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CN1708589A - Cns中crh应答基因 - Google Patents

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CN1708589A
CN1708589A CNA2003801025330A CN200380102533A CN1708589A CN 1708589 A CN1708589 A CN 1708589A CN A2003801025330 A CNA2003801025330 A CN A2003801025330A CN 200380102533 A CN200380102533 A CN 200380102533A CN 1708589 A CN1708589 A CN 1708589A
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P·J·彼得斯
H·W·H·格尔曼
S·M·A·斯瓦格马克斯
S·U·卡斯
T·H·W·斯特克勒
F·L·P·费伦斯
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Janssen Pharmaceutica NV
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Abstract

本发明一般涉及抑郁症的治疗和诊断。具体地，本发明涉及多肽以及编码这些多肽的多核苷酸，其中所述多肽表现出在介导促肾上腺皮质激素释放激素的内分泌应答中起主要作用。这些多肽和多核苷酸可用于抑郁症的诊断、治疗和/或预防。

Description

CNS中CRH应答基因
本发明一般涉及抑郁症的治疗和诊断。具体地，本发明涉及多肽以及编码这些多肽的多核苷酸，其中所述多肽表现出在介导促肾上腺皮质激素释放激素的细胞应答中起主要作用。这些多肽和多核苷酸可用于抑郁症的诊 断、治疗和/或预防。
发明背景
最近的社会经济学分析发现抑郁症是无能的首要原因和其他疾病发展的主要的危险因素。此外，在世界范围规模内，抑郁症被诊断不足和治疗不足。最近的抗抑郁药物已经被证明是有效的，但是存在作用起效慢和副作用的负担。在这上面，仍然不清楚它们通过哪种药理学作用模式发挥它们的临床效果。基于抑郁症的皮质类固醇受体假说的假说-驱动的研究已经导致一种新观念，其聚焦在脑神经肽受体，特别是促肾上腺皮质激素-释放激素(CRH)受体作为药物靶标的新概念。
促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)是一种41个氨基酸的多肽，在下丘脑-垂体-肾上腺轴的调节中起中心作用，介导对各种应激物的内分泌应答。下丘脑神经元应答压力而释放CRH到垂体门脉系统，刺激垂体促肾上腺皮质激素(ACTH)的分泌和生物合成，导致肾上腺糖皮质激素严生增加(1)。一些临床和临床前研究针对抑郁症发展中CRH系统中变化的原因角色(2)。在人中对CRH的最初研究表明在抑郁症患者中对CRH的ACTH应答被钝化，反映了连续增加的下丘脑CRH分泌继发的CRH受体脱敏(3；4)。支持钝化的ACTH应答作为增加的CRH释放的结果的证据是发现抑郁症患者的脑脊液中CRH水平升高。加强抑郁状态中CRH分泌过多这一观念的其他发现为患有抑郁症的自杀者中CRH分泌性神经元的数目增多和CRH受体的数目减少(5；6)。
关于CRH已经描述了两种高亲和性受体CRH1-R1和CRH-R2，它们两者都以几种剪接变体形式存在。这些受体被CRH的活化导致腺苷酸环化酶的Gs-介导的刺激，导致胞内cAMP水平上升。这自身将活化依赖cAMP的蛋白激酶A(KPA)和最终导致cAMP和Ca2+的升高的胞质水平。cAMP和Ca2+的升高的水平导致一些其他的激酶如依赖Ca2+/钙调蛋白的激酶II(CAMK II)和p42/p44促分裂原活化的激酶(MAPK)的活化。结果，Ca2+/cAMP应答元件结合蛋白(CREB)被磷酸化并且这反过来将调节在启动子区含有cAMP应答元件(CRE)的基因的转录。表明参与CRH信号化(signaling)调节的这些基因的实例包括c-fos、巨噬细胞迁移抑制因子基因Mif、孤儿核受体Nurr77和Nurr1。
为了开发用于慢性垂体-肾上腺活化的动物模型，已经产生了CRF过表达小鼠(CRF-OE)(Stenzel-Poore等人，(1992)Endocrinology130：3378-3386)。由于这些动物中CRF的全身性过表达导致ACTH和皮质酮的终身过度产生，这些转基因小鼠呈现出库兴氏(Cushingoid)表型。与脑CRF介导内分泌、对压力的自主的和行为应答一致，CRF-OE小鼠表现出提高的情绪性的自发状态，对应激物高度反应性，并且CRF受体拮抗剂的主要施用逆转了这些类似anxiogenic的行为(Stenzel-Poore等人，(1994)J.Neurosci.14：2579-2584)。这些CRF-OE容许研究CRF对中枢神经系统的长期效果并且已经被用作焦虑和压力相关的行为的遗传模型。
尽管已经广泛研究了CRH活化的受体的下游途径并且导致参与信号级联的许多基因的鉴定，但是一个主要领域还未被探索。因此，本发明的目的是研究基因组水平上对CRH刺激的转录应答以鉴定与促肾上腺皮质激素释放激素受体活化的基因网络有关的其他基因。这样鉴定的多肽和编码所述多肽的多核苷酸作为筛选技术的药物靶标为药物开发提供了新的机会，或者可用于抑郁症的诊断、预防和/或治疗。
发明概述
本发明的一个目的是提供许多基因，这些基因迄今还未与CRH信号化相关并因此可用于鉴定调节细胞中CRH信号应答的化合物的方法中，或者用于诊断方法以鉴定个体中CRH诱导的抑郁症。
在一个实施方案中，鉴定能够改变细胞，尤其鼠垂体促肾上腺皮质激素细胞来源的腺瘤细胞系AtT-20中CRH信号应答的化合物的方法包括在所述化合物存在和不存在下将所述细胞与CRH接触并确定含有一核酸序列的多核苷酸的表达水平，该核酸序列选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID NO.5、SEQID NO.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID 11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID No.38和SEQ ID No.40。在该筛选方法中，通常使用结合前述多核苷酸的寡核苷酸探针，优选使用阵列技术方法评估表达水平。
因此，在特定实施方案中，本发明提供了鉴定调节细胞中CRH信号应答的化合物的方法，所述方法包括在所述化合物存在和不存在下将所述细胞与CRH接触；并确定具有核酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ IDNO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ IDNo.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ IDNo.31、SEQ ID NO.32、SEQ IDNO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID No.38和SEQ ID No.40的多核苷酸的表达水平，其中这些序列的表达谱的变化指示能够改变所述细胞中CRH信号应答的化合物。
附图简述
表1：表明是CNS中CRH诱导的变化的重要介质的基因。
表2：用于RT-PCR的寡核苷酸的序列
图1：不同小鼠组织中CRH-R1的表达水平。为脑区对来自三种不同动物的组织应用定量RT-PCR。
图2：在所有研究的脑区得到的微阵列数据的光谱图分析。正方形表示不同的样品，而圆圈表示基因。圆圈的直径相应于基因的平均强度。正方形之间的距离测量样品之间的类似性。基因与给定样品的正关联性(即该具体样品中该基因的上调)导致该基因和样品位于通过矩心(通过十字表示)的共有线(common line)上。以下面的顺序显示不同的区域：(A)小脑，(B)额叶皮质，(C)海马，(D)伏隔核，(E)颞区，(F)垂体。
图3：用于微阵列分析的动物中的HPA轴参数。与野生型动物相比血浆CORT水平在CRH过表达者中高6到8倍。ACTH水平没有观察到显著差异。
图4：与糖皮质激素信号化有关的基因的微阵列和定量RT-PCR数据。(A)使用定量RT-PCR(水平针对β-肌动蛋白标准化)证实了表明海马中11β-羟基类固醇脱氢酶I型(HSD11b1)的下调的阵列数据。(B)表明FK 506结合蛋白5(Fkbp 5)——糖皮质激素受体激活的一种调节剂在海马和额叶皮质中的显著上调。(C)通过额叶皮质中的定量RT-PCR证实了关于血清/糖皮质激素调节的激酶(Sgk)的阵列数据。
图5：神经降压肽受体1和2的微阵列和定量RT-PCR数据。(A)使用定量RT-PCR建立了在海马中观察到的CRH过表达小鼠的神经降压肽受体2(Ntsr2)的下调。神经降压肽受体1(Ntsr1)的水平低于微阵列分析中的检测极限。(B)而定量RT-PCR在CRH过表达者中建立了Ntsr1的类似下调。此外，对qRT-PCR数据的双向ANOVA表明了处理的重要作用，该媒介物(vchicle)处理显然被R121919处理所取消。
图6：通过对冰冻的玻璃封固的脑组织切片的定量放射自显影确定的对所有NTS-位点的[125I]NT结合(0.1nM，30min，RT)。数据以对每种至少3个不同的前囟点(Bregma)切片的平均IOD±SEM表示。
(*)：遗传组之间的差异，p＜0.05。
AMG：包括Ace、MeA、BMA和BLA的杏仁核；CG2：前扣带皮质；HC-SR：海马-放射层；RSG：后夹肌粒状皮质；TC：颞/顶骨皮质；U：未处理的；Ve：媒介物-处理的；R：R121919处理的。
图7：Nts2位点被左卡巴斯汀封闭的海马切片内结构上[125I]NT对NTS1 & 3-位点的结合。通过对冷冻玻璃封固的脑组织切片的定量放射自显影确定0.1nM[125I]NT(30min，RT)的结合。数据以对每种至少3个不同的前囟点(Bregma)切片的平均IOD±SEM表示。
(***)：遗传组之间的差异，p＜0.001
SNC，substantia faigra pars compacta；其他缩写，见图5。
发明详述
如此处所用的，术语“化合物”或“试剂”指生物或化学化合物如简单或复杂的有机分子、肽、蛋白质或寡核苷酸。如此处所用的“受试化合物”指用于根据本发明的方法的“化合物”或“试剂”，用以评估所述化合物是否调节CRH信号化活性。
如此处所用的“CRH信号化”指细胞中CRH使促肾上腺皮质激素释放激素受体活化后所述细胞的基因转录的变化。其从而诱导CRH特异基因表达谱。可以在蛋白质或基因，RNA水平上评估转录水平的变化。
如此处所用的“CRH应答活性”一般指由于所述细胞暴露于CRH导致可检测的细胞参数的变化。可检测的细胞参数包括膜电位的变化、调节所述细胞中CRH信号化的酶的酶活性的变化、根据本发明的蛋白质的表达水平的变化或者第二信使如cGMP、cAMP、Ca2+或IP3的量的变化。
术语“类似物”或“功能类似物”指哺乳动物嘌呤通透酶的修饰形式，其中已经进行了至少一个氨基酸置换使得所述类似物在体外和/或体内保持和未修饰的哺乳动物嘌呤通透酶基本相同的生物学活性。
如此处所用的“样品”或“生物学样品”指来自如血液、尿、唾液、组织活检或尸检材料的细胞、细胞提取物、体液或组织样品。
术语“功能类似物”旨在包括根据本发明的多肽的“片段”、“变体”、“简并变体”、“类似物”和“同系物”或“化学衍生物”。多肽的有用的化学衍生物是本领域中熟知的并包括，例如具有次级化学部分的多肽内所含的反应性有机位点的共价修饰。熟知的交联试剂可用于与氨基、羧基或醛残基反应以导入例如亲和标记如生物素、荧光染料，或者将多肽缀合到固相表面(例如，产生亲和树脂)。
多核苷酸或多肽的变体，如该术语在此处所用的，分别是与参比多核苷酸或多肽不同的多核苷酸或多肽。多核苷酸的变体可以是天然发生的变体如天然发生的等位基因变体，或者其可以是不知道是天然发生的变体。(1)在核苷酸序列中与参比多核苷酸不同的多核苷酸。通常差异受到限制从而参比和变体的核苷酸序列总体上非常类似，在许多区域中相同。如下面所指出的，变体的核苷酸序列的改变可以是沉默的。即，它们可能不改变该多核苷酸编码的氨基酸。当改变局限于这种类型的沉默变化时，变体将编码具有与参比相同的氨基酸序列的多肽。还如下面所提到的，变体的核苷酸序列的改变可以改变参比多核苷酸所编码的多肽的氨基酸序列。这种核苷酸改变可导致如上讨论的参比序列编码的多肽中氨基酸置换、加入、缺失、融合和截断。(2)氨基酸序列与另一参比多肽不同的多肽。一般地，差异受到限制从而参比和变体的多肽序列总体上非常类似并且，在许多区域中相同。变体和参比多肽在氨基酸序列中可以相差一个或多个置换、插入、缺失、融合和截断，它们可以以任一组合呈现。
如此处所用的术语“互补的”或“互补性”指嘌呤和嘧啶核苷酸通过氢键结合形成双链核酸分子的能力。下面的碱基对通过互补性相关联：鸟嘌呤和胞嘧啶；腺嘌呤和胸腺嘧啶；腺嘌呤和尿嘧啶。如此处所用的“互补的”指前述关系应用于所述分子的全长上，含有两条单链核酸分子的基本所有碱基对。“部分互补的”指前述关系，其中两条单链核酸分子之一在长度上短于另一条从而两个分子之一的一部分保持单链的。
术语“保守置换”或者“保守氨基酸置换”指基于本领域认识到的某些氨基酸的可置换性，亲本蛋白质中一个或多个氨基酸残基置换而不影响亲本分子的生物学活性(见，例如，M.Dayhoff，Atlas ofProtein Sequence and Structure，卷5，增补3，345-352页，1978)。
“其片段”指序列在此处公开的核酸或蛋白质的片段、片、或亚区域，从而所述片段含有5或更多氨基酸，或者10个或多个核苷酸，在亲本蛋白质或核酸分子中这些氨基酸或核苷酸是相邻的。
如此处所用的“功能片段”指此处公开的蛋白质的分离的亚区域或者片段，或者氨基酸序列，它们例如，含有功能上明显的区域，如受体的活化位点。功能片段可通过克隆技术产生，或者作为备选剪接机制的天然产物。
术语“同系物”或“同源的”描述不同核酸分子或氨基酸序列之间的关系，其中所述序列或分子通过所述分子或序列内一个或多个区组或区域处的部分同一或类似性相联系。“分离的核酸化合物”指任一RNA或DNA序列，其无论如何分析或合成，在位置上与其天然位置不同。
如此处所用的“核酸探针”或“探针”是标记的核酸化合物，其与另一种核酸化合物杂交。“核酸探针”指将与单链靶核酸序列杂交的单链核酸序列。核酸探针可以是寡核苷酸或核苷酸聚合物。“探针”通常含有可检测部分，其可以附着到该探针的末端或者可以在该探针的序列内部。
术语“引物”是作为例如核酸分子的酶促或合成的延伸的起始底物的核酸片段。
如此处所用的术语“杂交”指一种过程，其中单链核酸分子与互补链通过核苷酸碱基配对接合。
术语“严格性”指杂交条件。高严格性调节不利于非同源碱基配对。低严格性条件具有相反作用。例如，通过温度和盐浓度可以改变严格性。“严格条件”指在含有50％甲酰胺、5×SSC(750mM NaCl，75mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5×Denhardt溶液、10％硫酸葡聚糖、和20μg/ml变性的、剪切的鲑精DNA的溶液中于42℃下过夜孵育，然后在0.1×SSC中约65℃下洗涤滤器。其他适宜的杂交条件在实施例中描述。
“较低的严格条件”包括在含有6×SSPE(20X SSPE＝3MNaCl；0.2M NaH2PO4；0.02M EDTA，pH 7.4)、0.5％ SDS、30％甲酰胺、100μg/ml鲑精封闭DNA的溶液中37℃过夜孵育，然后用1×SSPE、0.1％SDS在50℃洗涤。此外，为了实现甚至更低的严格性，可以在更高盐浓度(例如，5×SSC)下进行严格杂交后的洗涤。注意到通过用于抑制杂交实验中背景的备选封闭试剂的包括和/或替换可以实现上面条件的改变。典型的封闭试剂包括Denhardt试剂、BLOTTO、肝素、变性的鲑精DNA、和通过商业途径可得到的专利制剂。特异封闭试剂的包含由于相容性问题可能需要修改上述杂交条件。
如此处所用的术语“融合蛋白”指为了得到结构域或者接头(linker)区的组合功能，组合多个蛋白质结构域或者区而形成的的蛋白质构建体。这可以通过编码这种结构域的核苷酸序列的分子克隆以产生编码所希望的融合蛋白的新的多核苷酸序列实现。备选地，通过化学方法连接两个蛋白质产生融合蛋白。
如此处所用的术语“接头区”或者“接头结构域”或者类似的这些描述性术语指用于克隆载体或融合蛋白的构建中的多核苷酸或多肽序列。接头区的功能可以包括将克隆位点导入核苷酸序列、将柔性组分或空间产生区域导入两个蛋白质结构域之间，或者产生用于特定分子相互作用的亲和标记。接头区可被导入在多肽或多核苷酸序列构建期间作出的选择导致的融合蛋白中。
筛选方法
本发明涉及用于鉴定调节促肾上腺皮质激素-释放激素(CRH)诱导的抑郁症和紧张的化合物的筛选方法。该方法基于作为CRH活化的CRH受体的下游调节剂的许多基因的鉴定。具体地，本发明提供了鉴定能够改变细胞中CRH信号化应答的化合物的方法，所述方法包括：
a)所述化合物存在或不存在时将所述细胞与CRH接触；
b)确定调节所述细胞中促肾上腺皮质激素-释放激素(CRH)信号化的至少一种蛋白质在转录水平上的改变；和
c)比较在所述化合物存在和不存在时所述蛋白质的转录水平；其中，调节促肾上腺皮质激素-释放激素(CRH)信号化的蛋白质选自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ  ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ IDNO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ IDNo.41。
为了确定蛋白质水平上转录的变化，可以使用本领域中公知的技术确定所述蛋白质的量。例如，使用分离技术如等电聚焦或SDS-PAGE联合蛋白质染色技术如考马斯或银染。备选地，对于是酶的蛋白质，可以按照该酶产生的催化效果，即其底物向反应产物的转化，测量或分析给定溶液或组织提取物中的量。例如，对于激酶，可以使用含有激酶特异磷酸化位点的底物并通过测量由于放射性磷酸向底物的掺入导致的该底物的磷酸化来评估激酶活性。可以在受试化合物存在或不存在时实施该测定法。对于不是酶的蛋白质，需要其他定量方法。例如，转运蛋白可通过它们与它们所转运的分子的结合来测量，激素和毒素可通过它们产生的生物学效应来测定。
为评估基因水平上转录的变化，RNA或cDNA可被直接使用或者可以在分析前通过使用PCR或其他扩增技术酶促扩增。优选地，所述分析方法包括使用标记的寡核苷酸探针，该探针靶定所述细胞中编码调节CRH信号化的蛋白质的基因的适宜区域。因此，在优选的实施方案中，使用结合编码一种氨基酸序列的多核苷酸的探针评估基因转录水平，该氨基酸序列选自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41。
在另一实施方案中，可以构建含有编码调节CRH信号化的蛋白的核苷酸序列或者其片段的寡核苷酸探针阵列以实施基因表达的有效筛选。阵列技术是熟知的并且具有普遍适用性并且可用于处理分子遗传学中的各种问题，包括基因表达、遗传连锁，和遗传变异性(见例如：M.Chee等人，Science，卷274，610-613页(1996))。
在备选的实施方案中，鉴定能够改变细胞中CRH信号化应答的化合物的方法包括：
a)在所述化合物存在和不存在时将所述细胞与CRH接触；和
