CN1735690A - 硫酯酶相关核酸序列及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及与脂肪酸合成、尤其是饱和脂肪和不饱和脂肪比率相关的核酸分子和核酸构建体以及其它因子。此外，本发明涉及掺入这类因子的植物，其中所述植物表现出改变的饱和脂肪和不饱和脂肪比率。具体地讲，本发明涉及掺入这类因子的植物，其中所述植物表现出改变的饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸水平。

Description

硫酯酶相关核酸序列及方法

                    发明领域

本发明涉及与脂肪酸合成相关的核酸分子和核酸构建体以及其它因子(agents)。此外，本发明涉及掺入这类因子的植物，其中所述植物表现出改变的饱和脂肪和不饱和脂肪比率。具体地讲，本发明涉及掺入这类因子的植物，其中所述植物表现出改变的饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸比率。

                       背景

植物油用于各种各样的应用。需要从生物合成来源或天然植物资源中获得新的植物油组成以及获得油组成的改进方法。根据预期的油脂用途，需要各种不同组成的脂肪酸。植物、尤其是在植物种子中合成大量油脂的植物种类，是食用油和工业用油的重要来源。

除了椰子胚乳油和棕榈仁油(都含有大量的月桂酸(C12:0))以外，普通食用油基本上全都由棕榈酸(16:0)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1)、亚油酸(18:2)和亚麻酸(18:3)组成。许多油料种子植物具有非常高水平的饱和脂肪酸。椰子油含有超过90％的饱和脂肪酸，主要是月桂酸(12:0)和范围在C6至C16的其它中链脂肪酸。其它高饱和油包括具有高水平的棕榈酸(16:0)和硬脂酸(18:0)(至多约60％的酰基链)的油。这些油包括来源于可可脂(25％棕榈酸；34％硬脂酸)和油棕中果皮(45％棕榈酸；15％硬脂酸)的油。通常，大豆油含有约16-20％的饱和脂肪酸：13-16％棕榈酸和3-4％硬脂酸。Voelk.er等，52 Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.335-61(2001)。

对于许多油脂应用而言，饱和脂肪酸水平优选小于6％(重量)，更优选约2-3％(重量)。饱和脂肪酸具有不需要的高熔点而且在低温下浑浊。消费者和食品工业最好使用含有低饱和脂肪酸水平的油生产的产品，因为它们被认为是更健康的和/或可以按照FDA的指南标识为“无饱和脂肪酸”产品或“无反式脂肪”产品。具有低饱和脂肪酸水平的油脂具有改进的冷流性能(该性能在生物柴油(biodiesel)和润滑剂应用上是重要的)以及在低温下不浑浊，因而不需要或较少需要对所述油进行冬化，用于食品应用，例如色拉油。

高等植物在质体中通过脂肪酸合成酶(FAS)途径合成脂肪酸。在正在开发的油料种子中，大多数脂肪酸连接在甘油主链上，形成甘油三酯，作为能源贮藏起来。

β-酮脂酰-ACP合酶I催化延伸反应直到棕榈酰-ACP(C16:0)，而β-酮脂酰-ACP合酶II催化最终的延伸反应直到硬脂酰-ACP(C18:0)。通常，贮藏甘油三酯中存在的植物不饱和脂肪酸例如油酸、亚油酸和亚麻酸，在由可溶性质体δ-9去饱和酶(通常也称为“硬脂酰-ACP去饱和酶”)催化的反应中，来源于硬脂酰-ACP的去饱和，形成油酰-ACP(C18:1)。继而通过膜结合的δ-12去饱和酶和δ-15去饱和酶的作用影响其它的去饱和作用。因而，这些“去饱和酶”产生多不饱和脂肪酸。

特殊的硫酯酶可以通过将新产生的酰基-ACP水解成游离脂肪酸和ACP，而终止脂肪酸链的延伸。随后，游离脂肪酸在质体膜中转化成脂酰-CoA并输出到细胞质，在此它们可掺入到内质网(ER)脂质生物合成途径(Kennedy途径)，该途径负责磷脂、甘油三酯和其它中性脂质的形成。因为植物酰基-ACP硫酯酶在脂肪酸合成中的作用以及它们在植物油料种子生物工程中的用途，所以它是生物化学的目标。在植物脂肪酸的从头生物合成中，硫酯酶在决定链长方面起重要作用，因此，这些酶可用于提供各种改良的脂酰组成、尤其是提供种子贮藏油中存在的各种相对比例的脂酰基。

植物硫酯酶按其序列同源性和底物偏好可分为两个基因家族。第一个基因家族FATA包括主要对油酰-ACP(18:1-ACP)具有活性的长链酰基-ACP硫酯酶。油酰-ACP是通过ER脂质生物合成途径合成的磷脂和甘油三酯中存在的多数脂肪酸的直接前体。第二类植物硫酯酶FATB包括在大多数植物中利用棕榈酰-ACP(16:0-ACP)、硬脂酰-ACP(18:0-ACP)和油酰-ACP(18:1-ACP)的酶。FATB酶已从下列植物中分离出来：加州月桂(Umbellularia californica)(美国专利第5,955,329号、美国专利第5,723,761号)、榆(美国专利第5,723,761号)、Cuphea hookeriana(美国专利第5,723,761号)、Cuphea palustris(美国专利第5,955,329号)、披针叶萼距花(Cuphea lanceolata)、肉豆蔻、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、芒果(美国专利第5,723,761号)、韭葱(美国专利第5,723,761号)、樟(Cinnamomum camphora)(美国专利第5,955,329号)、双低油菜(canola)(美国专利第5,955,650号)和玉米(美国专利第6,331,664号)。

获得能在FAS中产生表型结果的核酸序列、脂肪酸去饱和和/或将脂肪酸掺入到甘油主链中产生油，从而克服了包括但不限于以下的许多障碍：目标代谢因子的鉴定、具有有用的动力学特性的酶源的选择和表征、以容许其氨基酸测序的水平的目标蛋白的纯化、利用氨基酸序列数据得到能用作探针的核酸序列以寻找所需DNA序列，以及基因构建体的的制备、转化和所得植物的分析。

因此，需要用于改良脂肪酸组成的额外核酸靶和方法。特别是需要产生各种各样的不同脂肪酸组成的构建体和方法。

                      发明概述

本发明提供一种基本纯化的核酸分子，所述核酸分子包含一种与SEQ ID NO：2或其互补序列有至少70％序列同一性的核酸序列。本发明也提供一种基本纯化的核酸分子，所述核酸分子包含一种与SEQ ID NO：3或其互补序列有至少70％序列同一性的核酸序列。本发明也提供一种基本纯化的核酸分子，所述核酸分子包含一种与SEQID NO：4或其互补序列有至少70％序列同一性的核酸序列。本发明也提供一种基本纯化的核酸分子，所述核酸分子包含一种与SEQ IDNO：5或其互补序列有至少70％序列同一性的核酸序列。本发明也提供一种基本纯化的核酸分子，所述核酸分子包含一种与SEQ ID NO：6或其互补序列有至少70％序列同一性的核酸序列。本发明也提供一种基本纯化的核酸分子，所述核酸分子包含一种与SEQ ID NO：7或其互补序列有至少70％序列同一性的核酸序列。本发明也提供一种基本纯化的核酸分子，所述核酸分子包含一种与SEQ ID NO：8或其互补序列有至少70％序列同一性的核酸序列。本发明还提供一种包含具有SEQ ID NO：2序列的核酸分子的至少15个连续核苷酸的核酸分子；和一种包含具有SEQ ID NO：3序列的核酸分子的至少15个连续核苷酸的核酸分子；和一种包含具有SEQ ID NO：4序列的核酸分子的至少15个连续核苷酸的核酸分子；和一种包含具有SEQ ID NO：5序列的核酸分子的至少15个连续核苷酸的核酸分子；和一种包含具有SEQ ID NO：6序列的核酸分子的至少15个连续核苷酸的核酸分子；和一种包含具有SEQ ID NO：7序列的核酸分子的至少15个连续核苷酸的核酸分子；和一种包含具有SEQ ID NO：8序列的核酸分子的至少15个连续核苷酸的核酸分子。

本发明也提供一种重组核酸分子，所述核酸分子包含作为有效连接组分的以下元件：(A)一个启动子，所述启动子在植物细胞中发挥作用，从而导致产生mRNA分子；和(B)一个核酸序列，所述序列与选自以下的核酸序列有至少85％的同一性：SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、其互补序列以及任一序列的片段。

本发明也提供一种从基因组多核苷酸序列获得的内含子，其中所述基因组多核苷酸序列选自：(a)与全长SEQ ID NO：1的SEQ ID NO：1编码区有至少70％同一性的基因组多核苷酸序列；(b)与全长SEQ IDNO：1的SEQ ID NO：1编码区有至少80％同一性的基因组多核苷酸序列；(c)与全长SEQ ID NO：1的SEQ ID NO：l编码区有至少90％同一性的基因组多核苷酸序列；和(d)与全长SEQ ID NO：1的SEQ IDNO：1编码区有至少95％同一性的基因组多核苷酸序列。

本发明也提供一种从基因组多核苷酸序列获得的内含子，其中所述基因组多核苷酸序列选自：(a)与全长SEQ ID NO：10的SEQ IDNO：l0编码区有至少70％同一性的基因组多核苷酸序列；(b)与全长SEQ ID NO：10的SEQ ID NO：10编码区有至少80％同一性的基因组多核苷酸序列；(c)与全长SEQ ID NO：10的SEQ ID NO：10编码区有至少90％同一性的基因组多核苷酸序列；和(d)与全长SEQ ID NO：10的SEQ ID NO：10编码区有至少95％同一性的基因组多核苷酸序列。

本发明也提供转化植物细胞和植物，所述细胞和植物包含重组核酸分子，所述重组核酸分子包含作为有效连接组分的以下元件：(A)一个启动子，所述启动子在植物细胞中发挥作用，从而导致产生mRNA分子；和(B)一个核酸序列，所述序列与选自以下的核酸序列有至少85％同一性：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、其互补序列以及任一序列的片段。

本发明也提供具有重组核酸分子的转化大豆植物，所述分子包含一个与核酸序列有效连接的启动子，所述核酸序列与选自以下的核酸序列有至少85％同一性：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、其互补序列以及任一序列的片段。

本发明还提供一种转化大豆植物，所述植物具有包含以下的核酸分子：(a)第一启动子，所述启动子与具有第一核酸序列的第一核酸分子有效连接，所述第一核酸序列与选自以下的核酸序列有至少85％同一性：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、其互补序列以及任一序列的片段；和(b)第二核酸分子，所述核酸分子具有编码选自以下酶的第二核酸序列：β-酮脂酰-ACP合酶I、β-酮脂酰-ACP合酶IV和δ-9去饱和酶。

本发明也提供从包含重组核酸分子的转化植物获得的种子，所述重组核酸分子包含作为有效连接组分的以下元件：(A)一个启动子，所述启动子在植物中发挥作用，从而导致产生mRNA分子；和(B)一个核酸序列，所述序列与选自以下的核酸序列有至少85％同一性：SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、其互补序列以及任一序列的片段。

本发明也提供从转化植物种子获得的油，其中所述转化植物包含重组核酸分子，所述重组核酸分子包含作为有效连接组分的以下元件：(A)一个启动子，所述启动子在植物中发挥作用，从而导致产生mRNA分子；和(B)一个核酸序列，所述序列与选自以下的核酸序列有至少85％同一性：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、其互补序列以及任一序列的片段，其中所述油相对于从具有相似遗传背景但缺乏所述重组核酸分子的植物种子获得的油表现出降低的饱和脂肪酸含量。

本发明也提供产生其种子具有降低的饱和脂肪酸含量的转化植物的方法，所述方法包括：(A)用一种核酸分子转化植物以产生转化植物，其中所述核酸分子包含一种与植物硫酯酶基因的内含子有至少85％同一性的核酸序列；和(B)培育所述转化植物，其中所述植物相对于具有相似遗传背景但缺乏所述核酸分子的植物产生具有降低的饱和脂肪酸含量的种子。

本发明还提供产生其种子具有降低的棕榈酸和硬脂酸含量的植物的方法，所述方法包括：用包含(a)第一启动子和(b)第二核酸分子的核酸分子转化植物，其中第一启动子有效连接第一核酸分子，所述核酸分子具有与选自以下的核酸序列有至少85％同一性的第一核酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、其互补序列以及任一序列的片段；而第二核酸分子具有编码选自以下酶的第二核酸序列：β-酮脂酰-ACP合酶I、β-酮脂酰-ACP合酶IV和δ-9去饱和酶；然后培育所述植物，其中所述植物相对于具有相似遗传背景但缺乏所述核酸分子的植物产生具有降低的棕榈酸和硬脂酸水平的种子。

本发明也提供产生其种子具有改良的油组成的植物的方法，所述方法包括：用一种核酸分子转化植物，所述核酸分子包含作为有效连接组分的第一启动子和第一核酸分子，所述核酸分子具有与选自以下序列有至少85％同一性的第一核酸序列：SEQ ID NO：2、SEQID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、其互补序列以及任一序列的片段；然后培育所述植物，其中所述植物相对于具有相似遗传背景但缺乏所述核酸分子的植物产生具有改良的油组成的种子。

本发明还提供改良植物细胞中脂质组成的方法，所述方法包括：用具有选自以下的DNA序列的重组DNA构建体转化植物细胞：SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、其互补序列以及任一序列的片段；然后在起始所述DNA序列转录的条件下培养所述细胞，从而改良所述脂质组成。

本发明也提供改良宿主细胞中脂质组成的方法，所述方法包括：用DNA构建体转化植物细胞，所述构建体按5′→3′转录方向包含作为有效连接组分的以下元件：一个在宿主细胞中起作用的转录起始区、一个选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、其互补序列以及任一序列的片段的DNA序列，和一个转录终止序列；然后在起始所述DNA序列转录的条件下培养所述细胞，从而改良所述脂质组成。

