CN101675339B - 涉及细胞表面糖基化作用的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了多种方法用于通过在一个细胞上的细胞表面聚糖类的分析来评定由该细胞产生的一种靶糖蛋白的糖基化作用。因此，本发明传授了细胞表面蛋白类的糖基化作用能够用来作为对于其他蛋白的糖基化作用的一种代用品。

Description

涉及细胞表面糖基化作用的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2007年4月16日提交的美国临时申请序列号60/923,655的优先权，其全部内容通过引用结合在此。

背景

糖蛋白的糖基化作用模式经常在该糖蛋白的功能中发挥重要的作用。仅给出一些实例，糖蛋白的糖基化作用模式会影响其正确地折叠的能力、其稳定性(例如，对蛋白质水解和/或其他的降解的耐受性)、催化活性、药效学和/或药物代谢动力学特性、和/或糖蛋白与其他分子适当地进行相互作用的能力。可替代地或额外地，糖蛋白的糖基化作用模式可以影响这种糖蛋白的传送和靶向。例如，糖蛋白的糖基化作用模式会影响该糖蛋白是否仍然在细胞内(包括，例如该糖蛋白正确地靶向适当的亚细胞区室或多个区室)，该糖蛋白是否会是膜结合的和/或该糖蛋白是否会从细胞中分泌出来。为此，重要的是能够对糖蛋白糖基化作用模式进行鉴定和/或表征。

概述

本披露部分地基于细胞表面聚糖可以提供有关该细胞的状态的信息的认识，例如在由该细胞所产生的蛋白的糖基化作用中所反映。具体而言，已经发现细胞表面聚糖可以提供有关由该细胞所产生(并且可任选的是分泌)的一种糖蛋白的糖基化作用状况的信息。因此，不必将一种靶蛋白从一种细胞分离出来以便获得有关其糖基化作用状况的信息。相反，可对在该细胞表面上的一种或多种蛋白或脂类的糖基化作用进行评价以间接地揭示一种靶蛋白的糖基化作用的一个或多个方面。这可以简化并且促进靶蛋白糖基化作用的分析。

除其他事项之外，本披露提供了一些方法，其中在产生至少一种靶糖蛋白的细胞上对这些细胞表面聚糖进行分析。细胞表面聚糖的检测用来作为针对在靶糖蛋白上的糖基化作用的检测的一种代用品(proxy)(即，这些检测的聚糖不在靶糖蛋白上或来自靶糖蛋白)。在多个实施方案中，这种靶糖蛋白是一种非细胞表面糖蛋白。例如，这种靶糖蛋白是可溶的或从细胞中分泌的。在此类实施方案中，细胞表面聚糖的检测作为对于在已产生的非细胞表面糖蛋白上的特定的聚糖结构的测定的一种代用品(proxy)。

在某些实施方案中，本披露提供了多种方法，其中产生一种所感兴趣的糖蛋白(例如，一种非细胞表面糖蛋白或正在直接对与它相关联的聚糖进行分析的糖蛋白之外的任何其他的糖蛋白)的细胞是在允许所感兴趣的糖蛋白进行表达的条件下进行培养的，并接着与一个或多个试剂相接触，这些试剂检测了一种细胞表面聚糖(它不是所感兴趣的糖蛋白的一部分)的糖基化作用。典型地，此类方法将不包括一个分离所感兴趣的糖蛋白的步骤。此外，在多个实施方案中，这些步骤不包括所感兴趣的糖蛋白的任何一种直接的分析。因此，在此类实施方案中，这种细胞表面聚糖的分析作为一种代用品而使用以便于对该靶糖蛋白的糖基化作用进行评定。

在本披露的一些实施方案中，这种有关的细胞是一种哺乳动物细胞，例如CHO细胞。在本披露的一些实施方案中，这种靶糖蛋白是一种治疗性糖蛋白；在一些实施方案中，这种靶糖蛋白包括一种抗体或抗体片段。

在一些方面，本披露提供了一些方法，这些方法通过对一种细胞的一种细胞表面聚糖(例如，在该细胞的表面的一种糖蛋白或糖脂上的一种细胞表面聚糖)的一种特性进行评价来对由该细胞所产生的一种糖蛋白的糖基化作用性质进行鉴定。在其他方面，细胞表面聚糖的特性能更普遍地与该细胞的状况相关，例如与该细胞的生存力、形态学、密度、或其他可能受到不同的方法的条件(例如在用于培养该细胞的方法中、例如在从一种细胞中产生一种糖蛋白产物的方法中)所影响的特性相关。因此，本披露的实施方案可在多种不同的情况下进行使用，例如除其他事项之外，可以对细胞表面聚糖进行评价以便：(a)评定或预测一种糖蛋白产物(例如，一种治疗性糖蛋白产物)的糖基化作用的特征，(b)在用于产生这种糖蛋白产物的一种方法的一个或多个步骤的过程中对糖蛋白产品的质量(例如聚糖结构)进行监测，(c)检测在用于产生一种糖蛋白产物的一种方法中在多个方法条件方面的变化，(d)提供有关(例如比较)一种糖蛋白制品的不同批次的信息，(e)在用于产生这种糖蛋白产物的一种方法的不同步骤的过程中提供有关(例如比较)细胞状况或糖蛋白产物状况的信息，(f)在用于产生这种糖蛋白产物的多种方法的相同步骤的过程中提供有关(例如比较)细胞状况或糖蛋白产物状况的信息；和/或(g)提供有关(例如比较)由在相似或相同的条件下生长的两种或更多细胞或细胞群体(例如，源自从一种原始细胞群体中选择出来的单一细胞的克隆群体)所产生的一种糖蛋白产物的糖基化作用的特征的信息。

附图简要说明

图1示出了在具有或者没有升高的葡糖胺补充物的细胞培养基中所产生的已表达的、非细胞表面抗体糖蛋白上的核心岩藻糖基化作用的水平。

图2示出了在具有或者没有升高的葡糖胺补充物的细胞培养基中所产生的细胞表面糖蛋白上的核心岩藻糖基化作用的水平。

图3A至图3B示出了在对照培养基中(图3A)或在包含一种升高的葡糖胺浓度的培养基中(图3B)生长的细胞表面糖蛋白的聚糖结构。

图4示出了已表达的(非细胞表面)重组抗体以及细胞表面糖蛋白的唾液酸水平的液相色谱法分析。

图5示出了在具有或者没有一种升高的N-乙酰甘露糖胺浓度的细胞培养基中所产生的已表达的抗体糖蛋白上的唾液酸水平，如通过DMB进行标记以及HPLC所测量。

图6示出了在具有或者没有一种升高的N-乙酰甘露糖胺浓度的细胞培养基中的细胞表面糖蛋白上的唾液酸水平，如通过DMB进行标记以及HPLC所测量。

图7示出了在具有或者没有一种升高的N-乙酰甘露糖胺浓度的细胞培养基中所产生的细胞表面糖蛋白上的唾液酸水平，如通过唾液酸特异的凝集素结合以及流式细胞术所测量。

图8示出了通过细胞表面聚糖的阴离子交换色谱法所测定的细胞表面唾液酸的含量。中性的(NA2F)、单唾液酸化的(A1)、双唾液酸化的(A2)、或三唾液酸化的(A3)标准物的迁移显示在色谱图的上部。下部的色谱图展示了来自CHO细胞的细胞表面聚糖的代表性数据、以及相关的百分数。定义

大约、约、约略：如在此所使用，术语“大约”、“约”或“约略”当施用至一个或多个所感兴趣的值时，是指与一个所指出的参考值相类似的一个值。在某些实施方案中，术语“大约”、“约”或“约略”是指落在所指出的参考值的以下比例之内的数值的范围：25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、或更小。

生物样本：如在此所使用，术语“生物样品”是指由任何活细胞或生物体排泄或分泌而获得的任何固体或液体的样品，包括但不限于组织培养物、生物反应器样品、人或动物的组织、植物、水果、蔬菜、单细胞的微生物(如，细菌以及酵母)以及多细胞的生物体。例如，生物样本可以是一种生物液体，这种生物液体获自例如，血液、血浆、血清、尿液、胆汁、精液、脑脊液、房水或玻璃体液、或任何一种身体的分泌物、一种渗出液、一种溢泌物(例如，获自脓肿或任何其他的感染或炎症点的液体)、或者获自关节的液体(例如，正常的关节或受疾病(如类风湿性关节炎、骨性关节炎、痛风或脓毒性关节炎)影响的关节)。生物样品还可以是例如，获自任何器官或组织(包括活组织检查或尸体解剖样本)的一种样品，可以包括细胞(不论是原代细胞或是培养的细胞)，受任何细胞、组织或器官、组织培养物限制的培养基。

细胞表面糖蛋白：如在此所使用，术语“细胞表面糖蛋白”是指一种糖蛋白，它的至少一部分存在于细胞的外表面上。在一些实施方案中，细胞表面糖蛋白是一种位于细胞表面上的蛋白质，这样这些聚糖结构中至少一个结构存在于该细胞的外表面上。

细胞表面聚糖：“细胞表面聚糖”是存在于一个细胞的外表面上的一种聚糖。在本披露的多个实施方案中，细胞表面聚糖被共价地连接到作为一种细胞表面糖蛋白的部分的一个多肽上。细胞表面聚糖还可以被连接到细胞膜的脂类上。

相关：如在此所使用，术语“相关”是指两个事物之间的一种可预测的关系的建立。在此所说明的实施方案中，细胞的表面上的糖基化作用模式(或它的一种特征)与由该细胞所产生的一种靶结合糖(例如，糖蛋白)的一种糖基化作用模式(或它的一种特征)相关。这些相关的模式(或特征)不必彼此完全相同，只要从一个可以预测出另一个即可。一旦建立了相关性，即可以对其进行记录，例如进行书面记录或能够以其他方式被附着在一种介质或记忆源中(例如，一种电脑可读的介质或计算机记忆库或磁盘)。然后，相关的糖基化作用模式(或其特征)的检测可涉及参考书面的或附着的记录、或参考一种证实相关性的比较器实验(comparator experiment)、等等。这种比较器实验可以与一种糖基化作用模式(或其特征)的评定同时进行，或可以是一种历史的或将来的实验。

聚糖：如本领域内已知并且在此所使用，“聚糖”是多种糖。聚糖可以是糖残基的单体或聚合物，但典型地包含至少三个糖，并且可以是直链的或分支的。聚糖可以包括天然的糖残基(例如，葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰神经氨酸、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、己糖、阿拉伯糖、核糖、木糖、等等)和/或经修饰的糖(例如，2’-氟代核糖、2’-脱氧核糖、磷酸甘露糖、6’磺基N-乙酰葡糖胺、等等)。术语“聚糖”包括糖残基的均聚物和杂聚物。术语“聚糖”还涵盖了结合糖的一个聚糖组分(例如，一种糖蛋白、糖脂、蛋白聚糖、等等的一个聚糖组分)。该术语还涵盖游离的聚糖，包括从一种结合糖中已经被切割的或由其他方式所释放的聚糖。

聚糖制品：如在此所使用的术语“聚糖制品”是指根据一个具体的产生方法而获得的一组聚糖。在一些实施方案中，聚糖制品是指从一种糖蛋白制品(见以下糖蛋白制品的定义)中获得的一组聚糖。

结合糖：如在此所使用的术语“结合糖”涵盖了以下所有分子，其中至少一个糖部分被共价地连接到至少一个其他部分上。该术语准确地涵盖了所有具有共价附连的糖部分的生物分子，包括例如N-连接的糖蛋白、O-连接的糖蛋白、糖脂、蛋白聚糖、等等。

糖形：在此所使用的术语“糖形”是指结合糖的一种具体形式。即，当相同的主链部分(它作为一种结合糖的部分)(例如多肽、脂类、等等)具有被连接到不同的聚糖或聚糖的不同组上的潜在性时，于是结合糖(即，其中该主链被连接到具体的一组聚糖上)的每一种不同形式即被称为一种“糖形”。

