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CN1758060A - 脂肪油中有效成分的一种测定方法 - Google Patents

脂肪油中有效成分的一种测定方法 Download PDF

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CN1758060A
CN1758060A CN 200410080429 CN200410080429A CN1758060A CN 1758060 A CN1758060 A CN 1758060A CN 200410080429 CN200410080429 CN 200410080429 CN 200410080429 A CN200410080429 A CN 200410080429A CN 1758060 A CN1758060 A CN 1758060A
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Abstract

本发明公开了脂肪油中有效成分的一种测定方法，该方法采用柱前衍生反相HPLC法，简化了样品衍生化操作步骤，无需萃取，节省时间和试剂，衍生化反应完全，采用适当的色谱分离条件，将目的组分与杂质完全基线分离。

Description

脂肪油中有效成分的一种测定方法
技术领域
本发明涉及脂肪油中有效成分的一种测定方法。
背景技术
海狗系深海哺乳动物，生活在北极圈以内-50℃的高寒水域中，以名贵的鳕鱼为食，皮下有厚厚的脂肪层，体内富含ω-3多烯脂肪酸。以加拿大北部无污染海域海狗脂肪为原料提炼出的海狗脂肪油，其中含有三种重要的ω-3多烯脂肪酸-EPA(Eicosapentaenoic Acid，二十碳五烯酸)、DPA(Docosapentaenoic Acid，二十二碳五烯酸)和DHA(Docosahexaenoic Acid，二十二碳六烯酸)，且总含量在20％以上。医学界经过多年的研究已经证实，这三种脂肪酸对人体有多种独特的生物学活性：EPA具有改善血液循环、软化血管、调整血脂、降低血压和血糖以及抗炎作用；DHA和DPA具有营养大脑、促进胎儿和儿童大脑发育、保护视力、调节免疫和抗癌作用，其中DHA又被称作“脑黄金”。近期人们又发现它们对一些疾病具有治疗作用：EPA已被开发作为治疗动脉硬化和高血脂的药物；还发现海狗油对II型糖尿病、脂肪肝和前列腺炎具有治疗和预防作用。
人体自身不能合成ω-3多烯脂肪酸，只能从外界摄取，深海冷水鱼油中虽然也还有ω-3多烯脂肪酸，但其与海狗油相比除含量一般较低外，还有以下重大区别：
1.海狗与人类同为哺乳类动物，其体内甘油脂的化学结构与人类相似，ω-3多烯脂肪酸一般位于甘油三脂的1、3位，而鱼是低级冷血动物，ω-3多烯脂肪酸位于甘油三脂的2位，要经过人体肝脏代谢后才能利用。因此海狗油的ω-3多烯脂肪酸相比之下有更好的生物利用度，且不会增加肝脏负担。
2.海狗油中还含有2-3％的角鲨烯，这也是鱼油中没有的，这种物质有效抑制生物中不良胆固醇的吸收并加速其代谢，还具有防癌作用，另外对皮肤也有滋润作用。
3.海狗油中不仅富含EPA和DHA，并且富含DPA，而大多数鱼油中DPA含量很低。
4.海狗油中几乎不含胆固醇，而大多数鱼油却含有较多胆固醇。
因此，海狗油相对于鱼油具有更高的应用价值，可帮助人们战胜糖尿病、脂肪肝、冠心病等长期困扰人类的“现代文明病”。
海狗油等脂肪油中脂肪酸的含量测定多采用柱前衍生毛细管气相色谱法，近年来HPLC测定法由于其外标定量准确、方法重现性良好、有足够的分离度、仪器相对比较普及，并可以为中低压液相制备提供依据等独特的优点而越来越受到重视。
脂肪油的碱催化转酯化方法国内外均有文献报道，但现有的操作步骤均较繁琐，衍生后需进行多次萃取，处理时间长，且耗费大量有机溶剂，所以此方法还需进一步改进。对于海狗油来说，采用衍生方法中脂肪油的碱催化转酯化方法，操作步骤繁琐，要求衍生后进行多次萃取，再合并萃取液用无水硫酸钠干燥，最后减压吹干萃取剂再定容。按此步骤操作，每处理一个样品约需4-6小时，费时费力，且浪费大量有机溶剂，不利人体健康，也破坏了环境。而且采用传统样品衍生方法，回收率低，仅83.6％左右，衍生化试剂也需现用现配，给操作带来不便。因此目前海狗油等脂肪油中有效成分的测定方法还需进一步改进，才能更为准确地测定脂肪油中的有效成分EPA、DHA和DPA的含量。
发明内容
本发明的目的在于提供脂肪油中有效成分的一种测定方法，该方法采用柱前衍生反相HPLC法，简化了样品衍生化操作步骤，无需萃取，节省了时间和试剂，能保证完全酯化的衍生条件，采用适当的色谱分离条件，将目的组分与杂质完全基线分离。
本发明的另一目的在于提供海狗油中有效成分的一种测定方法。
为了实现本发明的目的，本发明提供脂肪油中有效成分的一种测定方法，包括以下步骤：
1)脂肪油的衍生化处理：
取脂肪油与含0.2-1.0mol/L醇的碱金属盐以1∶30-100体积比混合摇匀，在0-60℃下反应至小油滴完全消失，再加入酸终止反应，用醇定容，过滤，得衍生处理过的脂肪油供试品溶液；
2)色谱进样分析
取衍生处理后的脂肪油，进入液相色谱仪，所述的色谱仪的色谱条件为：
流动相：甲醇水系统、乙腈四氢呋喃水系统或乙腈甲醇水系统，等梯度洗脱，
流速：1.1-1.5ml/min，
柱温：15-45℃，
检测波长：202～230nm，
进样量：5～50μl；
3)记录色谱图，用外标法测定脂肪酸的含量。