本发明还提供改变种子中FATB基因表达的方法，所述方法包括：(a)将能表达第一RNA的第一DNA序列和能表达第二RNA的第二DNA序列导入植物细胞中，所述第一RNA序列表现出与FATB基因的转录内含子有至少90％同一性，而所述第二RNA能与第一RNA形成dsRNA；和(b)在种子中表达所述第一RNA和第二RNA。

本发明也提供改变种子中FATB基因表达的方法，所述方法包括：(a)将能表达第一RNA的第一DNA序列和能表达第二RNA的第二DNA序列导入植物细胞中，所述第一RNA序列表现出与FATB基因的转录内含子有至少90％同一性；而第二RNA表现出与FATB基因的转录内含子有至少90％同一性；和(b)在种子中表达所述第一RNA和第二RNA。

                     附图简述

图1是构建体pCGN3892的示意图。

图2是构建体pMON70674的示意图。

图3是构建体pMON41164的示意图。

图4是构建体pMON70678的示意图。

图5是构建体pMON70675的示意图。

图6是构建体pMON70680的示意图。

图7是构建体pMON70656的示意图。

图8是构建体pMON70681的示意图。

                    发明详述

核酸序列的描述

SEQ ID NO：1是大豆FATB基因组克隆的核酸序列。

SEQ ID NO：2是大豆FATB内含子I的核酸序列。

SEQ ID NO：3是大豆FATB内含子II的核酸序列。

SEQ ID NO：4是大豆FATB内含子III的核酸序列。

SEQ ID NO：5是大豆FATB内含子IV的核酸序列。

SEQ ID NO：6是大豆FATB内含子V的核酸序列。

SEQ ID NO：7是大豆FATB内含子VI的核酸序列。

SEQ ID NO：8是大豆FATB内含子VII的核酸序列。

SEQ ID NO：9是大豆FATB酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：10是大豆FATB部分基因组克隆的核酸序列。

SEQ ID NOs：11-18是寡核苷酸引物的核酸序列。

SEQ ID NO：19是含大豆FATB内含子II的PCR产物的核酸序列。

SEQ ID NO：20是大豆FATB cDNA的核酸序列。

定义

本文所用的术语“基因”是指核酸序列，所述序列包含与基因产物表达相关的5′启动子区、任何内含子区和外显子区以及与所述基因产物表达相关的3′非翻译区。

本文所用的术语“ACP”是指酰基载体蛋白部分。本文所用的术语“脂肪酸”是指脂肪酸和酰基-脂肪酸基团。

本文所用的“FATB”基因或“棕榈酰-ACP硫酯酶”基因是编码酶(FATB)的基因，所述酶的优选反应是能催化棕榈酰-ACP的panthothene辅基中的碳-硫硫酯键水解断裂。该酶也可催化其它脂肪酸-ACP硫酯的水解。

在本文中当指蛋白和核酸时，如果用普通大写例如“FATB”，是指酶、蛋白、多肽或肽，而用斜体大写例如“FATB”，是指核酸，包括但不限于基因、cDNA和mRNA。

本文所用的“β-酮脂酰-ACP合酶I”基因或“KAS I”基因是编码酶(KAS I)的基因，所述酶能催化脂酰基部分延伸到棕榈酰-ACP(C16:0)。示例性的KAS I基因和酶描述于美国专利第5,475,099号和PCT公布号WO 94/10189。

本文所用的“β-酮脂酰-ACP合酶IV”基因或“KAS IV”基因是编码酶(KAS IV)的基因，所述酶能催化中链酰基-ACP的缩合。示例性的KAS IV基因和酶描述于PCT公布号WO 98/46776。

本文所用的“δ-9去饱和酶”基因或“硬脂酰-ACP去饱和酶”基因或“ω-9去饱和酶”基因是编码能催化将双键插入到从羧基端计第9位的脂酰部分中的酶的基因。示例性的δ-9去饱和酶基因和酶描述于美国专利第5,723,595号。

本文所用的“中油酸大豆种子”是种子油组成为介于50％至75％之间油酸的种子。

本文所用的“高油酸大豆种子”是种子油组成大于75％油酸的种子。

本文所用的“低饱和”油组成含有3.4％至7％之间的饱和脂肪酸。

本文所用的“零饱和”油组成含有小于3.4％的饱和脂肪酸。

本文所用的细胞或生物体可具有不止一个编码特定酶的基因家族，例如，植物可具有不止一个FATB基因(即编码具有特殊活性的酶的基因存在于植物基因组内不同位点)的家族。本文所用的“FATB基因家族成员”是在植物遗传物质内存在的任何FATB基因。在一个实施方案中，基因家族可以按其核酸序列相似性另外分类。在该实施方案的一个优选方面，一个基因家族成员在所述基因的编码序列部分中表现出至少60％、更优选至少70％、更优选至少80％的核酸序列同一性。

术语“非编码序列”是指不编码表达蛋白的部分或全部的核酸分子序列。非编码序列包括但不限于内含子、启动子区、3′非翻译区和5′非翻译区。

本文所用的术语“内含子”当指核酸分子、通常是DNA区段时，是指该术语的通常意义，即不编码表达蛋白的部分或全部的核酸分子，所述核酸分子在内源条件下转录为RNA分子，但在所述RNA翻译成蛋白之前，从所述内源RNA上被剪接掉。

本文所用的术语“外显子”当指核酸分子、通常是DNA区段时，是指该术语的通常意义，即编码表达蛋白的部分或全部的核酸分子。

本文所用的“有效连接”一个或多个核酸序列的启动子能驱动排列在一个多顺反子构型中的一个或多个核酸序列(包括多编码核酸序列或非编码核酸序列)的表达。

“多顺反子基因”或“多顺反子mRNA”是任何含有转录核酸序列的基因或mRNA，所述核酸序列对应于不止一个定向表达基因的核酸序列。人们知道，所述多顺反子基因或mRNA可含有对应于以下的序列：内含子、5′UTR、3′UTR或其组合，而重组多顺反子基因或mRNA例如可以但不限于含有对应于来自一个基因的一个或多个UTR的序列和来自第二个基因的一个或多个内含子。

本文所用的术语核酸序列互补是指所述序列与其全长互补。

本文所用的任何所示范围，除非另有说明，否则都包括所示范围的终点。

因子

本发明的因子就其结构属性而论最好具有“生物学活性”，例如一种核酸分子与另一种核酸分子杂交的能力，或者蛋白被抗体结合的能力(或者与另一分子竞争这种结合的能力)。或者，所述属性可以是催化属性，因而涉及所述因子介导化学反应或应答的能力。所述因子最好是“基本纯化的”。本文所用的术语“基本纯化的”是指一种分子与其在其天然状态下正常结合的几乎所有其它分子分离开来。更优选基本纯化的分子是制品中存在的主要分子。基本纯化的分子不含天然混合物中存在的其它分子(溶剂除外)，其含量60％以上、75％以上、优选90％以上、最优选95％以上。术语“基本纯化的”往往不包括其天然环境条件中存在的分子。

本发明的因子也可以是重组体。本文所用的术语重组体是指任何因子(例如包括但不限于DNA、肽等)，人工操作核酸分子直接或间接获得的因子。

人们知道，本发明的因子可以用便于检测出所述因子的试剂(例如荧光标记，Prober等，Science 238：336-340(1987)；Albarella等，EP144914；化学标记，Sheldon等，美国专利4,582,789；Albarella等，美国专利4,563,417；修饰碱基，Miyoshi等，EP 119448)进行标记。

核酸分子

本发明的因子包括核酸分子。在本发明的一个方面，所述核酸分子包含核酸序列，当所述核酸序列导入细胞或生物体内时，能选择性降低FATB蛋白和/或FATB转录物的水平。

在本发明的一个优选方面，所述核酸序列是FATB基因的内含子序列或其它非编码序列，当所述序列导入细胞或生物体内时，能选择性降低内源FATB蛋白和/或内源FATB转录物的水平，从而引起脂肪酸生物合成途径的改变，随之降低在所述细胞或生物体中的饱和脂肪酸水平。FATB基因的非编码序列也可与编码例如以下酶的核酸序列联合使用：β-酮脂酰-ACP合酶I、β-酮脂酰-ACP合酶IV和δ-9去饱和酶，这些酶进一步改变脂肪酸生物合成途径并进一步降低细胞或生物体中的饱和脂肪酸水平。FATB基因的非编码序列也可与减量调节其它酶的核酸序列(例如能够有义抑制δ-12去饱和酶基因的cDNA)联合使用，从而进一步改变脂肪酸生物合成途径，进一步降低细胞或生物体中的饱和脂肪酸水平。

在一个优选的方面，通过比较mRNA转录物水平，达到核酸分子选择性降低蛋白和/或转录物水平的能力。在本发明的另一个优选的方面，本发明的核酸分子包含选自以下的核酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、其互补序列以及任一序列的片段。

在本发明的一个方面，本发明的核酸是指所导入的核酸分子。如果一个核酸分子经人工操作(不管如何间接)而导入细胞或生物体内时，该核酸分子就称为“导入的”。所导入的核酸分子的实例包括但不限于已通过转化、转染、注射和发射而导入细胞内的核酸，以及已经通过包括但不限于接合、胞吞和吞噬等方法而导入生物体内的核酸。所述细胞或生物体可以但不限于是植物、植物细胞、藻类细胞、藻类、真菌细胞、真菌或细菌细胞；或者可以但不限于来自植物、植物细胞、藻类细胞、藻类、真菌细胞、真菌或细菌细胞。

本文所用的因子(例如蛋白、脂肪酸或mRNA)的“选择性降低”是相对于缺乏能选择性降低所述因子的核酸分子的细胞或生物体而言。在一个优选的方面，所述因子的水平被选择性降低至少50％、优选至少75％以上、甚至更优选至少90％或95％以上。

本文所用的因子(例如蛋白、脂肪酸或mRNA)水平的“部分降低”是指相对于缺乏能降低所述因子的核酸分子的细胞或生物体而言，所述水平降低至少25％。

本文所用的因子(例如蛋白、脂肪酸或mRNA)水平的“显著降低”是指相对于缺乏能降低所述因子的核酸分子的细胞或生物体而言，所述水平降低至少75％。

本文所用的因子(例如蛋白、脂肪酸或mRNA)的“有效消除”是指相对于缺乏能降低所述因子的核酸分子的细胞或生物体而言，所述因子水平降低至少95％。

当对因子水平进行比较时，所述比较最好是在具有相似遗传背景的生物体之间进行。在一个优选的方面，相似遗传背景是其中所述生物体的核遗传物质有至少50％相同的背景。在一个更优选的方面，相似遗传背景是其中所述生物体的核遗传物质有至少75％、更优选至少90％相同的背景。在另一个甚至更优选的方面，相似遗传背景是其中所比较的生物体是植物的背景，所述植物除了先前用植物转化技术导入的遗传物质以外，是等基因的。

在本发明的一个实施方案中，一种核酸分子，当导入细胞或生物体内时，能够选择性降低蛋白、脂肪酸和/或转录物的水平。在一个优选的方面，相对于缺乏能选择性降低蛋白、脂肪酸和/或转录物水平的核酸分子的细胞或生物体而言，来确定一种能选择性降低蛋白、脂肪酸和/或转录物水平的核酸分子的能力。本文所用的nRNA转录物包括加工和非加工的mRNA转录物，而“FATB转录物”是指任何由FATB基因编码的转录物。

在另一个实施方案中，一种核酸分子，当导入细胞或生物体内时，能够至少部分降低FATB蛋白和/或FATB转录物的水平。在一个不同的实施方案中，一种核酸分子，当导入细胞或生物体内时，能够至少显著降低FATB蛋白和/或FATB转录物的水平。在一个进一步的实施方案中，一种核酸分子，当导入细胞或生物体内时，能够有效消除FATB蛋白和/或FATB转录物的水平。

在一个不同的实施方案中，一种核酸分子，当导入细胞或生物体内时，能够选择性降低FATB蛋白和/或FATB转录物的水平，同时过量表达一种不同的蛋白和/或转录物的水平。所述不同的蛋白最好选自β-酮脂酰-ACP合酶I、β-酮脂酰-ACP合酶IV和δ-9去饱和酶，而所述不同的转录物编码选自以下的酶：β-酮脂酰-ACP合酶I、β-酮脂酰-ACP合酶IV和δ-9去饱和酶。

在一个进一步的实施方案中，一种核酸分子，当导入细胞或生物体内时，能够至少部分降低FATB蛋白和/或FATB转录物的水平，同时过量表达一种不同的蛋白和/或转录物的水平。所述不同的蛋白最好选自β-酮脂酰-ACP合酶I、β-酮脂酰-ACP合酶IV和δ-9去饱和酶，而所述不同的转录物编码选自以下的酶：β-酮脂酰-ACP合酶I、β-酮脂酰-ACP合酶IV和δ-9去饱和酶。在一个不同的实施方案中，一种核酸分子，当导入细胞或生物体内时，能够至少显著降低FATB蛋白和/或FATB转录物的水平，同时过量表达一种不同的蛋白和/或转录物的水平。在一个进一步的实施方案中，一种核酸分子，当导入细胞或生物体内时，能够有效消除FATB蛋白和/或FATB转录物的水平，同时过量表达一种不同的蛋白和/或转录物的水平。

本发明的更优选的实施方案是核酸分子，所述核酸分子与本发明的核酸分子以及与所述核酸分子互补的核酸分子的全长有至少50％、60％或70％同一性。更优选的是核酸分子，所述核酸分子包含与本发明的核酸分子以及与所述核酸分子互补的核酸分子的全长有至少80％或85％同一性的区域。在这一方面，优选与其全长有至少90％同一性的核酸分子，特别优选有至少95％同一性的核酸分子。此外，更优选有至少97％同一性的核酸分子，特别更优选有至少98％和99％同一性的核酸分子，最优选有至少99％同一性的核酸分子。

本发明也提供一种核酸分子，所述核酸分子包含在严格性杂交条件下，用具有所述核酸分子序列或其片段的探针，来筛选含有序列表所示核酸分子序列的完整基因的合适文库而得到的核酸分子序列；并且分离所述核酸分子序列。用于获得所述核酸分子的片段包括例如，如本文所述的探针和引物。

