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CN1703427A - 通过同时加载和激活抗原呈递细胞的选定的亚型产生并且控制t细胞的效应物谱的方法和组合物 - Google Patents

通过同时加载和激活抗原呈递细胞的选定的亚型产生并且控制t细胞的效应物谱的方法和组合物 Download PDF

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CN1703427A
CN1703427A CNA038252988A CN03825298A CN1703427A CN 1703427 A CN1703427 A CN 1703427A CN A038252988 A CNA038252988 A CN A038252988A CN 03825298 A CN03825298 A CN 03825298A CN 1703427 A CN1703427 A CN 1703427A
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apc
antigen
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王立林
D·史密斯
B·菲利普斯
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Astral Inc
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Abstract

本发明涉及能导致针对Te 1效应物的I类－免疫的有效重新定向的新组合物，所述重新定向利用了通过IgG主链内的肽与抗原呈递细胞的合适指令的组合出乎意料地加载MHC I。上述组合物能够将看上去无效的治疗剂转变成高效的治疗剂，与I类－限制的细胞溶解性细胞和IFN－γ，IL－2生产T细胞的产生相关，还与抗高毒力微生物的保护作用或从恶性肿瘤过程中恢复相关。

Description

通过同时加载和激活抗原呈递细胞的选定的 亚型产生并且控制T细胞的效应物谱的方法和组合物
相关申请：
本申请要求申请日为2002年9月20日的美国专利申请流水号60/412,219和申请日为2003年3月14日的国际申请号PCT/US03/07995的优先权，这两份申请被以它们的整体形式收作本文参考。
发明领域
本发明总体上涉及产生免疫反应的方法和组合物。更具体地讲，本发明涉及加载抗原呈递细胞，以便以适合产生需要的T细胞反应的方式在I类MHC分子上展示送递的表位的方法和组合物。
发明背景
还没有直接的证据证实通过Fcγ受体(“FcγR”)送递抗原，能够引发有效的抗肿瘤或抗感染反应。例如，以前业已证实了，在免疫球蛋白或IgG主链内送递病毒NP(核蛋白)衍生的表位不会导致可检测的细胞毒性免疫的诱导(Zaghouani等，Eur J Immunol.1993Nov；23(11)：2746-50)。相反，在NP表达细胞(转染瘤)中送递相同的表位，产生了显著的细胞溶解活性。因此，那时得出的结论是“APC(抗原呈递细胞)不能够将流感核蛋白[NP]肽从相同的场合(1μMIg-NP)呈递到I类MHC-限制的T细胞”，因此，“内吞腔室在相同的载体蛋白上提供I-和II-类MHC限制的肽时，有利于通过II类呈递至少1000倍”。
