KR20230061490A

KR20230061490A - Il-2 돌연변이체 및 그 응용

Info

Publication number: KR20230061490A
Application number: KR1020237011285A
Authority: KR
Inventors: 잉잉 후; 쭤샤오 차오; 린홍 탕; 후 거; 야위안 푸; 진솅 런
Original assignee: 산둥심시어 바이오파마슈티칼 씨오., 엘티디.
Priority date: 2020-09-04
Filing date: 2021-09-03
Publication date: 2023-05-08
Also published as: ZA202304098B; CL2023000631A1; BR112023004040A2; PE20240123A1; TWI859467B; IL301027A; AU2021338393B2; US20240209051A1; MX2023002648A; CA3191260A1; US20240247041A1; JP7583155B2; TW202214677A; EP4209503A4; EP4209503A1; CN116323653A; US20230265148A1; JP2023540761A; AU2021338393A1; WO2022048640A1

Abstract

IL-2 돌연변이체 및 그 응용을 제공하고, 구체적으로 IL-2 돌연변이체 및 상응한 융합 단백질, 접합체, 핵산 단편, 벡터, 숙주 세포, 상기 돌연변이체 또는 융합 단백질의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 IL-2 돌연변이체 또는 융합 단백질, 약물 조성물, 제약 용도, 질환 치료 방법 및 조절성 T세포의 우선 자극 방법을 개시하며; 상기 IL-2 돌연변이체는 야생형 IL-2에 비해, Tm값이 향상되고, IL-2 단백질의 안정성을 개선하였으며; 또는 야생형에 비해, 상기 IL-2 돌연변이체 생산량이 향상되거나, 또는 IL-2Rβγ 복합물과의 결합 활성이 변화된다.

Description

IL-2 돌연변이체 및 그 응용

본 발명은 생물 의약 분야에 관한 것으로, 구체적으로 IL-2 돌연변이체 및 그 응용에 관한 것이다.

인터류킨-2(interleukin-2, IL-2)는 최초에 T세포 성장 인자(TCGF)로 감정되었고, 후속 연구에서 L-2가 그 수용체와 결합되고, T세포, NK세포 등 면역 세포의 증식 및 활성화를 활성화시킬 수 있는 것을 발견하였다.

IL-2 수용체는 IL-2Rα 서브유닛(CD25), IL-2Rβ 서브유닛(CD122) 및 IL-2Rγ 서브유닛(CD132)을 포함하고, 상이한 서브유닛 사이는 친화력이 서로 다른 수용체 복합물을 형성할 수 있으며, 높은 친화력의 수용체 IL-2Rαβγ, 중간 친화력의 수용체 IL-2Rβγ, 낮은 친화력의 수용체 IL-2Rα 또는 IL-2Rαβ를 포함한다. 상이한 세포가 발현하는 IL-2R 서브유닛 유형은 다르고, 예를 들어, 휴지 조건 하에서의 종래 T세포 CD4⁺T, CD8⁺T 표면에 일반적으로 IL-2수용체 β(IL-2Rβ, CD122), IL-2 수용체 γ(IL-2Rγ, CD132)를 발현하나, IL-2 수용체 α(IL-2Rα, CD25)를 거의 발현하지 않는 반면, 조절성 T세포(Treg)는 IL-2Rβ, IL-2Rγ를 발현하는 외에, 구성적으로 IL-2Rα를 고도로 발현한다.

현재 연구원들은 IL-2 또는 그 돌연변이체에 의해 면역 세포 또는 어느 서브 집단의 면역 세포를 활성화시킴으로써, 종양 또는 자가면역 질환을 치료하는 것을 시도하고 있다. 예를 들어, 높은 조제량의 IL-2는 악성 흑색종 또는 전이성 신장 세포암 치료에 사용하도록 승인되었고, IL-2 폴리에틸렌글리콜 약물 접합체 NKTR-358은 자가면역 질환의 임상 실험을 진행하도록 승인되었다.

IL-2의 안정성, 생산량의 향상 및/또는 이와 어느 수용체 복합물의 결합 능력 변화는 IL-2 유형 약물 개발에 중요한 의미를 가진다. 이를 감안하여, 특별히 본 발명을 제공한다.

본 발명은 IL-2 돌연변이체, 융합 단백질, 접합체, 핵산 단편, 벡터, 숙주 세포, 돌연변이체 또는 융합 단백질의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 돌연변이체 또는 융합 단백질, 약물 조성물, 제약 용도, 치료 방법 및 조절성 T세포의 우선 자극 방법을 개시 및 제공한다.

제1 양태에 있어서, 본 발명은 IL-2 돌연변이체를 제공하고, 야생형 IL-2에 비해, 상기 IL-2 돌연변이체는 Q13, L18, G27, Y31, A73, H79, P82, I89, N90, V91, V93, F117 또는 R120에서 발생하는 하나 또는 복수의 돌연변이를 포함한다.

일부 구체적인 실시형태에 있어서, 상기 돌연변이는 삽입, 결실 또는 치환이고, 바람직하게는 치환이다.

일부 구체적인 실시형태에 있어서, 상기 IL-2 돌연변이체는 Q13L, L18I, G27W, Y31V, A73L, H79Q, P82L, I89L, N90Y, V91A, V93I, F117W 또는 R120F의 하나 또는 복수의 돌연변이를 포함한다.

일부 구체적인 실시형태에 있어서, 상기 IL-2 돌연변이체는,

(a) Y31/A73/H79 돌연변이; 바람직하게는, Y31V/A73L/H79Q 돌연변이;

(b) Q13 돌연변이; 바람직하게는, Q13L 돌연변이;

(c) R120 돌연변이, 바람직하게는, R120F 돌연변이;

(d) L18/V91/F117 돌연변이; 바람직하게는, L18I/V91A/F117W 돌연변이;

(e) L18/I89/V93 돌연변이; 바람직하게는, L18I/I89L/V93I 돌연변이;

(f) G27/R120 돌연변이; 바람직하게는, G27W/R120F 돌연변이;

(g) P82/R120 돌연변이; 바람직하게는, P82L/R120F 돌연변이;

(h) N90/R120 돌연변이; 바람직하게는, N90Y/R120F 돌연변이 중 적어도 하나의 그룹의 돌연변이를 포함한다.

일부 구체적인 실시형태에 있어서, 상기 IL-2 돌연변이는 SEQ ID NO: 2~9 중 어느 하나로 표시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.

일부 구체적인 실시형태에 있어서, 상기 IL-2 돌연변이체의 Tm값은 야생형 IL-2보다 높다.

일부 구체적인 실시형태에 있어서, 상기 야생형 IL-2는 SEQ ID NO: 60 또는 SEQ ID NO: 1로 표시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.

일부 구체적인 실시형태에 있어서, 상기 IL-2 돌연변이체는 H16, D20, N88, V91 또는 Q126 돌연변이, 예를 들어 H16E 돌연변이, D20A, D20H 또는 D20Y 돌연변이, N88A, N88I, N88G, N88R 또는 N88D 돌연변이, V91R 또는 V91K 돌연변이, Q126L 또는 Q126F 돌연변이로부터 선택되는 하나 또는 복수의 돌연변이를 더 포함하고;

바람직하게는, 상기 IL-2 돌연변이체는,

(ⅰ), H16 돌연변이, 바람직하게는 H16E 돌연변이;

(ⅱ), D20 돌연변이, 바람직하게는 D20A 돌연변이;

(ⅲ), V91 돌연변이, 바람직하게는 V91R 돌연변이;

(ⅳ), H16/V91 돌연변이, 바람직하게는 H16E/V91R 돌연변이로부터 선택되는 적어도 하나의 그룹의 돌연변이를 더 포함한다.

일부 구체적인 실시형태에 있어서, 상기 IL-2 돌연변이체는,

(a), H16/Y31/A73/H79 돌연변이; 바람직하게는 H16E/Y31V/A73L/H79Q 돌연변이;

(b), H16/R120 돌연변이; 바람직하게는 H16E/R120F 돌연변이;

(c), H16/L18/V91/F117 돌연변이; 바람직하게는 H16E/L18I/V91A/F117W 돌연변이;

(d), H16/L18/I89/V93 돌연변이; 바람직하게는 H16E/L18I/I89L/V93I 돌연변이;

(e), H16/G27/R120 돌연변이; 바람직하게는 H16E/G27W/R120F 돌연변이;

(f), H16/P82/R120 돌연변이; 바람직하게는 H16E/P82L/R120F 돌연변이;

(g), D20/Y31/A73/H79 돌연변이; 바람직하게는 D20A/Y31V/A73L/H79Q 돌연변이;

(h), D20/R120 돌연변이; 바람직하게는 D20A/R120F 돌연변이;

(i), V91/Y31/A73/H79 돌연변이; 바람직하게는 V91R/Y31V/A73L/H79Q 돌연변이;

(j), V91/Q13 돌연변이; 바람직하게는 V91R/Q13L 돌연변이;

(k), V91/R120 돌연변이; 바람직하게는 V91R/R120F 돌연변이;

(l), V91/L18/I89/V93 돌연변이; 바람직하게는 V91R/L18I/I89L/V93I 돌연변이;

(m), H16/V91/Y31/A73/H79 돌연변이; 바람직하게는 H16E/V91R/Y31V/A73L/H79Q 돌연변이;

(n), H16/V91/L18/I89/V93 돌연변이; 바람직하게는 H16E/V91R/L18I/I89L/V93I 돌연변이 중 적어도 하나의 그룹의 돌연변이를 포함한다.

일부 구체적인 실시형태에 있어서, 상기 IL-2 돌연변이체는 SEQ ID NO: 22~27, 29~30, 32~35 또는 37~38 중 어느 하나로 표시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.

일부 구체적인 실시형태에 있어서, 상기 IL-2 돌연변이체는 N26, N29, N30, N71, Q11, L132, L70, P82, G27 또는 F28 돌연변이로부터 선택되는 하나 또는 복수의 돌연변이를 더 포함하고;

바람직하게는, 상기 IL-2 돌연변이체는 N26Q, N29S, N30S, N71Q, Q11C, L132C, L70C, P82C, G27C, F78C 돌연변이로부터 선택되는 하나 또는 복수의 돌연변이를 더 포함하며;

더욱 바람직하게는, 상기 IL-2 돌연변이체는,

(a), N26Q 돌연변이;

(b), N29S 돌연변이;

(c), N30S 돌연변이;

(d), N71Q 돌연변이;

(e), Q11C/L132C 돌연변이;

(f) L70C/P82C 돌연변이;

(g) G27C/F78C 돌연변이 중 적어도 하나의 그룹의 돌연변이를 더 포함한다.

일부 구체적인 실시형태에 있어서, 상기 IL-2 돌연변이체는 F42, Y45 또는 L72 돌연변이, 바람직하게는 F42A, Y45A 또는 L72G 돌연변이로부터 선택되는 하나 또는 복수의 돌연변이를 더 포함한다.

일부 구체적인 실시형태에 있어서, 야생형 IL-2에 비해, 상기 돌연변이체와 IL-2Rβγ 서브유닛 복합물의 결합 능력이 저하되고; 바람직하게는, 결합력_{IL-2Rβγ 서브유닛 복합물}/결합력_{IL-2αβγ 서브유닛 복합물}이 저하된다.

일부 구체적인 실시형태에 있어서, 야생형 IL-2에 비해, 상기 돌연변이체는 비조절성 T세포 또는 NK(자연 살해)세포를 자극하는 능력이 저하되고, 상기 자극은 세포내 STAT5 인산화 또는 세포 증식으로부터 선택될 수 있다.

일부 구체적인 실시형태에 있어서, 비조절성 T세포 또는 NK(자연 살해)세포에 비해, 상기 돌연변이체는 말초 혈액 또는 T세포군 중의 조절성 T세포(Treg)를 우선 자극하고; 상기 우선 자극은 조절성 T세포 내 STAT5 인산화를 우선 자극하는 것, 조절성 T세포 증식을 우선 자극하는 것, 조절성 T세포와 비조절성 T세포의 비율을 향상시키는 것, 또는 조절성 T세포와 NK세포의 비율을 향상시키는 것으로부터 선택된다.

제2 양태에 있어서, 본 발명은 IL-2 돌연변이체를 개시하고, 야생형 IL-2에 비해, 상기 IL-2 돌연변이체는 H16, D20 또는 V91에서 발생하는 하나 또는 복수의 돌연변이를 포함하며; 바람직하게는, 상기 IL-2 돌연변이체는,

(ⅰ), H16 돌연변이, 바람직하게는 H16E 돌연변이;

(ⅱ), D20 돌연변이, 바람직하게는 D20A 돌연변이;

(ⅲ), V91 돌연변이, 바람직하게는 V91R 돌연변이;

(ⅳ), H16/V91 돌연변이, 바람직하게는 H16E/V91R 돌연변이로부터 선택되는 돌연변이를 포함한다.

일부 구체적인 실시형태에 있어서, 상기 IL-2 돌연변이체는 SEQ ID NO: 21, 28, 31 또는 36으로 표시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.

바람직하게는, 상기 IL-2 돌연변이체는 N26Q, N29S, N30S, N71Q, Q11C, L132C, L70C, P82C, G27C 또는 F78C 돌연변이로부터 선택되는 하나 또는 복수의 돌연변이를 더 포함하며;

더욱 바람직하게는, 상기 IL-2 돌연변이체는,

(a), N26Q 돌연변이;

(b), N29S 돌연변이;

(c), N30S 돌연변이;

(d), N71Q 돌연변이;

(e), Q11C/L132C 돌연변이;

(f) L70C/P82C 돌연변이;

일부 구체적인 실시형태에 있어서, 비조절성 T세포 또는 NK세포에 비해, 상기 돌연변이체는 말초 혈액 또는 T세포군 중의 조절성 T세포(Treg)를 우선 자극하고; 상기 우선 자극은 조절성 T세포 내 STAT5 인산화를 우선 자극하는 것, 조절성 T세포 증식을 우선 자극하는 것, 조절성 T세포와 비조절성 T세포의 비율을 향상시키거나, 조절성 T세포와 NK세포의 비율을 향상시키는 것으로부터 선택된다.

일부 구체적인 실시형태에 있어서, 상기 돌연변이는 결실, 삽입 또는 치환을 포함하고, 바람직하게는 치환이다.

제3 양태에 있어서, 본 발명은 융합 단백질을 개시하고, 상기 융합 단백질은 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하며, 여기서, 상기 제1 폴리펩티드는 전술한 IL-2 돌연변이체이고, 상기 제2 폴리펩티드는 비IL-2 폴리펩티드이다.

일부 구체적인 실시형태에 있어서, 상기 제2 폴리펩티드는 Fc, 종양 항원 결합 분자 또는 IL-2 수용체 서브유닛이고;

선택적으로, 상기 Fc는 인간 IgG Fc이며, 예를 들어 인간 IgG1 Fc이며;

바람직하게는, 상기 인간 IgG1 Fc는,

(a), C220S;

(b), N297G;

(c) C220S 및 N297G;

(d), A327Q;

(e), L234A 및 L235A;

(f), A287C 및 L306C;

(g), A259C 및 L306C;

(h), R292C 및 V302C;

(i), V323C 및 I332C로부터 선택되는 적어도 하나의 그룹의 돌연변이를 포함하고;

더욱 바람직하게는, 상기 인간 Ig G1 Fc는 SEQ ID NO: 11로 표시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하며;

선택적으로, 상기 종양 항원은 EDB-FN(extra domain of fibronectin), Muc1, p53, FAP, GD2, EpCAM, tenascin-C, CD20, CEA, MAdCAM-1 또는 WT1(Wilms tumor protein1)을 포함하고; 선택적으로, 상기 종양 항원 결합 분자는 항체이며, 예를 들어 scFv, sdFv, Fab, Fab’, F(ab’)₂ 또는 Fv이고;

선택적으로, 상기 IL-2 수용체 서브유닛은 IL-2 수용체 α 서브유닛이다.

일부 구체적인 실시형태에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드의 C말단은 연결펩티드를 통해 또는 연결펩티드를 통하지 않고 상기 제2 폴리펩티드의 N말단에 연결되거나; 또는 상기 제1 폴리펩티드의 N말단은 연결펩티드를 통해 또는 연결펩티드를 통하지 않고 상기 제2 폴리펩티드의 C말단에 연결되며;

상기 연결펩티드는 바람직하게는 (G₄S)_n, (GGNGT)_n 또는 (YGNGT)_n으로부터 선택되고, 상기 n은 1, 2, 3, 4 또는 5로부터 선택되며; 더욱 바람직하게는, 상기 제1 폴리펩티드의 C말단은 상기 제2 폴리펩티드의 N말단에 연결펩티드(G₄S)₃를 통해 연결된다.

일부 구체적인 실시형태에 있어서, 상기 융합 단백질은 SEQ ID NO: 13~20 또는 SEQ ID NO: 39~56 중 어느 하나로 표시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.

제4 양태에 있어서, 본 발명은 접합체를 제공하고, 상기 접합체는 전술한 돌연변이체 또는 융합 단백질을 포함하며, 상기 돌연변이체 또는 융합 단백질에 접합되는 안정제, 약물 또는 추척 분자를 더 포함하고, 여기서 상기 안정제는 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜(Monomethoxy polyethylene glycol)과 같은 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택될 수 있다.

제5 양태에 있어서, 본 발명은 단리된 핵산 단편을 개시하고, 상기 핵산 단편은 전술한 돌연변이체 또는 융합 단백질을 코딩한다.

제6 양태에 있어서, 본 발명은 벡터를 개시하고, 상기 벡터는 전술한 핵산 단편을 포함한다.

제7 양태에 있어서, 본 발명은 숙주 세포를 개시하고, 상기 숙주 세포는 전술한 벡터를 포함한다.

일부 구체적인 실시형태에 있어서, 상기 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포이고; 상기 원핵 세포 또는 진핵 세포는 대장간균, 효모, 곤충 세포 또는 포유 동물 세포로부터 선택될 수 있고, 상기 포유 동물 세포는 CHO 세포계 또는 HEK293 세포계로부터 선택될 수 있다.

제8 양태에 있어서, 본 발명은 전술한 IL-2 돌연변이체 또는 융합 단백질의 제조 방법을 개시하고, 상기 방법은 전술한 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 숙주 세포가 발현하는 IL-2 돌연변이체 또는 융합 단백질을 단리하는 단계를 포함한다.

제9 양태에 있어서, 본 발명은 전술한 방법에 의해 제조된 IL-2 돌연변이체 또는 융합 단백질를 개시한다.

제10 양태에 있어서, 본 발명은 약물 조성물을 개시하고, 상기 약물 조성물은 전술한 돌연변이체, 융합 단백질, 접합체, 핵산 단편, 벡터 또는 숙주 세포; 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 보조제를 포함하며;

바람직하게는, 상기 약물 조성물은 주사 가능한 약물 조성물이고, 예를 들어 정맥 주사 약물 조성물 또는 피하 주사 약물 조성물이며; 더욱 바람직하게는, 각 조제량당 상기 약물 조성물은 피험자에게 유효량을 줄 수 있는 융합 단백질을 포함하고; 가장 바람직하게는, 상기 유효량은 0.001~10 mpk이며, 예를 들어 0.001 mpk, 0.002 mpk, 0.003 mpk, 0.004 mpk, 0.005 mpk, 0.006 mpk, 0.007 mpk, 0.008 mpk, 0.009 mpk, 0.01 mpk, 0.02 mpk, 0.03 mpk, 0.04 mpk, 0.05 mpk, 0.06 mpk, 0.07 mpk, 0.08 mpk, 0.09 mpk, 0.1 mpk, 0.2 mpk, 0.3 mpk, 0.4 mpk, 0.5 mpk, 0.6 mpk, 0.7 mpk, 0.8 mpk, 0.9 mpk, 1 mpk, 2 mpk, 3 mpk, 4 mpk, 5 mpk, 6 mpk, 7 mpk, 8 mpk, 9 mpk 또는 10 mpk이다.

제11 양태에 있어서, 본 발명은 약물 제조에서 전술한 돌연변이체, 융합 단백질, 접합체, 핵산 단편, 벡터 또는 숙주 세포의 용도를 개시하고;

바람직하게는, 상기 약물은 주사 약물이며, 예를 들어 정맥 주사 약물 또는 피하 주사 약물이고;

바람직하게는, 각 조제량당 상기 약물은 피험자에게 유효량을 줄 수 있는 융합 단백질을 포함하며; 가장 바람직하게는, 상기 유효량은 0.001~10 mpk이고, 예를 들어 0.001 mpk, 0.002 mpk, 0.003 mpk, 0.004 mpk, 0.005 mpk, 0.006 mpk, 0.007 mpk, 0.008 mpk, 0.009 mpk, 0.01 mpk, 0.02 mpk, 0.03 mpk, 0.04 mpk, 0.05 mpk, 0.06 mpk, 0.07 mpk, 0.08 mpk, 0.09 mpk, 0.1 mpk, 0.2 mpk, 0.3 mpk, 0.4 mpk, 0.5 mpk, 0.6 mpk, 0.7 mpk, 0.8 mpk, 0.9 mpk, 1 mpk, 2 mpk, 3 mpk, 4 mpk, 5 mpk, 6 mpk, 7 mpk, 8 mpk, 9 mpk 또는 10 mpk이며;

바람직하게는, 상기 약물은 자가면역 질환, 또는 증식성 질환, 또는 바이러스 감염을 치료하는 데 사용된다.