b)确定含有一种核酸序列的多核苷酸的表达水平，该核酸序列选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID 11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQID NO.36、SEQ ID No.38和SEQ ID No.40。
为了评估表达水平的改变，RNA或cDNA可被直接使用或者可以在分析前通过使用PCR或其他扩增技术酶促扩增。优选地，所述分析方法包括使用标记的寡核苷酸探针，该探针靶定该多核苷酸的适宜区域。因此，在优选的实施方案中，使用结合含有一种核酸序列的多核苷酸的探针评估基因转录水平，该核酸序列选自SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID 11、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.15、SEQ IDNO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID No.38和SEQ ID No.40。
在另一实施方案中，可以构建含有编码调节CRH信号化的蛋白质的核苷酸或者其片段的寡核苷酸探针阵列以有效筛选基因表达。在该实施方案中，本发明提供了鉴定能够改变细胞中CRH信号化应答的化合物的方法，所述方法包括在所述化合物存在或不存在时将所述细胞与CRH接触；确定具有核酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID 11、SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ IDNO.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ IDNo.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID No.38和SEQ ID No.40的多核苷酸的表达水平。具体地，使用结合具有核酸序列SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID NO.9、SEQID 11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID No.38和SEQ ID No.40的多核苷酸的寡核苷酸探针阵列。阵列技术是熟知的并且具有普遍适用性并且可用于处理分子遗传学中的各种问题，包括基因表达、遗传连锁，和遗传变异性(见例如：M.Chee等人，Science，卷274，610-613页(1996))。
对于基因组DNA不被直接使用的情况，可以分离mRNA，并实施第一条链cDNA合成。可以实施DNA合成的第二轮以产生第二条链。随后，通过特异PCR扩增，可以得到分离的cDNA。如果希望，双链cDNA可被克隆到任一适宜的载体，例如，质粒，从而形成cDNA文库。类似于上面的方法，可以用靶定编码调节CRH信号化的蛋白质的基因的任一适宜的区域的标记的寡核苷酸探针筛选在噬菌体或质粒穿梭载体中构建的cDNA文库。见例如， PCR Protocols：A Guide to Method and Application，编者M.Innis等人，Academic Press(1990)。
在适宜的载体如质粒或噬菌体中构建cDNA文库以在原核或真核细胞中增殖的方法是本领域技术人员熟知的。[见例如Maniatis等人，如前]。适宜的克隆载体是熟知的并且可普遍得到。
在另一实施方案中，在mRNA水平确定基因转录的变化。可以使用用于多核苷酸定量的本领域中熟知的方法之一在RNA水平测量减少或增加的表达，这些方法为，例如，核酸扩增，例如，通过PCR、RT-PCR；RNA酶保护；Northern印迹和其他杂交方法。可用于确定蛋白质，如来自宿主的样品中本发明的多肽的水平的测定技术是本领域技术人员熟知的。这些测定方法包括放射免疫测定法、竞争-结合测定法、蛋白质印迹分析和ELISA测定法。可用于确定蛋白质衍生物或者变体的存在的测定技术包括质谱法。
从而，本发明的一个目的是提供鉴定能够改变细胞中CRH信号化应答的化合物的方法，所述方法包括：
d)所述化合物存在或不存在时将所述细胞与CRH接触；
e)确定调节所述细胞中促肾上腺皮质激素-释放激素(CRH)信号化的至少一种蛋白质的量；和
f)比较在所述化合物存在和不存在时所述蛋白质的量；其中，调节促肾上腺皮质激素-释放激素(CRH)信号化的蛋白质选自SEQ IDNO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41。
优选地，测定调节CRH信号化的蛋白质的量的方法是使用结合含有选自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的一种氨基酸序列的多肽的抗体。
从而，在另一实施方案中，本发明提供了与调节CRH信号化的蛋白质具有免疫反应性的单特异抗体，所述蛋白质选自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ IDNO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41。
使用常规方案，通过将本发明多肽或者含有表位的片段、类似物或者表达这些的细胞施用于动物，优选非-人动物，可以得到所产生的针对本发明多肽的抗体。对于单克隆抗体制备，可以使用提供通过连续细胞系培养产生的抗体的任一技术。实例包括杂交瘤技术(Kohler，G.和Milstein，C.，Nature(1975)256：495-497)、trioma技术、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等人，Immunology Today(1983)4：72)和EBV-杂交瘤技术(Cole等人，MONOCLONAL ANTIBODIES ANDCANCER THERAPY，77-96页，Alan R.Liss，Inc.，1985)。
产生单链抗体，如美国专利号4,946,778中所描述的那些单链抗体的技术也可适用于产生针对本发明多肽的单链抗体。而且，转基因小鼠，或者其他生物，包括其他哺乳动物，也可以用于表达人源化抗体。
上述抗体可用于分离或鉴定表达该多肽的克隆或者通过亲和层析纯化这些多肽。
针对本发明多肽的抗体也可用于治疗CRH代谢相关的失调如CRH诱导的紧张或抑郁症。
为了确定调节CRH信号化的蛋白质的量，根据本发明的抗体被用于常规免疫学技术。适宜的免疫学技术是本领域技术人员熟知的并包括例如，ELISA、蛋白质印迹分析、竞争性或三明治免疫测定法等，如所熟知的，它们都依赖于抗原-抗体免疫复合物的形成，其中为了测定法起见，抗体可以被例如，放射、酶或荧光标记物可检测地标记，或者可固定在不可溶的载体上。
例如，在一种ELISA筛选方法中，抗体被加到固相(例如，微量滴定板的底部)，该固相被偶联到载体(如BSA)的蛋白质或者其片段包被，然后加入缀合可检测标记如酶，优选辣根过氧化物酶，或者放射性同位素如125I的抗免疫球蛋白抗体(例如，当在小鼠中进行免疫时，使用抗小鼠免疫球蛋白抗体，例如，绵羊-抗-小鼠免疫球蛋白(Ig))。
从而本发明的一个目的是提供确定或检测调节样品中CRH信号化的蛋白质的免疫测定法，该方法包括将样品与根据本发明的蛋白质接触并确定在该抗体和所述蛋白质之间是否形成免疫复合体。可以对组织样品或者体液样品实施这些方法并且它们通常包括从受试者的身体得到样品；将所述样品与根据本发明的可检测标记的抗体的成像有效量接触；并检测标记以鉴定调节样品中CRH信号化的蛋白质的存在。
使用本发明抗体的测量方法不被具体限制。可以使用任一测量方法，只要相应于抗原的抗体、抗原或者抗原-抗体复合体的量可被化学或物理方法检测，并且从通过使用含有已知量的抗原的标准溶液制备的标准曲线计算得到。例如，可以适宜地使用浊度测定法、竞争法、免疫测量方法和三明治方法。对于灵敏性和特异性，尤其优选使用下面描述的三明治方法。
在使用标记物质的测量方法中，放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质等被用作标记剂。放射性同位素的实例包括125I、131I、3H和14C。酶通常被缀合适宜的底物，该底物反过来又催化可检测的反应物而使得该酶可被检测。该底物的实例包括，例如，β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶和苹果酸脱氢酶，优选辣根过氧化物酶。发光物质包括，例如，鲁米诺、鲁米诺衍生物、萤光素、水母发光蛋白和萤光素酶。此外，抗生物素蛋白-生物素系统也可以用于标记抗体和本发明的免疫原。
因此，在另一方面，本发明提供了鉴定能够改变细胞中CRH信号化应答活性的化合物的方法，该方法包括：
a)将表达含有选自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的氨基酸序列的至少一种蛋白质的细胞与所述受试化合物接触；和
b)比较所述化合物存在和不存在时所述细胞中CRH应答活性。
使用常规电生理学技术并且当它们可以得到时，使用当前正在开发的新的高通量方法测量膜电位的变化。因为膜电位的改变通常是离子通量的结果，作为备选方法，使用离子敏感的荧光染料，包括fluo-3、fluo-4、fluo-5N、fura red、Sodium Green、SBFI和来自包括Molecular Probes的供应商的其他类似探针，可以通过细胞内离子浓度的变化间接测量膜电位的变化。来自包括Molecular Probes的供应商的其他荧光染料如DIBAC4(3)或Di-4-Anepps可以检测膜电位变化。例如，使用荧光测量和荧光成像技术，包括荧光显微术，用或不用激光共聚焦方法组合图像分析算法，可以实时表征钙和钠离子通量。
在优选的实施方案中，该测定法基于称作荧光成像板读出器((FLIPR)，Molecular Devices Corporation)的仪器。在其最通常的配置中，该仪器激发并测量基于萤光素的染料发出的荧光。其使用氩离子激光在荧光团的488nm处产生高能量激发，用光学系统快速扫描96-/384-孔板的底部并用灵敏的冷CCD相机捕捉发出的荧光。其还包括96/384-孔移液头以允许该仪器递送试剂溶液到96-/384-孔板的孔中。FLIPR测定法被设计用于同时从所有96-/384-孔实时地测量化合物加入之前、之中和之后来自细胞群体的荧光信号。
从而本发明的一个目的是提供用于筛选和鉴定在调节细胞CRH应答中具有功能活性的化合物的FLIPR测定法，所述细胞表达选自SEQ IDNO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的蛋白。
在备选实施方案中，可以使用电生理学方法评估细胞的活性。因此，可以使用全细胞和单通道电生理学鉴定调节细胞中CRH信号化的蛋白质。
从而，本发明的另一个目的是提供鉴定调节细胞中CRH信号化应答活性的化合物的筛选方法，所述方法包括：
a)将表达选自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的蛋白质的宿主细胞与受试化合物接触；
b)使用电生理技术测量受试化合物对所述细胞膜电位的影响；和
c)比较所述化合物存在和不存在时所述细胞中CRH应答活性。
在优选的实施方案中，宿主细胞是爪蟾(Xenopus)卵母细胞并且电生理学测量由使用电压钳技术在不同的膜电位测量膜电流组成。
调节所述细胞中CRH信号化的酶的酶活性的变化一般可以按照酶产生的催化效果，即底物向反应产物的转化来测量或分析。例如，对于激酶，可以使用含有该激酶特异磷酸化位点的底物并通过测量该底物的磷酸化评估该激酶的活性。类似地对于磷酸酶，可以使用磷酸化底物并通过测量该底物的去磷酸化评估磷酸酶活性。可以在受试化合物存在和不存在时实施这些测定。
从而本发明的一个目的是提供鉴定能够改变细胞中CRH信号化应答活性的化合物的方法，所述方法包括：
a)将包括选自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的激酶的混合物与磷酸源和适宜的激酶底物接触；
b)在所述化合物存在或不存在时孵育所述混合物；
c)测量与所述受试化合物不存在时所述底物的磷酸化水平相比所述化合物存在时所述底物的磷酸化水平。
在本发明的测定法中，激酶可作为蛋白质提供或者其可以作为编码所述激酶的mRNA在测定混合物中提供。当该测定法包括无细胞组分时，该激酶以蛋白质提供。当该测定法在细胞环境中实施时，该激酶可以作为蛋白质或者作为编码所述激酶的mRNA提供，其中，为了该激酶可以在该测定法中被利用，该mRNA被翻译从而产生激酶蛋白。从此处提供的实施例得到该激酶的mRNA并将该mRNA注射到细胞中以产生激酶蛋白是显然是很简单的事情。还可以通过编码激酶蛋白的质粒的表达提供激酶。可以用标准分子生物学技术构建编码激酶蛋白的可操作质粒并在细胞中表达质粒(Sambrook，等人，1989，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)。
如此处所讨论的，可以在体外(其中测定混合物无细胞或者其中活细胞被包括在测定法中)，或者体内在动物中实施鉴定激酶调节剂的方法。从而，在本发明的一个方面，混合物被包含在真核细胞中并且可以实施本发明的方法，其中测定混合物的一些组分可以通过这些组分向细胞的微注射外源地提供给细胞，一些组分可以是细胞内源的。
如此处所用的术语“细胞内源的”指该组分在受试细胞中天然地产生。
如此处所用的术语“细胞外源的”指该组分在受试细胞中没有天然地发现，或者在细胞中以低水平发现，和被加到细胞中。
当使用真核细胞实施本发明方法时，一种或多种激酶蛋白、激酶底物和受试化合物可以在真核细胞孵育前注射到真核细胞中。然后如此注射的细胞在促进蛋白质激酶活性的条件下孵育，在孵育期之后，使用此处描述的测定法随后测量蛋白质激酶活性水平。
用于本发明方法中的真核细胞可以是非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞、非洲爪蟾胚细胞、哺乳动物细胞(如IOTI/2细胞)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)S2细胞、Dictyostefium discoideum细胞和酵母细胞。更优选地，真核细胞是鼠垂体促肾上腺皮质激素细胞-来源的腺瘤细胞系细胞AtT-20之一。
用于本发明方法的磷酸源可以是磷酸的任一普通来源，包括，但不限于，核苷酸三磷酸如，但不限于，ATP或GTP。在优选的实施方案中，磷酸源上结合可检测的标记，在反应期间该标记随磷酸基团转移到激酶底物。这样，磷酸化激酶底物可以与非-磷酸化激酶底物区分，因为磷酸化底物将含有可检测的标记而非磷酸化底物将不含有标记。在另一实施方案中，磷酸源上不结合可检测标记；而是，例如通过抗体识别底物的一种形式而不能识别另一种形式，可以将磷酸化激酶底物与非-磷酸化激酶底物区分。
用于本发明的方法中的可检测标记可包括任一已知或至今未知的可检测标记，该标记由于蛋白质激酶活性的结果在磷酸基团转移时转移到激酶底物。可用的标记包括，但不限于，放射性标记，如γ32P、31S和非放射性标记，如生物素等。
优选的激酶测定法在细胞中实施并包括：
a)将含有选自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的激酶的细胞与磷酸源和适宜的激酶底物接触；
b)在所述化合物存在或不存在时孵育所述混合物和；
c)在所述化合物存在和不存在时比较所述细胞的CRH应答活性。
类似地，可以使用磷酸测定法评估CRH信号应答中的变化，所述测定法包括：
a)将含有选自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的磷酸酶的混合物与适宜的磷酸化底物接触；
b)在所述化合物存在或不存在时孵育所述混合物；
测量与所述受试化合物不存在时所述底物的磷酸化水平相比，所述化合物存在时所述底物的磷酸化水平。
对于激酶测定法，本发明的测定法中的磷酸酶可以以蛋白质提供或者其可以作为编码所述磷酸酶的mRNA在测定混合物中提供。通常用可检测的磷酸残基标记磷酸化底物。可用的标记物包括，但不限于，放射性标记，如γ32P、31S和非放射性标记，如生物素等。对于用于磷酸酶活性测定法，底物优选由在酪氨酸或丝氨酸残基被磷酸化，典型地用γ32P标记的肽底物组成。通常，可以以各种方法完成磷酸化。典型地，使用蛋白质酪氨酸激酶。例如，可以使用可溶的EGF-受体激酶联合.sup.32P标记的ATP磷酸化本发明的肽上的酪氨酸残基。这种磷酸化反应通常允许在30℃持续约2小时或者在室温过夜。
然后从磷酸化反应混合物纯化磷酸化肽，其在下文中被称为“磷酸肽”。例如，通过加入三氯乙酸并离心，从而肽保留在上清液中，可以从反应混合物分离肽。一般通过柱层析，例如在C18上进一步纯化肽。纯化的磷酸化肽可被冻干并在-20℃保存备用。
孵育后，通过磷酸肽的去磷酸化(即从去磷酸化释放的游离放射性磷)释放的放射性分离没有去磷酸化的磷酸肽(“未-去磷酸化的磷酸肽”)。如此处所用的，术语“放射性磷“包括所有形式，其中放射性磷原子可存在于酪氨酸残基上并且可通过去磷酸化，例如，作为磷酸根基团被除去。通常，通过离心，然后通过加入包括非放射性磷酸酯和活性炭的物质终止去磷酸化反应实现未-去磷酸化的磷酸肽与磷酸肽的去磷酸化释放的游离的放射性磷的分离。通过本领域普通技术人员熟知的方法确定上清液的放射性。基于最初通过磷酸肽加入测定混合物的放射性的量和作为去磷酸化释放的放射性在测定法的末尾检测的放射性的量，可以计算所分析的样品的磷酸酶酶促活性。
优选地，磷酸酶测定法在细胞中实施并包括：
a)将含有选自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的磷酸酶的细胞与适宜的磷酸化底物接触；
b)在所述化合物存在或不存在时孵育所述混合物和；
c)比较所述化合物存在和不存在时所述细胞的CRH应答活性，其中通过底物的磷酸化水平的改变确定所述细胞的CRH应答活性。
本发明的一个实施方案是提供鉴定能够改变细胞中CRH信号化应答活性的化合物的方法，所述方法包括：
a)将表达包括选自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的氨基酸序列至少一种蛋白质的细胞与所述受试化合物接触；和
b)比较所述化合物存在和不存在时所述细胞中第二信使，如cAMP、cGMP、Ca2+或IP3的水平。
使用本领域公知的技术确定含有前述蛋白质之一的全细胞或细胞提取物中第二信使的水平。
鉴定能够改变细胞中CRH信号化应答活性的化合物的另一方法是基于基因的使用，如报道基因，其可操作地连接基因启动子或者其调节序列元件，其特征是所述基因启动子或者调节序列元件含有转录因子结合位点，其中所述转录因子能够调节细胞中CRH信号化。在优选的实施方案中，能够调节细胞中CRH信号化的转录因子选自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41。因此，本发明提供了含有如上面定义的基因启动子区的重组DNA分子。在所述重组DNA分子中，启动子区可操作地连接编码可检测的产物的核酸分子，如报道基因。如此处所用的，术语“可操作地连接”指按适宜的框将基因与启动子功能性融合以表达处于该启动子控制下的基因。如此处所用的，术语“报道基因”指一种基因，其编码的基因产物可以用简单、便宜的方法鉴定并且该基因可以可操作地连接到启动子区或者其活性片段。报道基因如，例如，萤火虫萤光素酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、细菌氯霉素乙酰基转移酶或者绿色荧光蛋白报道基因可用于确定根据本发明的筛选测定法中的转录活性(见，例如，Goeddel(编著)，Methods Enzymol.，卷185，San Diego：AcademicPress，Inc.(1990)；还见Sambrook，如前)。在优选的实施方案中，报道基因是萤火虫萤光素酶基因。本发明还提供了含有如上定义的重组DNA分子的载体，以及用所述载体，或者一般用根据本发明的重组DNA分子稳定转化的宿主细胞。术语“载体”指用于将DNA转移到宿主细胞中以通过宿主细胞复制和/或适宜表达外源DNA的任何外源DNA运载工具。因此，在特定实施方案中，所述载体是表达载体，如通过商业途径可得到的pGL31uc表达载体。