其中，所述的脂肪油为鱼油、植物油或海狗油等含有三种多烯脂肪酸EPA、DPA和DHA的脂肪油，所测定脂肪油中的有效成分是指三种ω-3多烯脂肪酸：EPA-Eicosapentaenoic Acid，二十碳五烯酸；DPA-Docosapentaenoic Acid，二十二碳五烯酸和DHA-Docosahexaenoic Acid，二十二碳六烯酸，本方法可测定这三种脂肪酸中的一种或多种。本方法尤其适合海狗油中这三种ω-3多烯脂肪酸的测定。
其中，步骤1)脂肪油的衍生化处理：取脂肪油80-120μl，加入0.2-1.0mol/L醇的碱金属盐4-8ml，摇匀，在0-60℃下反应至小油滴完全消失，再加入0.2-0.5ml酸终止反应，用醇定容，0.2μm-0.3μm滤膜过滤，得衍生处理过的脂肪油供试品溶液。
进一步地说，所述的衍生化处理方法为：取脂肪油100-120μl，加入0.5-0.8mol/L的甲醇钠4-6ml，摇匀，室温反应15-30分钟，至小油滴完全消失，再加入0.2-0.4ml冰醋酸终止反应，用甲醇定容，0.2μm滤膜过滤，得衍生处理过的脂肪油供试品溶液。
衍生化反应中所述的醇的碱金属盐可为甲醇钠、乙醇钠或甲醇钾等，优选为甲醇钠，甲醇钠在15天以内催化衍生化能力基本无变化。其浓度为0.2-1.0mol/L，优选为0.5-0.8mol/L。
终止反应所用的酸为冰醋酸、甲酸、三氟乙酸或硫酸等中的任意一种，定容所用的醇为甲醇、乙醇等。
为了使产品具有更好的稳定性，定容时可加0.001％-0.005％的抗氧化剂，所述的抗氧化剂为2，6-二叔丁基对甲酚或对羟基叔丁基茴香醚。
优选的，本发明所述的衍生化处理在0-60℃下反应5-30分钟，为了便于操作，衍生化反应更优选在室温下进行，反应15分钟。
本发明色谱仪所用的色谱柱可为：Allsphere Octyl(C8)，3μm，100，4.6mm×150mm；Waters SymmetryShield RP-18，5μm，100，3.9mm×150mm和LichrospherRP-18，5μm，100，4.6mm×250mm。以RP-18型，5μm，100，4.6mm×250mm型号为好。如Waters高效液相色谱仪，Lichrospher高效液相色谱仪，Mightsil高效液相色谱仪。优选的，液相色谱仪为RP-18型，5μm，100，4.6mm×250mm型号。
在选择色谱仪的色谱条件时，发现检测波长在202～230nm之间均可，其中210nm处三种脂肪酸吸收较强且稳定，精密度也符合药典要求，故检测波长选用210nm为佳。
本发明选择甲醇水系统、乙腈四氢呋喃水系统或乙腈甲醇水系统三种系统中的任意一种作为流动相进行等梯度洗脱。经反复调试，改变比例，最终发现乙腈甲醇水系统最好，在其比例为7∶1∶2流速逐渐提高至1.1-1.5ml/min，最后发现在流速为1.2ml/min时各项指标达到最佳。所以流动相优选为乙腈甲醇水系统，三者比例为7∶1∶2，流速为1.2ml/min，同时柱温选择在15-45℃。
为实现本发明的另一目的提供海狗油中有效成分的一种测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)海狗油的衍生化处理：
取海狗油80-120μl，加入0.2-1.0mol/L甲醇钠4-8ml，摇匀，在0-60℃下反应至小油滴完全消失，再加入0.2-0.5ml冰醋酸终止反应，用含0.001％-0.005％2，6-二叔丁基对甲酚的醇定容，0.2μm-0.3μm滤膜过滤，得衍生处理过的海狗油供试品溶液；
2)色谱进样分析
取衍生处理后的海狗油供试品溶液，进入液相色谱仪，所述的色谱仪的色谱条件为：
流动相：甲醇水系统、乙腈四氢呋喃水系统或乙腈甲醇水系统，等梯度洗脱，
流速：1.1-1.5ml/min，
柱温：15-45℃，
检测波长：202-230nm，
进样量：5～50μl；
3)记录色谱图，用外标法测定脂肪酸的含量。
所述的衍生化处理方法优选为：取脂肪油100-120μl，置于10-200量瓶中，加入0.5-0.8mol/L的甲醇钠4-6ml，摇匀，室温反应15-30分钟，至小油滴完全消失，再加入0.2-0.4ml冰醋酸终止反应，用含0.003％-0.005％2，6-二叔丁基对甲酚的甲醇定容，0.2μm滤膜过滤，得衍生处理过的脂肪油供试品溶液。
更优选的衍生化处理方法为：取海狗油120μl，加入0.5mol/L甲醇钠4ml，摇匀，室温反应至小油滴完全消失，再加入0.2ml冰醋酸终止反应，用含0.005％2，6-二叔丁基对甲酚的甲醇定容，0.2μm滤膜过滤，得衍生处理过的海狗油供试品溶液。
其中，所测定海狗油中的有效成分是指三种ω-3多烯脂肪酸：EPA-Eicosapentaenoic Acid，二十碳五烯酸；DPA-Docosapentaenoic Acid，二十二碳五烯酸和DHA-Docosahexaenoic Acid，二十二碳六烯酸，本方法可测定这三种脂肪酸中的一种或多种。
本发明的脂肪油中有效成份的一种测定方法是本发明技术人员多年对测定方法摸索的结果，具有以下优点：
1.脂肪油的碱催化转酯化方法国内外均有文献报道，但操作步骤均较繁琐，都要求衍生后进行多次萃取，再合并萃取液用无水硫酸钠干燥，最后减压吹干萃取剂再定容。按此步骤操作，每处理一个样品约需4-6小时，费时费力，且浪费大量有机溶剂，不利人体健康，也破坏了环境。本发明经步骤优化后，每处理一个样品仅需0.5小时左右，且无需萃取，节省了大量时间和有机溶剂。
2.采用传统样品衍生方法，结果回收率仅83.6％左右，这与其操作步骤较多，样品有损失有关，本发明简化了操作步骤，提高了回收率，回收率接近100％。
3.现有的衍生化试剂需现用现配，给操作带来不便。本发明对衍生化试剂的稳定性进行了考察，证明其15天内稳定，节省了操作时间和试剂。