더욱 바람직하게는, 상기 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 전신성 홍반 루프스, 피부 홍반 루프스, 루프스 신염, IgA 신장병, 쇼그렌 증후군, 다발성 근염, 피부근염, 경피증, 건선, 판상 건선, 원형 탈모증, 다발성 경화증, 근위축성 측삭경화증, 염증성 장질환, 궤양성 결장염, 크론병, 이식편대숙주질환, 장기이식거부, 자가 면역 간염, I형 당뇨병, 자가 면역성 혈관염, 습진 또는 천식을 포함하고;

더욱 바람직하게는, 상기 증식성 질환은 신생물, 고형종양, 혈액 종양, 악성복수 또는 악성흉수를 포함하며; 여기서, 상기 고형종양은 양성 또는 악성, 원발성 또는 전이성일 수 있고, 상기 악성 고형종양은 암 또는 육종, 예를 들어, 상피 세포암, 내피 세포암, 평편세포암, 기형종, 폐부 종양, 유두종 바이러스로 인한 암, 선암, 암종, 흑색종, 혈관육종, 신경모세포종, 전이성 폐암, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 유방암, Merkel세포암, 난소암, 신장세포암, 전이성 신장암, 두경부암, 방광암, 비근 침윤성 방광암일 수 있으며; 상기 혈액 종양은 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 예를 들어 B세포 림프종, T세포 림프종, 피부 T세포 림프종, T세포 대형과립 림프구 백혈병으로부터 선택될 수 있고;

더욱 바람직하게는, 상기 바이러스 감염은 HIV감염, 신종 코로나 바이러스 감염 또는 HPV 바이러스 감염으로부터 선택된다.

제12 양태에 있어서, 본 발명은 자가면역 질환, 또는 증식성 질환, 또는 바이러스 감염의 치료 방법을 개시하고, 상기 방법은 피험자에게 유효량의 전술한 IL-2 돌연변이체, 융합 단백질, 접합체, 핵산 단편, 벡터, 숙주 세포 또는 약물 조성물을 투여하는 단계를 포함하며;

바람직하게는, 투여 방식은 주사이고, 예를 들어 정맥 주사 또는 피하 주사이며;

바람직하게는, 상기 유효량은 0.001~10 mpk이고, 예를 들어 0.001 mpk, 0.002 mpk, 0.003 mpk, 0.004 mpk, 0.005 mpk, 0.006 mpk, 0.007 mpk, 0.008 mpk, 0.009 mpk, 0.01 mpk, 0.02 mpk, 0.03 mpk, 0.04 mpk, 0.05 mpk, 0.06 mpk, 0.07 mpk, 0.08 mpk, 0.09 mpk, 0.1 mpk, 0.2 mpk, 0.3 mpk, 0.4 mpk, 0.5 mpk, 0.6 mpk, 0.7 mpk, 0.8 mpk, 0.9 mpk, 1 mpk, 2 mpk, 3 mpk, 4 mpk, 5 mpk, 6 mpk, 7 mpk, 8 mpk, 9 mpk 또는 10 mpk이며;

바람직하게는, 상기 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 전신성 홍반 루프스, 피부 홍반 루프스, 루프스 신염, IgA 신장병, 쇼그렌 증후군, 다발성근염, 피부근염, 경피증, 건선, 판상 건선, 원형 탈모증, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 염증성 장질환, 궤양성 결장염, 크론병, 이식편대숙주질환, 장기이식거부, 자가 면역 간염, I형 당뇨병, 자가 면역성 혈관염, 습진 또는 천식을 포함하고;

바람직하게는, 상기 증식성 질환은 신생물, 고형종양, 혈액 종양, 악성복수 또는 악성흉수를 포함하며; 여기서, 상기 고형종양은 양성 또는 악성, 원발성 또는 전이성일 수 있고, 상기 악성 고형종양은 암 또는 육종, 예를 들어, 상피 세포암, 내피 세포암, 평편세포암, 기형종, 폐부 종양, 유두종 바이러스로 인한 암, 선암, 암종, 흑색종, 혈관육종, 신경모세포종, 전이성 폐암, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 유방암, Merkel세포암, 난소암, 신장세포암, 전이성 신장암, 두경부암, 방광암, 비근 침윤성 방광암일 수 있으며; 상기 혈액 종양은 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 예를 들어 B세포 림프종, T세포 림프종, 피부 T세포 림프종, T세포 대형과립 림프구 백혈병으로부터 선택될 수 있고;

제13 양태에 있어서, 본 발명은 T세포군 또는 말초 혈액 중 조절성 T세포를 우선 자극하는 방법을 개시하고, 여기서, 상기 방법은 상기 T세포군 또는 말초 혈액을 전술한 IL-2 돌연변이체 또는 융합 단백질, 또는 접합체, 또는 핵산 단편, 또는 벡터, 또는 숙주 세포, 또는 의약물 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하며;

바람직하게는, 상기 상기 우선 자극은

(a) 비조절성 T세포 또는 NK세포에 비해, 조절성 T세포의 STAT5인산화를 우선 자극하는 것;

(b) 비조절성 T세포 또는 NK세포에 비해, 조절성 T세포 증식을 우선 자극하는 것;

및/또는 (c) 조절성 T세포와 비조절성 T세포의 비율을 향상시키거나, 조절성 T세포와 NK세포의 비율을 향상시키는 것을 포함한다.

용어 정의 및 설명

본 발명에서 별도로 정의하지 않는 한 본 발명과 관련된 과학적 및 기술적 용어는 본 기술 분야의 통상의 기술자가 이해하는 의미를 갖는다.

별로도 설명하지 않는 한, 본 발명에 기재된 용어 “IL2” 또는 “IL-2”는 영장류 동물(예를 들어 인간) 및 설치류 동물(예를 들어, 마우스 및 랫트) 및 길들여 기르거나 농업 포유 동물과 같은 포유 동물을 포함하는 임의의 척추 동물 래원의 임의의 천연 또는 재조합 IL-2를 지칭한다. 본 발명에 기재된 “IL2” 또는 “IL-2”는 미가공 성숙된 IL-2(예를 들어 N말단 신호 펩티드를 포함하는 IL-2) 및 세포 중에 생성된 가공 성숙된 IL-2의 임의의 형태를 포함한다. 본 발명에 기재된 “IL2” 또는 “IL-2”는 IL-2의 천연 변이체 및 단편, 예를 들어 전단 변이체 또는 대립 유전자 변이체를 더 포함한다. 본 발명에 기재된 “IL2” 또는 “IL-2”는 비천연적으로 존재하는 돌연변이체, 예를 들어 유전자 공학을 통해 인공 개조한 IL-2 돌연변이체를 더 포함한다.

“야생형 IL-2”는 기타 측면에서 IL-2 돌연변이체와 동일하나, 단 IL-2 돌연변이체의 각각의 돌연변이 아미노산 위치가 야생형 아미노산을 유지하는 IL-2 형태이다. 예시적으로, IL-2 돌연변이체가 미가공 성숙된 IL-2이면, 해당 돌연변이체의 야생형 형태는 미가공 성숙된 IL-2이고; IL-2 돌연변이체가 가공 성숙된 IL-2이면, 해당 돌연변이체의 야생형 형식은 가공 성숙된 IL-2이며; IL-2 돌연변이체가 IL-2의 절단 형태이면, 해당 돌연변이체의 야생형 형태는 야생형 서열을 갖는 상응한 IL-2절단 형태이다. 예시적으로, 본 발명에 기재된 “야생형 IL-2”은

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF X QSIISTLT (SEQ ID NO: 60)의 아미노산 서열을 가질 수 있고; 여기서, 제125 번 아미노산 잔기 “X”는 C, S, A 또는 V를 나타낸다.

본 발명의 용어 “돌연변이”는 아미노산 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 본 발명에 기재된 “돌연변이”는 본 기술 분야의 공지의 유전학 또는 화학 방법으로 생성한 아미노산 돌연변이를 사용할 수 있고, 부위 특이적 돌연변이 유발, PCR, 유전자 합성 등 방법을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 기재된 IL-2 돌연변이체의 “돌연변이 부위” 번호는 SEQ ID NO: 60으로 표시되는 “야생형 IL-2”의 제1 번 아미노산 잔기 A로부터 계수된다. 예시적으로, 본 발명의 “Q13 돌연변이”는 IL-2 돌연변이체가 SEQ ID NO: 60으로 표시되는 야생형 IL-2의 제13 번 아미노산 잔기(Gln, Q) 위치에서 발생하는 돌연변이를 의미한다. 예시적으로, 본 발명의 “Q13L 돌연변이”는 IL-2 돌연변이체가 SEQ ID NO: 60으로 표시되는 야생형 IL-2의 제13 번 위치의 아미노산 잔기에서 Q(Gln)가 L(Leu)로 돌연변이 위치를 의미한다.

본 발명의 돌연변이 부위 사이에 사용되는 용어 “/”는 “및”의 의미를 나타내고, “/” 전후의 돌연변이가 동일한 IL-2 돌연변이체에서 동시에 존재하는 것을 의미한다. 예시적으로, “Y31/A73/H79”는 동일한 IL-2 돌연변이체에서 Y31 부위, A73 부위 및 H79 부위에서 동시에 돌연변이가 발생하는 것을 의미하고, “Y31V/A73L/H79Q”는 동일한 IL-2 돌연변이체에서 Y31V, A73L 및 H79Q 돌연변이가 동시에 존재하는 것을 의미한다.

본 발명의 용어 “Tm”(melting temperature, 용점)은 50%의 단백질이 변성하는 온도를 의미한다. 본 발명에 기재된 “Tm”은 본 기술 분야의 공지의 방법으로 측정한 단백질의 Tm값을 사용할 수 있고, 예시적으로, 본 발명의 실시예 3 또는 실시예 6에 따른 방법을 사용하여 단백질의 Tm값을 측정할 수 있다.

본 발명의 용어 “융합 단백질”(fusion protein)은 유전자 재조합 방법, 화학 방법 또는 기타 적합한 방법을 통해 두 개 또는 복수의 유전자의 코딩 영역을 연결하고, 동일 조절 서열 제어 하에 유전자 재조합을 발현시켜 얻은 단백질 산물을 의미한다. 본 발명의 융합 단백질에서, 두 개 또는 복수의 유전자의 코딩 영역 사이는 코딩 연결펩티드의 서열을 통해 하나 또는 복수의 위치에서 융합될 수 있다. 연결펩티드는 본 발명의 융합 단백질을 구축하는 데 사용될 수 있다.

본 발명의 용어 “연결펩티드(Linker)”는 본 발명에서 IL-2와 다른 단백질 분자 또는 단백질 단편을 연결하여, 단백질의 정확한 접힘 및 안정성을 확보하기 위한 펩티드를 의미한다. 상기 다른 분자는 Fc를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 “연결펩티드”는 바람직하게는 (GGGGS)n이고, 여기서 n는 0, 1, 2, 3, 4, 5일 수 있다. 연결펩티드 서열이 너무 짧으면, 두 단백질의 고급 구조의 접힘에 영향을 미쳐, 서로 간섭될 수 있고; 연결펩티드 서열이 너무 길면, 연결펩티드 서열 자체가 새로운 항원이기 때문에 면역 원성 문제도 관련된다.

본 발명의 용어 “제2 폴리펩티드”는 단일 사슬 폴리펩티드, 예를 들어 항체 중의 scFv일 수 있다. 상기 “제2 폴리펩티드”는 다중 사슬 폴리펩티드를 더 포함하고, 그 중 적어도 한 가닥의 폴리펩티드는 IL-2 또는 그 돌연변이체에 융합되고, 다른 폴리펩티드 사슬은 공유결합 또는 비공유결합을 통해 융합이 발생하는 상기 적어도 한 가닥의 폴리펩티드, 예를 들어 항체 중의 Fab에 연결되며, 여기서 Fab의 중쇄는 IL-2 또는 그 돌연변이체에 융합될 수 있고, 경쇄는 이황화 결합을 통해 상기 중쇄에 연결된다.

본 발명의 용어 “Fc”는 면역 글로불린 사슬 불변 영역을 의미하고, 특히 면역 글로불린 중쇄 불변 영역의 카르복실기 말단 또는 그 중의 일부를 의미하며, 이는 항원 결합 활성을 가지지 않고, 항체 분자가 이펙트 분자 또는 세포와 서로 작용하는 부위이다. 본 발명에 기재된 “Fc”는 임의의 Fc 또는 그 변이체일 수 있고, 인간 또는 비인간 포유동물로부터 유래된다. 예를 들어, 면역 글로블린 Fc는 중쇄 CH1, CH2, CH3, CH4의 두 개 또는 그 이상의 도메인과 면역 글로불린 힌지 영역의 조합을 포함할 수 있다. Fc는 상이한 종으로부터 유래될 수 있고, 바람직하게는 인간의 면역 글로불린이다. 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열에 따르면, 면역 글로불린은 상이한 클래스로 나뉠 수 있고, 주로 5가지 유형의 면역 글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM을 포함한다. 그 중 일부는 서브 클래스(동종형), 예컨대 IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4; IgA-1 및 IgA-2로 더 나뉠 수 있다. “Fc”는 바람직하게는 적어도 하나의 면역 글로불린 힌지 영역 및 IgG의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 더욱 바람직하게는 IgG1의 하나의 CH2도메인, 하나의 CH3도메인 및 하나의 면역 글로블린 힌지 영역을 포함하고, 힌지 영역 시작 아미노산 위치는 변경될 수 있다. 별도로 설명하지 않는 한, 본 발명에 기재된 Fc, 불변 영역 또는 항체 중의 아미노산 잔기는 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interes, 제5판, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에 기재된 EU 번호 체계에 따르고, EU 인덱스로도 불리우며, 넘버링을 진행한다.

본 발명의 “항체”(antibody)는 본 발명에서 가장 넓은 의미로 사용되고, 각 종 항체 구조를 포함하며, 기대하는 항원 결합 활성을 나타내기만 하면 되고, 상기 항체는 단일클론 항체, 다클론 항체, 다중 특이성 항체(예를 들어 이중 특이성 항체) 및 항원 결합 단편을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 항체는 뮤린 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 낙타 항체를 포함할 수 있다. 예시적으로, 항체는 면역 글로불린일 수 있고, 두 가닥의 동일한 중쇄 및 두 가닥의 동일한 경쇄가 사슬 간 이황화 결합을 통해 연결되어 이루어진 4 펩티드 사슬 구조이다. 면역 글로불린 중쇄 불변 영역의 아미노산 조성 및 배열 순서가 다르기에 그 항원성도 다르다. 이에 따라, 면역 글로불린을 다섯 종류로 나누거나, 또는 면역 글로불린의 동종형, 즉 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 부를 수 있으며, 그 상응한 중쇄는 각각 μ 사슬, δ 사슬, γ 사슬, α 사슬 및 ε 사슬이다. 동일한 종류의 Ig는 그 힌지 영역 아미노산 조성 및 중쇄 이황화 결합의 수 및 위치의 차이에 따라 상이한 서브 클래스로 나뉠 수도 있고, 예컨대 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4로 나뉠 수 있다. 경쇄는 불변 영역의 차이로 인해 κ 사슬 또는 λ 사슬로 구분된다. 다섯 종류의 Ig 중 각 종류의 Ig는 모두 κ 사슬 또는 λ 사슬을 가질 수 있다. 본 발명에 기재된 “항체”는 scFv, sdFv, Fab, Fab’, F(ab’)₂ 및 Fv를 더 포함한다.

본 발명의 용어 “단리된”은 재료를 그 본래 또는 천연 환경(예를 들어 그 천연적으로 존재하는 자연 환경)에서 꺼내는 것을 의미한다. 따라서, 생체 동물에 존재하는 천연 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리된 것이 아니나, 인위적인 개입으로 천연 체계에서 일부 또는 전부 공존 재료에서 단리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리된 것이다.

“단리된 핵산 단편”은 RNA 또는 DNA 중합체이고, 이는 단일 사슬 또는 이중 사슬이며, 선택적으로 합성되거나 비천연적 또는 변화된 뉴클레오티드 염기를 함유한다. DNA 중합체 형태의 단리된 핵산 단편은 하나 또는 복수의 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA 단편으로 구성된다. 본 발명에 기재된 “핵산 단편”은 벡터의 일부분일 수 있고, 이종 부위에서 숙주 세포 염색체에 통합된다. 본 발명에 기재된 “핵산 단편”은 조성물의 일부분일 수 있다. 이러한 벡터 또는 조성물은 천연적으로 존재하는 환경의 일부분이 아니기에, 여전히 단리된 것이다.

본 발명의 용어 “벡터”는 핵산 벡터, 예를 들어 DNA벡터(예컨대 플라스미드), RNA벡터, 바이러스 또는 다른 적합한 레플리콘(예를 들어 바이러스 벡터)을 포함한다. 외인성 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 원핵 세포 또는 진핵 세포에 전달하기 위한 다양한 벡터가 개발되었다. 본 발명에 기재된 “벡터”는 단백질을 발현하거나 및/또는 이러한 폴리뉴클레오티드 서열을 포유 동물 세포 게놈에 통합하기 위한 부가 서열 요소, 유전자 전사를 가이드하기 위한 조절 서열(예컨대 프로모터 및 인핸서 영역) 또는 유전자의 번역 속도를 증강하거나 또는 유전자 전사를 통해 생성되는 mRNA의 안정성 또는 핵 출력을 개선하기 위한 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열 요소는 예를 들어 5’ 및 3’ 비번역 영역, 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 및 폴리아데닐화 신호 부위를 포함하여, 발현 벡터에 지닌 유전자의 효과적인 전사를 지시한다. 본 발명에 기재된 “벡터”는 이하의 뉴클레오티드를 함유할 수 있고, 해당 폴리뉴클레오티드는 이러한 벡터를 함유하는 세포를 선택하기 위한 표지를 코딩한다. 적합한 표지의 구현예로서 항생제(예컨대 암피실린, 클로람페니콜, 카나마이신 또는 뉴소트리신) 내성을 코딩하는 유전자를 포함한다.

본 발명의 용어 “숙주 세포”는 외인성 핵산이 인입된 세포를 의미하고, 이러한 세포의 후대를 포함한다. 상기 “후대”는 핵산 내용물이 친본과 완전히 같을 수 있고, 돌연변이를 포함하여, 친본 세포와 완전히 다를 수도 있다. 상기 “후대”는 1차 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선택된 기능 또는 생물학적 활성과 동일한 기능 또는 생물학 활성을 갖는 돌연변이 후대를 포함한다.

본 발명의 용어 “약물 조성물”은 하나 또는 복수의 본 발명에 기재된 IL-2 돌연변이체, 융합 단백질, 핵산 단편, 벡터 또는 숙주 세포를 포함하는 혼합물이고, 상기 혼합물은 기타 성분을 더 포함하며, 상기 기타 성분은 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 보조제를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 기재된 약물 조성물은 생체에 대한 투여를 촉진하고, 활성 성분의 흡수에 유리하여 생물 활성을 발휘하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 용어 “치료”는 외과 수술 또는 약물 처리(surgical or therapeutic treatment)를 의미하고, 이는 세포 증식성 질환(예컨대 암 또는 전염성 질환), 자가면역 질환(예컨대 전신성 홍반 루프스)의 발전과 같은 치료 대상에서 원하지 않는 생리 변화 또는 병변을 예방, 둔화(감소)하는 것을 목적으로 한다. 유익하거나 또는 희망하는 임상 결과는 측정 가능 또는 측정 불가를 막론하고 증상의 경감, 질환 심각도 감쇠, 질환 상태 안정(즉 비악화), 질환 발전의 지연 또는 늦춤, 질환 상태의 개선 또는 완화 및 완해(remission)(부분 완해 또는 완전 완해를 막론함)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 치료가 필요한 대상은 이미 병증 또는 질환에 걸린 대상 및 병증 또는 질환에 걸리기 쉬운 대상 또는 병증 및 질환을 예방하기 위한 대상을 포함한다. 둔화, 경감, 감쇠퇴, 완화, 완해 등 용어가 언급되는 경우, 그 의미는 제거, 소실, 발생하지 않는 등 상황도 포함한다.

본 발명의 용어 “피험자”는 예컨대 본 발명에 기재된 특정 질환 또는 병증(예컨대 암 또는 전염성 질환 또는 자가면역 질환)에 대한 치료를 받는 생체를 의미한다. 대상 및 환자의 구현예는 질환 또는 병증 치료를 받는 인간, 영장류 동물, 돼지, 산양, 토끼, 햄스터, 고양이, 개, 기니피그, 소 또는 기타 소과 패밀리 구성원, 면양 및 말 등 포유 동물을 의미한다.

본 발명의 용어 “유효량”은 단독 투여하거나 다른 치료제와 조합하여 세포, 조직 또는 대상에 투여할 때 질환 병증 또는 해당 질환의 발전을 효과적으로 방지하거나 완해하는 치료제 사용량을 의미한다. “유효량”은 또한 증상 완해, 예를 들어 관련 의학 병증을 치료, 치유, 방지 또는 완화하거나, 또는 이러한 병증을 치료, 치유, 방지 또는 완해하는 속도가 증가되기에 충분한 화합물의 사용량을 의미한다. 활성 성분을 단독으로 대상체에 투여하는 경우, 치료 유효 조제량은 단지 해당 성분을 의미한다. 어느 조합을 응용하는 경우, 치료 유효 조제량은 조합, 연속 또는 동시 투여를 막론하고 치료 작용을 일으키는 활성 성분의 조합 사용량을 의미한다.