糖脂：如在此所使用的术语“糖脂”是指包含一个或多个共价连接的糖部分(即，聚糖)的一种脂类。这个或这些糖部分可以是处于单糖、二糖、寡糖、和/或多糖的形式。这种或这些糖部分可以包括糖残基的一个单一的无分支的链或者可以由一个或多个分支的链所组成。在某些实施方案中，这些糖部分可以包括硫酸根和/或磷酸根基团。在某些实施方案中，这些糖蛋白包含O-连接的糖部分；在一些实施方案中，这些糖蛋白包含N-连接的糖部分。

糖蛋白：如在此所使用，术语“糖蛋白”是指一种蛋白质，该蛋白质包含了共价连接至一个或多个糖部分(即，聚糖)上的一个肽主链。如本领域的普通技术人员所理解，这种肽主链典型地包括具有多种氨基酸残基的一个直链。在某些实施方案中，这种肽主链跨越了细胞膜，这样它包括一个跨膜部分以及一个细胞外部分。在某些实施方案中，跨过了细胞膜的糖蛋白的肽主链包括了细胞内部分，跨膜部分、以及细胞外部分。在某些实施方案中，本披露的方法包括使用一种蛋白酶来切割一种细胞表面糖蛋白以释解出(liberate)该糖蛋白的细胞外部分，或它的一部分，其中这种暴露基本上不会使细胞膜破裂。这个或这些糖部分(moiety)可以是处于单糖、二糖、寡糖、和/或多糖的形式。这个或这些糖部分可以包括糖残基的一个单一的无分支的链或者可以包括一个或多个分支的链。在某些实施方案中，这些糖部分可以包括硫酸根和/或磷酸根基团。可替代地或额外地，这些糖部分可以包括乙酰基、羟乙酰基、丙基或其他烷基的修饰。在某些实施方案中，这些糖蛋白包含O-连接的糖部分；在一些实施方案中，这些糖蛋白包含N-连接的糖部分。在某些实施方案中，在此所披露的方法包括对以下项中任何一项或全部进行分析的一个步骤：细胞表面糖蛋白、已释解出的细胞表面糖蛋白的碎片(例如，糖肽)、附连到细胞表面糖蛋白上的细胞表面聚糖、细胞表面糖蛋白的肽主链；此类糖蛋白、聚糖和/或肽主链的碎片，以及它们的组合。

糖蛋白制品：如在此所使用，术语“糖蛋白制品”是指一组单个的糖蛋白分子，该组中的每一个包括具有一个特定的氨基酸序列(这种氨基酸序列包括至少一个糖基化位点)的一个多肽以及被共价地附连到该至少一个糖基化位点上的至少一种聚糖。在糖蛋白制品中的一种特定的糖蛋白的单个的分子典型地具有相同的氨基酸序列，但是可能在该至少一个糖基化位点的占用方面有所不同和/或在被连接到该至少一个糖基化位点上的聚糖的身份方面所有不同。即，一种糖蛋白制品可以仅包括一种特定的糖蛋白的一种单一的糖形，但是更典型地包括多种糖形。相同的糖蛋白的不同制品可以在所存在的糖形的身份方面(例如，在一种制品中存在的糖形可能是另一种制品所缺少的)和/或在不同糖形的相对量值方面有所不同。

糖苷酶：如在此所使用的术语“糖苷酶”是指一种试剂，该试剂切割了位于聚糖中的多种顺序的糖之间或糖与主链部分之间(例如，在糖蛋白的糖与肽主链之间)的一个共价键。在一些实施方案中，糖苷酶是一种酶。在某些实施方案中，糖苷酶是含有一个或多个多肽链的一种蛋白质(例如，一种蛋白质酶(protein enzyme))。在某些实施方案中，糖苷酶是一种化学切割试剂。

糖基化作用模式：如在此所使用，术语“糖基化作用模式”是指在一个具体的样品中存在的一组聚糖结构。例如，一个特定的结合糖(例如，糖蛋白)或一组结合糖(例如，糖蛋白的组合)将具有一种糖基化作用模式。在一些实施方案中，提及的是细胞表面聚糖的糖基化作用模式，或者一种“表面糖基化作用模式”。如在此使用，“表面糖基化作用模式”可以指存在于一个单一的所感兴趣的细胞表面糖蛋白和/或糖脂的细胞外结构域的聚糖的模式(或“糖基化作用模式”)。额外地或者可替代地，“表面糖基化作用模式”可以指存在于多种细胞表面糖蛋白和/或糖脂的细胞外结构域的聚糖的模式(或“糖基化作用模式”)。在某些实施方案中，“表面糖基化作用模式”说明了存在于细胞表面糖蛋白和/或糖脂的全部补体(complement)的聚糖的模式(或“糖基化作用模式”)。基于上下文，本领域的普通技术人员应当容易地理解“表面糖基化作用模式”是否是指一种单一的细胞表面糖蛋白和/或糖脂的糖基化作用模式或是指多种细胞表面糖蛋白和/或糖脂的糖基化作用模式。糖基化作用模式的特征可以是，例如聚糖的身份、单个的聚糖或特定类型的聚糖的量(绝对的或相对的)、糖基化位点的占用度、等等，或此类参数的组合。

N-聚糖：如在此所使用，术语“N-聚糖”是指多种糖的一个聚合物，该聚合物已经从一种结合糖中释放，但是之前通过一个氮连接(参见以下N-连接的聚糖的定义)被连接到该结合糖上。

N-连接的聚糖：N-连接的聚糖是通过一个氮连接而连接到一种结合糖上的聚糖。存在着不同分类的N-连接的聚糖，但是它典型地基于共同的核心戊糖(Man)₃(GlcNAc)(GlcNAc)。

O-聚糖：如在此所使用，术语“O-聚糖”是指多种糖的一个聚合物，该聚合物已经从一种结合糖中释放，但是之前通过一个氧连接(参见以下O-连接的聚糖的定义)被连接到该结合糖上。

O-连接的聚糖：O-连接的聚糖是通过一个氧连接而连接到一种结合糖上的聚糖。O-连接的聚糖典型地通过N-乙酰基-D-半乳糖胺(GalNAc)而被附连至糖蛋白上或者通过N-乙酰基-D-葡糖胺(GlcNAc)而被附连至L-丝氨酸(Ser)或L-苏氨酸(Thr)的羟基基团上。一些O-连接的聚糖还具有多种修饰作用，如乙酰化作用和硫酸化作用。在一些例子中，O-连接的聚糖附连到糖蛋白，通过岩藻糖或甘露糖到L-丝氨酸(Ser)或L-苏氨酸(Thr)的羟基基团上。

磷酸化作用：如在此所使用，术语“磷酸化作用”是指将一个或多个磷酸根基团共价地加至一个分子(例如，一种聚糖)中的过程。

蛋白酶：如在此所使用的术语“蛋白酶”是指一种试剂，该试剂切割了位于一个多肽链中的多个顺序的氨基酸之间的一个肽键。在一些实施方案中，蛋白酶是一种酶(即，一种蛋白水解酶)。在某些实施方案中，蛋白酶是一种蛋白质(例如，一种蛋白质酶)，该蛋白质包括一个或多个多肽链。在某些实施方案中，蛋白酶是一种化学切割试剂。

蛋白质：总体而言，“蛋白质”是一种多肽(即，通过肽键彼此相连的一串至少两个的氨基酸)。蛋白质可以包括除氨基酸之外的部分(例如，可以是糖蛋白)和/或还可以另行进行处理或修饰。本领域的普通技术人员应当理解，“蛋白质”可以是由一个细胞(具有或没有一种信号序列)所产生的一种完整的多肽链，或者可以是它的一个功能性部分。本领域的普通技术人员应当进一步地理解，有时蛋白质可包括多于一种的多肽链，例如通过一个或多个二硫键相连接或通过其他方式相缔合。

唾液酸：在此所使用，术语“唾液酸”是针对神经氨酸的N-或O-取代的衍生物的一个统称，是一种九碳单糖。神经氨酸的氨基基团典型地带有唾液酸中的乙酰基或羟乙酰基的基团。唾液酸中存在的羟基取代基可以通过乙酰化作用、甲基化作用、硫酸化作用、以及磷酸化作用进行修饰。主导性唾液酸是N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)。唾液酸向聚糖传递一个负电荷，这是因为羰基基团在生理pH下易于解离出一个质子。示例性的去质子的唾液酸显示如下：

N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)                    神经氨酸(Neu)

基本上：如在此所使用，术语“基本上”是指展示出一个所感兴趣的特征或特性的总体的或接近总体的范围或程度的定性的状态。生物领域内的普通技术人员应当理解，生物以及化学现象很少(如果存有的话)会达到完全和/或进行到完全或实现或避免一个绝对的结果。因此，术语“基本上”在此进行使用以涵盖在许多生物以及化学现象中固有的潜在的完全性的缺失。仅给出一个具体的实例，当一种处理被说成“基本上”不会使细胞膜破裂时，它意指在处理的过程中以及在处理之后所有的或大部分细胞膜仍然是完整的，例如这样细胞内的糖蛋白或糖肽因此不会从细胞中释放。在某些实施方案中，术语“基本上”当被施用至未破裂的细胞膜中时是指一种状态，其中经受了一种特定的处理的细胞的15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、或更少展示出了可测量的已破裂的细胞膜。在某些实施方案中，术语“基本上”当被施用于未破裂的细胞膜中是指一种状态，其中经受了一种特定的处理的多个细胞都没有展示出可测量的已破裂的细胞膜。某些优选的实施方案的详细说明

如在此所说明的，本披露涉及存在于细胞表面上的聚糖结构的检测，其存在、身份、和/或分布(例如，相对量值)揭示了有关该细胞的状况的信息，例如有关由这些细胞产生的一个或多个非细胞表面糖蛋白的糖基化作用状况和/或特征的信息。即，在本披露的一方面，细胞表面聚糖作为对于在非细胞表面糖蛋白上所发现的聚糖结构和/或糖基化作用模式的测定的一种代用品。在本披露的一些实施方案中，这种非细胞表面糖蛋白是一种治疗性糖蛋白。在一些此类的实施方案中，已经对该细胞进行工程化处理以表达这种治疗性糖蛋白，和/或以预先确定的水平或在预先确定的情况下表达这种治疗性蛋白。细胞表面聚糖

许多不同类型的细胞将它们产生的蛋白质和/或脂类中至少一些进行糖基化，并且针对这种糖基化作用存在着几种不同的机制。然而，总体而言，寡糖链是经由N-连接或者O-连接而被连接至内质网以及高尔基体中的一种多肽链(即，一种蛋白)和/或一种脂类上。N-连接的糖基化作用

典型地，N-连接的寡糖链被加到内质网的内腔中的糖蛋白上(见Alberts等人的Molecular Biology of the Cell，1994，通过引用结合在此)。确切地，将一种初始寡糖(典型地是14-糖)加到包含于Asn-X-Ser/Thr的靶共有序列内的天冬酰胺残基的侧链的氨基基团上，其中X可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。这种初始寡糖的结构为大多数真核生物所共有，并且包含3个葡萄糖、9个甘露糖、以及2个N-乙酰葡糖胺的残基。这种初始寡糖链通常通过内质网中的特异性糖苷酶的酶类进行修剪，产生由两个N-乙酰葡糖胺以及三个甘露糖的残基所组成的一个短的、分支的核心寡糖。

N-聚糖可以再分成三个独特的组，称为“高甘露糖类型”、“杂合类型”、以及“复合类型”，其中在所有三个组中均存在一个常见的戊糖核心(Man(α1，6)-(Man(α1，3))-Man(β1，4)-GlcpNAc(β1，4)-GlcpNAc(β1，N)-Asn)。

在内质网中进行最初的处理之后，糖蛋白接着被传送至高尔基体，在高尔基体中可发生进一步的处理。如果该聚糖在完全地被剪切成核心戊糖结构之前被转入到高尔基体，则它导致了一种“高甘露糖聚糖”。

