CN1761472A - 细胞表面蛋白质的调节 - Google Patents

Abstract

本发明涉及筛选调节细胞表面蛋白质活性的化合物的方法。本发明涉及一种调节蛋白质插入或保留在细胞表面膜上的方法，所述蛋白质如囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)。本发明还涉及由细胞表面膜蛋白的异常插入或活性引起的疾病的诊断与治疗或预防的方法，所述疾病如囊性纤维化。

Description

细胞表面蛋白质的调节

技术领域

本发明涉及一种调节蛋白质插入或保留在细胞表面膜上的方法。本发明还涉及由细胞表面膜蛋白的异常插入或活性引起的疾病的诊断与治疗或预防方法，所述疾病如囊性纤维化(cystic fibrosis)。本发明进一步涉及筛选调节转运分子进或出细胞的化合物和调节细胞表面蛋白质活性的化合物的方法。

背景技术

细胞极性(cell polarity)的建立及维持是上皮细胞的内在功能。这些独特功能域的建立涉及其在提供屏障及控制离子和溶质转运方面的功能。产生所述功能性极化发展的因素包括E-钙粘蛋白(E-cadherin)介导的细胞-细胞接触及整联蛋白(integrin)介导的细胞-胞外基质粘连。这些空间连接通过细胞骨架及信号传导复合体(signalingcomplex)的区域化组装(assembly)与细胞内部组分进行通讯。这又接下来指导了细胞表面和分泌系统的重新组织。肌动蛋白细胞骨架通过与含有整联蛋白及钙粘蛋白的复合物直接相互作用而在上皮细胞极性的建立中具有重要作用。相似地，肌动蛋白丝系统负责芽殖酵母中的定向分泌。因而，肌动蛋白细胞骨架在不同门物种的极性建立中似乎都具有一定作用。

肌动蛋白细胞骨架的极化功能可能超出肌动蛋白丝与含有整联蛋白及钙粘蛋白的复合物之间的特异相互作用。肌动蛋白丝本身的同工型(isoform)组合物可以在细胞的不同位置有所区别的证据正在不断出现。在胃壁(gastric parietal)细胞中，β及γ肌动蛋白同工型在细胞中的分布是不同的，β肌动蛋白主要位于代谢更加活跃的顶端表面。在成熟神经元(adult neuron)中发现了相似的β及γ肌动蛋白极化。极化还延伸到mRNA定位，β肌动蛋白mRNA在与运动性相关的细胞如lamellapodia和生长锥(growth-cone)中特异地定位于外周位点，而γ肌动蛋白mRNA则不是这样。

有很多以上皮细胞极性改变或定向蛋白质运送过程中的缺陷为重要特征的疾病状态。例如在常染色体多囊肾病(autosomalpolycystic kidney disease)中，基底外侧蛋白(basolateral protein)在顶膜(apical membrane)上的异常表达导致产生充满液体的囊。最近报道了3个基底外侧膜组织化所需的细胞骨架结合蛋白，E-钙粘蛋白、sec6及sec8在患病细胞内异常定位。这导致了向基底外侧膜的蛋白及脂质运送受损(Charron et al.，2000，Journal of Cell Biology 149，111-124)。

囊性纤维化是一种常染色体隐性情况，通常是由于ΔF508突变。这个突变导致囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(cystic fibrosistransmembrane conductance regulator，CFTR)氯离子通道异常。在ΔF508突变导致的囊性纤维化中，CFTR异常折叠，从而在RER中滞留并被降解(Qu et al.，1997，Journal of Bioenergetics&Biomembranes29，483-490；Brown and Breton，2000，Kidney International57，816-824)。另外，具有ΔF508突变的CFTR在顶膜中半衰期缩短(Heda et al.，2001，American Journal of Physiology-Cell Physiology 280，C166-C174)。

在囊性纤维化患者中，肺上皮细胞表面的CFTR蛋白质数量减少。过去已经表明称为delta F508的CFTR普通突变形式被滞留于细胞内部并且几乎没有拷贝能够成功到达其所属的细胞表面。一种理论是CFTR蛋白质被滞留仅仅是因为其未能快速折叠，并且这些错误折叠的蛋白质在其获得到达其位置(即细胞表面)的机会之前即被降解。另一种可能是CFTR被滞留在细胞中是因为其被细胞中另一种蛋白质结合，例如BAP31。因而，任何可以促进CFTR到达细胞表面的试剂都可以是治疗囊性纤维化的潜在治疗剂。

在对局部缺血的反应中，在近端肾小管细胞(renal proximal tubulecell)中同样观察到了细胞骨架蛋白质分布的变化(Brown et al.，1997，American Journal of Physiology 273，F1003-F1012)。在大鼠肾中，发现一小时的局部缺血再灌注导致刷状缘蛋白质、绒毛蛋白和肌动蛋白再定位至基底外侧极(Brown et al.，1997，American Journal of Physiology273，F1003-F1012)。再灌注24小时后观察到了部分恢复，5日之内完全恢复。本文作者推测皮层肌动蛋白细胞骨架的解离可能允许细胞形状的改变以使存活细胞(surviving cells)覆盖细胞损失的区域。在另一研究中，发现近端肾小管细胞局部缺血导致原肌球蛋白与F肌动蛋白解离，原肌球蛋白再定位至微绒毛远端。这些作者提出原肌球蛋白再定位允许一种竞争性肌动蛋白结合蛋白质，肌动蛋白去寡聚化因子(actin depolymerising factor，ADF)去破坏顶端微丝进而破坏顶端微绒毛。

上皮细胞极性改变或定向蛋白质输送过程缺陷导致的疾病状态(如囊性纤维化)的诊断与治疗方法是非常需要的。

发明简述

本发明研究了胃肠上皮细胞肌动蛋白微丝的组分及其在运送囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)到顶膜中的作用。本研究揭示了一种特异的微丝群体，其含有在单细胞层中极化的原肌球蛋白同工型。这种微丝群体的极化在对细胞-细胞和细胞-基底(substratum)接触的反应中发生得非常迅速，并且其还涉及未被接触的微丝的移动。在长时间培养中观察到了原肌球蛋白同工型和CFTR的共定位(co-localisation)。原肌球蛋白同工型表达降低导致CFTR表面表达和cAMP刺激引起的氯离子外向通量(chloride efflux)均增加。此结果表明原肌球蛋白同工型可以表示调节蛋白质在细胞膜中的插入和/或保留的顶端微丝群体。

因此，本发明第一个方面提供了一种筛选调节细胞表面蛋白质活性的化合物的方法，所述方法包括确定在候选化合物存在的情况下原肌球蛋白的活性或细胞定位，其中相对比于所述化合物不存在时，在所述化合物存在的情况下原肌球蛋白的活性或细胞定位改变提示所述化合物调节所述细胞表面蛋白质的活性。

在此方面的一个优选的实施方案中，在所述化合物存在的情况下，原肌球蛋白细胞定位的改变，优选地是极化分布的丧失，提示所述化合物增加了所述细胞表面蛋白质的活性。

在另一个方面，本发明提供了一种筛选调节分子转运进细胞或转运出细胞的化合物的方法，所述方法包括确定在候选化合物存在的情况下原肌球蛋白的活性或细胞定位，其中相对比于所述化合物不存在时，在所述化合物存在的情况下原肌球蛋白的活性或细胞定位改变提示所述化合物调节分子转运进细胞或转运出细胞。

在此方面的一个优选的实施方案中，在所述化合物存在的情况下，原肌球蛋白细胞定位的改变，优选地是极化分布的丧失，提示所述化合物增加了分子转运进和/或出细胞。

在另一个方面，本发明提供了一种用于筛选治疗囊性纤维化的治疗性化合物的方法，所述方法包括在候选化合物存在的情况下确定原肌球蛋白的活性或细胞定位，其中相对比于所述化合物不存在时，在所述化合物存在的情况下原肌球蛋白的活性或细胞定位改变提示所述化合物在治疗囊性纤维化中是有用的。

在此方面的一个优选的实施方案中，在所述化合物存在的情况下，原肌球蛋白细胞定位的改变，优选地是极化分布的丧失，提示所述化合物在治疗囊性纤维化中是有用的。

在这些方面的一个独特的优选实施方案中，原肌球蛋白的细胞定位被视为所述化合物调节分子转运进细胞或转运出细胞或调节细胞表面蛋白质活性的能力的指示物。通常显示原肌球蛋白极化分布的细胞(例如胃肠上皮细胞、成纤维细胞或神经元)优选地被这种筛选方法选择。在所述候选化合物暴露于所选择的细胞后，接下来评估原肌球蛋白的定位或分布，并且与未被暴露于所述候选化合物的细胞内的原肌球蛋白的定位或分布对比。在一个优选实施方案中，原肌球蛋白在已被暴露于所述候选化合物的细胞内极化分布的丧失提示所述候选化合物能够增加细胞表面蛋白质的活性或所述化合物能够增加分子转运进和/或出细胞，或所述化合物在治疗囊性纤维化中是有用的。

在另一个方面，本发明提供了一种筛选调节细胞表面蛋白质的活性的化合物的方法，所述方法包括在候选化合物存在的情况下确定原肌球蛋白的表达水平，其中相对比于所述化合物不存在时，在所述化合物存在的情况下原肌球蛋白表达改变提示所述化合物调节所述细胞表面蛋白质的活性。

在此方面的一个优选的实施方案中，在所述化合物存在的情况下，原肌球蛋白表达降低提示所述化合物增加所述细胞表面蛋白质的活性。

在另一个方面，本发明提供了一种筛选调节分子转运进细胞或转运出细胞的化合物的方法，所述方法包括确定在候选化合物存在的情况下原肌球蛋白的表达水平，其中相对比于所述化合物不存在时，在所述化合物存在的情况下原肌球蛋白表达改变提示所述化合物调节分子转运进细胞或转运出细胞。

在此方面的一个优选的实施方案中，在所述化合物存在的情况下，原肌球蛋白表达降低提示所述化合物增加分子转运进细胞或转运出细胞。

在另一个方面，本发明提供了一种用于筛选治疗囊性纤维化的治疗性化合物的方法，所述方法包括确定在候选化合物存在的情况下原肌球蛋白的表达水平，其中相对比于所述化合物不存在时，在所述化合物存在的情况下原肌球蛋白表达改变提示所述化合物在治疗囊性纤维化中是有用的。

在此方面的一个优选的实施方案中，在所述化合物存在的情况下，原肌球蛋白表达降低提示所述化合物在治疗囊性纤维化中是有用的。

在一个优选实施方案中，确定原肌球蛋白的表达水平包括测量原肌球蛋白蛋白质和/或mRNA的量。在一个优选实施方案中，原肌球蛋白蛋白质的量是用抗-原肌球蛋白抗体测量的。在另一个实施方案中，原肌球蛋白相关转录物(例如mRNA)的量是通过与原肌球蛋白转录物选择性杂交的多核苷酸样品接触来测量的。

在另一个方面，本发明提供了一种筛选调节细胞表面蛋白质活性的化合物的方法，所述方法包括测量在候选化合物存在的情况下原肌球蛋白与其结合配偶体(binding partner)的结合，其中相对比于所述化合物不存在时，在所述化合物存在的情况下原肌球蛋白与其结合配偶体的结合水平改变提示所述化合物调节细胞表面蛋白质的活性。

在此方面的一个优选的实施方案中，在所述化合物存在的情况下，原肌球蛋白与其结合配偶体的结合水平降低提示所述化合物增加细胞表面蛋白质的活性。

在另一个方面，本发明提供了一种筛选调节分子转运进细胞或转运出细胞的化合物的方法，所述方法包括测量在候选化合物存在的情况下原肌球蛋白与其结合配偶体的结合，其中相对比于所述化合物不存在时，在所述化合物存在的情况下原肌球蛋白与其结合配偶体的结合水平改变提示所述化合物调节分子转运进细胞或转运出细胞。

在此方面的一个优选的实施方案中，在所述化合物存在的情况下，原肌球蛋白与其结合配偶体的结合水平降低提示所述化合物增加分子转运进细胞或转运出细胞。

在另一个方面，本发明提供了一种用于筛选治疗囊性纤维化的治疗性化合物的方法，所述方法包括测量在候选化合物存在的情况下原肌球蛋白与其结合配偶体的结合，其中相对比于所述化合物不存在时，在所述化合物存在的情况下原肌球蛋白与其结合配偶体的结合水平改变提示所述化合物在治疗囊性纤维化中是有用的。

在此方面的一个优选的实施方案中，在所述化合物存在的情况下，原肌球蛋白与其结合配偶体的结合水平降低提示所述化合物在治疗囊性纤维化中是有用的。

在本发明这些方面的一个进一步的优选实施方案中，原肌球蛋白结合配偶体选自calponin、CEACAM1、内抑制素(endostatin)、Enigma、凝溶胶蛋白(Gelsolin)(优选地是亚结构域2)、S100A2及肌动蛋白。在另一个优选实施方案中，原肌球蛋白结合配偶体是肌动蛋白。

为使本领域技术人员容易理解，本发明的方法提供了一种设计和选择与原肌球蛋白相互作用并调节原肌球蛋白活性的化合物的合理方法。大多数情况下，这些化合物会需要进一步的改进以增强活性。在独特的实施方案中，本发明的方法包括这些进一步的改进步骤。例如，本发明的实施方案中进一步包括制造步骤，如在药剂制造中将所述化合物掺入治疗组合物中。

因此，在另一个方面，所述方法进一步包括配制所鉴定的化合物以给予人或非人类动物，如本文所描述。

在另一个方面，本发明提供了一种调节蛋白质在细胞表面膜上插入或保留的方法，所述方法包括给予细胞一种调节原肌球蛋白表达、定位或活性的试剂。

在另一个方面，本发明提供了一种增加蛋白质在细胞表面膜上插入或保留的方法，所述方法包括给予细胞一种原肌球蛋白拮抗剂。

在另一个方面，本发明提供了一种调节分子转运进细胞或转运出细胞的方法，所述方法包括给予细胞一种调节原肌球蛋白表达、定位或活性的试剂。

在另一个方面，本发明提供了一种增加分子转运进细胞或转运出细胞的方法，所述方法包括给予细胞一种原肌球蛋白拮抗剂。

在本发明的一个实施方案中，被转运的分子选自电解质、水、单糖和离子。

在另一个方面，本发明提供了一种治疗或预防个体由于细胞表面膜蛋白异常插入、保留或活性而引起的疾病的方法，所述方法包括给予所述个体一种调节原肌球蛋白表达、定位或活性的试剂。优选地，所述调节原肌球蛋白表达、定位或活性的试剂是一种原肌球蛋白拮抗剂。

在本发明的一个优选的实施方案中，所述细胞表面膜蛋白选自转运蛋白、通道、受体、生长因子、抗原、信号传导蛋白和细胞粘着蛋白。所述转运蛋白优选地是囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)。

在本发明的一个进一步优选的实施方案中，所述细胞是非肌细胞。在一个优选的实施方案中，所述细胞是神经元细胞或上皮细胞。优选地，所述上皮细胞是胃肠上皮细胞。

所述由于细胞表面膜蛋白异常插入或活性而引起的疾病可以是例如囊性纤维化、多发性硬化、多囊肾病、病毒感染、细菌感染、再灌注损伤、门克斯病(Menkes disease)、威尔逊病(Wilson’s Disease)、糖尿病、肌强直性营养不良、癫痫或心境障碍如抑郁、双相性精神障碍或情绪恶劣性障碍。

在另一个方面，本发明提供了一种治疗或预防个体中囊性纤维化的方法，所述方法包括给予所述个体一种调节原肌球蛋白表达、定位或活性的试剂。优选地，所述调节原肌球蛋白表达、定位或活性的试剂是原肌球蛋白拮抗剂。

在本发明文中，优选地所述原肌球蛋白是由一个选自但不限于下述组中的人基因编码的同工型，所述组由TPM1、TPM2、TPM3及TPM4组成。例如，所述同工型可以选自TM1、TM2、TM3、TM4、TM5、TM5a、TM5b、TM6、Tm5NM-1、Tm5NM-2、Tm5NM-3、Tm5NM-4、Tm5NM-5、Tm5NM-6、Tm5NM-7、Tm5NM-8、Tm5NM-9、Tm5NM-10和Tm5NM-11。

在一个优选的实施方案中，所述原肌球蛋白同工型包括由TPM1基因外显子1b编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)或由TPM3基因外显子1b编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)。

在另一个优选实施方案中，所述原肌球蛋白同工型是TM5a(优选地具有SEQ ID NO：9所示序列)或TM5b(优选地具有SEQ ID NO：10所示序列)。

本发明所用原肌球蛋白拮抗剂可以选自肽、抗原肌球蛋白的抗体、小有机分子、抗原肌球蛋白编码mRNA的反义化合物、抗原肌球蛋白催化性分子如核酶或脱氧核酶(DNAzyme)及以原肌球蛋白表达为目标的dsRNA或小干扰RNA(RNAi)分子。

在一个优选的实施方案中，所述原肌球蛋白拮抗剂是针对原肌球蛋白编码mRNA的反义化合物、催化性分子或RNAi分子。在一个进一步的优选实施方案中，所述原肌球蛋白拮抗剂是特异针对TPM1基因外显子1b(SEQ ID NO：7)或反TPM3基因外显子1b(SEQ ID NO：8)的反义化合物、催化性分子或RNAi分子。

在一个进一步的优选实施方案中，所述原肌球蛋白拮抗剂是靶向序列AGCTCGCTGGAGGCGGTG(SEQ ID NO：13)的反义化合物、催化性分子或RNAi分子。

在一个特别优选的实施方案中，所述原肌球蛋白拮抗剂是一个包括序列CACCGCCUCCAGCGAGCT(SEQ ID NO：14)的反义化合物。

在一个优选的实施方案中，所述原肌球蛋白拮抗剂特异性地改变TM5a或TM5b的细胞定位。“特异性地改变TM5a或TM5b的细胞定位”意思是所述化合物显著地改变TM5a或TM5b的细胞定位同时不会显著地改变其它原肌球蛋白同工型的细胞定位。

在另一个优选的实施方案中，所述原肌球蛋白拮抗剂特异性地降低或抑制TM5a或TM5b表达。“特异性地降低或抑制TM5a或TM5b表达”意思是所述化合物显著地降低或抑制TM5a或TM5b表达同时不会显著地降低或抑制其它原肌球蛋白同工型的表达。