4.传统样品衍生方法要求10℃反应10分钟，操作不便。本发明对衍生时间和温度进行了考察，在室温下即可进行衍生化操作，找到了方便操作又能保证完全酯化的衍生条件。
5.本发明在对色谱条件进行研究的过程中，对不同色谱柱进行筛选，筛选出Lichrospher RP-18色谱柱，寻到了理想的色谱条件，最终将目的组分与杂质完全基线分离。
6.本发明所述的测定方法为进一步对海狗油纯化打下了基础。
附图说明
图1为海狗油衍生化程度考察，其中3为未衍生样品，4为衍生样品，5为未完全衍生样品；
图2为样品与样品中加入对照品的光谱图；
图3为Allsphere Octyl柱最佳分离色谱图；
图4为Waters-C18柱最佳分离色谱图；
图5为Lichrospher RP-18柱最佳分离色谱图；
图6为甲醇水系统最佳分离色谱图；
图7为乙腈四氢呋喃水系统最佳分离色谱图；
图8为乙腈甲醇水系统最佳分离色谱图；
图9为1.0ml/min流速下的色谱图；
图10为室温分离色谱图；
图11为30℃分离色谱图；
图12为空白试验与样品对照色谱图；
图13为Mightsil RP-18柱色谱图。
具体实施方式
下面实施例为进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。
                         实施例1
本实施例所述的海狗油有效成分的测定方法，包括以下步骤：
1)海狗油的衍生化处理：
取海狗油120μl，置于10ml量瓶中，加入0.5mol/L甲醇钠4ml，摇匀，室温反应15分钟，至小油滴完全消失，再加入0.2ml冰醋酸终止反应，用含0.005％BHT的甲醇定容，0.2μm滤膜过滤，得衍生处理过的海狗油供试品溶液；
2)取20μl衍生处理后的海狗油供试品溶液，进入液相色谱仪，所述的色谱仪的色谱条件为：
色谱柱：Lichrospher RP-18，5μm，100A，4.6mm×250mm；
流动相：乙腈∶甲醇∶水＝7∶1∶2，等梯度洗脱；
流速：1.2ml/min；
柱温：45℃；
检测波长：210nm；
进样量：20μl；
3)记录色谱图，测定EPA、DHA和DPA三种脂肪酸的含量。
采用本发明所述的测定方法测得样品海狗油中三种多烯脂肪酸的百分含量(W/W)为：EPA6.92％，回收率99.10％；DHA9.76％，回收率98.90％；DPA4.18％，回收率99.60％。
                         实施例2
本实施例所述的海狗油有效成分的测定方法，包括以下步骤：
1)海狗油的衍生化处理：
取海狗油80μl，置于50ml量瓶中，加入0.8mol/L甲醇钠6ml，摇匀，40℃下反应至小油滴完全消失，再加入0.3ml冰醋酸终止反应，用含0.003％BHT的甲醇定容，0.2μm滤膜过滤，得衍生处理过的海狗油供试品溶液；
2)取30μl衍生处理后的海狗油供试品溶液，进入液相色谱仪，所述的色谱仪的色谱条件为：
色谱柱：LichrospherRP-18，5μm，100A，4.6mm×250mm；
流动相：甲醇∶水＝3∶2，等梯度洗脱；
流速：1.3ml/min；
柱温：30℃；
检测波长：202nm；
进样量：30μl；
3)记录色谱图，测定EPA、DHA和DPA三种脂肪酸的含量
采用本实施例所述的测定方法测得样品海狗油中三种多烯脂肪酸的百分含量(W/W)为：EPA7.06％，回收率99.70％；DHA9.829％，回收率98.70％；DPA 4.29％，回收率99.50％。
                        实施例3
本实施例所述的海狗油有效成分的测定方法，包括以下步骤：
1)海狗油的衍生化处理：
取海狗油100μl，置于100ml量瓶中，加入1.0mol/L甲醇钠8ml，摇匀，50℃下反应至小油滴完全消失，再加入0.5ml冰醋酸终止反应，用含0.001％BHT的甲醇定容，0.2μm滤膜过滤，得衍生处理过的海狗油供试品溶液；
2)取50μl衍生处理后的海狗油供试品溶液，进入液相色谱仪，所述的色谱仪的色谱条件为：
色谱柱：Waters SymmetryShield RP-18，5μm，100，3.9mm×150mm；
流动相：乙腈∶甲醇∶水＝7∶1∶2，等梯度洗脱；
流速：1.3ml/min；
柱温：15℃；
检测波长：220nm；
进样量：50μl；
3)记录色谱图，测定EPA、DHA和DPA三种脂肪酸的含量。
采用本实施例所述的测定方法测得样品海狗油中三种多烯脂肪酸的百分含量(W/W)为：EPA7.15％，回收率97.90％；DHA9.75％，回收率99.60％；DPA4.21％，回收率99.30％。
                        实施例4
本实施例所述的鲱鱼油有效成分的测定方法，包括以下步骤：
1)鲱鱼油的衍生化处理：
取鲱鱼油90μl，置于200ml量瓶中，加入0.6mol/L乙醇钠5ml，摇匀，10℃下反应至小油滴完全消失，再加入0.35ml盐酸终止反应，用含0.002％2，6一二叔丁基对甲酚的甲醇定容，0.2μm滤膜过滤，得衍生处理过的鲱鱼油供试品溶液；
2)取40μl衍生处理后的鲱鱼油供试品溶液，注入液相色谱仪，所述的色谱仪的色谱条件为：
色谱柱：Waters SymmetryShield RP-18，5μm，100，3.9mm×150mm；
流动相：乙腈四氢呋喃水系统＝7∶1∶2，等梯度洗脱；
流速：1.4ml/min；
柱温：40℃；
检测波长：230nm；
进样量：40μl；
3)记录色谱图，测定EPA和DHA两种脂肪酸的含量。