额外地或可替代地，一个或多个N-乙酰葡糖胺的单糖单元可以被加到核心甘露糖的亚单元中以便形成一个“复合聚糖”。半乳糖可以被加到N-乙酰葡糖胺的亚单元中，并且唾液酸的亚单元可以被加到半乳糖的亚单元中，产生用唾液酸、半乳糖、或N-乙酰葡糖胺的残基中的任何一个进行终止的链。额外地，一种岩藻糖残基可以被加到核心寡糖的一个N-乙酰葡糖胺残基中。这些加入物各自通过特异性的糖基转移酶进行催化。‘杂合聚糖’包含高甘露糖以及复合聚糖的特征。例如，杂合聚糖的一个支链可以主要地或专门地包括甘露糖残基，而另一个支链可以包括N-乙酰葡糖胺、唾液酸、半乳糖、和/或岩藻糖的糖类。O-连接的糖基化作用

O-连接的寡糖链被加至多肽链中的特异的丝氨酸或苏氨酸的残基上。第一糖残基的转运(在许多情况下是一种N-乙酰半乳糖胺)典型地在内质网中开始并且在高尔基体中完成。这些O-连接的低聚糖的残基是一次添加一个的并且每个残基的加入是由一种特异的酶进行催化的。与N-连接的糖基化作用相反，针对O-连接的糖基化作用的氨基酸序列共有区定义欠佳。靶糖蛋白

本披露的技术可以应用于评定所感兴趣的任何非细胞表面糖蛋白或任何其他的糖蛋白(除了正在直接对与它相关联的聚糖进行分析或由一个特定的细胞或多个细胞的群体所产生的糖蛋白之外)的糖基化作用的状态。所感兴趣的非细胞表面糖蛋白的身份不旨在限定本披露。然而，在大多数的实施方案中，已知这种细胞或这些细胞能产生一种特定的所感兴趣的糖蛋白(“靶”糖蛋白)，将对其糖基化作用状况进行评定。

在多个实施方案中，这种所感兴趣的靶糖蛋白不是一种由该细胞自然地产生的糖蛋白；相反，已对该细胞进行工程化处理来产生它。在一些实施方案中，这种靶糖蛋白是一种由该细胞自然地产生的糖蛋白，但是以对该细胞进行工程化处理以一种升高的水平和/或在预先确定的情况下(例如，在一种诱导剂、等等的存在下)来产生它。

在多个实施方案中，靶糖蛋白当给予至动物(例如，哺乳动物(如，人类))时具有治疗性活性。仅给出一些实例，促红细胞生成素、干扰素、血液凝血因子、集落刺激因子、多种抗体，并且某些酶类全部是糖蛋白，这些糖蛋白是目前作为生物药剂学试剂在已工程化处理的细胞系中产生的。在本披露的一些实施方案中，如在此所说明对产生这些试剂中的一个或多个试剂的细胞的表面上的聚糖进行测定，以便评定或监测试剂的糖基化作用。本领域的普通技术人员应当知道出于治疗以及其他目的可以进行工业化表达(例如，在生物反应器中生产)的其他商业上相关的糖蛋白。本披露提供了一些方法用于对此类商业上相关的糖蛋白的糖基化作用模式进行监测。

代表性的、可商购的糖蛋白产物包括，例如：

如本领域的普通技术人员应当理解，此类治疗性糖蛋白试剂的糖基化作用模式可以潜在地影响它们的治疗特性。本披露提供了一些技术，这些技术允许研究者在这些蛋白当在细胞中产生时对这些蛋白的糖基化作用进行评定，而不要求将这些蛋白它们自身分离。如以下进一步所讨论，因此本披露提供了(除其他事项之外)在这些糖蛋白正在被产生时针对治疗性糖蛋白产物的产品质量的实时评定。

本领域的普通的技术人员应当理解本披露不局限于在以上所列的糖蛋白上、或确实在治疗性糖蛋白上、或在一种细胞中已经对这些糖蛋白的表达进行工程化处理(和/或表达的程度或计时)的糖蛋白上的糖基化作用的评定。这些表现仅仅是本披露的某些具体的实施方案；然而，本领域的普通技术人员应当理解本披露的原则适合于任何一种靶糖蛋白。在细胞中产生靶糖蛋白

本领域的普通技术人员应当容易地理解的是，可以在多种细胞和/或细胞系中的任何一种中产生多种糖蛋白，这些糖蛋白的糖基化作用将如在此所说明而被监测。的确，可以利用将它的多种蛋白质中的至少一些进行糖基化的任何一种细胞并且使其在允许这种糖基化作用发生的任何一种情况下进行生长。适宜的细胞包括但是不局限于：哺乳动物细胞、禽类细胞、鱼细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞、细菌细胞、以及杂交的细胞。在一些实施方案中，已经对这些细胞进行(例如，遗传学上的和/或化学的)工程化处理以具有更类似于人类细胞的一个或多个糖基化作用特征。

根据本披露可使用的示例性的哺乳动物细胞包括但是不局限于：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞、幼仓鼠肾(baby hamster kidney)(BHK细胞)、NS0细胞、MCF-7细胞、MDA-MB-438细胞、U87细胞、A172细胞、HL60细胞、A549细胞、SP10细胞、DOX细胞、DG44细胞、HEK293细胞、SHSY5Y、Jurkat细胞、BCP-1细胞、COS细胞、Vero细胞、GH3细胞、9L细胞、3T3细胞、MC3T3细胞、C3H-10T1/2细胞、NIH-3T3细胞、以及C6/36细胞。

根据本披露可使用的示例性的鱼细胞系包括但是不局限于：ZF4细胞、AB9细胞、GAKS细胞、OLF-136细胞、CAEP细胞、CAF细胞、OLHE-131细胞、OLME-104细胞、ULF-23细胞、BRF41细胞、Hepa-E1细胞、Hepa-T1细胞、GEM-81细胞、GEM-199细胞、GEM-218细胞、GAKS细胞、D-11细胞、R1细胞、RTG-2细胞、RTO细胞、以及TPS细胞。更多的完整览表可以在Fryer and Lannan，2005，″Three decades of fish cell culture：a current listing of cell lines derivedfrom fishes，″J.Tissue Culture Methods，16：87-94中发现。

根据本披露可使用的示例性的昆虫细胞系包括但是不局限于：SFM细胞、Sf21细胞、Sf9细胞、Schneider细胞、S2细胞、T.ni细胞、SES-MaBr-1细胞、SES-MaBr-3细胞、NIAS-MB-25细胞、NIAS-MaBr-92细胞、FRI-SpIm-1229细胞、SES-MaBr-4细胞、NIAS-LeSe-11细胞、TUAT-SpLi-221细胞、NIAS-PX-64细胞、NIAS-MB-32细胞、NIAS-MaBr-93细胞、SES-MaBr-5细胞、BM-N细胞、NIAS-PX-58细胞、MBHL-2细胞、以及MBHL-3细胞。

本领域的普通技术人员应当认识到这是一种示例性的、不是根据本披露可使用的不同细胞的综合性列表。可对其他细胞进行有利地利用来产生一种靶糖蛋白。此类细胞可以处于培养之中或在组织、器官、或生物体的环境中。

本领域的普通技术人员还应当理解的是，可以使用多种表达系统和载体以便在根据本披露所使用的细胞或细胞系中表达所感兴趣的一种蛋白(例如见Molecular cloning：A Laboratory Manual，Ed.bySambrook，CSHL Press，2002)。

此外，可以根据本披露使用多种细胞培养基中的任何一种(包括能够支持一种或多种细胞类型或细胞系的生长的复合培养基和/或无血清的培养基)。典型地，细胞培养基包含一种缓冲剂、盐类、能量来源、多种氨基酸(例如，天然的氨基酸、非天然的氨基酸、等等)、多种维生素、和/或多种痕量元素。细胞培养基可以可任选地包含多种其他的成分，包括但不限于：碳源(例如、天然的糖类、非天然的糖类、等等)、辅因子、脂类、糖类、核苷类、由动物衍生的组分、水解产物、激素/生长因子、表面活性剂、指示剂、矿物质、特异性酶类的激动剂/抑制剂、以及多种有机物(例如，丁酸盐/酯，它诱导凋亡，它释放糖基化酶并经常使细胞的生长速率变缓，它改变糖基转移酶的水平，它可以导致更成熟的糖基化作用，并且它导致细胞的能量方面的变化；氯喹，它影响细胞内的pH；甜菜碱，它是一种渗透压保护剂(osmoprotectant)；氨，它改变了细胞内的pH水平并且它可以改变糖基转移酶的效率；等等)、和/或小分子代谢产物(例如，CMP-唾液酸、葡糖胺、非天然的糖衍生物、等等)。适宜于根据本披露所使用的细胞培养基可以从多个来源(例如ATCC(Manassas，Va))进行商购。

在某些实施方案中，可使用以下培养基中的一种或多种使生长细胞：RPMI-1640 Medium、Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium、Minimum Essential Medium Eagle、F-12K Medium、Iscove′s ModifiedDulbecco′s Medium。如本领域的普通的技术人员应当理解，当使用无血清和/或无蛋白胨的限定性培养基时，这种培养基是典型地高度富集多种氨基酸以及痕量元素的(见例如授予Mather等人的美国专利号5,122,469以及授予Keen等人的美国专利号5,633,162)。

不同的细胞培养基可以影响在该培养基中所表达的糖蛋白的糖基化作用模式。例如，一种给定的细胞培养基可以导致以下糖蛋白的产生，这种糖蛋白具有一种增高的糖基化作用模式、一种降低的糖基化作用模式、或一种经改变的糖基化作用模式(例如，表示成在某些聚糖方面增加而在其他聚糖方面减少)。本领域的普通技术人员应当知道并且将能够选择出一个或多个适宜的细胞培养基用于生长细胞(使用本披露的某些方法将对这些细胞的细胞表面聚糖进行分析)。

在一些实施方案中，将这些细胞按照以下方式进行培养：分批培养、补料分批培养(fed batch culture)、灌注培养、静止悬浮(例如，转瓶、T型烧瓶、微载体、T150、等等)、和/或在摇床上。

根据本披露产生至少一种非细胞表面糖蛋白(即靶糖蛋白)的细胞可以在多种细胞培养条件的任何一种条件下进行生长。

在一些实施方案中，将这些细胞在以下的细胞培养条件下进行培养，这样使得预期这种靶糖蛋白展示出一种所希望的糖基化作用模式。在一些实施方案中，对一种或多种细胞培养条件进行控制和/或改进以便产生具有更多令人希望的糖基化作用模式的靶糖蛋白。此类可以得到控制或改进的细胞培养条件包括但不局限于：pH、CO₂水平、氧气水平、培养物的搅拌速率、氧化还原的条件、培养温度、细胞密度、种子培养的密度、培养的持续时间、反应器的设计、喷雾率、和/或摩尔渗透压浓度。

如果希望的话，可以使用多种方法中的任何一种将这些细胞从这种细胞培养基中分离出来。在某些实施方案中，这些细胞在一种悬浮的培养系(suspension culture)中进行生长。在此类实施方案中，可以通过离心作用和清洗的一个或多个循环(如，使用一种生理学上适宜的洗涤液，如磷酸盐缓冲盐水)将这些细胞从这种细胞培养基中纯化出来。

在某些实施方案中，这些细胞在一种粘附的培养系(adhesion culture)中进行生长。在此类实施方案中，通过首先从培养系表面释放这些细胞而使它们可以从细胞培养基中纯化出来。例如，通过使这些细胞经受EDTA将它们从这种培养系表面中释放。本领域的普通技术人员应当知道其他适宜的可用于将粘附的细胞从这种培养系表面释放的试剂。在释放之后，这些细胞可以通过离心作用和洗涤的一个或多个循环(例如，使用一种生理学适宜的洗涤液，如磷酸盐缓冲盐水)而被纯化。当使用在悬浮培养中生长的细胞时，应该注意不用过高的力将这些细胞离心以避免不必要的细胞破碎。细胞表面聚糖的分析

