CN105705522B

CN105705522B - 针对低免疫原性蛋白的表位疫苗及其制法和用途

Info

Publication number: CN105705522B
Application number: CN201480027977.0A
Authority: CN
Inventors: 李荣秀; 张丽; 仲从浩; 程超; 张莉; 徐爱章; 卢悟广; 蔺智兵
Original assignee: Shanghai Hycharm Inc
Current assignee: Shanghai Tailor-made Pharmaceutical Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2013-05-14
Filing date: 2014-05-14
Publication date: 2020-09-15
Anticipated expiration: 2034-05-14
Also published as: JP6549560B2; WO2014183649A1; EP2998322A4; JP2016526026A; CN105705522A; US20160206732A1; EP2998322A1

Abstract

本发明提供了一种携带抗原表位的重组蛋白，所述重组蛋白具有源自载体蛋白的骨架结构，并在所述载体蛋白的至少一个分子表面氨基酸残基区通过拼接、替换和/或插入引入低免疫原性蛋白表位。所述载体蛋白具有至少一个T细胞表位，并且所述重组蛋白可有效激发机体针对所述低免疫原性蛋白表位的免疫反应。

Description

针对低免疫原性蛋白的表位疫苗及其制法和用途

技术领域

本发明属于生物和医药领域，具体地涉及针对低免疫原性蛋白的表位抗原的疫苗及其制法和用途。本发明可有效激发机体针对低免疫原性蛋白的特定表位产生免疫反应。

背景技术

慢性病包括心脑血管疾病和癌症，随着经济发展和生活营养水平的持续提高，其发病率和死亡率快速升高，成为人类致病、致死主要原因；利用单克隆抗体药物治疗的优点是靶点明确，疗效确切，但需要用药剂量大、重复次数多治疗成本高。

预防用疫苗作为控制传染性疾病及其并发症的重要手段已经挽救了数亿人的生命、对人类健康做出了重大贡献；传统上的疫苗的抗原源自病原体，对人类机体来讲是外源物质自然能够激发人体的免疫保护反应。而慢性病的病因和治疗干预靶点是自身物质，如果也能够设计疫苗通过主动免疫，激发机体产生免疫反应，产生与单克隆抗体药物具有相似治疗效果的自身抗体是一条非常具有吸引力的治疗途径；具有疗效持续时间长，治疗成本低，用药既方便又经济，还具有预防发病的潜力。

但是，由于机体存在对自身物质具有免疫耐受的保护机制，正常的健康状态下，机体不会产生针对自身物质的免疫反应。目前Le Buanec等人和法国NeoVacs公司(http：//neovacs.fr/)，将用戊二醛将几十个人蛋白(包括多种细胞因子、生长因子)与铜蓝蛋白(the keyhole limpet hemocyanin，KLH)偶联后，再用甲醛长时间处理杀灭人蛋白分子的生物活性，制备了kinoid抗原疫苗；KLH偶联TNF-α制备的TNFK抗原在小鼠炎症模型中具有治疗作用，临床试验证明在人体中能够成功诱导免疫反应[Le Buanec H，et al.TNFalphakinoid vaccination-induced neutralizing antibodies to TNF alpha protect micefrom autologous TNFalpha-driven chronic and acute inflammation.Proc Natl AcadSci USA 2006；103(51)：19442-7]。虽然，这种疫苗的有效性得到了部分验证，但是这种几十个人蛋白分子与KLH分子偶联、再加上甲醛长时间处理形成的复杂的凝絮物质，在满足临床药品要求的成份清楚、结构明确、质量可控方面存在诸多的难度和难以说明的安全风险。

因此，本领域迫切需要开发能够有效激发机体产生针对低免疫原性蛋白的免疫应答的疫苗抗原技术，同时满足临床药品成份清楚、结构明确、质量可控的要求。

发明内容

本发明的目的就是提供一种可有效激发机体产生针对低免疫原性蛋白的免疫应答的方法以及相关的重组蛋白和组合物(如疫苗组合物)。

在本发明的第一方面，提供一种携带抗原表位的重组蛋白，所述重组蛋白具有源自载体蛋白的结构骨架，并且所述载体蛋白具有至少一个T细胞表位，并且在所述载体蛋白的至少一个分子表面氨基酸残基区通过拼接、替换、和/或插入而引入所述的抗原表位。

在另一优选例中，所述“分子表面氨基酸残基区”包括loop区、beta-tum区、N末端或C末端。

在一优选例中，所述重组蛋白诱导产生针对所述抗原表位的免疫应答。

在另一优选例中，所述抗原表位是B细胞表位或T细胞表位。

在另一优选例中，所述的载体蛋白是病原体蛋白，包括病毒蛋白、细菌蛋白、衣原体蛋白、支原体蛋白、或其组合。

在另一优选例中，所述的抗原不来自所述载体蛋白。

在另一优选例中，所述的抗原表位是来源于哺乳动物蛋白。

在另一优选例中，所述的抗原表位选自下组：

(a)单表位的抗原表位；较佳地，所述的单表位的抗原表位(肽)的长度为5-30个，较佳地6-15个氨基酸；或

(b)多表位的抗原表位；较佳地，所述的多表位的抗原表位(肽)的长度为15-500个，较佳地20-300个，更佳地30-200个氨基酸。

在另一优选例中，在所述的载体蛋白的C或N末端引入所述的多表位的抗原表位(肽)。

在另一优选例中，当所述的重组蛋白被施用于人时，诱导人产生针对所述抗原表位的免疫应答。

在另一优选例中，所述的替换包括部分替换或全部替换所述载体蛋白的所述表面氨基酸残基区的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的部分替换包括替换所述载体蛋白的表面氨基酸残基区序列中的1-15个氨基酸，较佳地2-10个氨基酸。

在另一优选例中，所述抗原表位是低免疫原性蛋白的表位。优选地所述的低免疫原性蛋白包括人和非人哺乳动物的蛋白。

在另一优选例中，所述的低免疫原性蛋白包括：自身免疫疾病相关蛋白、肿瘤相关蛋白、心血管疾病相关蛋白。

在另一优选例中，所述的低免疫原性蛋白包括：

(a)VEGF、TNF-α、Her2蛋白、凝血因子、白细胞介素、成纤维细胞活化蛋白(Fibroblast Activation Protein，FAP)、EGFR、PDL1或其组合；

(b)将(a)中蛋白经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的并且与载体蛋白重组后能够诱发针对该低免疫原性蛋白的免疫反应的蛋白。

在另一优选例中，所述低免疫原性蛋白为TNF-α或者将TNF-α经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的并且与载体蛋白重组后能够诱发针对该TNF-α的免疫反应的蛋白。

在另一优选例中，所述抗原表位源自TNF-α，且在TNF-α中具有两个点突变A145R和Y87H。

在另一优选例中，所述抗原表位源自TNF-α，并且选自下组：

(1)SEQ ID NO.：10或SEQ ID NO.：12所示的氨基酸序列；

(2)将SEQ ID NO.：10或SEQ ID NO.：12氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且与载体蛋白融合后具有诱发免疫反应功能的衍生的多肽。

在另一优选例中，所述抗原表位选自下组中的一个或多个：

(1)VSRFAISYQEKVNLLSA；

(2)LDFAESGQV；

(3)WLNRRANA；

(4)GMDLKDNQLVV；

(5)VSRFAISYQEKVNLLSAV；

(6)ISRIAVSYQTKVNLLSA；

(7)ISRIAVSYQTKVNLLSAI；和

(8)其他TNF-α蛋白中与(1)～(7)表位序列对应的肽段。

在另一优选例中，所述低免疫原性蛋白为凝血因子。

在另一优选例中，所述凝血因子为FXI。

在另一优选例中，所述抗原表位选自下组中的一个或多个：

(1)FYGVESPK；

(2)QYKMAESGYDI；

(3)WGYRKLRDKIQ；

(4)TNEECQKRYRGHKITH；

(5)ACIRDIF；

(6)TTKIKPRIVGGTASVRGE；和

(7)其他FXI蛋白中与(1)～(6)表位序列对应的肽段。

在另一优选例中，所述抗原表位包括凝血因子为FXI的催化结构域。

在另一优选例中，所述FXI的催化结构域选自下组：

(a)具有SEQ ID NO.：45氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO.：45氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且与载体蛋白融合后具有诱发免疫反应功能的由(a)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述凝血因子为FXII。

在另一优选例中，所述抗原表位选自下组中的一个或多个：

(1)EAFSPVSYQHDLA；

(2)EGFSSITYQHDLA；；和

(3)其他FXII蛋白中与(1)、(2)表位序列对应的肽段。

在另一优选例中，所述抗原表位包括凝血因子为FXII的催化结构域。

在另一优选例中，所述FXII的催化结构域选自下组：

(a)具有SEQ ID NO.：129或SEQ ID NO.：130氨基酸序列的多肽；

(b)将(a)中氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且与载体蛋白融合后具有诱发免疫反应功能的由(a)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述抗原表位肽源自FAP，并且所述抗原表位肽包括YGDEQYPR。

在另一优选例中，所述低免疫原性蛋白为FAP。

在另一优选例中，所述抗原表位源自FAP，并且所述抗原表位包括YGDEQYPR。

在另一优选例中，所述抗原表位源自FAP催化结构域。

在另一优选例中，所述FAP催化结构域选自下组：

(a)具有SEQ ID NO.：108氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO.：108氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且与载体蛋白融合后具有诱发免疫反应功能的由(a)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述重组蛋白的氨基酸序列选自下组：

(a)具有SEQ ID NO.：50或SEQ ID NO.：51氨基酸序列的多肽；

(b)将(a)中多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有诱发免疫反应功能的由(a)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述抗原表位源自VEGF。

在另一优选例中，所述抗原表位选自下组：

(a)具有SEQ ID NO.：63氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO.：63氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且与载体蛋白融合后具有诱发免疫反应功能的由(a)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述重组蛋白的氨基酸序列选自下组：

(a)具有SEQ ID NO.：62氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO.：62氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有诱发免疫反应功能的由(a)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述抗原表位源自PDL1。

在另一优选例中，所述抗原表位源自PDL1E。

在另一优选例中，所述抗原表位选自下组：

(a)具有SEQ ID NO.：67、SEQ ID NO.：68、SEQ ID NO.：122、SEQ ID NO.：123、SEQID NO.：124或SEQ ID NO.：125所示氨基酸序列的多肽；

(b)将(a)中多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且与载体蛋白融合后具有诱发免疫反应功能的由(a)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述重组蛋白选自下组：

(a)具有SEQ ID NO.：69、SEQ ID NO.：70、SEQ ID NO.：126或SEQ ID NO.：127所示氨基酸序列的多肽；

在另一优选例中，所述抗原表位源自表皮生长因子受体EGFR。

在另一优选例中，所述抗原表位源自表皮生长因子受体EGFR的第III亚区。

在另一优选例中，所述抗原表位源自表皮生长因子受体EGFR，并且所述抗原表位肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO.：83、SEQ ID NO.：109、SEQ ID NO.：110、SEQ ID NO.：111所示氨基酸序列的多肽；

在另一优选例中，所述重组蛋白的所述抗原表位源自表皮生长因子受体EGFR，并且包括SEQ ID NO.：83或SEQ ID NO.：109所示的氨基酸序列的至少一种，和

SEQ ID NO.：110和SEQ ID NO.：111中的至少一种。

在另一优选例中，所述重组蛋白选自：

(a)具有SEQ ID NO.：84、SEQ ID NO.：85、SEQ ID NO.：86、SEQ ID NO.：87、SEQ IDNO.：119或SEQ ID NO.：120所示氨基酸序列的多肽；

在另一优选例中，所述的抗原表位的长度为5-40个氨基酸，较佳地为8-30个氨基酸。

在另一优选例中，所述的载体蛋白包括白喉毒素DT、白喉毒素的跨膜结构域DTT、轮状病毒VP7、利什曼原虫的热休克蛋白、空肠弯曲菌鞭毛蛋白、沙眼衣原体主要外膜蛋白、血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)，鸡卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)，纤维蛋白原、多聚赖氨酸(PLL)。