본 발명의 용어 “자가면역 질환”은 대상이 자가 세포, 조직 및/또는 기관에 대해 면역 반응을 발생하여 세포, 조직 및/또는 기관 손상을 일으키는 것을 특징으로 하는 대상 병증을 의미한다. 예시적으로, 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 전신성 홍반 루프스, 피부 홍반 루프스, 루프스 신염, IgA 신장병, 쇼그렌 증후군, 다발성근염, 피부근염, 경피증, 건선, 판상 건선, 원형 탈모증, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 염증성 장질환, 궤양성 결장염, 크론병, 이식편대숙주질환, 장기이식거부, 자가 면역 간염, I형 당뇨병, 자가 면역성 혈관염, 습진 또는 천식을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 용어 “증식성 질환”은 세포 또는 조직의 성장이 조절되지 않거나 및/또는 비정상적으로 성장하여 불필요한 병세 또는 질환의 병세를 초래하는 것을 의미하고, 암성일 수 있거나 암성이 아닐 수 있으며, 신생물, 고형종양, 혈액 종양, 악성복수 또는 악성흉수를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 “고형종양”은 양성(benign) 또는 악성(maligant), 원발성(Primary) 또는 전이성(metastatic)일 수 있고; 악성 고형종양은 (carcinomas) 또는 육종(sarcomas)일 수 있다. 예시적으로, 본 발명의 “고형종양”은 상피 세포암, 내피 세포암, 평편세포암, 기형종, 폐종양, 유두종 바이러스로 인한 암, 선암, 암종, 흑색종, 혈관육종, 신경모세포종, 전이성 폐암, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 유방암, Merkel세포암, 난소암, 신장세포암, 전이성 신장암, 두경부암, 방광암, 비근 침윤성 방광암을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예시적으로, 본 발명의 “혈액 종양”은 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 예를 들어 B세포 림프종, T세포 림프종, 피부 T세포 림프종, T세포 대형과립 림프구 백혈병을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 용어 “IL-2수용체 α 서브유닛”(IL-2Rα)은 “CD25”로도 불리우고, 영장류 동물(예를 들어 인간) 및 설치류 동물(예를 들어 마우스 및 랫트)과 같은 포유류 동물을 포함하는 임의의 척추 동물의 임의의 천연 IL-2수용체 α 서브유닛 또는 그 돌연변이체를 의미하며, “전장”의 미가공된 IL-2수용체 α 서브유닛 및 세포에서 유래되는 가공된 임의의 형태의 IL-2수용체 α 서브유닛을 포함하고, 천연적으로 존재하는 IL-2수용체 α 서브유닛 변이체, 예를 들어 접합 변이체 또는 대립유전자 변이체를 더 포함하며, 천연 IL-2수용체 α 서브유닛에 기초하여 인공 개조된 돌연변이체를 더 포함한다. 일부 실시 형태에 있어서, IL-2수용체 α 서브유닛은 인간 IL-2수용체 α 서브유닛이고, 예시적 서열은 SEQ ID NO: 57로 표시된 바와 같다.

본 발명의 용어 “IL-2수용체 β 서브유닛”(IL-2Rβ)은 “CD122”로도 불리우고, 영장류 동물(예를 들어 인간) 및 설치류 동물(예를 들어 마우스 및 랫트)과 같은 포유류 동물을 포함하는 임의의 척추 동물의 임의의 천연 IL-2수용체 β 서브유닛 또는 그 돌연변이체를 의미하며, “전장”의 미가공된 IL-2수용체 β 서브유닛 및 세포에서 유래되는 가공된 임의의 형태의 IL-2수용체 β 서브유닛을 포함하고, 천연적으로 존재하는 IL-2수용체 β 서브유닛 변이체, 예를 들어 접합 변이체 또는 대립유전자 변이체를 더 포함하며, 천연 IL-2수용체 β 서브유닛에 기초하여 인공 개조된 돌연변이체를 더 포함한다. 일부 실시 형태에 있어서, IL-2수용체 β 서브유닛은 인간 IL-2수용체 β 서브유닛이고, 예시적 서열은 SEQ ID NO: 58로 표시된 바와 같다.

본 발명의 용어 “IL-2수용체 γ 서브유닛”(IL-2Rγ)은 “CD132”로도 불리우고, 영장류 동물(예를 들어 인간) 및 설치류 동물(예를 들어 마우스 및 랫트)과 같은 포유류 동물을 포함하는 임의의 척추 동물의 임의의 천연 IL-2수용체 γ 서브유닛 또는 그 돌연변이체를 의미하며, “전장”의 미가공된 IL-2수용체 γ 서브유닛 및 세포에서 유래되는 가공된 임의의 형태의 IL-2수용체 γ 서브유닛을 포함하고, 천연적으로 존재하는 IL-2수용체 γ 서브유닛 변이체, 예를 들어 접합 변이체 또는 대립유전자 변이체를 더 포함하며, 천연 IL-2수용체 γ 서브유닛에 기초하여 인공 개조된 돌연변이체를 더 포함한다. 일부 실시 형태에 있어서, IL-2수용체 γ 서브유닛은 인간 IL-2수용체 γ 서브유닛이고, 예시적 서열은 SEQ ID NO: 59로 표시된 바와 같다.

본 발명의 용어 “Treg”는 “조절성 T세포” 또는 “T_{조절 세포}”로도 불리우고, 다른 T세포의 응답을 억제할 수 있는 특수화 CD4⁺T세포 유형을 의미한다. Treg는 IL-2 수용체 α 서브유닛(CD25) 및 전사 인자 포크헤드 박스 P3(Forkhead box protein P3, FOXP3)을 발현하고, 항원에 대한 외주 자체 내성을 유도하고 유지하는 데 관건적인 역할을 하는 것을 특징으로 한다. Treg는 그 기능, 발육 및 그 억제적 특징의 유도를 구현하기 위해 IL-2를 필요로 한다.

본 발명의 용어 “결합력”은 쌍을 이루는 분자 간에 나타나는 상호 간의 결합 또는 상호 작용을 의미한다. 통상적인 쌍을 이루는 분자는 리간드와 수용체, 항원과 항체, 효소와 기질 등을 포함하고, 보다 구체적으로, 예를 들어 본 발명에 따른 IL-2와 IL-2βγ 서브유닛 복합물, 또는 IL-2와 IL-2αβγ 서브유닛 복합물을 포함한다. 본 발명에 기재된 “결합력”은 본 기술 분야에서 이미 알려진 통상의 방법으로 측정할 수 있고, ELISA 또는 FACS를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

도 1은 유세포 분석(FACS) 방법으로 CHO-K1 hIL2-Rα 1A6 재조합 세포계 인간 IL-2 수용체 α단백질 발현 수준을 측정한 결과도이고, 여기서 IL-2 수용체 α항체는 BioLegend에서 구입하며; 음성 대조는 동형 항체 대조이다.
도 2는 유세포 분석(FACS) 방법으로 CHO-K1 hIL-2Rβ 2A5 재조합 세포계 인간 IL-2수용체 β 단백질 발현 수준을 측정한 결과도이고, 여기서 IL-2수용체 β 항체는 BioLegend에서 구입하며; 음성 대조는 동형 항체 대조이다.
도 3은 유세포 분석(FACS) 방법으로 CHO-K1 hIL-2Rβγ 2E6 재조합 세포계 인간 IL-2수용체 βγ 단백질 발현 수준을 측정한 결과도이고, IL-2수용체 β, γ항체는 BioLegend에서 구입하며; 음성 대조는 동형 항체 대조이다.
도 3A는 IL2수용체 β 단백질 발현 수준 결과도이다.
도 3B는 IL2수용체 γ 단백질 발현 수준 결과도이다.
도 4는 유세포 분석(FACS)방법으로 CHO-K1 hIL-2Rαβγ 2D6 재조합 세포계 인간 IL-2수용체 αβγ 단백질 발현 수준을 측정한 결과도이고, IL-2수용체 α, β, γ항체는 BioLegend에서 구입하며; 대조는 CHO-K1공세포 대응 수용체 발현 수준이다.
도 4A는 IL2수용체 α 단백질 발현 수준 결과도이다.
도 4B는 IL2수용체 β 단백질 발현 수준 결과도이다.
도 4C는 IL2수용체 γ 단백질 발현 수준의 결과도이다.
도 5는 유세포 분석(FACS)방법으로 IL-2 돌연변이 단백질 및 CHO-K1 IL-2수용체 αβγ, IL-2수용체 βγ 재조합 세포결합 활성을 측정한 결과도이다.
도 5A는 mut7.36-linker2-hFc, mut11.08-linker2-hFc, mut61-linker2-hFc, mut61.08-linker2-hFc 또는 mut61.46-linker2-hFc와 CHO-K1 IL2수용체 αβγ재조합 세포결합 활성의 결과도이다.
도 5B는 mut11.31-linker2-hFc, mut7.66-linker2-hFc와 CHO-K1 IL2수용체 αβγ재조합 세포결합 활성의 결과도이다.
도 5C는 mut7.36-linker2-hFc, mut11.08-linker2-hFc, mut61-linker2-hFc, mut61.08-linker2-hFc 또는 mut61.46-linker2-hFc와 CHO-K1 IL2수용체 βγ 재조합 세포결합 활성의 결과도이다.
도 5D는 mut11.31-linker2-hFc, mut7.66-linker2-hFc와 CHO-K1 IL2수용체 βγ 재조합 세포결합 활성의 결과도이다.
도 6은 IL-2 돌연변이 단백질이 Treg(도 6A-도 6C), CD4⁺CD25^-FoxP3^-T세포(도 6D-도 6F), CD8⁺T세포(도 6G-도 6I)STAT5 인산화 수준에 미치는 영향을 측정한 것이다.
도 6A는 mut7.36-linker2-hFc가 Treg STAT5 인산화 수준에 미치는 영향을 보여준다.
도 6B는 mut11.08-linker2-hFc가 Treg STAT5 인산화 수준에 미치는 영향을 보여준다.
도 6C는 mut11.31-linker2-hFc, mut7.66-linker2-hFc가 Treg STAT5 인산화 수준에 미치는 영향을 보여준다.
도 6D는 mut7.36-linker2-hFc가 CD4⁺CD25^-FoxP3^-T세포 인산화 수준에 미치는 영향을 보여준다.
도 6E는 mut11.08-linker2-hFc가 CD4⁺CD25^-FoxP3^-T세포 인산화 수준에 미치는 영향을 보여준다.
도 6F는 mut11.31-linker2-hFc, mut7.66-linker2-hFc가 CD4⁺CD25^-FoxP3^-T세포 인산화 수준에 미치는 영향을 보여준다.
도 6G는 mut7.36-linker2-hFc가 CD8⁺T세포 인산화 수준에 미치는 영향을 보여준다.
도 6H는 mut11.08-linker2-hFc가 CD8⁺T세포 인산화 수준에 미치는 영향을 보여준다.
도 6I는 mut11.31-linker2-hFc, mut7.66-linker2-hFc가 CD8⁺T세포 인산화 수준에 미치는 영향을 보여준다.
도 7은 IL-2 돌연변이 단백질이 Treg(도 7A-도 7B), CD4⁺CD25^-FoxP3^-T세포(도 7C-도 7D), CD8⁺CD25^-T세포(도 7E-도 7F)증식 수준에 미치는 영향을 측정한 것이다.
도 7A는 mut7.36-linker2-hFc, mut7.66-linker2-hFc가 Treg증식 수준에 미치는 영향을 보여준다.
도 7B는 mut11.08-linker2-hFc, mut11.31-linker2-hFc가 Treg증식 수준에 미치는 영향을 보여준다.
도 7C는 mut7.36-linker2-hFc, mut7.66-linker2-hFc가 CD4⁺CD25^-FoxP3^-T세포 증식 수준에 미치는 영향을 보여준다.
도 7D는 mut11.08-linker2-hFc, mut11.31-linker2-hFc가 CD4⁺CD25^-FoxP3^-T세포 증식 수준에 미치는 영향을 보여준다.
도 7E는 mut7.36-linker2-hFc, mut7.66-linker2-hFc가 CD8⁺CD25^-T세포 증식 수준에 미치는 영향을 보여준다.
도 7F는 mut11.08-linker2-hFc, mut11.31-linker2-hFc가 CD8⁺CD25^-T세포 증식 수준에 미치는 영향을 보여준다.
도 8은 IL-2 돌연변이 단백질이 NK세포 증식 수준에 미치는 영향을 측정한 것이다.
도 9A는 비장 중 Treg세포가 CD4⁺T세포에서의 점유율을 보여준다.
도 9B는 비장 중 CD4⁺CD25^-Foxp3^-세포가 CD4⁺세포에서의 점유율을 보여준다.
도 9C는 비장 중 CD3⁺CD4^-세포의 CD3⁺세포에서의 점유율을 보여준다.
도 10A는 말초 혈액 중 Treg세포가 CD4⁺세포에서의 점유율을 보여준다.
도 10B는 말초 혈액 중 CD4⁺CD25^-Foxp3^-세포가 CD4⁺세포에서의 점유율을 보여준다.
도 10C는 말초 혈액 중 CD3⁺CD4^-세포가 CD3⁺세포에서의 점유율을 보여준다.
도 11A는 야생형 마우스 DTH 모델의 상이한 그룹별 Δ귀 두께 변화를 보여주고, Δ귀 두께는 자극 전후, 우측 귀의 두께 변화를 의미한다.
도 11B는 야생형 마우스 DTH 모델의 상이한 그룹별 체중 변화를 보여준다.
도 12A는 야생형 마우스 DTH 모델의 상이한 그룹별 Δ귀 두께 변화를 보여주고, Δ귀 두께는 자극 전후, 우측 귀의 두께 변화를 의미한다.
도 12B는 야생형 마우스 DTH 모델의 상이한 그룹별 체중 변화를 보여준다.
도 13A는 NOG 마우스의 상이한 그룹별 Treg/Tcon을 보여준다.
도 13B는 NOG마우스의 상이한 그룹별 Treg/CD8+를 보여준다.
도 14A는 NOG마우스의 상이한 그룹별 Treg세포수를 보여준다.
도 14B는 NOG마우스의 상이한 그룹별 Tcon세포수를 보여준다.
도 14C는 NOG마우스의 상이한 그룹별 CD8+세포수를 보여준다.
도 15A는 NOG마우스의 상이한 그룹별 체중 변화를 보여준다.
도 15B는 NOG마우스의 상이한 그룹별 GVHD 평점을 보여준다.
도 16A는 야생형 마우스 피하 투여 후 혈중약제 농도를 보여준다.
도 16B는 야생형 마우스 피하 투여 후 혈중약제 농도를 보여준다.
도 17은 야생형 마우스 정맥 투여 후 혈중약제 농도를 보여준다.
도 18은 PBMC 접종 마우스 피하 투여 후 혈중약제 농도를 보여준다.
도 19는 사이노몰구스 원숭이 피하 투여 후 혈중약제 농도를 보여준다.
도 20A은 사이노몰구스 원숭이 피하 투여 후 Treg수를 보여준다.
도 20B은 사이노몰구스 원숭이 피하 투여 후 Treg수 변화 배수를 보여준다.
도 20C는 사이노몰구스 원숭이 피하 투여 후 Treg가 CD4⁺T세포에서 차지하는 비율을 보여준다.
도 20D는 사이노몰구스 원숭이 피하 투여 후 Treg Ki67⁺세포 비율을 보여준다.
도 20E느 사이노몰구스 원숭이 피하 투여 후 FoxP3 평균 형광 강도 변화 배수를 보여준다.
도 20F는 사이노몰구스 원숭이 피하 투여 후 CD25평균 형광 강도 변화 배수를 보여준다.
도 21A는 사이노몰구스 원숭이 피하 투여 후 FoxP3^-CD4⁺세포수를 보여준다.
도 21B는 사이노몰구스 원숭이 피하 투여 후 FoxP3^-CD4⁺세포수 변화 배수를 보여준다.
도 21C는 사이노몰구스 원숭이 피하 투여 후 CD8⁺T세포수를 보여준다.
도 21D는 사이노몰구스 원숭이 피하 투여 후 CD8⁺T세포수 변화 배수를 보여준다.
도 21E는 사이노몰구스 원숭이 피하 투여 후 NK세포수를 보여준다.
도 21F는 사이노몰구스 원숭이 피하 투여 후 NK세포수 변화 배수를 보여준다.

이하 구체적 실시예에 결부하여 본 발명을 추가로 설명하도록 하고, 본 발명의 장점 및 특점이 설명에 따라 더욱 명백해질 것이다. 실시예에서 구체적인 조건을 명시하지 않았다면, 통상적인 조건 또는 제조 업체가 제안하는 조건에 따라 진행한다. 사용되는 시약 또는 기기는 제조사를 명시하지 않고, 모두 시중에서 구매하여 얻을 수 있는 통상적인 제품이다.

본 발명의 실시예는 시범적인 예에 불과하고, 본 발명의 범위에 대해 어떠한 한정도 하지 않는다. 본 기술 분야의 통상의 기술자는 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않는 전제 하에서 본 발명의 기술적 해결수단의 세부 사항 및 형식을 수정 및 대체할 수 있으나, 이러한 수정 및 대체는 모두 본 발명의 보호 범위 내에 속하는 것을 이해해야 한다.

실시예 1 IL-2 열안정성 돌연변이의 설계 및 발현 플라스미드 구축

다양한 알고리즘을 사용하여 열안정성이 향상된 IL-2 돌연변이를 얻었고, 상응한 서열을 설계 합성하였으며, 야생형 IL2 및 전술한 돌연변이형 IL2를 코딩하는 핵산 단편을 Fc 태그를 갖는 pTT5벡터에 클론하여, 이미 구축된 표준 분자 생물학 방법으로 플라스미드를 제조하였고, 상기 플라스미드는 IL2-linker2-hFc, mut0.08-linker2-hFc, mut0.31-linker2-hFc, mut0.36-linker2-hFc, mut0.39-linker2-hFc, mut0.46-linker2-hFc, mut0.57-linker2-hFc, mut0.66-linker2-hFc 및 mut0.68-linker2-hFc의 융합 단백질을 코딩하였다.

전술한 융합 단백질 및 각 요소의 구체적인 서열 정보는 표 1에 나타낸 바와 같고, 여기서, “IL2”는 야생형 IL2를 나태내고, “mutXX”는 야생형에 비해, 돌연변이가 발생하는 돌연변이형 IL2를 나타내었다.

IL-2 안정성 돌연변이 서열

돌연변이	서열번호	서열 정보
IL2	SEQ ID NO：1	APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
mut0.08 (Y31V/A73L/H79Q）	SEQ ID NO：2	APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINN V KNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNL L QSKNF Q LRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
mut0.31 （Q13L）	SEQ ID NO：3	APTSSSTKKTQL L LEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
mut0.36 （R120F）	SEQ ID NO：4	APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLN F WITFAQSIISTLT
mut0.39（L18I/V91A/F117W）	SEQ ID NO：5	APTSSSTKKTQLQLEHL I LDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNIN A IVLELKGSETTFMCEYADETATIVE W LNRWITFAQSIISTLT
mut0.46（L18I/I89L/V93I）	SEQ ID NO：6	APTSSSTKKTQLQLEHL I LDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISN L NVI I LELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
mut0.57 （G27W/R120F）	SEQ ID NO：7	APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILN W INNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLN F WITFAQSIISTLT
mut0.66 （P82L/R120F）	SEQ ID NO：8	APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLR L RDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLN F WITFAQSIISTLT
mut0.68 （N90Y/R120F）	SEQ ID NO：9	APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNI Y VIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLN F WITFAQSIISTLT
linker2	SEQ ID NO：10	GGGGSGGGGSGGGGS
hFc （C220S/N297G）	SEQ ID NO：11	EPKS S DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
IL2-linker2-hFc (WT IL-2-linker2-hFc, C220S/N297G）	SEQ ID NO：12	APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT GGGGSGGGGSGGGGS EPKS S DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
mut0.08-linker2-hFc (Y31V/A73L/H79Q）	SEQ ID NO：13	APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINN V KNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNL L QSKNF Q LRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT GGGGSGGGGSGGGGS EPKS S DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
mut0.31-linker2-hFc （Q13L）	SEQ ID NO：14	APTSSSTKKTQL L LEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT GGGGSGGGGSGGGGS EPKS S DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
mut0.36-linker2-hFc (R120F）	SEQ ID NO：15	APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLN F WITFAQSIISTLT GGGGSGGGGSGGGGS EPKS S DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
mut0.39-linker2-hFc （L18I/V91A/F117W）	SEQ ID NO：16	APTSSSTKKTQLQLEHL I LDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNIN A IVLELKGSETTFMCEYADETATIVE W LNRWITFAQSIISTLT GGGGSGGGGSGGGGS EPKS S DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
mut0.46-linker2-hFc （L18I/I89L/V93I）	SEQ ID NO：17	APTSSSTKKTQLQLEHL I LDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISN L NVI I LELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLTG GGGSGGGGSGGGGS EPKS S DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
mut0.57-linker2-hFc (G27W/R120F）	SEQ ID NO：18	APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILN W INNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLN F WITFAQSIISTLT GGGGSGGGGSGGGGS EPKS S DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
mut0.66-linker2-hFc （P82L/R120F）	SEQ ID NO：19	APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLR L RDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLN F WITFAQSIISTLT GGGGSGGGGSGGGGS EPKS S DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
mut0.68-linker2-hFc （N90Y/R120F）	SEQ ID NO：20	APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNI Y VIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLN F WITFAQSIISTLT GGGGSGGGGSGGGGS EPKS S DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

실시예 2 IL-2열안정성 돌연변이의 생산 및 정제

HEK293세포(중국 과학원 셀뱅크에서 구입)에 대해 실시예 1에서 구축한 플라스미드(PEI, Polysciences)를 일시적으로 형질감염하였고, FreeStyle TM293 Expression Medium(Gibco에서 구입)을 사용하여 37°C에서 확대 배양하였다. 7일 후 세포 배양액을 수집하고, 세포 성분을 원심 분리로 제거하여, IL-2-hFc융합 단백질을 함유한 배양 상등액을 얻었다.