CRH诱导的基因表达图谱的鉴定
另一方面，本发明涉及分离的和纯化的核酸分子的使用，已表明它们在长时间暴露于CRH的上升的水平时被上调和下调，其中所述核酸分子为RNA、DNA、cDNA或者基因组DNA，作为细胞中的CRH信号化标记。
具体地，本发明包括分离和纯化的核酸分子，该核酸分子包括选自如下组的一个成员：
a)与选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ D No.8、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30和SEQ ID No.31的多核苷酸在所述多核苷酸的全长上具有至少70％同一性、优选至少80％同一性、更优选至少90％同一性、甚至更优选至少95％同一性、甚至更优选至少97-99％同一性的核苷酸序列；
b)与选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ D No.8、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30和SEQ ID No.31的多核苷酸在所述多核苷酸的全部编码区上具有至少70％同一性、优选至少80％同一性、更优选至少90％同一性、甚至更优选至少95％同一性、甚至更优选至少97-99％同一性的核苷酸序列；
c)具有选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ D No.8、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30和SEQ ID No.31的核苷酸序列的多核苷酸。
同一性和相似性，如本领域中公知的，是如通过比较序列确定的两个和多个多肽序列或者两个或多个多核苷酸序列之间的关系。在本领域中，同一性还指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性的程度，可以如通过这些序列串之间的匹配确定。可以容易地计算同一性和相似性(Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，编者，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，编者，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis ofSequence Data，PartI，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis inMolecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，编者，M Stockton Press，New York，1991)。尽管有许多方法可以测量两种多核苷酸或两种多肽序列之间的同一性和相似性，但是两种术语都是技术人员熟知的(Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；Sequence AnalysisPrimer，Gribskov，M.和Devereux，J.，编者，M Stockton Press，New York，1991；和Carillo，H.，和Lipman，D.，(1988)SIAM J.Applied Math.，48，1073)。通常用于确定序列之间的同一性或相似性的方法包括，但不限于Carillo，H.，和Lipman，D.，(1988)SIAMJ.Applied Math.，48，1073中公开的那些方法。设计确定同一性的优选方法以给出所试验的序列之间的最大匹配。确定同一性和相似性的方法在计算机程序中编码。确定两个序列之间同一性和相似性的优选的计算机程序方法包括，但不限于GCG程序包(Devereux，J.，等人，(1984)Nucleic Acids Research 12(1)，387)、BLASTP、BLASTN、和FASTA(Atschul，S.F.等人，(1990)J.Molec.Biol.215，403)。
可以从所述基因被表达的组织，如但不限于，脑、心脏、肾脏、胰腺、肝脏和皮肤分离编码能够调节CRH活性的蛋白质的核酸序列或者其片段。也可以从人和小鼠之外的哺乳动物分离所述序列。如此处描述的，通过筛选细胞提取物或全细胞测定中CRH活性可以进行适宜的细胞的选择。在这些测定法的任一种中具有CRH调节活性的细胞可适于分离根据本发明的核酸序列。
本领域中公知的各种方法的任一种可用于编码根据本发明的蛋白质的DNA的分子克隆。在一种方法中，mRNA被分离，并且实施第一条链cDNA合成。可以实施第二轮DNA合成以产生第二条链。随后通过从调节CRH信号化的纯化蛋白的氨基酸序列设计简并寡核苷酸引物对DNA片段进行特异PCR扩增，可以得到分离的cDNA。如果希望，可将双链cDNA克隆到任一适宜的载体，例如，质粒，从而形成cDNA文库。另一种方法是筛选用靶定SEQ ID NO：1、SEQ ID NO 7或SEQ ID NO：3的任一适宜区域的标记的寡核苷酸探针在噬菌体或质粒穿梭载体中构建的cDNA文库。见例如，PCR  Protocols：A Guide to Method and Application，Ed.M.Innis等人，Academic Press(1990)。
在适宜的载体如质粒或噬菌体中构建cDNA文库以在原核或真核细胞中增殖的方法是本领域技术人员熟知的。[见例如，Maniatis等人，如前]。适宜的克隆载体是熟知的和普遍可得到的。
对本领域技术人员显而易见的是其他类型的文库，以及从其他细胞或细胞类型构建的文库，可用于分离根据本发明的核酸序列。其他类型的文库包括，但不限于，从其他细胞、从不同于人和小鼠的其他生物得到的cDNA文库，和基因组文库，其包括YAC(酵母人工染色体)和粘粒文库。可通过本领域中熟知的标准技术实施基因组DNA文库的构建。在T.Maniatis等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第二版.14章(1989)可发现熟知的基因组DNA文库构建技术。
技术人员将明白，在许多情况中，分离的cDNA序列将是不完整的，因为编码多肽的区域在该cDNA的5’末端短。这是逆转录酶——具有内在的低“持续合成能力”(酶在聚合反应期间保持附着到模板的能力的一种测量)的一种酶在第一条链cDNA合成期间不能完成mRNA模板的DNA拷贝的结果。
有一些方法可利用并且是本领域中技术人员熟知的，用于得到全长cDNA，或者延伸短cDNA，例如，cDNA末端的快速扩增(RACE)方法(Frohman等人，1988，PNAS USA 85，8998-9002)，或者该技术的最近改良方法，例如MarathonTM技术(Clontech Laboratories Inc.)。
多肽
在另一实施方案中，本发明涉及调节CRH信号化的基本纯的形式的多肽，其中所述多肽被分离和纯化的根据本发明的核酸分子编码。在优选实施方案中，该多肽具有选自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41和其功能类似物的氨基酸序列。
根据本发明的蛋白质包括根据本发明的核酸编码的所有可能的氨基酸变体，包括被所述分子编码和具有保守氨基酸变化的多肽。
本领域技术人员将认识到通过多种重组DNA技术包括，例如，杂交、聚合酶链式反应(PCR)扩增，或者从头DNA合成(见，例如，T.Maniatis等人.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版.14章(1989))，可以得到调节CRH信号化的蛋白质。
调节CRH信号化的纯化的生物活性蛋白质可以具有几种不同的物理形式。根据本发明的多肽可以以全长新生的或者未加工的多肽，或者作为部分加工的多肽或者加工的多肽的组合存在。全长新生多肽可以是被特定蛋白质水解切割事件翻译后修饰的，该事件导致全长新生多肽的片段的形成。片段，或者片段的物理缔合可以具有与根据本发明的蛋白质相关的全部生物学活性；然而，CRH调节活性的程度可以在个体片段之间变化。
在本发明的该方面还优选的是该多肽的结构或功能属性所表征的片段。在这一点上本发明的优选实施方案包括含有α-螺旋和α-螺旋形成区、β-折叠和β-折叠-形成区、转角和转角-形成区、卷曲螺旋和卷曲螺旋-形成区、亲水区、疏水区、α两性区、β两性区、弹性区、表面-形成区、底物结合区、本发明的多肽的高抗原性指数区的片段，和这些片段的组合。优选的区是介导本发明的多肽的活性的区。在这一点上最高度优选的是具有本发明的应答调节多肽的化学、生物学或其他活性的片段，包括具有类似活性或者提高的活性，或者具有降低的不希望的活性的那些片段。
编码调节CRH活性的蛋白质的多核苷酸的重组表达
在另一实施方案中，根据本发明的多核苷酸可以通过分子克隆到含有适宜的启动子和其他适宜的转录调节元件的表达载体中，并转移到原核和真核宿主细胞以产生调节CRH信号化的蛋白质，而被重组地表达。这种操作的技术在Maniatis，T，等人(如前)中完整描述，并且是本领域中熟知的。
因此，在另一方面，本发明提供了在重组宿主中表达调节CRH信号化的蛋白质的表达载体，其中所述载体含有编码调节CRH信号化的蛋白质的核酸序列和其功能类似物。在本发明的更优选的方面，该表达载体含有编码调节CRH信号化的蛋白质的核酸分子，其具有选自SEQID NO.9、SEQ ID 11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID No.38和SEQ ID No.40和其功能类似物的核苷酸序列或者含有编码调节CRH信号化的蛋白质的基因组DNA。
表达载体在此处被定义为适宜的宿主中所克隆基因拷贝的转录和它们的mRNA翻译所需要的DNA序列。这些载体可用于在各种宿主中表达真核基因，该宿主为如细菌(包括大肠杆菌)、蓝细菌、植物细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞、真菌细胞(包括酵母细胞)和动物细胞。
特别设计的载体允许宿主之间的DNA穿梭，所述宿主如细菌-酵母或细菌-动物细胞或者细菌-真菌细胞或细菌-无脊椎动物细胞。适宜构建的表达载体可含有：用于在宿主细胞中自主复制的复制原点、可选择的标记物、有限数目的有用的限制酶位点、高拷贝数的潜力，和活性启动子。启动子被定义为指导RNA聚合酶结合DNA并启动RNA合成的DNA序列。强启动子是导致mRNA以高频率启动的mRNA。表达载体可包括，但不限于，克隆载体、修饰的克隆载体、特别设计的质粒或病毒。
编码调节CRH信号化的蛋白质的根据本发明的分离和纯化的核酸分子可被克隆到表达载体中以在重组宿主细胞中表达。重组宿主细胞可以是原核或真核的，包括但不限于细菌如大肠杆菌、真菌细胞如酵母、两栖动物细胞如爪蟾卵母细胞、哺乳动物细胞包括但不限于人、牛、猪、猴和啮齿类来源的细胞系，和昆虫细胞包括但不限于果蝇-和蚕-来源的细胞系。适宜的并且可通过商业途径得到的来自哺乳动物种类的细胞系包括但不限于：CV-1(ATCC CCL 70)、COS-1(ATCC CRL1650)、COS-7(ATCC CRL 1651)、CHO-K1(ATCC CCL 61)、3T3(ATCCCCL 92)、NIH/3T 3(ATCC CRL 1658)、HeLa(ATCC CCL 2)、C127I(ATCCCRL 1616)、BS-C-1(ATCC CCL 26)、MRC-5(ATCC CCL 171)、L-细胞、成神经细胞瘤、神经胶质细胞和HEK-293(ATCC CRL1573)。
因此，在另一实施方案中，本发明涉及重组宿主细胞，其含有编码调节CRH信号化的蛋白的重组克隆的核酸分子或其功能类似物。在另一方面，根据本发明的重组宿主细胞含有一种核酸分子，其或者是基因组DNA或者具有选自SEQ ID NO.9、SEQ ID 11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID No.38和SEQ ID No.40的核苷酸序列；和其功能类似物。
通过包括但不限于转化、转染、原生质体融合、脂转染、和电穿孔的许多技术之一可以将表达载体导入宿主细胞中。含有表达载体的细胞被克隆增殖和分析以确定它们是否产生介导CRH信号化的蛋白质。表达通透酶的宿主细胞克隆的鉴定可通过几种方法进行，这些方法包括但不限于针对根据本发明的多肽的抗体的免疫反应性，和宿主细胞相关的哺乳动物嘌呤通透酶活性的存在。
从而，本发明还涉及在重组细胞中表达调节CRH信号化的蛋白质的方法，该方法包括在允许调节来自如此处概述的表达载体的调节CRH信号化的蛋白质表达的条件下培养根据本发明的宿主细胞。本发明的蛋白质可以通过直接表达合成或者作为融合蛋白合成，该融合蛋白含有作为与另一种蛋白质或肽的翻译融合的目标蛋白，该另一种蛋白质或肽可自身地、通过酶或化学切割除去。因此，在具体实施方案中，本发明提供了根据本发明的蛋白，其中所述多肽是融合蛋白的部分。
在重组系统的某些肽的产生中经常观察到作为融合蛋白的表达延长了寿命，增加了所希望的肽的产率，或者提供了纯化该蛋白质的方便的方法。当在原核宿主中表达哺乳动物蛋白时这尤其相关。公知各种肽酶(例如，肠激酶和凝血酶)，它们在特定位点切割多肽或者，从肽链的氨基或羧基末端(例如二氨基肽酶)消化肽。此外，特定化学药品(例如溴化氰)将在特定位点切割多肽。技术人员将明白氨基酸序列必要的修饰(和如果使用重组方法，合成的或半合成的编码序列)以掺入位点-特异的内部切割位点。见例如，P.Carter，″融合蛋白的位点特异的蛋白酶解″，第13章， Protein Purification：From Molecular Mechanisms to Large Scale Processes.American ChemicalSociety，Washington，D.C.(1990)。
此外，可以使用例如，已经在其基因组中含有如上面描述的编码调节CRH信号化的蛋白质的核酸分子，但是由于例如，弱启动子而不表达该核酸分子或者不以适宜的方式表达该核酸分子的哺乳动物细胞，并向该哺乳动物细胞导入与编码所述嘌呤通透酶多肽的内源核酸分子紧邻的调节序列如强启动子，以便诱导该核酸分子的表达。
同样，含有编码处于异源转录和/或调节序列或蛋白质控制下的调节CRH信号化的蛋白质的多核苷酸的重组宿主细胞将是本发明的另一实施方案。
在该上下文中，术语“调节序列”指可用于增加嘌呤通透酶多肽的表达的核酸分子，这是由于该核酸分子整合到细胞的基因组中并且与CRH调节蛋白-编码基因紧邻。这些调节序列包括启动子、增强子、失活的沉默子内含子序列、3’UTR和/或5’UTR编码区、蛋白质和/或RNA稳定元件、编码调节蛋白的核酸分子，例如，转录因子，这些调节序列能够诱导或引发CRH调节蛋白质-编码基因的表达，或者公知活化基因表达和/或增加基因产物的量的其他基因表达控制元件。所述调节序列的导入导致多肽的表达的增加和/或诱导，该多肽调节CRH信号化，最后导致细胞中所述多肽的量增加。从而，本发明的目的是提供调节CRH信号化的多肽的从头和/或增加的表达。
通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质-介导的转染、电穿孔、转导、感染或其他方法可以实现构建体向宿主细胞的导入。这些方法在许多标准实验室手册，如Davis，Basic Methods InMolecular Biology(1986)中描述。特别预期调节CRH信号化的多肽可以实际上被缺少重组载体的宿主细胞表达。
此外，使用体外产生的合成mRNA也可以实施根据本发明的多核苷酸的表达。合成的mRNA或者从能够调节CRH信号化的细胞分离的mRNA可被有效地在各种无细胞系统中翻译，这些无细胞系统包括但不限于麦芽提取物和网织红细胞提取物，以及在基于细胞的系统有效地翻译，其包括但不限于微注射到蛙卵母细胞，一般优选微注射到蛙卵母细胞。
转基因非-人动物
本发明还涉及产生转基因非人动物，优选转基因小鼠的方法，该方法包括将本发明的多核苷酸或载体导入生殖细胞、胚胎细胞、干细胞或卵或者从它们得到的细胞。非-人动物可以按照此处描述的本发明的筛选方法使用并且可以是非-转基因健康动物，或者可以有磷酸摄入或再吸收失调，优选由调节CRH信号化的蛋白质中至少一个突变导致的失调。这些转基因动物很适于，例如，与上述多肽的突变形式有关的药物的药理学研究。可以，例如，如A.L.Joyner编者，GeneTargeting，A Practical Approach (1993)，Oxford UniversityPress描述的实施转基因胚胎的产生和这些胚胎的筛选。使用例如，DNA印迹，用适宜的探针可以分析胚胎的胚胎膜的DNA；见如前。
优选地，本发明的转基因非-人动物还含有相应哺乳动物CRH调节蛋白-编码基因的至少一个失活的野生型等位基因；见如前。该实施方案允许例如，研究根据本发明的多肽的各种突变形式的相互作用对CRH代谢中疾病相关的失调的临床症状的发作的影响。此前关于转基因动物讨论的所有应用也应用于携带两个、三个或更多转基因；例如编码中性内肽酶(NEP)的动物。还希望使调节CRH信号化表达或者处于该转基因动物的发育和/或生命的一定阶段的功能失活。这可以通过使用，例如，组织特异的、发育和/或细胞调节的和/或可诱导的启动子，该启动子驱动例如，针对编码能够调节CRH信号化的蛋白的RNA转录物的反义或核酶的表达，来实现；也见上文。适宜的可诱导的系统为例如四环素-调节的基因表达，如例如，Gossen和Bujard(Proc.Natl.Acad.Sci.89 USA(1992)，5547-5551)和Gossen等人(TrendsBiotech.12(1994)，58-62)所描述的。类似地，通过这些调节元件可以控制调节CRH信号化的突变蛋白的表达。
此外，本发明还涉及含有(优选稳定整合到其基因组)根据本发明的核酸或者其部分的转基因哺乳动物细胞，其中该核酸分子或者其部分的转录和/或表达导致调节CRH信号化的蛋白质的合成的减少。
在优选的实施方案中，通过反义、有义、核酶、共抑制和/或显性突变体效应实现减少。“反义”和“反义核苷酸”指阻碍天然发生的基因产物的表达的DNA或RNA构建体。
根据本发明的多核苷酸的提供打开了产生具有如上述的蛋白质的降低的水平并，从而，具有磷酸代谢缺陷的转基因非-人动物的可能性。怎样实现该可能性的技术是本领域中技术人员熟知的。这些技术包括，例如，反义-RNA、核酶或者组合反义和核酶功能的分子和/或提供共-抑制效果的分子的表达；也见上文。当使用反义方法减少调节细胞中CRH信号化的蛋白质的量时，编码反义-RNA的核酸分子对于用于转化的动物种类优选为同源来源。然而，还可能使用表现出与编码调节CRH信号化的蛋白质的内源发生的核酸分子具有高度同源性的核酸分子。在这种情况中，同源性优选高于80％，特别优选高于90％，更优选高于95％。转基因哺乳动物细胞中根据本发明的蛋白质的合成的减少可导致例如腺嘌呤再吸收的改变。在含有这些细胞的哺乳动物中，这可导致各种生理的、发育的和/或形态的改变。