采用本实施例所述的测定方法测得样品鲱鱼油中三种多烯脂肪酸的百分含量(W/W)为：EPA 6.828％，回收率99.80％；DHA 6.35％，回收率98.50％。
                       实验例1
本实验例在于研究脂肪油—海狗油的衍生化处理方法。
1.试剂及样品
样品：海狗油，产自加拿大TerraNova渔业有限公司。
试剂：2，6-二叔丁基对甲酚(BHT)、金属钠、金属钾、冰醋酸、无水乙醚、正己烷、无水硫酸钠、氢氧化钾、乙醇、酚酞、盐酸、丙酮、三乙胺均为国产分析纯；高纯氮气，Fisher公司产品；α-溴代苯乙酮，色谱纯，Wako公司产品。
2.衍生化方法的选择
2.1α-溴代苯乙酮衍生法
取海狗油20μl，精确称定，加入2ml2.0％氢氧化钾-乙醇置5ml离心管中，氮气密封100℃皂化30分钟。冷却至室温后以酚酞为指示剂、盐酸乙醇(4∶1)中和，离心取上清液，氮气吹干，再加入100μlα-溴代苯乙酮的丙酮溶液(10mg/ml)及100μl三乙胺的丙酮溶液(10mg/ml)，充氮密封后沸水浴5分钟。冷却后加入160μl冰醋酸的丙酮溶液(2mg/ml)，再次沸水浴5分钟。所得反应液0.45μm滤膜过滤，氮气吹干，准确加入0.15ml甲醇溶液，取5μl进样。
本衍生法由于在脂肪酸链羧基端引入了苯环结构，使得被测物在254nm处有很强的吸收，故几种目的组分HPLC的检测限可达0.25ng，此方法衍生步骤繁琐，操作费时，且回收率难以保证。
2.2碱催化一步转酯化法
取海狗油约0.2g，精密称定，溶于4ml四氢呋喃，与新制0.5mol/L甲醇钠溶液8ml混合，10℃反应约10分钟，加入0.4ml冰醋酸终止反应，反应液用20ml蒸馏水稀释后，以50ml乙醚分三次萃取；合并萃取液，用无水Na2SO4及KHCO3干燥后，减压抽干，甲醇定容至100ml，0.2μm滤膜过滤，进样20μl。
该方法操作相对简便，且利用脂肪酸中多个双键较强的远紫外端(210nm)吸收，几种目的组分HPLC的检测限约7-8ng，可很好的满足定量要求，故采用此方法作进一步的研究。
3.衍生化步骤的研究
原方法操作步骤较多，回收率较低，仅83％左右。分析衍生反应机理及各反应物和产物性质并结合反相分离的特点，认为反应产生的少量盐在反相柱上基本不保留，对分离无影响，而水在流动相中本来就有，也不必除去；另外试验发现海狗油酯化后可溶于甲醇，衍生前加入四氢呋喃也没必要。故将方法改为衍生完后直接定容进样，步骤如下：
取海狗油80-120μl，置于瓶中，加入0.5-1.0mol/L甲醇钠4-8ml，摇匀，在0-60℃下反应5-30分钟，至小油滴完全消失，再加入0.2-0.5ml冰醋酸终止反应，用含0.001％-0.005％2，6-二叔丁基对甲酚的甲醇定容，0.2μm-0.3μm膜过滤，得衍生处理过的海狗油供试品溶液。
经多次重复，并和原方法对比，结果证明本发明方法完全可行，对目的组分的分离无任何影响，且大大简化了操作步骤，省去了四氢呋喃溶剂的添加，及萃取步骤，同时却能保证较高的样品回收率，并节省了大量有机溶剂。
4.温度对衍生化反应的影晌
由于各文献报道的衍生反应温度各不相同，故对样品衍生温度进行考察：取海狗油6份各120μl分别置10ml棕色容量瓶中，精密称定，均分三组，平行操作，按优化好步骤衍生，反应温度分别为第一组冰浴(0℃)，第二组室温(15℃)，三组60℃水浴。衍生10分钟后终止反应，各进样两次，考察温度对衍生化反应的影响。
试验中发现，温度对反应速率有一定影响：冰浴组样品油滴最早消失，室温组其次，60℃水浴组最馒，说明低温可加速该衍生反应，但10分钟后油滴都消失。另外不断振摇可明显加速衍生反应，这是由于振摇可使海狗油滴破裂为小油滴，增大了油与衍生化试剂的接触面积，加快了反应的进行。
                                            表1温度对衍生化反应的影响结果
  反应温度/℃   EPAM平均峰面积   DHAM平均峰面积   DPAM平均峰面积
  0   4398834   5708265   2288815
  0   3982547   5758572   2175738
  15   4247395   5719200   2186221
  15   4196638   5684480   2172971
  60   3938505   5622290   2246374
  60   4207884   5660505   2281390
  平均值   4161967   5689009   2212539
  标准差   4398834   52523   48729
  RSD％   4.15   0.923   2.202
由表1可知，温度在0℃到60℃之间变化对衍生化反应结果影响较小，经初步统计分析，其中EPA甲酯(EPAM)变异较大，故以其峰面积为考察指标，对各衍生温度下结果进行方差分析，比较各组之间有无统计学差异，结果见表2和表3。
                                            表2不同反应温度对EPAM峰面积影响结果表
  反应温度/℃   0   15   60
  4401125   4240804   3920078
  EPAM   4396542   4253985   3956932
  峰面积   3986839   4289578   4285512
  3978254   4103698   4130256   ∑
  ∑x   16762760   16888065   16292778   49943603
  ∑x 2   7.04209×1013   7.13216×1013   6.6449×1013   2.08191×1014