在另一优选例中，所述的表面氨基酸残基区在DTT上的287-299位氨基酸之间或DTT的C末端或N末端，优选地所述表面氨基酸残基区选自下组：DTT上的290-297位氨基酸、DTT上的291-297位氨基酸、DTT上的292-297位氨基酸、293-297位氨基酸、294-297位氨基酸、DTT上的295-297位氨基酸、DTT上的296-297位氨基酸。

在另一优选例中，所述表面氨基酸残基区选自下组：DTT上的305-310位氨基酸和295-310位氨基酸。

在另一优选例中，在1-5个(较佳地1-3个)表面氨基酸残基区引入抗原表位。

在另一优选例中，所述的表面氨基酸残基区包括载体蛋白的C末端。

在另一优选例中，所述的表面氨基酸残基区包括载体蛋白的N末端。

在另一优选例中，所述抗原表位连接于所述载体蛋白的C末端和/或N末端。

在另一优选例中，所述抗原表位和所述载体蛋白之间具有连接肽。优选地，所述连接肽长度为3-30个氨基酸。更优选地，所述连接肽长度为4-20个氨基酸。最优选地，所述连接肽长度为5-10个氨基酸。

在另一优选例中，所述抗原表位和所述载体蛋白之间不具有连接肽。

在另一优选例中，所述抗原表位替换所述载体蛋白的C末端或N末端的1-50个氨基酸。优选地，所述抗原表位替换所述载体蛋白的C末端或N末端的5-30个氨基酸。更优选地，所述抗原表位替换所述载体蛋白的C末端或N末端的10-20个氨基酸。

在另一优选例中，所述的载体蛋白为白喉毒素的跨膜结构域DTT，并且所述的可插入抗原表位的表面氨基酸残基区包括：

白喉毒素跨膜结构域(DTT)可植入抗原表位的表面氨基酸残基区

本发明的第二方面，提供一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码第一方面所述的重组蛋白。

本发明的第三方面，提供一种表达载体，所述表达载体含有第四方面所述的多核苷酸。

本发明的第四方面，提供一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有第三方面所述的表达载体，或者在基因组中整合有第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母、CHO细胞、DC细胞等。

本发明的第五方面，提供一种药物组合物，所述的组合物含有第一方面所述的重组蛋白、第二方面所述的多核苷酸或者第三方面所述的表达载体或者第四方面所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或辅料。

在另一优选例中，所述的组合物为疫苗。

本发明的第六方面，提供一种疫苗组合物，所述的组合物含有第一方面所述的重组蛋白、第二方面所述的多核苷酸或者第三方面所述的表达载体或者第四方面所述的宿主细胞，以及免疫学上可接受的载体和/或辅料。

在另一优选例中，所述的疫苗组合物还含有佐剂。

在另一优选例中，所述疫苗组合物为核酸疫苗组合物，所述核酸疫苗组合物中包含第二方面所述的多核苷酸或者第三方面所述的表达载体。

在另一优选例中，所述的佐剂包括氧化铝、皂苷、quil A、胞壁酰二肽、矿物油或植物油、基于囊泡的佐剂、非离子嵌段共聚物或DEAE葡聚糖、细胞因子(包括IL-1、IL-2、IFN-r、GM-CSF、IL-6、IL-12、和CpG)。

本发明的第七方面，提供第一方面所述的携带抗原表位的重组蛋白的用途，(a)用于制备针对所述抗原表位的抗体；和/或(b)用于制备治疗与所述抗原表位相关的疾病的药物。

在另一优选例中，所述的疾病包括：自身免疫疾病(如类风湿关节炎)、肿瘤、心血管疾病等。

本发明的第八方面，提供一种治疗方法，给需要的对象施用第一方面所述的重组蛋白、第四方面所述的药物组合物或第三方面的疫苗组合物。

本发明的第九方面，提供一种抗原表位肽，所述抗原表位肽源自哺乳动物(如人)的低免疫原性蛋白且包含一个或多个抗原表位，

并且所述抗原表位肽氨基酸序列长度为相应的低免疫原性蛋白全长的5-100％(优选地，所述抗原表位肽氨基酸序列长度为相应的低免疫原性蛋白全长的5-70％；更优选地，所述抗原表位肽氨基酸序列长度为相应的低免疫原性蛋白全长的5-50％；最优选地，所述抗原表位肽氨基酸序列长度为相应的低免疫原性蛋白全长的5-30％，如10％、15％、20％、25％)，且所述抗原表位肽的长度为5-500个氨基酸；

并且所述抗原表位肽与本发明载体蛋白形成的重组蛋白可诱发同一种类的所述哺乳动物产生针对该低免疫原性蛋白的免疫反应。

优选地，所述抗原表位肽氨基酸序列长度为3-57。更优选地，所述抗原表位肽氨基酸序列长度为5-17。

在另一优选例中，所述的低免疫原性蛋白包括：VEGF、TNF-α、Her2蛋白、凝血因子、白细胞介素、FAP、PDL1、EGFR。

在另一优选例中，所述抗原表位肽源自TNF-α，并且选自下组：

(1)SEQ ID NO.：10或SEQ ID NO.：12所示的氨基酸序列；

在另一优选例中，所述的抗原表位肽源于TNF-α，并且所述抗原表位肽选自下组：

(a)SEQ ID NO.：5-8、SEQ ID NO.：34、SEQ ID NO.：117或SEQ ID NO.：118所示的多肽；

(b)将SEQ ID NO.：5-8或SEQ ID NO.：34所示的多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且与载体蛋白融合后具有诱发针对TNF-α免疫反应功能的由(a)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述抗原表位肽源于凝血因子FXI，并且所述抗原表位肽选自下组：

(a)SEQ ID NO.：40或SEQ ID NO.：41所示的多肽；

(b)将SEQ ID NO.：40或SEQ ID NO.：41所示的多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且与载体蛋白融合后具有诱发免疫反应功能的由(a)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述抗原表位肽包括FXI的催化结构域或其同源序列。

在另一优选例中，所述FXI的催化结构域的蛋白序列如SEQ ID NO.：45所示。

在另一优选例中，所述抗原表位肽源自凝血因子为FXI，并且所述抗原表位肽选自下组：

(a)SEQ ID NO.：45所示的多肽；

(b)将SEQ ID NO.：45所示的多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且与载体蛋白融合后具有诱发免疫反应功能的由(a)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述抗原表位肽源自FXII。

在另一优选例中，所述抗原表位肽选自下组中的一个或多个：

(1)EAFSPVSYQHDLA；

(2)EGFSSITYQHDLA；；和

(3)其他FXII蛋白中与(1)、(2)表位序列对应的肽段。

在另一优选例中，所述抗原表位肽包括凝血因子为FXII的催化结构域。

在另一优选例中，所述FXII的催化结构域选自下组：

(a)具有SEQ ID NO.：129或SEQ ID NO.：130氨基酸序列的多肽；

在另一优选例中，所述抗原表位肽源自FAP催化结构域。

在另一优选例中，所述FAP催化结构域选自下组：

(a)具有SEQ ID NO.：108氨基酸序列的多肽；

在另一优选例中，所述抗原表位肽源于FAP，并且所述抗原表位肽选自下组：

(a)SEQ ID NO.：49所示的多肽；

(b)将SEQ ID NO.：49所示的多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且与载体蛋白融合后具有诱发免疫反应功能的由(a)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述抗原表位肽源自VEGF。

在另一优选例中，所述抗原表位肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO.：63氨基酸序列的多肽；

在另一优选例中，所述抗原表位肽源自PDL1。

在另一优选例中，所述抗原表位肽源自PDL1E。

在另一优选例中，所述抗原表位肽源自PDL1，并且所述抗原表位肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO.：67、SEQ ID NO.：68、SEQ ID NO.：122、SEQ ID NO.：123、SEQID NO.：124或SEQ ID NO.：125氨基酸序列的多肽；

在另一优选例中，所述抗原表位肽源自表皮生长因子受体EGFR。

在另一优选例中，所述抗原表位肽源自表皮生长因子受体EGFR的第III亚区。

在另一优选例中，所述抗原表位肽源自表皮生长因子受体EGFR，并且所述抗原表位肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO.：83、110、111所示氨基酸序列的多肽；

在另一优选例中，所述抗原表位肽源自表皮生长因子受体EGFR，并且包括SEQ IDNO.：83所示的氨基酸序列，和

SEQ ID NO.：110和SEQ ID NO.：111中的至少一种。

本发明的第十方面，提供一种融合蛋白，所述融合蛋白是如本发明第九方面的抗原表位肽与载体蛋白融合所形成的。

在另一优选例中，所述载体蛋白与所述抗原肽段不是来自同一个蛋白，所述载体蛋白包含至少一个T细胞表位，所述载体蛋白可以增强所述表位肽的免疫原性。

在另一优选例中，所述载体蛋白包括白喉毒素DT、白喉毒素的跨膜结构域DTT、轮状病毒VP7、利什曼原虫的热休克蛋白、空肠弯曲菌鞭毛蛋白、沙眼衣原体主要外膜蛋白、血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)，鸡卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)，纤维蛋白原。

在另一优选例中，在所述载体蛋白的至少一个分子表面氨基酸残基区通过拼接、替换和/或插入引入所述抗原表位肽形成所述融合蛋白。

在另一优选例中，所述抗原表位肽连接于所述载体蛋白的C末端和/或N末端形成所述融合蛋白。

在另一优选例中，所述抗原表位和所述载体蛋白之间具有连接肽。优选地，所述连接肽长度为3-30个氨基酸。更优选地，所述连接肽长度为4-20个氨基酸。最优选地，所述连接肽长度为7-17个氨基酸。

在另一优选例中，所述融合蛋白选自：

(a)具有SEQ ID NO.：9、11、13、35、37、39、42、43、44、50、51、62、69、70、84、85、86、87、112、119、120、126或127所示氨基酸序列的多肽；

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了实施例中基于重叠PCR的扩增原理图。

图2显示了实施例1中mTNF疫苗抑制发病的效果。图2A显示了免疫后TNF28相对于DT抗血清针对小鼠和人的TNF蛋白的蛋白杂交实验。图2B显示每组老鼠免疫与发病期间的平均发病分数，可以看到mTNF28组相对于对照组Alum在发病率上表现出明显的滞后和减轻炎症的治疗作用。图2C显示各融合蛋白的生物活性。图2D显示每组老鼠免疫与发病期间的平均发病分数，可以看到DTT-mTNFt组相对于对照组在发病分数上有明显抑制发病的效果。

图3显示了实施例2中mTNF28-1抗原蛋白的引发免疫反应的效果。图3A显示mTNF28-1第四次加强免疫之后60天取小鼠的血来做抗体分型，发现针对IgG1的滴度还有10000以上。图3B显示了每组老鼠免疫与发病期间的平均发病分数，可以看到mTNF28-1组相对于对照组在发病分数上有明显抑制发病的效果。

图4显示了实施例3中FXI疫苗的抗血栓效果。图4A显示各组抗原免疫后小鼠在致死肺栓塞模型中的存活率。图4B显示从注射人胎盘浸出液到小鼠开始出现呼吸困难的时间。图4C和图4D显示29号抗原免疫后小鼠血栓的形态(C)和湿重(D)。