本发明的核酸分子可以用作RNA、cDNA或基因组DNA的杂交探针，以分离全长cDNA或基因组克隆，并分离与序列表所示核酸分子具有高度序列相似性的其它基因的cDNA或基因组克隆。

通过使用本文所述的核酸分子或其片段，筛选从各种植物或其它合适生物体获得的cDNA文库或基因组文库，可容易地获得本发明的核酸分子。这些方法以及用于形成所述文库的方法，都是本领域技术人员已知的。在一个实施方案中，通过将本发明的核酸分子与基因组文库成员一起保温，然后回收与所述核酸分子杂交的克隆，而获得所述序列。在第二个实施方案中，可以使用染色体步查法或反向PCR法，获得所述序列。在第三个实施方案中，可以采用本领域已知的生物信息技术，将本发明核酸分子的序列用于筛选文库或数据库，有关生物信息技术参见例如Bioinformatics，Baxevanis &Ouellette编著，Wiley-Interscience(1998)。

可以采用多种方法中的任一种来获得本发明的一种或多种核酸分子。为了该目的，可使用自动核酸合成仪，制备具有在细胞或生物体中也存在的核酸分子的序列。为了替代所述合成方法，所公开的核酸分子可用于确定引物对，所述引物对可用于聚合酶链式反应，以扩增和得到任何所需要的核酸分子或片段。

“同一性”是本领域众所周知的，是指通过比较其序列而测定的两个或两个以上多肽序列或者两个或两个以上核酸序列之间的关系。在本领域中，“同一性”也指通过匹配所述序列的序列段而测定的多肽序列间或核酸分子序列间序列关系的程度。“同一性”可按已知方法容易地计算出来，所述已知方法包括但不限于描述于以下文献的方法：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.编著，OxfordUniversity Press，New York(1988)；Biocomputing.Informatics andGenome Projects，Smith，D.W.编著，Academic Press，New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data，第I部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编著，Humana Press，New Jersey(1994)；Sequence Analysis inMolecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press(1987)；SequenceAnalysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.编著，Stockton Press，NewYork(1991)以及Carillo，H.和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math，48：1073(1988)。设计测定同一性的方法，以得到被测序列之间的最大匹配。此外，测定同一性的方法已编制成公众可用的程序。可用于测定两个序列间同一性的计算机程序包括但不限于GCG(Devereux，J.等，Nucleic Acids Research 12(1)：387(1984)；一套共5个BLAST程序，3个用于核苷酸序列查询(BLASTN、BLASTX和TBLASTX)，2个用于蛋白质序列查询(BLASTP和TBLASTN)(Coulson，Trends inBiotechnology，12：76-80(1994)；Birren等，Genome Analysis，1：543-559(1997))。所述BLASTX程序公众可得自NCBI和其它来源(BLASTManual，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH，Bethesda，MD 20894；Altschul，S.等，J.Mol.Biol.，215：403-4l0(1990))。众所周知的Smith Waterman算法也可用于测定同一性。

用于多肽序列比较的参数通常包括如下：

算法：Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，48：443-453(1970)

比较矩阵：BLOSSUM62，得自Hentikoff和Hentikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：10915-10919(1992)

空位罚分(Gap Penalty)：12

空位长度罚分(Gap Length Penalty)：4

具备这些参数的程序公众可得自Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin，称为“gap”程序。对于肽比较来说，以上对末端空位没有罚分的参数是缺省参数。

用于核酸分子序列比较的参数通常包括如下：

算法：Needleman和Wunsch，J.Mol.Bio.，48：443-453(1970)

比较矩阵：匹配-+10；错配＝0

空位罚分：50

空位长度罚分：3

本文所用的“％同一性”是用以上参数作为缺省参数进行核酸分子序列比较并使用来自GCG的“gap”程序(10.2版)而测定的。

本发明还涉及与本发明的核酸分子杂交的核酸分子。具体地讲，本发明涉及在严格性条件下与上述核酸分子杂交的核酸分子。本文所用的术语“严格性条件”和“严格性杂交条件”是指序列间有至少95％同一性、最好至少97％同一性时通常会发生的杂交。严格性杂交条件的一个实例是在42℃在包含以下组分的溶液中保温过夜：50％甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5x Denhardt氏溶液、10％硫酸葡聚糖和20微克/毫升变性剪切鲑精DNA，然后在约65℃在0.1x SSC中洗涤杂交支持物。其它的杂交和洗涤条件是众所周知的，并示例于Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，NY(1989)，特别是第11章。

在核酸序列当表达时能选择性降低FATB蛋白和/或FATB转录物的水平的实施方案中，优选的核酸序列选自：(1)与选自以下的核苷酸序列的全长核酸分子有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO：2、SEQID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、其互补序列以及任一序列的片段；(2)含有在大豆FATB基因内含子中也存在的序列的核酸分子；和(3)表现出其序列与(2)的核酸分子的全长核酸分子有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸分子。

本发明的核酸分子的一个亚组包括片段核酸分子。片段核酸分子可由本发明核酸分子的重要部分或者事实上是大部分(例如具体所公开的那些部分)组成。或者，所述片段可包含较小的寡核苷酸(具有约15个至约400个连续核苷酸残基、更优选约15个至约30个连续核苷酸残基、或约50个至约100个连续核苷酸残基、或约100个至约200个连续核苷酸残基、或约200个至约400个连续核苷酸残基、或约275个至约350个连续核苷酸残基)。更优选所述片段可包含小的寡核苷酸，所述寡核苷酸具有约15个至约45个连续核苷酸残基、约20个至约45个连续核苷酸残基、约15个至约30个连续核苷酸残基、约21个至约30个连续核苷酸残基、约21个至约25个连续核苷酸残基、约21个至约25个连续核苷酸残基、约19个至约25个连续核苷酸残基或约21个连续核苷酸。

在另一方面，片段核酸分子具有本发明核酸分子的至少15个、25个、50个或100个连续核苷酸的核酸序列。在一个优选的实施方案中，所述核酸分子具有选自以下核酸序列的核酸分子的至少15个、25个、50个或100个连续核苷酸的核酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8及其互补序列。

本发明的一种或多种核酸分子的片段可以是探针，准确地说是PCR探针。PCR探针是能够起始聚合酶活性同时与另一种核酸分子形成双链结构的核酸分子。用于测定PCR探针的结构的各种方法和PCR技术是本领域的现有技术。为了鉴定潜在的PCR引物，可以运用如Primer3(www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi)、STSPipeline(www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/www-STS_Pipeline)或GeneUp(Pesole等，BioTechniques 25：112-123(1998))等程序，用计算机进行搜索。

本发明的核酸分子或其片段在某些情况下能与其它核酸分子特异性杂交。本发明的核酸分子包括能与具有选自以下的核酸序列的核酸分子特异性杂交的核酸分子：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、其互补序列以及任一序列的片段。本文所用的两种核酸分子如果所述两种分子能够形成反平行双链核酸结构则一般认为是能够相互特异性杂交。

本发明的核酸分子也可编码同系物核酸分子。本文所用的同系物核酸分子或其片段是在第二个物种中的对应物核酸分子或其片段(例如玉米FATB内含子I核酸分子是拟南芥FATB内含子I核酸分子的同系物)。同系物也可以通过分子进化或DNA改组技术产生，致使所述分子保留原始多肽的至少一种功能或结构特征(参见例如美国专利5,811,238)。

在另一个实施方案中，所述同系物从选自以下的植物中获得：苜蓿、拟南芥属(Arabidopsis)、大麦、白菜型油菜(Brassica campestris)、欧洲油菜(oilseed rape)、青花椰菜、卷心菜、双低油菜、柑桔、棉花、大蒜、燕麦、葱属(Allium)、亚麻、观赏植物、霍霍巴(jojoba)、玉米、花生、胡椒、马铃薯、油菜籽(rapeseed)、水稻、黑麦、高粱、草莓、甘蔗、甜菜、番茄、小麦、杨树、松树、冷杉、桉树、苹果、莴苣、兵豆、葡萄、香蕉、茶树、草坪草、向日葵、菜豆属(Phaseolus)、两节荠(crambe)、芥菜、蓖麻籽、芝麻、棉籽、亚麻籽、红花和油棕。更具体地讲，优选的同系物从选自以下的植物获得：双低油菜、玉米、白菜型油菜、欧洲油菜、大豆、两节荠、芥菜、蓖麻籽、花生、芝麻、棉籽、亚麻籽、油菜籽、红花、油棕、亚麻和向日葵。在一个甚至更优选的实施方案中，所述同系物从选自以下的植物获得：双低油菜、油菜籽、玉米、白菜型油菜、欧洲油菜、大豆、向日葵、红花、油棕和花生。

在进一步的实施方案中，额外的FATB内含子可通过其中可鉴定额外内含子的任何方法而获得。在一个优选的实施方案中，额外的大豆FATB内含子可通过用已知的大豆FATB外显子或内含子序列的探针筛选大豆基因组文库而获得。然后可克隆所述大豆FATB基因。在另一个优选的实施方案中，额外的大豆FATB内含子可通过比较大豆基因组序列和大豆cDNA序列而获得，所述比较允许对额外内含子的鉴定。在一个更优选的实施方案中，额外的大豆FATB内含子可通过用已知的大豆FATB外显子或内含子序列的探针筛选大豆基因组文库而获得。然后可克隆并证实所述大豆FATB基因，任何额外的内含子可通过比较大豆基因组序列和大豆eDNA序列而鉴定。额外的内含子可以例如不限于用PCR来扩增，并用于本发明的实施方案中。

在另一个优选的实施方案中，内含子例如大豆内含子等，可以通过与另一种生物(例如拟南芥)的内含子进行序列比对而克隆。在这个实施方案中，鉴定出内含子例如在拟南芥氨基酸序列中的位置。然后，拟南芥氨基酸序列例如可以与例如大豆氨基酸序列进行比对，提供了例如额外大豆FATB内含子的预测位置。可以例如采用大豆FATB cDNA来合成引物。预测内含子可以通过例如PCR，采用所述引物来合成。所述内含子可用于本发明的实施方案中。

植物构建体和植物转化体

本发明的一种或多种核酸分子可用于植物转化或转染。外源遗传物质可以转移到植物细胞，该植物细胞再生成能育或不育整株植物或植物部分。外源遗传物质无论是否是天然存在的，是任何来自能被插入到任何生物体的任何来源的遗传物质。

在本发明的一个实施方案中，一个FATB基因家族成员的蛋白或转录物的表达水平被选择性降低，同时第二个FATB基因家族成员的蛋白或转录物水平部分不受影响。在本发明的一个优选的实施方案中，一个FATB基因家族成员的蛋白或转录物的表达水平被选择性降低，同时第二个FATB基因家族成员的蛋白或转录物水平基本不受影响。在本发明的一个更优选的实施方案中，一个FATB基因家族成员的蛋白或转录物的表达水平被选择性降低，同时第二个FATB基因家族成员的蛋白或转录物水平完全不受影响。

本文所用的“部分不受影响”是指因子(例如蛋白或mRNA转录物)的水平，其中与缺乏能选择性降低另一种因子的核酸分子的细胞或生物体中的水平相比，部分不受影响的所述因子水平在80％内、更优选在60％内、更优选在50％内。

本文所用的“基本不受影响”是指因子(例如蛋白或mRNA转录物)的水平，其中与缺乏能选择性降低另一种因子的核酸分子的细胞或生物体中的水平相比，基本不受影响的所述因子水平在49％内、更优选在35％内、更优选在24％内。

本文所用的“完全不受影响”是指因子(例如蛋白或mRNA转录物)的水平，所述水平既没有被特定事件改变或仅有一定程度改变，又没有影响所述因子的生理功能。在一个优选的方面，与缺乏能选择性降低另一种因子的核酸分子的细胞或生物体中的水平相比，完全不受影响的因子水平在20％内、更优选在10％内、甚至更优选在5％内。

在一个更特别优选的实施方案中，本发明的大豆植物包括当表达时能选择性降低FATB蛋白和/或FATB转录物、同时又过量表达不同蛋白和/或转录物水平的核酸序列。所述蛋白最好选自β-酮脂酰-ACP合酶I、β-酮脂酰-ACP合酶IV和δ-9去饱和酶，而所述不同的转录物编码选自以下的酶：β-酮脂酰-ACP合酶I、β-酮脂酰-ACP合酶IV和δ-9去饱和酶。

在核酸序列当在转化植物中表达时能选择性降低FATB蛋白和/或FATB转录物的水平的实施方案中，优选的核酸序列选自：(1)与选自以下的核苷酸序列的全长核酸分子有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、其互补序列以及任一序列的片段；(2)含有在大豆FATB基因内含子中也存在的序列的核酸分子；和(3)表现出其序列与(2)的核酸分子的全长核酸分子有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸分子。

在一个优选的实施方案中，本发明大豆种子的油组成是50％或更高的油酸以及15％或更低的饱和脂肪酸(包括棕榈酸和硬脂酸)。在一个更优选的实施方案中，本发明大豆种子的油组成是10％或更低的饱和脂肪酸。本文所用的植物或植物部分(例如种子)中所有％油组成都以重量计。

在一个特别优选的实施方案中，本发明大豆种子的油组成是9％或更低、8％或更低、7％或更低、6％或更低、5％或更低、4％或更低、3.6％或更低、3.5％或更低、或者3.4％或更低的饱和脂肪酸。在一个更优选的实施方案中，本发明大豆种子的油组成是低饱和组成，而在另一个更优选的实施方案中，本发明大豆种子的油组成是零饱和组成。

在另一个优选的实施方案中，本发明大豆种子的油组成是50％或更高的油酸以及介于10％至15％之间的饱和脂肪酸。在一个更优选的实施方案中，本发明大豆种子的油组成是介于7％和10％之间的饱和脂肪酸、介于5％和8％之间的饱和脂肪酸、介于3.4％和7％之间的饱和脂肪酸、介于3.5％和7％之间的饱和脂肪酸、介于3.6％和7％之间的饱和脂肪酸、介于2％和4％之间的饱和脂肪酸或3.4％以下的饱和脂肪酸。