                                             表3不同反应温度对EPAM峰面积影响方差分析表
  变异来源   离均差平方和SS  自由度v   均方MS   F   P
  总   3.27823×1011  11
  组间(处理组间)   49245919643  2   24622959822   0.7955   ＞0.05
  组内(误差)   2.78577×1011  9   30953040596
由于F0.05(2.9)＝4.26，方差分析计算所得F＝0.7955＜F0.05(2.9)，P＞0.05，所以三组数据间无统计学差异，说明尽管衍生温度不同，最后反应都达到一个共同的平衡。温度可选择在在0-60℃之间，为了便于操作，衍生化反应优选在室温下进行。
5.衍生化试剂甲醇钠稳定性考察
因有的文献报道甲醇钠不稳定，须现用现配，给试验带来较大不便；而有的文献却说甲醇钠可室温放置数月而保持稳定，故考察甲醇钠的稳定性。
配制0.5mol/L甲醇钠溶液7份，分别室温(约15℃左右)放置1、2、3、5、10、15、30天。取海狗油7份，精密称定，平行操作，分别加入7种放置不同时间的甲醇钠进行衍生。各进样两次，以DHA为考察对象，以峰面积除以取样量的商为指标，考察衍生化试剂稳定性。
由表5可见，甲醇钠在15天以内催化衍生化能力基本无变化，峰面积/取样量仅下降约1％；到第30天略有下降，峰面积/取样量仅下降约4.5％，故甲醇钠配好后最少可用15天。
                               表5甲醇钠室温放置对催化能力的影响
  甲醇钠放置时间/天   海狗油取样量/g   DHAM平均峰面积   峰面积/取样量
  1   0.11486   5416429   47156790
  2   0.11473   5410270   47156781
  3   0.11478   5396079   47012365
  5   0.11481   5394629   46987452
  10   0.11483   5369028   46756323
  15   0.11479   5359061   46685790
  30   0.11485   5170971   45023698
6.衍生化完全程度考察
取海狗油及衍生化样品点于硅胶G薄层板(110℃活化1h)上，石油醚(沸程30～60℃)-乙醚(9∶1)展开，喷0.02％Rhodamin6G乙醇液，于紫外灯(365nm)下观察(见图1)。脂肪酸甲酯的Rf值大于甘油三酯，衍生后样品中甘油三酯点的消失，说明衍生化完全。
图中4衍生完后样品中甘油三酯斑点已完全消失，样品衍生完全。
7.样品衍生化方法的确立
综上可知，样品衍生化方法为：取海狗油80-120μl，置于瓶中，加入0.5-1.0mol/L甲醇钠4-8ml，摇匀，在0-60℃下反应5-30分钟，再加入0.2-0.5ml冰醋酸终止反应，用含0.001％-0.005％2，6-二叔丁基对甲酚的甲醇定容，0.2μm-0.3μm膜过滤，得衍生处理过的海狗油供试品溶液。
最佳样品衍生化方法为：取海狗油120μl，精密称定，置100ml棕色容量瓶中，加入0.5mol/L甲醇钠4ml，不断振摇，室温反应约15分钟，加入0.2ml冰醋酸终止反应，用含0.005％/BHT的甲醇定容，0.2μm滤膜过滤，得衍生处理过的海狗油供试品溶液。
                         实验例2
本实验例在于研究液相色谱仪的色谱条件。
1.仪器及试剂
仪器：岛津(Shimadzu)201OA高效液相色谱仪、紫外双波长检测器、Class-VP色谱工作站；Waters515泵、996型二极管阵列检测器、Millennium32色谱工作站；MiIlipore超纯水制备机。
试剂：高纯氮气；甲醇、乙腈色谱纯，Fisher公司产品；三氟乙酸，色谱纯，Merck公司产品；α-溴代苯乙酮，色谱纯，Wako公司产品；EPA甲酯(EPAM)标准液(9.99mg/ml)、DHA甲酯(DHAM)标准液(9.81mg/ml)、DPA甲酯(DPAM)标准液(9.94mg/ml)，Supelco公司产品。
2.目的峰的确认
利用相同条件下对照品和样品保留时间对照法和样品中加入对照品峰面积增大法对样品中的目的组分进行了确认。
由图2可见，在相同色谱条件下样品中1号峰和EPAM对照品保留时间相同，2号峰和DHAM对照品保留时间相同，3号峰和DPAM保留时间相同。在样品中分别加入EPAM、DHAM和DPAM对照品，则1号、2号、3号峰分别增高，由此可见样品中1、2、3号峰分别为EPAM、DHAM和DPAM。后应用二极管陈列检测器，通过光谱比对也验证了该结果。
3.检测波长的选择
样品衍生后进液相色谱仪，用二极管陈列检测器记录色谱图，从3D图中提取三种脂肪酸的光谱图；以吸光系数和精密度为指标，选择合适的检测波长。
由光谱图可见，三种脂肪酸的极大吸收波长均为196.9nm，接近紫外末端，吸收值不稳定，故精密度较差，日内精密度RSD达3％以上；且大部分物质在196.6nm都有较强吸收，基线噪音较大。经尝试发现210nm处三种脂肪酸吸收较强且稳定，精密度也符合药典要求，故检测波长选用210nm。
4.测试浓度和取样量的选择
为减少系统误差，使定量更准确，结合标准曲线的结果，确定样品测定浓度约为0.1-0.3mg/ml左右；预定目的组分含量为5～10％，初步确定取样量为120μl，定容至100ml。
5.色谱柱的选择