从而，本发明还涉及含有上述转基因细胞的转基因非-人动物。这些动物可以表现出，例如，与野生型动物相比CRH代谢中的不足，这是由于外来DNA的稳定或暂时存在导致至少一种下面的特征：
(a)编码能够调节CRH信号化的内源基因的破坏；
(b)针对含有本发明的多核苷酸的转录物的反义RNA和/或核酶的至少一种的表达；
(c)本发明的多核苷酸的有义和/或不翻译的mRNA的表达；
(d)本发明的抗体的表达；
(e)本发明的调节序列的功能或非功能拷贝的掺入；或
(f)本发明的重组DNA分子或载体的掺入。
使用本发明的多肽、它们的编码多核苷酸和载体，现在可能研究体内和体外关于调节患者的CRH信号化的蛋白质中特定突变的药物的效率和受到影响的表型。此外，本发明的多肽的突变形式可用于确定药物的药理学图谱和鉴定和制备其他药物，这些药物可有效治疗与CRH代谢有关的失调，尤其改善CRH诱导的紧张或抑郁症。
从而将明白本发明还涉及预防、治疗或改善与包括CRH受体相关的失调的CRH代谢失调有关的医学病症的方法，该方法包括对哺乳动物受试者使用治疗有效量的本发明的多肽、编码能够调节CRH信号化的蛋白质的多核苷酸或者载体。
诊断试验
本发明还涉及本发明的多核苷酸作为诊断试剂的用途。通过与功能异常相关的SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQID NO.9、SEQ ID 11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ IDNo.38和SEQ ID No.40的多核苷酸为特征的基因的突变形式的检测将提供一种诊断工具，其可辅助，或者限定疾病，或者对疾病的易感性的诊断，该疾病，或者对疾病的易感性来自该基因的表达不足、过表达或者改变的空间或时间上的表达。通过各种技术可以在DNA水平上检测携带该基因突变的个体。
从而将明白本发明提供了诊断与CRH活性失调相关的受试者中的病理状况或者对病理状况的易感性的方法，该方法包括：
(a)确定根据本发明的多核苷酸中突变的存在或不存在；和
(b)基于所述突变的存在或不存在检测病理状况或者对病理状况的易感性。
用于诊断的核酸可从受试者的细胞，如从血液、尿、唾液、组织活检或尸检材料得到。基因组DNA可直接用于检测或者在分析前使用PCR或者其他扩增技术酶促扩增。RNA或者cDNA也可以以类似方式使用。通过与正常基因型比较扩增产物的大小的改变检测缺失和插入。将扩增的DNA与根据本发明的标记的核苷酸序列杂交可以鉴定点突变。通过RNA酶消化或者通过熔解温度的差异可以将完美匹配的序列与错配的双链体区别。通过改变毛细管电泳柱或者凝胶中的DNA片段的电泳迁移率，使用或不使用变性剂，或者通过直接DNA测序(例如，Myers等人，Science(1985)230：1242)也可以检测DNA序列差异。通过特定限制性内切酶、核酸酶保护测定法，如RNase和S1保护或者化学切割方法也可以揭示特定位置的序列变化(见Cotton等人，ProcNatl Acad Sci USA(1985)85：4397-4401)。在另一实施方案中，可以构建含有编码能够调节CRH活性的蛋白的核酸序列或者其片段的寡核苷酸探针阵列以实施例如基因突变的有效筛选。阵列技术是熟知的并且具有普遍适用性并且可用于处理分子遗传学中的各种问题包括基因表达、遗传连锁，和基因变异性(见例如：M.Chee等人，Science，卷274，610-613页(1996))。
该诊断试验提供了通过用所描述的方法检测CRH调节蛋白-编码基因中的突变诊断或确定对疾病的易感性的方法。此外，通过包括从来自受试者的样品确定多肽或者mRNA的异常减少或增加的水平，以及通过从所述样品确定与正常结构(见上面)相比蛋白质衍生物的存在的方法诊断这些疾病。可以使用用于多核苷酸定量的本领域中熟知的方法的任一种在RNA水平上测量减少或增加的表达，该方法为如，例如，核酸扩增，例如，通过PCR、RT-PCR；RNA酶保护；RNA印迹和其他杂交方法。可用于确定来自宿主的样品中蛋白质，如本发明的多肽的水平的测定技术是本领域中熟知的。这些测定方法包括放射免疫测定法、竞争-结合测定法、蛋白质印迹分析和ELISA测定法。可用于确定蛋白质衍生物或变体的存在的测定技术包括质谱法。
从而，另一方面，本发明提供了诊断长期CRH暴露的失调有关的受试者中病理学状况或者对病理学状况的易感性的方法，该方法包括：
(a)确定生物学样品中根据本发明的多肽或者其衍生物的存在或者表达量；和
(b)基于该多肽或者其衍生物的存在或者表达量诊断病理学状况或者对病理学状况的易感性。
具体地，本发明提供了诊断个体中CRH诱导的基因表达的方法，所述方法包括：
a)得到所述个体的生物学样品；和
b)确定所述生物学样品中调节促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)信号化的至少一种蛋白质的量；其中调节促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)信号化的蛋白选自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41。在备选实施方案中，诊断CRH诱导的表达谱的方法不限于根据本发明的至少一种蛋白，但是需要同时评估所鉴定为与CRH信号有关的蛋白质组，即具有氨基酸序列SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的蛋白质的表达水平。
优选地，在蛋白质水平上，优选使用结合该蛋白质的抗体，或者在基因转录水平上，优选使用结合编码选自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的氨基酸序列的多核苷酸的探针确定所述蛋白质的量。
备选地，通过评估含有选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNO.5、SEQ IDNO.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID 11、SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ IDNO.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ IDNo.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、S EQ ID No.38和SEQ ID No.40的核酸序列的基因的基因转录水平确定CRH诱导的基因表达谱。确定基因转录水平的方法已经在上文中描述并且包括在优选的实施方案中使用结合、优选选择性结合选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNO.5、SEQ IDNO.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID 11、SEQ ID NO.13、SEQID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQID NO.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ IDNO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID No.38和SEQ IDNo.40的多核苷酸或者其互补序列的探针。在另一实施方案中，可以构建含有根据本发明的核苷酸序列或者其片段的寡核苷酸探针阵列以实施个体样品中基因转录水平的有效筛选。
在另一方面，本发明涉及诊断试剂盒，其含有：
(a)本发明的多核苷酸，优选SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNO.5、SEQ IDNO.6、SEQ IDNo.7、SEQ ID No.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID 11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID No.38和SEQ ID No.40的核苷酸序列或者其片段。
(b)与(a)的核苷酸序列互补的核苷酸序列；
(c)本发明的多肽，优选SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ IDNO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ IDNO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ IDNO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的多肽或者其片段；或
(d)本发明的多肽的抗体，优选SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的多肽和任选适宜的检测方法。
将明白在任何这种试剂盒中，(a)、(b)、(c)或(d)可以含有实质性组分。这种试剂盒将用于诊断疾病或对疾病的易感性，尤其CRH代谢相关的失调如CRH诱导的紧张或抑郁症。
本发明的核苷酸序列对于染色体定位也是有价值的。这些序列特异靶定，并可以与个人染色体上的特定位置杂交。根据本发明的染色体相关的序列的作图是将这些序列与基因-相关的疾病相互关联的重要的第一步。一旦序列被映射到精确的染色体位置，那么染色体上该序列的物理位置可以与遗传图数据相关联。这些数据在例如，V.McKusick，Mendelian Inheritance in Man(可通过Johns HopkinsUniversity Welch Medical Library在线获得)中发现。然后通过连锁分析(物理上相邻的基因的共遗传)鉴定已经被映射到相同的染色体区域的基因和疾病之间的关系。本发明的基因映射到人15号染色体。
也可以确定受影响和未受影响的个体之间cDNA或基因组序列的差异。如果在一些或者所有受影响的个体中但是没有在任一正常个体中观察到突变，那么该突变可能是该疾病的病因。
本发明的核苷酸序列对于组织定位也是有价值的。这些技术允许通过检测编码根据本发明的多肽的mRNA来确定这些多肽的表达模式。这些技术包括原位杂交技术和核苷酸扩增技术，例如，PCR。这些技术是本领域中熟知的。来自这些研究的结果指出生物中这些多肽的正常功能。
本发明的多肽或者它们的片段或它们的类似物，或者表达它们的细胞，也可用作免疫原以产生对本发明的多肽免疫特异的抗体。术语“免疫特异的”指抗体具有对本发明的多肽比它们对现有技术中其他相关多肽大得多的亲和性。
从而在另一实施方案中，本发明提供了与哺乳动物嘌呤通透酶具有免疫反应性的单特异抗体。在优选的实施方案中，所述抗体与具有选自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID  No.39和SEQ ID No.41的氨基酸序列的多肽和其功能类似物具有免疫反应性或者所述抗体封闭调节CRH信号的蛋白质的活性。
针对本发明的多肽的抗体可以通过使用常规方案，将该多肽或者含有表位的片段、类似物或者表达这些的细胞施用于动物，优选非人哺乳动物得到。对于单克隆抗体的制备，可以使用通过连续细胞系培养产生的抗体。实例包括杂交瘤技术(Kohler，G.和Milstein，C.，Nature(1975)256：495-497)、trioma技术、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等人，Immunology Today(1983)4：72)和EBV-杂交瘤技术(Cole等人，MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY，77-96页，Alan R.Liss，Inc.，1985)。
产生单链抗体，如美国专利号4,946,778中所描述的那些单链抗体的技术也可适用于产生针对本发明多肽的单链抗体。而且，转基因小鼠，或者其他生物，包括其他哺乳动物，也可以用于表达人源化抗体。
上述抗体可用于分离或鉴定表达表达该多肽的克隆或者通过亲和层析纯化这些多肽。
针对本发明多肽的抗体也可用于治疗CRH代谢相关的失调。
另一方面，本发明涉及基因工程化的可溶的融合蛋白，其包括本发明的多肽，或者其片段，和各种亚类(IgG、IgM、IgD、IgE)的免疫球蛋白的重链或轻链恒定区的各种部分。优选作为免疫球蛋白的是人IgG，特别是IgG I的重链的恒定部分，其中在铰链区发生融合。在具体实施方案中，通过切割序列的掺入可以简单地除去Fc部分，该切割序列可以用例如血液凝固因子Xa切割。此外，本发明涉及通过基因工程制备这些融合蛋白的方法，还涉及它们用于药物筛选、诊断和治疗的用途。本发明的另一方面还涉及编码这些融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白技术的实例可以在国际专利申请号WO 94/29458和WO 94/22914中发现。
治疗效用
本发明的另一方面涉及免疫/疫苗制剂(组合物)，其当导入哺乳动物宿主时，在该哺乳动物中诱导针对本发明的多肽的免疫应答，其中该组合物含有本发明的多肽或者多核苷酸。疫苗制剂可以还含有适宜的载体。因为多肽可以在胃中分解，所以其优选肠胃外(例如，皮下、肌内、静脉内，或者皮内注射)施用。适于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性无菌注射液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑茵剂和使得制剂与接受者的血液等渗的溶质；和水性和非水性无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂或增稠剂。该制剂可以在单剂量或者多剂量容器，例如，密闭的安瓿和小瓶中提供并且可以保存在冰冻干燥的条件中，仅需要在使用前加入无菌液体载体。该疫苗制剂还可包括用于增强制剂的免疫原性的佐剂系统，如水包油系统和本领域中公知的其他系统。剂量将依赖于疫苗的特异活性并且可通过常规实验方法容易地确定。
在再一个方法中，可以使用表达阻断技术抑制编码调节CRH信号化的蛋白质的基因的表达。公知的这些技术包括使用反义序列，其或者是内部产生的或者是外部施用的(见，例如，O′Connor，J.Neurochem(1991)56：560；寡脱氧核糖核苷酸作为基因表达的反义抑制剂，CRC Press，Boca Raton，FL(1988))。备选地，可以提供与基因形成三螺旋(“三链体”)的寡核苷酸(见，例如，Lee等人，Nucleic Acids Res(1979)6：3073；Cooney等人，Science(1988)241：456；Dervan等人，Science(1991)251：1360)。这些寡聚体本身可被施用或者可以体内表达相关的寡聚体。合成的反义和三链体寡核苷酸可含有修饰的碱基或者修饰的主链。修饰的主链的实例包括甲基磷酸酯、硫代磷酸酯或肽核酸主链。这些主链被掺入反义和三链体寡核苷酸中以提供保护防止核酸酶降解并且是本领域中熟知的。用这些和/或其他修饰的主链合成的反义和三链体分子也形成本发明的部分。
在用于抑制细胞中靶基因表达的另一方法中，具有部分和完全双链特征的RNA被导入细胞或者胞外环境。抑制是特异的，因为选择来自靶基因的一部分的核苷酸序列产生抑制性RNA。该RNA可含有聚合的核糖核苷酸的一条或多条链；其可以包括对磷酸酯-糖主链或者核苷的修饰。通过单条自身-互补RNA链或者两条互补链可以形成双链结构。抑制是序列-特异的，因为相应于RNA的双链体区的核苷酸序列被靶定用于基因抑制。优选含有与靶序列的一部分相同的核苷酸序列的RNA。可以在国际专利申请WO 99/32619中发现RNA抑制技术的实例。
此外，调节CRH信号化的蛋白质的表达可以通过使用对编码所述蛋白质的mRNA序列特异的核酶来防止。核酶是具有催化活性的RNA，其可以是天然的或合成的(见例如Usman，N，等人，Curr.Opin.Struct.Biol(1996)6(4)，527-33)。可以设计合成的核酶以在所选的位置特异切割前述mRNA，从而防止所述mRNA翻译成功能多肽。可以合成具有天然核糖磷酸酯主链和天然碱基的核酶，如通常在RNA分子中发现的。备选地，可以合成具有非天然主链的核酶，例如，2’-0-甲基RNA以提供对核糖核酸酶降解的保护，并且可以含有修饰的碱基。
对于治疗与调节CRH信号化的蛋白质的表达不足有关的异常病症，也可以利用几种方法。一种方法包括对受试者施用治疗有效量的激活本发明的多肽的化合物，例如，如上述的激动剂，结合药学上可接受的载体，从而减轻异常病症。备选地，可以使用基因治疗来影响受试者的相关细胞内源产生哺乳动物嘌呤通透酶。例如，可以将本发明的多核苷酸工程化以在复制-缺陷的逆转录病毒载体中表达，如上面讨论的。然后逆转录病毒表达构建体可被分离并导入用含有编码本发明的多肽的RNA的逆转录病毒质粒载体转导的包装细胞中，从而该包装细胞产生含有目标基因的感染性病毒微粒。这些生产者细胞可被施用于受试者以体内工程化细胞并体内表达多肽。对于基因治疗的综述，见Human Molecular Genetics，T Strachan和A P Read，BIOSScientific Publishers Ltd(1996)中第20章：基因治疗和其他基于分子遗传学的治疗方法(和其中引用的参考文献)。另一种方法是施用治疗量的本发明的多肽与适宜的药物载体相组合。
另一方面，本发明提供了含有治疗有效量的多肽，如本发明多肽的可溶形式，激动剂/拮抗剂肽或者小分子化合物，与药学上可接受的载体或赋形剂相组合的药物组合物。这些载体包括，但不限于，盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇和它们的组合。本发明还涉及药物包装和试剂盒，它们含有装有一种或多种本发明的前述组合物的成分的一个或多个容器。本发明的多肽和其他化合物可以单独使用或者与其他化合物，如治疗性化合物联合使用。
该组合物将被适应于施用途径，例如，通过全身的或者口服途径。全身性施用的优选形式包括注射，通常通过静脉内注射。可以使用其他注射途径，如皮下、肌内或者腹膜内注射。全身性使用的备选方法包括使用渗透剂如胆汁盐或者梭链孢酸或者其他去污剂透粘膜和透皮施用。此外，如果本发明的多肽和其他化合物可以制备成肠或者胶囊化制剂，那么经口施用也是可能的。这些化合物的施用也可以是局部和/或局部化的，为贴剂、药膏、糊剂、凝胶剂等的形式。
所需要的剂量范围依赖于本发明的多肽和其他化合物的选择、施用途径、制剂的性质、受试者病症的性质，和主治医生的判断。然而，适宜的剂量为0.1-100μg/kg受试者。然而，考虑到可利用的化合物的多样性和各种施用途径的不同效率，可以预期所需剂量的宽的变化。例如，口服施用预期比通过静脉内注射施用需要更高的剂量。使用用于优化的标准经验常规可以判断这些剂量水平的变化，如本领域中所熟知的。
也可以在受试者内内源地产生用于治疗的多肽，这在治疗模式中通常被称为如上述的“基因治疗”。从而，例如，来自个体的细胞可被多核苷酸，如DNA或RNA工程化以体外编码多肽，以及例如，通过使用逆转录病毒治疗载体。然后将细胞导入受试者中。
通过参考下面的实验细节可以更好地理解本发明，但是本领域中技术人员将容易明白这些实验细节仅用于阐明本发明，其在后面的权利要求书中更完全地描述。此外，在该申请书的全文中，应用了各种出版物。这些出版物的公开在此处被并入本申请的参考文献中以更完整地描述本发明所属的本领域的状态。
实验程序