在本发明的另一个优选的实施方案中，本发明大豆种子的油组成是其中棕榈酸水平至少部分被降低、至少基本被降低或被有效消除。在另一个实施方案中，本发明大豆种子的油组成是其中硬脂酸水平至少部分被降低、至少基本被降低或被有效消除。

在核酸序列当表达时能选择性降低FATB蛋白和/或FATB转录物的表达水平的实施方案中，使得本发明的大豆种子具有低饱和或零饱和的油组成同时还含有50％或更高的油酸，所述核酸序列选自：(1)与选自以下的核苷酸序列的全长核酸分子至少有50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、其互补序列以及任一序列的片段；(2)含有在大豆FATB基因内含子中也存在的序列的核酸分子；和(3)表现出其序列与(2)的核酸分子的全长核酸分子有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸分子。

也可以从其它物种获得遗传物质，例如单子叶植物或双子叶植物，包括但不限于双低油菜、玉米、大豆、拟南芥属、菜豆属、花生、苜蓿、小麦、水稻、燕麦、高粱、油菜籽、黑麦、大麦、小米、狐茅、多年生黑麦草、甘蔗、酸果、番木瓜、香蕉、红花、油棕、亚麻、香甜瓜、苹果、黄瓜、石斛、唐菖蒲、菊花、百合、棉花、桉树、向日葵、白菜型油菜、欧洲油菜、草坪草、甜菜、咖啡和薯蓣(Christou，INO：Particle Bombardment for Genetic Engineering ofPlants，Biotechnology Intelligence Unit.Academic Press，San Diego，Califomia(1996))，其中优选双低油菜、玉米、白菜型油菜、欧洲油菜、油菜籽、大豆、两节荠、芥菜、蓖麻籽、花生、芝麻、棉籽、亚麻籽、红花、油棕、亚麻和向日葵，更优选双低油菜、油菜籽、玉米、白菜型油菜、欧洲油菜、大豆、向日葵、红花、油棕和花生。在一个更优选的实施方案中，将双低油菜遗传物质转移到双低油菜中。在另一个更优选的实施方案中，将欧洲油菜遗传物质转移到欧洲油菜中。在另一个特别优选的实施方案中，将大豆遗传物质转移到大豆中。

在整个生物体例如植物中、或者在所述生物体的一种或多种特定器官或组织中，可以增加或降低产物例如转录物或蛋白的水平。例如，在植物的一种或多种组织和器官中，可以增加或降低产物水平，所述植物组织和器官包括但不限于根、块茎、茎、叶、梗、果、浆果、坚果、皮、荚果、种子和花。优选的器官是种子。

可以通过使用设计用于该目的的DNA载体或构建体，将外源遗传物质转入到宿主细胞中。所述载体的设计通常是在本领域技术范围内(参见例如Plant Molecular Biology：A Laboratory Manual，Clark(编著)，Springer，New York(1997))。

构建体或载体可以包括植物启动子，以表达所选的核酸分子。在一个优选的实施方案中，本文所述的任何核酸分子可以有效连接启动子区，所述启动子区在植物细胞中发挥作用从而导致产生mRNA分子。例如，任何在植物细胞中发挥作用从而导致产生mRNA分子的启动子，例如本文所述的启动子，可以不受限制地使用。在一个优选的实施方案中，所述启动子是植物启动子。

许多在植物细胞中有活性的启动子在文献中已有描述。它们包括但不限于胭脂碱合酶(NOS)启动子(Ebert等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A)84：5745-5749(1987))、章鱼碱合酶(OCS)启动子(它在根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的根瘤诱导质粒上携带)、花椰菜花叶病毒启动子例如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子(Lawton等，Plant Mol.Biol.9：315-324(1987))和CaMV 35S启动子(Odell等，Nature313：810-812(1985))、玄参花叶病毒35S启动子(美国专利第5,378,619)、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基的光诱导型启动子(ssRUBISCO)、Adh启动子(Walker等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)84：6624-6628(1987))、蔗糖合酶启动子(Yang等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)87：4144-4148(1990))、R基因复合体启动子(Chandler等，ThePlant Cell 1：1175-1183(1989))和叶绿素a/b结合蛋白基因启动子。这些启动子已经用于产生在植物中表达的DNA构建体；参见例如PCT公布号WO84/02913。CaMV 35S启动子优选用于植物。在植物细胞中引起DNA转录的已知或已发现的启动子可用于本发明。

特别优选的启动子也可用于在种子或果实中表达本发明的核酸分子。事实上，在一个优选的实施方案中，所用的启动子是种子特异性启动子。所述启动子的实例包括例如以下的基因的5′调节区：napin(Kridl等，Seed Sci.Res.1：209-219(1991))、菜豆蛋白(Bustos等，Plant Cell，1(9)：839-853(1989))、大豆胰蛋白酶抑制剂(Riggs等，PlantCell 1(6)：609-621(1989))、ACP(Baerson等，Plant Mol.Biol.，22(2)：255-267(1993))、硬脂酰-ACP去饱和酶(Slocombe等，Plant Physiol.104(4)：167-176(1994))、大豆b-伴大豆球蛋白(conglycinin)的a′亚基(大豆7s，(Chen等，Proc.Natl.Acad.Sci.，83：8560-8564(1986)))和油质蛋白(参见例如Hong等，Plant Mol.Biol.，34(3)：549-555(1997))。更多的实例包括β-伴大豆球蛋白启动子(Chen等，Dev.Genet.10：112-122(1989))和FAE启动子(PCT公布号WO 01/11061)。用于在种子中表达的优选的启动子是7S和napin启动子。

可以使用的额外启动子描述于例如美国专利5,378,619、5,391,725、5,428,147、5,447,858、5,608,144、5,608,144、5,614,399、5,633,441、5,633,435和4,633,436。另外，可使用组织特异性增强子(Fromm等，The Plant Cell 1：977-984(1989))。

构建体或载体也可以包括目标区的核酸序列，所述序列的全部或部分作用是终止该区的转录。已经分离出许多这样的序列，包括Tr73′序列和NOS 3′序列(Ingelbrecht等，The Plant Cell 1：671-680(1989)；Bevan等，Nucleic Acids Res.11：369-385(1983))。本发明的植物表达构建体中也可以提供调节转录终止区。可以通过编码目标基因的DNA序列或来自不同基因来源的常规转录终止区(例如与所述转录起始区天然相关的转录终止区)，来提供提供转录终止区。技术人员知道，在植物细胞中能终止转录的任何常规转录终止区都可以用于本发明的构建体。

载体或构建体也可以包括调节元件。所述调节元件的实例包括Adh内含子1(Callis等，Genes and Develop.1：1183-1200(1987))、蔗糖合酶内含子(Vasil等，Plant Physiol.91：1575-1579(1989))和TMV ω元件(Gallie等，The Plant Cell 1：301-311(1989))。在适当时，可以包括这些调节元件和其它调节元件。

载体或构建体也可以包括选择标记。选择标记也可用于选择含有外源遗传物质的植物或植物细胞。其实例包括但不限于：neo基因(Potrykus等，Mol.Gen.Genet.199：183-188(1985))，该基因编码卡那霉素抗性并且可以根据使用卡那霉素、RptII、G418、hpt等进行选择；bar基因，该基因编码双丙氨膦(bialaphos)抗性；突变型EPSP合酶基因(Hinchee等，Bio/Technology 6：915-922(1988)；Reynaerts等，Selectable and Screenable Markers，In Gelvin and Schilperoort.PlantMolecular Biology Manual，Kluwer，Dordrecht(1988)；Reynaerts等，Selectable and screenable markers.In Gelvin and Schilperoort.PlantMolecular Biology Manual，Kluwer，Dordrecht(1988))；aadA(Jones等，Mol.Gen.Genet.(1987))，所述基因编码草甘膦(glyphosate)抗性；腈水解酶基因，该基因赋予溴苯腈(bromoxynil)抗性(Stalker等，J.Biol.Chem.263：6310-6314(1998))；突变型乙酰乳酸合酶基因(ALS)，该基因赋予咪唑啉酮或磺酰脲抗性(欧洲专利申请154,204(1985年9月11日)；ALS(D’Halluin等，Bio/Technology 10：309-314(1992)，和甲氨蝶呤抗性DHFR基因(Thillet等，J.Biol.Chem.263：12500-12508(1988))。

载体或构建体也可以包括筛选标记。可以用筛选标记来监测表达。示例性的筛选标记包括：β-葡糖醛酸酶或uidA基因(GUS)，该基因编码各种显色底物为已知的酶(Jefferson，Plant Mol.Biol.Rep.5：387-405(1987)；Jefferson等，EMBO J.6：3901-3907(1987))；R-基因座基因，该基因编码调节植物组织中花色素苷色素(红色)产生的产物(Dellaporta等，Stadler Symposium 11：263-282(1988))；β-内酰胺酶基因(Sutcliffe等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)75：3737-3741(1978))，该基因是一种编码各种显色底物为已知的酶的基因(例如PADAC，显色头孢菌素)；荧光素酶基因(Ow等，Science 234：856-859(1986))；xylE基因(Zukowsky等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)80：1101-1105(1983))，该基因编码可以转变显色儿茶酚的儿茶酚双加氧酶；α-淀粉酶基因(Ikatu等，Bio/Technol.8：241-242(1990))；酪氨酸酶基因(Katz等，J.Gen.Microbiol.129：2703-2714(1983))，该基因编码能够将酪氨酸氧化为DOPA和多巴醌的酶，DOPA和多巴醌进而缩合为黑素；α-半乳糖苷酶，该酶将转变显色α-半乳糖底物。

术语“选择标记基因或筛选标记基因”也包括编码分泌标记的基因，分泌标记的分泌可以通过对转化细胞的鉴定或选择进行检测。实例包括编码可以通过抗体相互作用鉴定的分泌性抗原的标记或者甚至可以用催化方法检测的分泌性酶。分泌性蛋白分为许多类别，包括可检测(例如通过ELISA)的小的扩散蛋白、可在胞外溶液中检测到的小的活性酶(α-淀粉酶、β-内酰胺酶、膦丝菌素转移酶)或在细胞壁中插入或捕获的蛋白(例如包括在延伸表达单位或烟草PR-S中存在的前导序列的蛋白)。其它可能的选择标记基因和/或筛选标记基因对于本领域技术人员而言将会是显而易见的。

人们知道，本发明的两种或更多种核酸分子可以用一个构建体导入植物中，所述构建体可含有不止一个启动子。在所述构建体是设计用于表达两个核酸分子的实施方案中，优选所述两个启动子是(i)两个组成型启动子，(ii)两个种子特异性启动子，或(iii)一个组成型启动子和一个种子特异性启动子。优选的种子特异性启动子和组成型启动子分别是napin和7S启动子。说明性的组合示于实施例5。人们知道，可以采用一个启动子物理连接和表达两种或更多种核酸分子，所述启动子最好是种子特异性启动子或组成型启动子。

人们还知道，用两个或更多个不同构建体可以将本发明的两种或更多种核酸导入植物中。或者，本发明的两种或更多种核酸可以导入两种不同植物中，而所述植物可以杂交以产生一种表达两种或更多核酸的植物。在一个RNAi实施方案中，人们知道，有义链和反义链可导入同一植物中。或者将有义链和反义链导入两种不同的植物中，所述植物可以杂交，产生一种既表达有义链又表达反义链的植物。

本发明的任何核酸分子和构建体可以永久方式或瞬时方式导入植物或植物细胞中。本发明优选的核酸分子和构建体如上发明详述和在实施例中描述。本发明另一个实施方案涉及产生转基因植物的方法，所述方法通常包括选择合适的植物或植物细胞、用重组载体转化该植物或植物细胞以及获得转化宿主细胞的步骤。

在一个优选的实施方案中，所述植物或细胞是用于生产食用或工业用植物油的相关植物，或来源于用于生产食用或工业用植物油的相关植物。特别优选的是温带油料种子作物。目标植物包括但不限于油菜(双低油菜和高芥酸品种)、玉米、大豆、两节荠、芥菜、蓖麻籽、花生、芝麻、棉花、亚麻籽、红花、油棕、亚麻、向日葵和椰子。本发明同样适用于单子叶植物或双子叶植物，并且容易用于新的和/或改进的转化和调节技术。

将DNA导入植物细胞中的方法和技术是本领域技术人员熟知的，实际上，将核酸分子导入细胞中的任何方法都适用于本发明。合适方法的非限制性实例包括：化学方法；物理方法例如微注射、电穿孔、基因枪、微弹轰击和真空渗入；病毒载体；和受体介导机制。细胞转化的其它方法也可使用，包括但不限于通过直接DNA转移到花粉，通过将DNA直接注射到植物繁殖器官，或通过将DNA直接注射到不成熟胚胎细胞将DNA导入植物中，然后让干燥胚再吸水。

土壤杆菌介导的转移是将基因导入植物细胞中的广泛适用的系统。参见例如Fraley等，Bio/Technology 3：629-635(1985)；Rogers等，Methods Enzymol.153：253-277(1987)。待转移的DNA区被边界序列限定，间插DNA通常插入到植物基因组中。Spielmann等，Mol.Gen.Genet.205：34(1986)。现代土壤杆菌转化载体能够在大肠杆菌(E.coli)和土壤杆菌中复制，便于常规操作。K1ee等，载于：Plant DNA InfectiousAgents，Hohm和Schell(编著)，Springer-Verlag，New York，第179-203页(1985)。

由单一植物原生质体转化体或各种转化外植体再生、发育和栽培植株是本领域众所周知的。通常参见Maliga等，Methods in PlantMolecular Biology，Cold Spring Harbor Press(1995)；Weissbach和Weissbach，载于：Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，San Diego，CA(1988)。本发明的植物可以是育种程序的一部分或来自育种程序，并且也可以用无融合生殖来繁殖。无融合植物产生的方法是本领域已知的，参见例如美国专利5,811,636。