在另一个优选的实施方案中，所述原肌球蛋白拮抗剂特异性地改变TM5a或TM5b与其结合配偶体之一的结合。“特异性地改变TM5a或TM5b与其结合配偶体之一的结合”意思是所述化合物显著地改变TM5a或TM5b与其结合配偶体之一的结合同时不会显著地改变其它原肌球蛋白同工型与其配偶体的结合。

在另一个方面，本发明提供了一种评估一个个体对于由细胞表面膜蛋白的异常插入、保留或活性而引起的疾病的易感性(predisposition)的方法，所述方法包括确定在所述个体的原肌球蛋白基因中存在突变的步骤。

所述原肌球蛋白基因中的突变可能是一个点突变(即单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP))、缺失和/或插入。此类突变可通过从所述原肌球蛋白基因分离及测序DNA片段来检测或通过从所述个体分离mRNA并通过其合成DNA(例如通过RT-PCR)测序检测。突变还可以通过用有差别的寡核苷酸探针杂交或用有差别的寡核苷酸引物扩增程序来检测。

在另一个方面，本发明提供了一种评估一个个体对于由细胞表面膜蛋白异常插入、保留或活性而引起的疾病的易患性的方法，所述方法包括分析所述个体的细胞中原肌球蛋白的极化分布。

如果一种独特的原肌球蛋白同工型的分布在从所述受检个体衍生出的细胞中与在正常个体细胞中观察到的不同，这提示所述受检个体易患由于一种细胞表面膜蛋白异常插入、保留或活性而引起的疾病。

为了实现本发明的方法，本发明还提供了试剂盒，所述试剂盒包括多核苷酸探针和/或单克隆抗体及可能包括的定量标准。进一步地，本发明提供了在治疗本文所提到的病症的临床试验中涉及的评价药物效力和监控患者进程的方法。

很明显，本发明的一个方面的优选特征和性质也适用于本发明的其它方面。

本说明书全文中的词语“包含”应理解为是指包括所述要素、整数或步骤，或一组要素、一组整数或一组步骤，而且不是指排除任何其它要素、整数或步骤，或一组要素、一组整数或一组步骤。

附图说明

图1.四个原肌球蛋白(Tm)基因及其产物的图谱。外显子用阴影方块表示，3’非翻译序列用无阴影方块表示，内含子用线表示。(A)：fast基因(α-Tmf)。注意外显子1b对于Tm5a和Tm5b是特有的。(B)：Tm5NM基因。(C)：β-TM基因。(D)：TM-4基因(得自Temm-Grove CJet al 1998和Percival et al 2000)

图2.原肌球蛋白抗体特异性。原肌球蛋白抗体在T84细胞和人成纤维细胞中的特异性示于Western印迹中。311在T84细胞(左)和人成纤维细胞(右)中的特异性显示在A中，αf9d和CG3抗体的特异性分别显示在B和C中。311抗体在人成纤维细胞中检测Tm6(40kDa)、Tm2(36kDa)和Tm3(34kDa)。T84细胞中不存在Tm2。T84细胞和人成纤维细胞中都不存在Tm1(36kDa)。αf9d检测Tm6(40kDa)、Tm3(34kDa)、Tm5a(30kDa)和Tm5b(30kDa)。CG3抗体检测11个在30kDa共迁移的可能同工型。

图3.T84单细胞层表达Tm5a和Tm5b的极化分布。(A-F)：成熟T84单细胞层用αf9d(A和B)、311(C和D)及CG3抗体标记。抗体分布用共聚焦激光扫描显微镜(Confocal Laser Scanning Microscopy)分析。垂直平面(xz)的图像显示在左侧，水平平面(xy)的图像显示在右侧。αf9d和311的不同染色模式代表了Tm5a和Tm5b。比例尺条(Bar)：10μm。(G)：通过各个单细胞层的顶端及中央区域测量顶端和中央像素强度(pixel intensity)的平均值。在共染色的单细胞层中比较αf9d和311的顶端：中央平均像素强度比并且每一组都以平均值±标准差表示。结果代表了8个共染色的单细胞层的平均值。

图4.原肌球蛋白同工型在大鼠十二指肠小囊(crypt)和绒毛中的定位。大鼠十二指肠组织切片被固定并用αf9d(C和D)、311(E和F)及CG3(G和H)抗体染色。左侧是穿过小囊的切片，右侧是穿过绒毛的切片。A和B代表抗体阴性对照。箭头所示为胃肠上皮细胞。免疫反应性由蓝色染色表示，载玻片用核快红(Nuclear fast red)对比染色。比例尺条：10μm。

图5.原肌球蛋白同工型极化的发展。(A-L)：T84细胞免疫荧光共聚焦显微图像，细胞在接种(seeding)后不同时间点进行原肌球蛋白同工型染色。所有图像都是在垂直平面(xz)。在每一个时间点，左侧和中间的图像属于同一共染色的细胞。左侧显示的是311抗体(Tm3，6)染色。中间显示的是αf9d抗体(Tm3，5a，5b，6)染色。右侧细胞是用CG3抗体(TmNM1-11)染色。(A，B和C)：10分钟；(D，E和F)：1小时；(G，H和I)：2小时；(J，K和L)：24小时。箭头所示为一个悬浮的环染色(circumferential staining)的T84细胞。比例尺条：10μm。(M和N)：T84单细胞层发育过程中的总蛋白质和特异的原肌球蛋白同工型表达。蛋白质在接种后1、2、4、24小时及7天从T84细胞中提取。(M)：凝胶用考马斯蓝染色显示总蛋白质。(N)：用αf9d抗体(Tm3、5a、5b、6)免疫印迹的Western印迹。

图6.原肌球蛋白同工型在T84细胞中经过jasplakinolide或诺考达唑(nocodazole)处理后的定位。T84细胞免疫荧光共聚焦显微图像，细胞在接种后10分钟进行的原肌球蛋白同工型染色(A-D)及成熟的T84单细胞层图像(E和F)。全部图像是在垂直平面(xz)。左侧细胞用311抗体(Tm3、6)染色，右侧细胞用αf9d抗体(Tm3、5a、5b、6)染色。(A和B)：用1μM jasplakinolide处理的细胞。(C和D)：用33μM诺考达唑处理的细胞。(E和F)：用20μM细胞松弛素D处理3小时的T84单细胞层。箭头所示为一个悬浮的环染色的T84细胞。比例尺条：10μm。

图7.T84单细胞层对原肌球蛋白同工型和CFTR共染色。T84单细胞层对原肌球蛋白同工型和CFTR共染色的免疫荧光共聚焦显微图像。全部图像是在垂直平面。(A)：αf9d抗体(Tm3、5a、5b、6)。箭头所示为在与CFTR不相关的顶膜上富集αf9d染色的区域。(B)：CFTR抗体。箭头所示为位于细胞质中的CFTR。(C)：图像A和图像B的重叠。比例尺条：10μm。

图8.针对Tm5a和Tm5b的反义和无义寡核苷酸对T84单细胞层中αf9d抗体染色分布的作用。T84单细胞层的免疫荧光共聚焦显微图像。两个图像均在垂直平面。两个单细胞层都已用αf9d抗体(Tm3、5a、5b、6)染色。(A)：无义寡核苷酸2μM处理24小时；(B)：反义寡核苷酸2μM处理24小时。比例尺条：10μm。(C和D)：Western印迹显示针对Tm5a和Tm5b的反义和无义寡核苷酸对T84细胞的作用。在用针对Tm5a和Tm5b的2μM反义或无义寡核苷酸处理24小时后，从T84单细胞层提取蛋白质。(C)：凝胶用考马斯蓝染色显示总蛋白质。(D)：用αf9d抗体(Tm3、5a、5b、6)免疫印迹的Western印迹。(E)：针对Tm5a和Tm5b的反义和无义寡核苷酸对在T84单细胞层中用αf9d抗体顶端染色的强度的作用。所述顶端αf9d抗体染色像素强度在用2μM反义或无义寡核苷酸处理24小时的T84单细胞层中通过共聚焦显微镜确定。每一组用平均值±1标准差描述。(无义：150.86±48.28，反义：53.62±31.62；p＜0.001)

图9.针对Tm5a和Tm5b的反义和无义寡核苷酸对T84单细胞层的CFTR细胞表面表达和氯离子外向通量的作用。(A)：酶联CFTR表面表达测试在用2μM反义或无义寡核苷酸处理24小时的T84单细胞层上进行。CFTR表达在655nm处吸收表示，在每个实验内以无义寡核苷酸处理组的平均吸收值做标准化。每一组用平均值±1标准差描述。(无义：1±0.42，反义：1.49±0.78；p＜0.001)。(B)：MQAE氯离子外向通量测试在用针对Tm5a和Tm5b的2μM反义或无义寡核苷酸的对照T84单细胞层上进行。15分钟的累积氯离子外向通量由自基线(baseline)的荧光百分比增长平均值表示，在每个实验内以无义寡核苷酸处理组的平均百分比增加做标准化。每一组用平均值±1标准差描述。(无义：1±0.36，反义：1.47±0.41；p＜0.001)。

图10.诺考达唑处理对T84单细胞层的CFTR细胞表面表达和氯离子外向通量的作用。酶联CFTR表面表达测试在用或未用33μM诺考达唑处理3小时的毛喉素刺激的T84单细胞层上进行。CFTR表达用655nm处的吸收表示，在每个实验内以对照组的平均吸收值做标准化。每一组用平均值±标准差描述。(对照：1.00±0.29，诺考达唑：0.92±0.25；p＝0.64)。(B)：MQAE氯离子外向通量测试在对照T84单细胞层上和在用33μM诺考达唑处理3小时的T84单细胞层上进行。15分钟的累积氯离子外向通量由自基线的荧光百分比增长平均值表示，在每个实验内以对照组的平均百分比增加做标准化。每一组用平均值±标准差描述。(对照：1.00±0.22，诺考达唑：1.01±0.43；p＝0.93)。

序列表简述

SEQ ID NO：1：原肌球蛋白1(α)(TPM1)基因序列编码的一种同工型的人(Homo sapiens)cDNA序列；

SEQ ID NO：2：原肌球蛋白2(β)(TPM2)基因序列编码的一种同工型的人cDNA序列；

SEQ ID NO：3：原肌球蛋白3(TPM3)基因序列编码的一种同工型的人cDNA序列；

SEQ ID NO：4：原肌球蛋白4(TPM4)基因序列编码的一种同工型的人cDNA序列；

SEQ ID NO：5：同工型TM5a的人cDNA序列；

SEQ ID NO：6：同工型TM5b的人cDNA序列；

SEQ ID NO：7：TPM1基因外显子1b的人DNA序列；

SEQ ID NO：8：TPM3基因外显子1b的人DNA序列；

SEQ ID NO：9：同工型TM5a的人蛋白质序列；

SEQ ID NO：10：同工型TM5b的人蛋白质序列；

SEQ ID NO：11：TPM1基因外显子1b的人蛋白质序列；

SEQ ID NO：12：TPM3基因外显子1b的人蛋白质序列；

SEQ ID NO：13：用于优选的反义构建体的TPM1基因外显子1b中的人靶序列；

SEQ ID NO：14：靶向TPM1基因外显子1b的反义寡核苷酸序列；

SEQ ID NO：15：无义寡核苷酸序列(对照序列)；

SEQ ID NO：16和17：用于产生下调人TM5a或TM5b产物的siRNA分子的多核苷酸；

SEQ ID NO：18-20：TPM1基因外显子1b编码的氨基酸序列中的抗原性表位。

优选实施方案的详细描述

除非另外说明，本文所用全部技术性及科学性术语具有本领域(例如细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术及生物化学)技术人员所通常理解的含义。标准技术被用于分子、遗传及生化方法(一般地参见Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rded.(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.和Ausubel et al.，Short Protocols in Molecular Biology(1999)4th Ed，John Wiley&Sons，Inc.-和题为“Current Protocols in MolecularBiology”的完全版，这些文献并入此处作参考)和化学方法。

原肌球蛋白

本发明基于蛋白质在细胞表面膜的插入、保留或维持被原肌球蛋白调节的发现。此发现提供了关于由细胞表面蛋白质的异常插入或功能导致的疾病的诊断及治疗方法的基础。

原肌球蛋白(tropomyosins，TMs)是在所有真核细胞中都有发现的一组有多种形式的蛋白质，其在肌肉(骨骼肌、心肌和平滑肌)、大脑和多种非肌细胞中都有独特的同工型。它们是伸长的蛋白质，在其全长上具有简单的二聚α-螺旋卷曲螺旋结构。所述卷曲螺旋结构基于一种在第一和第四个位置具有疏水残基的7个氨基酸的重复模式，并且此结构在从酵母到人类的真核生物中的所有TM同工型中是高度保守的，都具有一个显著的7残基重复周期(5个基序)。不同的同工型由差别剪接产生，例如α-原肌球蛋白的同工型在横纹肌和平滑肌中不同。

TMs与肌细胞的肌节(sarcomere)中的细丝和非肌细胞的微丝相关。TMs用头-尾相接(head-to-tail)方式互相结合并处于F-肌动蛋白的沟内，每一个TM都与6或7个肌动蛋白单体互相作用。

TM在骨骼肌和心肌中的作用是与肌钙蛋白复合物(肌钙蛋白T、C和I)一起调节肌动蛋白和肌球蛋白的钙敏感性相互作用。在静息胞内钙离子浓度下，肌钙蛋白-原肌球蛋白复合物抑制肌动球蛋白ATP酶活性。当一个刺激诱导肌细胞中的钙离子释放时，肌钙蛋白C结合多余的钙离子并且通过肌钙蛋白-原肌球蛋白复合物传递一个构象变化，所述肌钙蛋白-原肌球蛋白复合物不再抑制肌动球蛋白ATP酶活性，导致收缩。

对比于骨骼肌和心肌，平滑肌和非肌肉TMs的生物学功能还不清楚。平滑肌和非肌细胞缺少肌钙蛋白复合物，并且肌球蛋白轻链的磷酸化似乎是控制肌动蛋白和肌球蛋白相互作用的主要钙敏感性调控机制。不同细胞类型的收缩性结构(contractile apparatus)调节的差异似乎需要结构和功能上都不同的TM形式。

当本文用到术语“原肌球蛋白”时，其应该包括该蛋白质的所有同工型。例如，所述术语包括由哺乳动物基因TPM1(也称为α-TM基因)(MacLeodand Gooding，1988，Mol.Cell.Biol.8，433-440)、TPM2(也称为β-TM基因)(MacLeod et al.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82，7835-7839)、TPM3(也称为γ-TM基因)(Clayton et al.，1988，J.Mol.Biol.201，507-515)和TPM4(也称为δ-TM基因)(MacLeod et al.，1987，J.Mol.Biol.194，1-10)编码的所有同工型。

通过可变剪接从这4个基因衍生出至少40种原肌球蛋白同工型(图1)。例如参见Lees-Miller and Helfman，1991，Bioessays 13(9)：429-437。尽管原肌球蛋白同工型具有高度相似性，但是在肌动蛋白结合域和头-尾结合域还是有一些差异。不同的原肌球蛋白同工型具有对肌动蛋白不同的结合亲和性，并且这被认为在肌动蛋白微丝的稳定性方面导致了不同作用。另外，肌球蛋白在肌动蛋白微丝上的位置可能调节肌动蛋白在细胞运动和细胞骨架重塑(remodeling)方面的作用。一旦被插入，原肌球蛋白影响肌动蛋白和其它肌动蛋白结合蛋白之间的相互作用。例如，高分子量的原肌球蛋白对于抵抗肌动蛋白结合蛋白凝溶胶蛋白的切割活性(severing activity)有保护作用。

由人TPM1、TMP2、TPM3和TPM4基因编码的同工型的cDNA序列分别列于SEQ ID NO：1至4。这些序列仅仅是代表性的例子，不是为了限制本方面的范围。本发明的方法可以用于其它人类或非人类的原肌球蛋白序列。

诊断分析

本发明的一个方面涉及一种预期一个个体具有易患由细胞表面蛋白异常插入、保留或活性而引起的疾病的可能性的方法，或帮助诊断此类疾病的方法。

在一个实施方案中，所述诊断方法包括从一个个体获取一个待测多核苷酸样品并分析样品的原肌球蛋白基因的步骤。

所述待测遗传样品可以从所述个体任何具核的细胞中获取。对于基因组DNA分析，事实上任何生物学样品(除纯红细胞外)都是合适的。例如，易获取的组织样品包括全血、精液、唾液、泪液、尿、排泄物、汗液、皮肤、睾丸、胎盘、肾和毛发。对于cDNA或mRNA分析，所述组织样品优选地从有靶核酸表达的器官中获取。例如，上皮细胞是获取原肌球蛋白基因cDNA的合适来源。

分析原肌球蛋白基因可能需要从靶样品扩增DNA。这可以通过例如PCR完成。一般地可参见PCR Technology：Principles andApplications for DNA Amplification(ed.H.A.Erlich，Freeman Press，New York，N.Y.，1992)；PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications(eds.Innis，et al.，Academic Press，San Diego，Calif.，1990)；Mattila et al.，Nucleic Acids Res.19，4967(1991)；Eckert et al.，PCRMethods and Applications 1，17(1991)；PCR(eds.McPherson et al.，IRLPress，Oxford)；和U.S.Pat.No.4,683,202。

其它合适的扩增方法包括连接酶链式反应(Ligase Chain Reaction，LCR)(参见Wu and Wallace，Genomics 4，560(1989)，Landegren et al.，Science 241，1077(1988))、转录扩增(Kwoh et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,1173(1989))和自动维持序列扩增(Guatelli et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，87，1874(1990))和基于核酸的序列扩增(nucleic acidbased sequence amplification，NASBA)。后两种扩增方法包括基于同时产生单链RNA(ssRNA)和双链DNA(dsDNA)扩增产物的等温转录的等温反应，所述单链RNA和双链DNA产物的比例大约分别是30或100比1。

位于感兴趣的多态位点的核苷酸可以被多种方法鉴别，如基因组DNA的Southern分析；限制酶消化的直接突变分析；RNA的Northern分析；变性高压液相色谱(DHPLC)；基因分离及测序；等位基因特异性寡核苷酸与基因扩增产物的杂交；外显子捕获(exon trapping)；单碱基延伸(single base extension，SBE)；或原肌球蛋白蛋白质分析。