动物舍饲和处理-CRF过表达C57BL/6J转基因雄性小鼠(CRF-OE或TG)和它们的野生型同窝出生仔畜(WT)被维持在特定无病原的设施中，该设施满足对于动物照管的所有国际和欧洲要求。实验开始前动物单独居住在环境-受控的动物群体中4周，具有12h黑暗-白天循环(在7：00EST照亮)，可以自由接近食物和水。处理前，3月龄的小鼠被随机化成三组，每组含有4只野生型和4只转基因动物。一个组不接受处理，第二组接受媒介物注射5天，每天2次(10％环葡聚糖(CD)，pH 4)，第三组按照相同的方案接受10％CD中的10mg/kg CRH-R1特异拮抗剂R121919。最后处理16小时后，动物被处死以解剖脑区并随后分离RNA。
样品制备-从转基因和野生型动物宏观地解剖下面的脑区域：垂体、小脑、颞区、海马、额叶皮质，和伏隔核。使用Ultra-turrax T25研磨机(IKA-labortechnik)将脑组织在Trizol(Invitrogen LifeTechnologies)中匀浆。根据生产商的使用说明书用Trizol提取总RNA。使用Rneasy试剂盒(Qiagen)，在柱上用DNAseI处理进一步纯化总RNA。
微阵列杂交-如下制备cRNA。使用T7-oligo(dT)24-引物和SuperscriptII RT(Invitrogen Life Technologies)对10μg总RNA在42℃实施逆转录1h。用大肠杆菌DNA聚合酶I、DNA连接酶和RNAseH(Invitrogen Life Technologies)在16℃进行2h的第二条链cDNA合成。用相-锁定凝胶(Eppendorf)进行苯酚-氯仿萃取后，使用Bioarray高产率RNA转录物标记试剂盒与生物素标记的核糖核苷酸(Enzo Diagnostics)在37℃实施体外转录6h。CRNA产物在QiagenRneasy柱上纯化并在95℃片段化35分钟。cRNA产率为50到100μg。在GeneChips(Affymetrix，Santa Clara，CA)上处理样品。为了检查每个样品的质量，将5μg标记的cRNA在Test 2-阵列上运行。实际的实验在鼠基因组U74Av2阵列上实施，该阵列含有检查约12,000个全长小鼠基因和来自UniGene database(Build 74)的EST簇的探针组。在持续旋转下用15μg cRNA于45℃实施杂交16h。将阵列在Affymetrix Fluidics工作台(station)中用链霉抗生物素蛋白/藻红蛋白(SAPE)染色，然后用抗-链霉抗生物素蛋白的抗体染色并进行第二次SAPE染色。随后，用HP-激光扫描仪扫描阵列并用MicroarraySuite Software(Affymetrix)分析数据。在该阶段不进行分级或者标准化。基于当前调用(present calls)百分数(见表)评估实验的质量。
  区域   当前调用   3’/5’β-肌动蛋白   3’/5’GAPDH
  颞区   46.15±1.98％   1.96±0.53   1.46±0.38
  海马   46.27±1.89％   1.58±0.39   1.22±0.29
  小脑   47.14±2.13   1.67±0.37   0.97±0.08
  额叶皮质   44.68±2.23   1.85±0.39   1.29±0.26
  伏隔核   44.27±2.11   2.69±0.85   2.52±1.20
  垂体   45.33±1.67   1.53±0.28   1.25±0.21
具有RNA的低产率或者低百分比当前调用或者偏离的3’/5’比例的样品从随后的分析中省略。用于分析的动物的数目在表中显示。
  WT未处理的   WT媒介物   WTR121919   TG未处理的   TG媒介物   TGR121919
  颞区   4   4   4   3   4   3
  海马   4   4   4   3   3   4
  小脑   3   4   4   3   4   3
  额叶皮质   3   4   4   3   4   4
  伏隔核   4   3   4   4   3   4
  垂体   4   4   4   4   3   4
数据分析和基因的选择
使用下面的算法将每个阵列上的原始强度标准化：
基本上该校准将一个阵列的平均强度设定为所测的平均值，该标准化弥补了杂交、洗涤和染色中阵列与阵列的差异，最终允许阵列之间合理的比较。标准化后，使用加权光谱作图分析(SMA)(7)分析数据。加权光谱作图是一种无监督的多变量分析方法，其包括与代表解释数据集内方差的大多数的两种最高的主要组分的专门的可视化相组合的数据的双中心化。尽管双中心化除去了阵列数据的“大小”成分，但是通过代表各自样品(通过正方形描绘)和基因(通过圆圈描绘)的大小的符号的面积，该信息在可视化中被再次导入。所剩下的是不同基因之间的对比和数据表的不同样品的对比。这些对比可表达为由于通过该算法实施的对数转换导致的比。该对比可被理解为不同样品的不同基因的特异性。相反地，它们还指对于这些基因的一些的不同样品的特异性和优选性。因此，可以声明SMA提供了基因和样品之间相互作用的可视化。该方法允许减小大的微阵列数据集和提供可视地检查从而鉴定数据中的基因簇和/或受试者。从而，在光谱图样品中，群集在一起的样品可被解释为相似的。相应地，位于轴和中心的相反位置的样品可被解释为不相似的。
除了该总的分析，还使用微阵列数据的显著性分析(SAM)(8)鉴定了组间具有不同表达水平的个别基因。SAM通过吸收一组基因-特异的t-检验鉴定在表达中具有统计学显著的改变的基因。与经典t-检验相比，该基因特异的t-检验不仅考虑对特定基因所观察的方差，而且还包括覆盖测量的所有基因的总方差的通常所说的误差系数(fudgefactor)。具有高于阈值的得分的基因被认为是潜在显著的。为了估计这些潜在显著变化的基因之间的假阳性数目，SAM使用排列来估计假发现率。为此，对测量的排列迭代计算t-值。可以调整阈值以鉴定更小或更大的基因组，并计算相应的FDRs。除了影响显著改变的基因的数目和相应FDR的阈值delta，可以使用成倍改变阈值以抛弃在样品之间的表达中仅表现出有限差异的基因。这些改变可能来自几乎无显著性的生物学观点。
用OmniViz程序实施了在给定脑区域上得到的表达数据的K-方法聚类。除了所有样品中缺乏的所有记录并将小于20的所有信号设为20。这允许具有相似行为的基因的聚类。
定量RT-PCR-使用实时PCR分析证实微阵列数据。使用随机六聚物引物和SuperscriptII RT(Invitrogen Life Technologies)对0.5μg总RNA实施第一条链cDNA合成。用Taqman PCR试剂盒在ABIPrism 7700循环仪(Applied Biosystems)上实施定量PCR。cDNA的连续稀释液被用于产生相对β-肌动蛋白、CRH受体1(Crh-R1)、CRH受体2(Crh-R2)、神经降压肽受体1(Ntsr1)、神经降压肽受体2(Ntsr2)、神经降压肽受体3(Ntsr3)、11β-羟基类固醇脱氢酶1(Hsd11B1)、血清/糖皮质激素调节的激酶(Sgk)和目的基因(见引物序列表)的浓度的对数的循环阈值的标准曲线。从标准曲线计算的线性回归线容许确定来自每个脑区不同治疗组的RNA样品中的转录水平。
  β-肌动蛋白正向β-肌动蛋白探针β-肌动蛋白逆向  5′-CATCTTGGCCTCACTGTCCAC-3′5′-TGCTTGCTGATCCACATCTGCTGGA-3′5′-GGGCCGGACTCATCGTACT-3′
  CRF2正向CRF2探针CRF2逆向  5′-GGGAGAACAGAAGCGCCTG-3′5′-AGAAGGGTGAGGATCCCCCAAATCAGAGT-3′5′-CCCTTGTTTCAATCACTCCCA-3′
  CRF1正向CRF1探针CRF1逆向  5′-TTTCTGAACAGTGAGGTCCGC-3′5′-CCGGAAGAGGTGGCGGCGA-3′5′-GGGCTCTGATGGAGTGCTTG-3′
  Nst1正向Nst1探针Nst1逆向  5′-CGCCGCCGAAAGAAGAG-3′5′-CCAACGTTCTCCAGGAAGCCAAACAG-3′5′-ACGCATGGTTGCTGGACAT-3′
  Nst2正向Nst2探针Nst2逆向  5′-TGGTGACCAACACGCTCTTCT-3′5′-TCAGCTCGGCAGTGACCCCA-3′5′-AGGAAGACACGGCGTTGTAGA-3′
  Nst3正向Nst3探针Nst3逆向  5′-GGAAGCCGGAGAACAGCAA-3′5′-TGCGACGCTACCGCAAAGAACA-3′5′GGATATGAAGGCTGCACTCGTT-3′
  Sgk正向Sgk探针Sgk逆向  5′-TGGACCAATGCCCCAGTT-3′5′-TCAGTCAAAGCCGTTGGTGTTTTCATTG-3′5′-GCCCGTTTTATAGGTGACATTTTAA-3′
  Hsd11b1正向Hsd11b1探针Hsd11b1逆向  5′-GGGATAATTAACGCCCAAGCTT-3′5′-CCCAAGGAGGAGTGCGCCCT-3′5′-AGAGCTGTGCCTTTGATGATCTC-3′
放射自显影-如以前由Moyse等人(12)描述的实施对成年雄性C57BL/6J小鼠和它们的野生型同窝出生仔畜的脑实施神经降压肽结合和膜放射显影。将20微米厚的切片与含有0.1％牛血清白蛋白、1mMEDTA、5×10-5M杆菌肽、2μg/ml胰凝乳蛋白酶抑制剂和4μg/ml亮肽素的50mM Tris-HCl，pH7.4中的0.1nM单碘代[125I]Tyr3-神经降压肽(2200Ci/mmol，Perkin Elmer)孵育。在1μM天然神经降压肽存在下孵育额外的切片评估非特异染色。在1μM左卡巴斯汀——一种Nts2拮抗剂存在下对海马切片实现了[125I]神经降压肽结合与Nts2封闭。用MCID M4数字分析仪(Imaging Research，St Catharines，ON，加拿大)实施了膜放射显影的光密度分析。在每张切片上结构被交互地描绘并在所描绘的区域内测量了象素灰色水平。用共-暴露的125I-标准将象素灰色水平转化成每毫克组织的放射性并将其在所测量区域内平均。用SPSS 11.0软件通过双向ANOVA和伴随的Bonferroni′s事后检验统计分析数据。
结果与讨论
为了研究长期CRH施用对中枢神经系统的影响，发明人将来自CRH过表达小鼠的脑区中的基因表达谱与它们的野生型同窝出生仔畜的相比较。此外，我们研究了CRH-R1拮抗剂施用对这些表达谱的影响。在该研究中研究的脑区包括垂体、伏隔核、额叶皮质、颞区、海马和小脑。使用定量实时RT-PCR(RTq)测量了CRH受体1(CRH-R1)和2(CRH-R2)的表达。尽管可以容易地检测CRH-R1，但是对于这些脑区中的CRH-R2没有得到可靠的测量。这些脑区中CRH受体的所观测的表达水平符合以前报导的小脑和额叶皮质中CRH-R1的高水平和CRH-R2的低表达水平，CRH-R2主要是外周受体(见图1)(9)。
在含有12000个鼠EST的阵列上分别处理了从来自不同动物的不同脑区分离的RNA。标准化后，分析每个脑区的数据。用光谱图分析(SMA)实施数据的第一次通过检查，使得可以对与处理组和基因型相关的基因表达应答进行总的图像解释。SMA指出对于除了垂体之外的所有区域，治疗组之间的表达没有总的改变。在所有脑区中，来自转基因动物(Tg)的多数样品与来自野生型动物(WT)的样品相比在不同位置聚集。这在垂体水平上是最明显的，其中在光谱图中在Tg和WT动物之间观察到表达模式的明显不同，样品聚集在相反的位置。一起考虑，这些数据表明终生暴露于CRH诱导所有研究的脑区中基因表达谱的改变，在垂体中观察到最显著的影响。用CRH-R1拮抗剂处理5天对表达谱的这些改变没有影响(或仅限于有限程度)，如通过垂体光谱图所示例的。
为了鉴定显著变化的基因，应用了微阵列数据的显著性分析(SAM)算法。按照SMA，仅仅发现有限数目的基因在大多数脑区中显著变化(见补充信息)。然而，在垂体中，WT和TG动物有300种以上的基因差别表达。CRH过表达小鼠的所研究的脑区中基因表达谱阐明了存在于这些动物中的以前未认识到的内环境稳定机制。一般地，所观察的表达谱指出在转基因动物(TG)中受到影响的一些途径。
TG动物的血浆糖皮质激素水平高于WT动物6-8倍(见图3)。结果，基因表达谱表现出对皮质酮的这些高水平的适应。这通过糖皮质激素受体信号化的增强子如海马中I型11β-羟基类固醇脱氢酶(11B-HSD1)的下调和该信号途径的假定抑制剂如FK506结合蛋白5(Fkbp5)的上调来实现(见图4)。
组织糖皮质激素浓度不仅由血浆激素水平决定，而且由两种胞内11β-羟基类固醇脱氢酶(1和2型)决定，这两种胞内11β-羟基类固醇脱氢酶局部互变活性糖皮质激素和惰性11-酮形式。11β-HSD1(脑中的主要同种型)似乎作为主要的11β-还原酶，从11-酮形式再生活性糖皮质激素。通过研究11β-HSD1缺陷小鼠，阐明了通过11β-HSD1的糖皮质激素的胞内再生在HPA-轴控制中起重要作用。相应抑制压力，这些小鼠表现出放大的ACTH和皮质酮水平。此外，11β-HSD1缺陷小鼠对于HPA活化的外源皮质醇抑制较不敏感，表明这些动物中减小的糖皮质激素反馈。考虑到CRH过表达者的海马中11β-HSD1的显著下调，可以想象这些小鼠具有改变的糖皮质激素反馈。
发现在试验的所有脑区中Fbp5被上调，尽管在一些中显著，所有其他的表现出类似的倾向(图4)。观察到亲免素Fkbp5和Fkbp4的交换是糖皮质激素受体(GR)活化的重要的第一步，这一观察是有趣的。在松鼠猴和一般地New World灵长类属中，Fkbp5已经被鉴定为糖皮质激素受体结合的强烈抑制剂。我们对Fkbp5的诱导的观察可被解释为对循环的糖皮质激素持久高水平应答中GR的减弱。
改变的糖皮质激素信号化的另一指征是小脑、伏隔核和颞区中血清/糖皮质激素激酶(Sgk)的上调(图4)。Sgk是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶，其转录被糖皮质激素和血清诱导并且受到不等渗和等渗细胞体积变化的调节。在大鼠脑中，已经表明颞叶(包括海马)中脱水增加Sgk mRNA水平。在同一研究中，阐明Sgk显著增加了神经元K+通道Kvl.3的活性，表明Sgk可能参与神经元兴奋性调节。有趣的是Sgk促进大鼠中空间学习的记忆巩固。表明Sgk在快速学习者对缓慢学习者中差别表达，此外还阐明Skg转染到海马的CA1区导致水迷宫成绩提高(10)。在该方面，显著的是尽管该研究阐明CRH过表达者表现出高水平Sgk mRNA，但是已经报导这些动物表现出高度学习不足(11)。
发现在除了垂体之外的包括海马和伏隔核的一些脑组织中神经降压肽受体2(Ntsr2)被下调(见图5)。神经降压肽(NT)是一种十三肽，其被发现以高浓度存在于CNS的许多区域，其中其发挥神经递质和神经调节剂的角色。当NT被通过脑室内注射施用时，观察到各种CNS效应，包括低行动、低温、痛觉消失和食物消耗减少。已经鉴定了NT的三种受体(Ntsr1、2和3)。Ntsr1缺陷小鼠的研究表明该受体是NT对体温、进食行为和低行动的效应的原因。Ntsr2另一方面似乎是NT的痛觉消失效应的原因，如通过在小鼠脑中应用反义策略所阐明的。Ntsr2下调的观察促使我们通过RTq研究NT受体家族的其他成员的表达水平。在所有试验的区域中Ntsr3不表现出表达变化。相比，Ntsr1在CRH过表达中被显著下调，该效果在海马中最明显(图5)。下调水平对于Ntsr1比对Ntsr2更高。显著的是与未处理的动物相比媒介物处理的动物(tg和Wt)中Ntsr1和Ntsr2都被上调。表达水平的这种增加在R121919处理的动物中被消除，表明反复紧张诱导的Ntsr1的表达(Ntsr2程度较小)并且该诱导可以被CRH-R1拮抗剂逆转(甚至最后处理后16小时)。我们的数据第一次表明CRH过表达动物中CRH和NT系统之间的联系并提出这些NT受体在反复紧张中的角色。
为了评价蛋白质表达水平上Nts1和Nts2mRNA的变化，我们通过结合在脑切片上的[125I]NT的放射自显影评估了受体表达(Nts1-3)。所产生的数据阐明了在CRF-OE对WT动物中与海马的CA1-CA2区(21.8±3.0％，p＜0.05)和前扣带皮质(-22.2±2.7％，p＜0.05％)接近的放射层中总体上非选择的(Nts1-3)、遗传确定的[125I]NT结合能力的下调(图6)。在嗅球、伏隔核和隔膜中没有观察到变化。
WT和CRF-OE动物中，与未处理的动物相比，媒介物处理的动物[125I]NT结合能力没有改变。然而，CRF1拮抗剂R121919的亚慢性施用导致在WT和CRF-OE动物中与媒介物处理的动物相比，对邻接CA1-CA2区域的放射层的[125I]NT结合能力的向上的趋势(p＝0.057)。此外，R121919处理的CRF-OE动物中[125I]NT结合水平等于在未处理的WT-动物中测量的水平(图6)。
为了区别不同的受体，在饱和浓度的左卡巴斯汀(一种Nts2特异拮抗剂)存在下实施[125I]NT结合实验。基于前面的结合实验的结果，我们集中于海马脑切片(图7)。与WT动物相比，在CRF-OE中，放射层(-63.8±6.5％，p＜0.001％)、retroslenial粒状皮质(-49.4±7.5％，p＜0.001％)和额叶皮质(-34.8±3.5％，p＜0.001％)中[125I]NT结合能力被下调。
尽管在WT和CRF-OE媒介物处理的小鼠的海马中，Nts1 mRNA水平被上调(图5)，但是在[125I]NT结合水平上在载体处理的动物中没有观察到这种改变(图6和7)。当与WT动物相比时，CRF-OE中海马和前扣带皮质的放射层中对Nts1-3的总体[125I]NT结合能力被下调(图6)。此外，当我们用Nts2特异拮抗剂左卡巴斯汀封闭Nts2受体时，与WT-同窝出生仔畜相比，CRF-OE动物中海马、retrosplenial粒状皮质和额叶皮质的放射层中[125I]NT结合能力被下调地甚至更显著(图7)。虽然Nts3也在所提及的区域中表达，但是Nts3对NT的亲和性比Nts1对NT的亲和性的低的多，表明[125I]NT主要结合到Nts1。此外，由于在Rtq中没有看到Nts3 mRNA中的变化，我们将该下调完全归因于Nts1。
惊人地，在载体处理的CRF-OE和WT动物中Nts1(Nts2较不显著)mRNA表达被上调。该mRNA增加可能被反复注射压力所诱导并且通过CRF1拮抗剂R121919的亚慢性施用可以抵消。然而，这没有在受体水平上被翻译。在未处理的和载体处理的WT和CRF-OE小鼠中[125I]NT表现出对Nts1的相当结合(图6，7)。然而，在总NT结合水平上，R121919抵消了[125I]NT结合的下调。在CRF-OE中，R121919将放射层中[125I]NT结合水平增加到等于未处理的动物中的水平(图6)。这可以暗示CRF1受体与NT受体的表达的调节有关。
以前的报导表明糖皮质激素增加原代下丘脑神经元培养物和室周下丘脑核(PVN)中NT mRNA表达(+92％)和NT-释放(+100％)(Nicot等人，1995；Scarceriaux等人，1995；Souaze等人，1997)。有趣地，不同的应激子像在冷水中强迫游泳一样，固定压力和尾巴振动压力也引起大鼠的PVN和中央扁桃体核中NT mRNA的增加。轮到NT时，其可以导致HPA-轴活化，如通过脑室内施用所阐明的。该活化可被α-螺旋CRF(一种非特异的CRF拮抗剂)和SR-48450(一种Nts1-2拮抗剂)所封闭(Azzi等人，1998；Lepee-Lorgeoux等人，2000；Nicot等人，1994；Rowe等人，1995)。高NT水平也下调Nts1和Nts2(Hermans和Maloteaux，1998)。可以提出CRF-OE中Nts1-2的所观察的下调与它们上升的糖皮质激素水平有关。该观点可被如下观察支持：皮质醇过多症或者地塞米松施用导致PVN中Nts1 mRNA的选择性下调(40-70％)(Nicot等人，1995)并且地塞米松减少了原代下丘脑神经元培养物中[125I]NT结合(Scarceriaux等人，1996)。从而，Nts1-2下调可能因此防止进一步NT-诱导的CRF释放。一并考虑，这些数据证明了边缘脑区中HPA-轴和NT-系统之间明显的联系。因此NT-系统除了以前提出的在精神分裂症和疼痛抑制中的角色，在反复压力和焦急中也有调节作用。