共抑制是降低特定内源基因或基因家族的表达水平、通常是在RNA水平上降低其表达水平，由于能够转录与内源基因的转录物相同的链的mRNA的同源有义构建体的表达所致(Napoli等，Plant Cell2：279-289(1990)；van der Krol等，Plant Cell 2：291-299(1990))。共抑制可以由于用与所述细胞中存在的核酸序列同源的单拷贝核酸分子稳定转化所引起(Prolls和Meyer，Plant J.2：465-475(1992))或者用与所述细胞中存在的核酸序列同源的多拷贝核酸分子稳定转化所引起(Mittlesten等，Mol.Gen.Genet.244：325-330(1994))。即使是与同源启动子连接的不同基因也可以导致连锁基因的共抑制(Vaucheret，C.R.Acad.Sci.III 316：1471-1483(1993)；Flavell，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)91：3490-3496(1994))；van Blokland等，Plant J.6：861-877(1994)；Jorgensen，Trends Biotechnol.8：340-344(1990)；Meins和Kunz，载于：Gene Inactivation and Hologous Recombination in Plants，Paszkowski(编著)，第335-348页，Kluwer Academic，Netherlands(1994))(Kinney，Induced Mutations and Molecular Techniques for CropImprovement，Proceedings of a Symposium 19-23 June 1995(IAEA和FA联合组织))，第101-113页(IAEA-SM 340-49)。

人们知道，可以将本发明的一种或多种核酸导入植物细胞中，使用合适的启动子进行转录，其中所述转录导致内源蛋白的共抑制。

反义方法是一种通过靶向遗传材料防止或降低基因功能的方法(Mol等，FEBS Lett.268：427-430(1990))。反义方法的目的是利用与靶基因互补的序列阻断其表达并且产生一种所选蛋白水平选择性降低或消除的突变细胞系或生物体。反义技术有几个优于其它“反遗传”方法的优点。失活位点及其发育效应可以通过选择反义基因的启动子进行操作，或者通过定时外部施用或微注射进行操作。反义可以通过选择靶基因的独特区或与其它相关基因共享同源性的区来控制其特异性(Hiatt等，载于：Genetic Engineering，Setlow(编著)，第11卷，New York：Plenum 49-63(1989))。

反义RNA技术涉及将与靶mRNA互补的RNA导入细胞中，产生通过在反义底物和靶mRNA之间的碱基配对所形成的特异性RNA:RNA双链体(Green等，Annu.Rev.Biochem.55：569-597)。在一个实施方案下，所述方法涉及反义基因序列的导入和表达。这样的序列是其中将正常基因序列的部分或全部置于处于反向启动子的控制之下致使“错误”或互补链被转录为与所述靶mRNA杂交并干扰其表达的非编码反义RNA的序列(Takayama和Inouye，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.25：155-184(1990))。通过标准方法构建反义载体，并将其通过转化、转染、电穿孔、微注射、感染等方法导入细胞中。转化的类型和载体的选择将决定表达是瞬时的还是稳定的。反义基因所用的启动子可以影响反义抑制的水平、定时、组织、特异性或诱导性。

据报道，也可将双链RNA导入细胞，以破坏内源基因功能(Fire等，Nature 391：806-811(1998))。所述破坏已在例如秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)中得到证明，并且通常称为RNA干扰或RNAi(Fire等，Nature 391：806-811(1998))。据报道，在秀丽新小杆线虫中通过双链RNA对基因表达的破坏，引起转录后机制的抑制(Montgomery等，Proc.Natl.Acad.Sci.95：15502-15507(1998))。在植物中也已报道了双链RNA的基因沉默的证据(Waterhouse等，Proc.Natl.Acad.Sci.95：13959-13964(1998))。也参见Plasterk，Science296：1263-1265(2002)；Zamore，Science 296：1265-1269(2002)。

据报道，内含子剪接发夹结构也可用于影响转录后基因抑制(Smith等，Nature 407：319-320(2000))。报告表明，可以用具有发夹结构的内含子剪接RNA，以几乎100％的效率，诱导转录后基因沉默(Smith等，Nature 407：319-320(2000))。影响RNA沉默的代表性方法示于美国申请，代理公司卷号16518.069，发明名称为″Intron DoubleStranded RNA Constructs and Uses Thereof(内含子双链RNA构建体及其应用)，″JoAnne Fillatti为发明人，一并同时提交。

人们知道，本发明的一种或多种核酸可以被修饰，从而影响RNAi或转录后基因抑制的另一种模式。

本发明也提供植物部分、尤其是繁殖或贮藏部分。植物部分包括但不限于种子、胚乳、胚珠、花粉、根、块茎、茎、叶、梗、果、浆果、坚果、皮、荚果、种子和花。在一个特别优选的本发明的实施方案中，所述植物部分是种子。

本发明也提供装有超过10,000粒种子、更优选20,000粒种子、甚至更优选40,000粒种子的容器，其中所述种子的10％以上、更优选25％、更优选50％、甚至于更优选75％或90％是从本发明植物获得的种子。

本发明也提供装有超过10kg种子、更优选25kg种子、甚至更优选50kg粒种子的容器，其中所述种子的10％以上、更优选25％、更优选50％、甚至于更优选75％或90％是从本发明植物获得的种子。

可以对本发明的任何植物或其部分进行加工，以生产饲料、食品、蛋白制剂或油制品。对于该目的一个特别优选的植物部分是种子。在一个优选的实施方案中，所述饲料、食品、蛋白制剂或油制品为牲畜或人所设计。饲料、食品、蛋白制剂或油制品的生产方法是本领域已知的。参见例如美国专利4,957,748、5,100,697、5,219,596、5,936,069、6,005,076、6,146,669和6,156,227。在一个优选的实施方案中，所述蛋白制剂为高蛋白制剂。这样的高蛋白制剂的蛋白含量优选高于5％w/v，更优选高于10％w/v，甚至更优选高于15％w/v。在一种优选的油制品中，所述油制品是高油制品，其中从本发明植物或其部分获得的油含量高于5％w/v，更优选高于10％w/v，甚至更优选高于15％w/v。在一个优选的实施方案中，所述油制品为液体并且其体积超过1升、5升、10升或50升。本发明提供用本发明植物生产的或者用本发明方法生产的油。所述油可以表现出增加的氧化稳定性。这样的油可以是任何所得产品的次要成分或主要成分。此外，可以将这样的油与与其它油混合。在一个优选的实施方案中，用本发明植物生产的或者用本发明方法生产的油以体积或重量计占任何产品中油类成分的0.5％以上、1％以上、5％以上、10％以上、15％以上、50％以上、75％以上或90％以上。在另一个实施方案中，可以将所述油制品混合，并且可以以体积计占所述混合物的10％以上、25％以上、35％以上、50％以上或75％以上。可以将用本发明植物生产的油与一种或多种有机溶剂或石油馏出物混合。

在一个实施方案中，本发明的油的油组成为50％或更高的油酸和15％或更低的饱和脂肪酸。在另一个实施方案中，本发明的油的油组成为10％或更低的饱和脂肪酸。在另一个实施方案中，本发明的油组成为9％或更低的饱和脂肪酸、8％或更低的饱和脂肪酸、7％或更低的饱和脂肪酸、6％或更低的饱和脂肪酸、5％或更低的饱和脂肪酸、4％或更低的饱和脂肪酸、3.6％或更低的饱和脂肪酸、3.5％或更低的饱和脂肪酸、或3.4％或更低的饱和脂肪酸。在一个更优选的实施方案中，本发明的油的油组成为低饱和组成，而在另一个优选的实施方案中，本发明的油的油组成为零饱和组成。

在另一个优选的实施方案中，本发明的油的油组成为50％或更高的油酸以及介于10％和15％之间的饱和脂肪酸。在一个更优选的实施方案中，本发明的油的油组成为介于7％和10％之间的饱和脂肪酸、介于5％和8％之间的饱和脂肪酸、介于3.4％和7％之间的饱和脂肪酸、介于3.5％和7％之间的饱和脂肪酸、介于3.6％和7％之间的饱和脂肪酸、介于2％和4％之间的饱和脂肪酸、或低于3.4％的饱和脂肪酸。

在另一个优选的实施方案中，本发明的油的油组成中，棕榈酸水平至少被部分降低、至少被显著降低或被有效消除。在另一个实施方案中，本发明的油的油组成中，硬脂酸水平至少被部分降低、至少被显著降低或被有效消除。

在核酸序列当表达时能选择性降低FATB基因编码的蛋白和/或转录物的表达水平的实施方案中，从而使本发明的油的油组成为50％或更高油酸以及10％或更低饱和脂肪酸，最好是5％或更低饱和脂肪酸，最好是3.6％或更低饱和脂肪酸，最好是3.5％或更低饱和脂肪酸，更优选3.4％或更低饱和脂肪酸，所述核酸序列选自：(1)与选自以下的核苷酸序列的全长核酸分子至少有50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列：SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、其互补序列以及任一序列的片段；(2)含有在大豆FATB基因内含子中也存在的序列的核酸分子；和(3)表现出其序列与(2)的核酸分子的全长核酸分子有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸分子。

计算机可读介质

可以以各种便于使用的介质形式，提供SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、其互补序列以及任一序列的片段的核苷酸序列，或者其序列与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、其互补序列以及任一序列的片段有至少50％、60％或70％同一性、或优选80％、85％同一性、或特别优选90％、或95％同一性、或特别更优选97％、98％、或99％同一性的核苷酸序列。所述介质也可以以容许技术人员检查所述序列的形式，来提供其亚组。

在该实施方案的一个应用方面，本发明的核苷酸序列可以记录在计算机可读介质上。本文所用的“计算机可读介质”是指计算机可以直接阅读和存取的任何介质。所述介质包括但不限于：磁存储介质例如软盘、硬盘、存储介质和磁带；光存储介质例如CD-ROM；电存储介质例如RAM和ROM；以及这些类型的结合，例如磁/光存储介质。技术人员可容易地理解，目前已知计算机可读介质怎样用于生产产品，所述产品包括其上记录有本发明核苷酸序列的计算机可读介质。

本文所用的“记录”是指在计算机可读介质中储存信息的方法。技术人员可容易地采用目前用于将信息记录在计算机可读介质的任何已知方法，来产生包含本发明核苷酸序列信息的介质。技术人员可采用大量数据储存结构，来产生其上记录有本发明核苷酸序列的计算机可读介质。数据储存结构的选择通常是根据所选的存取储存信息的方式。另外，各种数据处理程序和格式可用于在计算机可读介质上储存本发明的核苷酸序列信息。所述序列信息可以字处理纯文本形式或者以ASCII形式存在，所述字处理纯文本形式是商业通用软件的格式，例如Word Perfect和Microsoft Word，而ASCII形式是储存为数据库应用形式，例如DB2、Sybase、Oracle等。技术人员可以容易地采用各种数据处理结构格式(例如纯文本或数据库)，以得到已在其上记录有本发明的核苷酸序列信息的计算机可读介质。

通过提供本发明的一个或多个核苷酸序列，技术人员可常规存取序列信息用于各种目的。计算机软件是公众可得到的，容许技术人员存取计算机可读介质提供的序列信息。在Sybase系统上执行BLAST(Altschul等，J Mol.Biol.215：403-410(1990))和BLAZE(Brutlag等，Comp.Chem.17：203-207(1993))搜索算法的软件可用于在含有与其它生物非编码区同源的基因组中鉴定出本发明的非编码序列区和其它核酸分子。所述非编码序列区可用于影响市售的重要蛋白的表达，所述蛋白例如用于氨基酸生物合成、代谢、转录、翻译、RNA加工、核酸和蛋白降解、蛋白修饰以及DNA复制、限制、修饰、重组和修复的酶。

本发明还提供系统、尤其是基于计算机的系统，所述系统含有本文描述的序列信息。所述系统是设计用于鉴定商业上重要的本发明核酸分子片段的。本文所用的“基于计算机的系统”是指用于分析本发明核苷酸序列信息的硬件方式、软件方式和数据存储方式。本发明基于计算机的系统的最低硬件配置包括中央处理器(CPU)、输入方式、输出方式和数据储存方式。技术人员可容易地理解，任何目前可用的基于计算机的系统都适用于本发明。

如上所示，本发明的基于计算机的系统包括其中存储本发明的核苷酸序列的数据存储方式以及支持和执行搜索方法的必要的硬件方式和软件方式。本文所用的“数据存储方式”是指存储本发明核苷酸序列信息的存储器，或者能存取其上记录有本发明核苷酸序列信息的产品存取方式。本文所用的“搜索”是指在基于计算机的系统中执行的一个或多个程序，以比较靶序列或靶结构基序和所述数据存储方式中的序列信息。搜索方法是用于鉴定与特定靶序列或靶基序匹配的本发明序列的片段或区域。已公开了各种已知算法，各种用于进行搜索的市售软件也可使用，并可用于本发明的基于计算机的系统。所述软件的实例包括但不限于MacPattern(EMBL)、BLASTIN和BLASTIX(NCBLA)。一个用于进行同源搜索的可用的算法或执行软件包，可适用于本发明的基于计算机的系统。

最优选的靶序列的序列长度为约10-100个氨基酸残基，或者约30-300个核苷酸残基。然而，已公认在搜索商业重要的本发明核酸分子片段(例如涉及基因表达和蛋白质加工的序列片段)中，所述靶序列可以更短些。

本文所用的“靶结构基序”或“靶基序”是指任何合理选择的序列或序列组合，其中所述序列是根据所述靶基序的折叠而形成的三维构型来选择。本领域已知各种靶基序。蛋白靶基序包括但不限于酶活性位点和信号序列。核酸靶基序包括但不限于启动子序列、顺式元件、发夹结构和诱导型表达元件(蛋白结合序列)。