图5显示了实施例3中FXI疫苗免疫小鼠的抗体延长了正常人血浆APTT值(A)及FXI(B)特异的血浆APTT值。

图6显示了实施例4中FXII疫苗免疫后小鼠血栓的形态(A)和湿重(B)。

图7显示了实施例5中融合疫苗DTT-FAP对肿瘤生长的抑制效果。图7A为肿瘤接种后小鼠的存活率。图7B显示了肿瘤体积的变化趋势。图7C显示接种4周后肿瘤的大小。

图8显示了实施例6中DTT-VEGF免疫后可以显著延长荷瘤小鼠的生存时间。

图9显示了实施例6中不同实验组肿瘤周围血管状况、瘤体内部病理形态、肿瘤重量和肿瘤体积的变化趋势。

图10显示了实施例7中DTT-PDL1E和DTT-PDL1E重组蛋白疫苗对肿瘤生长的抑制效果。图10A显示了免疫治疗小鼠肿瘤体积变化。

图10B、图10C和图10D分别显示了实施例7中DTT-PDL1E和DTT-PDL1E重组蛋白疫苗免疫治疗小鼠肿瘤重量变化(图10B)、荷瘤小鼠的体重(图10C)和肿瘤肿瘤与荷瘤小鼠的体重比值(图10D)。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，以合适的载体蛋白的结构骨架为基础，在所述载体蛋白的至少一个表面氨基酸残基区处通过拼接、替换和/或插入而引入来自低免疫原性蛋白的肽段，可以制得一类新颖的重组蛋白。所述重组蛋白不仅可有效激发机体(如哺乳动物)对所述重组蛋白的免疫应答，而且可以有效地产生针对所述来自低免疫原性蛋白肽段的免疫反应，包括产生抗体。在此基础上完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“载体蛋白”指在本发明的重组蛋白中作为蛋白结构骨架的蛋白。通常，所述的载体蛋白是免疫原性较强的蛋白，例如病原体蛋白，代表性的例子包括(但并不限于)：病毒蛋白、细菌蛋白、衣原体蛋白、支原体蛋白等。

如本文所用，术语“抗原表位(肽)”指拟诱导动物产生免疫反应的其它蛋白的一段肽，该表位相对于载体蛋白而言的不是指载体蛋白本身能够引起免疫反应的肽段。通常，抗原表位指免疫反应拟靶向的肽段，较佳地来源于哺乳动物(如人)蛋白的一段肽，而不是来自所述载体蛋白。

如本文所用，术语.pdb专指蛋白质三级结构数据文件，来自Protein Data Bank(www.pdb.org)；

如本文所用，术语DTT指白喉毒素的跨膜结构域；

如本文所用，术语T细胞表位是指T细胞表位，又称为T细胞抗原表位，是抗原分子经过抗原呈递细胞中酶解加工产生的一段肽，能够由主要组织相容性复合体(MHC)分子结合，呈递在细胞表面被T细胞受体(TCR)结合，激活T细胞，包括T辅助细胞表位等。

如本文所用，术语“低免疫原性蛋白”是指单独免疫动物不能引起足够的免疫反应的蛋白

如本文所用，术语“分子表面氨基酸残基区”或“表面氨基酸残基区”是指位于蛋白分子表面的氨基酸残基组成的区域，优选地，所述“分子表面氨基酸残基区”包括loop区、beta-tum区、N末端或C末端。

代表性的载体蛋白

1.白喉毒素及其跨膜结构域

白喉毒素(diphtheria toxin，DT)是感染了beta噬菌体的白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)产生的外毒素，存在于临床使用的百白破疫苗成份中。安全性得到多年临床使用的验证，罕见严重不良反应，目前尚无由白喉成份引起过敏反应的报道。

白喉毒素分子由535个氨基酸残基构成，空间上相对独立的催化结构域(1-193AAs)、跨膜结构域(205-378AAs)和受体结合域(386-535AAs)组成；跨膜结构域和受体结合域本身无毒性，其功能是通过细胞表面受体结合，将催化结构域转导进入细胞内。

白喉毒素氨基酸序列(P00588，DTX_CORBE)如下所示：

白喉毒素分子中的存在5个T-辅助细胞表位可被高达80％以上的人MHC class II识别。其中，四个T-辅助细胞表位位于白喉毒素的跨膜结构域(T区，DTT)上，分别为DTT-Th表位271-290(271-PVFAGANYAAWAVNVAQVID-290)，DTT-Th表位321-340(321-VHHNTEEIVAQSIAL SSLMV-340)，DTT-Th表位331-350(QSIALSSLMVAQAIPLVGEL-350)，DTT-Th表位351-370(351-VDIGFAAYNFVESIINLFQV-370)，主要分布在三段长α螺旋结构(276-ANYAAWAVNVA-286；327-EIVAQSIALSSLMVAQAIPLV-347；353-IGFAA YN FV ESIINLFQVVHNSYN-376)。

本发明人对白喉毒素的蛋白结构进行模拟，保留结构稳定需要的α螺旋和β折叠元件和T细胞表位，能够被替换植入抗原表位的表面氨基酸残基区位置列于下表中。

白喉毒素(DT)表面氨基酸残基区可植入位置汇总

白喉毒素跨膜结构域(DTT)本身无毒，主要由α螺旋元件构成核心骨架，螺旋元件之间由灵活性的环区连接。

DTT氨基酸序列(1F0L.pdb：202-378)如下所示：

本发明人对DTT的蛋白结构进行模拟，保留结构稳定需要的α螺旋和β折叠元件和T细胞表位，能够被替换植入抗原表位的位置列于下表中。

DTT可植入抗原表位的表面氨基酸残基区汇总

在本发明的优选例中，可选择药物拟干预的靶蛋白的肽段移植到DTT上，并替换DTT的表面氨基酸残基区，包括α螺旋元件之间环区氨基酸残基。

本发明的研究表明，白喉毒素跨膜结构与来自靶蛋白的肽段整合后，不会或基本上不会影响各自的折叠。在重组蛋白中，DTT作为蛋白骨架，靶蛋白肽段移植到DTT上后，可以诱导动物产生针对所述靶蛋白的免疫反应。因此DTT是一种非常合适的蛋白骨架。

组合物和施用方法

本发明还提供了一种组合物，它含有：(i)本发明的重组蛋白或本发明的可编码重组蛋白的多核苷酸，以及(ii)药学上或免疫学上可接受的赋形剂或佐剂。

本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于或存在于本发明的组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

本发明的组合物包括药物组合物和疫苗组合物。

本发明的组合物可以是单价的(仅含有一种重组蛋白或多核苷酸)，也可以是多价的(含有多种重组蛋白或多核苷酸)。

本发明的药物组合物或疫苗组合物可制备成各种常规剂型，其中包括(但并不限于)：注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾剂等。

(1)药物组合物

本发明的药物组合物包含(或含有)治疗有效量的本发明重组蛋白或多核苷酸。

本文所用的术语“治疗有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果可通过例如抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量。

为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.001毫克/千克至1000毫克/千克，较佳地约0.01毫克/千克至100毫克/千克体重的重组蛋白。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(例如本发明的重组蛋白)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体或赋形剂的充分讨论。

组合物中药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常，可将组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。

(ii)疫苗组合物

本发明的疫苗(组合物)可以是预防性的(即预防疾病)或治疗性的(即在患病后治疗疾病)。

这些疫苗包含免疫性抗原(包括本发明重组蛋白)，并且通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。另外，抗原也可以和细菌类毒素(如白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌等病原体的类毒素)偶联。

增强免疫组合物效果的优选佐剂包括但不限于：(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油型乳剂配方，例如，(a)MF59(参见WO 90/14837)，(b)SAF，和(c)Ribi^TM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)，(3)皂素佐剂；(4)Freund完全佐剂(CFA)和Freund不完全佐剂(IFA)；(5)细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CFS)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(6)细菌ADP-核糖基化毒素(如大肠杆菌热不稳定毒素LT)的脱毒变异体；以及(7)作为免疫刺激剂来增强组合物效果的其它物质。

包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物(例如，可包括抗原、药学上可接受的载体以及佐剂)，通常含有稀释剂，如水，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。

更具体地，包括免疫原性组合物在内的疫苗，包含免疫学有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的组分。“免疫学有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量可根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如人)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。

通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，以增强佐剂效果。

此外，本发明的疫苗组合物可以是单价的或多价疫苗。

(iii)给药途径和剂量

一旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待治疗的对象可以是哺乳动物，尤其是人。

当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的重组蛋白直接施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。

给予本发明药物组合物或疫苗组合物的途径包括(但并不限于)：肌内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要，可以组合给药途径，或根据疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。

应以“有效量”给予重组蛋白疫苗，即重组蛋白的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效促使保护宿主抵抗相关的疾病。

代表性的疾病包括(但并不限于)：自身免疫性疾病、肿瘤等。

在各疫苗剂份中所选用的重组蛋白的量，是按可引发免疫保护性应答而无明显的副作用的量而定。通常，在感染宿主细胞后，各剂的疫苗足以含有约1μg-1000mg，较佳地为1μg-100mg，更佳地10μg-50mg蛋白质。可用包括观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用量。可通过监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血清中的抗体滴定度后，可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/或免疫刺激剂就可提高对本发明的蛋白质的免疫应答。

优选方法是从肠胃外(皮下或肌内)途径通过注射给予免疫原性组合物。

此外，本发明的疫苗可以结合其它免疫调节剂一起给予，或者与其他治疗剂一起给予。

本发明的主要优点在于：

(1)可有效激发机体针对低免疫原性靶点的特定表位免疫反应。

(2)携带抗原表位的重组蛋白的制备成本低，给药方便。

(3)相对于与载体蛋白化学偶联的制剂，抗原结构确切、质量可控，更安全。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实验方法：

方法1重组蛋白抗原结构设计

单表位重组蛋白抗原结构设计用靶蛋白的抗原表位肽氨基酸序列移植到DTT的表位展示位置并替换原位置氨基酸残基完成，形成新蛋白结构；多表位重组蛋白抗原结构设计将靶蛋白的多抗原表位肽段或结构域插入DTT的C末端，或通过一段linker插入到DTT的C末端完成，形成新蛋白结构。

方法2重组蛋白的表达载体构建

根据GeneBank中DTT基因mRNA和靶蛋白基因mRNA的开放阅读框的抗原表位区序列，设计DTT基因引物(DTT-F和DTT-R)和靶蛋白基因引物，通过重叠PCR的原理在DTT相应的表位展示位置引入抗原表位区序列，并在头尾引入酶切位点BamHI和XhoI，引入3个保护碱基(图1)。各引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

(1)抗原表位从DTT中间插入/替换的重组蛋白表达载体构建：以DTT基因DNA为模板，取引物DTT-F(含BamH I酶切位点和)和靶蛋白-2R进行第一轮PCR扩增；同时以DTT基因DNA为模板，取引物用引物DTT-R(含XhoI酶切位点)和靶蛋白-3F进行PCR扩增；以上两种扩增产物混合后，取引物DTT-F和DTT-R进行PCR扩增重组蛋白基因。

(2)抗原表位从DTT的C末端插入/替换的重组蛋白表达载体构建：以DTT基因DNA为模板，引物对DTT-F(含BamH I酶切位点和肠激酶切位点DDDDK的序列)进行第一轮PCR扩增；再以靶蛋白基因引物对(反向引物含Xho I酶切位点序列)PcR扩增靶蛋白抗原表位基因；以上两种扩增产物混合后以引物对DTT-F和靶蛋白基因反向引物进行PCR扩增重组蛋白基因。

重组蛋白基因用BamH I和Xho I酶切连接到质粒pGEX 6p-1达到表达质粒pGEX-DTT-靶蛋白抗原表位，通过测序确认正确性。

PCR体系配制后，94℃变性2 min；94℃ 15s，55℃ 30s，68℃ 2min，35个循环；68℃10min。取2μL扩增产物进行电泳，Goldview染色观察后出现目的带。PCR产物和pEGX-6P-1载体双酶切的回收纯化，用AXYGEN凝胶清洁试剂盒清洁后。在PCR仪上采用T4连接酶连接进行连接反应16℃ 5h。连接产物热激转化大肠杆菌，将5uL的连接产物加入感受态细胞中轻轻混匀，冰浴20min再转入42℃水浴90s，再冰浴2min，加900μL 37℃预热LB培养基，于37℃摇床150rpm复苏1h，取200μL涂布于含有Amp抗菌素LB平板，37℃培养20h，进步一鉴定筛选转化子。提取的载体质粒用头尾引物PCR扩增后经鉴定的阳性克隆加入终浓度为15％的无菌甘油，于-80℃超低温冰箱保存备用，为含有重组蛋白表达质粒的大肠杆菌菌种。阳性克隆通过测序与理论序列比较判断是否连接成功。

表1 DTT基因C端插入表位的通用引物表

引物名称	引物序列
		DTT-F(SEQ ID NO.：3)	CGCGGATCCCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCATAAATCTTGATTGGGATGTC
DTT-R(SEQ ID NO.：4)	CCGCTCGAGCTAGGGACGATTATACGAATTATG