受影响的其他途径包括细胞内钙信号/感觉(hippocalcin样1、钙周期蛋白，...)、成髓鞘(髓磷脂、髓鞘相关糖蛋白，...)、细胞增殖和神经发生(Edg2、Id2、GAB1，...)和胞外基质形成(核心蛋白聚糖、brevican，...)。
Hippocalcin样1(Hpcall)属于神经元钙传感家族的Ca2+-结合蛋白，它们在各种过程中起作用，这些过程包括神经递质释放的调节、环核苷酸代谢的控制、磷酸肌醇的生物合成和离子通道的间接调节。已经阐明hippocalcin可能加强保护以防止神经元凋亡抑制剂(IAPs)蛋白施加的凋亡。
在编码与髓鞘形成、细胞增殖和细胞外基质形成有关的蛋白质的基因中观察到的表达的改变暗示CRH过表达者中神经发生的动力学中的改变。支持该观点的是主要在伏隔核中观察到的表达的改变，包括内皮分化溶血磷脂酸G-蛋白-偶联的受体2(Edg2)、生长因子受体结合的蛋白质2-相关的蛋白质1(Gab1)、DNA结合2的抑制剂(Id2)和成纤维细胞生长因子受体2(Fgfr2)。
由于垂体是CRH的主要靶器官，预期如存在于CRH表达者中CRH的长期上升的水平诱导转基因动物的垂体中表达谱的较大改变。垂体的活化状态由一些激肽释放酶的高表达水平例证，这些激肽释放酶在从垂体分泌的各种激素的加工中作为原蛋白质协同酶(proproteinconcerting enzymes)发挥作用。显著的是前脑啡肽原A水平的升高(Tg中比Wt中高10倍)和强啡肽原水平较低程度地升高(Tg中比Wt中高2倍)。该发现，即CRH过表达者中内源阿片样物质的升高的水平符合如下观点，即这些阿片样物质代表生物适应慢压力的主要调节系统，其平衡应激物置于脑上的应答，持续的压力应答可能产生潜在有害的效果。垂体中其他有趣的发现包括Bdnf mRNA水平的升高，Bdnf是脑中最普遍的神经营养因子之一，和囊状抑制性氨基酸转运蛋白(Viaat)的升高。该Bdnf的升高与急性和慢性压力降低海马中Bdfn水平的报导(11)形成对比。
总之，CRH过表达小鼠的一些脑区的基因表达谱阐明了存在于这些动物中的以前未认识到的内环境稳定机制。
与野生型同窝出生仔畜相比CRH过表达小鼠中变化的基因的鉴定容许该慢性垂体-肾上腺活化的动物模型的进一步分子表征。我们提供了在基因表达水平上评价长期暴露于CRH的后果的工具，其可以最终导致动物和人类中紧张、焦虑和抑郁症中新的标记物的使用。此外，我们阐明CRH-R1拮抗剂的施用不导致转基因动物中表达水平的总的“正态化”，尽管检测量垂体水平上该化合物的一些影响。此外，该治疗造成的反复压力似乎在特定基因如神经降压肽受体1的基因表达中引起应答。该效应可通过CRH-R1特异拮抗剂逆转，表明神经降压肽和CRH之间的密切联系。
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ggcttgtattttctaaaagaaacccatcaggattgtggatagaaaactgttatgaaaatctatgaaaaatcgaaatccctttcaaagcagacaattgaggcc
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agaatccatgaaaatgttccaattccacttttttcagggggtaggaagaacaggtaattagaacagagct
SEQ ID No.10
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SEQ ID No.11
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gacaccagcctgacagcttctgtggccaacctgctggctattgctatcgagaggcacatcacggttttccgcatgcagctccatacacgaatgagcaa
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tggctatgttcgccagaggactatgaggatgtctcggcatagttctggacccaggaggaatcgggacaccatgatgagccttctgaagactgtggtca
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tatacctttttttttttttacataatcgggttgatattgtaaaatgttttgtaactttttctttcagaattgccaggtttttctatggcattttttttcaaaaacgttagcg
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gggttcttgacaagatgtttcccaataacccagacccttaacataactagcaaatttactttagtaggaactggtgatccctttctggacacaagaaaaca
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gcttgtgtctggacagtcagtggtaggcatgtgacatttgcctggtggaaaaaaaataagtaggcggagatccagttagcaggacaaagattttgctcg
aggattcccccaatccaagaaatttaaactggaaatgagtgaaccgaacttggacttttattgattccccttttatgggggaggtaaggactatttgaattg
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tgtgatggcttctctctctgaccttctttaacagtctgaggcagcccaacaactgttcctttagctcagatactggttcctcatccatgagattcatgagaga
cgtgttacctcaatggaatgagtactagagcaaggtatttagagagattttttttattatttatttatttattttgaataaaatgtatgtataaataagataaaata
aa
SEQ ID No.12
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SEQ ID No.13
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ctgcacctaccagctggctagaggcatggagtacttggcttcccaaaaatgtatccatcgagatttggctgccagaaacgtgttggtaacagaaaaca
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gggattgctggcatgctgtaccctcacagagacccacattcaagcagttggtcgaagacttggatcgaattctgactctcacaaccaatgaggaatact
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SEQ ID No.14
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PTNCTNELYMMMRDCWHAVPSQRPTFKQLVEDLDRILTLTTNEEYLDLTQPLEQYSPSYPDTSS
SCSSGDDSVFSPDPMPYEPCLPQYPHINGSVKT
SEQ ID No.15
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cttcctcccagagcaaacacggaatgaatggctttttgcagcaacaaatgatgtatgactgcccaccgtcccggctgacatctgtctcgggagagtcc
agcctctataacctgcccaggagctattcccatgacgtgttgccaaaggaatccccatcaagcacggaggccgacggggagctgtacacctttaaca
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cggtctcctgtggaaacgtgtggagtcccacgcacggcctcggacactgacagcagttactgtatccctcctccagtaggcatgacgccctcccgga
gtaataccatttccaccgtggatttgaacaagttgcggaaagatgctagttctcaagattgctatgatattccacggacctttccgagcgatagatctagtt
ccctggaaggcttccatagccagtataaaatcaaaagcgtgttgacagcgggaggtgtctcgggtgaagagctggatgagaactacgttcccatgaa
ccccaactcgccacctcgacaacattccggcagctttaccgagccaatccaggagccaaactatgtgccaatgaccccagggacctttgacttttcttc
ctttggaatgcaagtccctcctcctgctcatatgggcttcaggtccagcccaaagacccctcccaggaggccagttcctgttgctgactgtgaaccacc
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cagatctcccatcaccaggagcttcgctcgggactcctctaggtttcccatgtcccctcggcctgattctgtgcacagtacgacatcgagcagcgactc
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cgatgaataaacccaaaggagacaaacaagtcgaatacctggatttagacctagattctgggaagtccacgccaccacggaagcaagagagcagt
ggttctggcagcagcatggcagacgagagggtggattacgttgtggtggaccaacagaagactctggccctgaagagtaccagagaagcttggac
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gtagtattactatactgatgcacgttttcatttaaaaccttgggtttgggtcttcccgatctaccttaacagactttccttgggaggtcttttggcctcctcacact
actctatataacaatactaagtgaactgagctacttgtaattctggaaattccagttgaagctacagggctaacaccattaaaacaagaagtaagttgaca
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SEQ ID No.16
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PEPNRTLFDSAKPTFSETDCNDNVPSHQTPASSQSKHGMNGFLQQQMMYDCPPSRLTSVSGESS
LYNLPRSYSHDVLPKESPSSTEADGELYTFNTPSGTAGVETQMRHVSISYDIPPTPGNTYQIPRTF
PESTLGQSSKLDTIPDIPPPRPPKPHPSHDRSPVETCGVPRTASDTDSSYCIPPPVGMTPSRSNTIS
TVDLNKLRKDASSQDCYDIPRTFPSDRSSSLEGFHSQYKIKSVLTAGGVSGEELDENYVPMNPN
SPPRQHSGSFTEPIQEPNYVPMTPGTFDFSSFGMQVPPPAHMGFRSSPKTPPRRPVPVADCEPPP
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GSGSSMADERVDYVVVDQQKTLALKSTREAWTDGRQSTESETPTKNVK
SEQ ID No.17
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cgtcctgaggtgctgcaggacctgcgggaacacacggaattcaccgaccatgagcttcaggagtggtacaagggcttcctcaaggactgccccact
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accaacagcgatggcaccatcgacttccgggagttcatcattgctctgagtgtgacctctcggggcaagctggaacagaagctcaagtgggccttta
gcatgtacgacctggacggcaatggctacatcagccgcagtgaaatgctggagatagtgcaggccatctacaagatggtgtcctccgtgatgaagat
gcctgaggacgagtccacgcccgagaagcgaacagacaagatcttcaggcagatggacacaaacaatgatggcaaactgtccctggaagaattca
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cgcaccctcctgacctggccaactgtggcttcctcctcctccagtccaggctggctccttccaatggttcaagtgttctcggctgtcgggctccttcctgc
ccacagagggcctggcggcccttaaggacaccagacaggacttttcagtatcttaccaagaccagctaatttattctatgatcccaggtgactttgtgag
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tggtatccttacttttaatatatgagttatttgtatggtgagatggactataatgttcagcccctgtatttaatgcctctgactgcctttgaagcatggtcccctg
tggcctgtgattccccccacccccaagtctggctgtgctgtggtatttatgcattcatgatttgcctgattccacaggagatacatgcatgcccagggctg
tggacatctgccctccgtcctgtaaatgcaggtgtttctgtgtgctctgtccttcctgtcgattggtatggcatattaaaatgatcaaat
SEQ ID No.18
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QF
SEQ ID No.19
ggatgagacagaaggatagagaggaggagagagagagagagaagagaagcaaccagaaataggcagccaataaaaaggagccgcacttatct
gaagcctcaaggggcctgagccaggtccctgtttgatggcagttatgaaaaattacctcctcccgatcctggtgctctccctggcctactactactattct
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tcaaaaatgggagcccatgtggtattgactgccaggtcggaggaaggtctccagaaggtagtgtctcgctgccttgaactcggagcagcctctgctca
ctacattgctggcactatggaagacatgacatttgcggagcaatttattgtcaaggcgggaaagctcattgggcggactggacatgcttattctaaacca
catcactcagacctcgctgtctctcttccatgacgacatccactctgtgcgaagagtcatggaggtcaacttcctcagctacgtggtcatgagcacagc
cgccttgcccatgctgaagcagagcaatggcagcattgccgtcatctcctccttggctgggaaaatgacccagcctatgattgctccctactctgcaag
caagtttgctctggatgggttcttttccaccattagaacagaactctacataaccaaggtcaacgtgtccatcactctctgtgtccttggcctcatagacac
agaaacagctatgaaggaaatctctgggataattgacgccctagcttctcccaaggaggagtgcgccctggagatcatcaaaggcacagctctacgc
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gacatgtttgtaagtaactaggaactcctgagccctggtgagtggtcttagaacagtcctgcctcatacttcagtaagccctacccacaaaagtatctttc
cagagatacacaaattttggggtacaccttcattcatgagaaattcttgcaacacttgcacagtgaaaatgtaattgtaataaatgtcacaaaaccactttggg
cctgcagttgtgaacttgattgtaactatggatataaacacatagtggttgtatcggctttacctcacactgaatgaaacaatgataactaatgtaacattaa
atataataaaggtaatatcaacttcgtaaatgcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
SEQ ID No.20
MAVMKNYLLPILVLSLAYYYYSTNEEFRPEMLQGKKVTVTGASKGIGREMAYHLSKMGAHVV
LTARSEEGLQKVVSRCLELGAASAHYIAGTMEDMTFAEQFIVKAGKLMGGLDMLILNHITQTS
LSLFHDDIHSVRVMEVNFLSYVVMSTAALPMLKQSNGSIAⅥSSLAGKMTQPMIAPYSASKFA
LDGFFSTIRTELYITKVNVSITLCVLGLIDTETAMKEISGIIDALASPKEECALEIIKKGTALRKSEVY
YDKLPLTPILLGNPGRKIMEFFSLRYYNKDMFVSN
SEQ ID No.21
ggagatcaggccaccacgagacagagatggagaccagcagcctgtggcccccgaggcccagccccagtgcagggctgagcctggaggcgcg