因此，本发明还提供用于接收靶序列的输入方式、用于存储本发明的靶序列(所述序列用上述搜索方法鉴定)的数据存储方式和用于鉴定同源序列的输出方式。用于输入和输出的各种结构格式都可用于在本发明的基于计算机的系统中输入和输出信息。一个用于输出方式的优选的格式通过对所述靶序列或靶基序同源的不同程度来排列本发明的序列的片段。所述提示为技术人员提供了含不同数量的所述靶序列或靶基序的序列的排列，并鉴定出所鉴定片段中所含的同源性程度。

各种比较方法可用于用所述数据存储方式来比较靶序列或靶基序，以鉴定本发明序列的序列片段。例如，运行能执行BLAST和BLAZE算法(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990))的软件，可用于在本发明的核酸分子中鉴定非编码区。技术人员可容易地认识到，任何公众可得到的同源搜索程序都可用作本发明的基于计算机的系统的搜索方法。

如下实施例是说明性的而不以任何方式限制。

                          实施例

实施例1  FATB硫酯酶基因组序列的克隆

将得自生长的大豆品种A3244的叶组织，在液氮中磨碎并贮藏于-80℃待用。将6ml的SDS提取缓冲液(650ml无菌ddH₂O，100ml1M Tris-Cl pH8，100ml 0.25M EDTA，50ml 20％SDS，100ml 5MNaCl，4μl β-巯基乙醇)加入到2ml冷冻/磨碎的叶组织中，然后将所述混合物在65℃保温45分钟。将样品每15分钟振摇一次。将2ml冰冷的5M乙酸钠加入到样品中，将样品振摇，然后在冰上保温20分钟。将3ml的CHCl₃加入到样品中，然后将样品振摇10分钟。

将所述样品以10,000rpm离心20分钟，然后收集上清液。将2ml异丙醇加入到上清液中并进行混合。然后将样品以10,000rpm离心20分钟，并倒掉上清液。将沉淀重悬于200μl RNA酶中，然后在65℃保温20分钟。加入300μl乙酸铵/异丙醇(1∶7)并进行混合。然后将样品以10,000rpm离心15分钟，倒掉上清液。所得沉淀用500μl 80％乙醇冲洗，让其风干。然后将所得基因组DNA沉淀重悬于200μl的T10E1(10mM Tris:1mM EDTA)中。

在第一个方法中，用大豆FATB cDNA序列来设计6个寡核苷酸，所述寡核苷酸跨越以下基因：F1(SEQ ID NO：11)、F2(SEQ ID NO：12)、F3(SEQ ID NO：13)、R1(SEQ ID NO：14)、R2(SEQ ID NO：15)、和R3(SEQ ID NO：16)。所述寡核苷酸成对用于从所述分离的大豆基因组DNA进行PCR扩增：对1(F1+R1)、对2(F1+R2)、对3(F1+R3)、对4(F2+R1)、对5(F2+R2)、对6(F2+R3)、对7(F3+R1)和对8(F3+R2)。如下进行PCR扩增：1次循环，95℃10分钟；40次循环，95℃1分钟，58℃30秒，72℃55秒；1次循环，72℃7分钟。从引物对3、6和7得到3个阳性片段。每个片段克隆到载体pCR2.1(Invitrogen)。仅有#3基因组片段克隆成功并得到证实和测序(SEQ IDNO：10)。

通过比较所述基因组序列和所述cDNA序列，鉴定出大豆FATB基因中的如下3个内含子：内含子I(SEQ ID NO：2)跨越所述基因组序列(SEQ ID NO：10)的碱基106至碱基214，其长度为109bp；内含子II(SEQ ID NO：3)跨越所述基因组序列(SEQ ID NO：10)的碱基289至碱基1125，其长度为837bp；和内含子III(SEQ ID NO：4)跨越所述基因组序列(SEQ ID NO：10)的碱基1635至碱基1803，其长度为169bp。

在第二个方法中，将拟南芥(Arabidopsis thaliana)FATB cDNA和拟南芥FATB基因组序列与大豆FATB cDNA进行比对，确定了大豆FATB内含子的潜在位置。合成了用于邻接推定的大豆内含子的序列的寡核苷酸，并用合适的引物对扩增基因组DNA。通过比较扩增的基因组序列和所述cDNA序列，鉴定出大豆FATB基因中4个额外的内含子。这4个大豆内含子序列与大豆cDNA序列和3个先前分离的大豆内含子序列组合，产生FATB基因的基因组序列(SEQ ID NO：1)。所分离的4个新的内含子如下：引物F1和R1产生内含子IV(SEQID NO：5)，所述内含子跨越所述基因组序列(SEQ ID NO：1)的碱基1939至碱基2463，其长度为525bp；引物F2和R2产生内含子V(SEQID NO：6)，所述内含子跨越所述基因组序列(SEQ ID NO：1)的碱基2578至碱基2966，其长度为389bp；引物F3和R3产生内含子VI(SEQID NO：7)跨越所述基因组序列(SEQ ID NO：1)的碱基3140至碱基3245，其长度为106bp；以及内含子VII(SEQ ID NO：8)，所述内含子跨越所述基因组序列(SEQ ID NO：1)的碱基3314至碱基3395，其长度为82bp。

实施例2  植物表达构建体

用部分FATB克隆基因组DNA序列(SEQ ID NO：10)作为模板，用引物18133(SEQ ID NO：17)和18134(SEQ ID NO：18)，通过PCR扩增大豆FATB内含子II序列(SEQ ID NO：3)。如下进行PCR扩增：1次循环，95℃10分钟；25次循环，95℃30秒，62℃30秒，72℃30秒；1次循环，72℃7分钟。

PCR扩增产生长度为854bp的产物(SEQ ID NO：19)。所述PCR产物通过连接所述PCR引物5′端的XhoI位点、以有义方向直接克隆到表达盒pCGN3892(图1)，形成pMON70674(图2)。载体pCGN3892含有大豆7S启动子和豌豆RBCS 3′。然后pMON70674用NotI切割，并连接到含有受FMV启动子调节的CP4基因的载体pMON41164(图3)。所得基因表达构建体pMON70678(图4)用于采用如本文所述的土壤杆菌方法来转化大豆。

产生了含有大豆FATB内含子II序列(SEQ ID NO：3)的两个其它表达构建体。将pMON70674用NotI切割，并连接到含有受FMV启动子调节的CP4基因以及受napin启动子调节的KAS IV基因的载体pMON70675(图5)。所得表达构建体pMON70680(图6)用于采用如本文所述的土壤杆菌方法来转化大豆。然后，所述表达载体pMON70680用SnaBI切割，并以有义方向连接由7S启动子调节的霍霍巴δ-9去饱和酶基因的基因融合(pMON70656；图7)。所得表达构建体pMON70681(图8)用于采用如本文所述的土壤杆菌方法来转化大豆。

其它大豆FATB内含子序列例如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8，均按类似方法克隆。根据所需内含子序列来设计合适的引物。这些引物对用于从所述FATB基因组序列来扩增内含子。所扩增的内含子连接到所需表达载体上，然后将所述构建体转化大豆中。

实施例3  植物转化和分析

通过Martinell等(美国专利6,384,301)的方法，将含有所述大豆FATB内含子的表达构建体的线状DNA片段稳定地导入大豆(Asgrow品种A3244)中。通过在含有草甘膦的培养基上进行选择，鉴定出转化的大豆植物。

采用气相色谱法，分析来自用内含子表达构建体转化的大豆品系种子的脂肪酸组成。与非转化大豆种子的油相比，含有pMON70678的植物的R1单粒种子的油组成证明，转基因大豆品系种子的油的饱和及不饱和脂肪酸组成发生了变化(表1)。具体地讲，在转基因种子中降低了16:0。可以根据所需的相对脂肪酸组成，对所述品系进行选择。另外，因为每种所述内含子能够以不同范围改良各自的脂肪酸水平，所以预期可根据所需组成来使用内含子组合。

                         表1

R1单粒种子

数据                                           脂肪酸

构建体	事件	16:0	18:0	18:1	18:2	18:3
							PMON70678	GM_A31349	7.7	5.0	17.4	62.2	7.7
PMON70678	GM_A31349	7.8	4.6	18.2	61.9	7.3
							PMON70678	GM_A31349	7.9	5.5	17.3	60.4	8.3
PMON70678	GM_A31349	7.9	5.0	17.3	60.6	8.6
							PMON70678	GM_A31349	8.2	5.5	15.6	61.8	8.3
PMON70678	GM_A31342	8.4	6.8	12.4	63.1	9.0
							PMON70678	GM_A31342	8.7	5.3	15.9	62.7	7.3
PMON70678	GM_A31341	8.7	4.0	19.5	59.4	7.8
							PMON70678	GM_A31345	8.8	5.1	15.2	62.4	8.4
PMON70678	GM_A31342	8.8	5.8	13.4	63.0	9.0
							PMON70678	GM_A31345	8.9	5.2	15.3	62.0	8.7
PMON70678	GM_A31345	8.9	5.6	15.0	61.9	8.4
							PMON70678	GM_A31341	8.9	3.3	38.8	43.2	5.3
PMON70678	GM_A31345	9.0	5.1	16.6	60.7	8.5
							PMON70678	GM_A31342	9.0	5.5	16.2	61.9	7.2
PMON70678	GM_A31341	9.0	4.1	31.1	49.9	5.5
							PMON70678	GM_A31349	9.1	6.0	12.7	61.9	9.7
PMON70678	GM_A31342	9.1	5.2	15.4	62.5	7.8
							PMON70678	GM_A31417	9.2	5.6	15.1	60.8	9.0
PMON70678	GM_A31349	9.2	5.5	14.0	62.2	9.2
							PMON70678	GM_A31350	9.2	4.6	18.5	58.8	8.5
PMON70678	GM_A31342	9.4	5.1	15.5	62.2	7.5
							PMON70678	GM_A31350	9.5	5.3	14.7	61.5	8.6
PMON70678	GM_A31417	9.5	5.3	15.3	60.9	8.6
							PMON70678	GM_A31345	9.5	5.7	14.6	61.2	8.8
PMON70678	GM_A31350	9.6	5.5	13.7	61.7	9.1
							PMON70678	GM_A31417	9.6	5.2	16.0	60.0	8.8

PMON70678	GM_A31341	9.6	3.5	24.6	54.9	6.9
							PMON70678	GM_A31341	9.7	3.7	20.7	58.5	6.7
PMON70678	GM_A31341	9.8	3.8	19.6	58.5	7.7
							PMON70678	GM_A31345	9.9	5.1	14.8	61.4	8.6
对照	A3244	12.4	4.3	18.3	56.4	8.0
							对照	A3244	12.4	6.7	14.0	57.1	8.8
对照	A3244	12.6	4.9	15.4	57.4	9.1
							对照	A3244	12.9	5.0	17.6	55.9	8.2
对照	A3244	12.9	4.9	14.4	57.5	9.8
							对照	A3244	13.0	4.7	14.6	55.6	9.7
对照	A3244	13.0	4.7	14.9	57.0	9.4
							对照	A3244	13.0	5.0	13.8	57.4	10.2
对照	A3244	13.2	4.5	16.9	54.6	7.8
							对照	A3244	13.3	5.1	14.1	57.8	9.4

实施例4

从2种FATB内含子抑制品系的纯合R2种子和阴性对照(野生型种子和来自每种内含子抑制事件的无效分离子的种子)中分离RNA。含有这些RNA样品的RNA印迹用凝胶用FATB cDNA来探测。相对于阴性对照来说，在所述内含子抑制品系中FATB转录物水平明显降低。

实施例5  FATB内含子构建体

制备含有有义或反义方向的一个或多个FATB内含子的植物表达构建体。为了达到所需脂肪酸效应，将两个或两个以上FATB内含子组合到一个转录单元中。在一个替代方法中，每个FATB内含子都在其自身启动子(单顺反子)控制下进行表达。制备其它构建体，其中FATB内含子能或者只使用一个转录单元(反向重复)或者使用两个表达盒(一个含有有义内含子，另一个含有反义内含子)来产生dsRNA。

通过先前描述的方法，将这些构建体稳定地导入大豆(例如生长中的品系A3244)中。转化大豆植物通过在含有草甘膦的培养基上进行选择而鉴定出来。采用气相色谱法，测定来自用所述构建体转化的大豆品系种子的脂肪酸组成。另外，任何所述构建体都可含有其它目标序列，包括但不限于过量表达KASI、KAS IV和/或δ-9去饱和酶的序列以及启动子的不同组合。

                        序列表

<110>孟山都技术有限公司(Monsanto Technology，LLC)

<120>用产生具有改良脂肪酸组成的植物的硫酯酶相关核酸序列及其使用方法

<130>16518.128

<160>20

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>4086

<212>DNA

<213>大豆(Glycine max)