在另一个实施方案中，所述诊断方法包括分析原肌球蛋白在所述个体的细胞中的极化分布。此分析可以通过例如取自所述受检个体的细胞(优选地是上皮细胞)内一种独特的原肌球蛋白同工型的抗体染色进行。

原肌球蛋白拮抗剂/激动剂

本发明的一个方面涉及筛选调节原肌球蛋白活性或细胞内定位的方法。

在某些实施方案中，潜在调节物的组合文库(combinatorial library)根据结合原肌球蛋白或调节活性的能力被筛选。传统上，具有有用性质的新的化学实体(chemical entity)通过鉴别一种具有某种所希望的性质或活性(例如抑制活性)的化学化合物(称为“前导化合物(leadcompound)”)、生成所述前导化合物的变体及评价那些变体化合物的性质及活性来产生。经常地，高通量筛选(HTS)方法被用于此类分析。

在一个优选的实施方案中，高通量筛选方法包括提供一个含有大量潜在治疗性化合物(候选化合物)的文库。此类“组合化学文库”接下来在一种或多种检测中被筛选，以鉴别那些显示所希望的特征活性的文库成员(尤其是化学种(species)或亚类(subclass))。被如此鉴别的化合物可以用作传统的“前导化合物”或其自身可以用作潜在的或实际的治疗剂。

一个组合化学文库是一个由化学合成或生物学合成产生的不同化学化合物的集合，所述化学合成或生物学合成通过组合一定数量的化学“积木(building blocks)”如试剂来完成。例如，一个线性组合化学文库如一个多肽(例如突变蛋白(mutein))文库通过对于指定的化合物长度(即一个多肽化合物中的氨基酸数目)以所有可能的方式组合一组称为氨基酸的化学积木建立。数以百万计的化学化合物可以通过此类化学积木的组合性混和(combinatorial mixing)合成(Gallop et al.，1994，J.Med.Chem.37(9)：1233-1251)。

组合化学文库的制备和筛选是本领域技术人员所熟知的。所述组合化学文库包括但不限于肽文库、类肽(peptoid)、被编码的肽、随机生物寡聚物(random bio-oligomer)、非肽肽模拟物(nonpeptidalpeptidomimetics)、小化合物文库的类似有机合成物(analogousorganic syntheses of small compound library)、核酸文库、肽核酸文库、抗体文库、碳水化合物文库和小有机分子文库。

原肌球蛋白结合化合物可以用本领域技术人员所熟知的方法容易地鉴别并分离。可用于鉴别原肌球蛋白结合化合物的方法例如酵母双杂交筛选、噬菌体展示、亲和层析、表达克隆和Biacore系统。Biacore系统被用于鉴别原肌球蛋白的化学模拟物，因为这些系统可以实时检出与监测生物分子的结合事件而不需要标记，并且其通常不需要纯化所包含的物质(Biacore，Rapsagatan 7，SE 754 50 Uppsala.)。

特别地，酵母双杂交筛选方法利用了转录激活以测定蛋白质-蛋白质相互作用。很多转录因子可被分为两个结构域：一个DNA结合结构域和一个转录激活结构域，它们在分开时是无活性的。当这两个结构域被置于“紧密接近(closely proximity)”状态，它们的功能性转录激活活性重新产生。在本发明中，原肌球蛋白与一个转录因子的DNA结合结构域融合，从cDNA文库中得到的cDNA与编码一个转录激活结构域的序列融合。一个被编码与一个转录因子DNA结合结构域相融合的感兴趣蛋白的cDNA转化的酵母菌株，被所述转录激活结构域/cDNA融合文库转化。任何编码与感兴趣的蛋白质相结合的蛋白质的cDNA将允许生成一个功能性杂交转录激活物(因为所述DNA结合结构域和转录激活结构域现在处于“紧密接近”状态)，其引起报道基因的表达并导致细胞存活。编码所述结合蛋白的cDNA接下来被分离，其编码的蛋白质也被鉴别。

鉴别调节物的测定优选地适用于高通量筛选。因此优选的测定可以检出原肌球蛋白基因转录的增强或抑制、多肽表达的抑制或增强、和多肽活性的抑制或增强。

特定核酸或蛋白质产物的存在、缺失、量化、或其它性质的高通量测定是本领域技术人员所熟知的。类似地，结合测定和报道基因测定也是被熟知的。因此，例如U.S.Patent No.5,559,410公开了蛋白质的高通量筛选方法，U.S.Patent No.5,585,639公开了核酸结合(即阵列(array))的高通量筛选方法，U.S.Patent Nos.5,576,220和5,541,061公开了配体/抗体结合的高通量筛选方法。

另外，高通量筛选系统已可商业获得(参见例如Zymark Corp.，Hopkinton，MA；Air Technical Industries，Mentor，OH；BeckmanInstruments，Inc.Fullerton，CA；Preeision Systems，Inc.，Natick，MA，等等)。这些系统典型地使所述测定全程自动化，包括所有样品及试剂加样、液体分液(liquid dispensing)、定时孵育(timed incubaion)、和在适于所示测试的检测仪上进行微平板(microplate)的最终读数。这些可配置的系统提供高通量和快速启动，以及高度可调性和高度用户化。此类系统的制造者对于不同的高通量系统提供详细的使用方案。例如Zymark Corp.提供技术手册描述检测基因转录调节、配体结合调节等的筛选系统。

蛋白质或肽抑制剂

在一个实施方案中，调节物是蛋白质，通常是天然产生的蛋白质或天然产生的蛋白质的片段。因而，可以应用例如含有蛋白质的细胞提取物或蛋白质细胞提取物的随机或指定消化物。

以这种方式，蛋白质文库可针对用本发明的方法筛选而建立。本实施方案中特别优选的是细菌、真菌、病毒、及哺乳动物蛋白质文库，其中哺乳动物蛋白质文库是优选的，人类蛋白质文库是尤其优选的。特别有用的测试化合物是被归类到靶所属的蛋白质种类的那些，例如酶底物或配体和受体。

在一个优选的实施方案中，调节物是大约5到大约30个氨基酸的肽，优选地是大约5到大约20个氨基酸，特别优选地是大约7到大约15个氨基酸。所述肽可以是如上所述的天然产生的蛋白质的消化物，随机肽，或“有倾向性的(biased)”随机肽。本文中“随机化的(randomized)”或其语法上的等同物是指每一个核酸和肽基本上分别由随机核苷酸或氨基酸组成。由于通常这些随机肽(或核酸，在后文讨论)是化学合成的，它们可能在任何位置掺入任何核苷酸或氨基酸。所述合成过程可以被设计为产生随机化的蛋白质或核酸，以允许在序列上生成全部或大部分可能的组合，从而建立一个随机化的候选生物活性蛋白质制剂的文库。

在一个实施方案中，肽基原肌球蛋白抑制剂是化学或重组合成的，如衍生自原肌球蛋白序列的寡肽(约10-25氨基酸长)。或者，原肌球蛋白片段由天然或重组产生的原肌球蛋白被例如用蛋白酶消化产生，所述蛋白酶例如胰蛋白酶、嗜热芽孢菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、或胃蛋白酶。应用电脑分析(用已有商业软件例如MacVector，Omega，PCGene，Molecular Simulation，Inc.)鉴别蛋白切割位点。所述蛋白切割或合成片段可包括部分或完全抑制原肌球蛋白功能所需数目的氨基酸残基。优选的片段长度包括至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个氨基酸。

蛋白质或肽抑制剂也可以是原肌球蛋白的显性失活突变体。术语“显性失活突变体(dominant-negative mutant)”是指一个原肌球蛋白肽段被从其天然状态突变并与一种通常与原肌球蛋白相互作用的蛋白质相互作用，从而阻止内源性天然原肌球蛋白发生所述相互作用。

抗-原肌球蛋白抗体

本发明所用术语“抗体”包括完整分子及其片段，如能够结合原肌球蛋白表位决定簇的Fab、F(ab′)2和Fv。这些抗体片段保留一定选择性结合其抗原的能力，并定义如下：

(1)Fab，含有一个抗体分子的一个一价抗原结合片段的片段，可通过用木瓜蛋白酶消化整个抗体以获取一条完整轻链和一条重链的一部分来产生；

(2)Fab’，一个抗体分子片段，可通过用胃蛋白酶处理整个抗体、再进行还原以获取一条完整轻链和重链的一部分获得；每个抗体分子可获得两个Fab’片段；

(3)(Fab’)2，一个抗体片段，可通过用胃蛋白酶处理整个抗体而不进行还原获得；F(ab)2是两个Fab’片段通过两个二硫键连在一起而形成的二聚体；

(4)Fv，定义为一个含有轻链可变区和重链可变区的遗传工程片段，表达为两条链；及

(5)单链抗体(SCA)，定义为一个含有通过合适的多肽接头(linker)连接的轻链可变区和重链可变区的作为一个遗传融合单链分子的遗传工程分子。

制造这些片段的方法被本领域所熟知。(参见例如Harlow andLane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1988)，并入此处作参考)。

本发明的抗体可以通过以完整原肌球蛋白或其片段为免疫抗原制备。一个用于免疫动物的肽可以衍生自翻译的cDNA或化学合成并被纯化及缀合到载体蛋白质，如果需要的话。此类通常用的与所述肽化学偶联的载体包括匙孔血蓝蛋白(KLM)、甲状腺球蛋白、牛血清清蛋白(BSA)和破伤风毒素。偶联的肽可以接下来用于免疫所述动物(例如小鼠或兔)。

如果需要，多克隆抗体可被进一步纯化，例如通过在一种结合了产生所述抗体的所述肽的基质上结合并洗脱。本领域技术人员应当了解免疫学领域的对于纯化和/或浓缩多克隆抗体及单克隆抗体的各种普通技术。(参见例如Coligan，et al.，Unit 9，Current Protocols inImmunology，Wiley Interscience，1991，并入此处作参考)。

单克隆抗体可用任何通过培养中的持续细胞系产生抗体分子的技术制备，例如杂交瘤技术、人类B细胞杂交瘤技术和EBV杂交瘤技术(Kohler et al.Nature 256，495-497，1975；Kozbor et al.，J.Immunol.Methods 81，31-42，1985；Cote et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80，2026-2030，1983；Cole et al.，Mol.Cell Biol.62，109-120，1984)。

本领域所熟知的技术使显示结合原肌球蛋白的抗体可从抗体表达文库中鉴别并分离。例如，一种鉴别并分离一个显示结合原肌球蛋白的抗体结合结构域的方法是噬菌体λ载体系统。此载体系统已被用于在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达一个得自小鼠抗体所有组成成分的Fab片段组合文库(Huse，et al.，Science，246：1275-1281，1989)和一个得白人抗体所有组成成分的Fab片段组合文库(Mullinax，et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.，87：8095-8099，1990)。通过与预选择的配体结合，此方法学还可用于表达单克隆抗体的杂交瘤细胞系。分泌所希望的单克隆抗体的杂交瘤可以通过利用本领域技术人员所熟知技术的多种途径产生，此处不再重复。这些技术的详细内容在下列参考文献中被描述：Monoclonal Antibodies-Hybridomas：ANew Dimension in Biological Analysis，Edited by Roger H.Kennett，etal.，Plenum Press，1980；和U.S.4,172,124，并入此处作参考。

另外，产生具有“人类化(humanized)”抗体不同组合的嵌合体抗体分子的方法在本领域中是熟知的，并且包括将鼠可变区和人恒定区组合在一起(Cabily，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：3273，1984)，或通过移植鼠抗体互补决定区(CDRs)至人构架上完成(Riechmann，etal.，Nature 332：323，1988)。

在一个实施方案中，所述抗体结合选自但不限于SEQ ID NOs：18-20的人原肌球蛋白一个区域的至少一部分。

反义化合物

术语“反义化合物”涵盖与原肌球蛋白mRNA分子的至少一部分互补(Izant and Weintraub，Cell 36：1007-15，1984；Izant and Weintraub，Science 229(4711)：345-52，1985)并能够干扰转录后事件如mRNA翻译的DNA或RNA分子。互补于原肌球蛋白编码mRNA的至少大约15个连续核苷酸的反义寡聚体是优选的，因为它们可以很容易地合成并且当被导入产生原肌球蛋白的靶细胞时与较大分子比较不可能引起问题。反义方法的应用是本领域熟知的(Marcus-Salcura，Anal.Biochem.172：289，1988)。优选的反义核酸应包括与SEQ IDNO：7或SEQ ID NO：8所列出的编码氨基酸序列的序列的至少15个连续核苷酸互补的核苷酸序列。

催化核酸

术语催化核酸(catalytic nucleic acid)是指DNA分子或含有DNA的分子(本领域中也称为脱氧核酶(DNAzyme))或RNA或含有RNA的分子(也称为核酶(ribozyme))，所述分子特异性地识别独特的底物并催化该底物的化学修饰。催化核酸中的核酸碱基可以是碱基A、C、G、T和U，及其衍生物。这些碱基的衍生物是本领域所熟知的。

典型地，催化核酸含有一个特异识别靶核酸的反义序列和一种核酸切割的酶活性(本文中也称为“催化结构域”)。为获得特异性，优选的核酶和脱氧核酶应包括与编码原肌球蛋白同工型的序列的至少大约12-15个连续核苷酸互补的核苷酸序列。

本发明中特别有用的核酶类型是锤头状核酶(Haseloff andGerlach 1988，Perriman et al.，1992)和发夹状核酶(hairpin ribozyme)(Shippy et al.，1999)。

本发明的核酶和编码核酶的DNA可以用本领域所熟知的方法进行化学合成。核酶还可通过与一个RNA聚合酶启动子(例如T7 RNA聚合酶启动子或SP6 RNA聚合酶启动子)可操纵地连接的DNA分子制备(其转录时产生RNA分子)。因此，本发明还提供了一个编码本发明的核酶的核酸分子，即DNA或cDNA。当所述载体还含有一个与所述DNA分子可操纵连接的RNA聚合酶启动子时，所述核酶可通过与RNA聚合酶及核苷酸温育在体外合成。在另一个实施方案中，所述DNA可被插入一个表达盒(expression cassette)或转录盒(transcription cassette)中。在合成之后，所述RNA分子可以通过连接到一个能稳定所述核酶并使其可以抗RNA酶的DNA分子上来修饰。另外，所述核酶可被修饰为磷硫类似物(phosphothio analog)以用于脂质体送递系统。这一修饰也使核酶具有对核酸内切酶活性的抗性。

RNA抑制剂

dsRNA对于特异地抑制独特蛋白的产生是尤其有用的。尽管不希望受限于理论，Dougherty和Parks(Curr.Opin.Cell Biol.7：399(1995))已经提出了一个dsRNA可以用于降低蛋白产量的机制模型。此模型最近被Waterhouse et al.修改并扩展(Proc.Natl.Acad.Sci.95：13959(1998))。该技术基于存在含有具有与感兴趣的基因的mRNA基本相同的序列的dsRNA分子，在此情况下所述mRNA是一个编码原肌球蛋白的mRNA。方便地，所述dsRNA可以在重组载体或宿主细胞中由一个单一开放阅读框产生，其中有义及反义序列侧翼是无关序列，其使有义和反义序列能够杂交生成dsRNA分子，与无关序列一起形成一个环结构。针对原肌球蛋白的适当dsRNA分子的设计和生成是本领域技术人员力所能及的，特别是考虑到Dougherty和Parks(1995，见上)、Waterhouse et al.(1998，见上)、WO 99/32619、WO99/53050、WO 99/49029和WO 01/34815。

如本文所用，术语“小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)”和“RNAi”是指同源双链RNA(dsRNA)，其特异地靶定一个基因产物，从而导致无效(null)表型或亚效(hypomorphic)表型。特别地，所述dsRNA包括两个衍生自编码PAC-1的靶RNA并具有自身互补性的短核苷酸序列，以便其可以退火并推测其在转录后水平干扰靶基因的表达。RNAi分子被描述于Fire et al.，Nature 391，806-811，1998，并被综述于Sharp，Genes&Development，13，139-141，1999。

优选的siRNA分子包括与靶mRNA中大约19-21个连续核苷酸相同的核苷酸序列。优选地，所述靶序列是TPM1或TPM3基因的外显子1b。

如本文所示，优选的针对原肌球蛋白编码区的siRNA包括一段21个核苷酸的序列，如SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17所示。对于根据SEQ ID NOS：16和17列出的示范性siRNA产生包括一个茎环结构的siRNA，有义和反义链被放置以便它们位于一个间插环序列(intervening loop sequence)的侧翼。优选的环序列应该是为本领域技术人员所熟知的。

小分子抑制剂

可以测定大量有机分子调节免疫系统的能力。例如，在本发明一个实施方案中，适当的有机分子可以选自一个化学文库，其中化学物质分别被测定，或者选自组合化学文库，其中多个化合物一起被测定，然后去重叠(deconvolute)以确定并分离活性最强的化合物。

这类组合化学文库的代表性例子包括那些如下所描述的：Agrafiotis et al.，″System and method of automatically generatingchemical compounds with desiredproperties，″U.S.Pat.No.5,463,564；Armstrong，R.W.，″Synthesis of combinatorial arrays of organiccompounds through the use of multiple component combinatorial arraysyntheses，″WO95/02566；Baldwin，J.J.et al.，″Sulfonamide derivativesand their use，″WO 95/24186；Baldwin，J.J.et al.，″Combinatorialdihydrobenzopyran library，″WO 95/30642；Brenner，S.，″New kit forpreparing combinatorial libraries.″WO 95/16918；Chenera，B.et al.，″Preparation of library of resin-bound aromatic carbocyclic compounds，″WO 95/16712；Ellman，J.A.，″Solid phase and combinatorial synthesis ofbenzodiazepine compounds on a solid support，″U.S.Pat.No.5,288,514；Felder. E.et al.，″Novel combinatorial compound libraries，″WO95/16209；Lerner.R.et al.，″Encoded combinatorial chemical libraries.″WO 93/20242；Pavia，M.R.et al.，″A method for preparing and selectingpharmaceutically useful non-peptide compounds from a structurallydiverse universal library″WO 95/04277；Summerton，J.E.和D.D.Weller，″Morpholino-subunit combinatorial library andmethod，″U.S.Pat.No.5,506,337；Holmes，C.，″Methods for the Solid Phase Synthesis ofThiazolidinones，Metathiazanones，and Derivatives thereof，″WO96/00148；Phillips，G.B.和G.P.Wei，″Solid-phase Synthesis ofBenzimidazoles，″Tet.Letters 37：4887-90，1996；Ruhland，B.et al.，″Solid-supported Combinatorial Synthesis of StrueturallyDiverse.beta.-Lactams，″J.Amer.Chem.Soc.111：253-4，1996；Look，G.C.et al.，″The Identification of Cyclooxygenase-1 Inhibitors from4-Thiazolidinone Combinatorial Libraries，″Bioorg and Med.Chem.Letters 6：707-12，1996。