10 mL의 단백질 A칼럼(Bestchrom에서 구입)으로 세포 배양 상등액 중의 융합 단백질을 정제하였다. 단백질 A칼럼을 먼저 3~5배 칼럼 부피의 평형 완충액(PBS 인산 완충액, pH7.4)으로 평형시킨 후, 맑은 배양 상등액을 단백질 A칼럼에 샘플 로딩하고, 유속을 10 mL/min으로 제어하였다. 샘플 로딩 완료 후 평형 완충액으로 단백질 A칼럼을 세정하고, 평형 완충액의 부피는 단백질 A칼럼 칼럼배드 부피의 3~5배이다. 용리액(0.02 M의 구연산 완충액, 0.1 M의 글리신, 0.1 M의 염화나트륨, pH 3.0)으로 단백질 A칼럼에 결합된 단백질을 용리하고, 핵산 단백질 측정기로 용리 상황(A280자외선 흡수 피크)을 모니터링하였다. 용리된 단백질을 수집하고, 1 M의 아르기닌, 0.4 M의 숙신산, pH 9.0의 완충액을 첨가하여 pH를 중화시켰다. 다음 분자체(Bestchrom에서 구입)를 통과시키고, 완충계는 20 mM의 PB, 200 mM의 염화나트륨이며, pH 6.0-6.5이고, 목적 단백질을 수집하였다. 0.22 μm의 필터로 무균 필터링을 수행하고, 무균 보존하여, 정제된 IL-2 돌연변이 융합 단백질을 얻었다.

정제된 IL-2 돌연변이 융합 단백질에 대해 단백질 생산량, 단백질 농도(A280/1.4), SEC순도 등을 측정하여 분석하고, 정제 후의 IL-2 안정성 돌연변이 융합 단백질의 품질이 합격이며, 동시에 IL-2안정성 돌연변이(mutXX-linker2-hFc)의 생산량도 야생형 IL-2(IL2-linker2-hFc)에 비해 현저히 향상되었다. 여기서, 단백질 생산량, 단백질 농도 및 순도의 측정 정보는 표 2를 참조바란다.

IL-2 안정성 돌연변이 융합 단백질의 측정 및 분석

돌연변이	단백질 생산량 (mg/L)	단백질 SEC 순도	단백질 농도 (mg/mL)
IL2-linker2-hFc	0.95	97.25%	1.11
mut0.08-linker2-hFc	8.95	99.85%	1.79
mut0.31-linker2-hFc	1.54	98.49%	2.20
mut0.36-linker2-hFc	2.98	99.99%	1.49
mut0.39-linker2-hFc	43.10	99.58%	2.13
mut0.46-linker2-hFc	13.82	99.92%	1.22
mut0.57-linker2-hFc	1.25	99.91%	0.89
mut0.66-linker2-hFc	7.39	99.90%	1.12
mut0.68-linker2-hFc	11.90	99.99%	1.19

실시예 3 IL-2 열안정성 돌연변이 DSF 측정

Protein Thermal Shift Dye Kit(Applied Biosystems에서 구입, 물품번호 4461146) 중의 완충액을 50×로 희석하여, 실시예 2에 기재된 방법을 통해 정제하여 얻은 IL-2 돌연변이 단백질을 0.5 mg/mL로 희석하고, 염료를 2×농도로 20 μL 반응계에 보충하였다. 균일하게 혼합한 후 8스트립 튜브에 첨가하고, 각각의 샘플을 2개의 중복 웰로 하여, 튜브캡을 닫고, 5-10초간 원심 분리하며, 측정기기(Applied Biosystems 7500)에 놓아 측정하고, Boltzmann 분석법으로 용해 곡선을 분석하여, Tm값을 얻었다. 결과는 표 3에 나타낸 바와 같고, 안정성 IL-2 돌연변이(mutXX-linker2-hFc)는 야생형 IL-2(IL2-linker2-hFc)에 비해, Tm이 3°C 이상 향상되고, 열안정성이 현저하게 향상되었다.

IL-2안정성 돌연변이 DSF 분석

돌연변이	Tm(℃)
IL2-linker2-hFc	46.74
mut0.08-linker2-hFc	54.91
mut0.31-linker2-hFc	57.53
mut0.36-linker2-hFc	56.59
mut0.39-linker2-hFc	55.93
mut0.46-linker2-hFc	53.83
mut0.57-linker2-hFc	57.98
mut0.66-linker2-hFc	57.24
mut0.68-linker2-hFc	54.77

실시예 4 IL-2 돌연변이(βγ 서브유닛과 상호 작용이 감쇠된 IL2 돌연변이 및 그 기초 상에서 열안정성 돌연변이를 조합)의의 설계 및 발현 플라스미드 구축

MOE 소프트웨어를 포함한 여러 알고리즘을 사용하여 인간의 IL-2와 상응한 수용체 α, β, γ 서브유닛의 상호 작용 계면을 시물레이션하여, βγ 서브유닛과 상호 작용이 감쇠된 돌연변이 부위를 얻었다. βγ 서브유닛과 상호 작용이 감쇠된 IL-2 돌연변이체 서열 및 열안정 돌연변이와 조합된 IL-2 돌연변이체 서열을 설계 합성하였다. 야생형 IL-2 및 전술한IL-2 돌연변이체를 코딩하는 핵산 단편을 Fc태그를 갖는 pTT5벡터에 클론하고, 이미 구축된 표준 분자 생물학 방법으로 플라스미드를 제조하며, 상기 플라스미드는 IL2-linker2-hFc, mut7-linker2-hFc, mut7.08-linker2-hFc, mut7.36-linker2-hFc, mut7.39-linker2-hFc, mut7.46-linker2-hFc, mut7.57-linker2-hFc, mut7.66-linker2-hFc, mut8-linker2-hFc, mut8.08-linker2-hFc, mut8.36-linker2-hFc, mut11-linker2-hFc, mut11.08-linker2-hFc, mut11.31-linker2-hFc, mut11.36-linker2-hFc, mut11.46-linker2-hFc, mut61-linker2-hFc, mut61.08-linker2-hFc 및 mut61.46-linker2-hFc의 융합 단백질을 코딩하였다. 상기 융합 단백질 및 그 조성 요소의 구체적 서열 정보는 표 4에 나타낸 바와 같고, 여기서, “IL2”는 야생형 IL2를 나타내고, “mutXX”는 야생형에 비해, 돌연변이가 발생하는 돌연변이형 IL2를 나타내었다.

IL-2 돌연변이 서열

돌연변이	서열 번호	서열 정보
IL2	SEQ ID NO：1	(표 1 참조)
mut7 （H16E）	SEQ ID NO：21	APTSSSTKKTQLQLE E LLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
mut7.08 （H16E/Y31V/A73L/H79Q）	SEQ ID NO：22	APTSSSTKKTQLQLE E LLLDLQMILNGINN V KNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNL L QSKNF Q LRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
mut7.36 （H16E/R120F）	SEQ ID NO：23	APTSSSTKKTQLQLE E LLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLN F WITFAQSIISTLT
mut7.39 （H16E/L18I/V91A/F117W）	SEQ ID NO：24	APTSSSTKKTQLQLE E L I LDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNIN A IVLELKGSETTFMCEYADETATIVE W LNRWITFAQSIISTLT
mut7.46 （H16E/L18I/I89L/V93I）	SEQ ID NO：25	APTSSSTKKTQLQLE E L I LDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISN L NVI I LELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
mut7.57 （H16E/G27W/R120F）	SEQ ID NO:26	APTSSSTKKTQLQLE E LLLDLQMILN W INNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLN F WITFAQSIISTLT
mut7.66 （H16E/P82L/R120F）	SEQ ID NO：27	APTSSSTKKTQLQLE E LLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLR L RDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLN F WITFAQSIISTLT
mut8 （D20A）	SEQ ID NO：28	APTSSSTKKTQLQLEHLLL A LQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
mut8.08 （D20A/Y31V/A73L/H79Q）	SEQ ID NO：29	APTSSSTKKTQLQLEHLLL A LQMILNGINN V KNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNL L QSKNF Q LRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
mut8.36 （D20A/R120F）	SEQ ID NO：30	APTSSSTKKTQLQLEHLLL A LQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLN F WITFAQSIISTLT
mut11 （V91R）	SEQ ID NO：31	APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNIN R IVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
mut11.08 （V91R/Y31V/A73L/H79Q）	SEQ ID NO：32	APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINN V KNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNL L QSKNF Q LRPRDLISNIN R IVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
mut11.31 （V91R/Q13L）	SEQ ID NO：33	APTSSSTKKTQL L LEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNIN R IVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
mut11.36 （V91R/R120F）	SEQ ID NO：34	APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNIN R IVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLN F WITFAQSIISTLT
mut11.46 （V91R/L18I/I89L/V93I）	SEQ ID NO：35	APTSSSTKKTQLQLEHL I LDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISN L N R I I LELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
mut61 (H16E/V91R)	SEQ ID NO:36	APTSSSTKKTQLQLE E LLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNIN R IVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
mut61.08 (H16E/V91R/Y31V/A73L/H79Q)	SEQ ID NO:37	APTSSSTKKTQLQLE E LLLDLQMILNGINN V KNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNL L QSKNF Q LRPRDLISNIN R IVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
mut61.46 (H16E/V91R/L18I/I89L/V93I)	SEQ ID NO:38	APTSSSTKKTQLQLE E L I LDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISN L N R I I LELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
linker2	SEQ ID NO:10	(표 1 참조)
hFc （C220S/N297G）	SEQ ID NO:11	(표 1 참조)
IL2-linker2-hFc	SEQ ID NO：12	(표 1 참조)
mut7-linker2-hFc （H16E）	SEQ ID NO:39	APTSSSTKKTQLQLE E LLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT GGGGSGGGGSGGGGS EPKS S DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
mut7.08-linker2-hFc （H16E/Y31V/A73L/H79Q）	SEQ ID NO:40	APTSSSTKKTQLQLE E LLLDLQMILNGINN V KNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNL L QSKNF Q LRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT GGGGSGGGGSGGGGS EPKS S DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
mut7.36-linker2-hFc （H16E/R120F）	SEQ ID NO：41	APTSSSTKKTQLQLE E LLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLN F WITFAQSIISTLTG GGGSGGGGSGGGGS EPKS S DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
mut7.39-linker2-hFc （H16E/L18I/V91A/F117W）	SEQ ID NO：42	APTSSSTKKTQLQLE E L I LDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNIN A IVLELKGSETTFMCEYADETATIVE W LNRWITFAQSIISTLT GGGGSGGGGSGGGGS EPKS S DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
mut7.46-linker2-hFc （H16E/L18I/I89L/V93I）	SEQ ID NO：43	APTSSSTKKTQLQLE E L I LDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISN L NV I ILELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT GGGGSGGGGSGGGGS EPKS S DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
mut7.57-linker2-hFc （H16E/G27W/R120F）	SEQ ID NO:44	APTSSSTKKTQLQLE E LLLDLQMILN W INNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLN F WITFAQSIISTLT GGGGSGGGGSGGGGS EPKS S DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
mut7.66-linker2-hFc （H16E/P82L/R120F）	SEQ ID NO：45	APTSSSTKKTQLQLE E LLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLR L RDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLN F WITFAQSIISTLT GGGGSGGGGSGGGGS EPKS S DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
mut8-linker2-hFc （D20A）	SEQ ID NO:46	APTSSSTKKTQLQLEHLLL A LQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT GGGGSGGGGSGGGGS EPKS S DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
mut8.08-linker2-hFc （D20A/Y31V/A73L/H79Q）	SEQ ID NO:47	APTSSSTKKTQLQLEHLLL A LQMILNGINN V KNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNL L QSKNF Q LRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT GGGGSGGGGSGGGGS EPKS S DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
mut8.36-linker2-hFc （D20A/R120F）	SEQ ID NO:48	APTSSSTKKTQLQLEHLLL A LQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLN F WITFAQSIISTLT GGGGSGGGGSGGGGS EPKS S DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
mut11-linker2-hFc （V91R）	SEQ ID NO:49	APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNIN R IVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT GGGGSGGGGSGGGGS EPKS S DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
mut11.08-linker2-hFc （V91R/Y31V/A73L/H79Q）	SEQ ID NO：50	APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINN V KNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNL L QSKNF Q LRPRDLISNIN R IVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT GGGGSGGGGSGGGGS EPKS S DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
mut11.31-linker2-hFc （V91R/Q13L）	SEQ ID NO：51	APTSSSTKKTQL L LEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNIN R IVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT GGGGSGGGGSGGGGS EPKS S DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
mut11.36-linker2-hFc （V91R/R120F）	SEQ ID NO:52	APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNIN R IVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLN F WITFAQSIISTLT GGGGSGGGGSGGGGS EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
mut11.46-linker2-hFc （V91R/L18I/I89L/V93I）	SEQ ID NO：53	APTSSSTKKTQLQLEHLILDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISN L N R I I LELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT GGGGSGGGGSGGGGS EPKS S DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
mut61-linker2-hFc (H16E/V91R)	SEQ ID NO:54	APTSSSTKKTQLQLE E LLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNIN R IVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT GGGGSGGGGSGGGGS EPKS S DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
mut61.08-linker2-hFc (H16E/V91R/Y31V/A73L/H79Q)	SEQ ID NO:55	APTSSSTKKTQLQLE E LLLDLQMILNGINN V KNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNL L QSKNF Q LRPRDLISNIN R IVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT GGGGSGGGGSGGGGS EPKS S DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
mut61.46-linker2-hFc (H16E/V91R/L18I/I89L/V93I)	SEQ ID NO:56	APTSSSTKKTQLQLE E L I LDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISN L N R I I LELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT GGGGSGGGGSGGGGS EPKS S DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

실시예 5 IL-2 돌연변이의 생산 및 정제

HEK293세포(중국 과학원 셀뱅크에서 구입)에 대해 실시예 4에서 구축한 플라스미드(PEI, Polysciences)를 일시적으로 형질감염하고, FreeStyle TM 293 Expression Medium(Gibco에서 구입)을 사용하여 37°C에서 확대 배양하였다. 7일 후 세포 배양액을 수집하고, 세포 성분을 원심 분리로 제거하여, IL-2-hFc융합 단백질을 함유한 배양 상등액을 얻었다.

10 mL의 단백질 A칼럼(Bestchrom에서 구입)으로 세포 배양 상등액 중의 융합 단백질을 정제하였다. 단백질 A칼럼을 먼저 3~5배 칼럼 부피의 평형 완충액(PBS 인산 완충액, pH7.4)으로 평형시킨 후, 맑은 배양 상등액을 단백질 A칼럼에 샘플 로딩하고, 유속을 10 mL/min으로 제어하였다. 샘플 로딩 완료 후 평형 완충액으로 단백질 A칼럼을 세정하고, 평형 완충액의 부피는 단백질 A칼럼 칼럼배드 부피의 3~5배이다. 용리액(0.02 M의 구연산 완충액, 0.1 M의 글리신, 0.1 M의 염화나트륨, pH 3.0)으로 단백질 A칼럼에 결합된 단백질을 용리하고, 핵산 단백질 측정기로 용리 상황(A280자외선 흡수 피크)을 모니터링하였다. 용리된 단백질을 수집하고, 1 M의 아르기닌, 0.4 M의 숙신산, pH 9.0의 완충액을 첨가하여 pH를 중화시킨다. 다음 분자체(Bestchrom에서 구입)를 통과시키고, 완충계는 20 mM의 PB, 200 mM의 염화나트륨이며, pH 6.0-6.5이고, 목적 단백질을 수집하였다. 0.22 μm의 필터로 무균 필터링을 진행하고, 무균 보존하여, 정제된 IL-2 돌연변이 융합 단백질을 얻었다.

정제된 IL-2 돌연변이 융합 단백질(mutXX-linker2-hFc)에 대해 단백질 농도(A280/1.4), SEC 순도 등을 측정하여 분석하고, 정제 후의 IL-2 돌연변이 융합 단백질의 품질은 합격이다. 여기서, 단백질 순도 및 농도의 측정 정보는 표 5를 참조바란다.

IL-2 돌연변이 융합 단백질의 측정 및 분석

돌연변이		단백질 SEC 순도	단백질 농도(mg/mL)
IL2-linker2-hFc		97.25%	1.11
mut7-linker2-hFc		100%	0.97
mut7.08-linker2-hFc		99.84%	1.73
mut7.36-linker2-hFc	99.94%		2.40
mut7.39-linker2-hFc	99.77%		1.16
mut7.46-linker2-hFc	99.90%		1.28
mut7.57-linker2-hFc	99.89%		1.37
mut7.66-linker2-hFc	99.89%		1.92
mut8-linker2-hFc	97.19%		0.98
mut8.08-linker2-hFc	-		0.82
mut8.36-linker2-hFc	-		1.65
mut11-linker2-hFc	99.13%		1.65
mut11.08-linker2-hFc	99.88%		1.29
mut11.31-linker2-hFc	100.00%		1.37
mut11.36-linker2-hFc	99.97%		1.15
mut11.46-linker2-hFc	99.90%		1.52
mut61-linker2-hFc	99.93%		1.36
mut61.08-linker2-hFc	99.99%		1.15
mut61.46-linker2-hFc	99.99%		1.30

실시예 6 IL-2 돌연변이 DSF 측정

Protein Thermal Shift Dye Kit(Applied Biosystems에서 구입, 물품번호 4461146) 중의 완충액을 50×로 희석하여, 실시예 5에서 정제된 IL-2 돌연변이 단백질을 0.5 mg/mL로 희석하고, 염료를 2×농도로 20 μL 반응계에 보충하였다. 균일하게 혼합한 후 8스트립 튜브에 첨가하고, 각각의 샘플을 2개의 중복 웰로 하여, 튜브캡을 닫고, 5-10초간 원심 분리하며, 측정기기(Applied Biosystems 7500)에 놓아 측정하고, Boltzmann 분석법으로 용해 곡선을 분석하여, Tm값을 얻었다. 구체적으로 Tm값은 표 6에 나타낸 바와 같다.

표 6에 나타낸 결과로부터 알 수 있다시피, 실시예 4-5에 나타낸 IL-2 돌연변이체(mutXX-linker2-hFc)는 야생형 IL-2(IL2-linker2-hFc)에 비해, Tm이 모두 5℃이상 향상되고, 그 중 일부분의 IL-2 돌연변이체의 Tm은 9℃ 이상 향상되었으며, 모든 돌연변이체의 열안정성이 모두 현저하게 향상되었다.

예상 밖으로, βγ 서브유닛과 상호 작용이 감쇠된 IL-2 돌연변이체는 야생형 IL-2에 비해, 그 Tm값이 향상되고, 열안정성이 향상되었으며; 그 기초 상에, 추가로 열안정성 돌연변이를 조합한 조합형 돌연변이체는 모두 높은 Tm값을 유지하고, 그 중 열안정 돌연변이가 조합된 일부분의 조합 돌연변이는, 단지 βγ 서브유닛과 상호 작용이 감쇠된 돌연변이에 비해, Tm이 여전히 2℃ 이상 향상되고, 최고 6℃ 이상 향상될 수 있으며, 열안정성이 더욱 향상되었다.

IL-2 돌연변이 DSF 분석

돌연변이	Tm(℃)
IL2-linker2-hFc	45.95
mut7-linker2-hFc	51.08
mut7.08-linker2-hFc	54.70
mut7.36-linker2-hFc	56.95
mut7.57-linker2-hFc	57.54
mut7.66-linker2-hFc	56.64
mut8-linker2-hFc	55.24
mut8.08-linker2-hFc	55.32
mut8.36-linker2-hFc	56.84
mut11-linker2-hFc	56.63
mut11.08-linker2-hFc	58.80
mut11.31-linker2-hFc	59.37
mut11.36-linker2-hFc	57.56
IL2-linker2-hFc	46.74
mut7-linker2-hFc	51.05
mut7.39-linker2-hFc	56.30
mut7.46-linker2-hFc	54.84
mut11-linker2-hFc	57.17
mut11.46-linker2-hFc	57.02
IL-2-linker2-hFc	46.86
mut61-linker2-hFc	56.84
mut61.08-linker2-hFc	57.71
mut61.46-linker2-hFc	56.84

실시예 7 인간 또는 마우스 IL-2수용체를 과발현하는 안정적 형질 감염 세포주의 구축

A. 인간 IL-2수용체 α를 과발현하는 안정적 형질 감염 세포주 구축

인간의 IL-2수용체 α 서브유닛의 아미노산 서열(NCBI 중의 유전자 등록 번호는 P01589이고, 구체적인 서열은 SEQ ID NO: 57로 표시된 바와 같음)을 pLVX-IRES-Puro벡터(unibio에서 구입, 상품번호: VT1464)에 클론하고, 렌티바이러스 패킹을 수행한 후, CHO-K1 세포계(중국 과학원 셀뱅크에서 구입)에 감염시켰다. CHO-K1 세포를 바이러스 감염 72 시간 후, 이미 알려진 IL-2수용체 α 서브유닛 항체(품번 302606, BioLegend에서 구입)로 유세포 분석법을 거쳐 측정검하였다. 형질 감염된 세포가 인간 IL-2수용체 α 서브유닛을 발현하기 시작하는 것이 확인되면, Puromycin(Gibco에서 구입)을 첨가하여 스크리닝하고, 세포 회복 후 한계 희석법으로 96웰 배양 플레이트에서 서브클론을 진행하며, 37℃, 5% (v/v)CO₂조건 하에 놓아 배양하고, 약 2주 후 일부 단일클론 웰을 선택하여 6웰 플레이트에 증폭시켰다. 증폭된 클론에 대해 다시 이미 알려진 IL-2수용체 α 서브유닛 항체를 사용하여 유세포 분석법을 거쳐 스크리닝하였다. 성장 추세가 양호하고, 형광 강도가 비교적 높은 단일클론 세포계를 선택하여 계속 확대 배양하고, 유세포 분석법으로 다시 중복 측정한 후 액체 질소로 냉동 보관하여, 인간 IL-2수용체 α 서브유닛을 발현하는 안정적 형질 감염 세포주를 얻었다. 구체적인 선택 결과는 표 7 및 도 1에 나타낸 바와 같고, 표 7에서 양성 세포(%)는 전체 세포수에서 양성 세포가 차지하는 백분율을 의미한다. 표 7은 일련의 IL-2수용체 α 서브유닛 과발현 CHO-K1 세포계를 제조하여 얻은 것을 설명한다.