gctgggcgtggacactcgcctctgggccaaggtgctgttcaccgcgctctattcgctcatcttcgcgcttggcacagccggcaatgcgctgtccgtgc
acgtggtgctgaaggcgcggacgggtcgccccgggcgcctgcgctaccacgtgctcagcctggcactgtcagccctgctgctactgctgatcagc
gtgcccatggagctctacaacttcgtgtggtcccactacccctgggtcttcggcgatctcggctgtcgtggctattacttcgtgcgcgagctgtgcgcct
acgccacggtgctgagcgtggccagcctgagcgcagagcgctgcctggccgtgtgccagccgctgcgcgcccgccgcctgctcaccccgcgcc
gcacctgccgcctgctgtcactggtctgggtcgcctctctgggccttgccctgcccatggcggttatcatgggacagaagcacgaaatggagagggc
cgacggggagcctgagcctgcctcgcgtgtgtgcacggtgctagtaagtcgcgccagctccaggtctacattccaggtgaaacgtgctggtctcctt
cgttctcccctttgggaactcactgctattctgaatgggatcactgtcaaccacctggtggccctctactcccaggtaccatcagcttctgcccaagtcaa
ctccatccccagccgcctggagctcctgagtgaggaaggcctcctgggcttcatcacatggagaaagaccctctccctgggggtccaagccagcct
ggtgagacacaaggatgccagccagatccgcagcctccagcacagcgcccaggttctcagagccatcgtggctgtgtatgtcatctgctggctgcc
gtaccatgcccgcaggctcatgtactgctacatccccgatgatggatggactgatgagctctatgacttctatcactatttctacatggtgaccaacacgc
tcttctatgtcagctcggcagtgaccccagtcctctacaatgccgtgtcttcctccttcagaaagctctttctggaatctctcagttccctgtgtggtgaaca
gcgctccgtggtgcccttaccccaagaagccccagagtcaactactagtacgtacagtttccggctttggggatccccaagaaaccccagcctgggt
gaaatacaagtgtgaagagaacaaacaatggctgcttgggacacacccatcagataagccatgccattactaacagtctaagcggacctactgaccc
agcgcagtcattgaccagtgcatactgcaggcaagccacgtaacacctcctgccctcagcttcccacctgtgcaaccaaggtgtagaataggacaaa
ttgcctagtgatgaaggtgcccagtgccagcctggtacagaaccagtactccataaatttttagctggtgctatttttaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
SEQ ID No.22
METSSLWPPRPSPSAGLSLEARLGVDTRLWAKVLFTALLYSLIFALGTAGNALSVHVVLKARTGR
PGRLRYHVLSLALSALLLLLISVPMELYNFVWSHYPWVFGDLGCRGYYFVRELCAYATVLSVA
SLSAERCLAVCQPLRARRLLTTPRRTCRLLSLVWVAASLGLALPMAVIMGQKHEMERADGEPEPAS
RVCTVLVSSRASSRSTFQVKRAGLLRSPLWELTAILNGITVNHLVALYSQVPSASAQVNSIPSRLEL
LSEEGLLGFTTWRKTLSLGVQASLVRHKDASQIRSLQHSAQVLRAIVAVYⅥCWLPYHARRLM
YCYIPDDDGWTDELYDFYHYFYMVTNTLFYVSSAVTPVLYNAVSSSFRKLFLESLSSLCGEQRSV
VPLPQEAPESTTSTYSFRLWGSPRNPSLGEIQV
SEQ ID No.23
ggcgctcgccctcgctcgccatggagaagaccgagctgatccagaggccaagctggccgagcaggccgagcgctacgacgacatggccacct
gcatgaaagccgtgacggagcagggcgccgagctgtccaacgaggagcgcaacctgctgtcggtggcctacaaaaacgtggtagggggccgca
ggtccgcctggagggtcatctcgagcattggagcagaagaccgacacctctgacaagaagttgcagctgatcaaggactatcgggagaaagtggagt
cggagctgaggtccatctgcaccacggtcctggaattgttggataagtatttaatagccaatgcaactaatccagagagtaaggtcttctatctgaaaat
gaagggagattatttccggtatcttgctgaagtagcttgtggcgatgatcgaaaacaaacaatagaaaattcccaaggagcctaccaagaggcgtttg
atataagcaagaaggagatgcagcctacgcatccaatccgcctggggctggctctttaacttttctgtattttactatgagatccttaataattccagagcttg
cctgcacactggctaaaacggcttttgatgaggccatcgcagagcttgatacactgaacgaagactcctacaaagacagcaccctcatcatgcagttg
cttagagacaacttaacattatggacatcagacagtgcaggagaagaatgtgatgcagcagagggggccgaaaactaaacc
SEQ ID No.24
MEKTELIQKAKLAEQAERYDDMATCMKAVTEQGAELSNEERNLLSVAAYKNVVGGRRSAWRVI
SSIEQKTDTSDKKLQLIKDYREKVESELRSICTTVLELLDKYLIANATNPESKVFYLKMKGDYF
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LAKTAFDEAIAELDTLNEDSYKDSTLIMMQLLRDNLTLWTSDSAGEECDAAEGAEN
SEQ ID No.25
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gggctcagctttcactaggcagggtgggcacactagcaagtgcagagaggaggcctgtatatatgtcaaccccacggagaaatatatcctcatgcag
ccgttcattatggtcatgtagcaggacaggtgtgcggttcatgggcgagaagcccagagctgggatccccaccgcccggataaagcggctgtcagt
ggcagcaggaaagatctctggctccagagtgaggttcattgccttgcaggctccgctgaaagctgcccaccagggatctgaatcatccgtgggtgtc
attcgaggctctgtaaacttctga
SEQ ID No.26
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gaaacatcattcacacactctttctcaggtgttttcctccggtgcacactcacacgagtttgcacatactataagcctgaataatgatgcccattatctgcaca
gggtaaaactgattccatactggtgcaacctggtggaagtcttcaggacacttaacaaaattatattctgattatttcattttctagatttggggatgaaaata
gaaaagaatataaacaaagcatgctttttgaggtttcttgggtcagttagtagaaaaataggtgttttctttgagaggtttttttaattgtttatcttattttattttt
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ctgttttcttaaactgagccttcttataggcgtgatgcagctctgtatgtgcccacagagagtaaaggaggacagaagctgctttgcttgccttngtgggg
catagcctttccctatgctgatgtcatattttctgcaaaacctcgggtccagagggctcgtgcattctggtaactattttgcattaaatgttcaac
SEQ ID No.27
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cgttcctgtggcctcctttttctctggtttttgcattttttcttggtccgatgaaagcatttcctttttctaaccaataaagtgatcgctttcagcaatgg
SEQ ID No.28
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cctcttccaggatgacagatgtgccaatctctttgaagcgttggtaggaactctgaaagctgcaaaacgaaggaagattgttacatacgcaggggaac
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agactagcgtgaatttccttatgtattttttagaactttgtaaacaaaggggggcttgttgagaagtcctgttttataaccttgaagcaaaacattacaatgt
aaaatgagacaaacctattatttttcttaagaaggtaatttgggaaatgtaggtaatgaaacatttttttgggaggtgtgaaaaagc
SEQ ID No.29
attggtgcatgtgtgtttgctagctcacttgtccatgagaatattttatgatattaaagaaaacctttttgaaatggctgcttttcaaagaagataattcatggct
tctcatttttcagtctcttcaaaagtgtggctggcctgttttatgactgcagagttgttatgttttttaattttgaatattgcctattaaagataggacaaacttgg
agattatgatgttgcttggcacagactgtattaaaacaacactcccgtga
SEQ ID No.30
ctggcacggacatggctgtcttctgtctgctgtgtgggaaacgctttcaggcacaaagcgcactccagcagcacatggaggtccacgcaggcgtgc
gcagctatatttgcagtgagtgcaaccgcaccttccccagccacacggctctcaagcgccaccttcgctcacatacaggtttttttctccatgtgtcacca
agtgaagtttgtgccttctatagcaaagagaatattttttacatcctactaacagtagatttttttgtagtgaacattttttgtatttttatttataagtctcataaga
aaaatagcgatgttcagttgtataccttgaatctgcagttagaagagaataaagttaactc
SEQ ID No.31
tttttttttttttttttgcaagagtaaaagtctttaatttactgtgcacctcagaaagctacaagtaaaatgtttgtaagaatatacacaaagaattcagagtataa
aattctccatgtaattagtagtcatattaatattagaactacagtagaaaaaaatagctgtctcctagattctcccaggagcctaactgtgtggctttgagaa
ggtggagttgttctgagtgagcgggaagtcaaagctcactcctccagttctcccagcagctccacgaagtcagtgatgtaccacttggcgttgtccttaa
cctgctgcctgatcacattgcctccaaagccaatgaaagcatcag
SEQ ID No.32
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gaccgagcgtgcggacggagcggcggcctgctgggcgggctgagcggcgcgcgcggcggcggagagacgcggagcgagggacgcggcg
gcggcggacgcggcgacaggtcttctacttacaaaggaccaatgactactgatgagggcaccagtaacaatggagagaacccagcagccaccatga
ctgagcagggtgaagatatcactacgaagaaagacagaggagtattaaagattgtcaaaagagtggggactagtgacgaggccccaatgtttggtg
acaaagtttatgtccactacaaagggatgttgtcagatggaaagaagtttgattccagtcatgacagaaagaagccatttgcctttaagccttggccaagg
ccaggttatcaaagcctgggacattggggtgtctactatgaagaaaggcggaatctgccatttattatgtaaaccagaattatgcttattggctcggctggc
cacctccaaaaaattccatcaaatgcaactctcttttttgagattgagctccttgatttcaaaggtgaggatttatttgaagattcaggcgttatccgtagaat
caaacggaaaggcgagggatactcaaacccaaacgaaggagcaacggtaaaagtccacctggaaggctgctgtggtggaaggacatttgattgcc
gagatgtggtgttcgttgttggggaaggagaagaccacgacattccgattgggatcgacaaagcccctggtgaagatgcagagagaagaacagtgta
ttctatatcttggaccacgctatggttttggagaagccgggaagcctaagtttggcattgaccccaatgctgagcttatgtacgaggtcacccttaagag
cttcgagaaggccaaagaatcttgggagatggacaccaaagaaaagctgacgcaggctgccatcgtgaaagagaagggaactgtgtacttcaagg
gaggcaagtacacgcaggccgtgattcagtacaggaagatagtgtcctggctggagatggaatacggcctgtcagagaaggagtccaaagcctca
gagtcgttcctcctcgcagccttcctgaacctggccatgtgctacctgaagctccgagagtacaacaaagccgtggagtgctgcgacaaggcccttg
gactggacagtgccaatgagaaaggcttgtacagaaggggcgaggcccagctgctcatgaatgactttgagtcggccaagggcgacttcgagaag
gtgttggcagtcaatcctcagaacagggccgctcgcctgcagatctccatgtgccagaggaaggcgaaggagcacaacgagcgggaccgcagg
gtgtacgccaacatgttcaagaagttcgcagagcgggacgcaaaggaggaagccagcaaagctgggagcaagaaggctgtagaaggagccgct
ggcaaacaacacgagagtcaggccattggaagaaggaaaggccaaaggccatgtatgacgctgcgccacggagggaagagagtcctaatgaact
cggccctcctcgctgggctcgcctccaactcaggactgaacagtgtttagtgtaaggtttgttacagtctctgtgattctggaagcaaatggcataccag
tagcttcccaaatgaccacctgctgctgcgggggggtgggggtgggggacatgccaggaaacagcagagaaggccgctggtgtgaagagacca
ggccagcagctcagtccagcccatttcagtttgtcacctttcagtgtccagcacagcatccctgtgaacctagggcccagctgctgtgggttctacatc
ggcactagggtcacactgcagaaaccgttgataaaacaaactcagtgatctctgctttccctattggtgggcatggcaggggcgggtgatgagatttgct
tagcactgactgactggcctgctaagaacacaagcccacagccaggggctccctggtccacagctgggtctcaggccccttacctgccttccaagtc
ctttcgcagactcttgagtgtggctttctgtcctagcagcatgtcccacagactctgttgttcctccaacgcccgtcattagtgacagctttctctctgagtt
tctgtggtgtggagagtgggtagaagtaggtttatctttcccgctgtctgccccactcaaggacgat
SEQ ID No.33
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AAGKQHESQAMEEGKAKGHV
SEQ ID No.34
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ttcaggatgggccccgtcccatcaaccccctgatttgctccctggagtgccaggacctggtgccgccctcagaggagtgggagacatgccggggct
tctcatcttttctcaccctgacggtctctgggctccgtggcaaggatgacttggaagatgaggttgctttggaagaaggcatcagtgcacatgccaagct
cttggaacccgtcctgaaggagctggagaaaagccgactccttaccagcgtcccagaggaaaagttcaggggtctctccagcagctttggcaacgg
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ccaaacgctatggcggctttttgcgcaaataccccaagaggagttccgagatggcccgggatgaggacgggggccaggatggggatcaggtagg
