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CN1255678C - 四季三黄胶囊活性成分含量检测方法 - Google Patents

四季三黄胶囊活性成分含量检测方法 Download PDF

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CN1255678C
CN1255678C CN 03116638 CN03116638A CN1255678C CN 1255678 C CN1255678 C CN 1255678C CN 03116638 CN03116638 CN 03116638 CN 03116638 A CN03116638 A CN 03116638A CN 1255678 C CN1255678 C CN 1255678C
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董大伦
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GUIYANG XINTIAN PHARMACEUTICAL INDUSTRY Co Ltd
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GUIYANG XINTIAN PHARMACEUTICAL INDUSTRY Co Ltd
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Abstract

本发明涉及中药复方制剂四季三黄胶囊活性成分含量的检测方法。本发明采用高效液相色谱法，分别定量测定四季三黄胶囊中各活性成分：大黄中的大黄素和大黄酚、黄柏中的盐酸小檗碱、黄芩中的黄芩苷。该方法快速、准确、灵敏，提供了一种有效地监控四季三黄胶囊质量的手段。

Description

四季三黄胶囊活性成分含量检测方法
技术领域
本发明涉及药物活性成分检测方法，具体涉及中药复方制剂四季三黄胶囊活性成分含量的检测方法。
背景技术
四季三黄胶囊处方由大黄、黄柏、黄芩、桅子组成，具有消炎退热，通便利水功能。主治口鼻生疮，咽痛齿痛，口干舌燥，目眩头晕，大便秘结，小便赤黄等。该处方为较经典的消炎退热中药复方，原一直以丸剂形式服用。该丸剂为生药原粉水泛丸而制成，由于其服用量较大，加之水泛丸易长菌生霉，且不便于部分患者尤其是小儿服用，生物利用度也低，因此，近年来通过采用现代药学技术理论，运用新的提取制备工艺，将丸剂改成胶囊剂，克服了老剂型的不足，便于有效成分的吸收，增强药物的疗效，为患者提供一个质优效佳、携带服用方便的新型中药制剂。
但对四季三黄胶囊的有效成分含量检测一直采用半定量的方式，如活性成分大黄素含量的检测是以大黄素为对照品，采用薄层色谱法，在紫外光365nm下测得，黄柏含量以盐酸小檗碱为对照品，同样采用薄层色谱法测得；黄芩含量以黄芩苷为对照品，用紫外分光光度法测得。这些方法操作繁琐，准确度差，精确度低，重现性受干扰因素较多，不能迅速及时地获得分析数据。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是采用现代分析仪器和手段，快速准确地定量测定四季三黄胶囊的活性成分含量。
本发明采用高效液相色谱法，分别定量测定四季三黄胶囊中各活性成分：大黄中的大黄素和大黄酚、黄柏中的盐酸小檗碱、黄芩中的黄芩苷，具体测定方法包括：
(1)大黄素和大黄酚测定
a、色谱条件与系统适用性试验：
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇∶0.1％磷酸镕液＝85∶15为流动相；流速0.8ml/min；检测波长254nm；柱温25℃。理论板数按大黄素峰计算应不低于1500；
b、对照品溶液的制备：
精密称取大黄素、大黄酚对照品各10mg，分别置100ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；分别精密量取大黄素溶液1ml、大黄酚溶液2ml，分别置25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得，大黄素每1ml含4μg、大黄酚每1ml含8μg；
c、供试品溶液的制备：
取本品内容物约0.1g，精密称定，置50ml锥形瓶中，精密加甲醇25ml，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置50ml圆底烧瓶中，挥去甲醇，加2.5mol/L硫酸溶液10ml，超声处理5分钟，再加氯仿10ml，加热回流1小时，冷却，移至分液漏斗中，用少量氯仿洗涤容器，并入分液漏斗中，分取氯仿层，酸液用氯仿提取2次，每次约8ml，合并氯仿液，以无水硫酸钠脱水，挥去氯仿，残渣加甲醇溶解，定容至10ml容量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
d、测定法：
分别精密吸取供试品溶液10μl，对照品溶液10μl注入液相色谱仪，测定，即得；
每粒含大黄以大黄素(C15H10O5)和大黄酚(C15H10O4)的总量计，不得少于2.0mg。
(2)盐酸小檗碱测定
a、色谱条件与系统适用性试验：
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈：0.1mol/L磷酸二氢钾溶液：0.025mol/L十二烷基硫酸钠溶液(50∶25∶25)为流动相；流速0.8ml/min；检测波长345nm；柱温25℃，理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于5000；