인간 IL-2수용체 α 발현 CHO-K1세포 FACS 스크리닝 측정 결과

순번	형질 감염 세포 클론 번호	IL-2수용체 α 항체		IgG서브타입 대조
순번	형질 감염 세포 클론 번호	양성 세포(％)	평균 형광 강도	양성 세포(％)	평균 형광 강도
1	CHO-K1 hIL-2Rα 1A6	100.00	38168	-	-
2	CHO-K1 hIL-2Rα 2D2	100.00	21817	-	-
3	CHO-K1 hIL-2Rα 2D5	100.00	18111	-	-
4	CHO-K1 hIL-2Rα 2B8	99.80	19018	0.04	80.70

B. 인간 IL-2수용체 β를 과발현하는 안정적 형질 감염 세포주 구축

인간의 IL-2수용체 β 서브유닛의 아미노산 서열(NCBI 중의 유전자 등록 번호는 P14784이고, 구체적인 서열은 SEQ ID NO: 58로 표시된 바와 같음)을 pLVX-IRES-Puro벡터(unibio에서 구입하고 상품번호는: VT1464)에 클론하고, 렌티바이러스 패킹을 수행한 후, CHO-K1세포계(중국 과학원 셀뱅크에서 구입)를 감염시켰다. CHO-K1 세포를 바이러스 감염 72 시간 후, 이미 알려진 IL-2수용체 β 서브유닛 항체(품번 339010, BioLegend에서 구입)로 유세포 분석법을 거쳐 측정하였다. 형질감염된 세포가 인간 IL-2수용체 β 서브유닛을 발현하기 시작하는 것이 확인되면, Puromycin(Gibco에서 구입)을 첨가하여 스크리닝하고, 세포 회복 후 한계 희석법으로 96웰 배양 플레이트에서 서브클론을 진행하며, 37℃, 5% (v/v)CO₂조건 하에 놓아 배양하고, 약 2주 후 일부 단일클론웰을 선택하여 6웰 플레이트에 증폭시켰다. 증폭된 클론에 대해 다시 이미 알려진 IL-2수용체 β 서브유닛 항체를 사용하여 유세포 분석법을 거쳐 스크리닝한다. 성장 추세가 양호하고, 형광 강도가 비교적 높은 단일클론 세포계를 선택하여 계속 확대 배양하고, 유세포 분석법으로 다시 중복 측정한 후 액체 질소로 냉동 보관하여, 인간 IL-2수용체 β 서브유닛을 발현하는 안정적 형질 감염 세포주를 얻었다. 구체적인 선택 결과는 표 8 및 도 2에 나타낸 바와 같고, 표 8 중 양성 세포(%)는 전체 세포수에서 양성 세포가 차지하는 백분율을 의미한다. 표 8은 일련의 IL-2수용체 β 서브유닛 과발현 CHO-K1세포계를 제조하여 얻은 것을 설명한다.

인간 IL-2수용체 β 발현 CHO-K1세포 FACS 스크리닝 측정 결과

순번	형질 감염 세포 클론 번호	IL-2수용체 β 항체		IgG서브타입 대조
순번	형질 감염 세포 클론 번호	양성 세포(％)	평균 형광 강도	양성 세포(％)	평균 형광 강도
1	CHO-K1 ML-2Rβ 2A5	100.00	7905	-	-
2	CHO-K1 hIL-2Rβ 2B3	99.40	5081	0.03	41.50
3	CHO-K1 hIL-2Rβ 2H4	99.40	1226	-	-

C. 인간 IL-2수용체 βγ를 과발현하는 안정적 형질 감염 세포주 구축

인간의 IL-2수용체 γ 서브유닛의 아미노산 서열(NCBI 중의 유전자 등록 번호는 P31785이고, 구체적인 서열은 SEQ ID NO: 59로 표시된 바와 같음)을 pLVX-IRES-Hygro벡터에 클론하고, 렌티바이러스 패킹을 수행한 후, CHO-K1 IL2수용체 β 서브유닛 세포계 과발현 세포계(CHO-K1 hIL-2Rβ2A5)를 감염시켰다. CHO-K1 세포를 바이러스 감염 72 시간 후, 이미 알려진 IL-2수용체 β, γ 서브유닛 항체(품번 339010, 338608, BioLegend에서 구입)로 유세포 분석법을 거쳐 측정하였다. 형질감염된 세포가 인간 IL-2수용체 βγ 서브유닛을 발현하기 시작하는 것이 확인되면, Puromycin, Hygromycin(Gibco에서 구입, Thermo)을 첨가하여 스크리닝하고, 세포 회복 후 한계 희석법으로 96웰 배양 플레이트에서 서브클론을 진행하며, 37°C, 5% (v/v)CO₂조건 하에 놓아 배양하고, 약 2주 후 일부 단일클론웰을 선택하여 6웰 플레이트에 증폭시켰다. 증폭된 클론에 대해 다시 이미 알려진 IL-2수용체 β, γ 서브유닛 항체를 사용하여 유세포 분석법을 거쳐 스크리닝하였다. 성장 추세가 양호하고, 형광 강도가 비교적 높은 단일클론 세포계를 선택하여 계속 확대 배양하고, 유세포 분석법으로 다시 중복 측정한 후 액체 질소로 냉동 보관하여, 인간 IL-2수용체 βγ 서브유닛을 발현하는 안정적 형질 감염 세포주를 얻었다. 구체적인 선택 결과는 표 9 및 도 3A-도 3B에 나타낸 바와 같고, 표 9에서 양성 세포(%)는 전체 세포수에서 양성 세포가 차지하는 백분율을 의미한다. 표 9는 일련의 IL-2수용체 βγ 서브유닛 과발현 CHO-K1세포계를 제조하여 얻은 것을 설명한다.

인간 IL-2수용체 βγ 발현 CHO-K1세포 FACS 스크리닝 측정 결과

순번	형질 감염 세포 클론 번호	IL-2수용체 β 항체		IgG서브타입 대조		IL-2수용체 γ 항체		IgG서브타입 대조
순번	형질 감염 세포 클론 번호	양성 세포(%)	평균 형광 강도	양성 세포(%)	평균 형광 강도	양성 세포(%)	평균 형광 강도	양성 세포(%)	평균 형광 강도
1	CHO-K1 IL-2Rβγ 2D3	100.00	4569	0.65	115	98.90	8932	23.30	1070
2	CHO-K1 hIL-2Rβγ 2C11	99.70	2111	-	-	99.00	31664	-	-
3	CHO-K1 IL-2Rβγ 2E6	100.00	2909	-	-	98.80	11764	-	-

D. 인간 IL-2수용체 αβγ를 과발현하는 안정적 형질 감염 세포주 구축

인간 IL-2수용체 α 서브유닛의 아미노산 서열을 pLVX-IRES-zsGreen벡터에 클론하고, 렌티바이러스 패킹을 수행한 후, IL-2수용체 βγ 서브유닛 과발현 CHO-K1세포계를 감염시켰다. CHO-K1 세포를 바이러스 감염 72 시간 후, 이미 알려진 IL-2수용체 α, β, γ 서브유닛 항체(위와 동일, BioLegend에서 구입)로 유세포 분석법을 거쳐 측정하였다. 형질감염된 세포가 인간 IL-2수용체 αβγ 서브유닛을 발현하기 시작하는 것이 확인되면, Puromycin, Hygromycin(Gibco, Thermo에서 구입), GFP를 첨가하여 형광 발현하여 스크리닝하며, 세포 회복 후 한계 희석법으로 96웰 배양 플레이트에서 서브클론을 진행하고, 37℃, 5% (v/v)CO₂조건 하에 놓아 배양하며, 약 2주 후 일부 단일클론웰을 선택하여 6웰 플레이트에 증폭시켰다. 증폭된 클론에 대해 다시 이미 알려진 IL-2수용체 α, β, γ 서브유닛 항체를 사용하여 유세포 분석법을 거쳐 스크리닝한다. 성장 추세가 양호하고, 형광 강도가 비교적 높은 단일클론 세포계를 선택하여 계속 확대 배양하고, 유세포 분석법으로 다시 중복 측정한 후 액체 질소로 냉동 보관하여, 인간 IL-2수용체 αβγ 서브유닛을 발현하는 안정적 형질 감염 세포주를 얻었다. 구체적인 선택 결과는 표 10 및 도 4A-도 4C에 나타낸 바와 같고, 표 10에서 양성 세포(%)는 전체 세포수에서 양성 세포가 차지하는 백분율을 의미한다. 표 10은 일련의 IL-2수용체 αβγ 서브유닛 과발현 CHO-K1세포계를 제조하여 얻은 것을 설명한다.

인간 IL-2수용체 αβγ 발현 CHO-K1세포 FACS 스크리닝 측정 결과

순번	형질 감염 세포 클론 번호	IL-2수용체 α 항체		IL-2수용체 β 항체		IL-2수용체 γ 항체
순번	형질 감염 세포 클론 번호	양성 세포(%)	평균 형광 강도	양성 세포(%)	평균 형광 강도	양성 세포(%)	평균 형광 강도
1	CHO-K1 hIL-2Rαβγ 1E3	99.90	10667	100.00	3002	99.90	14863
2	CHO-K1 hIL-2Rαβγ 2D6	99.90	5265	99.90	1324	99.80	2575
3	CHO-K1 hIL-2Rαβγ 1A10	100.00	12255	88.60	465	99.60	4106

실시예 7A-D 안정적 형질 감염 세포주 구축에 사용되는 유전자 명칭 및 그 코딩 단백질 서열 정보

유전자	서열 번호	서열 정보
hIL2Rα	SEQ ID NO：57	MDSYLLMWGLLTFIMVPGCQAELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEMETSQFPGEEKPQASPEGRPESETSCLVTTTDFQIQTEMAATMETSIFTTEYQVAVAGCVFLLISVLLLSGLTWQRRQRKSRRTI
hIL2Rβ	SEQ ID NO：58	MAAPALSWRLPLLILLLPLATSWASAAVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISWEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDTIPWLGHLLVGLSGAFGFIILVYLLINCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV
hIL2Rγ	SEQ ID NO：59	MLKPSLPFTSLLFLQLPLLGVGLNTTILTPNGNEDTTADFFLTTMPTDSLSVSTLPLPEVQCFVFNVEYMNCTWNSSSEPQPTNLTLHYWYKNSDNDKVQKCSHYLFSEEITSGCQLQKKEIHLYQTFVVQLQDPREPRRQATQMLKLQNLVIPWAPENLTLHKLSESQLELNWNNRFLNHCLEHLVQYRTDWDHSWTEQSVDYRHKFSLPSVDGQKRYTFRVRSRFNPLCGSAQHWSEWSHPIHWGSNTSKENPFLFALEAVVISVGSMGLIISLLCVYFWLERTMPRIPTLKNLEDLVTEYHGNFSAWSGVSKGLAESLQPDYSERLCLVSEIPPKGGALGEGPGASPCNQHSPYWAPPCYTLKPET

실시예 8 유세포 실험(FACS)으로 IL-2 돌연변이와 수용체 발현 세포의 결합을 측정

CHO-K1 IL2수용체 αβγ 또는 CHO-K1 IL2수용체 βγ세포(CHO-K1 hIL-2R αβγ 2D6, CHO-K1 hIL-2R βγ 2E6)를 T-75세포 배양 플라스크에서 90% 컨플루언스(confluence)로 확대 배양하였다. 배지를 제거하고, PBS완충액(Hyclone에서 구입하고, 상품번호는 SH30256.01임)으로 한 번 세척한 후, 2 mL의 0.25% EDTA를 함유한 판크레아틴(Invitrogen에서 구입하고, 상품번호는 25200072임)으로 세포를 2-3분간 처리하며, 8 mL의 10% (w/w)소태아혈청(Gibco에서 구입하고, 상품번호는 10099-141C임)을 함유하는 DMEM/F-12(Gibco에서 구입하고, 상품번호는 12634-010임)를 첨가하여 중화시키고, 피펫으로 3-4 회 불며, 불어 흩어진 세포를 15 mL의 원심관에 수집하여, 세포 계수를 진행한 후, 실온 조건 하에서 1000 rpm으로 5분간 원심 분리하고, 배지를 버렸다. 세포를 2% (w/w)소태아혈청을 함유하는 RPMI-1640(Gibco에서 구입하고, 상품번호는 A10491-01임)으로 재부유시키고 미리리터당 1.43 × 10⁶개 세포로 희석하며, 70 μL/웰로 U자형 바닥 96웰 FACS 반응 플레이트에 첨가하고, 4°C 또는 얼음 위에 놓아 준비하였다. 2% (w/w)소태아혈청을 함유하는 RPMI-1640으로 측정될 IL-2 돌연변이를 희석하고, 30 μL/웰로 세포에 넣어 균일하게 혼합하여, 얼음 위에서 1시간 배양한다. FACS 완충액[2% (w/w)소혈청 단백질을 함유하는 PBS 완충액]으로 2회 원심 분리 세척하고, 100 μL/웰로 형광 표지된 이차 항체(Biolegend에서 구입하고, 상품번호는 409306임)를 첨가하며, 얼음 위에서 30분간 배양하였다. FACS 완충액으로 2차례 원심 분리 세척하였다. FACS(FACS Canto II, BD사에서 구입)으로 측정 및 결과를 분석하였다. 또는 100 μL의 2% (w/w)파라포름알데히드(DingGuo에서 구입하고, 상품번호는 AR-0211임)를 함유하는 FACS 완충액으로 세포를 현탁시켜, 기기에서 측정하기 전까지 4°C에서 보관하고, 측정 전 각 웰에 100 μl의 PBS완충액을 첨가하여, FACS로 측정하고 결과를 분석하였다. 결과는 도 5A-도 5D 및 표 12-13에 나타낸 바와 같다. 결과는 IL-2 돌연변이가 세포 표면의 인간 IL2수용체 αβγ 삼량체와 결합할 수 있음을 보여준다. IL-2 돌연변이와 세포 표면의 인간 IL2수용체 βγ 이량체의 결합 활성은 야생형에 비해 약하고, 여기서, mut61-linker2-hFc, mut61.08-linker2-hFc 및 mut61.46-linker2-hFc와 CHO-K1 IL2Rβγ 이량체의 결합 활성은 크게 억제된다. 표에서 데이터 MFI는 측정된 세포군의 평균 형광 강도값이다.

FACS로 IL-2 돌연변이와 CHO-K1 IL2수용체 αβγ 재조합 세포를 측정(CHO-K1 IL2Rαβγ)의 결합 활성

단백질 농도 (nM)	23.529	4.7059	0.9412	0.1882	0.0376	0.0075	0.0015	0.0003
IL2-linker2-hFc (MFI)	25072	22623	22295	9026	1728	457	161	251
mut7.36-linker2-hFc (MFI)	23892	19565	18132	9608	2416	570	272	171
mut11.08-linker2-hFc (MFI)	22230	17370	14857	8713	2736	621	268	251
mut61-linker2-hFc (MFI)	23858	18259	16403	9188	2307	544	224	194
mut61.08-linker2-hFc (MFI)	22558	19652	18992	9557	2131	575	303	190
mut61.46-linker2-hFc (MFI)	24244	19701	19386	10124	2384	521	280	186
단백질 농도 (nM)	26.667	5.3333	1.0667	0.2133	0.0427	0.0085	0.0017	0.0003
인간 IgG대조 (MFI)	118	124	157	181	274	119	120	146

단백질 농도 (nM)	23.529	4.7059	0.9412	0.1882	0.0376	0.0075	0.0015	0.0003
IL2-linker2-hFc (MFI)	17021	16362	15503	9402	1983	423	188	156
mut7.66-linker2-hFc (MFI)	15503	11604	9659	7683	2485	568	227	177
mut11.31-linker2-hFc (MFI)	13449	10906	9502	7521	2181	553	214	172
단백질 농도 (nM)	26.667	5.3333	L0667	0.2133	0.0427	0.0085	0.0017	0.0003
인간 IgG대조 (MFI)	187	136	138	139	144	145	140	146

FACS로 IL-2 돌연변이와 CHO-K1 IL2수용체 βγ 재조합 세포를 측정(CHO-K1 IL2Rβγ)의 결합 활성

단백질 농도 (nM)	117.65	39.216	13.072	4.357	1.452	0484	0.161	0.054
IL2-linker2-hFc (MFI)	1210	1226	1162	980	904	603	325	191
mut7.36-linker2-hFc (MFI)	615	438	318	250	210	165	156	153
mut11 08-linker2-hFc(MFI)	854	645	447	342	232	178	160	144
mut61 -linker2-hFc(MFI)	169	155	142	142	145	146	148	142
mut61.08-linker2-hFc (MFI)	164	163	144	144	157	144	146	141
mut61.46-linker2-hFc (MFI)	148	159	132	131	134	133	136	134
단백질 농도 (nM)	133.33	44.444	14.815	4.938	1.646	0.549	0.183	0.061
인간 IgG대조 (MFI)	130	130	136	134	139	141	141	146

단백질 농도 (nM)	117.65	39.216	13.072	4.357	1.452	0.484	0.161	0.054
IL2-linker2-hFc (MFI)	2694	2703	2518	2170	1729	831	363	177
mut7.66-linker2-hFc (MFI)	905	597	357	216	157	136	124	118
mut11.31-linker2-hFc (MFI)	1320	950	560	285	180	134	121	115
단백질 농도 (nM)	133.33	44.444	14.815	4.938	1.646	0.549	0.183	0.061
인간 IgG대조 (MFI)	259	100	101	107	101	102	104	109

실시예 9 STAT5인산화 실험으로 IL-2 돌연변이가 상이한 세포에 대한 신호 경로 활성화 작용을 측정

냉동된 PBMC(Allcells에서 구입)를 소생시켜, 각 웰에 50 μl의 5 x 10⁵개의 세포 PBMC 및 50 μl의 IL-2 돌연변이 단백질을 첨가하여, 이산화탄소 인큐베이터에서 15분간 반응시켰다. 반응 완료 후, 각 웰에 100 μl의 예냉 DPBS를 첨가하여 반응을 종료하고, 원심 분리 후 각각 Livedead Violet 염색(Invitrogen-L34964)을 진행하며, Fix I(BD-557870)를 37℃에서 10분간 고정시키고, PermIII(BD-558050) 얼음 위에서 30분간 막파열을 수행하였다. CD3-AF700(BD-557943), CD4-PerCP cy5.5(BD-560650), CD8-FTIC(BD-555366), CD25-PE(BD-557138), FoxP3-AF647(BD-560045), pSTAT5-PE Cy7(Invitrogen-25-9010-42)로 실온에서 1시간 염색하고, 두 번 세척한 후 기기에서 측정하였다. 결과는 도 6A-도 6I 및 표 14-16에 나타낸 바와 같다. 결과로부터 알 수 있다시피, 야생형 IL-2에 비해, IL-2 돌연변이가 Treg 세포내 STAT5인산화를 활성화시키는 수준이 비슷하나, CD4⁺CD25^-FoxP3^-T세포 또는 CD8⁺T세포 내의 STAT5 인산화를 활성화시키는 수준은 현저히 낮아진다. 여기서 표에서의 데이터 MFI는 측정된 세포군 내 STAT5 인산화의 평균 형광 강도값이다.

FACS로 IL-2 돌연변이의 Treg STAT5 인산화 신호 활성화를 측정

단백질 농도(pM)	10000	1000	100	10	1	0.1	0.01
IL2-linker2-hFc(MFI)	3706	3498	3607	3440	2554	680	662
mut7.36-linker2-hFc(MFI)	3463	3498	3498	3139	1250	735	522
IL2-linker2-hFc(MFI)	3371	3451	3382	3619	1909	464	415
mut11.08-linker2-hFc(MFI)	3451	3440	3668	3558	1365	462	366
IL2-linker2-hFc(MFI)	3807	3731	3706	3833	1955	561	467
mut7.66-linker2-hFc(MFI)	3718	3743	3280	2323	668	544	419
mut11.31-linker2-hFc(MFI)	3570	3522	3428	2149	680	465	473

FACS로 IL-2 돌연변이의 CD4⁺CD25^-FoxP3^-T세포STAT5 인산화 신호 활성화 측정

단백질 농도(pM)	10000	1000	100	10	1	0.1
IL2-linker2-hFc(MFI)	1601	1370	1130	612	377	333
mut7.36-linker2-hFc(MFI)	527	473	388	371	368	336
IL2-linker2-hFc(MFI)	1111	960	833	485	362	370
mut11.08-linker2-hFc(MFI)	718	584	496	382	355	354
IL2-linker2-hFc(MFI)	1532	1361	1205	789	529	501
mut7.66-linker2-hFc(MFI)	592	564	481	496	496	501
mut11.31-linker2-hFc(MFI)	612	582	557	481	481	467

FACS로 IL-2 돌연변이의 CD8+T세포STAT5 인산화 신호 활성화 측정

단백질 농도(pM)	10000	1000	100	10	1	0.1
IL2-linker2-hFc(MFI)	973	413	274	221	233	239
mut7.36-linker2-hFc(MFI)	270	264	245	247	259	236
IL2-linker2-hFc(MFI)	758	381	321	260	270	288
mut11.08-linker2-hFc(MFI)	336	295	296	281	286	294
IL2-linker2-hFc(MFI)	910	481	372	361	344	339
mut7.66-linker2-hFc(MFI)	326	344	319	331	343	346
mut11.31-linker2-hFc(MFI)	311	324	346	327	326	317

실시예 10 T세포 증식 수준에 대한 IL-2 돌연변이의 조절 작용

냉동된 PBMC를 소생시켜, 세포를 10% FBS(Gibco에서 구입하고 상품번호는 10099-141C임)를 함유하는 RPMI-1640(Gibco에서 구입하고, 상품번호는 A10491-01임)에 재부유시키고, 100 ng/ml의 CD3항체(BD에서 구입하고 상품번호는 566685)가 미리 코팅되어 있는 6웰 플레이트에 첨가하여 2일간 배양하였다. 세포를 수집하여, PBS완충액(Hyclone에서 구입하고, 상품번호는 SH30256.01임)으로 세 번 세척하고, RPMI-1640에 10% FBS를 첨가한 배지에 재부유시키고, 6웰 플레이트에서 5일간 배양하였다. 세포를 수집하여, PBS완충액으로 한 번 세척하고, Celltrace Violet(Invitrogen에서 구입하고, 상품번호는 C34557임)로 염색하며, 배지를 첨가하여 한 번 세척하고, 배지로 재부유시키며, 24웰 플레이트의 각 웰에 900ul의 세포를 첨가하고, 100 μl의 IL2 돌연변이 단백질 샘플을 첨가하여, 7일간 배양하였다. 세포를 수집하여, 1% BSA(Sangon Biotech에서 구입하고, 상품번호는 A500023-0100임)를 함유하는 PBS(Sangon Biotech에서 구입하고, 상품번호는 B548117-0500임)로 재부유시키고, 세포를 96웰 플레이트에 첨가하였다.