方法3重组蛋白的表达鉴定与规模制备

将含有重组表达质粒蛋白的大肠杆菌单菌落接种到5mL LB培养基，37℃培养过夜。然后以1∶50稀释到含有50ng/L Amp、LB培养基50mL中，培养约4小时使其OD₆₀₀值约为0.6，加IPTG至终浓度为1mM，在37℃诱导4小时时取出鉴定表达情况。取50mL诱导的培养物，冰上放置30min，12000rpm离心8min，收集菌体，弃上清；沉淀用1×PBS(5mL/100mL培养物)加等体积冰冷的无菌水打散重悬；加入300μg/mL的溶菌酶，冰上轻摇30min后，置-70℃冻存12h；把样品用流动的水融化后加入蛋白酶抑制剂，冰浴中超声破碎(200W功率)，间歇破碎，每破碎5s，间隔5s，反复破碎共8min，(可在显微镜下观察破碎结果)。混合物在4℃用12，000g的转速离心12min；取混合、上清、沉淀样品保存4℃备用。

取混合，上清，沉淀样品分别用考马斯亮蓝法定量测定蛋白含量并稀释到一定浓度后取200uL加入50uL 5×上样buffer，煮沸5min，取出冷却后12，000rpm离心8min并加样。用微量进样器取20μL上述混合液，用SDS-PAGE电泳分析诱导表达的蛋白分子量和表达量，判断与理论分子量一致性和表达可溶性。

挑取表达阳性的菌种，接种于50mL选择性Amp LB液体培养基中，37℃，200rpm/min振摇过夜，第二天取1mL接种到1L LB液体培养基中，同样的操作一共4瓶，37℃，180rpm培养4h后，取一管不加IPTG样本作为对照，其余加入1mol/L IPTG于菌液中至终浓度为1mM，继续培养10小时。全部诱导后菌液6000rpm离心8min收集菌体沉淀，用1mL PBS(pH＝7.3)重悬洗涤一次离心收集菌体，加入体积250mL PBS(pH＝7.3)重悬后超声破碎，15min，脉冲破碎后用50mL离心管离心，15000rpm，40min后，小心取上清，4℃存放备用。

GE 5mL GST预装柱先1×PBS(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄，2mM KH₂PO₄)平衡，流速设为4mL/min左右，平衡5个柱体积，将上述处理好的蛋白上样，流速1mL/min；上样结束后，用1×PBS洗杂，流速为4mL/min，洗脱至少10个柱体积；之后用1×PSP buffer平衡柱子至少5个体积后，用800ul的PSP酶切割流穿GST柱子，使其均匀充满整个柱子，于4℃切割12-16小时后用含有洗脱液(50mM Tris-HCl，10m GSH，pH8.0)洗脱蛋白2-3个柱体积，洗脱流速为2mL/min，用过的柱子用20％乙醇冲洗柱子和仪器。之后将蛋白透析到生理盐水中，定量后将蛋白稀释成0.5mg/mL，电泳检测纯度达到90％以上。将蛋白用生理盐水透析后-20℃冰箱保存备用。所制备的三种蛋白纯度都在90％以上。

方法4融合蛋白的动物免疫和抗原滴度的检测

将融合蛋白抗原稀释成0.5mg/mL后与稀释后浓度为2mg/mL的氢氧化铝(sigma)佐剂或弗氏佐剂混匀后背部皮下多点注射，隔周加强免疫，如此加强免疫2次后小鼠眼眶取血，37℃静置2h后，4000rpm离心10min后，取上清血清备用。

用包被缓冲液(50mmol/L碳酸氢盐缓冲液，pH 9.6)将靶蛋白或靶细胞的稀释到浓度为100ng/100μl，然后转移到聚苯乙烯96孔板上(每孔加100μl)，4℃孵育过夜，用PBST(0.02M磷酸盐，0.15M NaCl，0.15％Tween-20，pH 7.4)洗6次，每次洗5分钟。再加入300μl脱脂奶粉(溶于PBST，蛋白浓度为5％)，37℃孵育2小时进行封闭。用PBST(0.02M磷酸盐，0.15MNaCl，0.15％Tween-20，pH 7.4)洗6次，每次洗5分钟。然后用脱脂奶粉(溶于PBST，蛋白浓度为5％)将免疫血清稀释一定的倍数后每孔加100μl，37℃孵育1小时，用PBST(0.02M磷酸盐，0.15M NaCl，0.15％Tween-20，pH 7.4)洗6次，每次洗5分钟。加入100μl羊抗鼠-IgG-辣根过氧化物酶交联物(1∶5，000稀释)，37℃孵育1小时，用PBST(0.02M磷酸盐，0.15M NaCl，0.15％Tween-20，pH 7.4)洗6次，每次洗5分钟。最后加入100μl底物溶液(10ml底物溶液含1mg四甲基联苯胺(TMB)，0.0969g柠檬酸钠，0.3496g Na₂HPO₄·12HO₂，32μl 0.75％H₂O₂，37℃孵育30分钟。加入50μl 2mol/L H₂SO₄终止反应。在酶标仪上对每个孔测450nm处的值。

实验5小鼠胶原模型的构建

当小鼠3次免疫之后，开始造类风湿关节炎模型，具体操作过程：第42天将牛的II型胶原(2mg/mL)与CFA(内含1mg/mL的M.tuberculosis)1∶1冰上背部多点注射共200uL；第63次将牛的II型胶原(4mg/mL)与CFA(内含1mg/mL的M.tuberculosis)1∶1比例，低温冰上用枪头吹打乳化(以滴一滴在清水上，不立即散开为乳化好的标准)，在距离小鼠尾根部1.5cm处注射50uL；第70天将牛的II型胶原(4mg/mL)与CFA(内含1mg/mL的M.tuberculosis，且每ml CFA中新加入3mg的M.tuberculosis)1∶1比例，低温冰上乳化后在距离小鼠尾根部1.5cm处注射50uL。以后每周两次来检测老鼠的体重和发病情况并做好记录。

评分标准：用4分制评判小鼠的发病程度：0分：无红肿和肿胀的证据；1分：红斑和轻度肿胀局限于足中段(跗骨)或踝关节(一个脚趾有轻微红肿)；2分：红斑和轻度肿胀从踝关节蔓延至足中段(有2个或者2个以上的脚趾红肿)；3分：红斑和中度肿胀从踝关节蔓延至跖关节(踝关节或髋关节红肿)；4分：红斑和重度肿胀包括了踝，足和趾(所有的关节和脚趾均红肿，不能弯曲)。所有的四肢均单独计分，故最高分为16分。

方法6 Western鉴定

原始样品一般上样量为20-30ug以初始电压为45V时的电流强度进行稳流电泳，当电压达65V时改为稳压电泳，在目的蛋白泳动至距胶下缘1cm以上结束。将胶浸于转移缓冲液中平衡10min。依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入转移缓冲液中平衡10min。如用PVDF膜需用纯甲醇浸泡饱和3-5秒钟。装配转移三明治：海绵3层滤纸胶膜3层滤纸海绵，每层放好后，用试管赶去气泡。将转移槽置于冰浴中，放入三明治(黑色面对黑色面)，加转移缓冲液，插上电极，10mA过夜或者100V，1h。(注意调整时间)转膜结束后，切断电源，取出杂交膜。

将膜从电转槽中取出，去离子水与TTBS稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡1h。将稀释好的一抗装入10mL的或者50mL的进口离心管。将Western膜从封闭液中取出，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，4℃静置过夜(正面上下用铅笔做好标记)。一抗孵育结束后，用TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次10min。根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择HRP标记的抗体，按相应比例稀释(1∶5000)，室温轻摇1h。二抗孵育结束后，用TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次10min。将A、B发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，调节曝光强度。

方法7 T细胞增殖实验

50ml离心管8只，洗净，灭菌；15ml离心管16只，洗净，灭菌。无菌细胞筛网8只，300ml 75％酒精，灭菌镊子两把，小剪刀两把，灭菌PBS，RPM1640+20％FCS，各一瓶。6孔培养板两只，10ml一次性注射器8个。小鼠脱颈处死后，放入75％乙醇中浸泡15分钟，浸泡期间，取出淋巴细胞分离液室温平衡，超净台内取出灭菌的剪刀镊子，用酒精棉擦拭后摆放在10cm细胞培养皿中，准备好6孔板，将滤器套在50ml离心管上。

将浸泡好的小鼠仰卧尾朝外平放在平皿中，从右侧腹股沟上方一厘米剪开腹腔，用小镊子拨开肝脏后小心拉出脾脏，放在6孔板的孔中，孔中预先加入2ml PBS；用注射器的活塞柄头小心的压碎脾脏，并进行旋转研磨至完全散开。将得到的细胞悬液小心的吸到离心管上的滤器中，至细胞悬液全部滤过，加1ml PBS冲洗下板孔并吸出冲洗滤网一次；准备好15ml离心管，预先加入3ml淋巴细胞分离液，按照说明书进行操作分离淋巴细胞；细胞沉淀用PBS再清洗一次，用含有10％FCS 1640将细胞调整至5×10⁶/ml，按照每孔100μL铺板，每孔加终浓度为10μg/ml抗原刺激，5％CO2 37度培养72小时；加入10μL MTT继续培养4小时，吸弃培养上清及悬浮的细胞；加入100μL二甲亚砜，室温震荡溶解蓝色沉淀；550nm、630nm读取吸光值，以OD₅₇₀-OD₆₃₀作为最终数值，判断每孔的活细胞数目。用抗原刺激组-空白对照组数值作为细胞增殖活性。

方法8 CTL杀伤实验

CFSE staining buffer和7AAD staining buffer按照7AAD/CFSE Cell-mediatedcytotoxicity Assay kit(Abnova，US)说明书准备。

标记靶细胞：肿瘤细胞用胰酶消化后，1000rpm 5min离心弃上清；加入3ml Cell-Based Assay Buffer重悬，计数后1000rpm 5min离心弃上清；按照10⁶cells/ml用CFSEstaining buffer重悬，对照细胞用同体积Cell-Based Assay Buffer重悬，室温避光孵育15min；1000rpm 5min离心弃上清，细胞按照10⁶cells/ml用含10％FBS+1640重悬；1000rpm5min离心弃上清，细胞按照10⁶cells/ml用含10％FBS+1640重悬。放置细胞培养箱中培养30min-1小时备用；按照T细胞增殖实验中的方法分离脾脏淋巴细胞，按照10⁷cells/ml铺6孔板，每孔2ml；加入终浓度为10μg/ml抗原肽和10unit/ml IL-2刺激，5％CO₂，37度培养5天后备用。

检测：将标记好的靶细胞按照10⁴cells/well铺96孔板中。刺激好的效应细胞按照效靶比10∶1，20∶1，50∶1加入到靶细胞中，并补足培养基至每孔总体积为200μL，5％CO₂37度孵育6小时。400g/5min收集细胞沉淀，每管加入50ul 7-AAD Staining Solution，重悬细胞。4度避光孵育15min；400g/5min收集细胞；加入0.2ml Assay Buffer重悬，400g/5min收集细胞；加入0.2ml Assay Buffer重悬，上流式检测，记录数据；收集20000个细胞。计算双阳性细(CFSE+7AAD+)占CFSE阳性细胞(CFSE+)的百分比作为最终的杀伤率。

方法9肿瘤细胞培养与小鼠移植癌症模型的建立与免疫治疗效果评价

细胞与肿瘤接种：材料包括DMEM培养基、1640培养基、胎牛血清、抗生素、胰蛋白酶、均购自Invitrogen公司，PBS(参考Takara说明书配制)。Binder细胞培养箱、飞鸽离心机、万和金属水浴锅。

肿瘤细胞培养与移植：CT26、B16 F10、Lewis等肿瘤细胞均购自中科院上海细胞库，根据不同肿瘤细胞特性常规传代培养，5％CO₂培养箱，37℃培养。当细胞融合度达到90％时，经0.25％胰酶消化，收集细胞于无血清的培养液中，轻轻摇动，500g，离心5min，洗涤-次，PBS重悬，调整浓度为10⁶，经台盼蓝染色，并用血球计数板计数，检测活细胞比例在95％以上。根据实验要求，实体瘤接种在前肢腋下10⁵-10⁶个/只。