根据目的组分的结构特点和理化性质，对以下三种色谱柱进行考察：(1)Allsphere Octyl(C8)，3μm，100，4.6mm×150mm；(2)Waters SymmetryShieldRP-18，5μm，100，3.9mm×150mm；(3)Lichrospher RP-18，5μm，100，4.6mm×250mm。
我们开始选用Allsphere Octyl柱，在乙腈-甲醇-水系统下反复调整各相比例，目的组份最好只能达到如图3的分离程度，于是换为Waters-C18柱。
由于Waters-C18柱为短柱，故出峰较快，柱效较低(见图4)，仍不能将目的组分基线分离。
最后换用Lichrospher RP-18柱，找到了最佳分离条件(见图5)。三种脂肪酸与杂质均完全基线分离，分离度均大于1.5，且峰对称性良好，故优选用LichrospherRP-18柱。
6.流动相的调整
对以下三种流动相体系进行考察：(1)甲醇∶水系统；(2)乙腈∶四氢呋喃∶水系统；(3)乙腈∶甲醇∶水系统。(见图6-8)
经反复调试，改变比例，最终发现系统(3)最好，在其比例为7∶1∶2时可使样品基线分离，三种目的组分与前后杂质峰的分离度都大于1∶7，峰对称性因子介于1到1.14之间，故选之。
7.流速的选择
在1.0ml/min流速下，目的组分出峰较晚，最后的DPAM要42分钟才能出峰(见图9)。这不仅浪费流动相，更使峰形展宽，分离度下降，影响定量准确性。因此，将流速逐渐提高至1.1-1.5ml/min，最后发现在流速为1.2ml/min时各项指标达到最佳，故选用该流速。
8.柱温的选择
分别考察样品在室温、30℃、45℃时的分离效果，室温(约20℃)及30℃时峰形展宽，分离变差，见图10、11。原因可能是由于温度较低时三种脂肪酸甲酯在固定相的溶解度发生变化，其与固定相的吸附解析过程时间变长，故峰展宽。经试验对比发现45℃分离最佳。
9.色谱条件的确立与系统适用性试验
综上可知，最佳色谱条件为：
色谱柱：Lichrospher RP-18，5μm，100A，4.6mm×250mm；
流动相：乙腈∶甲醇∶水＝7∶1∶2，等梯度洗脱；
流速：1.2ml/min；柱温：45℃；检测波长：210nm；进样量：20μl。
                        实验例3
本实验例目的在于对于本发明所述液相色谱条件方法学验证。
1.线性范围
精密量取EPA甲酯标准液0.4ml、DHA甲酯标准液0.4ml、DPA甲酯标准液0.2ml置10ml棕色容量瓶中，异丙醇定容，作为混标溶液；将此混标液用异丙醇连续作7次倍比稀释，得8种不同浓度的系列混标液；分别取20μl进样，以峰面积对进样浓度进行回归，考察线性。
结果显示三种脂肪酸甲酯标准品峰面积Y与其浓度X呈良好线性，线性方程见下表6：
                  表6各组分线性范围、回归方程及相关系数
  组分   线性方程   线性范围(μg/ml)  相关系数r
  EPAM   Y＝4.576×108x-1.33909×10-3   3.12187-399.6  0.99994
  DHAM   Y＝3.83614×108x-1.02352×10-3   3.06562-392.4  0.99996
  DPAM   Y＝1.34167×107x-2.89529×10-4   1.55312-198.8  0.99993
2.精密度
取配好的系列混标液高、中低三个浓度，各连续进样5针，计算日内精密度，各连续三天进样，计算日间精密度，结果见下表7：
                                 表7精密度试验结果
组分                   日内精密度％RSD(n＝5)                   日间精密度％RSD(n＝3)
  高浓度   中浓度   低浓度   高浓度   中浓度   低浓度
  EPAM   0.080   0.094   0.737   0.975   0.880   0.965
  DHAM   0.161   0.238   1.335   0.935   0.895   0.929
  DPAM   0.452   1.390   1.892   1.166   1.283   1.963
3.检测限及定量限
将混标溶液用异丙醇连续倍比稀释后进样，测出的三种脂肪酸甲酯的信号与空白样品测出的噪音信号进行比较，以信噪比约为3∶1时，相应浓度确定检测限，以信噪比约为10∶1时，相应浓度确定定量限，结果见表9。
          表9各组份检测限及定量限
  组分   检测限(μg/ml)   定量限(μg/ml)
  EPAM   0.36   1.21
  DHAM   0.35   1.18
  DPAM   0.40   1.34
4.专属性
4.1空白试验
取空白样品进样，记录色谱图，考察其他成分对样品分析有无干扰。
图12中上面为样品色谱图，下面为空白试验色谱图，对比可以看出冰醋酸、醋酸钠、BHT出峰时间较早，对样品分析均无干扰。
4.2峰纯度检查
样品衍生后进液相色谱仪，用二极管陈列检测器记录色谱图，计算峰纯度，见表10。
色谱工作站计算的三种脂肪酸甲酯色谱峰的纯度角均小于其纯度阈值，表明三者均为纯物质峰。
                    表10三种脂肪酸甲酯纯度角计算结果
Name RT Area Height   Purity1Angle   Purity1Threshold
  1   EPAM   20.526   2697638   124742   0.280   0.293
  2   DHAM   25.891   6125838   211120   0.234   0.288