BV605-CD8(Biolengend에서 구입하고 상품번호는 344742임)로 실내에서 30분간 염색하고, 1% BSA를 함유하는 PBS로 세척하였다. 각 웰에 200 μl의 고정액(eBioscience에서 구입하고, 상품번호는 00-5523-00임)을 첨가하고, 4°C에서 반시간 동안 고정시킨 후, 1% BSA를 함유하는 PBS로 세척하며, 각 웰에 200 μl의 막파열액액(eBioscience에서 구입하고 상품번호는 00-5523-00임)을 첨가하여, 4°C에서 반시간 동안 막파열 후, 1% BSA의 PBS로 세척하였다. 항체 APC-CY7-CD3(Biolengend에서 구입하고, 상품번호는 344818임), CD25 항체(Biolengend에서 구입하고, 상품번호는 302606임), Foxp3 항체(ThermoFisher#17-4777-42에서 구입)를 첨가하고, 실온에서 반시간 동안 염색하였다. 1% BSA를 함유하는 PBS로 세척하고, 샘플을 200 μl의 1% BSA를 함유하는 PBS에 재부유시키며, FACS(FACS Canto II, BD사에서 구입)로 측정하고 결과를 분석하였다. 결과는 도 7A-7F 및 표 17-19에 도시된 바와 같다. 결과로부터 알 수 있다시피, 야생형 IL-2에 비해, IL-2 돌연변이가 Treg 세포의 증식 수준에 대한 영향은 비슷하나, CD4⁺CD25^-FoxP3^-T세포 또는 CD8⁺CD25^-T세포세포의 증식 수준에 대한 영향은 다소 낮다. 여기서 표에서의 데이터 MFI는 측정한 세포군 Celltrace Violet의 평균 형광 강도값이고, 증식 후 세포내 Celltrace Violet의 평균 형광 강도값이 낮아지며, 즉, 동일한 측정 시간 내에, 세포 증식이 빠르고, 배가수가 더 많을수록, 측정된 형광 강도 평균값이 더욱 낮다.

FACS로 IL-2 돌연변이의 Treg세포 증식 활성화 측정

단백질 농도(nM)	10	1	0.1	0.01	0.001	0.0001	0.00001
IL2-linker2-hFc(MFI)	1995	1670	2857	3362	3624	3863	4518
mut7.36-linker2-hFc(MFI)	1823	1407	2070	3162	3555	4077	4389
mut7.66-linker2-hFc(MFI)	1583	1437	2068	3384	4392	4027	4887
IL2-linker2-hFc(MFI)	1807	1838	2651	3319	3459	3691	4758
mut11.08-linker2-hFc(MFI)	1633	1536	1884	2371	2930	3369	3953
mut11.31-linker2-hFc(MFI)	1735	1855	1985	2669	2626	3379	4323

FACS로 IL-2 돌연변이의 CD4⁺CD25^-FoxP3^-T세포 증식 활성화 측정

단백질 농도(nM)	10	1	0.1	0.01	0.001	0.0001	0.00001
IL2-linker2-hFc(MFI)	1653	2058	2216	3198	4578	5274	5602
mut7.36-linker2-hFc(MFI)	2361	2372	3317	4169	4971	5319	5815
mut7.66-linker2-hFc(MFI)	2258	2524	3160	4633	5374	5495	6022
IL2-linker2-hFc(MFI)	1679	1838	2055	2728	3997	4826	5314
mut11.08-linker2-hFc(MFI)	2254	2166	2538	3372	4154	5072	5391
mut11.31-linker2-hFc(MFI)	2332	2559	2885	3878	4779	5284	5509

FACS로 IL-2 돌연변이의 CD8⁺CD25^-T세포 증식 활성화 측정

단백질 농도(nM)	10	1	0.1	0.01	0.001	0.0001	0.00001
IL2-linker2-hFc(MFI)	1128	1422	1696	3303	4907	5767	6303
mut7.36-linker2-hFc(MFI)	1955	1921	2640	3732	4917	5562	6179
mut7.66-linker2-hFc(MFI)	1820	1983	2683	4038	5539	5553	6617
IL2-linker2-hFc(MFI)	1064	1236	1435	2497	4087	5010	5715
mut11.08-linker2-hFc(MFI)	1876	1682	1956	2965	4124	5195	5567
mut11.31-linker2-hFc(MFI)	1750	1945	2252	3463	4610	5406	5583

실시예 11 NK세포 증식 수준에 대한 IL-2 돌연변이의 조절 작용

NK 분리 키트(Miltenyi Biotec에서 구입하고 상품번호는 130-092-657임)로 NK세포를 분리하고 계수하며, MEM배지(Gibco에서 구입하고 상품번호는 12634-010임)에 재부유시키고, 배지에 25% 소혈청(Gibco에서 구입하고 상품번호는 10099-141C임), 0.2 mM의 이노시톨(Sigma Aldrich에서 구입하고 상품번호는 I7508-50G임), 0.1 mM의 β-메르캅토에탄올(Sigma Aldrich에서 구입하고 상품번호는 M3148-100 ML임), 0.02 mM의 엽산(Sigma Aldrich에서 구입하고 상품번호는 F8758-5G임)을 함유한다. 세포를 96웰 플레이트에 접종하고, 각 웰에 Fc blocker(Biolengend에서 구입하고 상품번호는 422302임)를 첨가하며, IL2 돌연변이 단백질을 더 첨가하여 3일간 배양하였다. 마지막 18시간에 BrdU(Biolengend에서 구입하고 상품번호는 423401임)를 첨가하였다. 세포를 수집하여, 1% BSA의 PBS로 세척하고 재부유시키며, 동일 부피의 4% 파라포름알데히드(DingGuo에서 구입하고 상품번호는 AR-0211임)로 실온에서 30분간 고정시키고, 1% BSA의 PBS로 세척하며, 0.5% Triton-X100(ThermoFisher에서 구입하고 상품번호는 HFH10임)으로 실온에서 15분간 막파열하고, 1% BSA의 PBS로 세척하며, DnaseI(Sigma Aldrich에서 구입하고 상품번호는 D4513-1VL임)을 첨가하여 37℃에서 1시간 소화시켰다. 1% BSA의 PBS로 세척하고 재부유시키며, APC 항-BrdU항체(Biolengend에서 구입하고 상품번호는 339808임)를 첨가하여 실온에서 20분간 염색하고, 1% BSA의 PBS로 세척하며, 샘플을 200 μl의 1% BSA의 PBS에 재부유시키고, FACS(FACS Canto II, BD사에서 구입)로 측정 및 결과를 분석하였다. 결과는 도 8 및 표 20에 나타낸 바와 같다. 결과로부터 알 수 있다시피 야생형 IL-2에 비해, IL-2 돌연변이의 NK세포의 증식 수준이 현저히 낮아졌다. 여기서 표에서의 데이터는 측정된 NK세포군 BrdU양성 세포 비율이다.

FACS로 IL-2 돌연변이의 NK세포 증식 활성화 측정

단백질 농도(nM)	100.00	33.33	11.11	3.70	1.23	0.41	0.14	0.05
IL2-linker2-hFc (APC+%)	13.9	12.0	12.9	14.3	11.4	8.5	9.1	4.0
mut7.36-linker2-hFc (APC+%)	7.7	5.6	7.0	4.6	4.8	3.2	3.5	3.6
mut7.66-linker2-hFc (APC+%)	2.6	5.3	3.9	5.6	5.6	3.8	4.3	3.8
mut11.08-linker2-hFc (APC+%)	9.1	12.3	7.2	5.3	6.3	4.8	4.2	3.2

실시예 12 야생형 마우스에게 피하 투여한 PD(약력학) 결과

Balb/c마우스 (암컷, 6-8주령, Charles River에서 구입)를 사용하였다. Fc-linker-IL2_V91K, mut11.08-linker2-hFc단백질을 PBS로 희석하여, 마우스 배부에 피하 투여하고, 투여 부피가 200 μL/마리이며, 그 후 상이한 시점에 마우스의 전혈 및 비장 샘플을 취해 FACS 측정에 사용하였다. Fc-linker-IL2_V91K서열은 SEQ ID NO: 60으로 표시된 바와 같고, 정제 방법은 실시예 2를 참조바란다.

(SEQ ID NO:60)

PKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINKIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT

2 mL의 EDTA/2K 항응고 튜브(Xinkang Medical, 상품번호는 X424임)에 마우스 전혈을 수집하고, 혈액 샘플 및 항응고제가 충분히 접촉하도록 상하로 균일하게 혼합하였다. 300 μL의 전혈을 FACS 튜브에 옮기고, 각 튜브에 항체를 염색하는 혼합액을 첨가하며, 실온, 어두운 곳에서 20분간 인큐베이션하였다. 그 후 튜브에 적혈구 용해액을 1 mL/샘플(Hybri-Max, 상품번호 R7757-100 mL)씩 첨가하고, 실온, 어두운 곳에서 5분간 정치하면, 플록이 나타나며, 20℃, 400 g으로 6분간 원심 분리하여, 상등액을 버리고, 세포를 흩어뜨렸다. 적혈구 용해를 반복하였다. 세포 세척: PBS 4 mL/샘플로 세포를 재부유시키고, 4℃, 500 g으로 6분간 원심 분리하여, 상등액을 버리고, 세포를 흩어뜨렸다. 고정액을 첨가하되, 500 μL/튜브씩 한방울씩 첨가하고, (방울씩 첨가할 때마다 진동)매번 첨가 후 간헐적으로 FACS 튜브를 진동시키며, 4℃에서 한시간 고정시키거나 밤새 고정시켰다.

마우스 비장을 취해, 70 μm의 세포 여과망에서 밀링하고(Falcon Corning, 상품번호 352350), 500 g으로 원심 분리하며, 각 비장에 3 mL의 적혈구 용해액을 첨가하고, 5분간 용해시키며, 20 mL의 PBS을 첨가하여 용해를 종료하고, 500 g으로 5분간 원심 분리하며, 5 mL의 PBS를 첨가하여 세포를 재부유시키고, 70 μm의 셀 스트레이너(cell strainer)로 거른다. 세포를 계수하고, 각 FACS 튜브에 1 × 10⁶개의 세포를 첨가하였다. Fc blocker를 5 μL/튜브(Biolengend, 상품번호 156603)씩 첨가하고, 와류 진탕기에서 진탕하며, 4°C에서 20분간 인큐베이션하되, 10분마다 한 번씩 진탕하였다. 4 mL/튜브씩 FACS 세척액(PBS+1% BSA)을 첨가하고, 4℃에서 400 g으로 6분간 원심 분리하였다. 상등액을 버리고, 흡수지로 튜브 입구 수분을 흡수하였다. 항-마우스 CD3e(BD Bioscience, 상품번호 740014), 항-마우스 CD4(BD Bioscience, 상품번호 553407), 항-마우스 CD25(Biolengend, 상품번호 102008)를 첨가하고, 한 번 진탕하며, 4℃에서 20분간 인큐베이션하되, 10분마다 한 번씩 진탕하였다. 4 mL/튜브씩 FACS 세척액을 첨가하고, 4℃, 400 g으로 6분간 원심 분리하였다. 상등액을 버리고, 흡수지로 튜브 입구 수분을 흡수하였다. 한 번 진탕한 후, 고정액을 첨가하되, 500 μL/튜브씩 한방울씩 첨가하고, (방울씩 첨가할 때마다 진동)매번 첨가 후 간헐적으로 FACS 튜브를 진동시키며, 4℃에서 한시간 고정시키거나 밤새 고정시켰다.

고정액: Set3901(eBioscience, 상품번호 00-5523-00) 중 Fixation/Permeabilization Concentrate 1부, Fixation/Permeabilization Diluent 3부, 1 : 3으로 고정액을 혼합 배합하였다.

Permeabilization buffer1부 + 9부 dd H₂O로 핵투과액을 배합하고, 진탕하여 균일하게 혼합하였다. 2 mL/튜브씩, 4℃에서 500 g으로 6분간 원심 분리하고, 상등액을 버리며, 튜브 입구 수분을 흡수하였다. 반복하여 핵투과액을 3 mL/튜브로씩 첨가하였다. Foxp3 항체(eBioscience, 상품번호 25-5773-82)를 10 μL/튜브씩 추가하고, 4°C에서 40분, 20분마다 한 번씩 진탕하였다. 4 mL/튜브싹 FACS 세척액을 첨가하고, 4℃에서 500 g으로 6분간 원심 분리하였다. 상등액을 버리고, 흡수지로 튜브 입구 수분을 흡수하였다. 한 번 진탕한 후, FACS 세척액을 100 μL/튜브씩 첨가하고, 재부유시켜 기기에 투입하였다. 각 그룹 동물 Treg(CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺), CD4⁺CD25^-Foxp3^-, CD3⁺CD4^-T세포 점유율은 모두 평균값 ± 표준차(Mean ± SEM)로 나타내고, Graphpad Prism5 소프트웨어로 작도하여 분석하였다.

실험 결과는 도 9A-도 9C, 도 10A-10C에 나타낸 바와 같고, 1 mpk로 1회 피하 투여하며, mut11.08-linker2-hFc는 마우스 비장 및 말초 혈액 Treg 점유율을 현저하게 향상시키고, CD4⁺CD25^-Foxp3^-T세포 점유율이 저하되며, CD3⁺CD4^-T세포 변화는 현저하지 않다. mut11.08-linker2-hFc 표현은 Fc-linker-IL2_V91K보다 우수하다.

실시예 13 야생형 마우스 DTH(delayed-type hypersensitivity)모델

감작 단계 3 mg/mL의 KLH(Sigma, 상품번호 H7017-50 mg): IFA(Sigma, 상품번호 F5506-10 mL): CFA(Sigma, 상품번호 F5581-10 mL)부피비는 1 : 1 : 1이고, 연통관 주사기법으로 항원을 약 1시간 정도 유화시켜, 항원이 충분히 점성의 유제로 유화 형성될 수 있도록 한다. 각 마우스에 100 μL의 유화제를 주사하고, 즉 100 μg의 KLH를 주사하였다. 각 마우스 견갑골 중간 부위 두 포인트에 유화된 KLH를 피하 주사하고, 각 포인트마다 50 μL씩 주사하였다. 동시에 WT IL-2-linker2-hFc(WT IL-2로 약칭하고, SEQ ID NO: 12를 참조), Fc-linker-IL2_V91K, mut11.08-linker2-hFc단백질을 피하 주사하되, 조제량은 1 mpk이고, 200 μL/마리 랫트이며, 3일에 한 번씩 투여하여, WT IL-2군, Fc-linker-IL2_V91K군, mut11.08-linker-hFc군으로 하며; 시클로스포린(Cyclosporin A, CsA, Sigma, 상품번호 F5581-10 mL)을 복강 주사하고, 조제은 10 mpk이며, 200 μL/마리 랫트이고, 매일 한 번씩 투여하여, CsA군으로 하며; PBS를 복강 주사하여, vehicle군으로 한다.

감작 후 5 일째에 자극한다. 10 mg/mL의 KLH를 PBS를 사용하여 1 μg/μL로 10배 희석하고, 각 마우스 우측 귀에 10 μL를 피내 주사하며, 즉 10 μg의 KLH로 주사하고, 좌측 귀에 10 μL의 PBS를 주사하여 대조로 한다.

감작 전, 마이크로미터 캘리퍼스(0-25 mm, 정밀도 0.001, NScing에서 구입)로 각 마우스의 좌우측 귀 두께를 측정하여 기록한다. 자극 전, 마이크로미터 캘리퍼스로 각 마우스 좌우측 귀 두께를 측정하여, 베이스값으로 한다. 자극 후, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h에 귀 두께를 한 번 측정한다. 각 그룹의 동물 체중 및 귀 두께 변화는 모두 평균값 ± 표준차(Mean ± SEM)로 표시하고, Graphpad Prism5 소프트웨어로 작도하여 분석하였다.

실험 결과는 도 11A에 나타낸 바와 같고, 1 mpk로 1회 피하 투여하며, vehicle군에 비해, WT IL-2 투여군 마우스 Δ귀 두께는 현저한 변화가 없으나, mut11.08-linker2-hFc 투여군 마우스 Δ귀 두께는 작아지고, 항염 작용을 나타내며, 항염 작용이 Fc-linker-IL2_V91K 및 CsA보다 우수하다. 도 11B로 나타낸 바와 같이, 각 그룹 동물 체중은 현저한 변화가 없다.

2라운드 실험 결과는 도 12A로 나태낸 바와 같고, Fc-linker-IL2_V91K는 1 mpk로 1회 피하 투여하며, mut11.08-linker2-hFc는 0.04, 0.2, 1, 5 mpk 4 가지 조제량으로 1회 피하 투여하였다. mut11.08-linker2-hFc의 항염 작용은 조제량에 의존하는 것으로 나타나고; mut11.08-linker2-hFc 0.2 mpk는 Fc-linker-IL2_V91K 1 mpk와 작용이 상당하며, 해당 조건 하에서 체중은 모두 이상이 없으며; mut11.08-linker2-hFc 5 mpk 시 마우스 체중에 파동 및 감소가 나타나고, 다른 그룹은 체중에 이상이 없으며, 상세한 내용은 도 12B를 참조바란다.

실시예 14 PBMC 마우스에게 피하 투여한 PD결과

NOG 마우스(암컷, 11-12주령, Charles River에서 구입)를 구입하였다. Day-1에 PBMC를 소생시키고 CD3(eBioscience에서 구입하고 상품번호는 16-0037-85/2106800이며, 최종 농도는 12.5 ng/mL임) 및 CD28(eBioscience에서 구입하고 상품번호는 16-0289-85/2073954이며, 최농도 25 ng/mL임)을 첨가하여 활성화시키며, 37℃, 5% CO₂의 인큐베이터에 넣어 밤새 16시간 동안 배양하였다. Day0에 PBMC(20 × 10⁶개/마우스, 400 μL)를 수집하여 NOG마우스 체내에 꼬리 정맥 접종한 후, 각 그룹당 3마리씩 체중에 따라 랜덤으로 대조군 PBS, mut11.08-linker2-hFc군(0.3 mpk, 1 mpk), Fc-linker-IL2_V91K군(0.3 mpk, 1 mpk) 총 5개 그룹으로 나누며, 약물을 (Day0)경부 피하 주사하기 시작하며, 1회 투여하였다. 투여 후 Day3에 마우스를 안락사시켜 비장을 취해, 유세포 측정에 사용하고, 데이터를 기록하였다. 각 그룹의 동물 Treg(CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺), Tcon(CD4⁺CD25^-), CD8⁺T세포의 수 및 변화 배율은 Graphpad Prism8 소프트웨어로 작도하여 분석하였다.

실험 결과는 도 13A-13B, 도 14A-14C에 나타낸 바와 같고, 1 mpk를 1회 피하 투여하며, mut11.08-linker2-hFc는 투여 후 3일에 Treg/Tcon, Treg/CD8⁺T 비율이 향상되고, 조제량에 의존하며, 점유율이 향상되어 Fc-linker-IL2_V91K보다 우수한 것으로 나타났다. 투여 후 3일에 Treg수량이 현저하게 변화하는 외에, Tcon은 증가 추세를 보이나 현저하지 않고, CD8⁺T세포 수량은 현저한 변화가 없다.

실시예 15 PBMC 마우스 이식편대숙조질환(graft-versus-host disease, GVHD)모델

NOG 마우스(암컷, 13-14주령, Charles River에서 구입)를 구입하였다. 실시예 14와 같은 조작 방식으로, 체중에 따라 NOG 마우스를 랜덤으로 G1군(PBS, 미접종 활성화 PBMC, 3마리), G2군(PBS, 10마리), G3군(0.2 mpk에 따라 mut11.08-linker2-hFc 투여, 10마리), 총 3개의 그룹으로 나누고, 여기서 G2군 및 G3군은 실시예 14의 접종 활성화한 PBMC를 참조바란다. (Day0)경부 약물 피하 주사를 시작하고, 1회 투여하였다. 매주 2회 무게를 측정하고, GVHD 특징이 나타난 후 평점을 시작한다 [평점 체계: 체중 감소(0점 < 10%, 1점 10% -20%, 2점 > 20%, 3점 > 30%); 빈혈(0점 적색 또는 핑크색 꼬리; 1점 백색 꼬리); 자세(0점 정상, 1점 곱사등); 일반 활동(0점 정상, 1점 제한); 탈모(0점 무탈모, 1점 탈모) 및 황달(0점 백색 또는 적색 꼬리, 1점 황색 꼬리); 가장 큰 질환 심각 정도 또는 사망은 8점에 해당됨], 데이터를 기록한다. 유의: 1. 마우스 가 가장 큰 질환 심각 정도 평점에 속하면 다른 증상은 평점하지 않고; 2. 사망된 마우스는 사망 후 실험 종료까지 평점한다.