候选化合物可以是有机分子，优选地是具有分子量大于100小于大约2500道尔顿的小有机化合物。优选的小分子小于2000、或小于1500、或小于1000、或小于500道尔顿。候选试剂包括对于和蛋白质结构性相互作用(尤其是氢键作用)必需的功能基团，并且典型地包括至少一个胺、羰基、羟基或羧基，优选地包括至少所述功能性化学基团中的两个。候选试剂通常包括被一或多个上述功能基团取代的环状碳(cyclical carbon)或杂环结构和/或芳族或多芳族结构(polyaromatic structure)。候选试剂还可以从包括糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、其衍生物、结构类似物或组合的生物分子中发现。

在一个实施方案中，本发明包括在原始及分级分离的(fractionated)天然产物提取物的文库中筛选小分子化学多样性(chemodiveristy)，以检测具有生物活性的化合物作为潜在候选物以进一步研究。

在本发明的一个实施方案中，所述候选化合物得自一个基因文库、低分子量化合物文库(如ChemBridge Research Laboratories的低分子量化合物文库)、细胞提取物、微生物培养上清液、细菌细胞组分等的表达产物。在一个独特的实施方案中，所述候选化合物得自一种肠致病性大肠杆菌(EPEC)菌株的提取物。

筛选原肌球蛋白激动剂/拮抗剂

基于原肌球蛋白极化分布的筛选方案

一种候选化合物抑制原肌球蛋白功能的能力的筛选方法的一个例子可以包括分析所述化合物对细胞中原肌球蛋白极化分布的作用。

例如，表达一种标记的感兴趣的原肌球蛋白同工型的细胞可被暴露于候选化合物并且监控所述原肌球蛋白同工型极化分布的丧失。所述标记的原肌球蛋白同工型可通过例如表达一个包括连接到一种荧光化合物(如绿色荧光蛋白(GFP))上的原肌球蛋白的融合构建体在细胞中产生。本领域技术人员应当了解其它可检测标记也可用于此筛选测定。

或者，细胞样品也可以暴露于一种候选化合物，感兴趣的原肌球蛋白同工型分布可由抗体染色确定。

基于原肌球蛋白表达的筛选方案

一种候选化合物抑制原肌球蛋白表达的能力的筛选方法的一个例子可以包括下述步骤：

(i)使一种候选化合物接触能够表达原肌球蛋白的细胞，

(ii)测量与所述候选化合物接触的细胞中原肌球蛋白的表达量，并且将此表达量与相应的对照细胞(未接触被研究的物质)中原肌球蛋白表达量(对照表达量)对比，及

(iii)选择一种相比于对照表达量(基于上述步骤(ii)的结果)，显示原肌球蛋白表达量降低的候选化合物。

本筛选方法所用细胞可以是任何能够表达原肌球蛋白的细胞，与天然和重组基因之间的区别无关。并且，所述原肌球蛋白的来源并没有被特别限制。所述细胞可以取自人，或取自人之外的其它哺乳动物如小鼠，或取自其它生物体。合适的人类细胞的例子是造血细胞，包括肥大细胞。并且，也可以用含有包括编码原肌球蛋白的核酸序列的表达载体的转化细胞。

允许所述候选化合物接触能够表达原肌球蛋白的细胞的条件没有限制，但是其优选地选自不会杀死适用细胞，并且可以表达原肌球蛋白基因的培养条件(温度、pH、培养物组成等等)。

术语“降低”不仅是指与对照表达量相比，还包括根本没有原肌球蛋白表达的情况。特别地，这包括原肌球蛋白表达量基本上为零的情况。

原肌球蛋白表达量可以通过测量一个原肌球蛋白基因(mRNA)表达量或通过测量所产生的原肌球蛋白量来评估。另外，测量原肌球蛋白量的方法不仅是一种直接测量基因(mRNA)表达量或所产生的蛋白质量的方法，也可以是任何反映这些的方法。

特别地，为测量原肌球蛋白表达量(检出及测定)，原肌球蛋白mRNA的表达量可通过DNA阵列或众所周知的方法如Northern印迹方法测量，其还可以通过用具有与应用的原肌球蛋白mRNA核苷酸序列互补的核苷酸序列的寡核苷酸的RT-PCR方法测量。另外，原肌球蛋白蛋白质的量可以通过使用如用抗原肌球蛋白抗体的Western印迹等众所周知的方法测量。

测量原肌球蛋白表达量(检出及测定)可以通过测量从标记基因衍生来的蛋白质活性来完成，所述测量使用已被导入了包括所述标记基因如连接到原肌球蛋白基因上的报道基因(例如荧光素酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因、β-葡糖醛酸糖苷酶基因、β-半乳糖苷酶基因和水母发光蛋白基因)的融合基因的细胞系来完成。或者，原肌球蛋白表达可以在遗传工程化的细胞中测量，其中一个报道序列通过同源重组被导入原肌球蛋白基因，从而该基因表达的原肌球蛋白产物被所述报道物(reporter)标记。

基于原肌球蛋白与其一或多个结合配偶体的结合的筛选方案

在一个实施方案中，原肌球蛋白激动剂或拮抗剂通过筛选干扰原肌球蛋白与原肌球蛋白结合配偶体结合的候选化合物鉴别。一个合适的原肌球蛋白结合配偶体的例子是肌动蛋白。

标准固相ELISA测定方式对于鉴别蛋白-蛋白相互作用的拮抗剂是特别有用的。根据本实施方案，一个结合配偶体(例如肌动蛋白丝)被固定在固体基质例如一个多针阵列(array of polymeric pins)或玻璃支持物(glass support)上。方便地，固定化的结合配偶体是一个包括谷胱苷肽S-转移酶(GST)的融合多肽(例如CAP-肌动蛋白融合体)，其中GST部分协助所述蛋白质在固相支持物上的固定化。溶液中的第二个结合配偶体(例如原肌球蛋白)与固定化的蛋白质建立物理联系以形成一个蛋白质复合物，此复合物通过使用针对第二个结合配偶体的抗体检出。所述抗体通常用荧光分子标记或与一个酶(例如辣根过氧化物酶缀合，或者使用可结合第一个抗体的标记的第二个抗体。方便地，第二个结合配偶体以一个具有FLAG或寡组氨酸(oligo-histidine)肽标签或其它合适的免疫原性肽的融合多肽形式表达，其中抗所述肽段标签抗体被用于检出所述结合配偶体。另外，寡HIS标签标记的蛋白质复合物可以通过其与镍-NTA树脂(Qiagen)的结合检出，或者FLAG标记的蛋白质复合物可以通过其与FLAG M2亲和凝胶(FLAGM2 Affinity Gel，Kodak)的结合检出。对于本领域技术人员显而易见的是本文所述测定形式可用于样品的高通量筛选，例如用结合的肽或融合蛋白的微阵列(microarray)。

一种如US Patent No.6,316,223所描述的双杂交测定也可用于鉴别干扰原肌球蛋白与其一个结合配偶体结合的化合物。此系统的基本机制与酵母双杂交系统类似。在所述双杂交系统中，结合配偶体在哺乳动物宿主细胞中表达为两个不同的融合蛋白。调整标准双杂交筛选用于本发明，第一个融合蛋白由一个与一个结合配偶体融合的DNA结合结构域组成，第二个融合蛋白由一个与另一个结合配偶体融合的转录激活结构域组成。DNA结合结构域结合一个控制一或多个报道基因表达的操纵基因(operator)序列。转录激活结构域通过结合配偶体之间的功能性相互作用作用于启动子。接下来，转录激活结构域与细胞基本转录系统相互作用，从而激活报道基因表达，报道基因的表达是可以测定的。调节结合配偶体之间的蛋白-蛋白相互作用的候选生物活性试剂通过其与宿主细胞温育时调节报道基因转录的能力来鉴别。拮抗剂会阻止或降低报道基因表达，而激动剂会增强报道基因表达。在小分子调节物的情况下，这些小分子被直接加入细胞培养基中并测定报道基因的表达。另一方面，肽调节物可以表达自转染进宿主细胞的核酸并测定报道基因的表达。事实上，可在被转染的细胞中筛选完整的肽文库。

另外，例如Vidal et al.，Proc.Natl Acad.Sci USA 93，10315-10320，1996所描述的反向双杂交筛选(reverse two hybrid screens)可被用来鉴别拮抗剂分子。反向杂交筛选不同于上述正向筛选，其利用一个逆选择报道基因(counter-selectable reporter gene)例如CYH2或LYS2来对蛋白-蛋白相互作用进行选择。细胞存活或生长在所述逆选择报道基因产物的非毒性底物存在下降低或停止，该非毒性底物被所述基因产物转变为毒性化合物。因而，若细胞中不发生本发明的蛋白-蛋白相互作用，例如存在所述相互作用的拮抗剂，则该细胞可以在所述底物存在的情况下存活，因为该底物不会被转变为毒性化合物。例如，结合肌动蛋白的原肌球蛋白的一部分/片段表达为DNA结合结构域与如GAL4的DNA结合结构域的融合体；肌动蛋白结合原肌球蛋白的部分被表达为合适的转录激活结构域融合多肽(例如与GAL4转录激活结构域融合)。所述融合多肽被表达在酵母中，与URA3逆选择报道基因可操纵地连接，其中URA3的表达需要GAL4的DNA结合结构域与转录激活结构域的物理联系。此物理联系可通过例如将报道基因表达置于一个包含GAL4可结合的核苷酸序列的启动子控制之下达到。表达此报道基因的细胞在尿嘧啶和5-氟乳清酸(5-FOA)存在下不能生长，因为5-FOA被转变为毒性化合物。候选肽抑制剂被表达于此类细胞文库中，其中在尿嘧啶和5-FOA存在下能够生长的细胞被保留进行进一步分析，例如分析编码候选肽抑制剂的核酸。拮抗所述相互作用的小分子通过在所述小分子存在的情况下温育细胞并且选择在尿嘧啶和5-FOA存在下能够生长或存活的细胞来确定。

另外，还可以应用一个如Karin et al.的U.S.Patent No.5,776,689所描述的蛋白质募集系统(protein recruitment system)。在标准蛋白质募集系统中，细胞中的蛋白-蛋白相互作用通过一种非转录因子的效应蛋白向特异细胞器的募集来检测。所述效应蛋白移位至该细胞器后，所述效应蛋白激活一个位于该细胞器的报道分子，其中所述报道分子的激活可通过例如细胞生存力检出，提示存在蛋白-蛋白相互作用。

更特异地，蛋白质募集系统的组分包括编码包含所述效应蛋白和一个结合配偶体(例如肌动蛋白或其一部分)的第一个融合蛋白的第一个可表达核酸，以及编码包含一个细胞器定位结构域和另一个结合配偶体(例如原肌球蛋白或其一部分)的第二个融合蛋白的第二个可表达核酸分子。同时还需要内源效应蛋白活性缺陷或缺失的一个细胞系或细胞株(例如酵母细胞或其它非哺乳动物细胞)，从而在没有所述蛋白-蛋白相互作用时，所述报道分子不表达。

作为结合配偶体相互作用的结果，融合多肽之间形成一个复合物，从而通过细胞器定位结构域(例如细胞膜定位结构域、细胞核定位结构域、线粒体膜定位结构域等等)的介导来指导所述复合物移位至合适的细胞器，所述效应蛋白接下来激活报道分子。此类蛋白质募集系统基本上可用于任何类型细胞，包括例如哺乳动物细胞、鸟类细胞、昆虫细胞及细菌细胞，并可以使用多种效应蛋白/报道分子系统。

例如，进行一种基于酵母细胞的测试，其中原肌球蛋白与其一或多个结合配偶体的相互作用导致鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF或C3G)募集进细胞膜，其中GEF或C3G激活报道分子，如Ras，从而导致细胞存活，否则细胞在特定培养条件下无法存活。对于此方法合适的细胞包括例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)cdc25-2细胞，其只有在有功能的GEF表达时能在36℃生长(Petitjean et al.，Genetics 124，797-806，1990)。GEF移位至细胞膜由一个细胞膜定位结构域协助。Ras的激活通过例如用已有的商品化检测试剂盒和/或试剂测量细胞中环AMP水平检出。为检出本发明的蛋白-蛋白相互作用的拮抗剂，在待测化合物存在或在一个候选肽拮抗剂在细胞中表达或不表达的情况下进行两次温育。在候选化合物或候选肽存在的情况下，降低的细胞存活或生长提示所述肽或化合物是原肌球蛋白和其一或多个结合配偶体相互作用的拮抗剂。

一种“反向(reverse)”蛋白质募集系统也被考虑，其中细胞被改变的存活或被改变的生长取决于所述蛋白-蛋白相互作用被所述候选化合物或候选肽的破坏。例如，在GEF存在下，可应用组成型表达活化的Ras的NIH 3T3细胞，其中缺少细胞转化提示蛋白质复合物被一种候选化合物或肽破坏。相反，在GEF存在下，组成型表达活化的Ras的NIH 3T3细胞具有被转化的表型(Aronheim et al.，Cell.78，949-961，1994)。

在另一个实施方案中，通过调整盘状琼脂扩散检测(plate agardiffusion assay)来测试小分子干扰原肌球蛋白与其一或多个结合配偶体的结合的能力，所述盘状琼脂扩散检测被描述于Vidal and Endoh，TIBS 17，374-381，1999，并入此处作参考。

在本发明一个优选的实施方案中，所述原肌球蛋白结合配偶体选自calponin(Childs et al. BBA.1121：41-46，1992)、癌胚抗原细胞粘附分子1(Cancinoembryonic antigen cell adhesion molecule 1，CEACAM1)(Schumann et al.，J.Biol Chem.276(50)：47421-33，2001)、内抑制素(endostatin)(MacDonald et al.J.Biol.Chem.276，25190-25196，2001)、Enigma(Guy et al.FEBS letters 10：1973-1984，1999)、凝溶胶蛋白(优选地是亚结构域2)(Koepf and Burtnick FEBS 309(1)：56-58，1992)、S100A2(Gimona et al.J.Cell Sci.110：611-621，1997)及肌动蛋白。在一个进一步的优选的实施方案中，所述原肌球蛋白结合配偶体是肌动蛋白。

基于肌球蛋白ATP酶活性的筛选方案

在经过调整的基于原肌球蛋白与其一或多个结合配偶体结合的筛选方案中，所述方法包括加入肌球蛋白至反应混和物中并检测肌球蛋白ATP酶活性。

例如，一种原肌球蛋白同工型可与肌动蛋白丝和特异的肌球蛋白一起温育。接下来在候选化合物存在的情况下测量肌球蛋白ATP酶活性。在通常条件下，原肌球蛋白抑制肌球蛋白ATP酶活性。

因而，与原肌球蛋白作用并阻止此抑制活性的化合物会引起肌球蛋白ATP酶活性增加。可以选择这些化合物用于进一步的筛选和/或定性。可以在不存在原肌球蛋白或存在一种不合适的原肌球蛋白同工型的情况下进行适当的阳性对照反应以消除抗肌球蛋白效应(anti-myosin effects)。

可调整以适用于本发明的确定肌球蛋白ATP酶活性的方法应该是本领域技术人员所熟知的。这些测定的例子被描述于Zhao et al.，Biochem.Biophys.Res Commun.267(1)：77-79，2000；Westra et al.，Archives of Physiology and Biochemistry 109：316-322，2001；和Drott etal.，Biochem J.264：191-8，1989。

治疗方法

由本发明的方法鉴别出的原肌球蛋白激动剂或拮抗剂可被治疗性地用于由细胞表面蛋白异常插入、保留或功能而引起的疾病。术语“治疗性”或如本文中与本发明的原肌球蛋白激动剂或拮抗剂所共同使用的，表示预防性和治疗性的施用。因而，原肌球蛋白激动剂/拮抗剂可给予高危患者以减轻一种疾病的可能性和/或严重性，或给予已经明确患病的患者。

人或其它物种可用原肌球蛋白功能的激动剂或拮抗剂处理的疾病或状况包括但不限于：囊性纤维化、多发性硬化、多囊肾病、病毒感染、细菌感染、再灌注损伤、门克斯病(Menkes disease)、威尔逊病(Wilson’s Disease)、糖尿病、肌强直性营养不良、癫痫或心境障碍如抑郁、双相性精神障碍或情绪恶劣性障碍。

给药方式

在所述候选化合物是一种低分子量化合物、肽或蛋白质如抗体的形式时，此物质可被配制进普通药物组合物(药物制剂)中，所述药物组合物通常用于此类形式，而且这些组合物可通过口服给药或非胃肠给药。一般来说，可以应用下列剂型和给药方式：

剂型包括下列代表性的形式如固体制剂(例如片剂、丸剂、粉剂、细粉剂(fine powders)、颗粒(granules)、及胶囊和液体制剂，例如溶液、悬浮液、乳剂、糖浆、及酏剂(elixirs))。这些剂型可根据给药途径归类为所述口服剂型或多种非胃肠剂型如透鼻(transnasal)制剂、透皮(transdermal)制剂、直肠(rectal)制剂(栓剂)、舌下(sublingual)制剂、阴道(vaginal)制剂、注射剂(静脉内、动脉内、肌内、皮下、皮内)和滴注剂(drip injections)。例如口服制剂，其可以是例如片剂、丸剂、粉剂、细粉剂、颗粒、胶囊、溶液、悬浮液、乳剂、糖浆等等，直肠和阴道制剂包括片剂、丸剂、胶囊、以及其它。透皮制剂不一定仅仅是液体制剂如洗液(lotion)，还可以是半固体制剂如乳膏(cream)、油膏(ointment)及其它。