可利用任何适宜的技术来检测根据本披露的一种细胞表面上的聚糖。可以在这些细胞上对这些聚糖进行检测和/或分析，例如当它仍然是由一种细胞产生的一种糖蛋白的部分时。例如，根据某些实施方案，在不存在蛋白酶或糖苷酶处理时对这些聚糖进行检测和/或分析。可替代地或额外地，这些聚糖可以是从这些细胞中释放并接着对其进行检测和/或分析。这些聚糖可以通过使这些细胞经受一种或多种蛋白酶、糖苷酶、或两者皆有而从细胞中释放。例如，通过使一种细胞经受一种或多种蛋白酶(诸如但不限于在此所说明的蛋白酶，将这种已释解出的糖肽经受一种或多种糖苷酶，诸如但不限于在此所说明的糖苷酶)，可将一种糖肽从一个细胞中释解出。作为另一个非限制性的实例，通过使该细胞直接经受糖苷酶处理，不使该细胞经受蛋白酶处理，可将这些聚糖从该细胞中释放。以下更详细地提出了某些代表性的分析技术，但是这些分析技术不旨在限制本披露的范围。糖肽的释放

在本披露的某些实施方案中，涉及对细胞表面聚糖进行分析的一个步骤是从该细胞的表面释解出此类聚糖。在由此类实施方案提供的几个优点中的是可以获得一种高度的纯的细胞表面聚糖的群体而没有被这些聚糖(主要发现在细胞内部)显著污染这一事实。例如，使用本披露的某些方法，当将这些细胞表面聚糖从该细胞中释解出时基本上避免了细胞的溶解。额外地或者可替代地，与目前可以获得的方法相比，在此所披露的某些方法在操作步骤的数目和/或难度方面提供了显著的降低。

在某些实施方案中，这些细胞表面糖蛋白通过使该细胞经受一种或多种蛋白酶而从该细胞表面释解出。这些蛋白酶在一种多肽链内切割了多个酰胺键。存在几种类别的蛋白酶，包括化学试剂以及酶试剂。这些蛋白水解酶包括例如，丝氨酸蛋白酶类、苏氨酸蛋白酶类、半胱氨酸蛋白酶类、天冬氨酸蛋白酶类、金属蛋白酶类、以及谷氨酸蛋白酶类。根据本披露可使用的特异性蛋白水解酶的非限制性的实例包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、疟原虫胃蛋白酶(plasmepsin)、肾素、凝乳酶、木瓜蛋白酶、一种组织蛋白酶(例如组织蛋白酶K)、一种半胱天冬蛋白酶(例如CASP3、CASP6、CASP7、CASP14)、钙蛋白酶1、钙蛋白酶2、嗜热菌蛋白酶(thermolysin)、羧肽酶A或B、基质金属蛋白酶、一种谷氨酸蛋白酶、和/或它们的组合。本领域的普通的技术人员应当知道多种其他的蛋白酶，这些蛋白酶可根据本披露用于从细胞表面释放一种糖蛋白。

目前分析细胞的糖蛋白的方法(即使明确地指出将靶向至细胞表面聚糖上)典型地是对于细胞表面聚糖而言不是特异地选择性的。例如，目前的这些方法典型地采用了一种或多种粗糙的洗涤剂来提取膜蛋白，在这之后在用从蛋白质或多肽中去除聚糖结构的试剂进行处理之前对游离的糖类进行透析。在此类条件下，这些聚糖制品被细胞内聚糖(例如，来自内质网和/或高尔基体)污染。此类细胞内的聚糖典型地是未成熟的、高甘露糖聚糖。因此，它们的夹杂物可以使与细胞表面糖蛋白相关联的聚糖结构的分析发生偏移。

在本披露的一些实施方案中，细胞表面聚糖的分析涉及洗涤剂的使用以便将细胞表面糖蛋白从膜中释放。然而，在本披露的一些实施方案中，洗涤剂处理被最小化或被完全避免有利于将细胞膜的破裂最小化的策略。例如，在一些实施方案中，这些细胞膜的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多仍然是完整的(例如，如通过台盼蓝排除法所监测)。除其他事项之外，此类方法是有利的，因为它们可以减少或消除存在于该细胞内部的未成熟的、高甘露糖糖蛋白的污染。

在本披露的某些实施方案中，通过使该细胞经受一种或多种蛋白酶将这些聚糖(处于糖肽的形式)从一种细胞表面释解出。在某些实施方案中，在将该细胞膜的破裂最小化的情况下，将这些细胞经受一种或多种蛋白酶。在本披露的一些实施方案中，通过将该细胞经受一种或多种蛋白酶达到一段限定的时间以避免该细胞膜的实质性溶解，将这些聚糖从一个细胞表面释解出。在某些实施方案中，将一种细胞经受一种或多种蛋白酶达到一个足够的限定的时间，这样不发生该细胞膜的实质性溶解。

例如，可以将一种细胞经受一种或多种蛋白酶达到一段时间，该段时间小于约15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1分钟。在某些实施方案中，将一种细胞经受一种或多种蛋白酶达到一段时间(该段时间大于15分钟，只要该细胞膜不发生实质性溶解)。例如，可以采用一种足够低的浓度的一种或多种蛋白酶、一个足够低的温度和/或多种其他因素或条件的任何一种，这样蛋白酶的整体活性被降低至一个点，在该点细胞膜不发生实质性溶解。本领域的普通技术人员应当知道并且将能够采用确保不发生细胞膜的实质性溶解的多个因素或条件。

在本披露的某些实施方案中，例如通过用蛋白酶进行处理，从这些细胞中释放至少约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的细胞表面聚糖。仅给出一个特定的实例，本披露证实了(例如)用胰蛋白酶在37℃切割持续15分钟导致了超过50％的细胞表面聚糖的释放。

在某些实施方案中，通过将一个细胞经受至少约0.1mg/mL的浓度的一种或多种蛋白酶(例如，蛋白水解酶)而将这些细胞表面聚糖释解出。在某些实施方案中，通过使一个细胞经受低于约2.0mg/mL的浓度的一种或多种蛋白酶(例如，蛋白水解酶)而将这些细胞表面聚糖释解出。在某些实施方案中，通过使一个细胞经受约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0mg/mL或更高的浓度的一种或多种蛋白酶(例如，蛋白水解酶)而将这些细胞表面聚糖释解出。

在某些实施方案中，这些细胞表面聚糖是通过使一种细胞经受多种蛋白酶而被释解出的。例如，可以使一种细胞经受2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多的蛋白酶以便将这些细胞表面聚糖释解出。可将此类的多种蛋白酶同时和/或顺序地给予该细胞。在某些实施方案中，通过使一种细胞同时经受多种蛋白酶而将这些细胞表面聚糖释解出，在这之后将已释解出的聚糖(处于糖肽类的形式)从该细胞中纯化出来。

在某些实施方案中，通过使一种细胞经受一种第一蛋白酶(或多个第一蛋白酶)达到一个第一时间段，之后使该细胞经受一种第二蛋白酶(或多个第二蛋白酶)达到一个第二时间段而将这些细胞表面聚糖释解出。在使用该第二蛋白酶处理之前，可以可任选地将该第一蛋白酶移出和/或使其失活。作为举例，在一个温度下孵育该蛋白酶达足以将其灭活的时间，可以使该第一蛋白酶失活。额外地或可替代地，通过用对该蛋白酶特异的一种抑制剂(例如，一种抗体或其他分子，它特异性地连接至该第一蛋白酶上并抑制其催化活性)对该第一蛋白酶进行孵育使该第一蛋白酶失活。其他的使该第一蛋白酶失活的方法对于本领域的普通技术人员而言应当是已知的。当通过用一种特异性的抑制剂对该第一蛋白酶进行孵育而使该第一蛋白酶失活时，应当理解的是该抑制剂的存在不应该基本上抑制该第二蛋白酶的活性。

在某些实施方案中，在聚糖的释放之前将这种或这些蛋白酶移除和/或使其失活。作为举例，在一个温度下将一种蛋白酶孵育达足以使其失活的时间可以使该蛋白酶失活。可替代地或额外地，通过用特异性结合一种蛋白酶并且抑制其活性的一种抑制剂或抗体或其他分子对该蛋白酶进行孵育可以使该蛋白酶失活。聚糖的释放

在本披露的某些实施方案中，在对这些细胞表面聚糖进行分析之前对这些细胞表面聚糖进行切割。例如，在某些实施方案中，在已将这些细胞表面糖肽从该细胞中释解出之后(例如，通过用多种蛋白酶进行处理，如以上更详细地说明)，将一种或多种聚糖结构从这些细胞表面糖肽上切割下来。在某些实施方案中，将一种或多种聚糖结构从还未从该细胞中释解出的这些细胞表面糖肽上切割下来。

在某些实施方案中，通过使用一种酶或多种酶(识别并剪切这些聚糖结构)来释放一种或多种聚糖结构。可以根据本披露使用中将这些聚糖结构从细胞表面糖蛋白上切割下来的多种糖苷酶以及其他酶类中的任何一种。此类酶的几个实例综述于R.A.O′Neill，Enzymatic release of oligosaccharides from glycoproteins forchromatographic and electrophoretic analysis，J.Chromatogr.A 720，201-215.1996；and S.Prime，et al.，Oligosaccharide sequencing based onexo-and endo-glycosidase digestion and liquid chromatographic analysisof the products，J.Chromatogr.A 720，263-274，1996中，其中每一篇的全文均通过引用结合在此。在某些实施方案中，使用酶PNGase F(肽N-糖苷酶F)将这些聚糖从一种糖肽或糖蛋白上移出。PNGase-F是一种酰胺酶，它在最里面的GlcNAc与来自N-连接的糖蛋白的高甘露糖、杂合、以及复合寡糖的天冬酰胺残基之间对酰胺键进行切割。额外地或可替代地，在某些实施方案中，使用酶PNGase A、O-聚糖酶、和/或Endo-H将这些聚糖移出。

为了改进糖基化位点对于一种剪切酶的可接近性，大多数糖蛋白要求一个蛋白质变性的步骤。典型地，这是通过使用洗涤剂(例如SDS)和/或二硫化物还原剂(例如β-巯基乙醇)而完成的，尽管为了根据本披露来使用的使一种糖蛋白变性的方法不限于使用此类试剂。例如，暴露于高温下能够足以使一种糖蛋白变性，这样用于对这些聚糖结构进行切割的一种适宜的酶能够达到该切割位点。在某些实施方案中，通过将一种糖蛋白在以下温度孵育达足以使该糖蛋白变性的一段时间来使该糖蛋白变性：80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100摄氏度、或更高。

在某些实施方案中，采用洗涤剂、二硫化物还原剂、高温、和/或其他试剂或反应条件的一个组合使一种糖蛋白变性。本领域的普通技术人员应当知道足以使一种糖蛋白变性的多个适宜的条件、孵育时间、等等。应当注意的是位于免疫球蛋白G(IgG)中保守的Fc位点上的这些寡糖容易被PNGase F切割。因此，在使用这种酶时，一个蛋白质变性的步骤典型地是不要求IgG分子。PNGase F在稀氨水溶液中也能将这些寡糖够移去，在2.5M尿素中在37℃持续24小时是稳定的，并且在5M尿素中仍然拥有其40％的活性。因此，PNGase F具有以下优点，在某些变性条件下它能够将这些聚糖从这些糖蛋白中切割下来。

根据本披露可以使用以便将这些聚糖结构从这些糖蛋白中切割下来的其他适宜的酶类包括但是不局限于：PNGase A、O-聚糖酶、和/或Endo-H。本领域的普通技术人员应当知道用于将这些聚糖从这些糖蛋白中切割下来的其他适宜的酶类。在某些实施方案中，使用多种酶将这些聚糖结构从一种糖蛋白上切割下来。在某些实施方案中，同时给予此类多种剪切酶。在某些实施方案中，顺序地给予此类多种剪切酶。