<220>

<223>大豆FATB基因组克隆

<400>1

ttagggaaac aacaaggacg caaaatgaca caatagccct tcttccctgt ttccagcttt     60

tctccttctc tctctccatc ttcttcttct tcttcactca gtcaggtacg caaacaaatc    120

tgctattcat tcattcattc ctctttctct ctgatcgcaa actgcacctc tacgctccac    180

tcttctcatt ttctcttcct ttctcgcttc tcagatccaa ctcctcagat aacacaagac    240

caaacccgct ttttctgcat ttctagacta gacgttctac cggagaaggt tctcgattct    300

tttctctttt aactttattt ttaaaataat aataatgaga gctggatgcg tctgttcgtt    360

gtgaatttcg aggcaatggg gttctcattt tcgttacagt tacagattgc attgtctgct    420

ttcctcttct cccttgtttc tttgccttgt ctgatttttc gtttttattt cttactttta    480

atttttgggg atggatattt tttctgcatt ttttcggttt gcgatgtttt caggattccg    540

attccgagtc agatctgcgc cggcttatac gacgaatttg ttcttattcg caacttttcg    600

cttgattggc ttgttttacc tctggaatct cacacgtgat caaataagcc tgctatttta    660

gttgaagtag aatttgttct ttatcggaaa gaattctatg gatctgttct gaaattggag     720

ctactgtttc gagttgctat tttttttagt agtattaaga acaagtttgc cttttatttt     780

acattttttt cctttgcttt tgccaaaagt ttttatgatc actctcttct gtttgtgata     840

taactgatgt gctgtgctgt tattatttgt tatttggggt gaagtataat tttttgggtg     900

aacttggagc atttttagtc cgattgattt ctcgatatca tttaaggcta aggttgacct     960

ctaccacgcg tttgcgtttg atgttttttc catttttttt ttatctcata tcttttacag    1020

tgtttgccta tttgcatttc tcttctttat cccctttctg tggaaaggtg ggagggaaaa    1080

tgtatttttt ttttctcttc taacttgcgt atattttgca tgcagcgacc ttagaaattc    1140

attatggtgg caacagctgc tacttcatca tttttccctg ttacttcacc ctcgccggac    1200

tctggtggag caggcagcaa acttggtggt gggcctgcaa accttggagg actaaaatcc    1260

aaatctgcgt cttctggtgg cttgaaggca aaggcgcaag ccccttcgaa aattaatgga    1320

accacagttg ttacatctaa agaaggcttc aagcatgatg atgatctacc ttcgcctccc    1380

cccagaactt ttatcaacca gttgcctgat tggagcatgc ttcttgctgc tatcacaaca    1440

attttcttgg ccgctgaaaa gcagtggatg atgcttgatt ggaagccacg gcgacctgac    1500

atgcttattg acccctttgg gataggaaaa attgttcagg atggtcttgt gttccgtgaa    1560

aacttttcta ttagatcata tgagattggt gctgatcgta ccgcatctat agaaacagta    1620

atgaaccatt tgcaagtaag tccgtcctca tacaagtgaa tctttatgat cttcagagat    1680

gagtatgctt tgactaagat agggctgttt atttagacac tgtaattcaa tttcatatat    1740

agataatatc attctgttgt tacttttcat actatattta tatcaactat ttgcttaaca    1800

acaggaaact gcacttaatc atgttaaaag tgctgggctt cttggtgatg gctttggttc    1860

cacgccagaa atgtgcaaaa agaacttgat atgggtggtt actcggatgc aggttgtggt    1920

ggaacgctat cctacatggt tagtcatcta gattcaacca ttacatgtga tttgcaatgt    1980

atccatgtta agctgctatt tctctgtcta ttttagtaat ctttatgagg aatgatcact    2040

cctaaatata ttcatggtaa ttattgagac ttaattatga gaaccaaaat gctttggaaa    2100

tttgtctggg atgaaaattg attagataca caagctttat acatgatgaa ctatgggaaa    2160

ccttgtgcaa cagagctatt gatctgtaca agagatgtag tatagcatta attacatgtt    2220

attagataag gtgacttatc cttgtttaat tattgtaaaa atagaagctg atactatgta    2280

ttctttgcat ttgttttctt accagttata tataccctct gttctgtttg agtactacta    2340

gatgtataaa gaatgcaatt attctgactt cttggtgttg ggttgaagtt agataagcta    2400

ttagtattat tatggttatt ctaaatctaa ttatctgaaa ttgtgtgtct atatttgctt    2460

caggggtgac atagttcaag tggacacttg ggtttctgga tcagggaaga atggtatgcg    2520

tcgtgattgg cttttacgtg actgcaaaac tggtgaaatc ttgacaagag cttccaggta    2580

gaaatcattc tctgtaattt tccttcccct ttccttctgc ttcaagcaaa ttttaagatg    2640

tgtatcttaa tgtgcacgat gctgattgga cacaatttta aatctttcaa acatttacaa    2700

aagttatgga accctttctt ttctctcttg aagatgcaaa tttgtcacga ctgaagtttg    2760

aggaaatcat ttgaattttg caatgttaaa aaagataatg aactacatat tttgcaggca    2820

aaaacctcta attgaacaaa ctgaacattg tatcttagtt tatttatcag actttatcat    2880

gtgtactgat gcatcacctt ggagcttgta atgaattaca tattagcatt ttctgaactg    2940

tatgttatgg ttttggtgat ctacagtgtt tgggtcatga tgaataagct gacacggagg    3000

ctgtctaaaa ttccagaaga agtcagacag gagataggat cttattttgt ggattctgat    3060

ccaattctag aagaggataa cagaaaactg actaaacttg acgacaacac agcggattat    3120

attcgtaccg gtttaagtgt atgtcaacta gtttttttgt aattgttgtc attaatttct    3180

tttcttaaat tatttcagat gttgctttct aattagttta cattatgtat cttcattctt    3240

ccagtctagg tggagtgatc tagatatcaa tcagcatgtc aacaatgtga agtacattga  3300

ctggattctg gaggtatttt tctgttcttg tattctaatc cactgcagtc cttgttttgt  3360

tgttaaccaa aggactgtcc tttgattgtt tgcagagtgc tccacagcca atcttggaga  3420

gtcatgagct ttcttccgtg actttagagt ataggaggga gtgtggtagg gacagtgtgc  3480

tggattccct gactgctgta tctggggccg acatgggcaa tctagctcac agtggacatg  3540

ttgagtgcaa gcatttgctt cgactcgaaa atggtgctga gattgtgagg ggcaggactg  3600

agtggaggcc caaacctatg aacaacattg gtgttgtgaa ccaggttcca gcagaaagca  3660

cctaagattt tgaaatggtt aacggttgga gttgcatcag tctccttgct atgtttagac  3720

ttattctggc ctctggggag agttttgctt gtgtctgtcc aatcaatcta catatcttta  3780

tatccttcta atttgtgtta ctttggtggg taagggggaa aagctgcagt aaacctcatt  3840

ctctctttct gctgctccat atttcatttc atctctgatt gcgctactgc taggctgtct  3900

tcaatattta attgcttgat caaaatagct aggcatgtat attattattc ttttctcttg  3960

gctcaattaa agatgcaatt ttcattgtga acacagcata actattattc ttattatttt  4020

tgtatagcct gtatgcacga atgacttgtc catccaatac aaccgtgatt gtatgctcca  4080

gctcag                                                             4086

<210>2

<211>104

<212>DNA

<213>大豆(Glycine max)

<220>

<223>大豆FATB内含子I

<400>2

caaatctgct attcattcat tcattcctct ttctctctga tcgcaaactg cacctctacg  60

ctccactctt ctcattttct cttcctttct cgcttctcag atcc                     104

<210>3

<211>839

<212>DNA

<213>大豆(Glycine max)

<220>

<223>大豆FATB内含子II

<400>3

ctcgattctt ttctctttta actttatttt taaaataata ataatgagag ctggatgcgt     60

ctgttcgttg tgaatttcga ggcaatgggg ttctcatttt cgttacagtt acagattgca    120

ttgtctgctt tcctcttctc ccttgtttct ttgccttgtc tgatttttcg tttttatttc    180

ttacttttaa tttttgggga tggatatttt ttctgcattt tttcggtttg cgatgttttc    240

aggattccga ttccgagtca gatctgcgcc ggcttatacg acgaatttgt tcttattcgc    300

aacttttcgc ttgattggct tgttttacct ctggaatctc acacgtgatc aaataagcct    360

gctattttag ttgaagtaga atttgttctt tatcggaaag aattctatgg atctgttctg    420

aaattggagc tactgtttcg agttgctatt ttttttagta gtattaagaa caagtttgcc    480

ttttatttta catttttttc ctttgctttt gccaaaagtt tttatgatca ctctcttctg    540

tttgtgatat aactgatgtg ctgtgctgtt attatttgtt atttggggtg aagtataatt    600

ttttgggtga acttggagca tttttagtcc gattgatttc tcgatatcat ttaaggctaa    660

ggttgacctc taccacgcgt ttgcgtttga tgttttttcc attttttttt tatctcatat    720

cttttacagt gtttgcctat ttgcatttct cttctttatc ccctttctgt ggaaggtggg    780

agggaaaatg tatttttttt ttctcttcta acttgcgtat attttgcatg cagcgacct     839

<210>4

<211>169

<212>DNA

<213>大豆(Glycine max)

<220>

<223>大豆FATB内含子III

<400>4

taagtccgtc ctcatacaag tgaatcttta tgatcttcag agatgagtat gctttgacta     60

agatagggct gtttatttag acactgtaat tcaatttcat atatagataa tatcattctg    120

ttgttacttt tcatactata tttatatcaa ctatttgctt aacaacagg                169

<210>5

<211>525

<212>DNA

<213>大豆(Glycine max)

<220>

<223>FATB内含子IV

<400>5

gttagtcatc tagattcaac cattacatgt gatttgcaat gtatccatgt taagctgcta     60

tttctctgtc tattttagta atctttatga ggaatgatca ctcctaaata tattcatggt    120

aattattgag acttaattat gagaaccaaa atgctttgga aatttgtctg ggatgaaaat    180

tgattagata cacaagcttt atacatgatg aactatggga aaccttgtgc aacagagcta    240

ttgatctgta caagagatgt agtatagcat taattacatg ttattagata aggtgactta    300

tccttgttta attattgtaa aaatagaagc tgatactatg tattctttgc atttgttttc    360

ttaccagtta tatataccct ctgttctgtt tgagtactac tagatgtata aagaatgcaa    420

ttattctgac ttcttggtgt tgggttgaag ttagataagc tattagtatt attatggtta    480

ttctaaatct aattatctga aattgtgtgt ctatatttgc ttcag                    525

<210>6

<211>389

<212>DNA

<213>大豆(Glycine max)

<220>

<223>FATB内含子V

<400>6

gtagaaatca ttctctgtaa ttttccttcc cctttccttc tgcttcaagc aaattttaag     60

atgtgtatct taatgtgcac gatgctgatt ggacacaatt ttaaatcttt caaacattta    120

caaaagttat ggaacccttt cttttctctc ttgaagatgc aaatttgtca cgactgaagt    180

ttgaggaaat catttgaatt ttgcaatgtt aaaaaagata atgaactaca tattttgcag    240

gcaaaaacct ctaattgaac aaactgaaca ttgtatctta gtttatttat cagactttat    300

catgtgtact gatgcatcac cttggagctt gtaatgaatt acatattagc attttctgaa    360

ctgtatgtta tggttttggt gatctacag                                      389

<210>7

<211>106

<212>DNA

<213>大豆(Glycine max)

<220>

<223>FATB内含子VI

<400>7

tatgtcaact agtttttttg taattgttgt cattaatttc ttttcttaaa ttatttcaga     60

tgttgctttc taattagttt acattatgta tcttcattct tccagt                   106

<210>8

<211>82

<212>DNA

<213>大豆(Glycine max)

<220>

<223>FATB内含子VII

<400>8

gtatttttct gttcttgtat tctaatccac tgcagtcctt gttttgttgt taaccaaagg    60

actgtccttt gattgtttgc ag                                             82

<210>9

<211>328

<212>PRT

<213>大豆(Glycine max)

<220>

<223>大豆FATB酶

<400>9

Met Glu Glu Gln Leu Leu Ala Ala Ile Thr Thr Ile Phe Leu Ala Ala

  1               5                  10                  15

Glu Lys Gln Trp Met Met Leu Asp Trp Lys Pro Arg Arg Pro Asp Met

             20                  25                  30

Leu Ile Asp Pro Phe Gly Ile Gly Lys Ile Val Gln Asp Gly Leu Val

         35                  40                  45

Phe Arg Glu Asn Phe Ser Ile Arg Ser Tyr Glu Ile Gly Ala Asp Arg

     50                  55                  60

Thr Ala Ser Ile Glu Thr Val Met Asn His Leu Gln Glu Thr Ala Leu

 65                  70                  75                  80

Asn His Val Lys Ser Ala Gly Leu Leu Gly Asp Gly Phe Gly Ser Thr

                 85                  90                  95

Pro Glu Met Cys Lys Lys Asn Leu Ile Trp Val Val Thr Arg Met Gln

            100                 105                 110

Val Val Val Glu Arg Tyr Pro Thr Trp Gly Asp Ile Val Gln Val Asp

        115                 120                 125

Thr Trp Val Ser Gly Ser Gly Lys Asn Gly Met Arg Arg Asp Trp Leu

    130                 135                 140

Leu Arg Asp Ser Lys Thr Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ala Ser Ser Val

145                 150                 155                 160

Trp Val Met Met Asn Lys Leu Thr Arg Arg Leu Ser Lys Ile Pro Glu

                165                 170                 175

Glu Val Arg Gln Glu Ile Gly Ser Tyr Phe Val Asp Ser Asp Pro Ile

            180                 185                 190

Leu Glu Glu Asp Asn Arg Lys Leu Thr Lys Leu Asp Asp Asn Thr Ala

        195                 200                 205

Asp Tyr Ile Arg Thr Gly Leu Ser Pro Arg Trp Ser Asp Leu Asp Ile

    210                 215                 220

Asn Gln His Val Asn Asn Val Lys Tyr Ile Gly Trp Ile Leu Glu Ser

225                 230                 235                 240

Ala Pro Gln Pro Ile Leu Glu Ser His Glu Leu Ser Ser Met Thr Leu

                245                 250                 255

Glu Tyr Arg Arg Glu Cys Gly Arg Asp Ser Val Leu Asp Ser Leu Thr

            260                 265                 270

Ala Val Ser Gly Ala Asp Met Gly Asn Leu Ala His Ser Gly His Val

        275                 280                 285

Glu Cys Lys His Leu Leu Arg Leu Glu Asn Gly Ala Glu Ile Val Arg

    290                 295                 300

Gly Arg Thr Glu Trp Arg Pro Lys Pro Val Asn Asn Phe Gly Val Val

305                 310                 315                 320

Asn Gln Val Pro Ala G1u Ser Thr

                325

<210>10

<211>1856

<212>DNA

<213>大豆(Glycine max)