b、对照品溶液的制备：
精密称取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.040mg的溶液，即得；
c、供试品溶液的制备：
取本品内容物约0.2g，精密称定，置25ml量瓶中，加入盐酸-甲醇(1∶100)约15ml，超声处理10分钟(功率不少于150W，频率不少于12KHz)，放冷至室温后，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，即得；
d、测定法：
分别精密吸取供试品溶液10μl，对照品溶液10μl注入液相色谱仪，测定，即得；
每粒含黄柏以盐酸小檗碱(C20H18ClNO4)计，不得少于0.8mg。
(3)黄芩苷的测定：
a、色谱条件与系统适用性试验：
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇∶水∶磷酸(47∶53∶0.2)为流动相；流速1.0ml/min；检测波长280nm；柱温25℃；理论板数按黄芩苷峰计算应不低于2500；
b、对照品溶液的制备：
精密称取在60℃减压干燥4小时的黄芩苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.060mg的溶液，即得；
c、供试品溶液的制备：
取本品约1g，精密称定，加70％乙醇40ml，加热回流3小时，放冷，滤过，滤液置100ml量瓶中，用少量70％乙醇分次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加70％乙醇至刻度，摇匀；精密量取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；
d、测定法：
分别精密吸取供试品溶液10μl，对照品溶液10μl注入液相色谱仪，测定，即得；
每粒含黄芩以黄芩苷(C21H18O11)计，不得少于10.0mg。
本发明所述四季三黄胶囊处方组成为：大黄452.8g，黄柏452.8g，黄芩452.8g，桅子141.5g。
其制剂制备包括：黄芩、桅子加水煎煮，滤过，滤液浓缩至浸膏，喷雾干燥，得喷雾粉备用。大黄用乙醇回流提取，滤过，合并滤液，回收乙醇，浓缩至浸膏，喷雾干燥，得喷雾粉备用。大黄药渣回收，干燥，粉碎成细粉备用。黄柏用乙醇回流提取，滤过，合并滤液，回收乙醇，浓缩至浸膏备用。将两种喷雾粉合并，加入适量大黄药渣细粉，用黄柏浸膏制粒，粉碎，干燥，混合，填充胶囊，即得。
下面对本发明分析方法的建立作进一步描述：
1.大黄素和大黄酚总量的含量测定
(1)仪器与试药
高效液相色谱仪：Elite Hypersil C18柱，5μm，4.6×250mm；G1314A(VWD检测器)；Agilent化学1100工作站；甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水。
色谱条件
流动相：甲醇-0.1％磷酸溶液(85∶15)；流速：0.8ml/min；检测波长：254nm；柱温：25℃。此条件下大黄素和大黄酚与其它组分达到较好分离。波长选择参照《中国药典》2000年版“大黄”项下，选择254nm作为检测波长。
(2)线性关系的考察
精密称取大黄素对照品适量，加甲醇制成8.08μg/ml的溶液，精密吸取上述溶液2ml，5ml，10ml，15ml，20ml于20ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，各进样10μl，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积值为纵坐标，大黄素对照品进样量为横坐标绘制标准曲线，计算的回归方程为：
Y＝4445.25X-1.7317 r＝0.9999
具体数据见表1
表1  大黄素对照品线性考察结果
    对照品进样量(μg)     峰面积
    0.00808     35.2
    0.0202     88.1
    0.0404     175.5
    0.0606     268.6
    0.0808     357.8
表明大黄素在0.00808-0.0808μg范围内具有良好线性关系。
精密称取大黄酚对照品适量，加甲醇制成16.16μg/ml的溶液，精密吸取上述溶液2ml，5ml，10ml，15ml，20ml于20ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，各进样10μl，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积值为纵坐标，大黄酚对照品进样量为横坐标绘制标准曲线，计算的回归方程为：
Y＝6491.91X-5.8879 r＝1.0000
具体数据见表2
表2  大黄酚对照品线性考察结果
    对照品进样量(μg)     峰面积
    0.01616     99.8
    0.0404     254.7
    0.0808     519.9
    0.1212     780.7
    0.1616     1043.1
表明大黄酚在0.01616-0.1616μg范围内具有良好线性关系。
(3)精密度试验
精密吸取大黄素对照品溶液(0.00404mg/ml)10μl重复进样5次，大黄素峰面积积分值的相对标准偏差＜2％，结果列于表3。
表3  大黄素对照品精密度试验结果
    实验次数     峰面积     RSD％
    1     171.3     1.4％
    2     173.1