表观效果评价：肿瘤接种7天左右(不同类型肿瘤略有差异)隔天游标卡尺测定肿瘤长和宽，利用肿瘤体积计算公式：Tumor volume＝width² _*length_*π/2。肿瘤体积大于2000mm³或3000mm³(不同类型肿瘤略有差异)理论上判断小鼠死亡，统计存活情况，制定生存曲线。在接种肿瘤(20-30天)剖杀小鼠，称量瘤重，根据公式：抑制率＝(对照组平均肿瘤重量-实验平均组肿瘤重量)/对照组平均肿瘤重量_*100％。小鼠在分组前和剖杀前，电子天平称量小鼠体重并记录，计算瘤重体重比。

实施例1靶向TNF-α的重组蛋白疫苗

抗TNF-α单克隆抗体药物在临床治疗类风湿关节炎领域获得了巨大成功，但是抗体药物用药剂量大、使用频繁、用药成本高阻碍了更大范围的使用惠及更多患者。本实施例开发了预防和治疗类风湿关节炎的靶向TNF-α的重组蛋白疫苗。

步骤1抗原结构设计

将表中mTNF抗原表位序列移植替换到DTT被替换的位置处构成，组成相应的抗原依次为mTNF28、mTNF31、mTNF37、mTNF25、DTT-mTNFt、DTT-hTNFt。将TNF分子的87位酪氨酸Y突变为组氨酸H、145位丙氨酸A突变为精氨酸R得到TNF-生物活性极低的突变体mTNFt和hTNFt(t为定点突变)，移植到DTT的C末端构成重组抗原DTT-mTNFt和DTT-mTNFt。本实施例中所用的其余重组抗原的结构移植信息参见表2。

表2 TNF重组抗原设计

DTT-mTNFt(A145R/Y87H)抗原蛋白氨基酸序列：

mTNFt(A145R/Y87H)氨基酸序列：

DTT-hTNFt(A145R/Y87H)抗原蛋白氨基酸序列：

hTNFt(A145R/Y87H)氨基酸序列：

mTNF31抗原蛋白氨基酸序列：

mTNF28的抗原蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO.：112)

mTNF28的抗原蛋白的核酸序列如SEQ ID NO.：121。

步骤2重组蛋白的表达纯化及免疫原性观察

按照方法2操作，用表3 TNF重组抗原基因引物分别构建各抗原的表达质粒，测序证明正确。

DTT-mTNFt(A145R/Y87H)抗原蛋白基因序列请见SEQ ID NO.：14。

DTT-hTNFt(A145R/Y87H)抗原蛋白基因序列请见SEQ ID NO.：15。

mTNF32抗原蛋白基因序列请见SEQ ID NO.：16。

mTNF31抗原蛋白基因序列请见SEQ ID NO.：17。

表3 TNF重组抗原基因引物

重组蛋白抗原的表达纯化按照方法3操作，制备出纯度达到90％-95％的重组抗原。小鼠免疫操作按照方法4，包被抗原用mTNF，最终ELISA结果显示，抗血清稀释100倍后，TNF28针对mTNF的OD₄₅₀平均值为0.33，mTNF31针对mTNF的OD₄₅₀平均值为0.09，mTNF37针对mTNF的OD₄₅₀平均值为0.11，而Alum针对mTNF为OD₄₅₀平均值0.05，TNF28比对照的Alum组产生针对mTNF的抗体比mTNF31、mTNF37都要好。免疫之后血清western结果显示TNF28组对比DTT组(单用DTT免疫的小鼠血清)有明显的抗体条带，并且人TNF条带比小鼠TNF条带反应信号更强(图2A)。

步骤3蛋白突变之后的生物活性测定

取对数生长期的L292细胞(25cm₂培养瓶培养2d)，倒掉培养液后用1×PBS洗涤两次，吸净1×PBS后加入0.7mL消化液37℃消化3min，1000rpm/min离心4min，吸去消化液，用5mL的1640培养液洗涤细胞2次，以去除胰酶。用1640培养液调整细胞浓度至2×10⁵/ml，取96孔细胞培养板，每孔中加0.1ml L929细胞悬浮液，在CO₂培养箱中培养过夜或24小时，待细胞贴满板壁95％以上时，方可加样。用AcD-1640培养基根据情况10倍系列稀释待测TNF，每孔加入稀释物100uL，每个稀释度3个重复孔，在CO₂培养箱中培养20h，直接于每孔加入20uL MTT(碧云天)，37℃下孵育4h，用酶标仪检测波长450nm，参考波长600-650nm，测各孔OD值。杀伤率计算公式：(对照组OD₄₅₀-实验组OD₄₅₀)/对照组OD₄₅₀×100％。最大杀伤浓度从0.2ng/ml降低到100000以上(已经做到的最大浓度)，定点突变后，重组蛋白的活性下降了100000倍以上(图2C)。

步骤4胶原诱导小鼠关节炎模型的观察

按照方法5中的步骤构建胶原诱导的小鼠关节炎模型。针对靶抗原mTNF28，mTNF31，mTNF37，利用改造后的表位移植蛋白mTNF28在小鼠关节炎动物模型上相对于Alum对照组，在发病分数上从60-120天期间低3-4分，mTNF31和mTNF37组只相差1-2分，mTNF28显示出由于mTNF31和mTNF37的治疗效果(图2B)。利用定点突变后的融合蛋白DTT-mTNFt在小鼠关节炎动物模型上相对于Alum对照组如图2D，在发病分数上从20-32天期间低5-6分。DTT-mTNFt相对于Alum对照组在发病分数上有明显抑制发病的效果。

实施例2 TNF80-96表位疫苗的优化

步骤1抗原结构设计

从实施例1中可以看出带有TNFS0-96表位的mTNF28效果较好，因此本实施例中对该表位进行改进。采用与实施例1相同的方法，不同点在于采用下表所示的蛋白表位和替换的位置构建mTNF21、mTNF26、mTNF28、mTNF30、mTNF32、mTNF28-1、mTNF29系列重组蛋白。

表4表位和替换的位置

hTNF上90-96氨基酸序列为：

hTNF上90-97氨基酸序列为：

hTNF28-1抗原蛋白的氨基酸序列

hTNF28-1抗原蛋白的基因序列请见SEQ ID NO.：36。

mTNF28-1抗原蛋白的氨基酸序列

mTNF28-1抗原蛋白的基因序列请见SEQ ID NO.：38。

mTNF32抗原蛋白氨基酸序列：

步骤2重组蛋白的表达纯化及免疫原性观察

具体重组蛋白抗原的构建和表达纯化方法参见方法2，3。制备的重组蛋白纯度都在95％以上系列重组蛋白，4℃放置2天和10天后，SDS-PAGE电泳结果表明mTNF28-1的结构稳定性要远优于其他蛋白。对比mTNF28-1和DTT圆二色谱，结果表明两个蛋白整个结构式一致，蛋白核心骨架没有变化。针对80-96表位进行优化所得的一系列蛋白，通过DSC做的Tm值，mTNF28-1(Tm＝66.58)与DTT(Tm＝69.85)的Tm值比较接近，远高于mTNF28(Tm＝61.01)的Tm值。虽然mTNF28-1与mTNF28蛋白仅差一个氨基酸，但是mTNF28-1在结构稳定性上确表现出了更高的稳定性。

抗原免疫后产生的血清的滴度如方法4操作，包被抗原分别为mTNF和DTT。第三次加强免疫后，产生能应答小鼠百分比mTNF28-1为80％，对mTNF蛋白的抗血清稀释100倍滴度后的OD₄₅₀平均值0.28，mTNF32分别为50％和0.22，mTNF21和mTNF28分别为25％和0.17，以及25％和0.15；mTNF28-1抗原性最高。免疫结果表明，mTNF28-1相比于其他的移植表现出了更好的免疫效果。

步骤3胶原诱导小鼠关节炎模型的观察

第4次加强免疫之后60天取小鼠的血来做抗体分型，结果如图3A所示，结果表明加强免疫之后60天，小鼠体内针对mTNF的抗体类型主要为IgG1，并且滴度还有10000。说明本发明的重组蛋白引起的免疫反应能够在体内维持较长时间。按照方法4的方法测定了mTNF28-1对胶原诱导小鼠关节炎模型的治疗效果，如图3B发现从第55-80天期间，mTNF28-1治疗组相对于Alum佐剂组和DTT载体蛋白组对小鼠关节炎发病抑制率达40％以上。

实施例3靶向凝血因子FXI的抗血栓疫苗

FXI为参与内源凝血途径的凝血因子，近年来的文献及病理统计数据支持，FXI缺失能帮助机体抗血栓，但是仅造成机体轻微出血，因此FXI被认为是安全有效的抗血栓靶点。本实施例构建针对凝血因子FXI的抗血栓疫苗，检验其免疫原性及抗血栓效果。

步骤1：重组抗原的设计

本实施例用的抗原为将人FXI的候选表位序列移植替换到DTT的待移植位置构建而成。17号抗原为将人FXI(523-538aa)氨基酸序列的TNEECQKRYRGHKITH(SEQ ID NO.：40)移植替换到DTT的291-297位置构成，20号抗原为将人FXI(363-380aa)的TTKIKPRIVGGTASVRGE(SEQ ID NO.：41)氨基酸序列移植替换到DTT的291-297位置构成。29号抗原为将人FXI(381-625aa)的催化结构域移植到DTT的C末端构成。

具体抗原的氨基酸序列如下：

17号抗原氨基酸序列：

20号抗原氨基酸序列：

29号抗原氨基酸序列：

人FXI(381-625aa)的催化结构域氨基酸序列：

17号抗原蛋白的基因序列请见SEQ ID NO.：46。

20号抗原蛋白的基因序列请见SEQ ID NO.：47。

29号抗原蛋白的基因序列请见SEQ ID NO.：48。

步骤2：重组抗原载体构建，蛋白表达鉴定及规模化制备

按方法2构建重组抗原的基因，通过方法3对重组蛋白进行表达鉴定及制备。通过12％SDS-PAGE检测，重组抗原29的分子量约为45KD，17号抗原和29号抗原的分子量约为20KD，与理论分子量相符，抗原纯度均为90％以上。

步骤3：动物免疫和抗体滴度检测

小鼠免疫方法及抗体反应检测按照方法4进行，其中所用小鼠为雌性C57BL/6J(购自上海斯莱克)，免疫剂量为30ng/只小鼠，每组8只小鼠。第二次加强免疫后一周采血制备血清，通过ELISA检测针对FXI的抗体反应。

以人FXI作为ELISA包被抗原，被17号，20号，29号抗原免疫的小鼠的抗血清按1比100稀释，ELISA结果OD₄₅₀值分别为0.52±0.11，0.43±0.08，2.52±0.3(阴性血清的值为0.14±0.03)，表明17号，20号，29号抗原能激发小鼠产生能识别人FXI的抗体。

以小鼠FXI作为ELISA包被抗原，被29号抗原免疫的小鼠的抗血清按1比100稀释，ELISA结果OD₄₅₀值为1.87±0.5(阴性血清的值为0.14±0.03)，表明29号抗原激发小鼠产生的抗体能通过交叉反应识别小鼠的FXI。

步骤4：免疫对小鼠凝血时间的作用

小鼠免疫方法参照及抗体反应检测参考方法4，其中所用小鼠为雌性C57BL/6J(购自上海斯莱克)，免疫剂量为30ng/只小鼠，每组5只小鼠。第二次加强免疫后14天，小鼠用戊巴比妥钠麻醉(100mg/kg经腹腔注射)。沿腹中线切口，翻开内脏暴露下腔静脉。用含50ul3.2％枸橼酸钠的注射器抽取450ul血液，轻轻转动注射器使血液和抗凝剂混匀。所有样品室温3000g离心15min制备不含血小板的血浆。APTT值和PT值在4h内分别用活化部分凝血活酶时间测定试剂盒(鞣花酸)(凝固法)，凝血酶原时间测定试剂盒(凝固法)(上海太阳生物技术有限公司)在thromboscreen 400c(pacific hemostasis)半自动凝血分析仪上测定。