gcatgaggacctgtacaaacgctatgggggcttcctgcggcgcattcgccccaagctgaagtgggacaaccagaagcgctatggtggtttcctgcg
gcgtcagttcaaggtggtgacgcggtcccaggagaaccccaatacctattctgaagatttagatgtttga
SEQ ID No.35
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GKESELAGADRMNDEAAQGRTVHFNEEDLRKQAKRYGGFLRKYPKRSSEMARDEDGGQDG
DQVGHEDLYKRYGGFLRRIRPKLKWDNQKRYGGFLRRQFKVVTRSQENPNTYSEDLDV
SEQ ID No.36
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ctgctggtcctgatccacgaccacccacccggcaaggttctctctaagagaaccttgtcagagacagaacgggtccctacaggcgcgttcttctctcct
acagcccatggcgcggttcctgaggctttgcacctggctgctggcgcttgggtcctgcctcctggctacagtgcaggcggaatgcagccaggactg
cgctaaatgcacgtaccgcctggttcgcccaggcgacatcaatttcctggcgtgcacactggaatgtgaaggtcagctgccttctttcaaaatctggga
gacctgcaaggatctcctgcaggtgtccaggcccgagttcccttgggataacatcgacatgtacaaagacagcagcaaacaggatgagagccactt
gctagccaagaagtacggaggcttcatgaaacggtacggaggcttcatgaagaagatgggacgagctatatcccatggagccagaagaagaagcga
acggaggagagatccttgccaagaggtatggcggcttcatgaagaaggatgcagatgagggagacaccttggccaactcctccgatctgctgaaag
agctactgggaacgggagacaaccgtgcgaaagacagccaccaacaagagagcaccaacaatgacgaagacatgagcagcaagaggtatggg
ggcttcatgagaagcctcaaaagaagcccccaactggaagatgaagcaaaagagctgcagaagcgctacgggggcttcatgagaagggtgggac
gccccgagtggtggatggactaccagaagaggtatgggggcttcctgaagcgctttgctgagtctctgccctccgatgaagaaggcgaaaattactc
gaaagaagttcctgagatagagaaaagatacgggggctttatgcggttctgaagcccttttccagcaggaccccgacccccactagcctgctccatc
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aaatgcttatttgtataaatataataaacccgtgaccccaactgc
SEQ ID No.37
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SEQ ID No.38
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acccttacctactccagaatgaggggaatggtagcgattctcatcgcttttatgaaacagagaaggatgggcctgaacgattttattcagaagattgcca
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cttgggctatctgcactccctaaacatcgtttatagagacttaaacctgagaatattctcctagactcccaggggcacatcgtcctcactgactttgggct
ctgcaaagagaatattgagcataacgggacaacatctaccttctgtggcacgcctgagtatctggctcctgaggtcctccataagcagccgtatgacc
ggacggtggactggtggtgtcttggggctgtcctgtatgagatgctctacggcctgcccccgttttatagccggaacacggctgagatgtacgacaat
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ttaataactaaaacctattgaaacggtcttgcaatgacgagcattcagatgcttaaggaaagcattgctgctacaaatatttctatttttagaaagggttttta
tggaccaatgccccagttgtcagtcaaagccgttggtggtttcattgtttaaaatgtcacctataaaacgggcattatttatgttttttttccctttgttcatattct
tttgcattcctgattattgtatgtatcgtgtaaaggaagtctgtacattgggttataacactagatattttaaacttacaggcttatttgtaaaccatcattttaatg
tactgtaattaacatgggttataatatgtacaattcctcctccttaccacacaactttttttgtgtgcgataaaccaattttggtttgcaataaaatcttgaaacc
t
SEQ ID No.39
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VLQKKAILKKKEEKHIMSERNVLLKNVKHPFLVGLHFSFQTADKLYFVLDYINGGELFYHLQR
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SEQ ID No.40
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ctcgagccccagagctcccaggatctcctggatagctggcttcgccgccggacggcacgccccccttagcttccacaccctctcctctgagcgcctc
ctcatctgcccctggagggactttcaccttcaaaggtgcaggacaaagccgcatatctggcgcccaccatgcacctcaacagctccgtgcagcagg
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gtgggcactgtgggcaactcggtgacagccttcactctagcgcggaagaagtcgctgcagagcctgcagagcactgtgcattaccacctgggtagc
ctggcactgtctgacctgctcatcctgctgctggccatgcccgtggagctgtacaacttcatctgggtgcaccatccctgggcctttggggatgctggct
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cgccatggagtcctcgtcttacgtgctgtggtaatcgcctttgtggtctgctggctgccctaccacgtgcggcgcctcatgttctgctatatctcagatga
acagtgagctacgttcctcttcgacttctaccactatttctatatgctgaccaacgctctcttctacgtcagctcagccatcaatcccatcctttacaacctcg
tctccgccaacttccgccaggtcttcctgtccacactggcttgcctctgtcctgggtggcgccgccgccgaaagaagaggccaacgttctccaggaa
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aaaagaggcggtttctctcctggccctacaaaaggcctttaacaagaagaaattagcactcaccaaggacggtctcctttgttcccagactaatggatg
ttttagagcaagaaatgaaagcaccacattgggcctggacagatgagctgttgtaaccataacagcaccttggaactgcactggcagggcgagaca
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tctgtaaggatgaaattgccacgggacatgggaggctcagtcacagcccaggctagcctctgctccctctgaacttaaaacaatgggtgaaaagtc
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ggcaggacctgggtgagtccggatcaaggctgacaccaggaagatgtgatcacccaagagggaagcccctcctcctaagaaatgtctgcatggga
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cagaagtctctgctgtagtctatagcatcttgtctgtgtgcttggtgtaattagggacatacatccatgcaccaccagacacacctgtgaccctggctgg
gtatcctatgctctgggccaagtgaagatgaaaatagttctggaggctgtcctgagcatcctggctagagtctcatgagcccagtcgtgatgtggaaac
aagtcgtgtgccccaaatatctgtcagaatgccacccaccctccacacttcaataaaagaacaccctcctcatatgtctcaataaagaataaaggaagc
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SEQ ID No.41
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NTVIANKLTVMVHQAAEQGRGVCTVGTHNSLEHSTFNMSIEPGRVQALRHGVLVLRAVVIAFV
VCWLPYHVRRLMFCYISDEQWTTFLFDFYHYFMLTNALFYVSSAINPILYNLVSANFRQVFLS
TLACLCPGWRRRRKKRPTFSRKPNSMSSNHAFSTSATRETLY

Claims (31)

1.诊断个体中CRH诱导的基因表达谱的方法，所述方法包括：
a)得到所述个体的生物学样品；和
b)确定含有选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID No.7、SEQID No.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID 11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID No.38和SEQ ID No.40的核酸序列的基因的基因转录水平。
2.根据权利要求1的方法，其中生物学样品是体液或组织样品。
3.根据权利要求1或2的方法，其中为具有由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID 11、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ IDNO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ IDNo.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ IDNo.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID No.38和SEQ ID No.40组成的核酸序列的基因确定基因转录的水平。
4.根据权利要求1或2的方法，其中使用结合含有选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID No.38和SEQ ID No.40的核酸序列的多核苷酸的探针评估基因转录的水平。
5.根据权利要求1到4任一项的方法，其中使用微阵列技术确定基因表达的水平。
6.诊断个体中CRH诱导的基因表达谱的方法，所述方法包括：
a)得到所述个体的生物学样品；和
b)确定所述生物学样品中调节促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)信号化的至少一种蛋白质的量；其中调节促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)信号化的蛋白选自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41。
7.根据权利要求6的方法，其中生物学样品是体液或组织样品。
8.根据权利要求6或7的方法，其中使用结合含有选自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的氨基酸序列的多肽的抗体确定调节CRH信号化的蛋白质的量。
9.根据权利要求6或7的方法，其中通过评估编码选自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的氨基酸序列的基因的基因转录水平来确定调节CRH信号化的蛋白质的量。
10.根据权利要求9的方法，其中使用结合编码选自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的氨基酸序列的多核苷酸的探针评估基因转录的水平。
11.根据权利要求10的方法，其中使用微阵列技术确定基因表达水平。
12.根据权利要求11的方法，其中使用结合编码具有氨基酸序列SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQID No.41的多肽组的多核苷酸的寡核苷酸探针的阵列分析基因转录水平。
13.根据权利要求11的方法，其中使用结合具有核酸序列SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID No.38和SEQ ID No.40的多核苷酸的寡核苷酸探针的阵列分析基因转录水平。
14.鉴定能够改变细胞中CRH信号化应答的化合物的方法，所述方法包括：
a)在所述化合物存在和不存在时将所述细胞与CRH接触；
b)确定调节所述细胞中促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)信号化的至少一种蛋白质的量；和
c)比较在所述化合物存在和不存在时所述蛋白质的量；其中，调节促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)信号化的蛋白质选自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41。
15.根据权利要求13的方法，其中细胞是真核细胞如鼠垂体促肾上腺皮质激素细胞来源的腺瘤细胞系AtT-20。
16.根据权利要求13或14的方法，其中使用结合含有选自SEQ IDNO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的氨基酸序列的多肽的抗体确定调节CRH信号化的蛋白质的量。
17.根据权利要求13或14的方法，其中通过评估编码选自SEQ IDNO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的氨基酸序列的基因的基因转录水平确定调节CRH信号化的蛋白质的量。
18.根据权利要求16的方法，其中使用结合编码选自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的氨基酸序列的多核苷酸的探针评估基因转录的水平。
19.根据权利要求16或17的方法，其中使用微阵列技术分析基因表达的水平。
20.根据权利要求18的方法，其中使用结合编码具有SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的氨基酸序列的多肽组的多核苷酸的寡核苷酸探针的阵列分析基因转录的水平。
21.根据权利要求18的方法，其中使用结合具有核酸序列SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID No.38和SEQ ID No.40的多核苷酸的寡核苷酸探针的阵列分析基因转录的水平。
22.鉴定能够改变细胞中CRH信号化应答活性的化合物的方法，所述方法包括：
a)将表达含有选自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的氨基酸序列的至少一种蛋白质的细胞与所述受试化合物接触；和
b)比较所述化合物存在和不存在时所述细胞中CRH应答活性。
23.根据权利要求21的方法，其中细胞是能够表达具有选自SEQ IDNO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的氨基酸序列的至少一种蛋白质的宿主细胞。
24.根据权利要求22的方法，其中用含有调节序列的至少一种载体转染宿主细胞。
25.根据权利要求22的方法，其中用含有编码选自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的氨基酸序列的多核苷酸序列的至少一种载体转染宿主细胞。
26.含有选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ D No.8、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30和SEQ ID No.31的核酸序列的分离的多核苷酸，其用作细胞中CRH信号化的标记物。
27.根据权利要求21的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸是mRNA、DNA或cDNA。
28.由选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ D No.8、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30和SEQ ID No.31的核酸序列组成的分离的多核苷酸，其用作细胞中CRH信号化的标记物。
29.含有根据权利要求25到27任一项的分离的多核苷酸的载体。
30.根据权利要求28的载体，其中多核苷酸可操作地连接到表达控制序列。
31.用根据权利要求28或29的载体转染的宿主细胞。
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