    3     174.7
    4     176.7
    5     176.9
精密吸取大黄酚对照品溶液(0.00808mg/ml)10μl重复进样5次，大黄酚峰面积积分值的相对标准偏差＜2％，结果列于表4。
表4  大黄酚对照品精密度试验结果
    实验次数     峰面积     RSD％
    1     558.6     0.6％
    2     555.8
    3     557.0
    4     556.1
    5     563.7
(4)稳定性试验
对照品的稳定性试验：
取大黄素对照品溶液(0.00404mg/ml)10μl，每隔一定时间进样一次，测得大黄素的峰面积值的相对标准偏差＜2％，结果见表5。
表5  大黄素对照品的稳定性试验结果
    时间     峰面积     RSD％
    1小时     171.3 1.6％
    2小时     175.4
    4小时     171.5
    8小时     173.4
    12小时     178.6
    24小时     173.8
取大黄酚对照品溶液(0.00808mg/ml)10μl，每隔一定时间进样一次，测得大黄酚的峰面积值的相对标准偏差＜2％，结果见表6。
表6  大黄酚对照品的稳定性试验结果
    时间     峰面积     RSD％
    1小时     558.6 1.2％
    2小时     563.7
    4小时     551.8
    8小时     546.0
    12小时     547.5
    24小时     555.7
样品的稳定性试验：
取四季三黄胶囊(批号20000903)照正文测定方法制备供试品溶液，精密吸取该溶液10μl，每隔一定时间进样一次，测得大黄素和大黄酚的峰面积积分值的相对标准偏差＜2％，结果见表7-8。
表7  样品的稳定性试验结果(大黄素峰)
    时间     峰面积     RSD％
    1小时     278.6 0.5％
    2小时     279.5
    4小时     281.7
    8小时     281.8
    12小时     281.4
    24小时     280.3
表8  样品的稳定性试验结果(大黄酚峰)
    时间     峰面积     RSD％
    1小时     813.0 0.5％
    2小时     809.1
    4小时     805.9
    8小时     808.0
    12小时     803.2
    24小时     803.7
(5)回收率试验
大黄素回收率试验
采用加样回收法，取已知含量的四季三黄胶囊(批号20000903，含量为3.132mg/g)样品，分别称取样品约0.04g(5份)，精密加入大黄素对照品溶液(0.10mg/ml)1ml按上述方法测定，以下式计算回收率，结果列于表9，结果表明本法有良好的回收率。
Figure C0311663800111
表9  回收率实验结果
取样量(g) 取样大黄素含量(mg) 添加大黄素的量(mg) 测出大黄素的量(mg)   回收率(％) 平均回收率(％) RSD(％)
 0.0415     0.1300     0.101     0.2280   97.03     99.5     2.9
 0.0350     0.1096     0.101     0.2063   95.74
 0.0484     0.1516     0.101     0.2536   100.99
 0.0463     0.1450     0.101     0.2480   101.98
 0.0548     0.1716     0.101     0.2743   101.68
大黄酚回收率试验
采用加样回收法，取已知含量的四季三黄胶囊(批号20000903，含量为5.724mg/g)样品，分别称取样品约0.05g(5份)，精密加入大黄酚对照品溶液(0.101mg/ml)3ml按上述方法测定，以下式计算回收率，结果列于表10，结果表明本法有良好的回收率。
表10  回收率实验结果
取样量(g) 取样大黄酚含量(mg) 添加大黄酚的量(mg) 测出大黄酚的量(mg) 回收率(％) 平均回收率(％)   RSD(％)
 0.0491     0.2810     0.303     0.5901   102.01     98.1     2.3
 0.0485     0.2776     0.303     0.5744   97.95
 0.0456     0.2610     0.303     0.5524   96.17
 0.0519     0.2971     0.303     0.5908   96.93
 0.0461     0.2639     0.303     0.5596   97.59
(6)重复性试验
取四季三黄胶囊(批号20000903)，按上述样品测定法进行含量测定，平行样5份，样品测定结果的相对标准偏差＜2％，结果见表11。
表11  重复性试验结果
    称样量   含量(mg/g)     RSD％
    0.1007     8.847     0.1
    0.0986     8.863
    0.1006     8.844
    0.1012     8.868
    0.1021     8.857
(7)样品测定
按正文所述的方法，进行样品测定，以下式计算样品中大黄素和大黄酚的含量，十批样品测定结果列于表12，由上述实验结果，确定本品含大黄素和大黄酚的总量不得低于2.0mg/粒。