注射剂可被制成可用的形式如溶液、悬浮液和乳剂，同时作为载体(vehicle)，无菌水、水-丙二醇、缓冲液、及0.4重量％浓度盐水可以作为例子。这些以此类液体形式存在的注射剂可被冷冻或冻干。通过冻干获得的产物可用蒸馏水即时恢复成注射剂等形式并给药。上述药物组合物(药物制剂)形式可以通过以本领域已确立的方式配制所述具有原肌球蛋白抑制作用的化合物和一种药物可接受的载体来制备。所述药物可接受的载体包括多种赋形剂、稀释剂、填充剂、膨胀剂(extenders)、粘合剂(binders)、崩解剂(disintegrators)、润湿剂、润滑剂、分散剂及其它。其它本领域通常使用的添加剂也可以配制。取决于所要生产的药物组合物的形式，这些添加剂可以正确地选自多种稳定剂、杀真菌剂、缓冲液、增稠剂(thickeners)、pH控制剂(pH controlagents)、乳化剂、助悬剂(suspending agents)、防腐剂、矫味剂(flavors)、着色剂(colors)、等张调节剂(tonicity control或isotonizing agents)、螯合剂和表面活性剂及其它。

任何一种形式的所述药物组合物可通过一种适合目标疾病、靶器官及其它因素的途径给药。例如，可以静脉内给药、动脉内给药、皮下给药、皮内给药、肌内给药或通过气道给药。还可以直接对染病组织局部给药或甚至口服给药或直肠给药。

所述药物组合物的给药剂量和给药时间表根据剂型、疾病或其症状、患者年龄及体重及其它因素变化，无法用概括性术语描述。根据成年人的日均活性成分的量，通常的剂量可以在大约0.0001mg至大约500mg的范围内，优选地在大约0.001mg至大约100mg的范围内，此药量可以每日一次给药，或每日分成几次给药。

当具有原肌球蛋白抑制活性的物质形式是多核苷酸如一种反义化合物时，所述组合物可以一种基因疗法(gene therapy)药物或预防性药物形式提供。近年来已有一定数量关于应用多种基因的报告，并且基因疗法现在已是一种确认的技术。

基因疗法药物可通过将目标多核苷酸导入载体或用载体转染合适的细胞来制备。对一个患者的给药方式大致可分为两种模式，即适用于(1)应用一种非病毒载体的情况的模式及适用于(2)应用一种病毒载体的情况的模式。对于分别应用一种病毒载体作为所述载体的情况和应用一种非病毒载体作为所述载体的情况，制备基因疗法药物的方法和给药方法都在一些涉及实验方案的书里详细描述(例如″BessatsuJikken Igaku，Idenshi Chiryo-no-Kosogijutsu(Supplement toExperimental Medicine，Fundamental Techniques of Gene Therapy)，Yodosha.1996；Bessatsu Jikken Igaku：Idenshi Donyu&HatsugenKaiseki Jikken-ho(Supplement to Experimental Medicine：ExperimentalProtocols for Gene Transfer&Expression Analysis)，Yodosha，1997；Japanese Society for Gene Therapy(ed.)：Idenshi Chiryo KaihatsuKenkyn Handbook(Research Handbook for Development of GeneTherapies)，NTS，1999等)。

当应用一种非病毒载体时，可以应用任何能表达所述抗原肌球蛋白核酸的表达载体。合适的例子包括pCAGGS(Gene 108，193-200(1991))、pBK-CMV、pcDNA 3.1和pZeoSV(Invitrogen，Stratagene)。

转移一个多核苷酸至患者体内可通过将目标多核苷酸以常规方式插入一个此类非病毒载体(表达载体)并将得到的重组表达载体给药完成。如此，目标多核苷酸可被导入患者细胞或组织中。

更特别地，将所述多核苷酸导入细胞的方法包括磷酸钙转染(共沉淀)技术和利用一个玻璃微管的DNA(多核苷酸)直接注射方法及其它方法。

将一个多核苷酸导入组织的方法包括利用内型脂质体(internaltype liposome)或静电型脂质体(electrostatic type liposome)的多核苷酸转移技术、HVJ-脂质体技术、改进的HVJ-脂质体(HVJ-AVE脂质体)技术、受体介导的多核苷酸转移技术、包括用微粒枪(particle gun)将所述多核苷酸与载体(金属微粒)一起转移进入细胞的技术、裸露DNA(naked-DNA)直接转移技术、及利用带正电聚合体的转移技术及其它。

合适的病毒载体包括衍生自重组腺病毒和逆转录病毒的载体。例子包括衍生自DNA或RNA病毒，如去毒逆转录病毒(detoxicatedretrovirus)、腺病毒、腺伴随病毒(adeno-associated virus)、疱疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、新培斯病毒(sindbis virus)、仙台病毒(Sendai virus)、SV40、人免疫缺陷病毒(HIV)等的载体。特别的，腺病毒载体众所周知具有远远高于其它病毒载体的感染效率，从这个角度看，腺病毒载体被优选地应用。

将多核苷酸转移进入患者体内可通过将目标多核苷酸导入一个此类病毒载体并用此获得的重组病毒感染所希望的细胞完成。通过此方式，所述目标多核苷酸可被导入细胞。

将如此制备的基因疗法药物给予患者的方法包括将所述基因疗法药物直接导入体内的体内(in vivo)技术和包括从人体提取某些细胞、将所述基因疗法药物体外(in vitro)导入细胞内并将所述细胞重新植回人体的回体(ex vivo)技术(Nikkei Science，April，1994 issue，20-45；Pharmaceuticals Monthly，36(1)，23-48，1994；Supplement toExperimental Medicine，12(15)，1994；Japanese Society for GeneTherapy(ed.)：Research Handbook for Development of Gene Therapies，NTS，19991)。对用于预防或治疗一种本发明涉及的炎症性疾病，所述药物被优选地通过体内技术导入体内。

当应用所述体内方法时，所述药物可以通过一种适合目标疾病、靶器官等的途径给药。例如其可以例如静脉内给药、动脉内给药、皮下给药或肌内给药，或可以直接对染病组织局部给药。

所述基因疗法药物可以根据所述给药途径以多种药物形式提供。例如在一种可注射形式的情况下，一种注射剂可以通过已经确立的过程制备，例如通过在一种溶剂中溶解所述活性组分多核苷酸，所述溶剂例如一种缓冲液，例如PBS、生理盐水、或无菌水，然后如果需要则进行过滤除菌，并且将所述溶液注入无菌小瓶(sterile vitals)。如果需要，此注射剂可与普通载体等一起提供。在脂质体如HVJ-脂质体的情况下，所述药物可以多种包裹在脂质体中的制剂形式被提供，这些形式如悬浮液、冷冻制剂和离心浓缩的冷冻制剂。

进一步地，为了所述基因可以更容易地定位在染病位点附近，可以制备一种释释(sustained-release)制剂(例如一种微丸(minipellet))并置于染病位点，或所述药物可以通过渗透泵(osmotic pump)等持续逐渐给予染病位点。

所述基因疗法药物的多核苷酸内容可以根据待治疗疾病、患者年龄和体重及其它因素正确地调整，但是对于每一个多核苷酸，通常的剂量大约是0.0001至大约100mg，优选地大约0.001至大约10mg。此药量优选地每隔几天或几个月给予。

在本说明书全文中，词语“包括(comprise)”或其变体应理解为暗示包含所阐明的元素、整数或步骤，或元素组、整数组或步骤组，但不排除任何其它元素、整数或步骤，或元素组、整数组或步骤组。

已被包括进本发明说明书的任何文件、法令(acts)、材料、设备、文章等等仅是为了提供本发明的上下文。其不应视为允许任何或全部这些材料在本申请的每一条权利要求的优先权日之前即已在澳大利亚存在并被视为形成涉及本发明领域中的现有技术的一部分或普遍知识。

现在本发明将由下列实施例阐明，但是这些实施例不以任何方式限制本发明。

实验细节

材料及方法

试剂和抗体

细胞松弛素D、毛喉素、6-甲氧基喹啉鎓1-乙酸乙酯(6-Methoxyquinolinium 1-acetic acid ethyl ester，MQAE)、诺考达唑、四甲基联苯胺、1，4-二氮杂二环[2.2.2.]辛烷(DABCO)、聚-D-赖氨酸和1％胶原蛋白购自Sigma(St.Louis，MO，U.S.A.)。Lipofectin试剂和反义寡核苷酸购自Invitrogen(Mulgrave，Vic，Australia)。Jasplakinolide购自Bio Scientific(Gymea，N.S.W.，Australia)。氯氮蓝四唑(Nitrobluetetrazolium chloride，NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸p-甲苯胺盐(BCIP)、组织培养基和试剂购自Life Technologies(Mulgrave，Vic，Australia)。双辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白检测试剂盒购自Pierce(Rockford IL，U.S.A.)。Thermanox盖玻片和细胞培养玻片(glasschamber slides)购自Medos(Mt Waverley，Vic，Australia)。组织培养塑料制品购自Interpath(Morrisville North Carolina，U.S.A.)。WesternLightening^TM化学发光试剂(chemiluminescence reagent)购自PerkinElmer Life Sciences Inc(Boston，MA，U.S.A.)。

罗丹明红X(Rhodamine Red X)缀合物和罗丹明山羊抗-绵羊IgG购自Jackson Immunoresearch(West Grove，PA，U.S.A)。辣根过氧化物酶(HRP)抗-小鼠和抗-兔IgG购自Amersham Life Sciences(Buckinghamshire，U.K.)。小鼠Tm单克隆抗体311和异硫氰酸荧光素(FITC)-驴抗小鼠二级抗体购自Sigma Aldrich(St.Louis，MO，U.S.A.)。Tm抗体CG3受赠于J.C.Lin(Univ.of Iowa，Iowa，U.S.A.)。CFTR抗体(MA1-935)购自Affinity Bioreagents Inc.(Golden，CO，USA)。C末端特异性小鼠抗人单克隆CFTR抗体购自Bio Scientific(Gymea，N.S.W.，Australia)。

细胞培养

人T84结肠癌细胞被接种至两块包被有聚-D-赖氨酸和1％胶原蛋白的细胞培养玻片、24或96孔板或盖玻片上。所述T84细胞得自American Tissue Culture Laboratory(60代)和受赠于Kim Barrett(SanDiego，U.S.A.)(20代)。在本研究过程中，它们分别被亚培养80和30代。T84细胞用Li et al的方法培养(Li et al.，1999，Infection&Immunity 67，5938-5945)。

处理后，T84细胞的生存力用锥虫蓝排除测定(trypan blueexclusion assay)评估。处理后，用PBS轻轻漂洗T84单细胞层并用1％锥虫蓝染色10分钟，立即用相差显微术(phase contrast microscopy)检测。处理的和对照单细胞层通过在随机视野中的吸收锥虫蓝的细胞计数对比。

免疫荧光分析

细胞在含有2％胎牛血清(FBS)的磷酸盐缓冲液(PBS)中漂洗，然后用4％多聚甲醛固定。用100％甲醇进行透化处理，在-80℃冷冻20分钟。细胞与初级和二级抗体在室温温育1小时，每次温育之后用含有2％FBS的PBS漂洗3次10分钟。将盖玻片盖在有抗脱色(anti-fade)剂DABCO的载玻片上。

荧光显微术

用共聚焦激光扫描显微镜(Leica Microsystems，Wetzler，Germany)63倍油镜检测荧光。荧光团的分布用在488nm扫描FITC和568nm扫描罗丹明检测，用8行平均值消除噪声。图像取自垂直(xz)和水平(xy)平面。水平平面的图像通过重叠从细胞顶端区域到基底区域每1μm取样的切片构建。

Tm抗体染色的像素强度(pixel intensity)在由共聚焦显微术获得的图像上测量。测量通过穿过单细胞层顶端区域和穿过中央区域进行，并将测量值进行平均以得到各个单细胞层的平均像素强度。抗体染色在各个单细胞层内的分别被描述为该单细胞层顶端区域平均像素强度与中央区域平均像素强度的比率。为确定αf9d和311抗体染色的相对分布，αf9d和311的所述顶端：中央平均像素强度比率在共染色的单细胞层中用对成对样品的Student t-检验对比。

组织学样品的抗体染色

大鼠十二指肠组织学样品在4％多聚甲醛盐溶液中固定，并在4℃保存于70％乙醇中直到在石蜡中包埋。切片在二甲苯中脱蜡(dewax)并在梯度乙醇(100％，100％，70％，水)中逐步再水合(rehydrate)。抗原提取通过在1x柠檬酸盐缓冲液(10x柠檬酸盐缓冲液：5g/L EDTA，2.5g/L Tris碱及3.2g/L柠檬酸三钠；pH8.0)中煮沸样品，微波炉强加热12分钟，然后冷却进行。样品在PBS中漂洗两次，用含10％血清的PBS封闭10分钟。然后加入初级抗体，在室温过夜。在加入二级抗体之前，样品在PBS中漂洗两次5分钟。加入二级抗体1小时，然后在PBS中漂洗样品一次5分钟，在碱性磷酸盐缓冲液(10ml的0.1M tris pH 9.5，5ml的1M MgCl和2ml的5M NaCl)中漂洗一次5分钟。接着加入含有NBT和BCIP的底物，40至60分钟后在PBS中漂洗样品一次5分钟。接着将样品用核快红对比染色1分钟，然后用蒸馏水漂洗2次，在梯度升高的乙醇(70％，100％，100％，100％)中脱水，用二甲苯澄清并用盖玻片盖好。

在单细胞层形成过程中用jasplakinolide、细胞松弛素和诺考达唑处理细胞

用胰蛋白酶/EDTA将上皮细胞单细胞层进行胰蛋白酶消化并离心得到细胞沉淀。然后在含有1μM jasplakinolide、20μM细胞松弛素D或33μM诺考达唑的培养基中重悬细胞，并接种至聚-D-赖氨酸和胶原蛋白包被的细胞培养玻片。接下来在接种10分钟后固定并染色正在生长的单细胞层。诺考达唑对微管的作用被抗β微管蛋白抗体染色并与未处理的细胞对比确认。成熟T84细胞单细胞层用含有20μM细胞松弛素D的培养基处理3小时后固定并染色。接下来进行如上所述的免疫荧光分析。

反义寡核苷酸

针对Tm5a和Tm5b的反义及无义硫代磷酸寡核苷酸(phosphorothioated oligonucleotides)序列分别是5’-CAC CGC CUCCAG CGA GCT(SEQ ID NO：14)和5’-GCT CCA GCC ACG CCG ACT(SEQ ID NO：15)。它们根据人αTMfast基因的外显子1b序列设计(Novy et al.，1993，Cell Motility&the Cytoskeleton 25，267-281)。T84`细胞单细胞层在盖玻片上、细胞培养玻片中或24孔板中生长至铺满。所述寡核苷酸以根据生产商指导的2μM浓度与10μg/ml Lipofectin试剂一起加入。所述T84细胞单细胞层接下来在37℃，5％CO₂条件下与所述寡核苷酸温育24小时，然后它们被用于需要寡核苷酸预处理的实验中。

原肌球蛋白同工型的免疫印迹分析

蛋白质用Wessel和Flugge的方法(Wessel and Flugge，1984)从T84细胞中提取。Western印迹如所描述的方法进行(Percival et al.，2000，Cell Motility&the Cytoskeleton 47，189-208)。简要说来，蛋白质用15％低bis丙烯酰胺凝胶的SDS-PAGE分级分离，转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride)膜并用Tm抗体探察。结合的抗体用HRP缀合的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG检出。条带用Western Lightening^TM化学发光试剂和x-射线底片曝光检出。

蛋白质表达用Western印迹自显影上的蛋白质条带强度，通过电脑程序Molecular Analyst(Version 1.5，Bio Rad Laboratories，CA，U.S.A.)测量。蛋白质条带强度以每个独立实验中对照组蛋白质条带强度进行标准化的蛋白质条带强度表示。为了确定处理的效果，标准化的蛋白质条带强度通过单侧Student t-检验与不存在的理论值1对比。

MQAE氯离子外向通量测定

在24或96孔板上培养的T84细胞单细胞层在含有10mM MQAE的培养基中温育16小时。接下来用氯离子缓冲液(2.4mM Na₂HPO₄，0.6mM NaH₂PO₄，1mM K₂SO₄，1mM MgSO₄，3.4mM KCl，124.6mMNaCl，1mM CaCl₂，10mM葡萄糖和10mM HEPES)漂洗所述单细胞层3次。T84细胞单细胞层通过与含有10μM毛喉素的氯离子缓冲液温育用毛喉素刺激10分钟，然后去掉氯离子缓冲液，换为含有10μM毛喉素的无氯离子的缓冲液(2.4mM Na₂HPO₄，0.6mM NaH₂PO₄，1mMK₂SO₄，1mM MgSO₄，3.4mM KNO₃，1mM Ca(NO₃)₂，124.6mM NaNO₃，10mM葡萄糖和10mM HEPES)，立即用荧光平板读数器(fluorescenceplate reader)进行可重复的荧光测量(激发，λ-360nm；发射：λ-460nm)。每30至60秒进行一次测量，持续15分钟。

氯离子外向通量测量表示为基线和特定时间点之间的荧光百分数增加。荧光百分数增加在实验内被标准化为该实验中对照组平均荧光百分数增加。为了确定处理的效果，所述标准化的荧光百分数增加在组间对比。两组的对比通过Student t-检验进行。

酶联表面CFTR检测

培养在胶原蛋白包被的盖玻片上的T84细胞单细胞层在含有10μM毛喉素或只是在氯离子缓冲液中在37℃，5％CO2条件下温育30分钟，然后在4℃下用4％多聚甲醛固定20分钟。所述T84细胞单细胞层首先与CFTR(MA1-935)抗体(Walker et al.，1995)(1∶500稀释)温育1小时，然后与HPR抗-小鼠IgG(1∶1000稀释)温育。

T84细胞单细胞层在每一次温育之前用含有10％FBS的PBS封闭10分钟并在每次温育之后用PBS漂洗4次。接下来将载玻片放入干净的24孔板并与500μl的3’3’5’5’-四甲基联苯胺温育30分钟。将每个孔的上清液转移至比色杯并用Beckman DU650分光光度计测定655nm的吸收值。初级抗体阴性对照的655nm吸收值同样被测定，此值被从初级抗体阳性单细胞层的吸收值中减去以测定此单细胞层的测定结果。