NP表位进入I类MHC呈递途径，取决于送递方法，并因此被认为随后严格局限于FcγR内化。最近，业已提出了抗原呈递细胞(“APC”)上的FcγR的交联或同时占据，可大大优化信号转导，并且导致交叉激发的刺激和APC刺激，导致了I类MHC分子的有效加载(Regnault等，J Exp Med.1999，Jan 18；189(2)：371-80)。这一目的可以利用免疫复合物(多价抗原-抗体非共价复合物)实现；不过，由于C(“补体”)介导的疾病的可能，所述复合物只能够离体施用于APC(Naama等，J Clin Lab Immunol.1985 Jun；17(2)：59-67；Rafiq等，J Clin Invest.2002 Jul；110(1)：71-9)。另外，(Fab)2-抗原重组融合构建体将受体定向到APC上，可以导致受体交联内化，并且在II类MHC分子中呈递(Lunde等，Biochem Soc Trans 2002；30(4)：500-6)。不过，所述抗原的插入修饰了免疫球蛋白(“Ig”)的恒定区(CH2和CH3)的Fc部分，这有可能导致对半衰期和药代动力学的严重的和不可预测的影响，这两种参数与该片段的完整性密切相关(Spiegelberg HL，J Clin Invest 1975 Sep；56(3)：588-94)。最终，到目前为止还没有上述任一种方法在体内利用时能诱导预防性或治疗性抗-肿瘤或抗-微生物免疫的确切证据，所述免疫与能产生诸如IFN-γ的特异性细胞因子的最佳I类和II类MHC-限制的T细胞的产生相关。即使是离体使用，所述免疫复合物方法表现出有限的效力，这是由于ITAM+和ITIM+FcγR的活性的平衡所致(Kalergis和Ravetch，J Exp Med 2002 Jun 17；195(12)：1653-9)。因此，尚有待确定通过Fcγ受体的单价连接进行的抗原到APC的体内送递是否可用于诱导有效的抗-肿瘤或抗病毒免疫。
申请日为2002年3月14日的PCT申请流水号PCT/US03/07995和申请日为200年4月30日的美国专利申请流水号60/364,490被收作本文参考。可以从Geneva BioInformatics获得的记录在CD-ROM上的Swiss-Protein/Trembl Protein KnowledgebaseTM以它的全文形式收作本文参考。
发明概述
本发明证实了与预期相反，利用没有修饰Fc部分而与IgG主链共价连接的肽表位，通过FcγR的单价占据而体内和离体加载APC，导致所述表位进入MHC I加工和呈递途径，以及有效加载I类MHC分子。出乎预料的是，这导致了强Tc2反应的产生，它以识别IgG主链内的表位的、产生IL-4，而不是IL-2或IFN-γ的I类MHC限制的T细胞为特征。
另外，这种“偏离的”反应的发生不能有效控制与肿瘤生长相关的病理学过程，并且与细胞溶解性T细胞的显著激发不相关。这在很大程度上解释了以前在类似的场合不能检测免疫的诱导，并且出乎预料的证实了APC上的FcγR的交联或多价占据(如对于免疫复合物或Fab2-抗原化合物来说)不是将所述肽有效加载到I类MHC分子上的先决条件。这一点是重要的，因为所述概念可体内使用(与免疫复合物不同)，并且可以保留Fc部分的完整性，并因此保留PK特征(与Fab2-抗原重组分子相反)。尽管有效加载了I类MHC分子，在通过IgG主链内的肽表位进行体内加载时，APC不能引发保护性抗-肿瘤和抗-微生物免疫。
另外，本申请披露了能导致I类-免疫向Tc1效应物有效重新定向的新组合物，所述重新定向利用了通过IgG主链内的肽对MHC I的出乎预料的加载。这种组合物能够将看上去无效的II类和I类MHC-限制的肽转变成高效肽。FcγR-介导的APC的加载与通过新的合成多核苷酸对APC的刺激相关，导致了I类-限制的细胞溶解性细胞和产生IFN-γ，IL-2的T细胞的产生，还与抗高毒力微生物的保护作用或从恶性肿瘤过程中恢复相关。还证实了所述技术的变化形式，不正确的使用或正如以前所推荐的用法，在产生抗病毒或肿瘤的免疫保护，特别是I类MHC-限制的免疫方面不是最佳的。本申请证实了过去失败的原因，并且教导了如何获得并且应用所述技术的不同成分，以便获得最佳效果。
本发明的各种实施方案包括：
