不同，

其中，X9和X10为天然氨基酸，可以存在或不存在，式(I)的肽可以是线形的或环化的。

2.权利要求1的肽，

其中，X1可以存在或不存在，为L，I，V，M，A，F，G，Q或N，

X2可以存在或不存在，为L，I，V，M，A或F，G

X3为Y，W，F，T或S

X4为E或D，

X5为L，I，V，M，A或F

X6为W，Y或F，

X7为E或D，可以与X4相同或不同，

X8为L，I，V，M，A或F，可以与X5相同或不同，

X9和X10可以存在或不存在，为C或S。

3.权利要求2的肽，

其中，X1可以存在或不存在，为L，G或Q，

X2可以存在或不存在，为L或A，

X3为Y，

X4为E，

X5为L，

X6为W，

X7为E，

X8为L，

X9和X10可以存在或不存在，为C。

4.权利要求3的肽，其中通式(I)所示的氨基酸序列是：

H98            LLGPYELWELSH(SEQ ID NO：1)

C10            GPYELWELSH(SEQ ID NO：2)

MutN1-2        GAGPYELWELSH(SEQ ID NO：3)

MutN1          QLGPYELWELSH(SEQ ID NO：4)或

CyclicH98      CLLGPYELWELSH C(SEQ ID NO：5)。

5.权利要求4的肽的保守性替换突变体。

6.权利要求1-5之任一的肽，它用于诱导产生针对HER-2的体液和细胞免疫反应。

7.权利要求1-5之任一的肽，它用于肿瘤的防治。

8.一种药物组合物，它包含权利要求1-5中任一的肽和可药用载体。

9.权利要求8的药物组合物，它用于治疗和预防下列器官的原发或转移的肿瘤和癌：乳腺、结肠、直肠、肺、口咽、喉咽、食管、胃、胰腺、肝、胆囊、胆管、小肠、肾、膀胱、泌尿道上皮宫颈、子宫、卵巢、绒毛膜癌、妊辰营养层病、前列腺、精囊、睾丸、甲状腺、肾上腺、垂体血管生成性瘤、黑素瘤、从骨或软组织发生的肉瘤、卡波济肉瘤、脑、神经、眼和脑膜的肿瘤，从造血恶性疾病发生的肿瘤。

10.权利要求8或9的药物组合物，该药物组合物中的权利要求1-5中的任一的肽与本领域常用的增强免疫的细胞因子或蛋白、其它肿瘤常用疫苗或常用的载体相混合或形成重组蛋白。

11.权利要求10的药物组合物，其中的细胞因子是白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-12(IL-12)、集落刺激因子(GM-CSF)、CCL2、CCL5、CCL7、CCL19、CCL21、CCL20、CXCL9、CXCL10、CXCL12、CXCL15、XCL1、FTL3L、CD40L等，其中的蛋白是热休克蛋白等，其中的肿瘤常用疫苗主要指的是癌基因、突变的抑癌基因、肿瘤相关抗原，其中的载体是钥匙孔戚血蓝蛋白，血清白蛋白，灭活的细菌毒素等。

12.权利要求11的药物组合物，其中的癌基因如CEA等、突变的抑癌基因如p53等、肿瘤相关抗原如黑色素瘤相关抗原等，其中的血清白蛋白可以是牛血清白蛋白或人血清白蛋白等，细菌毒素是破伤风、白喉毒素或结核菌素等。

13.权利要求8-12之任一的药物组合物，该药物组合物为一种疫苗。

14.编码权利要求1-5中的任一肽的核苷酸序列，该核苷酸可以独立存在，也可以与编码本领域常用的增强免疫的细胞因子或蛋白、其它肿瘤常用疫苗或常用的载体的基因相混合或形成重组核酸分子。

15.含有权利要求14的核苷酸的质粒或病毒载体。

16.含有权利要求15的质粒或载体的细胞。

17.一种药物组合物，它含有权利要求14的核苷酸，权利要求15的质粒或病毒载体或权利要求16的细胞和药用载体。

18.权利要求17的药物组合物，其中的细胞因子是白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-12(IL-12)、集落刺激因子(GM-CSF)、CCL2、CCL5、CCL7、CCL19、CCL21、CCL20、CXCL9、CXCL10、CXCL12、CXCL15、XCL1、FTL3L、CD40L等，其中的蛋白是热休克蛋白等，其中的肿瘤常用疫苗主要指的是癌基因、突变的抑癌基因、肿瘤相关抗原，其中的载体是钥匙孔戚血蓝蛋白，血清白蛋白，灭活的细菌毒素等。

19.权利要求18的药物组合物，其中的癌基因如CEA等、突变的抑癌基因如p53等、肿瘤相关抗原如黑色素瘤相关抗原等，其中的血清白蛋白可以是牛血清白蛋白或人血清白蛋白等，细菌毒素是破伤风、白喉毒素或结核菌素等。

20.权利要求17-19之任一的药物组合物，它用于诱导产生针对HER-2的体液和细胞免疫反应。

21.权利要求17-20之任一的药物组合物，它用于肿瘤的防治。

22.权利要求21的药物组合物，用于防治的肿瘤和癌是乳腺、结肠、直肠、肺、口咽、喉咽、食管、胃、胰腺、肝、胆囊、胆管、小肠、肾、膀胱、泌尿道上皮宫颈、子宫、卵巢、绒毛膜癌、妊辰营养层病、前列腺、精囊、睾丸、甲状腺、肾上腺发生的癌症或肿瘤、垂体血管生成性瘤、黑素瘤、从骨或软组织发生的肉瘤、卡波济肉瘤、脑、神经、眼和脑膜的肿瘤，从造血恶性疾病发生的肿瘤。

23.权利要求17-22之任一的药物组合物，它是一种疫苗，这种疫苗可以是蛋白质疫苗或核苷酸疫苗。

Images