<220>

<223>大豆FATB部分基因组克隆

<400>10

ttagggaaac aacaaggacg caaaatgaca caatagccct tcttccctgt ttccagcttt      60

tctccttctc tctctccatc ttcttcttct tcttcactca gtcaggtacg caaacaaatc     120

tgctattcat tcattcattc ctctttctct ctgatcgcaa actgcacctc tacgctccac     180

tcttctcatt ttctcttcct ttctcgcttc tcagatccaa ctcctcagat aacacaagac     240

caaacccgct ttttctgcat ttctagacta gacgttctac cggagaaggt tctcgattct     300

tttctctttt aactttattt ttaaaataat aataatgaga gctggatgcg tctgttcgtt     360

gtgaatttcg aggcaatggg gttctcattt tcgttacagt tacagattgc attgtctgct     420

ttcctcttct cccttgtttc tttgccttgt ctgatttttc gtttttattt cttactttta     480

atttttgggg atggatattt tttctgcatt ttttcggttt gcgatgtttt caggattccg     540

attccgagtc agatctgcgc cggcttatac gacgaatttg ttcttattcg caacttttcg     600

cttgattggc ttgttttacc tctggaatct cacacgtgat caaataagcc tgctatttta     660

gttgaagtag aatttgttct ttatcggaaa gaattctatg gatctgttct gaaattggag     720

ctactgtttc gagttgctat tttttttagt agtattaaga acaagtttgc cttttatttt     780

acattttttt cctttgcttt tgccaaaagt ttttatgatc actctcttct gtttgtgata     840

taactgatgt gctgtgctgt tattatttgt tatttggggt gaagtataat tttttgggtg     900

aacttggagc atttttagtc cgattgattt ctcgatatca tttaaggcta aggttgacct     960

ctaccacgcg tttgcgtttg atgttttttc catttttttt ttatctcata tcttttacag    1020

tgtttgccta tttgcatttc tcttctttat cccctttctg tggaaggtgg gagggaaaat    1080

gtattttttt tttctcttct aacttgcgta tattttgcat gcagcgacct tagaaattca    1140

ttatggtggc aacagctgct acttcatcat ttttccctgt tacttcaccc tcgccggact    1200

ctggtggagc aggcagcaaa cttggtggtg ggcctgcaaa ccttggagga ctaaaatcca  1260

aatctgcgtc ttctggtggc ttgaaggcaa aggcgcaagc cccttcgaaa attaatggaa  1320

ccacagttgt tacatctaaa gaaggcttca agcatgatga tgatctacct tcgcctcccc  1380

ccagaacttt tatcaaccag ttgcctgatt ggagcatgct tcttgctgct atcacaacaa  1440

ttttcttggc cgctgaaaag cagtggatga tgcttgattg gaagccacgg cgacctgaca  1500

tgcttattga cccctttggg ataggaaaaa ttgttcagga tggtcttgtg ttccgtgaaa  1560

acttttctat tagatcatat gagattggtg ctgatcgtac cgcatctata gaaacagtaa  1620

tgaaccattt gcaagtaagt ccgtcctcat acaagtgaat ctttatgatc ttcagagatg  1680

agtatgcttt gactaagata gggctgttta tttagacact gtaattcaat ttcatatata  1740

gataatatca ttctgttgtt acttttcata ctatatttat atcaactatt tgcttaacaa  1800

caggaaactg cacttaatca tgttaaaagt gctgggcttc ttggtgatgg ctggta      1856

<210>11

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物F1

<400>11

gcggccgccc cgggttaggg aaacaacaag gacg                                 34

<210>12

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物F2

<400>12

gcggccgccc cgggcagtca gatccaactc ctca                                34

<210>13

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物F3

<400>13

gcggccgccc cgggattggt gctgatcgta ccgc                                34

<210>14

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物R1

<400>14

gcggccgcgg taccccccct tacccaccaa agtatcac                            38

<210>15

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物R2

<400>15

gcggccgcgg taccaaactc tccccaggga acca                                34

<210>16

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物R3

<400>16

gcggccgcgg taccagccat caccaagaag ccca                                34

<210>17

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物18133

<400>17

gaattcctcg agctcgattc ttttctcttt taacttt                             37

<210>18

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物18134

<400>18

gaattcctcg agcatgcaaa atatacgcaa gttagaa                             37

<210>19

<211>854

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>含有大豆FATB内含子II的PCR产物

<400>19

gaattcctcg agctcgattc ttttctcttt taactttatt tttaaaataa taataatgag     60

agctggatgc gtctgttcgt tgtgaatttc gaggcaatgg ggttctcatt ttcgttacag    120

ttacagattg cattgtctgc tttcctcttc tcccttgttt ctttgccttg tctgattttt    180

cgtttttatt tcttactttt aatttttggg gatggatatt ttttctgcat tttttcggtt    240

tgcgatgttt tcaggattcc gattccgagt cagatctgcg ccggcttata cgacgaattt    300

gttcttattc gcaacttttc gcttgattgg cttgttttac ctctggaatc tcacacgtga    360

tcaaataagc ctgctatttt agttgaagta gaatttgttc tttatcggaa agaattctat    420

ggatctgttc tgaaattgga gctactgttt cgagttgcta ttttttttag tagtattaag    480

aacaagtttg ccttttattt tacatttttt tcctttgctt ttgccaaaag tttttatgat    540

cactctcttc tgtttgtgat ataactgatg tgctgtgctg ttattatttg ttatttgggg    600

tgaagtataa ttttttgggt gaacttggag catttttagt ccgattgatt tctcgatatc    660

atttaaggct aaggttgacc tctaccacgc gtttgcgttt gatgtttttt ccattttttt    720

tttatctcat atcttttaca gtgtttgcct atttgcattt ctcttcttta tcccctttct    780

gtggaaggtg ggagggaaaa tgtatttttt ttttctcttc taacttgcgt atattttgca    840

tgctcgagga attc                                                      854

<210>20

<211>1688

<212>DNA

<213>大豆(Glycine max)

<220>

<223>大豆FATB cDNA

<400>20

acaattacac tgtctctctc ttttccaaaa ttagggaaac aacaaggacg caaaatgaca     60

caatagccct tcttccctgt ttccagcttt tctccttctc tctctctcca tcttcttctt    120

cttcttcact cagtcagatc caactcctca gataacacaa gaccaaaccc gctttttctg    180

catttctaga ctagacgttc taccggagaa gcgaccttag aaattcatta tggtggcaac    240

agctgctact tcatcatttt tccctgttac ttcaccctcg ccggactctg gtggagcagg    300

cagcaaactt ggtggtgggc ctgcaaacct tggaggacta aaatccaaat ctgcgtcttc    360

tggtggcttg aaggcaaagg cgcaagcccc ttcgaaaatt aatggaacca cagttgttac    420

atctaaagaa agcttcaagc atgatgatga tctaccttcg cctcccccca gaacttttat    480

caaccagttg cctgattgga gcatgcttct tgctgctatc acaacaattt tcttggccgc    540

tgaaaagcag tggatgatgc ttgattggaa gccacggcga cctgacatgc ttattgaccc    600

ctttgggata ggaaaaattg ttcaggatgg tcttgtgttc cgtgaaaact tttctattag    660

atcatatgag attggtgctg atcgtaccgc atctatagaa acagtaatga accatttgca    720

agaaactgca cttaatcatg ttaaaagtgc tgggcttctt ggtgatggct ttggttccac    780

gccagaaatg tgcaaaaaga acttgatatg ggtggttact cggatgcagg ttgtggtgga    840

acgctatcct acatggggtg acatagttca agtggacact tgggtttctg gatcagggaa    900

gaatggtatg cgtcgtgatt ggcttttacg tgactccaaa actggtgaaa tcttgacaag    960

agcttccagt gtttgggtca tgatgaataa gctaacacgg aggctgtcta aaattccaga   1020

agaagtcaga caggagatag gatcttattt tgtggattct gatccaattc tggaagagga   1080

taacagaaaa ctgactaaac ttgacgacaa cacagcggat tatattcgta ccggtttaag   1140

tcctaggtgg agtgatctag atatcaatca gcatgtcaac aatgtgaagt acattggctg   1200

gattctggag agtgctccac agccaatctt ggagagtcat gagctttctt ccatgacttt   1260

agagtatagg agagagtgtg gtagggacag tgtgctggat tccctgactg ctgtatctgg   1320

ggccgacatg ggcaatctag ctcacagcgg gcatgttgag tgcaagcatt tgcttcgact   1380

ggaaaatggt gctgagattg tgaggggcag gactgagtgg aggcccaaac ctgtgaacaa   1440

ctttggtgtt gtgaaccagg ttccagcaga aagcacctaa gatttgaaat ggttaacgat    1500

tggagttgca tcagtctcct tgctatgttt agacttattc tggttccctg gggagagttt    1560

tgcttgtgtc tatccaatca atctacatgt ctttaaatat atacaccttc taatttgtga    1620

tactttggtg ggtaaggggg aaaagcagca gtaaatctca ttctcattgt aattaaaaaa    1680

aaaaaaaa                                                             1688

Claims (24)

1.一种重组核酸分子，所述核酸分子包含作为有效连接组分的以下元件：(A)一个启动子，所述启动子在植物细胞中发挥作用，从而导致产生mRNA分子；和(B)一个核酸序列，所述序列与选自以下的核酸序列有至少85％的同一性：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、其互补序列以及任一序列的片段。

2.权利要求1的重组核酸分子，其中所述启动子是种子特异性启动子。

3.权利要求2的重组核酸分子，其中所述启动子是7S启动子。

4.权利要求1的重组核酸分子，其中所述核酸序列相对于所述启动子为有义方向。

5.权利要求1的重组核酸分子，其中所述核酸序列相对于所述启动子为反义方向。

6.权利要求1的重组核酸分子，其中所述核酸序列能够表达dsRNA。

7.权利要求1的重组核酸分子，其中所述核酸分子还包含一个或多个额外的核酸序列，其中所述额外的核酸序列编码选自以下的酶：β-酮脂酰-ACP合酶I、β-酮脂酰-ACP合酶IV和δ-9去饱和酶。

8.权利要求7的重组核酸分子，其中所述额外的核酸序列编码β-酮脂酰-ACP合酶IV。

9.权利要求7的重组核酸分子，其中所述额外的核酸序列编码β-酮脂酰-ACP合酶IV和δ-9去饱和酶。

10.一种从基因组多核苷酸序列获得的内含子，其中所述基因组多核苷酸序列选自：

a)与全长SEQ ID NO：1的SEQ ID NO：1编码区有至少70％同一性的基因组多核苷酸序列；

b)与全长SEQ ID NO：1的SEQ ID NO：1编码区有至少80％同一性的基因组多核苷酸序列；

c)与全长SEQ ID NO：1的SEQ ID NO：1编码区有至少90％同一性的基因组多核苷酸序列；和

d)与全长SEQ ID NO：1的SEQ ID NO：1编码区有至少95％同一性的基因组多核苷酸序列。

11.一种从基因组多核苷酸序列获得的内含子，其中所述基因组多核苷酸序列选自：

a)与全长SEQ ID NO：10的SEQ ID NO：10编码区有至少70％同一性的基因组多核苷酸序列；

b)与全长SEQ ID NO：10的SEQ ID NO：10编码区有至少80％同一性的基因组多核苷酸序列；

c)与全长SEQ ID NO：10的SEQ ID NO：10编码区有至少90％同一性的基因组多核苷酸序列；和

d)与全长SEQ ID NO：10的SEQ ID NO：10编码区有至少95％同一性的基因组多核苷酸序列。

12.一种包含重组核酸分子的转化大豆植物，所述重组核酸分子包含作为有效连接组分的以下元件：(A)一个启动子，所述启动子在植物中发挥作用，从而导致产生mRNA分子；和(B)一个核酸序列，所述序列与选自以下的核酸序列有至少85％的同一性：SEQ ID NO：2、SEQID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、其互补序列以及任一序列的片段。

13.权利要求12的转化植物，其中所述转化植物相对于具有相似遗传背景但缺乏所述重组核酸分子的植物表现出降低的棕榈酸水平。

14.权利要求12的转化植物，其中所述转化植物相对于具有相似遗传背景但缺乏所述重组核酸分子的植物产生具有降低的棕榈酸水平的种子。

15.权利要求12的转化植物，其中所述转化植物相对于具有相似遗传背景但缺乏所述重组核酸分子的植物表现出降低的硬脂酸水平。

16.权利要求12的转化植物，其中所述转化植物相对于具有相似遗传背景但缺乏所述重组核酸分子的植物产生具有降低的硬脂酸水平的种子。

17.权利要求12的转化植物，其中所述转化植物相对于具有相似遗传背景但缺乏所述重组核酸分子的植物产生具有降低的饱和脂肪酸含量的种子。

18.权利要求12的转化植物，其中所述转化植物相对于具有相似遗传背景但缺乏所述重组核酸分子的植物表现出增加的油酸水平。

19.权利要求12的转化植物，其中所述转化植物相对于具有相似遗传背景但缺乏所述重组核酸分子的植物产生具有增加的油酸水平的种子。

20.一种转化大豆植物，所述植物具有包含以下的核酸分子：(a)第一启动子，所述启动子与具有第一核酸序列的第一核酸分子有效连接，所述第一核酸序列与选自以下的核酸序列有85％或85％以上的同一性：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、其互补序列以及任一序列的片段；和(b)第二核酸分子，所述核酸分子具有编码选自以下酶的第二核酸序列：β-酮脂酰-ACP合酶I、β-酮脂酰-ACP合酶IV和δ-9去饱和酶。

21.权利要求20的转化大豆植物，其中所述第一启动子是种子特异性启动子。

22.权利要求20的转化大豆植物，其中所述第一启动子是7S启动子。

23.权利要求20的转化大豆植物，其中所述第一核酸分子转录并且能够至少部分降低由内源FATB基因编码的转录物的水平。

24.一种改良宿主细胞中的脂质组成的方法，所述方法包括：用DNA构建体转化宿主细胞，所述构建体按5′→3′转录方向包含作为有效连接组分的以下元件：一个在所述宿主细胞中起作用的转录起始区，一个选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、其互补序列以及任一序列的片段的DNA序列，和一个转录终止序列；然后在其中起始所述DNA序列转录的条件下培养所述细胞，从而改良所述脂质组成。

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