결과는 도 15A-15B에 나타낸 바와 같고, PBMC 접종 Day13 후 G2군 체중이 감소되고, GVHD 증상은 상기 그룹에서 미리 발생하며; PBMC 접종 Day17 후 G3군 체중이 감소되고, 전체적 감소 폭은 G1에 미치지 못하며, 발생 시간도 G2군에 비해 늦고, 예상에 부합되며, mut11.08-linker2-hFc는 마우스에 GVHD가 발생하는 것을 효과적으로 억제하였다. 체중 평가를 통해 mut11.08-linker2-hFc는 0.2 mpk 투여 조제량에서 부작용이 없고, 비교적 우수한 항 GVHD 능력을 나타내는 것을 알 수 있다. 동시에 G3군 동물 사망율 및 GVHD평점은 모두 G2군보다 낮고, 현저한 차이를 보였다.

실시예 16 마우스 약물동태학

본 실시예의 혈중약제 농도 측정 방법은 다음과 같다: 1 μg/mL의 hIL2R alpha(ACROBiosystems, 상품번호 ILA-H52H9-100 μg)단백질로 코팅하고, 공백 마우스 혈청에 약물로 표준 곡선을 제작하며, 농도 범위는 500-3.90625 ng/mL이고, 동시에 고, 중, 저 3 개의 농도의 품질 제어품을 배합하고, 모든 측정될 샘플, 표준품, 품질 제어품은 희석액으로 40배 희석한 후 100 μL의 중복 웰로 플레이트에 첨가하고(측정될 샘플은 실제 상황에 따라 별도로 희석할 수 있음), 또 10000배 희석한 측정 항체 Peroxidase AffiniPure Mouse Anti-Human IgG, Fc fragment specific(Jackson, 상품번호 209-035-098)를 첨가하며, 마지막으로 100 μL의 TMB 발색액을 추가하여 발색하고, 50 μL의 1 M 황산으로 종료하여 수치를 읽는다.

야생형 마우스에게 피하 투여하고, 조제량은 1 mpk이며, 마우스 혈중약제 농도를 측정하였다. 두 번의 결과는 도 16A-16B 및 표 21-22에 나타낸 바와 같고, mut11.08-linker2-hFc 노출량은 모두 대조 Fc-linker-IL2_V91K(4-6배)보다 높고, Tmax는 Fc-linker-IL2_V91K에 비해 지연되었다. 1 mpk로 1회 피하 투여하고, mut11.08-linker2-hFc 노출량은 mut11-linker2-hFc보다 높다.

야생형 마우스에게 1회 피하 투여 후의 약물동태학 매개 변수

Mean	T1/2(h)	Tmax(h)	Cmax(ng/mL)	AUClast(h*ng/mL)
Fc-linker-IL2_V91K	NA	6.00	1430.94	28208.77
mut11-linker2-hFc	NA	12.00	1843.32	43254.14
mut11.08-linker2-hFc	NA	24.00	4433.17	139652.97

Mean	T1/2(h)	Tmax(h)	Cmax(ng/mL)	AUClast(h*ng/mL)
Fc-linker-IL2_V91K	NA	6.00	1628.30	42874.91
mut11.08-linker2-hFc	11.51	24.00	5391.62	177902.19

야생형 마우스 정맥 투여하고, 조제량은 1 mpk이며, 혈중약제 농도를 측정하였다. 결과는 도 17 및 표 23에 나타낸 바와 같고, mut11.08-linker2-hFc 노출량은 대조Fc-linker-IL2_V91K보다 높으나, 피하 주사에 비해, 차이가 작다(Cmax3배→1.3배, AUC4배→2.4배). mut11.08-linker2-hFc 노출량은 mut11-linker2-hFc보다 높으나, 피하 주사에 비해, 차이가 작다(Cmax2.4배→1.2배, AUC3.2배→1.6배).

따라서, mut11.08-linker2-hFc를 피하 투여하는 생물 이용도가 Fc-linker-IL2_V91K 및 mut11-linker2-hFc보다 우수하다. 안정성 돌연변이는 약물의 노출량 및 생물 이용도를 향상시킨다.

야생형 마우스에게 1회 정맥 투여 후의 약물동태학 매개 변수

Mean	T1/2(h)	Tmax(h)	Cmax(ng/mL)	AUClast(h*ng/mL)
Fc-linker-IL2_V91K	7.35	0.08	14518.61	92522.67
mut11-linker2-hFc	5.27	0.08	15450.84	138450.96
mut11.08-linker2-hFc	8.41	0.08	18761.22	217851.01

PBMC를 마우스에 접종하되, 방법은 실시예 14와 같고, 피하 투여하며, 조제량은 1 mpk이고, 마우스 혈중약제 농도를 측정하였다. 결과는 도 18 및 표 24에 나타낸 바와 같고, PBMC 마우스에게 1 mpk로 1회 피하 투여하며, mut11.08-linker2-hFc의 노출량은 현저한 우세를 갖고, Fc-linker-IL2_V91K 노출량의 5-8배이며, Tmax는 Fc-linker-IL2_V91K에 비해 지연되었다.

PBMC마우스에게 1회 피하 투여 후의 약물동태학 매개 변수

Mean	T1/2(h)	Tmax(h)	Cmax(ng/mL)	AUClast(h*ng/mL)
Fc-linker-IL2_V91K	12.29	12.00	2338.82	99848.69
mut11.08-linker2-hFc	43.06	24.00	7405.26	546719.71

실시예 17 사이노몰구스 원숭이 약물동태학 및 PD결과

본 실시예의 사이노몰구스 원숭이 혈중약제 농도 측정 방법은 다음과 같다. 1 μg/mL로 hIL2R alpha 단백질(ACROBiosystems, 상품번호 ILA-H52H9-100 μg)을 코팅하고, 공백 사이노몰구스 원숭이 혈청에서 약물로 표준 곡선을 제작하며, 농도 범위는 15-0.11718 ng/mL이고, 고, 중, 저 3 개의 농도의 품질 제어품을 배합하며, 모든 측정될 샘플, 표준품, 품질 제어품은 희석액으로 5배 희석한 후 100 μL의 중복 웰로 플레이트에 첨가하고(측정될 샘플은 실제 상황에 따라 별도로 희석할 수 있음), 또 1000배 희석한 측정 항체 Goat Anti-Human IgG, Monkey ads-BIOT(SoutherBiotech, 상품번호 2049-08)를 첨가하며, 5000배 희석한 Streptavidin-HRP(Thermo, 상품번호 21126)를 더 첨가하고, 마지막으로 100 μL의 TMB 발색액을 추가하여 발색하고, 50 μL의1 M황산으로 종료하여 수치를 읽는다. 사이노몰구스 원숭이 공백 혈청:HkeyBio.

4마리 사이노몰구스 원숭이에게, 0.05 mpk의 조제량으로 IL-2를 피하 투여하고, 여기서 1마리에게 WT IL-2-linker2-hFc(WT IL-2로 약칭, SEQ ID NO: 12를 참조)를 투여하고, 1마리에게 Fc-linker-IL2_V91K를 투여하며, 2마리에게 mut11.08-linker2-hFc(각각 Mut11.08-1 및 Mut11.08-2로 약칭)를 투여하여, 투여 후 의 혈장 농도를 측정하였다. 결과는 도 19 및 표 25에 나타낸 바와 같고, 0.05 mpk의 조제량에서, 종말 반감기 WT IL-2 분자가 비교적 길고, Fc-linker-IL2_V91K와 mut11.08-linker2-hFc는 근사하다. Cmax 및 AUC는 mut11.08-linker2-hFc > Fc-linker-IL2_V91K > WT IL-2로 배열되었다.

사이노몰구스 원숭이에게 1회 피하 투여 후의 약물동태학 매개 변수

mean	T1/2(h)	Tmax(h)	Cmax(ng/mL)	AUClast(h*ng/mL)
WT IL-2	204.97	4.00	57.70	1564.86
Fc-linker-IL2_V91K	13.20	24.00	125.07	4669.24
mut11.08-1	11.05	24.00	185.40	8165.21
mut11.08-2	11.80	24.00	355.50	15033.23

mut11.08-linker2-hFc 1회 피하 투여가 사이노몰구스 원숭이 Treg세포에 대한 증폭 작용을 측정하기 위해, 총 4 마리의 사이노몰구스 원숭이를 취하였다. 1마리는 WT IL-2-linker2-hFc를 투여하고, 1마리는 Fc-linker-IL2_V91K를 투여하며, 다른 2마리는 mut11.08-linker2-hFc를 투여하였다. 조제량은 0.05 mpk이고, 한 번 피하 투여하였다. 투여 전 및 투여 후 Day1, 3, 5, 7, 10, 14에 사이노몰구스 원숭이의 말초 혈액을 취하였다. 상이한 시점에 2 mL의 사이노몰구스 원숭이 혈액을 취하고, PBMC를 분리하여 냉동 보관하였다. 각 시점에서 각각 하나의 냉동 보관된 PBMC를 취하여 함께 소생시켜 측정하였다. 소생된 PBMC를 1 mL의 염색액 Staining Buffer(2% FBS를 함유하는 DPBS 완충액)로 재부유시킨 후, 각각 200 μL를 취해 두 개의 96웰 V베이스플레이트로 옮겨, Panel1 및 Panel2로 표기한다. 두 개의 플레이트를 DPBS로 한 번 세척한 후, Live/Dead Fixable Near-IR(Thermo, 상품번호 L34976)를 첨가하여 20분간 염색하였다. 염색 완료 후 Staining Buffer로 종료하고, 그 후 Human TruStain FcX(Biolegend, 상품번호 422302)를 첨가하여 20분간 인큐베이션하였다. 그 후 두 개의 플레이트에 각각 상이한 형광 항체 혼합액을 첨가하여 30분간 염색하고, Panel 1은 BV605 Mouse Anti-Human CD3(BD, 상품번호 562994), PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD4(BD, 상품번호 552838), FITC Mouse Anti-Human CD8(Biolegend, 상품번호 301050), BV421 Mouse Anti-Human CD25(Biolegend, 상품번호 302630)를 Brilliant stain buffer(BD, 상품번호 563794)로 희석하고, Panel 2는 BV605 Mouse Anti-Human CD3, PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD4, FITC Mouse Anti-Human CD8, Brilliant Violet421anti-human CD16(Biolegend, 상품번호 302038)를 Brilliant stain buffer로 희석하였다. 염색 완료 후 Staining Buffer로 한 번 세척하고, 그 후 Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set 키 (eBioscience, 상품번호 00-5523-00)트로 고정시키고 막파열을 수행하였다. 그 후 두 개의 플레이트에 각각 상이한 형광 항체 혼합액을 첨가하여 45분간 염색하고, Panel 1은 PE anti-human FOXP3(Biolegend, 상품번호 320208) 및 Ki67 Monoclonal Antibody APC(eBioscience, 상품번호 17-5698-82)를 Permeabilization Buffer로 희석하고, Panel 2는 Ki67 Monoclonal Antibody APC를 Permeabilization Buffer로 희석하였다. 염색 완료 후 Permeabilization Buffer로 한 번 세척하고, 그 후 400 μL의 Staining Buffer로 세포를 재부유시키며, 유세포 정량으로 200 μl의 샘플을 취해 측정하였다. 각 그룹의 동물 Treg, CD4+Foxp3-, CD8+T, NK세포의 수 및 변화 배율은 Graphpad Prism9소프트웨어로 작도하여 분석하였다.

실험 결과는 도 20A-20F에 나타낸 바와 같고, 0.05 mpk로 1회 피하 투여하며, mut11.08-linker2-hFc는 사이노몰구스 원숭이의 말초 혈액 Treg수 및 점유율을 현저하게 향상시켰다. Treg/CD4⁺T 비율에 따라, mut11.08-linker2-hFc는 Treg 편향성을 갖고, Treg 점유율은 약 Fc-linker-IL2_V91K의 2배이다. mut11.08-linker2-hFc는 Fc-linker-IL2_V91K에 비해, Treg에 대한 증식 능력이 더욱 높고(11.08vs Fc-linker-IL2_V91K = 79/55vs18), Fc-linker-IL2_V91K는 WT(18vs9.5)보다 우수하다. Treg 활성화 마커로부터 분석하고, 여기서 Ki67+Treg% 상이한 분자 투여 후 변별도가 크지 않다. Treg 활성화는 Foxp3 및 CD25의 발현량이 현저히 증가되고, Treg 증식 수준과 정적 상관관계를 유지함을 상징한다.

실험 결과는 도 21A-21F에 나타낸 바와 같고, 0.05 mpk로 1회 피하 투여하며, Fc-linker-IL2_V91K 투여 후 FoxP3^-CD4⁺T변화 배수 최대치가 2배 정도이고, CD8⁺T변화 배수최대치가 다소 높으며 4배 정도이다. mut11.08-linker2-hFc가 FoxP3^-CD4⁺T에 대한 증폭이 Fc-linker-IL2_V91K보다 약 2-3배 강하고; CD8⁺T에 대한 증폭이 Fc-linker-IL2_V91K보다 다소 약하거나 유사하며, WT보다 약 1.5-2배 강하다. Fc-linker-IL2_V91K 투여 후 NK세포수 변화는 현저하지 않고, mut11.08-linker2-hFc가 NK에 대한 증폭 수준은 Fc-linker-IL2_V91K와 유사하다.

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Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Val Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Leu Gln Ser Lys Asn Phe Gln Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 3 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 3 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Leu Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 4 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 4 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Phe Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile 115 120 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Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Arg Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Phe Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 145 150 155 160 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 165 170 175 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 180 185 190 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 195 200 205 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 210 215 220 Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 225 230 235 240 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 245 250 255 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 260 265 270 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 275 280 285 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 290 295 300 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 305 310 315 320 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 325 330 335 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 340 345 350 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 355 360 365 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375 380 <210> 53 <211> 380 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 53 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Ile Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Leu Asn Arg Ile Ile Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 145 150 155 160 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 165 170 175 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 180 185 190 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 195 200 205 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 210 215 220 Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 225 230 235 240 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 245 250 255 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 260 265 270 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 275 280 285 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 290 295 300 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 305 310 315 320 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 325 330 335 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 340 345 350 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 355 360 365 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375 380 <210> 54 <211> 380 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 54 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Glu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Arg Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 145 150 155 160 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 165 170 175 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 180 185 190 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 195 200 205 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 210 215 220 Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 225 230 235 240 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 245 250 255 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 260 265 270 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 275 280 285 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 290 295 300 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 305 310 315 320 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 325 330 335 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 340 345 350 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 355 360 365 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375 380 <210> 55 <211> 380 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 55 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Glu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Val Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Leu Gln Ser Lys Asn Phe Gln Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Arg Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 145 150 155 160 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 165 170 175 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 180 185 190 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 195 200 205 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 210 215 220 Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 225 230 235 240 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 245 250 255 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 260 265 270 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 275 280 285 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 290 295 300 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 305 310 315 320 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 325 330 335 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 340 345 350 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 355 360 365 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375 380 <210> 56 <211> 380 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 56 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Glu 1 5 10 15 Leu Ile Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Leu Asn Arg Ile Ile Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 145 150 155 160 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 165 170 175 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 180 185 190 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 195 200 205 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 210 215 220 Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 225 230 235 240 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 245 250 255 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 260 265 270 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 275 280 285 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 290 295 300 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 305 310 315 320 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 325 330 335 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 340 345 350 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 355 360 365 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375 380 <210> 57 <211> 272 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Met Asp Ser Tyr Leu Leu Met Trp Gly Leu Leu Thr Phe Ile Met Val 1 5 10 15 Pro Gly Cys Gln Ala Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro 20 25 30 His Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn 35 40 45 Cys Glu Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr 50 55 60 Met Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys 65 70 75 80 Gln Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro 85 90 95 Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro 100 105 110 Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro 115 120 125 Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val 130 135 140 Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His 145 150 155 160 Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg 165 170 175 Trp Thr Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln 180 185 190 Phe Pro Gly Glu Glu Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu 195 200 205 Ser Glu Thr Ser Cys Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr 210 215 220 Glu Met Ala Ala Thr Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln 225 230 235 240 Val Ala Val Ala Gly Cys Val Phe Leu Leu Ile Ser Val Leu Leu Leu 245 250 255 Ser Gly Leu Thr Trp Gln Arg Arg Gln Arg Lys Ser Arg Arg Thr Ile 260 265 270 <210> 58 <211> 551 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Met Ala Ala Pro Ala Leu Ser Trp Arg Leu Pro Leu Leu Ile Leu Leu 1 5 10 15 Leu Pro Leu Ala Thr Ser Trp Ala Ser Ala Ala Val Asn Gly Thr Ser 20 25 30 Gln Phe Thr Cys Phe Tyr Asn Ser Arg Ala Asn Ile Ser Cys Val Trp 35 40 45 Ser Gln Asp Gly Ala Leu Gln Asp Thr Ser Cys Gln Val His Ala Trp 50 55 60 Pro Asp Arg Arg Arg Trp Asn Gln Thr Cys Glu Leu Leu Pro Val Ser 65 70 75 80 Gln Ala Ser Trp Ala Cys Asn Leu Ile Leu Gly Ala Pro Asp Ser Gln 85 90 95 Lys Leu Thr Thr Val Asp Ile Val Thr Leu Arg Val Leu Cys Arg Glu 100 105 110 Gly Val Arg Trp Arg Val Met Ala Ile Gln Asp Phe Lys Pro Phe Glu 115 120 125 Asn Leu Arg Leu Met Ala Pro Ile Ser Leu Gln Val Val His Val Glu 130 135 140 Thr His Arg Cys Asn Ile Ser Trp Glu Ile Ser Gln Ala Ser His Tyr 145 150 155 160 Phe Glu Arg His Leu Glu Phe Glu Ala Arg Thr Leu Ser Pro Gly His 165 170 175 Thr Trp Glu Glu Ala Pro Leu Leu Thr Leu Lys Gln Lys Gln Glu Trp 180 185 190 Ile Cys Leu Glu Thr Leu Thr Pro Asp Thr Gln Tyr Glu Phe Gln Val 195 200 205 Arg Val Lys Pro Leu Gln Gly Glu Phe Thr Thr Trp Ser Pro Trp Ser 210 215 220 Gln Pro Leu Ala Phe Arg Thr Lys Pro Ala Ala Leu Gly Lys Asp Thr 225 230 235 240 Ile Pro Trp Leu Gly His Leu Leu Val Gly Leu Ser Gly Ala Phe Gly 245 250 255 Phe Ile Ile Leu Val Tyr Leu Leu Ile Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro 260 265 270 Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe 275 280 285 Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu 290 295 300 Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro 305 310 315 320 Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu 325 330 335 Leu Leu Gln Gln Asp Lys Val Pro Glu Pro Ala Ser Leu Ser Ser Asn 340 345 350 His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn Gln Gly Tyr Phe Phe Phe His 355 360 365 Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala Cys Gln Val Tyr Phe Thr Tyr 370 375 380 Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro Asp Glu Gly Val Ala Gly Ala Pro 385 390 395 400 Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln Pro Leu Ser Gly Glu Asp Asp 405 410 415 Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp Asp Leu Leu Leu Phe Ser Pro 420 425 430 Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ser Pro Pro Ser Thr Ala Pro Gly Gly Ser 435 440 445 Gly Ala Gly Glu Glu Arg Met Pro Pro Ser Leu Gln Glu Arg Val Pro 450 455 460 Arg Asp Trp Asp Pro Gln Pro Leu Gly Pro Pro Thr Pro Gly Val Pro 465 470 475 480 Asp Leu Val Asp Phe Gln Pro Pro Pro Glu Leu Val Leu Arg Glu Ala 485 490 495 Gly Glu Glu Val Pro Asp Ala Gly Pro Arg Glu Gly Val Ser Phe Pro 500 505 510 Trp Ser Arg Pro Pro Gly Gln Gly Glu Phe Arg Ala Leu Asn Ala Arg 515 520 525 Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly 530 535 540 Gln Asp Pro Thr His Leu Val 545 550 <210> 59 <211> 369 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Met Leu Lys Pro Ser Leu Pro Phe Thr Ser Leu Leu Phe Leu Gln Leu 1 5 10 15 Pro Leu Leu Gly Val Gly Leu Asn Thr Thr Ile Leu Thr Pro Asn Gly 20 25 30 Asn Glu Asp Thr Thr Ala Asp Phe Phe Leu Thr Thr Met Pro Thr Asp 35 40 45 Ser Leu Ser Val Ser Thr Leu Pro Leu Pro Glu Val Gln Cys Phe Val 50 55 60 Phe Asn Val Glu Tyr Met Asn Cys Thr Trp Asn Ser Ser Ser Glu Pro 65 70 75 80 Gln Pro Thr Asn Leu Thr Leu His Tyr Trp Tyr Lys Asn Ser Asp Asn 85 90 95 Asp Lys Val Gln Lys Cys Ser His Tyr Leu Phe Ser Glu Glu Ile Thr 100 105 110 Ser Gly Cys Gln Leu Gln Lys Lys Glu Ile His Leu Tyr Gln Thr Phe 115 120 125 Val Val Gln Leu Gln Asp Pro Arg Glu Pro Arg Arg Gln Ala Thr Gln 130 135 140 Met Leu Lys Leu Gln Asn Leu Val Ile Pro Trp Ala Pro Glu Asn Leu 145 150 155 160 Thr Leu His Lys Leu Ser Glu Ser Gln Leu Glu Leu Asn Trp Asn Asn 165 170 175 Arg Phe Leu Asn His Cys Leu Glu His Leu Val Gln Tyr Arg Thr Asp 180 185 190 Trp Asp His Ser Trp Thr Glu Gln Ser Val Asp Tyr Arg His Lys Phe 195 200 205 Ser Leu Pro Ser Val Asp Gly Gln Lys Arg Tyr Thr Phe Arg Val Arg 210 215 220 Ser Arg Phe Asn Pro Leu Cys Gly Ser Ala Gln His Trp Ser Glu Trp 225 230 235 240 Ser His Pro Ile His Trp Gly Ser Asn Thr Ser Lys Glu Asn Pro Phe 245 250 255 Leu Phe Ala Leu Glu Ala Val Val Ile Ser Val Gly Ser Met Gly Leu 260 265 270 Ile Ile Ser Leu Leu Cys Val Tyr Phe Trp Leu Glu Arg Thr Met Pro 275 280 285 Arg Ile Pro Thr Leu Lys Asn Leu Glu Asp Leu Val Thr Glu Tyr His 290 295 300 Gly Asn Phe Ser Ala Trp Ser Gly Val Ser Lys Gly Leu Ala Glu Ser 305 310 315 320 Leu Gln Pro Asp Tyr Ser Glu Arg Leu Cys Leu Val Ser Glu Ile Pro 325 330 335 Pro Lys Gly Gly Ala Leu Gly Glu Gly Pro Gly Ala Ser Pro Cys Asn 340 345 350 Gln His Ser Pro Tyr Trp Ala Pro Pro Cys Tyr Thr Leu Lys Pro Glu 355 360 365 Thr <210> 60 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 60 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Xaa Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130