Figure C0311663800121
As：供试品溶液的峰面积；  Ar：对照品溶液的峰面积；
Cs：对照品浓度(mg/ml)；
Vs：供试品取样量(g)；     V：定容体积(ml)
表12  样品测定结果
批号     大黄素和大黄酚的总含量(mg/粒)
    第一次     第二次     第三次
    1     3.262     3.250     3.256
    2     3.327     3.450     3.389
    3     3.566     3.497     3.531
    4     2.788     2.832     2.810
    5     2.926     2.888     2.907
    6     3.164     3.098     3.131
    7     3.066     3.084     3.075
    8     3.184     3.192     3.188
    9     2.554     2.566     2.560
    10     3.198     3.134     3.166
2.盐酸小檗碱的含量测定
(1)仪器与试药
高效液相色谱仪：Elite Hypersil C18柱，5μm，4.6×250mm；G1314A(VWD检测器)；Agilent化学1100工作站；甲醇、乙腈均为色谱纯，水为重蒸馏水。
色谱条件
流动相：乙腈：0.1mol/L磷酸二氢钾溶液：0.025mol/L十二烷基硫酸钠溶液(50∶25∶25)；流速：0.8ml/min；检测波长：345nm；柱温：25℃。此条件下盐酸小檗碱与其它组分达到较好分离。波长选择时，以盐酸小檗碱对照品溶液进行紫外扫描(200-500nm)，其最大吸收峰为345nm，故选择345nm作为检测波长。
(2)线性关系的考察
精密称取对照品适量，加甲醇制成0.082mg/ml的溶液，精密吸取上述溶液4ml，5ml，10ml，15ml，20ml于20ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，各进样10μl，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积值为纵坐标，盐酸小檗碱进样量为横坐标绘制标准曲线，计算的回归方程为：
Y＝4541.8X+42.391 r＝0.9999
具体数据见表13
表13  线性考察结果
    对照品进样量(μg)     峰面积
    0.164     767.7
    0.205     972.3
    0.410     1929.5
    0.615     2851.8
    0.820     3746.3
表明盐酸小檗碱在0.164-0.820μg范围内具有良好线性关系。
(3)精密度试验
精密吸取对照品溶液(0.0424mg/ml)10μl重复进样5次，盐酸小檗碱峰面积积分值的相对标准偏差＜2％，结果列于表14。
表14  精密度试验结果
    实验次数     峰面积     RSD％
    1     2081.1     0.5％
    2     2073.6
    3     2056.8
    4     2063.6
    5     2080.9
(4)稳定性试验
对照品的稳定性试验
取上述对照品溶液(0.0424mg/ml)10μl，每隔一定时间进样一次，测得盐酸小檗碱的峰面积值的相对标准偏差＜2％，结果见表15。
表15  对照品的稳定性试验结果
    时间     峰面积     RSD％
    1小时     2073.6 0.5％
    2小时     2080.9
    4小时     2103.5
    8小时     2091.6
    12小时     2083.3
    24小时     2082.8
样品的稳定性试验
取四季三黄胶囊(批号20000903)照正文测定方法制备供试品溶液，精密吸取该溶液10μl，每隔一定时间进样一次，测得盐酸小檗碱峰面积积分值的相对标准偏差＜2％，结果见表16。
表16  样品的稳定性试验结果
    时间     峰面积     RSD％
    1小时     1371.2     1.0％
    2小时     1376.0
    4小时     1376.4
    8小时     1405.1
    12小时     1378.7
    24小时     1394.7
(5)回收率试验
采用加样回收法，取已知含量的四季三黄胶囊(批号20000903，含量为3.40mg/g)样品，精密称取约0.1g，再精密加入盐酸小檗碱对照品溶液(0.082mg/ml)3ml(平行样5份)，按上述方法测定，以下式计算回收率，结果列于表17，结果表明本法有良好的回收率。
Figure C0311663800151
表17  回收率实验结果
取样量(g) 取样相当盐酸小檗碱含量(mg)   添加盐酸小檗碱的量(mg) 测出盐酸小檗碱的总量(mg) 回收率(％) 平均回收率(％) RSD(％)
 0.0996   0.3386   0.246   0.5748   96.02     97.9     2.2
 0.0998   0.3393   0.246   0.5754   95.98
 0.1004   0.3414   0.246   0.5865   99.63
 0.1008   0.3427   0.246   0.5904   100.69
 0.0987   0.3356   0.246   0.5743   97.03
(6)重复性试验