CFTR表面表达被表示为655nm测定的吸收值，对于每个独立实验中的对照组平均吸收值标准化。为了确定处理的效果，标准化的655nm吸收值在组间对比。两组的对比通过Student t-检验进行。

实施例1：原肌球蛋白基因表达及T84细胞中的抗体特异性

Tm蛋白质由4个不同基因编码。本研究所用抗体能够检测产生自3个Tm基因的特异的同工型。这些基因的外显子/内含子结构示于图1。αf9d抗体检测Tm 1、2、3、5a、5b和6(Schevzov et al.，1997，Molecular&Cellular Neurosciences 8，439-454)。311抗体检测αf9d抗体检测到的Tm的一个亚类(subset)，即Tm 1、2、3、和6。CG3抗体检测Tm5NM1-11(Novy et al.，1993，Cell Motility&theCytoskeleton 25，267-281；Dufour et al.，1998，Journal of BiologicalChemistry 273，18547-18555)。

人成纤维细胞中，311抗体可检出3个条带，条带在40、36和34kDa可见，分别相应于Tm 6、2和3(图2A)。在T84细胞中，311抗体只检出了40和34kDa的条带，相应于Tm 6和3(图2A)。αf9d抗体在T84细胞中检出4个条带，其中有相应于Tm 6和3在40和34kDa可见的条带，和一条30kDa的双条带，相应于Tm 5a和5b(图2B)。CG3抗体只在30kDa检出一个条带，相应于共迁移的Tm5NM同工型(图2C)。

实施例2：T84细胞单细胞层表达Tm5a和Tm5b的极化分布

为确定T84细胞中分散微丝群体的分布，用每一种抗体染色的8个单细胞层都用共聚焦显微术检测了垂直和水平平面。代表性的图像示于图3。检出Tm 3、5a、5b和6的αf9d抗体显示在细胞顶极具有明显的染色(图3A)。然而，识别Tm 3和6的311抗体则显示在同样细胞中从细胞顶极到基底极具有更均一的分布(图3C)。这种不同的染色模式只能用存在被αf9d检出但不被311检出的两种同工型(即Tm5a和Tm5b)的高度极化分布解释。因此我们的结论是Tm5a和Tm5b在顶端表面高度富集。对Tm5NM 1-11染色的抗体CG3分布于整个细胞(图3E)。

在取自水平平面的上皮细胞单细胞层切片中，αf9d(图3B)和311(图3D)的分布显示与侧面细胞膜相关，细胞质中可见极少量的染色。CG3显示位于细胞核周围的细胞质中(图3F)。

αf9d和311抗体染色的相对分布的定量分析示于图3G，其确认了上述定性差异。αf9d抗体的顶端与中央像素强度平均比值显著高于311抗体(3.88±0.60相比于1.64±0.23；p＜0.001)。

实施例3：特异微丝群体的极化分布随大鼠十二指肠上皮细胞分化变化。

为确定T84细胞中观察到的Tm同工型分布是否不同于在小囊及绒毛胃肠上皮细胞进行体内观察所见，6个大鼠十二指肠组织样品对Tm同工型染色并用明视场显微术检测。代表性切片示于图4。αf9d抗体染色显示小囊上皮中的扩散染色(图4C箭头)。在更加分化的绒毛上皮中该染色高度富集在顶端区域但是也在整个细胞质中可见(图4D箭头)。311抗体(Tm 3和6)在小囊上皮中稀疏染色(图4E)。在绒毛上皮中，蓝色染色可见于细胞核上一个环形区域(图4F)。CG3抗体染色(Tm5NM 1-11)显示与αff9d抗体所见相似的分布。在小囊上皮细胞中，染色扩散至整个细胞(图4G)，但是在绒毛上皮细胞中染色高度富集于顶端区域(图4H)。在主要位于小囊中的杯形细胞中，染色扩散至特有的粘蛋白泡(mucinous vacuole)外(图4G)。

这些结果表明Tm同工型在更加分化的绒毛上皮细胞中极化，但是在相对较弱分化的小囊上皮细胞中不极化。重要的是，十二指肠绒毛上皮细胞中αf9d抗体和311抗体染色的相对分布提示Tm5a和Tm5b在体内以相同于其在T84细胞模型中的极化方式极化。

实施例4：特异微丝群体的极性分布发生于单细胞层形成的早期阶段

αf9d染色极化分布发生的时间顺序在T84细胞接种后10分钟、1、2和24小时检测。每一时间点进行3次实验。Tm同工型的表达通过对提取自接种后1、2、4、24小时及7天收集的T84细胞的蛋白质进行Western印记检测。每一时间点进行3次实验。

代表性共聚焦显微图像示于图5。在T84细胞悬浮液中，αf9d、311和CG3(图6A、6B和5I，箭头所示及数据未显示)抗体染色是外周形(circumferential)的。接种后10分钟(5A-C)，T84细胞普遍地形成细胞-细胞接触和细胞-玻片接触。对于全部抗体，在此初始时间点，在细胞-玻片接触部位发生减弱的染色，尽管染色对于311和CG3抗体要比对于αf9d更明显。进一步地，αf9d抗体染色似乎限于游离面(free surface)而311抗体染色更多地位于细胞-细胞接触位置。相反，CG3抗体染色更均匀地分布在游离面和细胞-细胞接触位置。经过一段时间后，αf9d染色分布基本上没有变化(5E、H和K)，还是染色富集于游离面(反映Tm5a和Tm5b)同时有低水平的类似于311的扩散染色(反映Tm6和Tm3)。相反，311抗体染色分布(5D、G和J)和CG3抗体染色分布(5F、I和L)都更加均匀分布于整个细胞，包括所有表面及细胞质。

相对于接种后24小时和7天收集的细胞，Western印记分析揭示接种后2和4小时收集的T84细胞具有略微增加的Tm6和5a表达(图5N)。这些同工型的水平变化不可能是由于αf9d和311抗体染色的改变。因而这些同工型分布的改变很可能是这些蛋白质靶向(targeting)改变的结果。

实施例5：Tm5a和Tm5b的早期极化分布不涉及丝转换并且不依赖于微管

对于微丝极化发展的可能机制通过在接种中进行细胞骨架的药物处理来研究。用jasplakinolide稳定肌动蛋白丝，用细胞松弛素D将肌动蛋白丝片段化，及用诺考达唑破坏微管。这些药品在铺板前10分钟应用于悬浮液中的T84细胞。细胞在铺板后10分钟检测。

在接种之前用jasplakinolide预处理T84细胞改变了细胞形态。所述T84细胞与未处理的细胞(图5A)相比具有变平的外观(图6A)。在用jasplakinolide预处理的T84细胞中，在接种后10分钟αf9d(图6B)和311(图6A)抗体染色的分布与对照T84细胞(5A和5B)相似。αf9d抗体分布留在顶端，然而311抗体分布显示在细胞-细胞接触位置更加显著。在接种之前用用细胞松弛素D预处理T84细胞防止了细胞-玻片粘连，未获得图像。然而，用细胞松弛素D处理已建立的单细胞层消除了αf9d染色的极化分布提示其维持需要完好的肌动蛋白细胞骨架(图6F)。

在接种之前用诺考达唑预处理T84细胞改变了细胞形态。所述T84细胞从具有弯曲表面(图5A)变成具有不规则外形(图6C)。在接种10分钟后诺考达唑处理的T84细胞中αf9d(图6D)抗体染色分布与未处理的T84细胞相似。311抗体染色与αf9d抗体染色相似，其富集于顶端表面并且在细胞与玻片接触位置的染色很弱(图6C)。β微管蛋白染色确认诺考达唑破坏了正常微管结构(数据未列出)。

这些结果提示Tm5a和Tm5b的早期极化不涉及丝转换(filamentturnover)，因为肌动蛋白稳定剂jasplakinolide不影响极化的早期发展。另外，Tm5a和Tm5b的极化发生时，完整的微管并不是所要求的，尽管微管被诺考达唑破坏。然而，微管可能参与Tm3和Tm6再定位至细胞-细胞接触位置或它们在此位置的稳定。

实施例6：Tm5a和Tm5b与插入膜的CFTR共定位，但不与包含在亚顶小泡(sub-apical vesicles)中的CFTR共定位。

用CFTR抗体染色T84细胞(图7B)表现了可变的CFTR表达。可见两种形式的CFTR。一些细胞显示了显著的顶端染色，CFTR在顶膜上突出。CFTR还可作为位于细胞质中的较小的点被观察(图7B，箭头)，显示其位于一种小泡样结构中。与αf9d抗体共染色揭示了典型的在顶端富集的极化表观，以及突出于周围顶端表面的非常强的顶端染色的位置。这些高度富集的αf9d染色位置与CFTR掺入膜的位置同时发生(图7C)。因此Tms表现为掺入一个与CFTR相关的结构中。全部CFTR膜染色位置都与这些αf9d染色较强的位置相关。然而，不是所有αf9d染色较强的位置都显示显著的CFTR染色的事实提示αf9d抗体染色与CFTR可以插入的位置相关。αf9d抗体不与包含在细胞质小泡样(vesicle-like)结构中的CFTR共定位。

实施例7：Tm5a和Tm5b反义寡核苷酸改变T84细胞单细胞层中αf9d的顶端染色强度

以前的研究显示细胞松弛素D诱导的肌动蛋白丝破坏增加了通过CFTR的氯离子流(Prat et al.，1995，American Journal of Physiology268，C1552-C1561)，并且我们观察到了细胞松弛素D还破坏αf9d染色的极化分布(图6F)。因此我们认为被与CFTR共定位的αf9d标记的肌动蛋白丝可能抑制通过CFTR的氯离子分泌。为了验证此猜想，我们用反义寡核苷酸或混杂的无义对照处理T84细胞单细胞层。Western印迹分析显示暴露于所述寡核苷酸24小时后，Tm5a和Tm5b水平有实质下降(图8D)。相对于无义寡核苷酸处理，反义寡核苷酸处理引起Tm5a和Tm5b水平平均下降54±13％(p＝0.02)。

用反义寡核苷酸处理T84培养物消除了αf9d染色的极化分布，其主要地均匀分布于整个细胞(图8B)。相反，无义寡核苷酸基本上对αf9d染色的分布没有影响(图8A)。反义寡核苷酸诱导的染色再分布通过顶端表面αf9d染色像素强度的降低也可以佐证。同样用这些寡核苷酸平行处理的T84细胞单细胞层显示，对比于用无义寡核苷酸处理的培养物，用反义寡核苷酸处理的培养物中顶端像素强度降低(图8E)。这与用αf9d抗体检出的极化Tm水平降低是一致的。

总之，用αfast基因外显子1b的反义寡核苷酸处理会引起αf9d抗体顶端染色的显著下降。这些结果同时确认了未处理的T84细胞单细胞层中显著的顶端αf9d抗体染色是由于Tm5a和Tm5b的极化分布所致。

实施例8：Tm5a和Tm5b反义寡核苷酸增加CFTR表面表达和氯离子外向通量

Tm5a和Tm5b水平的反义下降和αf9d染色极化分布的消除提供了一个机会来评估这些分子在CFTR表面表达中的作用。这揭示了反义寡核苷酸处理对比与无义寡核苷酸对照增长50％(1.49±0.78相对于1±0.42；p＜0.001)。这提示Tm5a和Tm5b的存在是CFTR插入顶膜或CFTR保留在膜中的障碍。

CFTR表面表达的增加也可以通过反义寡核苷酸处理的细胞中的氯离子外向通量增加佐证。总的来说，是用2μM反义寡核苷酸处理24小时的21个T84细胞单细胞层与用2μM无义寡核苷酸处理24小时的21个T84细胞单细胞层比较。在反义和无义寡核苷酸处理后，进行MQAE氯离子外向通量检测，结果示于图9B。在10μM毛喉素刺激15分钟后，用反义寡核苷酸处理的T84细胞单细胞层与用无义寡核苷酸处理的T84细胞单细胞层相比，具有显著升高的相对荧光测量值(1.47±0.41相对于1±0.36；p＜0.001)。

实施例9：微管破坏对于T84细胞单细胞层的CFTR表面表达无影响

Tms反义寡核苷酸处理对于CFTR表面水平和氯离子外向通量的影响没有被微管的破坏佐证。将T84细胞与诺考达唑一起温育没有能够引起CFTR表面表达(图10A)或氯离子外向通量(图10B)的任何显著改变。我们认为这些参数在短时间条件下进行测试对于微丝的破坏敏感，而对于微管系统不敏感。这很好地符合了肌动蛋白丝相对于微管在调节小泡(vesicle)所运物质插入顶膜或其保留中所具有更重要的作用。

实施例10：肠致病性大肠杆菌(EPEC)感染对于肌动蛋白细胞骨架的影响

在澳大利亚土著群体儿童中，所患胃肠炎中多达17％是肠致病性大肠杆菌(EPEC)导致的。其引起腹泻的机制还不清楚，但是升高的氯离子分泌已经在动物模型中被提示。我们已经在前面说明，在细胞培养模型中，EPEC感染引起上皮细胞中氯离子通过CFTR氯离子通道的分泌减少，并且诱导原肌球蛋白5a和5b同工型在上皮细胞的细胞骨架中再分布。这些原肌球蛋白的功能还不清楚，但是我们已经说明它们在顶膜中与CFTR氯离子通道共定位。

本实验的目标就是研究EPEC感染改变氯离子通过CFTR氯离子通道分泌的机制。

生长于胶原蛋白包被的24孔板或塑料盖片上的培养的T84结肠癌细胞单细胞层被用作胃肠上皮模型。温育用EPEC接种6-9小时的单细胞层(104生物体/孔)用作EPEC感染模型并与HB 101(非致病性对照)对比。反义寡核苷酸用来降低原肌球蛋白5a和5b的表达，免疫比色测试(immuno-colourimetric assay)用来评估CFTR表面表达，细胞内MQAE荧光被用来评估氯离子外向通量。

实验结果显示相比于HB101，EPEC感染导致CFTR表达升高(平均升高：153％；95％CI：100％，205％；p＜0.001)但是氯离子分泌减少(平均减少：37％；95％CI：8％，66％；p＝0.014)。

原肌球蛋白5a和5b的再分布可能是在EPEC感染下CFTR插入顶膜增加的原因。含有丝的原肌球蛋白5a和5b可能产生CFTR在胃肠上皮细胞顶膜中插入或保留的障碍。在膜CFTR增加情况下氯离子分泌减少提示EPEC还可以抑制CFTR氯离子通道功能。在EPEC感染中可能发生腹泻作为一种在表面表达增加的情况下CFTR功能恢复的反跳现象(rebound phenomenon)。

这些结果提示EPEC含有能够抑制Tm5a和Tm5b的定位或功能的化合物。因而EPEC可能是可用于本文所描述的筛选测定的物质的有用来源。

讨论

在建立上皮细胞极性中的原肌球蛋白同工型分选

伴随着特异化的功能性结构域的产生，极化的发展对于正常上皮细胞功能是必需的。上皮细胞极化过程的中心是蛋白质分选(sorting)、转运及插入膜，这些过程使得结构域具有它们的功能(Yeaman et al.，1999，Physiological Reviews 79，73-98)。细胞骨架，尤其是肌动蛋白微丝系统在此过程中的功能还不清楚。肌动蛋白细胞骨架结构域的迅速生成提出了这样一种可能性，即细胞骨架极化可能是功能性极性，尤其是蛋白质向特异膜结构域分选和移动发展所必需的。

本发明的发现进一步支持了微丝在上皮细胞极性发展和膜蛋白极性化的运输中的作用。我们发现特异的Tm同工型在单细胞层发展过程中迅速极化。同样的同工型还被发现可以调节CFTR插入顶膜和/或其在顶膜中的保留。

同工型分选机制

与细胞骨架相互作用的药物被广泛用于研究细胞过程。通过应用这些技术，我们可以研究上皮细胞能够迅速对微丝进行分选的机制。在单细胞层的发展中，Jasplakinolide(一种阻止肌动蛋白丝分解和转换(turnover)的药物)没有影响Tm5a和Tm5b的早期极化。在成熟单细胞层中，细胞松弛素D(一种分解肌动蛋白丝的药物)破坏Tm5a和Tm5b的极化分布。因而我们可以得出结论，完整的微丝是Tm同工型极化发展和维持此极性所必需的。另外Tm同工型形成一种更高层次结构的一部分而不是以分离的分子形式存在，所述结构包括肌动蛋白丝。

我们的研究发现Tm同工型的分选发生得非常迅速。在10分钟之内，特异的Tm同工型已在其分布中被极化。其他研究者也发现Tm和肌动蛋白结构和组成的变化在细胞结构发展的早期发生。在Temm-Grove et al的研究中，特异的Tm同工型定位在微注射进上皮细胞15分钟后就会发生(Temm-Grove et al.，1998，Cell Motility&theCytoskeleton 40，393-407)。他们发现Tm5迅速定位于相邻细胞之间的粘合带(adhesion belt)。其他研究分析了表达水平和时间的关系。在成纤维细胞中，Tm5NM同工型表达水平在细胞周期中5小时增加2倍(Percival et al.，2000，Cell Motility&the Cytoskeleton 47，189-208)。在培养的肝细胞中，F肌动蛋白量在细胞与胞外基质粘着30分钟内增加20倍(Mooney et al.，1995，Journal of Cell Science 108，2311-2320)。在发育中的神经元，Tm5 mRNA发现定位于轴突隆起(axonal hillock)，从而形成神经元极性的一个早期标记(Hannan et al.，1995，Molecular&Cellular Neurosciences 6，397-412)。因而我们的结论是多种类型的细胞能够通过增加细胞骨架蛋白表达或在细胞内转运完整蛋白质来迅速改变其细胞骨架结构。这些发现提示Tm涉及细胞附着和极化发展的早期过程。