Claims

야생형 IL-2에 비해, Q13, L18, G27, Y31, A73, H79, P82, I89, N90, V91, V93, F117 또는 R120에서 발생하는 하나 또는 복수의 돌연변이를 포함하는 IL-2 돌연변이체.
제1항에 있어서,
상기 IL-2 돌연변이체는 Q13L, L18I, G27W, Y31V, A73L, H79Q, P82L, I89L, N90Y, V91A, V93I, F117W 또는 R120F의 하나 또는 복수의 돌연변이를 포함하는 IL-2 돌연변이체.
제1항에 있어서,
상기 IL-2 돌연변이체는,
(a), Y31/A73/H79 돌연변이; 바람직하게는, Y31V/A73L/H79Q 돌연변이;
(b), Q13 돌연변이; 바람직하게는, Q13L 돌연변이;
(c), R120 돌연변이, 바람직하게는, R120F 돌연변이;
(d), L18/V91/F117 돌연변이; 바람직하게는, L18I/V91A/F117W 돌연변이;
(e), L18/I89/V93 돌연변이; 바람직하게는, L18I/I89L/V93I 돌연변이;
(f), G27/R120 돌연변이; 바람직하게는, G27W/R120F 돌연변이;
(g), P82/R120 돌연변이; 바람직하게는, P82L/R120F 돌연변이;
(h), N90/R120 돌연변이; 바람직하게는, N90Y/R120F 돌연변이 중 적어도 하나의 그룹의 돌연변이를 포함하는 IL-2 돌연변이체.
제3항에 있어서,
상기 IL-2 돌연변이체는 구체적으로 SEQ ID NO: 2-9 중 어느 하나로 표시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 IL-2 돌연변이체.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 IL-2 돌연변이체의 Tm값이 야생형 IL-2보다 높은 IL-2 돌연변이체.
제1항 내지 제3항, 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 IL-2 돌연변이체는 H16, D20, N88, V91 또는 Q126 돌연변이, 예를 들어 H16E 돌연변이, D20A, D20H 또는 D20Y 돌연변이, N88A, N88I, N88G, N88R 또는 N88D 돌연변이, V91R 또는 V91K 돌연변이, Q126L 또는 Q126F 돌연변이로부터 선택되는 하나 또는 복수의 돌연변이를 더 포함하고;
바람직하게는, 상기 IL-2 돌연변이체는,
(ⅰ), H16 돌연변이, 바람직하게는 H16E 돌연변이;
(ⅱ), D20 돌연변이, 바람직하게는 D20A 돌연변이;
(ⅲ), V91 돌연변이, 바람직하게는 V91R 돌연변이;
(ⅳ), H16/V91 돌연변이, 바람직하게는 H16E/V91R 돌연변이로부터 선택되는 하나의 그룹의 돌연변이를 더 포함하는 IL-2 돌연변이체.
제6항에 있어서,
상기 IL-2 돌연변이체는,
(a), H16/Y31/A73/H79 돌연변이; 바람직하게는 H16E/Y31V/A73L/H79Q 돌연변이;
(b), H16/R120 돌연변이; 바람직하게는 H16E/R120F 돌연변이;
(c), H16/L18/V91/F117 돌연변이; 바람직하게는 H16E/L18I/V91A/F117W 돌연변이;
(d), H16/L18/I89/V93 돌연변이; 바람직하게는 H16E/L18I/I89L/V93I 돌연변이;
(e), H16/G27/R120 돌연변이; 바람직하게는 H16E/G27W/R120F 돌연변이;
(f), H16/P82/R120 돌연변이; 바람직하게는 H16E/P82L/R120F 돌연변이;
(g), D20/Y31/A73/H79 돌연변이; 바람직하게는 D20A/Y31V/A73L/H79Q 돌연변이;
(h), D20/R120 돌연변이; 바람직하게는 D20A/R120F 돌연변이;
(i), V91/Y31/A73/H79 돌연변이; 바람직하게는 V91R/Y31V/A73L/H79Q 돌연변이;
(j), V91/Q13 돌연변이; 바람직하게는 V91R/Q13L 돌연변이;
(k), V91/R120 돌연변이; 바람직하게는 V91R/R120F 돌연변이;
(l), V91/L18/I89/V93 돌연변이; 바람직하게는 V91R/L18I/I89L/V93I 돌연변이;
(m), H16/V91/Y31/A73/H79 돌연변이; 바람직하게는 H16E/V91R/Y31V/A73L/H79Q 돌연변이;
(n), H16/V91/L18/I89/V93 돌연변이; 바람직하게는 H16E/V91R/L18I/I89L/V93I 돌연변이 중 적어도 하나의 그룹의 돌연변이를 포함하는 IL-2 돌연변이체.
제7항에 있어서,
SEQ ID NO: 22-27, 29-30, 32-35 또는 37-38로 표시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 IL-2 돌연변이체.
제1항 내지 제3항, 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 IL-2 돌연변이체는 F42, Y45 또는 L72의 돌연변이; 바람직하게는 F42A, Y45A 또는 L72G 돌연변이로부터 선택되는 하나 또는 복수의 돌연변이를 더 포함하는 IL-2 돌연변이체.
IL-2 돌연변이체로서,
야생형 IL-2에 비해, H16, D20 또는 V91에서 발생하는 하나 또는 복수의 돌연변이를 포함하고; 바람직하게는, 상기 IL-2 돌연변이체는,
(ⅰ), H16 돌연변이, 바람직하게는 H16E 돌연변이;
(ⅱ), D20 돌연변이, 바람직하게는 D20A 돌연변이;
(ⅲ), V91 돌연변이, 바람직하게는 V91R 돌연변이;
(ⅳ), H16/V91 돌연변이, 바람직하게는 H16E/V91R 돌연변이 중 적어도 하나의 그룹의 돌연변이로부터 선택되는 돌연변이를 포함하는 IL-2 돌연변이체.
제10항에 있어서,
SEQ ID NO: 21, 28, 31 또는 36로 표시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 IL-2 돌연변이체.
제1항 내지 제3항, 제5항 내지 제7항, 제9항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 IL-2 돌연변이체는 N26, N29, N30, N71, Q11, L132, L70, P82, G27 또는 F28 돌연변이로부터 선택되는 하나 또는 복수의 돌연변이를 더 포함하고;
바람직하게는, 상기 IL-2 돌연변이체는 N26Q, N29S, N30S, N71Q, Q11C, L132C, L70C, P82C, G27C 또는 F78C 돌연변이로부터 선택되는 하나 또는 복수의 돌연변이를 포함하며;
더욱 바람직하게는, 상기 IL-2 돌연변이체는,
(a), N26Q 돌연변이;
(b), N29S 돌연변이;
(c), N30S 돌연변이;
(d), N71Q 돌연변이;
(e), Q11C/L132C 돌연변이;
(f), L70C/P82C 돌연변이;
(g), G27C/F78C 돌연변이 중 적어도 하나의 그룹의 돌연변이를 더 포함하는 IL-2 돌연변이체.
제6항 내지 제8항, 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
야생형 IL-2에 비해, 상기 돌연변이체와 IL-2Rβγ 서브유닛 복합물의 결합 능력이 저하되고; 바람직하게는, 결합력_{IL-2Rβγ 서브유닛 복합물}/결합력_{IL-2αβγ 서브유닛 복합물}이 저하되는 IL-2 돌연변이체.
제13항에 있어서,
야생형 IL-2에 비해, 상기 돌연변이체가 비조절성 T세포 또는 NK(자연 살해)세포에 대한 자극 능력이 저하되고, 상기 자극은 세포내 STAT5 인산화 또는 세포 증식으로부터 선택될 수 있거나;
또는, 비조절성 T세포 또는 NK(자연 살해)세포에 비해, 상기 돌연변이체는 말초 혈액 또는 T세포군 중의 조절성 T세포(Treg)를 우선 자극하고; 상기 우선 자극은 조절성 T세포 내 STAT5인산화를 자극하는 것, 조절성 T세포가 증식을 자극하는 것, 조절성 T세포와 비조절성 T세포의 비율을 향상시키거나, 조절성 T세포와 NK세포의 비율을 향상시키는 것으로부터 선택될 수 있는 IL-2 돌연변이체.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 돌연변이는 결실, 삽입 또는 치환을 포함하고, 바람직하게는 치환인 돌연변이체.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 야생형 IL-2는 SEQ ID NO: 60 또는 SEQ ID NO: 1로 표시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 돌연변이체.
제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하되, 상기 제1 폴리펩티드는 제1항 내지 제16항에 따른 IL-2 돌연변이체이고, 상기 제2 폴리펩티드는 비IL-2폴리펩티드인 융합 단백질.
제17항에 있어서,
상기 제2 폴리펩티드는 Fc, 종양 항원 결합 분자 또는 IL-2 수용체 서브유닛이고;
선택적으로, 상기 Fc는 인간 IgG Fc이며, 예를 들어 인간 IgG1 Fc이며;
바람직하게는, 상기 인간 IgG1 Fc는,
(a), C220S;
(b), N297G;
(c), C220S 및 N297G;
(d), A327Q;
(e), L234A 및 L235A;
(f), A287C 및 L306C;
(g), A259C 및 V302C;
(h), R292C 및 V306C;
(i), V323C 및 I332C로부터 선택되는 적어도 하나의 그룹의 돌연변이를 포함하고;
더욱 바람직하게는, 상기 인간 Ig G1 Fc는 SEQ ID NO: 11로 표시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하며;
선택적으로, 상기 종양 항원은 EDB-FN(extra domain of fibronectin), Muc1, p53, FAP, GD2, EpCAM, tenascin-C, CD20, CEA, MAdCAM-1 또는 WT1(Wilms tumor protein1)을 포함하고; 선택적으로, 상기 종양 항원 결합 분자는 항체이며, 예를 들어 scFv, sdFv, Fab, Fab’, F(ab’)₂ 또는 Fv이고;
선택적으로, 상기 IL-2 수용체 서브유닛은 IL-2 수용체 α 서브유닛인 융합 단백질.
제17항 또는 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 폴리펩티드의 C말단은 연결펩티드를 통해 또는 연결펩티드를 통하지 않고 상기 제2 폴리펩티드의 N말단에 연결되거나; 또는 상기 제1 폴리펩티드의 N말단은 연결펩티드를 통해 또는 연결펩티드를 통하지 않고 상기 제2 폴리펩티드의 C말단에 연결되며;
상기 연결펩티드는 바람직하게는 (G₄S)_n, (GGNGT)_n 또는 (YGNGT)_n으로부터 선택되고, 상기 n은 1, 2, 3, 4 또는 5로부터 선택되며;
더욱 바람직하게는, 상기 제1 폴리펩티드의 C말단은 상기 제2 폴리펩티드의 N말단에 연결펩티드(G₄S)₃를 통해 연결되는 융합 단백질.
제17항에 있어서,
상기 융합 단백질은 SEQ ID NO: 13-20 또는 SEQ ID NO: 39-56에 따른 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이체 또는 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 포함하고, 상기 돌연변이체 또는 융합 단백질에 접합되는 안정제, 약물 또는 추척 분자를 더 포함하며, 상기 안정제는 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택될 수 있는 접합체.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이체 또는 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 단편.
제22항에 따른 핵산 단편을 포함하는 벡터.
숙주 세포로서,
상기 숙주 세포는 제23항에 따른 벡터을 포함하고; 선택적으로, 상기 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포이며; 상기 원핵 세포 또는 진핵 세포는 대장간균, 효모, 곤충 세포 또는 포유 동물 세포로부터 선택될 수 있고, 상기 포유 동물 세포는 CHO 세포계 또는 HEK293 세포계로부터 선택될 수 있는 숙주 세포.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이체 또는 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질의 제조 방법에 있어서,
상기 방법은 제24항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 숙주 세포가 발현한 IL-2 돌연변이체 또는 융합 단백질을 단리하는 단계를 포함하는 방법.
제25항에 따른 방법에 의해 제조된 IL-2 돌연변이체 또는 융합 단백질.
약물 조성물로서,
상기 약물 조성물은 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이체, 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 제21항에 따른 접합체, 제22항에 따른 핵산 단편, 제23항에 따른 벡터, 제24항에 따른 숙주 세포 또는 제26항에 따른 돌연변이체 또는 융합 단백질; 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 보조제를 포함하고;
바람직하게는, 상기 약물 조성물은 주사 가능한 약물 조성물이며, 예를 들어 정맥 주사 약물 조성물 또는 피하 주사 약물 조성물이고; 더욱 바람직하게는, 각 조제량당 상기 약물 조성물은 피험자에게 유효량을 줄 수 있는 융합 단백질을 포함하며; 가장 바람직하게는, 상기 유효량은 0.001-10 mpk이고, 예를 들어 0.001 mpk, 0.002 mpk, 0.003 mpk, 0.004 mpk, 0.005 mpk, 0.006 mpk, 0.007 mpk, 0.008 mpk, 0.009 mpk, 0.01 mpk, 0.02 mpk, 0.03 mpk, 0.04 mpk, 0.05 mpk, 0.06 mpk, 0.07 mpk, 0.08 mpk, 0.09 mpk, 0.1 mpk, 0.2 mpk, 0.3 mpk, 0.4 mpk, 0.5 mpk, 0.6 mpk, 0.7 mpk, 0.8 mpk, 0.9 mpk, 1 mpk, 2 mpk, 3 mpk, 4 mpk, 5 mpk, 6 mpk, 7 mpk, 8 mpk, 9 mpk 또는 10 mpk인 약물 조성물.
약물 제조에서 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이체, 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 제21항에 따른 접합체, 제22항에 따른 핵산 단편, 제23항에 따른 벡터, 제24항에 따른 숙주 세포 또는 제26항에 따른 돌연변이체 또는 융합 단백질의 용도로서,
바람직하게는, 상기 약물은 주사 약물이며, 예를 들어 정맥 주사 약물 또는 피하 주사 약물이고;
바람직하게는, 각 조제량당 상기 약물은 피험자에게 유효량을 줄 수 있는 융합 단백질을 포함하며; 가장 바람직하게는, 상기 유효량은 0.001-10 mpk이고, 예를 들어 0.001 mpk, 0.002 mpk, 0.003 mpk, 0.004 mpk, 0.005 mpk, 0.006 mpk, 0.007 mpk, 0.008 mpk, 0.009 mpk, 0.01 mpk, 0.02 mpk, 0.03 mpk, 0.04 mpk, 0.05 mpk, 0.06 mpk, 0.07 mpk, 0.08 mpk, 0.09 mpk, 0.1 mpk, 0.2 mpk, 0.3 mpk, 0.4 mpk, 0.5 mpk, 0.6 mpk, 0.7 mpk, 0.8 mpk, 0.9 mpk, 1 mpk, 2 mpk, 3 mpk, 4 mpk, 5 mpk, 6 mpk, 7 mpk, 8 mpk, 9 mpk 또는 10 mpk이며;
바람직하게는, 상기 약물은 자가면역 질환, 또는 증식성 질환, 또는 바이러스 감염을 치료하는 데 사용되고;
더욱 바람직하게는, 상기 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 전신성 홍반 루프스, 피부 홍반 루프스, 루프스 신염, IgA 신장병, 쇼그렌 증후군, 다발성 근염, 피부근염, 경피증, 건선, 판상 건선, 원형 탈모증, 다발성 경화증, 근위축성 측삭경화증, 염증성 장질환, 궤양성 결장염, 크론병, 이식편대숙주질환, 장기이식거부, 자가 면역 간염, I형 당뇨병, 자가 면역성 혈관염, 습진 또는 천식을 포함하며;
더욱 바람직하게는, 상기 증식성 질환은 신생물, 고형종양, 혈액 종양, 악성복수 또는 악성흉수를 포함하고; 여기서, 상기 고형종양은 양성 또는 악성, 원발성 또는 전이성일 수 있고, 상기 악성 고형종양은 암 또는 육종, 예를 들어, 상피 세포암, 내피 세포암, 평편세포암, 기형종, 폐부 종양, 유두종 바이러스로 인한 암, 선암, 암종, 흑색종, 혈관육종, 신경모세포종, 전이성 폐암, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 유방암, Merkel세포암, 난소암, 신장세포암, 전이성 신장암, 두경부암, 방광암, 비근 침윤성 방광암일 수 있으며; 상기 혈액 종양은 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 예를 들어 B세포 림프종, T세포 림프종, 피부 T세포 림프종, T세포 대형과립 림프구 백혈병으로부터 선택될 수 있고,
더욱 바람직하게는, 상기 바이러스 감염은 HIV감염, 신종 코로나 바이러스 감염 또는 HPV 바이러스 감염으로부터 선택되는 용도.
자가면역 질환, 또는 증식성 질환, 또는 바이러스 감염의 치료 방법으로서,
상기 방법은 피험자에게 유효량의 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 IL-2 돌연변이체 또는 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 또는 제21항에 따른 접합체, 또는 제22항에 따른 핵산 단편, 또는 제23항에 따른 벡터, 또는 제24항에 따른 숙주 세포, 또는 제26상기 돌연변이체 또는 융합 단백질, 또는 제27항에 따른 약물 조성물을 투여하는 단계를 포함하고;
바람직하게는, 투여 방식은 주사이며, 예를 들어 정맥 주사 또는 피하 주사이고;
바람직하게는, 상기 유효량은 0.001-10 mpk이며, 예를 들어 0.001 mpk, 0.002 mpk, 0.003 mpk, 0.004 mpk, 0.005 mpk, 0.006 mpk, 0.007 mpk, 0.008 mpk, 0.009 mpk, 0.01 mpk, 0.02 mpk, 0.03 mpk, 0.04 mpk, 0.05 mpk, 0.06 mpk, 0.07 mpk, 0.08 mpk, 0.09 mpk, 0.1 mpk, 0.2 mpk, 0.3 mpk, 0.4 mpk, 0.5 mpk, 0.6 mpk, 0.7 mpk, 0.8 mpk, 0.9 mpk, 1 mpk, 2 mpk, 3 mpk, 4 mpk, 5 mpk, 6 mpk, 7 mpk, 8 mpk, 9 mpk 또는 10 mpk이고;
바람직하게는, 상기 자가면역 질환자가면역 질환은 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 전신성 홍반 루프스, 피부 홍반 루프스, 루프스 신염, IgA 신장병, 쇼그렌 증후군, 다발성근염, 피부근염, 경피증, 건선, 판상 건선, 원형 탈모증, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 염증성 장질환, 궤양성 결장염, 크론병, 이식편대숙주질환, 장기이식거부, 자가 면역 간염, I형 당뇨병, 자가 면역성 혈관염, 습진 또는 천식을 포함하며;
바람직하게는, 상기 증식성 질환은 신생물, 고형종양, 혈액 종양, 악성복수 또는 악성흉수를 포함하며; 상기 고형종양은 양성 또는 악성, 원발성 또는 전이성일 수 있고, 악성고형종양은 암 또는 육종, 예를 들어, 상피 세포암, 내피 세포암, 평편세포암, 기형종, 폐종양, 유두종 바이러스로 인한 암, 선암, 암종, 흑색종, 혈관육종, 신경모세포종, 전이성 폐암, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 유선암, Merkel세포암, 난소암, 신장세포암, 전이성 신장암, 두경부암, 방광암, 비근층 침윤성 방광암일 수 있으며; 상기 혈액 종양은 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 예를 들어 B세포 림프종, T세포 림프종, 피부 T세포 림프종, T세포 대형과립 림프구 백혈병으로부터 선택될 수 있는 자가면역 질환, 또는 증식성 질환, 또는 바이러스 감염의 치료 방법.
T세포군 또는 말초 혈액 중 조절성 T세포의 우선 자극 방법에 있어서,
상기 방법은 상기 T세포군 또는 말초 혈액을 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 IL-2 돌연변이체 또는 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 또는 제21항에 따른 접합체, 또는 제22항에 따른 핵산 단편, 또는 제23항에 따른 벡터, 또는 제24항에 따른 숙주 세포, 또는 제26항에 따른 돌연변이체 또는 융합 단백질, 또는 제27항에 따른 약물 조성물에 접촉시키는 단계를 포함하고; 바람직하게는, 상기 우선 자극은
(a) 비조절성 T세포 또는 NK세포에 비해, 조절성 T세포의 STAT5인산화를 우선 자극하는 것;
(b) 비조절성 T세포 또는 NK세포에 비해, 조절성 T세포 증식을 우선 자극하는 것;
및/또는 (c) 조절성 T세포와 비조절성 T세포의 비율을 향상시키거나, 또는 조절성 T세포와 NK세포의 비율을 향상시키는 것을 포함한하는 세포군 또는 말초 혈액 중 조절성 T세포의 우선 자극 방법.