在某些实施方案中，通过使用一种试剂(除了一种酶)将一种或多种聚糖结构从这些细胞表面糖蛋白上切割下来。在某些实施方案中，可使用一种化学试剂或多种化学试剂(例如，暴露于一种试剂如肼、硼氢化钠、内切糖苷酶、三氟甲磺酸(trifluoromethasenulfonicacid)(TFMS)、和/或β-消除剂、等等)从这些糖蛋白上剪切聚糖结构。例如：这种化学性肼的使用已经成功地被采用以便对这些聚糖结构进行切割。作为另一个非限定性的实例，已经提示可将氨-碳酸铵的一种混合物用于N-连接以及O-连接的寡糖(处于其天然的形式)的碱性释放(见Y.Huang，et al.，Microscale nonreductive release of O-linkedglycans for subsequent analysis through MALDI mass spectrometry andcapillary electrophoresis，Anal.Chem.73，6063-60，2001，其全文通过引用结合在此)。本领域的普通技术人员应当知道根据本披露可以使用的其他适宜的化学试剂。在一些情况下，使用一种化学试剂将这些聚糖结构从一种糖蛋白上切割下来导致了蛋白质的降解连同切割。然而，在切割之后，在分析和/或表征之前经常将这种聚糖结构从这种糖蛋白的蛋白组分中纯化出来。在此类情况下，在用一种化学试剂处理之后这种蛋白组分的降解对本披露的实施不是有害的。在一些情况下，这种蛋白组分的降解甚至可以有助于对这种或这些经切割的聚糖结构进行纯化的方法。

在一些实施方案中，可以用一种或多种外切糖苷酶对已经从一种糖蛋白释放和/或从一种细胞表面释放的聚糖进行消化，并且对这些消化产物的结构和/或构成进行分析。

外切糖苷酶是从聚糖的非还原性末端对末端的糖苷键进行切割的酶类。它们对于特定的单糖连接以及异头性(anomericity)(α/β)典型地是高度特异性的。在一些实施方案中，相邻的分枝模式可以影响外切糖苷酶的特异性。外切糖苷酶处理通常导致标准的触角连接的聚糖被切割成戊糖核心(M3N2)(包含3个甘露糖以及2个glcNAc残基)。然而，不常见的修饰的种类(例如，触角的岩藻糖化种类、高甘露糖以及杂合聚糖、乳糖胺扩展的聚糖、硫酸化的或磷酸化的聚糖，等等)对外切糖苷酶处理具有耐受性，并且可以用色谱方法分辨出并且相对于M3N2戊糖进行定量。

在一些实施方案中，根据本披露所使用的外切糖苷酶仅识别并且切割一种特定类型的糖苷连接。在一些实施方案中，根据本披露所使用的外切糖苷酶识别并且切割多于一种特定类型的糖苷连接。根据本披露可以使用的示例性的外切糖苷酶，包括但不限于：唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、岩藻糖苷酶、以及甘露糖苷酶。外切糖苷酶可以获自任何一种来源，包括商业来源(例如，来自QA-Bio、ProZyme、Roche、Sigma、NEB、EMD、Glyko、等等)。可替代地或额外地，外切糖苷酶可以从一种细胞的来源(例如细菌、酵母、植物、等等)中被分离和/或纯化。

在一些实施方案中，外切糖苷酶(例如，唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、岩藻糖苷酶、以及甘露糖苷酶)可以被分成多个分类或“亚组”。在一些实施方案中，不同的亚组显示出对切割不同类型的连接不同的能力。表1呈现出了一些示例性的外切糖苷酶，它们的连接特异性、以及从中衍生出每一种的生物体。本领域的普通技术人员应当理解这仅是一个示例性的，而非综合性的外切糖苷酶列表，并且具有任何连接特异性的外切糖苷酶都可以根据本披露进行使用。表1.外切糖苷酶

*“EC#”是指酶学委员会登记号

根据本披露，已经从一种糖蛋白和/或一种细胞表面释放的聚糖可以用任何一种外切糖苷酶进行消化。在某些实施方案中，通过将多种聚糖的一个群体经受多种外切糖苷酶的处理而对这些聚糖进行消化。例如，可以使多种聚糖的一个群体经受2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多种外切糖苷酶。在一些实施方案中，同时给予多种外切糖苷酶。在一些实施方案中，顺序地给予多种外切糖苷酶。在一些实施方案中，改变所给予的外切糖苷酶的身份揭示了有关聚糖的结构和/或组成的信息。在一些实施方案中，改变给予多种外切糖苷酶的顺序揭示了有关聚糖的结构和/或组成的信息。

在一些实施方案中，使用多种外切糖苷酶进行顺序消化揭示了有关聚糖的结构和/或组成的信息，该信息不同于用同一组外切糖苷酶同时消化所揭示的信息。在一些实施方案中，使用多种外切糖苷酶进行顺序消化揭示了有关聚糖的结构和/或组成的信息，该信息与用同一组外切糖苷酶同时消化所揭示的信息相同。对于在聚糖结构的分析中外切糖苷酶消化的效用的更全面的讨论，见共同待定的美国临时专利申请U.S.S.N.60/923,688，由Parsons等人于2007年4月16日提交的名为“使用外切糖苷酶的N-聚糖的表征”，通过引用将其结合在此。聚糖分析

可通过以下任何一种技术对这些聚糖进行分析，这些技术包括例如：配体结合、质谱法、核磁共振、和/或其他的方法。用于分析聚糖的多种方法在本领域内是已知的。例如见Anumula，Anal.Biochem，350(1)：1-23，2006；Klein et al.Anal.Biochem.，179：162-66，1989；以及Townsend，R.R.，Carbohydrate Analysis：High PerformanceLiquid Chromatography and Capillary Electrophoresis，ed.Z.El Rassi，pp.181-209，1995，Yuan et al.，J.Chromatography A(2005)1067：145-152，其中每一篇的全文均通过引用结合在此。

在某些实施方案中，在对这些细胞表面聚糖的结构进行分析之前，将这些细胞表面聚糖从该细胞中释解出(例如，经由用诸如以上所述的蛋白酶和/或糖苷酶进行处理)。通过多种不同方法中的一种或多种对已释解出的细胞表面糖蛋白的糖基化作用模式进行分析。作为非限定性的实例，已释解出的细胞表面聚糖的糖基化作用模式可以通过以下方法进行表征，例如NMR、质谱法、液相色谱法、2维色谱法、SDS-PAGE、抗体染色、凝集素染色、单糖定量、毛细管电泳法、荧光团辅助糖电泳(FACE)、胶束的电动色谱法(MEKC)、外切糖苷酶或内切糖苷酶处理、以及它们的组合方法。本领域的普通技术人员应当知道可用于对已释解出的这些细胞表面聚糖进行表征的其他方法。

在某些实施方案中，在对这些细胞表面聚糖的结构进行分析之前这些细胞表面聚糖未从该细胞中释解出。通过多种不同方法中的一种或多种可以对附连至该细胞表面的细胞表面聚糖的模式进行分析。

作为非限定性的实例，这些细胞表面聚糖可以通过以下方法进行表征，例如抗体结合、凝集素结合、以及它们的组合。可通过以下多种技术中的任何一种对识别一种或多种特异性聚糖结构的一种抗体、凝集素或其他试剂的结合进行监测，这些技术包括例如免疫荧光、化学发光法、ELISA测定、流式细胞术、等等。本领域的普通技术人员应当知道可用于对在这些细胞的表面上的细胞表面聚糖的糖基化作用模式进行表征的其他方法。

在某些实施方案中，通过从细胞中释放这些细胞表面聚糖、对这些细胞表面聚糖纯化、并且然后进行分析而对这些细胞表面聚糖进行分析。例如，在一些实施方案中，通过以下方法来对此类聚糖进行表征：色谱法、质谱法、电泳法、核磁共振(NMR)法，以及它们的结合。例如，在一些实施方案中，通过以下一种或多种方法对这些聚糖进行表征：NMR、质谱法、液相色谱法、2-维色谱法、SDS-PAGE、抗体染色、凝集素染色、单糖定量、毛细管电泳法、荧光团辅助糖电泳(FACE)、胶束电动色谱法(MEKC)、外切糖苷酶或内切糖苷酶处理、以及它们的组合。

在一些实施方案中，N-聚糖的结构和组成可以通过色谱方法进行分析，包括但不限于：液相色谱法(LC)、高效液相色谱法(HPLC)、超高效液相色谱法(UPLC)、薄层色谱法(TLC)、酰胺柱色谱法、以及它们的组合。

在一些实施方案中，N-聚糖的结构和组成可以通过质谱法(MS)以及相关的方法进行分析，包括但不限于：串联MS、LC-MS、LC-MS/MS、基质辅助激光解吸电离质谱法(MALDI-MS)、傅里叶变换质谱法(FTMS)、离子迁移率分离质谱法(IMS-MS)、电子转移解离(ETD-MS)、以及它们的组合。

在一些实施方案中，N-聚糖结构和组成可以通过电泳法进行分析，包括但不限于：毛细管电泳法(CE)、CE-MS、凝胶电泳法、琼脂糖凝胶电泳法、丙烯酰胺凝胶电泳法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)跟随有使用识别特定的聚糖结构的抗体的蛋白质印迹法、以及它们的组合。

在一些实施方案中，N-聚糖结构和组成可以通过核磁共振(NMR)以及相关方法进行分析，包括但不限于：一维NMR(1D-NMR)、二维NMR(2D-NMR)、相关谱磁性角自旋NMR(COSY-NMR)、全相关光谱NMR(TOCSY-NMR)、异核单量子相干NMR(HSQC-NMR)、异核多级量子相干(HMQC-NMR)、旋转核欧沃豪斯效应谱NMR(ROESY-NMR)、核欧沃豪斯效应谱(NOESY-NMR)、以及它们的组合。

本领域的普通技术人员应当知道可用于对已释解出的细胞表面糖蛋白的糖基化作用模式进行表征的其他方法。

在某些实施方案中，在表征之前对这些细胞表面糖蛋白和/或聚糖结构进行标记。如本领域的普通技术人员所已知，在表征过程中这种标记可能提高信号和/或降低背景噪音。根据本披露可以使用多种标记中的任何一种，包括但不限于：荧光标记、放射性标记、和/或化学发光标记。在某些实施方案中，用荧光性2-氨基苯甲酰胺(“2-AB”)对这些聚糖结构进行标记。本领域的普通技术人员应当知道根据本披露可以使用的其他适宜的标记物。应用

应当理解的是可以在多种应用中任何一种中利用在此说明的这些技术。总体而言，这些技术在涉及这些聚糖的结构表征的任何一种应用中是有用的，并且在希望对与一种靶结合糖(例如糖蛋白)相关联的聚糖进行表征时是特别有用的，但是这种结合糖的分离是时间或劳动密集性的或形成其他的挑战(例如，与该结合糖的不稳定性相关联、等等)。

可将本披露的方法施用至从多种来源中获得的聚糖上，这些来源包括但不限于治疗性配制品以及生物样品(例如，包含细胞)。在根据本披露对这种生物样品进行分析之前或之后这种生物样本可以经历一个或多个分析和/或纯化的步骤。仅给出一些实例，在一些实施方案中，使用一种或多种蛋白酶和/或外切糖苷酶对一个生物样本进行处理(例如，这样使这些聚糖释放)；在一些实施方案中，用一个或多个可检测的标记物或其他试剂对生物样本中的细胞表面聚糖进行标记，这可促进通过例如质谱或NMR进行分析。可将多种分离和/或分离步骤中的任何一个施用至根据本披露的一种生物样本中。

可利用本披露来分析处于多种状态下的任何一种的细胞表面聚糖，例如游离的聚糖、结合糖(例如，糖肽、糖脂、蛋白多糖、等等)、或细胞或细胞组分、等等。

本披露的方法可以用于针对所一种感兴趣的治疗性或其他商业上相关的糖蛋白的生产的过程进展的一个或多个阶段中。可以采用本披露的方法的此类过程进展阶段的非限制性的实例包括细胞选择、克隆选择、培养基最佳化、培养条件、处理条件、和/或纯化操作。本领域的普通技术人员应当知道其他的过程进展阶段。