取四季三黄胶囊(批号20000903)，按上述样品测定法进行含量测定，平行样5份，样品测定结果的相对标准偏差＜2％，结果见表18。
表18  重复性试验结果
    称样量   含量(mg/g)     RSD％
    0.2115     3.397     0.2
    0.2001     3.394
    0.2007     3.410
    0.2118     3.402
    0.2074     3.398
(7)样品测定
按正文所述方法，进行样品测定，以下式计算样品中盐酸小檗碱的含量，十批样品测定结果列于表19，由上述实验结果，确定本品含盐酸小檗碱不得少于0.8mg/粒。
Figure C0311663800161
As：供试品溶液的峰面积；     Ar：对照品溶液的峰面积；
Cs：对照品浓度(mg/ml)；
Ms：供试品取样量(g)；        V：定容体积(m1)
表19  样品测定结果
批号     盐酸八檗碱的含量(mg/粒)
    第一次     第二次     第三次
    1     1.158     1.174     1.166
    2     1.213     1.183     1.198
    3     1.358     1.361     1.360
    4     1.188     1.165     1.176
    5     1.244     1.262     1.253
    6     1.296     1.287     1.292
    7     1.175     1.165     1.170
    8     2.254     2.243     2.248
    9     1.025     1.022     1.024
    10     2.508     2.437     2.472
3.黄芩苷的含量测定
(1)仪器与试药
高效液相色谱仪：Elite Hypersil C18柱，5μm，4.6×250mm；G1314A(VWD检测器)；Agilent化学1100工作站；甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水。
色谱条件
流动相：甲醇—水—磷酸(47∶53∶0.2)；流速：1.0ml/min；检测波长：280nm；柱温：25℃。此条件下黄芩苷与其它组分达到较好分离。波长选择时，以黄芩苷对照品溶液进行紫外扫描(200-500nm)，其最大吸收峰为280nm，故选择280nm作为检测波长。
(2)线性关系的考察
精密称取对照品适量，加甲醇制成0.119mg/ml的溶液，精密吸取上述溶液2，5，10，15，20于20ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，各进样10μl，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积值为纵坐标，黄芩苷进样量为横坐标绘制标准曲线，计算的回归方程为：
Y＝3287.2X-48.238 r＝1.000
具体数据见表20
表20  线性考察结果
    对照品进样量(μg)     峰面积
    0.119     332.6
    0.2975     940.6
    0.595     1917.2
    0.8925     2871.0
    1.19     3868.0
表明黄芩苷在0.119-1.19μg范围内具有良好线性关系。
(3)精密度试验
精密吸取上述对照品溶液(0.0604mg/ml)10μl重复进样5次，黄芩苷峰面积积分值的相对标准偏差＜2％，结果列于表21。
表21  精密度试验结果
    实验次数     峰面积     RSD％
    1     1942.3     1.4％
    2     1912.2
    3     1976.9
    4     1949.9
    5     1974.8
(4)稳定性试验
对照品的稳定性试验
取上述对照品溶液(0.0604mg/ml)10μl，每隔一定时间进样一次，测得黄芩苷的峰面积值的相对标准偏差＜2％，结果见表22。
表22  对照品的稳定性试验结果
    时间     峰面积     RSD％
    1小时     1942.3     1.2％
    2小时     1971.2
    4小时     2008.9
    8小时     1985.6
    12小时     1993.4
    24小时     1997.2
样品的稳定性试验
取四季三黄胶囊(批号20000903)照正文测定方法制备供试品溶液，精密吸取该溶液10μl，每隔一定时间进样一次，测得黄芩苷峰面积积分值的相对标准偏差＜2％，结果见表23。
表23  样品的稳定性试验结果
    时间     峰面积     RSD％
    1小时     946.1 0.5％
    2小时     947.9
    4小时     939.3
    8小时     936.9
    12小时     936.9
    24小时     944.3
(5)回收率试验
采用加样回收法，取已知含量的四季三黄胶囊(批号20000903，含量为28.9mg/g)样品，精密称取约0.8g，再精密加入黄芩苷对照品溶液(0.792mg/ml)5ml(平行样5份)，按上述方法测定，以下式计算回收率，结果列于表24，结果表明本法有良好的回收率。
表24   回收率实验结果
取样量(g)   取样相当黄芩苷含量(mg) 添加黄芩苷的量(mg) 测出黄芩苷的总量(mg) 回收率(％) 平均回收率(％) RSD(％)