1.一种加载抗原呈递细胞，并且产生针对抗原或肽表位的T细胞反应的方法，包括使用与Ig，Ig主链主链或其部分连接的至少一个肽表位，以便形成Ig-肽分子/复合物或其部分，其中，在给患者体内或离体施用时，可以通过所述所述抗原呈递细胞的MHC I途径有效加工并且呈递所述表位，导致I类MHC分子在抗原呈递细胞上的有效加载，以便产生I类MHC-肽复合物。
2.如段落1的方法，其中，所述Ig-肽分子/复合物或其部分是与RNA链一起施用的。
3.如段落2的方法，其中，所述RNA是dsRNA链，并且是pA：pU。
4.如段落3的方法，其中，所述dsRNA是pA：pU，并且所述dsRNA的大小大约为20-100个碱基对。
5.如段落1，2，3或4的方法，其中，所述Ig主链来自人Ig。
6.如段落1，2，3或4的方法，其中，所述Ig主链来自人IgG。
7.如段落1，2，3或4的方法，其中，所述Ig主链是人源化Ig。
8.如段落1的方法，其中，所述抗原呈递细胞是通过FcγR的单价占据加载的。
9.如段落1的方法，其中，所述抗原呈递细胞可以在体内或离体加载。
10.如段落1的方法，其中，所述肽表位共价连接于所述Ig主链。
11.如段落1的方法，其中，所述肽表位连接于Ig主链，而不修饰所述Ig的Fc部分。
12.如段落1的方法，其中，所述肽表位被插入所述免疫球蛋白分子的CDR区。
13.如段落1，2，3或4的方法，其中，所述肽表位通过插入或者缺失而插入所述免疫球蛋白分子的CDR区。
14.如段落1，2，3或4的方法，其中，所述I类MHC-肽复合物导致了强Tc2反应的产生，该反应以IL-4，而不是IL-2或IFN-γ的产生为特征。
15.如段落1的方法，其中，所述肽表位选自下组：流感病毒M1或M2；丙型肝炎病毒NS3；乙型肝炎病毒核心抗原；人乳头瘤病毒HPV18-E7，HPV 16-E7，HPV 18 E6，HPV 16 E6；黑素瘤-gp 100；MART-1；TRP-2；癌胚抗原前体；Her-2；破伤风毒素通用T辅助表位；HIV-I：逆转录酶；HIV1：gag；胰岛素前体-人；人Gad 65；前列腺肿瘤抗原；粘蛋白1；单纯疱疹病毒抗原；和，呼吸道合胞病毒抗原。
16.如段落1的方法，其中，避免了血清的负面影响。
17.如段落1，2，3或4的方法，其中，所述Ig肽分子和dsRNA是通过皮下或腹膜内注射施用的。
18.如段落1的方法，其中，所述抗原呈递细胞选自下组：树突细胞，单核细胞，巨噬细胞和B细胞。
19.如段落1的方法，其中，所述抗原呈递细胞选自下组：CD11c+和CD11b+APC。
20.如段落1的方法，其中，通过体内送递形成的得到的MHC-肽复合物表达了最多达1-2周。
21.如段落1，2，3或4的方法，其中，所述MHC-肽复合物导致了T细胞的激活。
22.如段落21的方法，其中，所述T细胞反应是通过APC上的ITAM+和ITIM+Fcγ受体确定的。
23.如段落21的方法，其中，ITAM+FcγR同种型的γ链的表达诱导了T细胞反应，其中，ITIM+FcγRII限制了所述T细胞反应。
24.如段落18或19的方法，其中，单核细胞能诱导Th2和Tr1细胞，树突细胞和单核细胞都能诱导Th3细胞，并且，其中在IgG-介导的T细胞表位送递之后，CD11b+单核细胞在引发调控反应方面比树突细胞更有效。
25.如段落1，2，3或4的方法，其中，所述在体内用Ig主链内的肽加载APC，导致了Th2免疫的诱导。
26.如段落1，2，3或4的方法，其中，所述在体内用Ig主链内送递的肽加载APC导致了Th3和Tr1免疫的诱导。
27.如段落1的方法，其中，所述T细胞反应是通过选自下组的一种成分共刺激而增强的：抗CD40mAb，重组IL-12或合成的dsRNA。
28.如段落1，2，3或4的方法，其中，IL-2，IFN-γ和IL-4以剂量依赖性方式下调，而IL-10和TGF-β以剂量依赖性方式上调。
29.如段落1，2，3或4的方法，其中，所述肽表位是recNP，并且能诱导NP-特异性I类MHC-限制的T细胞免疫，该免疫由产生IL-4的Tc2细胞组成。