被PBS，DTT，17号抗原，29号抗原免疫的小鼠的APTT值分别为25.2±1.8s，24.5±2.1s，26.7±1.8s，30.3±2.5s。被PBS免疫的小鼠APTT值与野生型小鼠的值相近(野生型小鼠的APTT值为25.1s)，表明PBS不会干扰机体内源凝血途径功能。被29号抗原免疫的小鼠的APTT值相对于PBS组小鼠的值延长了1.2倍(p＜0.05，t检验)，表明该抗原能抑制FXI所参与的内源凝血途径的功能。

被PBS，DTT，17号抗原，29号抗原免疫的小鼠的PT值分别为10.4±0.2s，10.6±0.1s，10.2±0.2s，11.2±0.1s。被17号抗原免疫的小鼠的PT值没有显著延长，而被29号抗原免疫的小鼠的PT仅轻微延长(无临床意义)，表明所设计的重组抗原不会干扰正常的外源凝血途径的功能。

步骤5：抗原对肺栓塞血栓的预防

小鼠免疫方法参照及抗体反应检测参考方法4，其中所用小鼠为雌性C57BL/6J(购自上海斯莱克)，免疫剂量为30ng/只小鼠，每组8只小鼠。第二次加强免疫后14天，通过致死肺栓塞模型评价各组小鼠抗血栓效果。具体步骤如下：thromborel s(siemens)按说明书要求用10ml蒸馏水复溶。小鼠用戊巴比妥钠按50mg/kg腹腔注射麻醉后，分离暴露下腔静脉。按7.5ul/g的体重将复溶后的thromborel s在3s内注入下腔静脉，立刻计时，观察动物呼吸有无，20分钟时动物呼吸不停止即认为动物存活。

如图4A所示，被PBS，DTT，17号，20号，29号抗原免疫的小鼠在第20分钟的存活率分别为20％，0％，37.5％，25％，50％，表明17号和29号抗原能帮助小鼠抗肺栓塞。

小鼠免疫方法参照及抗体反应检测参考方法4，其中所用小鼠为雌性C57BL/6J(购自上海斯莱克)，免疫剂量为30ng/只小鼠，每组14只小鼠。第二次加强免疫后14天，通过肺栓塞模型评价29号抗原的抗血栓效果。小鼠用戊巴比妥钠按50mg/kg腹腔注射麻醉后，分离暴露下腔静脉。按30ug人胎盘浸出液/g体重的剂量从下腔静脉注射，记录各组小鼠开始出现呼吸困难的时间。

如图4B所示，被PBS，DTT及29号抗原免疫的小鼠的发生呼吸困难的时间分别为121±21s，118±35s，182±33s，被29号抗原免疫的小鼠发生呼吸困难的时间延长1.5倍(p＜0.01，t检验)，表明29号抗原能帮助小鼠抗肺栓塞。

步骤6：抗原对下腔静脉狭窄血栓的预防

小鼠免疫方法参照及抗体反应检测参考方法4，其中所用小鼠为雌性C57BL/6J(购自上海斯莱克)，免疫剂量为30ng/只小鼠，每组6只小鼠。第二次加强免疫后14天，通过下腔静脉狭窄血栓模型评价29号抗原的抗血栓效果。具体步骤如下：小鼠称重，按100mg/kg体重用戊巴比妥钠麻醉，腹部剃毛，涂碘伏消毒。用眼科剪小心开腹，翻出内脏用浸有生理盐水的纱布包好，暴露出下腔静脉，在左肾静脉支流下方分离下腔静脉和腹主动脉，用6-0丝线(上海金环)将下腔静脉结扎到30g针头上。除去针头，造成静脉狭窄。在腰支流部位分离下腔静脉和腹主动脉，在结扎线下方及腰直流部位分别用两个血管夹夹闭血管各20s。并记录下操作时刻。将肠子有序放回腹腔，用5-0尼龙线(上海金环)依次缝合肌肉和皮肤，涂碘伏消毒后放回洁净笼子。24h后取出栓子，生理盐水漂洗后，用4％多聚甲醛固定24h以上，拍照。用滤纸吸干后称湿重。

如4C、4D所示，被PBS，DTT，29号抗原免疫的小鼠的栓子分别为11.2±2.1mg，8.2±4.5mg，4.5±2.3mg，被29号抗原免疫的小鼠体内的栓子相对于对照组小鼠栓子的重量减小60％，表明29号抗原能帮助小鼠预防下腔静脉狭窄血栓。

步骤7抗体对人血浆的APTT值及PT值的影响

被各抗原免疫的小鼠的血浆中的抗体用蛋白A-sepharose介质纯化后用BCA定量试剂盒定量，用10mM PBS(pH7.4)稀释后，跟人血浆1比1体积比混合后，测APTT值，PT值，及FXI的活性。

29号抗原激发小鼠产生的抗体能显著延长正常人血浆的APTT值，且该抑制效果存在明显的量效关系(如图5A所示)，0.75mg/ml终浓度的抗体能使正常人血浆的APTT值延长到151s，对照组值为54s。29号抗原激发小鼠产生的抗体能显著抑制人FXI的活性，且该抑制效果存在明显的量效关系(如图5B所示)，抗体(0.75mg/ml终浓度)与正常人血浆混合后，抗体血浆混合物加入到乏FXI人血浆中，后者APTT值延长到121s，对照组值为63s。

正常人血浆分别与被29号抗原和DTT激发小鼠产生的抗体孵育后测PT值分别为41s，42s，表面29号抗原激发小鼠产生的抗体不会干扰人的正常止血所必须的外源凝血途径的功能。

步骤8抗原安全性检测

通过PT测试，29号抗原不影响小鼠的外源凝血通路的功能，表明这个抗原没有出血毒副作用。为了进一步说明抗原的安全性，本发明检查了小鼠体表及内脏有无出血。通过解剖比较，发现DTT，29号抗原免疫组小鼠各内脏(心肝脾肺肾肠胃等)上均无异常出血点。此外还检查了小鼠肝脏的形态色泽。肉眼观察结果显示，29号抗原免疫组小鼠肝脏的形态和色泽与DTT免疫组的小鼠无差异。

实施例4靶向凝血因子FXII的抗血栓疫苗

FXII为参与内源凝血途径的凝血因子，近年来的文献及病理统计数据支持，FXII缺失能帮助机体抗血栓，但是机体无异常出血，因此FXII被认为是安全有效的抗血栓靶点。本实施例构建针对凝血因子FXII的抗血栓疫苗，检验其免疫原性及抗血栓效果。

步骤1：重组抗原的设计

本实施例用的抗原为将人FXII的候选表位序列移植替换到DTT的待移植位置构建而成。38号抗原为将人FXII的EAFSPVSYQHDLA(79-91)(SEQ ID NO.：128)氨基酸序列移植替换到DTT的295-297位置构成，48号抗原为将人FXII的催化结构域(345-596)移植到DTT的C末端构成。

mFXII79-91位氨基酸

EGFSSITYQHDLA(SEQ ID NO.：131)

hFXII的催化结构域(345-596)

mFXII的催化结构域(345-596)

38号抗原氨基酸序列：

48号抗原氨基酸序列：

编码38号抗原的核酸序列请见SEQ ID NO.：115。

编码48号抗原的核酸序列请见SEQ ID NO.：116。

步骤2：重组抗原载体构建，蛋白表达鉴定及规模化制备

按方法2构建重组抗原的基因，通过方法3对重组蛋白进行表达鉴定及制备。通过12％SDS-PAGE检测，重组抗原48的分子量约为45KD，38号抗原的分子量约为20KD，与理论分子量相符，抗原纯度均为90％以上。

步骤3：动物免疫和抗体滴度检测

小鼠免疫方法及抗体反应检测参考方法4，其中所用小鼠为雌性C57BL/6J(购自上海斯莱克)，免疫剂量为30ng/只小鼠，每组8只小鼠。第二次加强免疫后一周采血制备血清，通过ELISA检测针对FXII的抗体反应。

以人FXII作为ELISA包被抗原，被38号，48号抗原免疫的小鼠的抗血清按1比100稀释，OD₄₅₀值分别为0.38±0.07，1.32±0.51(阴性血清的值为0.11±0.03)，表明38号，48号抗原能激发小鼠产生能识别人FXII的抗体。

以小鼠FXII作为ELISA包被抗原，被38号，48号抗原免疫的小鼠的抗血清按1比100稀释，OD₄₅₀值分别为0.11±0.04，1.75±0.21(阴性血清的值为0.12±0.03)，表明48号抗原激发小鼠产生的抗体能通过交叉反应识别小鼠的FXII。

步骤4：免疫对小鼠凝血时间的作用

小鼠免疫方法参照及抗体反应检测参考方法4，无血小板的血浆制备和APTT值和PT值测定按照实施例3步骤4。

被PBS，DTT，38号抗原，48号抗原免疫的小鼠的APTT值分别为25.2±1.8s，24.5±2.1s，31.2±3.2s，27.1±5.1s。被PBS或DTT免疫的小鼠APTT值与野生型小鼠的值相近(野生型小鼠的APTT值为25.1s)，表明PBS或DTT不会干扰机体内源凝血途径功能。被38号抗原免疫的小鼠的APTT值相对于PBS组小鼠的值延长了1.24倍(p＜0.05，t检验)，表明该抗原能抑制FXII所参与的内源凝血途径的功能。

被PBS，DTT，38号抗原，48号抗原免疫的小鼠的PT值分别为10.4±0.2s，10.6±0.1s，10.1±0.5s，10.2±0.4s。被PBS或DTT免疫的小鼠PT值与野生型小鼠的值相近(野生型小鼠的PT值为10.6s)，表明PBS或DTT不会干扰机体外源凝血途径的功能。被38号或48号抗原免疫的小鼠的PT值没有显著延长，表明所设计的重组抗原不会干扰小鼠外源凝血途径的功能。2.5mg华法林溶于800ml饮用水中让小鼠自由饮用三天，小鼠的PT值为60.1±38.7s，相对于野生型小鼠的PT值延长了5.7倍，该结果表明相对于临床上常用的抗凝药物华法林，本专利抗原免疫不会造成机体异常出血。

步骤5：抗原对肺栓塞血栓的预防

小鼠免疫方法参照及抗体反应检测参考方法4，肺栓塞血栓实验操作按照实施例3步骤5。

被PBS，DTT，38号抗原免疫的小鼠在第20分钟的存活率分别为20％，0％，37.5％，，表明38号抗原能帮助小鼠抗肺栓塞。

步骤6：抗原对下腔静脉狭窄血栓的预防

小鼠免疫方法参照及抗体反应检测参考方法4，下腔静脉狭窄血栓实验按照实施例3步骤6。

实验结果如图6所示，被PBS，DTT，38，48号抗原免疫的小鼠的栓子分别为11.2±2.1mg，8.2±4.5mg，4.7±2.7mg，4.8±2.5mg，被38号，48号抗原免疫的小鼠体内的栓子相对于PBS对照组小鼠栓子的重量分别减小58％，57％，表明38号，48号抗原能帮助小鼠预防下腔静脉狭窄血栓。

实施例5以FAP为靶点的肿瘤疫苗开发

成纤维细胞活化蛋白(fibroblast activation protein，FAP)是特异性表达于肿瘤相关成纤维细胞(carnicinoma associated fibroblasts，CAFs)的一种膜蛋白，其胞浆区为一段6个氨基酸的短肽链，跨膜区为一段19个氨基酸的疏水片段，胞外区包含一个β螺旋区域和一个αβ水解酶区域(氨基酸序列500～760)。FAP特异性表达于恶性上皮肿瘤(包括乳腺癌、肺癌、结肠癌等)的基质中，而在正常人体组织中无表达。FAP在肿瘤相关成纤维细胞上的表达对于形成肿瘤生长的微环境较为重要。研究表明过表达FAP会促进肿瘤微血管的生成并促进肿瘤生长，而敲除FAP可以抑制肿瘤免疫逃逸，实现机体对肿瘤的免疫应答。此外，FAP与肿瘤抗原相比，基因组更为稳定。因此，许多研究者选取FAP作为肿瘤治疗靶点。FAP酶活性抑制剂在动物实验中表现出良好的抗肿瘤效果，目前已进入临床实验。靶向FAP的DNA疫苗在动物实验中激发了CTL效应，表现出良好的抗肿瘤效果。因此，本专利选取FAP作为靶点，开发肿瘤疫苗并研究其免疫原性及抗肿瘤效果。