还可以利用本披露来监测在一个特定的细胞培养系中所发生的糖基化作用的程度和/或类型，由此允许调节或可能终止这种培养，以便(例如)实现一种特别希望的糖基化作用模式或避免发展一种特别不希望的糖基化作用模式。

还可以利于本披露来评定细胞或细胞系的糖基化作用特征，这些细胞或细胞系被认为用于产生一种特别希望的糖蛋白(例如，甚至是在对这些细胞或细胞系进行工程处理以产生该糖蛋白、或产生一种处于商业上相关水平的糖蛋白之前)。

在本披露的一些实施方案中，针对一种特定的靶糖蛋白的一种希望的糖基化作用模式是已知的，并且在此所说明的技术允许对这些培养系样品(culture sample)进行监测以评定沿一条已知的产生该希望的糖基化作用模式的路线的生产进程。例如，其中这种靶糖蛋白是一种治疗性糖蛋白，例如在一个或多个国家中已经历了规章审查，经常会希望的是对这些培养系进行监测以便评定它们会产生具有一种糖基化作用模式(尽可能接近于已确立的药物产品的糖基化作用模式)的产物的可能性，无论它是否正在通过确实相同的路径进行产生。如在此所使用，“接近”是指一种糖基化作用模式，该模式与所确立的药物产品的糖基化作用模式具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％的相关性。在此类实施方案中，典型地在多个时间点获取这些生产培养系的样品并将它们与一个已确立的标准或与一个对照培养系进行比较以便评定相对的糖基化作用。

在一些实施方案中，可使用根据本披露的方法来监测在产生一种糖蛋白的细胞的培养过程中的细胞表面糖基化作用模式。例如，糖蛋白的生产(例如，商业性生产)可能涉及以下步骤：(1)培养产生这种糖蛋白的细胞，(2)在整个培养细胞的过程中以规则或不规则的间隔获得样品，并且(3)分析所获得的样品上的细胞表面糖基化作用模式。在一些实施方案中，此类方法可进一步包括将不同的样品的细胞表面糖基化作用模式彼此进行比较和/或与由相关的一种或多种细胞所产生的一种或多种非细胞表面糖蛋白的糖基化作用模式进行比较的一个步骤。在一些实施方案中，此类方法可进一步包括将针对一种或多种所获得的样品的细胞表面糖基化作用模式与一种参比样品的糖基化作用模式进行比较的一个步骤。

在本披露的一些实施方案中，一种所希望的糖基化作用模式(例如，用一种已产生的非细胞表面糖蛋白所观察到的一种细胞表面糖基化作用模式和/或一种糖基化作用模式)将是更广泛的。例如，在一些实施方案中，一种所希望的糖基化作用模式显示出高度的糖基化位点占用(例如，高于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更高)；在一些实施方案中，一种所希望的糖基化作用模式显示出一个高分支度(例如，高于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％或更高具有三或四触角结构)。

在本披露的一些实施方案中，一种所希望的糖基化作用模式将会不太广泛。例如，在一些实施方案中，一种所希望的细胞表面糖基化作用模式显示出低的糖基化位点占有(例如，小于约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约15％、约5％、约1％、或更小)；和/或一种低分支度(例如，小于约20％、约15％、约10％、约5％、约1％或更少具有三或四触角结构)。

在一些实施方案中，一种所希望的糖基化作用模式在一些方面将会更加广泛，而在其他方面将会不太广泛。例如，采用易于产生具有长的，未分枝的寡糖链的糖蛋白的一种细胞系，这可能是所希望的。可替代地，采用易于产生具有短的，高度分支的寡糖链的糖蛋白的一种细胞系，这可能是所希望的。

在一些实施方案中，一种所希望的糖基化作用模式将会针对一种具体类型的聚糖结构进行富集。例如，在一些实施方案中，一种所希望的糖基化作用模式将会具有低水平的(例如，小于约20％、约15％、约10％、约5％、约1％、或更小)高甘露糖或杂合结构，高水平的(例如，大于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更高)高甘露糖结构，高水平的(例如，大于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更高；例如，每个糖蛋白至少一个)磷酸化的高甘露糖，或低水平的(例如，小于约20％、约15％、约10％、约5％、约1％、或更小)磷酸化的高甘露糖。

在一些实施方案中，一种所希望的糖基化作用模式将包括至少约一种唾液酸。在一些实施方案中，一种所希望的糖基化作用模式将包括一个高水平的(例如，大于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更高)唾液酸化的末端。在一些实施方案中，一种所希望的的糖基化作用模式(包括唾液酸化作用)将显示出至少约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更高的N-乙酰神经氨酸和/或小于约20％、约15％、约10％、约5％、约1％、或更少的N-羟乙酰神经氨酸。

在一些实施方案中，一种所希望的糖基化作用模式显示出分支延长的特异性(例如，高于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更多的延长是在α1，6甘露糖分枝上；或大于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更多的延长是在α1，3甘露糖分枝上)。

在一些实施方案中，一种所希望的糖基化作用模式将包括低水平(例如，小于约20％、约15％、约10％、约5％、约1％、或更小)或高水平(例如，大于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更大)的核心岩藻糖基化作用。

在一些实施方案中，一种所希望的糖基化作用模式将包括低水平(例如，小于约20％、约15％、约10％、约5％、约1％、或更小)或高水平(例如，大于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更大)的一种硫酸化的聚糖。

在一些实施方案中，一种所希望的糖基化作用模式将包括低水平(例如，小于约20％、约15％、约10％、约5％、约1％、或更小)或高水平(例如，大于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更大)的一种磷酸化的聚糖。

在一些实施方案中，一种所希望的糖基化作用模式将包括低水平(例如，小于约20％、约15％、约10％、约5％、约1％、或更小)或高水平(例如，大于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更大)的连接到N-乙酰葡糖胺上的一种唾液酸。

在一些实施方案中，一种所希望的糖基化作用模式将包括低水平(例如，小于约20％、约15％、约10％、约5％、约1％、或更小)或高水平(例如，大于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更大)的一种乙酰化的聚糖。

无论是否出于质量控制的目的而监测一种具体的靶蛋白的生产，可以利用本披露来(例如)监测处于具体的发展阶段的，或在具体的生长条件下的细胞表面糖基化作用。

在本披露的一些具体的实施方案中，在此所说明的方法可以用来表征和/或控制或比较这些治疗性产品的质量。仅给出一个实例，本发明的方法学可以用于评定在产生一种治疗性蛋白产品的细胞中的细胞表面糖基化作用。具体而言，假定糖基化作用可经常影响一种治疗性蛋白产品的活性、生物利用度、或其他特征，则用于评定在这种治疗性蛋白产品的产生过程中的细胞的糖基化作用的方法是特别希望的。除其他事项之外，本披露可以促进在用于治疗性蛋白的生产体系中的糖基化作用的实时分析。

无论是否出于质量控制的目的而监测一种具体的靶蛋白的生产，可以利用本披露来(例如)监测处于具体的发展阶段的、或在具体的生长条件下的糖基化作用。

在一些实施方案中，在此所说明的方法可以用来表征和/或控制或比较这些治疗性产品的质量。仅给出一个实例，本发明的方法学可以用于评定在产生一种治疗性蛋白产品的细胞中的糖基化作用。具体而言，假定糖基化作用可经常影响一种治疗性蛋白产品的活性、生物利用度、或其他特征，则用于评定在这种治疗性蛋白产品的生产过程中的细胞的糖基化作用的方法是特别希望的。除其他事项之外，本披露可以促进在用于治疗性蛋白的生产体系中的糖基化作用的实时分析。

例如，代表性的治疗性糖蛋白(其生产和/或质量可以根据本披露进行监测)包括多种血液学试剂中的任何一种(包括例如，促红细胞生成素、血液凝固因子，等等)、干扰素、集落刺激因子、抗体、酶、以及激素，特别是在细胞表面表达的那些。

在一些实施方案中，本披露提供了多种方法，在这些方法中将来自不同来源或样品的细胞表面聚糖彼此进行比较。在一些此类的实例中，随着时间获得了来自相同来源的多个样品，这样这些糖基化作用模式中的变化(并且特别是细胞表面的糖基化作用模式)就得到了监测。在一些实施方案中，含聚糖的样品以规则的间隔被移出。在一些实施方案中，含聚糖的样品按照以下间隔被移出：约30秒、约1分钟、约2分钟、约5分钟、约10分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约10小时、约12小时、或约18小时的间隔、或以甚至更长的间隔被移出。在一些实施方案中，含聚糖的样品以不规则的间隔被移出。在一些实施方案中，含聚糖的样品以5小时的间隔被移出。

在一些实施方案中，样品之一是一种历史样品或历史样品的一个记录。在一些实施方案中，样品之一是一个参比样品。

如在此所说明，在某些实施方案中，本披露的方法在确定由一种细胞所产生的一种糖蛋白的糖基化作用模式的一种或多种特征方面是有用的。在某些实施方案中，此类方法可以包括以下步骤：对在第一组条件下在产生一种所感兴趣的糖蛋白的一种细胞的表面上存在的一种第一表面糖基化作用模式与在第二组条件下在该细胞的表面上存在的一种第二表面糖基化作用模式之间的一种差异进行测定，并且基于所测定的差异建立由该细胞产生的所感兴趣的糖蛋白的糖基化作用模式的一种或多种特征。例如，通过确定在一种细胞培养系的不同的时间点的细胞的表面上存在的糖基化作用模式来确定随着时间的所感兴趣的一种糖蛋白的糖基化作用模式。

额外地或者可替代地，可以检测在一种或多种不同的生长参数下生长的所感兴趣的一种糖蛋白的糖基化作用模式的变化来确定针对糖蛋白生产的一种或多种所希望的生长参数、或多种参数的组合。在某些实施方案中，糖基化作用模式中的差异是通过对一种糖基化作用模式的特征进行观察和/或测量来测定的，这些特征例诸如但不限于糖基化位点的占用、所连接的聚糖的身份、所连接的聚糖的相对量值、所连接的聚糖的完整的或部分的构成、和/或所连接的聚糖的相对量值。本披露的方法涵盖了对本领域的普通技术人员已知的其他糖基化作用模式的特征进行观察和/或测量。

在一些具体的实施方案中，在此说明的方法可用于表征和/或控制或比较这些治疗性产物的质量而不要求将这些产物其本身分离。仅给出一个实例，根据在此所说明的本发明的方法学可以用于评定在产生一种治疗性蛋白产品的细胞中的糖基化作用。具体而言，假定糖基化作用可经常影响一种治疗性蛋白产品的活性、生物利用度、或其他特征，则用于在这种治疗性蛋白产品的生产过程中对细胞的糖基化作用进行评定的方法是特别希望的。除其他事项之外，本披露可以促进在用于治疗性蛋白的生产体系中的糖基化作用的实时分析。

在一些实施方案中，在此提供的这些方法被用来监测发生在不同的样品中(例如在不同的细胞培养系中)的糖基化作用的程度和/或类型。

在一些实施方案中，对来自不同的细胞培养系样品的聚糖进行比较，这些聚糖在以下条件下得到制备，这些条件在一个或多个所选择的参数方面有所不同(例如，细胞类型，培养类型[例如，连续进料对比分批进料，等等]、培养条件[例如，培养基的类型、一种或多种特定的培养基中特定成分的存在或浓度、渗透性、pH、温度、一种或多种因素(如渗透性、pH、温度，等等)变换的时间或程度]、培养时间，分离步骤，等等)，但在其他方面相同，从而确定所选择的一个或一些参数对N-糖基化作用模式的影响。在某些实施方案中，对来自不同的细胞培养系样品(这些样品在一定的条件下得到制备，这些条件在一个单一选择的参数方面有所不同)的聚糖进行比较，从而确定该单一选择的参数对糖基化作用模式的影响。因此，在其他应用中，本技术可以促进多个特定的参数对细胞中的糖基化作用模式的作用的确定。