  3   DPAM   33.557   2327500   64490   0.220   0.386
5.耐用性
5.1样品测试液稳定性考察
样品测试液配好后4℃放置，分别于0、2、4、8、12、24小时各取20μl进样2次，考察其稳定性。
由下表11可见，样品测试液随放置时间的延长，目的组分含量有下降趋势，但变化不大，在24小时内三种主成分含量的RSD均小于5％，故可以认为样品测试液在4℃放置24小时是稳定的。但样品测试液长时间放置不稳定，室温放置更会加速其降解，因此样品衍生后应及时测定。
             表11衍生化产物4℃放置稳定性考察结果
  放置时间h   EPAM平均峰面积   DHAM平均峰面积   DPAM平均峰面积
  0   4715461   6388976   2345467
  4   5233537   6193141   2358255
  8   4839895   6207655   2351127
  12   4722964   6211872   2365919
  24   4727123   6193824   2353844
  平均值   4847796   6239094   2354923
  标准差   224651   84195   7698
  RSD％   4.572   1.349   0.327
5.2不同仪器及色谱柱对分离的影响
将岛津(Shimadzu)2010A高效液相色谱仪换为Waters高效液相色谱仪，将LichrospherRP-18色谱柱换为同类型的Mightsil RP-18柱(5μm，100A，4.6mm×250mm)，考察方法耐用性。
图13为用Mightsil RP-18柱得到的结果，可见样品在两个色谱柱均可得良好分离；峰纯度检查在Waters高效液相色谱仪上进行，结果也显示方法耐用性良好。
6.准确度
将三种脂肪酸标准液用异丙醇作10倍稀释；准确称取已准确定量的海狗油9份各12μl，置10ml棕色容量瓶中，分别定量加入EPAM和DHAM标准稀释液1.2、1.0、0.8ml，加入DPAM标准稀释液0.6、0.5、0.4ml；每种浓度3份，衍生后定容进样，测定三种脂肪酸的含量，以加标液测定平均值为M，原样品液含量平均值为P，加标量为A，照下式计算回收率∶回收率＝(M-P)/A×100％
                    表12EPA甲酯加标回收率计算结果表
序号   本底含量(μg/ml)   加标量(μg/ml)   测得含量(μg/ml) 回收率   平均回收率 RSD％
  1   71.75588   79.92   150.962   99.11％ 98.04％ 1.215％
  2   73.4426   79.92   150.324   96.20％
  3   71.6856   79.92   150.632   98.78％
  4   72.17756   99.9   168.251   96.17％
  5   74.00484   99.9   171.325   97.42％
  6   71.12336   99.9   170.325   99.30％
  7   72.10728   119.8/8   190.354   98.64％
  8   72.037   119.88   190.365   98.71％
  9   71.75588   119.88   189.325   98.074％
                            表13DHA甲酯加标回收率计算结果表
序号   本底含量(μg/ml)   加标量(μg/ml)   测得含量(μg/ml) 回收率   平均回收率 RSD％
  1   99.5475   78.48   178.562   100.68％ 98.04％ 1.215％
  2   1014.8875   78.48   181.123   100.96％
  3   99.45   78.48   180.025   102.67％
  4   100.1325   98.1   199.687   101.48％
  5   102.6675   98.1   202.654   101.92％
  6   98.67   98.1   200.363   103.66％
  7   100.035   117.72   218.956   101.02％
  8   99.9375   117.72   217.023   99.46％
  9   99.5475   117.72   217.632   100.31％
                    表14DPA甲酯加标回收率计算结果表
序号   本底含量(μg/ml)   加标量(μg/ml)   测得含量(μg/ml) 回收率   平均回收率 RSD％
  1   43.45376   39.76   82.963   99.37％ 98.04％ 1.215％
  2   44.4752   39.24   81.964   95.54％
  3   43.4112   39.24   81.325   96.62％
  4   43.70912   49.05   91.756   97.95％
  5   44.81568   49.05   93.432   99.12％
  6   43.07072   49.05   91.324   98.38％
  7   43.66656   58.86   101.426   98.13％