Tm5a和Tm5b在调节CFTR功能上的作用

不希望受限于理论，至少有3种可能的机制解释Tm5a和Tm5b在cAMP刺激引起的反应中是如何限制CFTR插入进顶膜的。第一，Tm5a和Tm5b可能作为一种物理障碍阻止小泡向上皮细胞顶端表面运动。如果被清除，那么小泡运动将更自由，并且接下来插入膜的CFTR增长将是不可避免的。第二，Tm5a和Tm5b可能不是作为一种影响小泡运动的功能性障碍，但是可能是一种对于小泡沿着肌动蛋白丝运动的抑制性控制机制。所述小泡沿着肌动蛋白丝运动是一个主动过程，其需要肌动蛋白和肌球蛋白相互作用，Tm5a和Tm5b可能抑制这一相互作用。如果这就是实际情况，可以预期Tm5a和Tm5b在顶端区域的存在抑制CFTR小泡向顶膜的运输。相反，预期Tm5a和Tm5b的去极化将增加CFTR向顶膜的运输。最后，Tm5a和Tm5b相关的微丝可能涉及表面蛋白的细胞内吞循环过程。一项Gottlieb等人的研究发现微丝在上皮细胞顶膜的蛋白质内吞中有作用(Gottlieb etal.，1993，Journal of Cell Biology 120，695-710)。在他们的观察中，他们猜想肌动蛋白微丝形成一种机械化学发动机(mechanochemicalmotor)的一部分，所述机械化学发动机被用于微绒毛膜组分向微绒毛之间的空间移动，或为将膜凹陷转变为内吞小泡提供动力。如果涉及这些过程的微丝含有Tm5a和Tm5b，那么清除Tm5a和Tm5b将引起不能从顶膜内吞蛋白质如CFTR。

我们关于Tm5a和/或Tm5b调节CFTR插入到或保留在顶膜的发现进一步有助于增加证据证明Tm同工型具有不同功能。已知存在有超过40种Tm同工型(Lees-Miller和Helfinan，1991，Bioessays 13，429-437；Pittenger et al.，1994，Current Opinion in Cell Biology 6，96-104)(Dufour et al.，1998，Journal of Biological Chemistry 273，18547-18555)。支持存在不同功能的是关于不同Tms给予肌动蛋白微丝不同机械化学性质的知识。例如，Tm同工型对于肌动蛋白的不同结合亲和力引起肌动蛋白微丝稳定性的不同作用(Pittenger et al.，1994，Current Opinion in Cell Biology 6，96-104)。进一步的证据来自于Percival等人的工作，他们发现Tm5NM给予肌动蛋白微丝更强的细胞松弛素D抗性(Percival et al.，2000，Cell Motility&the Cytoskeleton47，189-208)。其他人已经发现特异的Tm同工型增加了肌动蛋白丝的刚性(rigidity)(Kojima et al.，1994，Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America 91，12962-12966)。当被插入肌动蛋白微丝后，Tms影响肌动蛋白和其他肌动蛋白结合蛋白的相互作用。例如，高分子量Tms可以抵抗肌动蛋白结合蛋白凝溶胶蛋白的切割活性(Ishikawa et al.，1989，Journal of Biological Chemistry 264，7490-7497)。

我们的发现有助于正在增多的支持Tms在特异细胞功能方面具有作用的证据。我们的结论是Tm同工型在胃肠上皮细胞中是分隔开的，并且能够调节重要的细胞功能。

上述参考的全部文献全文并入本公开。

本领域技术人员应了解如在特定实施方案中所显示的那样，可以对本发明作出如宽泛描述的大量变体和/或修饰而不背离本发明的精神或范围。因而现有实施方案在所有方面应被认为是示范性的而非限制性的。