步骤1重组抗原的设计

参照方法1，将人FAP的催化结构域(氨基酸序列500～760)与DTT的C端融合，设计了结构域疫苗DTT-FAP。另外，参照方法1将FAP表位序列239-246(YGDEQYPR(SEQ ID NO.：49))替换DTT的氨基酸序列291-297(SETADNLE)，设计了单表位疫苗DTT-4B。抗原氨基酸序列如下：

>DTT-FAP氨基酸序列

注：DDDK为肠激酶切位点，为促进融合蛋白原核可溶表达；GGGGG 5个甘氨酸残基，作为linker。

FAP的催化结构域(氨基酸序列500～760)

>DTT-4B氨基酸序列

注：其中YGDEQYPR为FAP表位。

步骤2重组抗原载体构建，蛋白表达鉴定及规模化制备

参照方法2，以含DTT基因的pGEX-6p-1质粒作为模板，采用引物1和引物2进行PCR获得DTT基因。以合成的FAP催化结构域基因序列为模板，采用引物3和引物4进行PCR获得FAP结构域基因。以上述操作获得的DTT基因和FAP结构域基因为模板，采用引物1和引物4进行重叠PCR，构建DTT-FAP融合蛋白基因序列。类似的，采用含DTT基因的pGEX-6p-1质粒作为模板，分别用引物5和引物6、引物7和引物8扩增获得DTT的上半段基因和下半段基因，采用引物5和引物7进行重叠PCR获得DTT-4B的基因。经电泳鉴定，DTT-FAP和DTT-4B基因的大小分别为1300bp和520bp，与理论值一致，测序表明融合基因序列正确。重组蛋白序列及引物序列如下：

>DTT-FAP核酸序列请见SEQ ID NO.：52。

>DTT-FAP引物序列：

>DTT-4B核酸序列请见SEQ ID NO.：57。

>DTT-4B引物序列

将重组基因装载在pGEX-6P-1载体中，并通过BL21(DE3)进行原核表达。参照方法3，进行重组蛋白表达，经GST-sepharose亲和纯化，电泳分析表明DTT-FAP和DTT-4B抗原的大小分别为51kD和20kD，与理论分子量一致，且纯度均在90％以上。

步骤3动物免疫和抗体滴度检测

参照方法4，免疫小鼠，其中所用小鼠为雌性Balb/C(购自常州卡文斯)，DTT-FAP组、DTT-4B组合对照组分别10、8、8只小鼠，采用弗氏佐剂，免疫剂量为30ng抗原/剂。第三次加强免疫后一周采血制备血清。

参照方法4，进行ELISA检测。以人FAP(购自美国R&D System)作为包被抗原，将小鼠抗血清样品稀释100倍作为一抗，ELISA测定DTT-FAP和DTT-4B组的A₄₅₀值分别为0.55±0.3和0.48±0.5，而阴性血清的值为0.16±0.06(p＜0.01)，表明DTT-FAP和DTT-4B均能激发小鼠针对人FAP的抗体。将血清用样品用稀释液分别稀释100倍、500倍、1000倍、5000倍、10000倍、50000倍、1000000倍。ELISA检测，并做A₄₅₀对稀释倍数的曲线图。采用A₄₅₀＞0.2且P/N≥2.1时(即实验组与对照组的吸光值之比≥2.1时)的最大稀释倍数作为抗血清的滴度。经测定，DTT-FAP和DTT-4B组的滴度分别为5000和1000。

步骤4抗肿瘤效果研究

参照方法9，第三次加强免疫后一周给小鼠接种鼠结肠癌CT26肿瘤。DTT-FAP组小鼠的成瘤速度较对照组慢，接瘤12天后，DTT-FAP组成瘤率仅90％，而对照组成瘤率为100％。肿瘤接种7天后，隔天用游标卡尺测定肿瘤长度和宽度，计算肿瘤体积并绘制制定生存曲线(图7B)，接瘤18天后，DTT-FAP组肿瘤体积仅为对照的53.8％(p＜0.01)。肿瘤接种27天后，处死小鼠，取出肿瘤并观察拍照。DTT-FAP组小鼠的肿瘤与DTT组相比，明显偏小(图7C)。接瘤后27天，DTT-FAP组小鼠的存活率为80％，而其他两组的小鼠存活率均在30％以下(p＜0.01)(图7A)。以上结果表明，DTT-FAP疫苗具有显著的抗肿瘤作用(。

实施例6以VEGF为靶点的抗肿瘤疫苗

以VEGF为靶点的抗肿瘤药物已经在临床上延长了众多癌症患者的生命。本专利发明人开发了靶向VEGF的DTT-VEGF疫苗抗原，在小鼠肿瘤模型上证实具有显著的抗肿瘤效应。

步骤1 DTT-VEGF抗原蛋白结构设计

按照方法1操作，发明人选择VEGF(8-109)插入DTT(202-378)的C末端组成DTT-VEGF抗原蛋白，命名为DTT-VEGF。

DTT-VEGF抗原蛋白氨基酸序列

VEGF(8-109)氨基酸序列：

步骤2抗原蛋白的制备

按照方法2具体地以引物对VEGF-F和VEGF-R作为靶蛋白基因引物构建表达质粒pGEX-DTT-VEGF，测序数据证明正确。表达质粒pGEX-DTT-VEGF转入E.coli BL21后培养，诱导，SDS-PAGE分析蛋白分子量为30KD左右，证明能够表达DTT-VEGF蛋白。放大培养至1L，按照方法3制备DTT-VEGGF蛋白，12％SDS-PAGE电泳分析纯度达到90％。

VEGF-F：	CAAGTAGTTCATAATTCGTATAATCGTCCCGGTCAGAACCACCACGAGGTTGT(SEQ ID NO.：64)
		VEGF-R：	CCG<u>CTCGAG</u>CTAATCTTTCTTCGGACGGCATTCGCACTTGTTGT(SEQ ID NO.：65)

DTT-VEGF抗原基因序列请见SEQ ID NO.：66。

步骤3小鼠免疫

免疫按照方法4进行，包被抗原为0.1μg/L的重组hVEGF蛋白(购自北京义翘神州生物技术有限公司)。ELISA结果显示，经DTT-VEGF免疫后小鼠抗血清稀释100倍后，针对hVEGF165的OD450达到了1.3，而单独VEGF免疫后抗血清OD450只有0.1左右，对照DTT以及Alum佐剂组抗血清OD450均不到0.05。该结果证明本专利中抗原设计相比单独使用VEGF免疫显著提高了针对VEGF的抗原性。此外，DTT-VEGF免疫后抗血清针对小鼠VEGF(mVEGF164)的OD450达到了0.4，证明DTT-VEGF免疫后与小鼠VEGF存在交叉反应。

步骤4体液免疫和细胞免疫反应检测

(1)体液免疫反应检测

为了验证设计的抗原是否能突破免疫耐受，发明人将DTT-VEGF以氢氧化铝为佐剂，免疫小鼠后发现可以激发高强度的针对hVEGF165的抗体，抗体对小鼠的VEGF也有交叉反应。抗体能有效中和VEGF与受体VEGF2的结合。如果未将VEGF与DTT融合则不能激发抗体的产生。表明DTT上Th表位对机体突破VEGF的B细胞免疫耐受起到了关键作用。

(2)毒性T淋巴细胞检测

第三次免疫后一周，处死小鼠，取脾脏细胞。以106细胞的浓度加到6孔板中，并加入终浓度25μg/ml相应的抗原，刺激培养3天，作为效应细胞。B16-F10肿瘤细胞作为靶细胞。按一共比例加入96孔板中，37℃度培养箱共培养4h，取50μl上清，用CytoTox96nonradioactive cytotoxicity assay(Promega)试剂盒按标准程序测定LDH的浓度，并按照说明书提供的公式计算裂解率。

CTL检测表明，随着效应细胞：靶细胞的比例逐步升高，靶细胞裂解率逐步升高，效靶比为5∶1的时候，DTT-VEGF免疫组裂解率仅为5％左右，当效靶比为40∶1的时候，DTT-VEGF免疫组的裂解率达到了40％，对照DTT载体蛋白组仅为15％。两者具有显著差异。证明DTT-VEGF能诱发抗原特异性CTL。

步骤5疫苗抑瘤疗效检测

1)B16-F10模型预防性疗效

小鼠随机分为4组，每组8只，Group A：D23V，Group B：VEGF(8-109)，Group C：DTT，Group D：佐剂。以0.03mg/鼠的剂量，进行背部皮下免疫，每2周加强免疫一次，共3次，每次免疫后一周通过尾部静脉取血，-70℃保存备用。第二次免疫1周后，通过皮下和尾静脉注射B16-F10细胞悬浮液(10⁵cells/只)，观察肿瘤出现情况，记录存活率及其他异常情况。

2)B16-F10模型治疗性疗效

小鼠黑色素瘤B16-F10细胞培养用含10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100μ/ml链霉素的DMEM培养液中，置于5％CO₂培养箱，37℃培养。指数增殖期细胞经0.25％胰酶消化，收集于无血清的培养液中，轻轻摇动，500g，离心5min，洗涤一次，PBS重悬，调整浓度为10⁶，经台盼蓝染色，检测细胞活力在95％以上。75％酒精消毒小鼠腋窝皮肤，取已经调整好密度的B16-F10小鼠黑色素瘤细胞接种子皮下，每只动物100μl，及每只小鼠接种10⁵个细胞(预实验已经确认10⁵cells/只可以100％至瘤，即假设已经得了肿瘤)，肿瘤接种后第二天，以0.03mg/鼠的剂量开始注射疫苗进行治疗，每周一次，连续3周。接种肿瘤后，每天观察肿瘤出现情况，记录存活率及其他异常情况。

3)CT26.WT治疗性疗效

40只6-8周龄Balb/C小鼠随机分为2组，每组20只，第一组用DTT-VEGF，以0.03mg/鼠的剂量，进行背部皮下免疫，每2周加强免疫一次，共3次，另外20只用PBS按相同的程序免疫作为对照。每次免疫后一周通过尾部静脉取血，-70℃保存备用。第二次免疫1周后，通过皮下注射CT26.WT细胞悬浮液(3×105cells/只)，观察肿瘤出现情况，记录存活率及其他异常情况。

B16-F10模型预防性疗效结果显示，小鼠平均生存时间由对照组的25天延长到了DTT-VEGF组的35天(图8B、C)生存期大大提高。B16-F10模型治疗实验中发现DTT-VEGF组小鼠生存期明显延长，平均生存时间由对照组的25天延长到了32天(图8E、F)。在CT26肿瘤治疗模型中，DTT-VEGF作为疫苗能显著抑制肿瘤细胞的生长(图9G)j；小鼠平均生存时间同样由对照组的25天延长到了DTT-VEGF组的35天，证明DTT-VEGF免疫后能显著延长荷瘤小鼠的生存期。

步骤6肿瘤组织病理切片

取肿瘤组织边缘无明显坏死的肿瘤组织，做常规石蜡病理切片，HE染色，CD8及CD31免疫组化。结果提示，在接种肿瘤14天后，DTT-VEGF免疫组肿瘤平均重量不到0.5g，而对照PBS组达到了1g；在接种肿瘤19天后，DTT-VEGF免疫组肿瘤平均重量达到0.5g，而对照PBS组超过了2.5g(图9A)。这证明DTT-VEGF免疫后显著抑制了肿瘤的生长。进一步观测表明，DTT-VEGF组肿瘤周围无明显的红色血管包围，而对照组肿瘤周围存在大量的的血管包围(图9B)，这证明DTT-VEGF免疫后显著抑制了肿瘤血管的生成。进一步HE切片显示，经DTT-VEGF免疫后瘤体内部细胞核与细胞膜界限不明显，核膜与细胞膜不完整，大片细胞出现坏死(图9C)。而对照组肿瘤内部细胞核质界限明显，细胞形状规则，绝大部分均为活细胞(图9C)。进一步分析了肿瘤内部的血管密度。用anti-CD31抗体做免疫组化结果显示，DTT-VEGF组肿瘤内部血管密度仅为3％，而对照组达到了8％(图9E、F)。