在一些实施方案中，对来自不同批次的产生一种所感兴趣的糖蛋白的细胞的细胞表面聚糖(例如，一种治疗性糖蛋白)(无论是通过相同的方法还是通过不同的方法进行制备，以及无论是同时制备还是分开制备)进行了比较。在此类实施方案中，本披露促进了糖蛋白制品的质量控制(即，一种靶糖蛋白制品的制备)。可替代地或额外地，一些此类的实施方案促进了监测一种特定的培养系(产生一种所感兴趣的糖蛋白)的进程(例如，当样品在不同的时间点从该培养系中被移出，并对样品进行分析并将这些样品彼此进行比较时)。在这些实施方案的任何一个中，这些聚糖分析的特征可以得到记录，例如在一个质量控制记录中。如以上所指明，在一些实施方案中，与糖蛋白的一个先前的历史记录、或标准批次、和/或与一个参比样品进行了比较。

在某些实施方案中，可在多项研究中利用本披露来修饰一种细胞的糖基化作用特征，(例如)以便确立具有一个或多个所希望的糖基化作用特征的一种细胞系和/或培养条件。然后，可以利用这种细胞系和/或此类培养条件(如果希望的话)用于产生一种特定的靶结合糖(例如，糖蛋白)，预期这种或此类糖基化作用特征对该靶结合糖是有益的。

根据本披露，在此说明的技术可以用于检测所希望的或不希望的聚糖，例如用于检测在一个产品中一种或多种污染物的存在或对其进行定量，或用于检测一种或多种活性或所希望的种类的存在或对其进行定量。

在不同的实施方案中，通过检测一种或多种特异性聚糖(其存在或水平(不论是绝对或相对)可能与一种特定的疾病状态(包括对一种特定疾病的易感性)和/或随着时间在此类聚糖的浓度上的变化相关)，这些方法可以用于评定一种或多种生物标记物，这些生物标记物在症状出现之前和/或疾病状态发展到一种不可处理或处理可能性较小的状态之前指明(例如)一种疾病状态。例如，在本披露的一些实施方案中，这种靶结合糖是一种生物标记物。

在某些实施方案中，在此说明的方法促进了聚糖(例如，细胞表面聚糖)的检测，这些聚糖以非常低的水平存在于一种来源中(例如，一种生物的样品)。在此类实施方案中，有可能对细胞表面聚糖的水平进行检测和/或可任选地进行定量，这些聚糖在多种聚糖的一个群体中按照以下水平存在：小于约10％、5％、4％、3％、2％、1.5％、1％、0.75％、0.5％、0.25％、0.1％、0.075％、0.05％、0.025％、或0.01％。在一些实施方案中，有可能对聚糖的水平进行检测和/或可任选地进行定量，这些聚糖的水平包括在一种细胞表面聚糖制品的0.1％与5％之间，例如在0.1％与2％之间，例如在0.1％与1％之间。在某些实施方案中，有可能对聚糖的水平进行检测和/或可任选地进行定量，这种聚糖的水平在约0.1fmol至约1mmol之间。

在一些实施方案中，在此说明的技术可以与一种或多种其他技术相结合，用于聚糖或结合糖的检测、分析、和或分离。试剂盒

可用于本披露的一种或多种方法的实施的试剂可以希望的是装在一种试剂盒一起提供。在某些实施方案中，本披露的试剂盒包括可用于将这些糖蛋白从该细胞表面释解出的一种或多种试剂(例如，一种或多种蛋白酶、糖苷酶、和/或其他试剂)、和/或多种补充性成分(如缓冲物、辅因子、等等)。在某些实施方案中，本披露的试剂盒包括可用于对从这些细胞(细胞表面糖蛋白已经从中被释解出)中释解出的细胞表面糖蛋白进行纯化和/或分析的一种或多种试剂。

在某些实施方案中，本披露的试剂盒包括可用于将这些聚糖结构从一种糖蛋白或糖肽上剪切下来的一种或多种试剂(例如，酶类如PNGase F、PNGase A、O-聚糖酶、和/或Endo-H)。在某些实施方案中，本披露的试剂盒包括可用于将这些经切割的聚糖结构从这些糖蛋白或糖肽(例如，一种或多种糖苷酶)的蛋白组分中纯化出来的一种或多种试剂。

在某些实施方案中，本披露的试剂盒包括用于对这些聚糖结构进行标记的一种或多种试剂。例如，本披露的试剂盒可包括荧光标记、放射性标记、和/或化学发光标记。在一些实施方案中，本披露的试剂盒包括荧光性2-氨基苯甲酰胺(“2-AB”)。

在某些实施方案中，本披露的试剂盒包括用于对细胞进行培养(例如，细胞培养基、缓冲物、培养基组分、等等)和/或在已对细胞进行培养之后对这些细胞进行纯化的一种或多种试剂。

以上说明应理解为仅仅是代表性的而并非旨在进行限定。用于实施本披露的多种替代性方法和材料以及本披露可施用的额外应用对于本领域的普通技术人员来说应当是清楚的，并且旨在将它们包含在所附的权利要求之中。例证实例1：通过外切糖苷酶处理释放的细胞表面聚糖的检测揭示了在细胞表面与非细胞表面糖基化作用方面的平行变化

将产生所感兴趣的一种细胞表面糖蛋白(在这种情况下是一种非细胞表面抗体)的CHO细胞在标准条件下在两种不同的培养基中进行培养：一种第一培养基(包含一个第一量的葡糖胺)以及一种第二培养基(包含一种第二量的葡糖胺)，其中第二量的葡糖胺比第一量的葡糖胺更高。

在处于培养之中生长了一段给定的时间之后，从相同的培养瓶中收集了细胞以及培养系的上清液。将细胞粒化并用PBS进行洗涤以便去除培养基组分，并且在对产物抗体进行分离之前将培养系的上清液变清。

为了产物的分离，用蛋白A琼脂糖珠将培养系的上清液孵育过夜。然后将珠子粒化并用PBS洗涤。用低pH 0.1M甘氨酸溶液对产物进行洗脱。

用蛋白酶对已洗涤的细胞的一个等分部分进行处理以便于将细胞表面糖肽释放出。通过离心作用使完整细胞与已释放出的细胞表面糖肽分离。

用PNGase F将这些聚糖从已分离的产物抗体或从已释放的细胞表面糖肽中酶性释放。对这些已分离的聚糖进行荧光标记并且用外切糖苷酶(唾液酸酶、半乳糖苷酶、以及己糖胺酶)对其进行处理以便使N-连接的聚糖塌陷成核心M3N2；通过LC和/或MS对经这种处理所释放的聚糖进行分析，这样岩藻糖化的以及非岩藻糖化的聚糖的相对量值就得到确定。

图1示出了在第一(对照物)以及第二(升高的葡糖胺)培养基中针对非细胞表面糖蛋白(抗体产物)所观察到的非岩藻糖化的聚糖的百分数；图3A至图3B示出了在相同的培养基中针对细胞表面聚糖所观察到的相同的百分数。图2示出了针对细胞表面聚糖的代表性的LC谱，如在图3A至图3B的概述资料中所包括。

如在图1和图3中清楚看到的，针对非细胞表面以及细胞表面聚糖群体观察到了在非岩藻糖化的结构方面的一种相似的增加(即，核心α1-6岩藻糖基化作用的损失)。这些资料证实根据本披露所利用的方法允许对细胞表面聚糖进行简便的检测、分离、和或分析，并且进一步证实在非细胞表面糖基化作用模式方面的变化可以反映在细胞表面糖基化作用模式方面类似的变化之中，这样细胞表面聚糖的检测可以作为对于非细胞表面聚糖的检测的一种代用品。实例2：在完整细胞上或在已释放出的细胞表面聚糖上的细胞表面聚糖的检测揭示了在细胞表面以及非细胞表面糖基化作用方面的平行变化

将产生所感兴趣的一种细胞表面糖蛋白(在这种情况下是一种非细胞表面抗体)的CHO细胞在标准条件下在两种不同的培养基中进行培养：一种第一培养基(包含一种第一量的N-乙酰甘露糖胺)以及一种第二培养基(包含一种第二量的N-乙酰甘露糖胺)，其中第二量的N-乙酰甘露糖胺比第一量的N-乙酰甘露糖胺更高。

在处于培养之中生长了一段给定的时间之后，从相同的培养瓶中收集了细胞以及培养系的上清液。将这些细胞粒化并用PBS进行洗涤以便去除培养基组分。将培养系的上清液变清。

通过用蛋白A琼脂糖珠将非细胞表面抗体产物孵育过夜使非细胞表面抗体产物从培养系的上清液中分离出来。然后，将珠子粒化并用PBS洗涤。用低pH 0.1M甘氨酸溶液对产物进行洗脱。

通过暴露于低渗溶液使已洗涤的细胞的一个等分部分裂解，并且对得到的膜进行粒化。

通过酸处理使唾液酸从所分离的抗体产物以及这些膜中释放出，并且通过离子交换色谱法而被分离。随后，得到的唾液酸被DMB(1，2-二氨基-4，5-亚甲基二氧基苯-2HCl)标记，并且用HPLC进行分析。

同时，将已洗涤的细胞的一个第二等分部分经受凝集素染色并且用流式细胞术进行分析。针对细胞表面以及该非细胞表面聚糖样品在各自的培养条件下对唾液酸的水平进行测定。

图4示出了来自细胞表面的唾液酸水平的代表性LC分析。图5至图7示出了在不同的培养条件下在细胞表面以及非细胞表面聚糖中唾液酸的相对量值。如能所见，当细胞在升高水平的N-乙酰甘露糖胺中生长时，在非细胞表面以及细胞表面聚糖群体中观察到了唾液酸水平的相似的增加。

这些数据证实在此所说明的方法允许对细胞表面聚糖进行简便的检测、分离、和或分析，并且进一步证实在非细胞表面糖基化作用模式方面的变化可以反映在细胞表面糖基化作用模式方面的类似变化中，这样细胞表面聚糖的检测可以作为对于非细胞表面聚糖的检测的一种代用品。重要的是，这些数据证实了对一种所感兴趣的产物的糖基化作用进行实时监测(不要求将产物其自身分离)的能力。实例3：葡糖胺补充物对细胞表面以及产物唾液酸化作用的效应

在葡糖胺补充物存在或不存在时对产生一种糖蛋白产物的CHO细胞进行培养。5天之后，收集这些细胞和产物并且针对唾液酸含量分开进行分析。通过阴离子交换色谱法对细胞表面的唾液酸含量进行测定，如图8所展示。相对于没有葡糖胺补充物而言，针对细胞表面和产物的唾液酸的百分数变化显示在以下表2中。表2中的数据表示为重复实验(replicates)的平均值(S.D.)。表2.唾液酸化作用下降的百分数

这些数据证实与葡糖按补充物相关联的唾液酸化作用方面的下降与产物唾液酸化作用的下降有关。等效物

本领域的普通技术人员应当认识到、或通过使用不超出常规实验即能够确定与在此说明的本披露的特定的实施方案一致的很多等效物。本披露的范围并非旨在限制以上的说明，而是如所附的权利要求书中所给出。

在权利要求中，冠词如“一个(种)”以及“该”可以表示一个或多于一个，除非指明与此相反或另外从上下文中是明确的。包括一组的一个或多个成员“或”在其之间的权利要求书或说明书被认为是满足以下条件：该组成员中的一个、多于一个或所有是否存在于，被用于、或者另外涉及了一个给定的产物或方法，除非指明与此相反或另外从上下文中是明确的。本披露包括多个实施方案，其中该组的一个成员准确地存在于，被用于、或者另外涉及了一种给定的产物或方法。本披露包括多个实施方案，其中该组成员的多于一个、或所有成员准确地存在于，被用于、或者另外涉及了一种给定的产物或方法。