                                序列表

<110>皇家亚力山大儿童医院

<120>细胞表面蛋白质的调节

<130>502300

<150>AU 2003901316

<151>2003-03-21

<160>20

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1265

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>1

ggcacgaggg aggaatgcgg tcgccccctt gggaaagtac atatctggga gaagcaggcg      60

gctccgcgct cgcactcccg ctcctccgcc cgaccgcgcg ctcgccccgc cgctcctgct     120

gcagccccag ggcccctcgc cgccgccacc atggacgcca tcaagaagaa gatgcagatg     180

ctgaagctcg acaaggagaa cgccttggat cgagctgagc aggcggaggc cgacaagaag     240

gcggcggaag acaggagcaa gcagctggaa gatgagctgg tgtcactgca aaagaaactc     300

aagggcaccg aagatgaact ggacaaatat tctgaggctc tcaaagatgc ccaggagaag     360

ctggagctgg cagagaaaaa ggccaccgat gctgaagccg acgtagcttc tctgaacaga     420

cgcatccagc tggttgagga agagttggat cgtgcccagg agcgtctggc aacagctttg     480

cagaagctgg aggaagctga gaaggcagca gatgagagtg agagaggcat gaaagtcatt     540

gagagtcgag cccaaaaaga tgaagaaaaa atggaaattc aggagatcca actgaaagag     600

gcaaagcaca ttgctgaaga tgccgaccgc aaatatgaag aggtggcccg taagctggtc     660

atcattgaga gcgacctgga acgtgcagag gagcgggctg agctctcaga aggccaagtc     720

cgacagctgg aagaacaatt aagaataatg gatcagacct tgaaagcatt aatggctgca     780

gaggataagt actcgcagaa ggaagacaga tatgaggaag agatcaaggt cctttccgac     840

aagctgaagg aggctgagac tcgggctgag tttgcggaga ggtcagtaac taaattggag     900

aaaagcattg atgacttaga agacgagctg tacgctcaga aactgaagta caaagccatc     960

agcgaggagc tggaccacgc tctcaacgat atgacttcca tgtaaacgtt catccactct    1020

gcctgcttac accctgccct catgctaata taagtttctt tgcttcactt ctcccaagac    1080

tccctcgtcg agctggatgt cccacctctc tgagctctgc atttgtctat tctccagctg    1140

accctggttc tctctcttag catcctgcct tagagccagg cacacactgt gctttctatt    1200

gtacagaagc tcttcgtttc agtgtcaaat aaacactgtg taagctaaaa aaaaaaaaaa    1260

aaaaa                                                                1265

<210>2

<211>1044

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>2

tgctgctctc ctcccgctcc gtcctcctcg cctgccaccg gtgcacccag tccgctcacc      60

cagcccagtc cgtccggtcc tcaccgcctg ccggccggcc caccccccac cgcaggccat     120

ggacgccatc aagaagaaga tgcagatgct gaagctggac aaggagaacg ccatcgaccg     180

cgccgagcag gccgaagccg acaagaagca agctgaggac cgctgcaagc agctggagga     240

ggagcagcag gccctccaga agaagctgaa ggggacagag gatgaggtgg aaaagtattc     300

tgaatccgtg aaggaggccc aggagaaact ggagcaggcc gagaagaagg ccactgatgc     360

tgaggcagat gtggcctccc tgaaccgccg cattcagctg gttgaggagg agctggaccg     420

ggcccaggag cgcctggcta cagccctgca gaagctggag gaggccgaga aggcggctga     480

tgagagcgag agaggaatga aggtcatcga aaaccgggcc atgaaggatg aggagaagat     540

ggaactgcag gagatgcagc tgaaggaggc caagcacatc gctgaggatt cagaccgcaa     600

atatgaagag gtggccagga agctggtgat cctggaagga gagctggagc gctcggagga     660

gagggctgag gtggccgaga gccgagccag acagctggag gaggaacttc gaaccatgga     720

ccaggccctc aagtccctga tggcctcaga ggaggagtat tccaccaaag aagataaata     780

tgaagaggag atcaaactgt tggaggagaa gctgaaggag gctgagaccc gagcagagtt     840

tgccgagagg tctgtggcaa agttggagaa aaccatcgat gacctagaag agaccttggc     900

cagtgccaag gaggagaacg tcgagattca ccagaccttg accagaccc  tgctggaact     960

caacaacctg tgagggccag ccccaccccc agccaggcta tggttgccac cccaacccaa    1020

taaaactgat gttactagcc tctc                                           1044

<210>3

<211>2089

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>3

ggcacgaggg gaggcaggaa ccggagcgcg agcagtagct gggtgggcac catggctggg      60

atcaccacca tcgaggcggt gaagcgcaag atccaggttc tgcagcagca ggcagatgat     120

gcagaggagc gagctgagcg cctccagcga gaagttgagg gagaaaggcg ggcccgggaa     180

caggctgagg ctgaggtggc ctccttgaac cgtaggatcc agctggttga agaagagctg     240

gaccgtgctc aggagcgcct ggccactgcc ctgcaaaagc tggaagaagc tgaaaaagct     300

gctgatgaga gtgagagagg tatgaaggtt attgaaaacc gggccttaaa agatgaagaa     360

aagatggaac tccaggaaat ccaactcaaa gaagctaagc acattgcaga agaggcagat     420

aggaagtatg aagaggtggc tcgtaagttg gtgatcattg aaggagactt ggaacgcaca     480

gaggaacgag ctgagctggc agagtcccgt tgccgagaga tggatgagca gattagactg     540

atggaccaga acctgaagtg tctgagtgct gctgaagaaa agtactctca aaaagaagat     600

aaatatgagg aagaaatcaa gattcttact gataaactca aggaggcaga gacccgtgct     660

gagtttgctg agagatcggt agccaagctg gaaaagacaa ttgatgacct ggaagataaa     720

ctgaaatgca ccaaagagga gcacctctgt acacaaagga tgctggacca gaccctgctt     780

gacctgaatg agatgtagaa cgccccagtc ccaccctgct gctgctcctc cctctgaccc     840

agactccgcc tgaggccagc ctgcgggaag ctgaccttta actgagggct gatctttaac     900

tggaaggctg ctttctcctt tcaccacccc ctccttccct gtgtcttttt cgccaaactg     960

tctctgcctc ttcccggaga atccagctgg gctagaggct gagcaccttt ggaaacaaca    1020

tttaagggaa tgtgagcaca atgcataatg tctttaaaaa gcatgttgtg atgtacacat    1080

tttgtaatta ccttttttgt tgttttgtag caaccatttg taaaacattc caaataattc    1140

cacagtcctg aagcagcaat cgaatccctt tctcactttt ggaaggtgac ttttcacctt    1200

aatgcatatt cccctctcca tagaggagag gaaaaggtgt aggcctgcct taccgagagc    1260

caaacagagc ccagggagac tccgctgtgg gaaacctcat tgttctgtac aaagtactag    1320

ctaaaccaga aaggtgattc caggaggagt tagccaaaca acaacaaaaa caaaaaatgt    1380

gctgttcaag ttttcagctt taagatatct ttggataatg ttatttctat tttttatttt    1440

tttcattaga agttaccaaa ttaagatggt aagacctctg agaccaaaat tttgtcccat    1500

ctctaccccc tcacaactgc ttacagaatg gatcatgtcc cccttatgtt gaggtgacca    1560

cttaattgct ttcctgcctc cttgaaagaa agaaagaaag aagactgtgt ttttgccact    1620

gatttagcca tgtgaaactc atctcattac ccttttctgg gtttgaagct gctgtctcta    1680

gaagtgccat ctcaattgtg ctttgtatca gtcagtgctg gagaaatctt gaatagctta    1740

tgtacaaaac tttttaaatt ttatattatt ttgaaacttt gctttgggtt tgtggcaccc    1800

tggccacccc atctggctgt gacagcctct gcagtccgtg ggctggcagt ttgttgatct    1860

tttaagtttc cttccctacc cagtccccat tttctggtaa ggtttctagg aggtctgtta    1920

ggtgtacatc ctgcagctta ttggcttaaa atgtactctc cttttatgtg gtctctttgg    1980

ggccgattgg gagaaagaga aatcaatagt gcaactgttt tgatactgaa tattgacaag    2040

tgtctttttg aaataaagaa ccagtccctc caaaaaaaaa aaaaaaaaa                2089

<210>4

<211>2049

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>4

gagcccagcc gagcgtccgc cgctgcccgt gcgcctctgc gctccgcgcc atggccggcc      60

tcaactccct ggaggcggtg aaacgcaaga tccaggccct gcagcagcag gcggacgagg     120

cggaagaccg cgcgcagggc ctgcagcggg agctggacgg cgagcgcgag cggcgcgaga     180

aagctgaagg tgatgtggcc gccctcaacc gacgcatcca gctcgttgag gaggagttgg     240

acagggctca ggaacgactg gccacggccc tgcagaagct ggaggaggca gaaaaagctg     300

cagatgagag tgagagagga atgaaggtga tagaaaaccg ggccatgaag gatgaggaga     360

agatggagat tcaggagatg cagctcaaag aggccaagca cattgcggaa gaggctgacc     420

gcaaatacga ggaggtagct cgtaagctgg tcatcctgga gggtgagctg gagagggcag     480

aggagcgtgc ggaggtgtct gaactaaaat gtggtgacct ggaagaagaa ctcaagaatg     540

ttactaacaa tctgaaatct ctggaggctg catctgaaaa gtattctgaa aaggaggaca     600

aatatgaaga agaaattaaa cttctgtctg acaaactgaa agaggctgag acccgtgctg     660

aatttgcaga gagaacggtt gcaaaactgg aaaagacaat tgatgacctg gaagagaaac     720

ttgcccaggc caaagaagag aacgtgggct tacatcagac actggatcag acactaaacg     780

aacttaactg tatataagca aaacagaaga gtcttgttcc aacagaaact ctggagctcc     840

gtgggtcttt ctcttctctt gtaagaagtt ccttttgtta ttgccatctt cgctttgctg     900

gaaatgtcaa gcaaattatg aatacatgac caaatatttt gtatcggaga agctttgagc     960

accagttaaa tctcattcct tccctttttt tttcaaatgg caccagcttt ttcagctctc    1020

ttattttttc cttaagtagc atttattcct aaggtaggca gggtatttcc tagtaagcat    1080

actttcttaa gacggaggcc atttggttcc tgggagaata ggcagcccca cactttgaag    1140

aatacagacc ccagtatcta gtcgtggata taattaaaac gctgaagacc ataacctttt    1200

gggtcaactg ttggtcaaac tataggagag accagggacc atcacatggg tagggatttt    1260

ccatccagag ccaataaaag gactggtggg ggccgggggt ggctattgtg ggaagtcata    1320

acccacagat agatcaacct aagaatcctg gcccttctcc actctccacc atgcaggaca    1380

aacatcttct caagcagtca acgtagaatg cttgggaaat agtcataatt acccacatat    1440

agtaattaat agatggtaat taattgatcc ttgatgtgat gttcttttgc atatttcctt    1500

cattctaaag ttgttccctg gccgggagcg tttgctttcg cctgtaatcc caacactttg    1560

ggaggccagg acagatcact tgaggtcagg agttcgagac cagcccagcc aacatggcga    1620

aaccatgtct ctactaaaaa tacaaaaatt atggtgacgc ctgcctgtag tcccagctac    1680

tcgggaggct gaggcaggag gatcgcttga acccaggaag tggagactgc agtgagccga    1740

tatcgcacca cagcgctcca gcctggtcga cagagtgaga ctccatctca agaaaaaata    1800

aaaataaagt tgttctctga agagcaaatg tctcattcca gtaatgaccc actcagcagg    1860

aatatggtgg agttcagtcc aattcaggtc agccatatcc aaaagaccac aagtcattac    1920

taagttgagc aaaagagttt ttatctatta gcagaaaggg cctctctggc agcagagatt    1980

aaaaactggc ccaacttcat ttccatactt cagggaacag caaattgagg atttacttat    2040

ctaggactt                                                            2049

<210>5

<211>1593

<212>DNA

<213>Hono sapiens

<400>5

ggcggaccgg cgctgggcag ccaggacagc cgcggcagcc gggtccgcag ggcagcagcc      60

ggcctctccc actgcagccc tcccgcccgc ctaccgtccg gcgcgatggc ggggagtagc     120

tcgctggagg cggtgcgcag gaagatccgg agcctgcagg agcaggcgga cgccgctgag     180

gagcgcgcgg gcaccctgca gcgcgagctg gaccacgaga ggaagctgag ggagaccgct     240

gaagccgacg tagcttctct gaacagacgc atccagctgg ttgaggaaga gttggatcgt     300

gcccaggagc gtctggcaac agctttgcag aagctggagg aagctgagaa ggcagcagat     360

gagagtgaga gaggcatgaa agtcattgag agtcgagccc aaaaagatga agaaaaaatg     420

gaaattcagg agatccaact gaaagaggcc aagcacattg ctgaagatgc cgaccgcaaa     480

tatgaagagg tggcccgtaa gctggtcatc attgagagcg acctggaacg tgcagaggag     540

cgggctgagc tctcagaagg caaatgtgcc gagcttgaag aagaattgaa aactgtgacg     600

aacaacttga agtcactgga ggctcaggct gagaagtact cgcagaagga agacagatat     660

gaggaagaga tcaaggtcct ttccgacaag ctgaaggagg ctgagactcg ggctgagttt     720

gcggagaggt cagtaactaa attggagaaa agcattgatg acttagaaga gaaagtggct     780

catgccaaag aagaaaacct tagtatgcat cagatgctgg atcagacttt actggagtta     840

aacaacatgt gaaaacctcc ttagctgcga ccacattctt tcgttttgtt ttgttttgtt     900

tttaaacacc tgcttacccc ttaaatgcaa tttatttact tttaccactg tcacagaaac     960

atccacaaga taccagctag gtcagggggt ggggaaaaca catacaaaaa ggcaagccca    1020

tgtcagggcg atcctggttc aaatgtgcca tttcccgggt tgatgctgcc acactttgta    1080

gagagtttag caacacagtg tgcttagtca gcgtaggaat cctcactaaa gcagaagaag    1140

ttccattcaa agtgccaatg atagagtcaa caggaaggtt aatgttggaa acacaatcag    1200

gtgtggattg gtgctacttt gaacaaaagg tccccctgtg gtcttttgtt caacattgta    1260

caatgtagaa ctctgtccaa cactaattta ttttgtcttg agttttacta caagatgaga    1320

ctatggatcc cgcatgcctg aattcactaa agccaagggt ctgtaagcca cgctgctctt    1380

ccgagacttc cattcctttc tgattggcac acgtgcagct catgacaatc tgtaggataa    1440

caatcagtgt ggatttccac tcttttcagt ccttcatgtt aaagatttag acaccacata    1500

caactggtaa aggacgtttt cttgagagtt ttaactatat gtaaacattg tataatgata    1560

tggaataaaa tgcacattgt aggacatttt cta                                 1593

<210>6

<211>1593

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>6

ggcggaccgg cgctgggcag ccaggacagc cgcggcagcc gggtccgcag ggcagcagcc      60

ggcctctccc actgcagccc tcccgcccgc ctaccgtccg gcgcgatggc ggggagtagc     120

tcgctggagg cggtgcgcag gaagatccgg agcctgcagg agcaggcgga cgccgctgag     180

gagcgcgcgg gcaccctgca gcgcgagctg gaccacgaga ggaagctgag ggagaccgct     240

gaagccgacg tagcttctct gaacagacgc atccagctgg ttgaggaaga gttggatcgt     300

gcccaggagc gtctggcaac agctttgcag aagctggagg aagctgagaa ggcagcagat     360

gagagtgaga gaggcatgaa agtcattgag agtcgagccc aaaaagatga agaaaaaatg     420

gaaattcagg agatccaact gaaagaggcc aagcacattg ctgaagatgc cgaccgcaaa     480

tatgaagagg tggcccgtaa gctggtcatc attgagagcg acctggaacg tgcagaggag     540

cgggctgagc tctcagaagg ccaagtccga cagctggaag aacaattaag aataatggat     600

cagaccttga aagcattaat ggctgcagag gataagtact cgcagaagga agacagatat     660

gaggaagaga tcaaggtcct ttccgacaag ctgaaggagg ctgagactcg ggctgagttt     720

gcggagaggt cagtaactaa attggagaaa agcattgatg acttagaaga gaaagtggct     780

catgccaaag aagaaaacct tagtatgcat cagatgctgg atcagacttt actggagtta     840

aacaacatgt gaaaacctcc ttagctgcga ccacattctt tcgttttgtt ttgttttgtt     900

tttaaacacc tgcttacccc ttaaatgcaa tttatttact tttaccactg tcacagaaac     960

atccacaaga taccagctag gtcagggggt ggggaaaaca catacaaaaa ggcaagccca    1020

tgtcagggcg atcctggttc aaatgtgcca tttcccgggt tgatgctgcc acactttgta    1080

gagagtttag caacacagtg tgcttagtca gcgtaggaat cctcactaaa gcagaagaag    1140

ttccattcaa agtgccaatg atagagtcaa caggaaggtt aatgttggaa acacaatcag    1200

gtgtggattg gtgctacttt gaacaaaagg tccccctgtg gtcttttgtt caacattgta    1260

caatgtagaa ctctgtccaa cactaattta ttttgtcttg agttttacta caagatgaga    1320

ctatggatcc cgcatgcctg aattcactaa agccaagggt ctgtaagcca cgctgctctt    1380

ccgagacttc cattcctttc tgattggcac acgtgcagct catgacaatc tgtaggataa    1440

caatcagtgt ggatttccac tcttttcagt ccttcatgtt aaagatttag acaccacata    1500

caactggtaa aggacgtttt cttgagagtt ttaactatat gtaaacattg tataatgata    1560

tggaataaaa tgcacattgt aggacatttt cta                                 1593

<210>7

<211>237

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>7

ggcggaccgg cgctgggcag ccaggacagc cgcggcagcc gggtccgcag ggcagcagcc      60

ggcctctccc actgcagccc tcccgcccgc ctaccgtccg gcgcgatggc ggggagtagc     120

tcgctggagg cggtgcgcag gaagatccgg agcctgcagg agcaggcgga cgccgctgag     180

gagcgcgcgg gcaccctgca gcgcgagctg gaccacgaga ggaagctgag ggagacc        237

<210>8

<211>203

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>8

gggtgagagg aggctgcaac gccgagcgag gaggcaggaa ccggagcgcg agcagtagct      60

gggtgggcac catggctggg atcaccacca tcgaggcggt gaagcgcaag atccaggttc     120

tgcagcagca ggcagatgat gcagaggagc gagctgagcg cctccagcga gaagttgagg     180

gagaaaggcg ggcccgggaa cag                                             203

<210>9

<211>248

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>9

Met Ala Gly Ser Ser Ser Leu Glu Ala Val Arg Arg Lys Ile Arg Ser

1               5                   10                  15

Leu Gln Glu Gln Ala Asp Ala Ala Glu Glu Arg Ala Gly Thr Leu Gln

            20                  25                  30

Arg Glu Leu Asp His Glu Arg Lys Leu Arg Glu Thr Ala Glu Ala Asp

        35                  40                  45

Val Ala Ser Leu Asn Arg Arg Ile Gln Leu Val Glu Glu Glu Leu Asp

    50                  55                  60

Arg Ala Gln Glu Arg Leu Ala Thr Ala Leu Gln Lys Leu Glu Glu Ala

65                  70                  75                  80

Glu Lys Ala Ala Asp Glu Ser Glu Arg Gly Met Lys Val Ile Glu Ser

                85                  90                  95

Arg Ala Gln Lys Asp Glu Glu Lys Met Glu Ile Gln Glu Ile Gln Leu

            100                 105                 110

Lys Glu Ala Lys His Ile Ala Glu Asp Ala Asp Arg Lys Tyr Glu Glu

        115                 120                 125

Val Ala Arg Lys Leu Val Ile Ile Glu Ser Asp Leu Glu Arg Ala Glu

    130                 135                 140

Glu Arg Ala Glu Leu Ser Glu Gly Lys Cys Ala Glu Leu Glu Glu Glu

145                 150                 155                 160

Leu Lys Thr Val Thr Asn Asn Leu Lys Ser Leu Glu Ala Gln Ala Glu

                165                 170                 175

Lys Tyr Ser Gln Lys Glu Asp Arg Tyr Glu Glu Glu Ile Lys Val Leu

            180                 185                 190

Ser Asp Lys Leu Lys Glu Ala Glu Thr Arg Ala Glu Phe Ala Glu Arg

        195                 200                 205

Ser Val Thr Lys Leu Glu Lys Ser Ile Asp Asp Leu Glu Glu Lys Val

    210                 215                 220

Ala His Ala Lys Glu Glu Asn Leu Ser Met His Gln Met Leu Asp Gln

225                 230                 235                 240

Thr Leu Leu Glu Leu Asn Asn Met

                245

<210>10

<211>248

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>10

Met Ala Gly Ser Ser Ser Leu Glu Ala Val Arg Arg Lys Ile Arg Ser

1               5                   10                  15

Leu Gln Glu Gln Ala Asp Ala Ala Glu Glu Arg Ala Gly Thr Leu Gln

            20                  25                  30

Arg Glu Leu Asp His Glu Arg Lys Leu Arg Glu Thr Ala Glu Ala Asp

        35                  40                  45

Val Ala Ser Leu Asn Arg Arg Ile Gln Leu Val Glu Glu Glu Leu Asp

    50                  55                  60

Arg Ala Gln Glu Arg Leu Ala Thr Ala Leu Gln Lys Leu Glu Glu Ala

65                  70                  75                  80

Glu Lys Ala Ala Asp Glu Ser Glu Arg Gly Met Lys Val Ile Glu Ser

                85                  90                  95

Arg Ala Gln Lys Asp Glu Glu Lys Met Glu Ile Gln Glu Ile Gln Leu

            100                 105                 110

Lys Glu Ala Lys His Ile Ala Glu Asp Ala Asp Arg Lys Tyr Glu Glu

        115                 120                 125

Val Ala Arg Lys Leu Val Ile Ile Glu Ser Asp Leu Glu Arg Ala Glu

    130                 135                 140

Glu Arg Ala Glu Leu Ser Glu Gly Gln Val Arg Gln Leu Glu Glu Gln

145                 150                 155                 160

Leu Arg Ile Met Asp Gln Thr Leu Lys Ala Leu Met Ala Ala Glu Asp

                165                 170                 175

Lys Tyr Ser Gln Lys Glu Asp Arg Tyr Glu Glu Glu Ile Lys Val Leu

            180                 185                 190

Ser Asp Lys Leu Lys Glu Ala Glu Thr Arg Ala Glu Phe Ala Glu Arg

        195                 200                 205

Ser Val Thr Lys Leu Glu Lys Ser Ile Asp Asp Leu Glu Glu Lys Val

    210                 215                 220

Ala His Ala Lys Glu Glu Asn Leu Ser Met His Gln Met Leu Asp Gln

225             230                     235                 240

Thr Leu Leu Glu Leu Asn Asn Met

                245

<210>11

<211>44

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>11

Met Ala Gly Ser Ser Ser Leu Glu Ala Val Arg Arg Lys Ile Arg Ser

1               5                   10                  15

Leu Gln Glu Gln Ala Asp Ala Ala Glu Glu Arg Ala Gly Thr Leu Gln

            20                  25                  30

Arg Glu Leu Asp His Glu Arg Lys Leu Arg Glu Thr

        35                  40

<210>12

<211>44

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>12

Met Ala Gly Ile Thr Thr Ile Glu Ala Val Lys Arg Lys Ile Gln Val

1               5                   10                  15

Leu Gln Gln Gln Ala Asp Asp Ala Glu Glu Arg Ala Glu Arg Leu Gln

            20                  25                  30

Arg Glu Val Glu Gly Glu Arg Arg Ala Arg Glu Gln

        35                  40

<210>13

<211>18

<212>DNA

<213>Homp sapiens

<400>13

agctcgctgg aggcggtg                                                    18

<210>14

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Antisense oligonucleotide

<400>14

caccgccucc agcgagct                                                    18

<210>15

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Oligonucleotide

<400>15

gctccagcca cgccgact                                                    18

<210>16

<211>21

<212>RNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Oligonucleotide

<400>16

gauccggagc cugcaggagu u                                                21

<210>17

<211>21

<212>RNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Oligonucleotide

<400>17

cuccugcagg cuccggaucu u                                                21

<210>18

<211>9

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Fragment of the protein encoded by exon 1b of human Tm5a and Tm5b

<400>18

Ser Leu Glu Ala Val Arg Arg Lys Ile

1               5

<210>19

<211>9

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Fragment of the protein encoded by exon 1b of human Tm5a and Tm5b

<400>19

Ser Leu Gln Glu Gln Ala Asp Ala Ala

1               5

<210>20

<211>9

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Fragment of the protein encoded by exon 1b of human Tm5a and Tm5b

<400>20

Arg Glu Leu Asp His Glu Arg Lys Leu

1               5

Claims (43)

1.一种筛选调节细胞表面蛋白质活性的化合物的方法，所述方法包括确定在候选化合物存在时原肌球蛋白的活性或细胞定位，其中与所述化合物不存在时对比，所述化合物存在时改变的原肌球蛋白活性或细胞定位提示所述化合物调节细胞表面蛋白质活性。

2.根据权利要求1的方法，其中所述化合物存在时改变的原肌球蛋白细胞定位提示所述化合物增加细胞表面蛋白质活性。

3.一种筛选调节细胞表面蛋白质活性的化合物的方法，所述方法包括确定在候选化合物存在时原肌球蛋白的表达水平，其中与所述化合物不存在时对比，所述化合物存在时改变的原肌球蛋白表达提示所述化合物调节细胞表面蛋白质活性。

4.根据权利要求3的方法，其中所述化合物存在时降低的原肌球蛋白表达提示所述化合物增加细胞表面蛋白质活性。

5.一种筛选调节细胞表面蛋白质活性的化合物的方法，所述方法包括测量在候选化合物存在时原肌球蛋白与其一个结合配偶体的结合，其中与所述化合物不存在时对比，所述化合物存在时改变的原肌球蛋白与其结合配偶体的结合水平提示所述化合物调节细胞表面蛋白质活性。

6.根据权利要求5的方法，其中所述化合物存在时降低的原肌球蛋白与其结合配偶体的结合水平提示所述化合物增加细胞表面蛋白质活性。

7.根据权利要求5或权利要求6的方法，其中所述原肌球蛋白结合配偶体选自calponin、CEACAM1、内抑制素、Enigma、凝溶胶蛋白(优选亚结构域2)、S100A2、及肌动蛋白。

8.根据权利要求7的方法，其中所述原肌球蛋白结合配偶体是肌动蛋白。

9.根据权利要求1-8任一项的方法，其中所述细胞表面蛋白选自转运蛋白、通道、受体、生长因子、抗原、信号传导蛋白和细胞粘着蛋白。

10.根据权利要求9的方法，其中所述蛋白是转运蛋白或通道。

11.一种筛选治疗囊性纤维化的治疗性化合物的方法，所述方法包括确定在候选化合物存在时原肌球蛋白的活性或细胞定位，其中与所述化合物不存在时对比，所述化合物存在时改变的原肌球蛋白活性或细胞定位提示所述化合物对于治疗囊性纤维化是有用的。

12.权利要求11的方法，其中所述化合物存在时改变的原肌球蛋白细胞定位提示所述化合物对于治疗囊性纤维化是有用的。

13.一种筛选治疗囊性纤维化的治疗性化合物的方法，所述方法包括确定在候选化合物存在时原肌球蛋白的表达水平，其中与所述化合物不存在时对比，所述化合物存在时改变的原肌球蛋白表达提示所述化合物对于治疗囊性纤维化是有用的。

14.根据权利要求13的方法，其中所述化合物存在时降低的原肌球蛋白表达提示所述化合物对于治疗囊性纤维化是有用的。

15.一种筛选治疗囊性纤维化的治疗性化合物的方法，所述方法包括测量在候选化合物存在时原肌球蛋白与其一个结合配偶体的结合，其中与所述化合物不存在时对比，所述化合物存在时改变的原肌球蛋白与其结合配偶体的结合水平提示所述化合物对于治疗囊性纤维化是有用的。

16.根据权利要求15的方法，其中所述化合物存在时降低的原肌球蛋白与其结合配偶体的结合水平提示所述化合物对于治疗囊性纤维化是有用的。

17.根据权利要求15或权利要求16的方法，其中所述原肌球蛋白结合配偶体选自calponin、CEACAM1、内抑制素、Enigma、凝溶胶蛋白(优选亚结构域2)、S100A2、及肌动蛋白。

18.根据权利要求17的方法，其中所述原肌球蛋白结合配偶体是肌动蛋白。

19.根据权利要求1-18任一项的方法，其中所述方法进一步包括配制被鉴别的化合物用于对人或非人类动物进行给药。

20.一种调节蛋白质在细胞表面膜中的插入或保留的方法，所述方法包括给予细胞一种调节原肌球蛋白表达、定位或活性的药剂。

21.根据权利要求20的方法，其中通过给予所述细胞原肌球蛋白拮抗剂而增加所述蛋白质在细胞表面膜中的插入或保留。

22.根据权利要求20或权利要求21的方法，其中所述蛋白质选自转运蛋白、通道、受体、生长因子、抗原、信号传导蛋白和细胞粘着蛋白。

23.根据权利要求22的方法，其中所述转运蛋白是囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)。

24.一种调节分子转运进细胞或转运出细胞的方法，所述方法包括给予细胞一种调节原肌球蛋白表达、定位或活性的药剂。

25.根据权利要求24的方法，其中通过给予所述细胞原肌球蛋白拮抗剂来增加所述分子转运进细胞或转运出细胞。

26.根据权利要求24或权利要求25的方法，其中所述分子选自电解质、水、单糖和离子。

27.一种治疗或预防个体由于细胞表面膜蛋白异常插入、保留或活性而引起的疾病的方法，所述方法包括给予所述个体一种调节原肌球蛋白表达、定位或活性的药剂。

28.根据权利要求20-27任一项的方法，其中所述细胞是非肌细胞。

29.根据权利要求28的方法，其中所述细胞是神经元细胞或上皮细胞。

30.根据权利要求29的方法，其中所述上皮细胞是胃肠上皮细胞。

31.根据权利要求27的方法，其中所述由于细胞表面膜蛋白异常插入或活性而引起的疾病选自囊性纤维化、多发性硬化、多囊肾病、病毒感染、细菌感染、再灌注损伤、门克斯病、威尔逊病、糖尿病、肌强直性营养不良、癫痫和心境障碍如抑郁、双相性精神障碍或情绪恶劣性障碍。

32.一种治疗或预防个体囊性纤维化的方法，所述方法包括给予所述个体一种调节原肌球蛋白表达、定位或活性的药剂。

33.根据权利要求1-32任一项的方法，其中所述原肌球蛋白是由一个选自TPM1、TPM2、TPM3及TPM4的基因所编码的同工型。

34.根据权利要求33的方法，其中所述原肌球蛋白同工型选自TM1、TM2、TM3、TM4、TM5、TM5a、TM5b、TM6、Tm5NM-1、Tm5NM-2、Tm5NM-3、Tm5NM-4、Tm5NM-5、Tm5NM-6、Tm5NM-7、Tm5NM-8、Tm5NM-9、Tm5NM-10和Tm5NM-11。

35.根据权利要求34的方法，其中所述原肌球蛋白同工型包括由TPM1基因外显子1b编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)或由TPM3基因外显子1b编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)。

36.根据权利要求34的方法，其中所述原肌球蛋白同工型是TM5a或TM5b。

37.根据权利要求20-36任一项的方法，其中所述药剂是原肌球蛋白拮抗剂，所述拮抗剂选自肽、原肌球蛋白的抗体、小有机分子、原肌球蛋白编码mRNA的反义化合物、抗原肌球蛋白催化性分子如核酶或脱氧核酶、及一种靶向原肌球蛋白表达的dsRNA或小干扰RNA(RNAi)分子。

38.根据权利要求37的方法，其中所述原肌球蛋白拮抗剂是针对原肌球蛋白编码mRNA的反义化合物、催化性分子或RNAi分子。

39.根据权利要求37的方法，其中所述原肌球蛋白拮抗剂是特异地针对TPM1基因外显子1b(SEQ ID NO：7)或TPM3基因外显子1b(SEQ ID NO：8)的反义化合物、催化性分子或RNAi分子。

40.根据权利要求37的方法，其中所述原肌球蛋白拮抗剂是靶向序列AGCTCGCTGGAGGCGGTG(SEQ ID NO：13)的反义化合物、催化性分子或RNAi分子。

41.根据权利要求37的方法，其中所述原肌球蛋白拮抗剂是包含序列CACCGCCUCCAGCGAGCT(SEQ ID NO：14)的反义化合物。

42.一种评估一个个体对由于细胞表面膜蛋白异常插入、保留或活性而引起的疾病的易感性的方法，所述方法包括确定在所述个体的原肌球蛋白基因中存在突变的步骤。

43.一种评估一个个体对由于细胞表面膜蛋白异常插入、保留或活性而引起的疾病的易感性的方法，所述方法包括分析所述个体的细胞中原肌球蛋白的极化分布。

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