进一步分析了肿瘤内部淋巴细胞浸润的情况。Anti-CD8抗体染色结果显示，DTT-VEGF组肿瘤内部存在大片的CD8⁺细胞浸润区域，而对照组肿瘤中只能发现散布的CD8+淋巴细胞(图9D)。以上结果提示，DTT-VEGF免疫后抑制了肿瘤血管生成，促进了淋巴细胞浸润和坏死。

实施例7靶向PDL1重组肿瘤疫苗

PDL1和PD1通路激活后，可以抑制T淋巴细胞活化，降低免疫相关细胞因子的分泌。PDL1/PD1等免疫负调节信号通路可以降低免疫系统对肿瘤标志物的识别，从而让肿瘤产生免疫逃避。针对PDL1作为靶点单克隆抗体已经进入临床，本专利设计针对PDL1的重组疫苗也具有良好的肿瘤抑制效果。

步骤1：抗原结构设计

按照方法1，选择PDL1的胞外结构域PDL1E、以及PDL1和PD1非结合位点所在胞外结构域PDL1E1，分别将PDL1E和PDL1E1插入DTT的C末端，得到DTT-PDL1E重组蛋白和DTT-PDL1E1重组蛋白。

mPDL1氨基酸序列：

mPDL1E氨基酸序列：

mPDL1E1氨基酸序列

DTT-PDL1E重组蛋白全序列

DTT-PDL1E1重组蛋白全序列

hPDL1氨基酸序列：

hPDL1E氨基酸序列：

hPDL1E1氨基酸序列：

DTT-hPDL1E重组蛋白全序列：

DTT-hPDL1E1重组蛋白全序列

步骤2质粒构建与蛋白表达

感受态BL21、Top10购自TransGen Biotech，载体pGEX-6p-1、PMD18-T、ExTaq酶、T4连接酶、反转录试剂盒购自TaKaRa。PDL1基因在黑色素瘤、结肠癌、肺癌细胞内高表达，复苏CT26、B16-F10，传代培养，收集细胞，冻融破碎，mRNA提取，反转录cDNA。以cDNA为模板，引物P1 P2进行PCR，测序验证得到了正确的mus-PDL1全长基因。按照方法2，以DTT基因和PDL1全长基因为模板，引物P3P4P5P6进行巢氏PCR，得到质粒mus-PDL1-DTT-E1-pGEX-6p-1；以DTT基因和PDL1全长基因为模板，引物P7 P8 P9 P10进行巢氏PCR，得到质粒mus-PDL1-DTT-E-pGEX-6p-1；以PDL1全长基因为模板，引物P11 P12进行PCR，得到质粒mus-PDL1-E-pGEX-6p-1。以上质粒通过测序验证成功构建PDL1重组表达相关载体。按照方法3，进行DTT(20KD)、DTT-PDL1E(42KD)、DTT-PDL1E1(30KD)、PDL1E(23KD)等重组蛋白纯化，并用SDS-page进行检测，结果得到目标蛋白大小的单一条带，分析纯度达到90％以上，可作疫苗进行动物免疫。

引物列表

步骤3动物免疫保护

购买自北京维通利华实验动物技术有限公司18只雌性9周龄Balb/c小鼠。实验前，选择体重21±1的小鼠为实验对象，随机分为3组，DTT组、DTT-PDL1E组、DTT-PDL1E1组，每组6只。按照方法4，进行动物免疫，免疫前采集血清，之后在每次免疫前一天采集血清。三免后，按照方法9，进行肿瘤细胞培养和肿瘤接种。接种肿瘤七天后开始隔天观测肿瘤体积变化，并记录。小鼠肿瘤体积变化(Tumor volume＝width²*length*π/2)趋势(见图10A)，结果显示DTT-PDL1E组，DTT-PDL1E1组较对照组具有保护效果(P＜0.05n＝6)。肿瘤接种22天后安乐死，剖检肿瘤，各组瘤重(见图10B)。统计学分析，DTT与DTT-PDL1E差异显著(P＜0.05)，DTT与DTT-PDL1E1差异极显著(P＜0.001)，两免疫保护组无统计学差异(P＞0.05)。肿瘤重量与体重比率，DTT对照组DTT-PDL1E组差异显著(P＜0.05)，DTT对照组DTT-PDL1E1组差异显著(P＜0.05)，两免疫保护组无统计学差异(P＞0.05)(图10C、D)。按照方法9得出，DTT-PDL1E肿瘤抑制率24.6％，DTT-PDL1E1肿瘤抑制率30％。结果表明靶向DTT-PDL1疫苗具有显著的抗肿瘤效。

实施例8以EGFR为靶点的抗肿瘤疫苗

步骤1抗原设计

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是一种广泛分布于人体各组织细胞膜上的多功能糖蛋白。其抑制剂(如gefitinib和erlotinib)和单抗药物(如cetuximab和panitumumab)已经上市用于治疗晚期结肠癌。EGFR胞外结构域由I、II、III、IV四个亚区构成。III亚区通过主要的保守氨基酸残基与配体相互作用。II亚区是介导二聚体形成的主要位点。本发明人将EGFR III亚区融合到DTT的C末端，并将第1I亚区中参与二聚体形成的主要表位(hEGFR 237-267DTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCV(SEQ IDNO.：83)，PPLMLYNPTTYQMDVNPE(SEQ ID NO.：109))，通过C端-N端距离相近原则将表位多肽移植到DTT的合适位置上，设计成多表位疫苗。设计步骤见方法1。

本实施例共设计了4个抗原蛋白，分别是DTT-mEGFRIII、DTT-hEGFRIII、DTT-mEGFRIII-pep、DTT-pep-mEGFRIII。其融合后氨基酸序列如下：

DTT-mEGFRIII抗原蛋白的氨基酸序列：

mEGFR III亚区氨基酸序列：

DTT-hEGFRIII抗原蛋白的氨基酸序列：

hEGFR III亚区氨基酸序列：

DTT-mEGFRIII-pep抗原蛋白的氨基酸序列：

DTT-hEGFRIII-pep抗原蛋白的氨基酸序列：

DTT-pep-mEGFRIII抗原蛋白的氨基酸序列(把DTT中的DSETADN替换为PPLMLYNPTTYQMDVNPE)：

DTT-pep-hEGFRIII抗原蛋白的氨基酸序列(把DTT中的DSETADN替换为PPLMLYNPTTYQMDVNPE)：

步骤2：载体构建，融合蛋白表达与纯化

根据GeneBank中DT的T结构域基因mRNA和mEGFR和hEGFR基因mRNA的开放阅读框的序列，设计引物通过重叠PCR的原理在DT的T结构域中相应的位置引入B表位。引物和模板由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。采用重叠PCR法制得PCR产物，每个蛋白分别采用1F和3R，2F和4R两对引物做第一轮PCR，1F和4R引物做第二轮PCR。PCR及载体构建步骤见方法2。

获得阳性克隆后提取质粒进行PCR鉴定，4个抗原蛋白(DTT-mEGFRIII、DTT-hEGFRIII、DTT-mEGFRIII-pep和DTT-pep-mEGFRIII)的PCR产物鉴定均在1200KD左右，符合预期。阳性克隆由金斯瑞测序公司测序，测序结果与预期设计相一致。重组蛋白表达及制备步骤见方法3。通过SDS-PAGE进行蛋白检测，结果显示，DTT-mEGFR，DTT-hEGFR，DTT-pep-mEGFR，DTT-mEGFR-pep分子量大小大约在40KD左右，符合预期。蛋白纯度均达到90％以上。

本专利设计的4个抗原蛋白对应的核酸及引物序列如下：

实施例7引物列表

DTT-mEGFRIII抗原蛋白的基因序列请见(SEQ ID NO.：104。

DTT-hEGFRIII抗原蛋白的基因序列请见SEQ ID NO.：105。

DTT-pep-mEGFRIII抗原蛋白的基因序列请见SEQ ID NO.：106。

DTT-mEGFRIII-pep抗原蛋白的基因序列请见SEQ ID NO.：107。

步骤3免疫原性的检测

每组取10只小鼠的血清进行检测，包被mEGFR标准品(购自北京义翘神州生物技术有限公司)，进行ELISA检测，具体步骤见方法4。ELISA检测显示，PBS组平均数值为0.31，DTT组平均数值为0.34，DTT-mEGFR平均数值为1.84，DTT-hEGFR平均数值为1.65，DTT-pep-mEGFR平均数值为1.91，DTT-mEGFR-pep平均数值为1.31。四组实验组针对mEGFR都产生了较好的抗体，说明本专利的方法成功突破了免疫耐受，产生了针对mEGFR的抗体(p＜0.05)。

包被Her1标准品，ELISA结果显示，PBS组平均数值为0.17，DTT组平均数值为0.20，DTT-mEGFR平均数值为0.60，DTT-hEGFR平均数值为1.25，DTT-pep-mEGFR平均数值为0.87，DTT-mEGFR-pep平均数值为0.29。四组实验组针对mEGFR都产生了较好的抗体，说明我们的方法成功突破了免疫耐受，产生了针对自身蛋白的抗体(p＜0.05)。mEGFR针对Her1也有抗体产生，同时Her1针对mEGFR也有较好的抗体，说明存在交叉反应。

步骤4 Western鉴定

我们用A431细胞裂解液为电泳样品做检测，同时选取B16F10细胞裂解液作为阴性对照。具体实验步骤见方法6。通过显色反应，实验组针对A431细胞裂解液有明显的抗体条带，且位置在105KD左右，符合EGFR分子量大小。这说明我们的抗体针对细胞表面的EGFR有特异性结合。

步骤5荷瘤小鼠免疫治疗

小鼠免疫步骤见方法4，肿瘤细胞培养、移植和表观效果评价具体步骤见方法9。选取Lewis小鼠肺癌细胞建立肿瘤模型，接种量为5×10⁵个/只。以接种天数为横坐标，肿瘤体积为纵坐标，做肿瘤生长曲线。结果显示，从第16天开始，本专利的4组实验组相对于PBS和DTT对照组都有显著性差异(p＜0.05)。DTT-mEGFR组相对于PBS组，肿瘤抑制率为16％。DTT-hEGFR组相对于PBS组，肿瘤抑制率为32％。DTT-mEGFR-pep组相对于PBS组，肿瘤抑制率为21％。DTT-pep-mEGFR组相对于PBS组，肿瘤抑制率为37％。结果说明我们的疫苗能打破自身免疫耐受，有较好的肿瘤抑制效果。

步骤6 T细胞增殖实验

用mEGFR标准品(购自北京义翘神州生物技术有限公司)作为抗原来刺激脾细胞，实验步骤见方法七。每组选取3只小鼠，PBS组平均读数为0.12，DTT组平均读数为0.12，DTT-pep-mEGFR组平均读数为0.20，实验组相对于两组对照组都有显著性差异(p＜0.05)。说明DTT-pep-mEGFR疫苗可以刺激T细胞增殖，打破了细胞免疫耐受。

步骤7 CTL杀伤实验

用mEGFR标准品(购自北京义翘神州生物技术有限公司)作为抗原来刺激脾细胞，用Lewis小鼠肺癌细胞作为靶细胞，实验具体步骤见方法8。每组选取3只小鼠，PBS组针对Lewis细胞的杀伤率平均为4％，DTT组杀伤率平均为8％，DTT-pep-mEGFR组杀伤率平均为29.8％，实验组相对于两组对照组都有显著性差异(p＜0.05)。说明DTT-pep-mEGFR疫苗针对靶细胞产生了CTL杀伤作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。