  0.8006     23.137     3.96     27.082   99.62   100.62   2.2
  0.8462     24.455     3.96     28.500   102.15
  0.8556     24.727     3.96     28.817   103.28
  0.8092     23.386     3.96     27.369   100.58
  0.8086     23.369     3.96     27.229   97.47
(6)重复性试验
取四季三黄胶囊(批号20000903)，按上述样品测定法进行含量测定，平行样5份，样品测定结果的相对标准偏差＜2％，结果见表25。
表25  重复性试验结果
    称样量   含量(mg/g)     RSD％
    0.9786     28.91     0.7
    0.9767     29.24
    0.9246     28.85
    0.9768     28.70
    0.9711     28.93
(7)样品测定
按正文所述方法，进行样品测定，以下式计算样品中黄芩苷的含量，十批样品测定结果列于表26，由上述实验结果，确定本品含黄芩苷不得少于10mg/粒。
Figure C0311663800191
As：供试品溶液的峰面积；   Ar：对照品溶液的峰面积；
Cs：对照品浓度(mg/ml)；
Vs：供试品取样量(g)；      V：定容体积(ml)
表26  样品测定结果
批号     黄芩苷的含量(mg/粒)
    第一次     第二次     第三次
    1     10.73     10.93     10.83
    2     12.29     12.62     12.46
    3     11.70     11.44     11.57
    4     11.25     11.38     11.32
    5     12.58     12.84     12.71
    6     12.95     13.08     13.02
    7     12.41     12.74     12.58
    8     12.00     11.90     11.95
    9     15.03     14.92     14.98
    10     10.39     10.67     10.53
上述试验结果显示，本发明建立高效液相色谱法测定大黄素和大黄酚、盐酸小檗碱、黄芩苷的方法，操作简便，准确性好，精确度高，为工业化生产质量监控提供了一种科学、迅速的检测方法。
具体实施方式
实施例1  大黄素和大黄酚测定
a、色谱条件与系统适用性试验：
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇：0.1％磷酸镕液(85：15)为流动相；流速0.8ml/min；检测波长254nm；柱温25℃。理论板数按大黄素峰计算应不低于1500；
b、对照品溶液的制备：
精密称取大黄素、大黄酚对照品各10mg，分别置100ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；分别精密量取大黄素溶液1ml、大黄酚溶液2ml，分别置25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得，大黄素每1ml含4μg、大黄酚每1ml含8μg；
c、供试品溶液的制备：
取四季三黄胶囊内容物约0.1g，精密称定，置50ml锥形瓶中，精密加甲醇25ml，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置50ml圆底烧瓶中，挥去甲醇，加2.5mol/L硫酸溶液10ml，超声处理5分钟，再加氯仿10ml，加热回流1小时，冷却，移至分液漏斗中，用少量氯仿洗涤容器，并入分液漏斗中，分取氯仿层，酸液用氯仿提取2次，每次约8ml，合并氯仿液，以无水硫酸钠脱水，挥去氯仿，残渣加甲醇溶解，定容至10ml容量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
d、测定法：
分别精密吸取供试品溶液10μl，对照品溶液10μl注入液相色谱仪，测定，结果见图1。图中A1峰和A2峰分别为大黄素和大黄酚所对应的峰。
实施例2    盐酸小檗碱测定
a、色谱条件与系统适用性试验：
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈：0.1mol/L磷酸二氢钾溶液：0.025mol/L十二烷基硫酸钠溶液(50∶25∶25)为流动相；流速0.8ml/min；检测波长345nm；柱温25℃，理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于5000；
b、对照品溶液的制备：
精密称取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.040mg的溶液，即得；
C、供试品溶液的制备：
取四季三黄胶囊内容物约0.2g，精密称定，置25ml量瓶中，加入盐酸-甲醇(1∶100)约15ml，超声处理10分钟(功率不少于150W，频率不少于12KHz)，放冷至室温后，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，即得；
d、测定法：
分别精密吸取供试品溶液10μl，对照品溶液10μl注入液相色谱仪，测定，即得，见图2，其中B峰即为盐酸小檗碱所对应的峰。