此外，应该理解的是本披露涵盖了全部变体、组合、以及排列，其中一个或多个限制、要素、条款、描述性术语、等等，从一个或多个所列出的权利要求中被引入到另一个权利要求。例如，可以对从属于另一个权利要求的任何一项权利要求进行修改以便包括在从属于同一基础权利要求的任何一项其他的权利要求中发现的一个或多个限制。此外，在权利要求提及一种组合时，应当理解的是包括针对在此所披露的目的中任何一种目的的组合的方法，并且包括根据形成在此所披露的多种方法中的任何一种而形成组合的方法或在本领域已知的其他方法，除非另有说明或者除非对于本领域的普通技术人员而言明显会产生一种矛盾或不一致性。

当多种要素作为列表(例如以Markush组的格式)存在时，应理解的是这些要素中的每个亚组也已被披露并且任何一个或多个要素可以从该组中被移出。应当理解的是，总体而言，当提及本披露或根据本披露的多个方面，是指包括具体的要素、特征、等等时，根据本披露的某些实施方案或根据本披露的多个方面包括，或基本上包括此类要素、特征，等等。出于简单的目的，那些实施方案没有在此处的这些词语中确切地给出。注意到了术语“包括”旨在是开放性的并且允许附加的要素或步骤的包含物。

当给出这些范围时，包括端点。此外，应该理解的是，除非另有指明或另外从上下文中以及本领域的普通技术人员的理解中是明确的，表达成范围的这些值可以假定为在本披露的不同实施方案中所指出的范围内的任何一种特定的值或亚范围，到该范围的下限单位的十分之一(除非上下文中另有清楚地指出)。

此外，应当理解的是，落入现有技术的本披露的任何一个具体实施方案可以明确地从这些权利要求中的任何一项或多项中排除。因为此类实施方案被认为是本领域的普通技术人员所已知的，即使没有在此明确地提出这种排除，它们也可以被排除。本披露的这些组合中的任何一个具体的实施方案(例如，任何外切糖苷酶、任何糖苷连接、任何反应条件、任何提纯的方法、产物分析的任何方法、等等)可以从任何一项或更多项权利要求中以任何原因而被排除，不论是否涉及现有技术的存在。

以上以及贯穿本文讨论的这些公开文件仅仅是因为它们的披露早于本申请的提交日而将它们提供在此。在此的任何内容都不得被解释为承认诸位发明人由于在先披露而没有资格超前于这种披露。

Claims (32)

1.测定由一个细胞产生的感兴趣的非细胞表面糖蛋白的糖基化作用模式的一种或多种特征的一种方法，该方法包括以下步骤：

a)测定在糖基化作用模式的以下各项之间的一种差异：

(i)在一个第一组条件下于一个细胞的表面上存在的一种第一表面糖基化作用模式，该细胞产生该感兴趣的非细胞表面糖蛋白；并且

(ii)在一个第二组条件下于一个细胞的表面上存在的一种第二表面糖基化作用模式；并且

b)基于该测定的差异，建立由该细胞产生的感兴趣的非细胞表面糖蛋白的糖基化作用模式的一种或多种特征。

2.如权利要求1所述的方法，其中该一种或多种特征包括在感兴趣的非细胞表面糖蛋白的糖基化作用模式中的一种变化。

3.如权利要求1所述的方法，其中该测定一种差异的步骤包括测定在该第一与第二表面糖基化作用模式之间唾液酸化作用的一种差异。

4.如权利要求3所述的方法，其中该建立一种或多种特征的步骤包括建立在感兴趣的非细胞表面糖蛋白的糖基化作用模式中存在的唾液酸化作用的一种程度。

5.如权利要求1所述的方法，其中：

该产生该感兴趣的非细胞表面糖蛋白的细胞是产生该感兴趣的非细胞表面糖蛋白的多个细胞的一个培养系；

该第一组条件代表时间上的一个第一点，这样该第一表面糖基化作用模式是在该时间上的第一点在处于培养之中的这些细胞的表面上存在的一种模式；并且

该第二组条件代表时间上的一个第二点，这样该第二表面糖基化作用模式是在该时间上的第二点在处于培养之中的这些细胞的表面上存在的一种模式，

这样该建立感兴趣的非细胞表面糖蛋白的糖基化作用模式的一种或多种特征的步骤涉及在感兴趣的非细胞表面糖蛋白的糖基化作用模式中建立随着时间的一种变化，并且由此允许生产状况或质量的评定。

6.如权利要求1所述的方法，其中：

该产生该感兴趣的非细胞表面糖蛋白的细胞是产生该感兴趣的非细胞表面糖蛋白的一种多个细胞的培养系；

该第一以及第二组条件代表应用到产生感兴趣的非细胞表面糖蛋白的多个细胞的培养系上的多种生长参数的不同的收集，

这样就建立起对于产生感兴趣的非细胞表面糖蛋白的希望的生长参数。

7.一种方法，包括以下步骤：

a)测定在糖基化作用模式的以下各项之间的一种差异：

(i)一种第一表面糖基化作用模式存在于多个细胞的一个第一培养系中的细胞的表面上；并且

(ii)一种第二表面糖基化作用模式存在于处于培养之中的细胞表面上，其中该第一培养系以及第二培养系相对于至少一个参数彼此不同；并且

b)基于该测定的差异，建立该至少一个参数对由处于培养之中的细胞所产生的感兴趣的非细胞表面糖蛋白的糖基化作用的效应。

8.如权利要求1或权利要求7所述的方法，其中该测定一种差异的步骤包括测定选自下组的一个特征的一种差异，该组的构成为：糖基化作用位点占用的程度、所连接的聚糖的身份、所连接的聚糖的相对量值、所连接的聚糖的完整的或部分的构成、所连接的聚糖的相对量值、以及它们的组合。

9.如权利要求1所述的方法，其中该测定步骤包括从该细胞中释解出至少一种细胞表面聚糖，并且对该已释解出的聚糖进行分析。

10.如权利要求9所述的方法，其中该释解步骤包括将该细胞暴露于一种蛋白酶。

11.如权利要求10所述的方法，其中该暴露步骤包括经受蛋白酶处理，这样使得至少一种细胞表面糖蛋白得以释解出，其中该蛋白酶处理不使细胞膜破裂。

12.如权利要求1或权利要求7所述的方法，其中该测定步骤不涉及从一些细胞中释解出聚糖类。

13.如权利要求9所述的方法，其中该释解步骤包括：

a)从一些细胞表面糖蛋白上切割一种或多种蛋白连接的一些细胞表面聚糖；并且

b)对该一种或多种已切割的蛋白连接的细胞表面聚糖进行表征。

14.如权利要求13所述的方法，其中该蛋白连接的细胞表面聚糖是一种N-连接的聚糖。

15.如权利要求13所述的方法，其中该蛋白连接的细胞表面聚糖是一种O-连接的聚糖。

16.如权利要求13所述的方法，其中该蛋白连接的细胞表面聚糖包括至少一个唾液酸残基。

17.如权利要求1或权利要求7所述的方法，进一步包括对关于所测定的差异或关于在一种固定的培养基中至少一种糖基化作用模式的信息进行记录的一个步骤。

18.测定由一种细胞产生的感兴趣的一种非细胞表面糖蛋白的糖基化作用模式的一种或多种特征的一种方法，该方法包括：

a)提供产生该感兴趣的非细胞表面糖蛋白的一种细胞，这种细胞具有至少一个附连至该细胞的表面上的细胞表面聚糖，这样使得该细胞具有一种细胞表面糖基化作用模式；并且

b)测定该细胞表面糖基化作用模式的至少一种特征；并且

c)基于该测定的特征，建立感兴趣的非细胞表面糖蛋白的糖基化作用模式的一种或多种特征，其中该测定的特征与感兴趣的非细胞表面糖蛋白的糖基化作用模式的一种或多种特征相关。

19.测定在感兴趣的一种非细胞表面糖蛋白的糖基化作用模式中的一种或多种差异的一种方法，包括：

a)提供一种第一细胞，该细胞包括至少一个附连至该第一细胞的表面上的一种细胞表面聚糖，这种第一细胞产生感兴趣的非细胞表面糖蛋白；

b)对该至少一种第一细胞表面聚糖进行表征；

c)提供一种第二细胞，该细胞包括至少一个附连至该第二细胞的表面上的一种第二细胞表面聚糖，这种第二细胞产生感兴趣的非细胞表面糖蛋白；

d)对该至少一种第二细胞表面聚糖进行表征；

e)测定在该第一细胞表面聚糖与第二细胞表面聚糖之间的一种或多种差异；并且

f)建立在感兴趣的非细胞表面糖蛋白的糖基化模式中的一种或多种差异，其中该所测定的差异或在该第一细胞表面聚糖与该第二细胞表面聚糖之间的差异与感兴趣的非细胞表面糖蛋白的糖基化模式中的一种或多种差异相关。

20.对感兴趣的一种非细胞表面糖蛋白的糖基化作用模式的一种或多种特征进行测定的一种方法，包括以下步骤：

a)提供一种细胞，该细胞包括至少一个附连至该细胞的表面上的一种细胞表面聚糖，这种细胞产生感兴趣的非细胞表面糖蛋白；并且

b)对该至少一种细胞表面聚糖进行表征；并且

c)测定感兴趣的非细胞表面糖蛋白的糖基化作用模式的一种或多种特征，其中所表征的至少一种聚糖与感兴趣的非细胞表面糖蛋白的糖基化作用模式的这些一种或多种特征相关。

21.权利要求1-7、9-11、13-16和18-20任一项所述的方法，其中该感兴趣的非细胞表面糖蛋白不是由该细胞天然产生的糖蛋白。

22.权利要求1-7、9-11、13-16和18-20任一项所述的方法，其中产生该感兴趣的非细胞表面糖蛋白的该细胞已进行工程化处理以产生该感兴趣的非细胞表面糖蛋白。

23.如权利要求1-7、9-11、13-16和18-20任一项所述的方法，其中该感兴趣的非细胞表面糖蛋白是由该细胞天然产生的糖蛋白，并且其中产生该感兴趣的非细胞表面糖蛋白的该细胞已进行工程化处理以升高的水平或在预先确定的情况下产生该感兴趣的非细胞表面糖蛋白。

24.权利要求8所述的方法，其中该感兴趣的非细胞表面糖蛋白不是由该细胞天然产生的糖蛋白。

25.权利要求8所述的方法，其中产生该感兴趣的非细胞表面糖蛋白的该细胞已进行工程化处理以产生该感兴趣的非细胞表面糖蛋白。

26.如权利要求8所述的方法，其中该感兴趣的非细胞表面糖蛋白是由该细胞天然产生的糖蛋白，并且其中产生该感兴趣的非细胞表面糖蛋白的该细胞已进行工程化处理以升高的水平或在预先确定的情况下产生该感兴趣的非细胞表面糖蛋白。

27.权利要求12所述的方法，其中该感兴趣的非细胞表面糖蛋白不是由该细胞天然产生的糖蛋白。

28.权利要求12所述的方法，其中产生该感兴趣的非细胞表面糖蛋白的该细胞已进行工程化处理以产生该感兴趣的非细胞表面糖蛋白。

29.如权利要求12所述的方法，其中该感兴趣的非细胞表面糖蛋白是由该细胞天然产生的糖蛋白，并且其中产生该感兴趣的非细胞表面糖蛋白的该细胞已进行工程化处理以升高的水平或在预先确定的情况下产生该感兴趣的非细胞表面糖蛋白。

30.权利要求17所述的方法，其中该感兴趣的非细胞表面糖蛋白不是由该细胞天然产生的糖蛋白。

31.权利要求17所述的方法，其中产生该感兴趣的非细胞表面糖蛋白的该细胞已进行工程化处理以产生该感兴趣的非细胞表面糖蛋白。

32.如权利要求17所述的方法，其中该感兴趣的非细胞表面糖蛋白是由该细胞天然产生的糖蛋白，并且其中产生该感兴趣的非细胞表面糖蛋白的该细胞已进行工程化处理以升高的水平或在预先确定的情况下产生该感兴趣的非细胞表面糖蛋白。

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