  8   43.624   58.86   100.365   96.40％
  9   43.45376   58.86   100.658   97.19％
                   实验例4
本实验例为海狗油有效成分含量的分析。
准确称取海狗油5份，按上述步骤操作，外标法测定三种脂肪酸的含量，由外标法首先算得海狗油中脂肪酸相应甲酯的含量，要求得脂肪酸含量，尚需进行以下折算：
EPA含量＝EPAM含量×302.450/316.478＝EPAM含量×0.95567
DHA含量＝DHAM含量×328.487/342.515＝DHAM含量×0.95904
DPA含量＝DPAM含量×330.530/344.531＝DPAM含量×0.95936
表15样品中三种多烯脂肪酸百分含量(W/W)结果表
  编号   EPA含量   DHA含量   DPA含量
  1   6.92   9.76   4.18
  2   6.98   9.64   4.35
  3   7.06   9.82   4.29
  4   7.15   9.75   4.21
  5   7.03   9.78   4.25
  平均值   7.028   9.75   4.256
  RSD   1.23％   0.69％   1.57％

Claims (10)

1.脂肪油中有效成分的一种测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)脂肪油的衍生化处理：
取脂肪油与含0.2-1.0mol/L醇的碱金属盐以1∶30-100体积比混合摇匀，在0-60℃下反应至小油滴完全消失，再加入酸终止反应，用醇定容，过滤，得衍生处理过的脂肪油供试品溶液；
2)色谱进样分析
取衍生处理后的脂肪油，进入液相色谱仪，所述的色谱仪的色谱条件为：
流动相：甲醇水系统、乙腈四氢呋喃水系统或乙腈甲醇水系统，等梯度洗脱，
流速：1.1-1.5ml/min，
柱温：15-45℃，
检测波长：202～230nm，
进样量：5～50μl；
3)记录色谱图，用外标法测定脂肪酸的含量。
2.根据权利要求1所述的脂肪油中有效成分的一种测定方法，其特征在于，基中，步骤1)脂肪油的衍生化处理：取脂肪油80-120μl，加入0.2-1.0mol/L醇的碱金属盐4-8ml，摇匀，在0-60℃下反应至小油滴完全消失，再加入0.2-0.5ml酸终止反应，用醇定容，0.2μm-0.3μm滤膜过滤，得衍生处理过的脂肪油供试品溶液。
3.根据权利要求1或2所述的脂肪油中有效成分的一种测定方法，其特征在于，所述的衍生化处理方法为：取脂肪油100-120μl，加入0.5-0.8mol/L的甲醇钠4-6ml，摇匀，室温反应15-30分钟，至小油滴完全消失，再加入0.2-0.4ml冰醋酸终止反应，用甲醇定容，0.2μm滤膜过滤，得衍生处理过的脂肪油供试品溶液。
4.根据权利要求1-3中任意一种所述的脂肪油中有效成分的一种测定方法，其特征在于，所述的醇的碱金属盐可为甲醇钠、乙醇钠或甲醇钾，优选为甲醇钠；定容所用的醇为甲醇或乙醇；所述的终止反应所用的酸为冰醋酸、甲酸、三氟乙酸或硫酸中的任意一种。
5.根据权利要求1-3中任意一种所述的脂肪油中有效成分的一种测定方法，其特征在于，定容时可加0.001％-0.005％的抗氧化剂，所述的抗氧化剂为2，6-二叔丁基对甲酚或对羟基叔丁基茴香醚。
6.根据权利要求1-3中任意一种所述的脂肪油中有效成分的一种测定方法，其特征在于，所述的衍生化处理方法为：取脂肪油100-120μl，加入0.5-0.8mol/L的甲醇钠4-6ml，摇匀，室温反应15-30分钟，至小油滴完全消失，再加入0.2-0.4ml冰醋酸终止反应，用含0.003％-0.005％ 2，6-二叔丁基对甲酚的甲醇定容，0.2μm滤膜过滤，得衍生处理过的脂肪油供试品溶液。
7.根据权利要求1-3中任意一种所述的脂肪油中有效成分的一种测定方法，其特征在于，所述的液相色谱仪为RP-18型，5μm，100，4.6mm×250mm型号。
8.根据权利要求1-3中任意一种所述的脂肪油中有效成分的一种测定方法，其特征在于，所述的流动相为乙腈甲醇水系统，三者比例为7∶1∶2，流速为1.2ml/min。
9.海狗油中有效成分的一种测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)海狗油的衍生化处理：
取海狗油80-120μ1，加入0.2-1.0mol/L甲醇钠4-8ml，摇匀，在0-60℃下反应至小油滴完全消失，再加入0.2-0.5ml冰醋酸终止反应，用含0.001％-0.005％ 2，6-二叔丁基对甲酚的醇定容，0.2μm-0.3μm滤膜过滤，得衍生处理过的海狗油供试品溶液；
2)色谱进样分析
取衍生处理后的海狗油供试品溶液，进入液相色谱仪，所述的色谱仪的色谱条件为：
流动相：甲醇水系统、乙腈四氢呋喃水系统或乙腈甲醇水系统，等梯度洗脱，
流速：1.1-1.5ml/min，
柱温：15-45℃，
检测波长：202-230nm，
进样量：5～50μl；
3)记录色谱图，用外标法测定脂肪酸的含量。
10.根据权利要求9所述的海狗油中有效成分的一种测定方法，其特征在于，所述的衍生化处理方法为：取海狗油120μl，加入0.5mol/L甲醇钠4ml，摇匀，室温反应至小油滴完全消失，再加入0.2ml冰醋酸终止反应，用含0.005％ 2，6-二叔丁基对甲酚的甲醇定容，0.2μm滤膜过滤，得衍生处理过的海狗油供试品溶液。
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