实施例3    黄芩苷的测定
a、色谱条件与系统适用性试验：
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇∶水∶磷酸(47∶53∶0.2)为流动相；流速1.0ml/min；检测波长280nm；柱温25℃；理论板数按黄芩苷峰计算应不低于2500；
b、对照品溶液的制备：
精密称取在60℃减压干燥4小时的黄芩苷对照品适量，加甲醇制成每lml含0.060mg的溶液，即得；
c、供试品溶液的制备：
取四季三黄胶囊内容物约1g，精密称定，加70％乙醇40ml，加热回流3小时，放冷，滤过，滤液置100ml量瓶中，用少量70％乙醇分次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加70％乙醇至刻度，摇匀；精密量取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；
d、测定法：
分别精密吸取供试品溶液10μl，对照品溶液10μl注入液相色谱仪，测定，即得，见图3，其中C峰即为黄芩苷所对应的峰。
附图说明
图1大黄素、大黄酚色谱图
图2盐酸小檗碱色谱图
图3黄芩苷色谱图

Claims (1)

1、一种中药复方制剂四季三黄胶囊活性成分含量的检测方法，其特征在于所述活性成分采用高效液相色谱法，分别定量测定各活性成分：大黄中的大黄素和大黄酚、黄柏中的盐酸小檗碱、黄芩中的黄芩苷的含量；其中：
(1)活性成分大黄素和大黄酚的测定包括：
a、色谱条件与系统适用性试验：
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇∶0.1％磷酸镕液＝85∶15为流动相；流速0.8ml/min；检测波长254nm；柱温25℃；理论板数按大黄素峰计算应不低于1500；
b、对照品溶液的制备：
精密称取大黄素、大黄酚对照品各10mg，分别置100ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；分别精密量取大黄素溶液1ml、大黄酚溶液2ml，分别置25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得，大黄素每1ml含4μg、大黄酚每1ml含8μg；
c、供试品溶液的制备：
取本品内容物约0.1g，精密称定，置50ml锥形瓶中，精密加甲醇25ml，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置50ml圆底烧瓶中，挥去甲醇，加2.5mol/L硫酸溶液10ml，超声处理5分钟，再加氯仿10ml，加热回流1小时，冷却，移至分液漏斗中，用少量氯仿洗涤容器，并入分液漏斗中，分取氯仿层，酸液用氯仿提取2次，每次约8ml，合并氯仿液，以无水硫酸钠脱水，挥去氯仿，残渣加甲醇溶解，定容至10ml容量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
d、测定法：
分别精密吸取供试品溶液10μl，对照品溶液10μl注入液相色谱仪，测定，即得；
(2)活性成分黄柏中盐酸小檗碱测定方法包括：
a、色谱条件与系统适用性试验：
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈∶0.1mol/L磷酸二氢钾溶液∶0.025mol/L十二烷基硫酸钠溶液＝50∶25∶25为流动相；流速0.8ml/min；检测波长345nm；柱温25℃，理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于5000；
b、对照品溶液的制备：
精密称取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.040mg的溶液，即得；
c、供试品溶液的制备：
取本品内容物约0.2g，精密称定，置25ml量瓶中，加入15ml盐酸-甲醇溶液，比例为盐酸∶甲醇＝1∶100，超声处理10分钟，功率不少于150W，频率不少于12KHz，放冷至室温后，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，即得；
d、测定法：
分别精密吸取供试品溶液10μl，对照品溶液10μl注入液相色谱仪，测定，即得；
(3)活性成分黄芩中的黄芩苷的测定包括：
a、色谱条件与系统适用性试验：
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇∶水∶磷酸＝47∶53∶0.2为流动相；流速1.0ml/min；检测波长280nm；柱温25℃；理论板数按黄芩苷峰计算应不低于2500；
b、对照品溶液的制备：
精密称取在60℃减压干燥4小时的黄芩苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.060mg的溶液，即得；
c、供试品溶液的制备：
取本品约1g，精密称定，加70％乙醇40ml，加热回流3小时，放冷，滤过，滤液置100ml量瓶中，用少量70％乙醇分次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加70％乙醇至刻度，摇匀；精密量取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；
d、测定法：
分别精密吸取供试品溶液10μl，对照品溶液10μl注入液相色谱仪，测定，即得。
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