30.如段落1的方法，还包括使用RNA基序，以便产生修饰过的免疫反应。
31.如段落30的方法，其中，所述RNA基序是dsRNA。
32.如段落27的方法，其中，所述IgG1和IgG2a抗体反应得到了加强，并且与增强了的Th1和Th2反应相关。
33.如段落2，27或30的方法，其中，所述dsRNA选自下组：pA：pU，pI：pC和pC：pG。
34.如段落27或30的方法，其中，所述dsRNA是pA：pU并且能诱导I类MHC-限制的Tc1细胞，以便产生IFN-γ。
35.如段落33或34的方法，其中，所述dsRNA为10-50Kd。
36.如段落2或30的方法，其中，所述RNA基序是选自下组的ssRNA：p(A)，p(C)，p(G)，p(I)和p(U)。
37.如段落1的方法，其中，所述肽-表位是NP，并且还包括共同施用dsRNA基序，以便导致IL-2和IFN-γ的有效诱导。
38.如段落1的方法，其中，所述APC是离体加载的，导致了I类MHC-肽复合物的形成和Tc反应的产生。
39.如段落38的方法，其中，所述APC是通过过继转移给所述患者施用的。
40.如段落38的方法，其中，所述I类MHC-肽复合物的形成导致了产生IL-4而不是IFN-γ的Tc2细胞的分化。
41.如段落38的方法，还包括施用RNA基序的步骤，以便导致所述T细胞谱的拓宽，使其包括产生IFN-γ的Tc1细胞。
42.一种对患者进行免疫的方法，包括通过使用与Ig主链或其部分连接的抗原的至少一个肽表位加载抗原呈递细胞，以便形成Ig-肽分子，并且在体内给所述患者施用与dsRNA基序组合的Ig-肽分子，其中，通过所述MHC I途径有效加工并且呈递所述表位，导致了I类MHC分子的有效加载，并且，在体内接触所述抗原之后，产生了MHC I类-限制的T细胞的有效的二次扩增。
43.如段落42的方法，其中，所述抗原是病毒。
44.如段落43的方法，其中，所述病毒是流感病毒。
45.如段落42的方法，其中，所述肽-表位是recIgG-NP(Kd)。
46.如段落42的方法，其中，所述dsNA是pA：pU。
47.如段落42的方法，其中，所述T细胞是细胞毒性T淋巴细胞。
48.如段落42的方法，其中，在体内接触所述抗原之后所述I类MHC-限制的T细胞的二次扩增大于仅仅施用存在于无菌盐水中的重组抗原。
49.一种在临床诊断之后控制并且治疗肿瘤的方法，包括通过使用与IgG主链或其部分连接的至少一个肿瘤相关的T细胞表位加载抗原呈递细胞，以便形成IgG-肽分子，并且在体内与dsRNA组合施用所述Ig-肽分子。
50.如段落49的方法，其中，通过MHC I途径有效加工并且呈递所述肿瘤相关的T细胞表位，导致I类MHC分子有效加载在抗原呈递细胞上，以便产生I类MHC-肽复合物。
51.如段落49的方法，其中，所述方法导致了针对所述肿瘤相关的T细胞表位的免疫反应和肿瘤排斥。
52.如段落49，50或51的方法，其中，所述dsRNA是pA：pU。
53.如段落49的方法，其中，所述Ig-G肽复合物和dsRNA是作为抗肿瘤治疗重复施用的。
54.如段落49的方法，其中，在肿瘤排斥时，产生了对所述肿瘤相关表位的Te1免疫。
55.如段落49的方法，其中，在施用IgG-肽和dsRNA时，产生了针对所述肿瘤相关表位的Tc2免疫。
56.如段落49的方法，其中，所述方法还包括对相同肿瘤相关表位的有效的记忆反应。
57.如段落49的方法，其中，所述方法导致了对肿瘤细胞变体的连续的免疫。
58.如段落49，50，51，52，53，54，55，56，或57的方法，其中，所述肿瘤相关的T细胞表位选自下组：黑素瘤-gp100，MART-1，TRP-2，癌胚抗原前体XP 064845/NCB1，Her-2，前列腺肿瘤抗原，和MUC 1。
59.能够与APC的FcγR结合的重组人Ig分子或其部分，包括邻近CH2区的CH3区，以便铰链区将抗原连接于所述CH2区，其中，所述抗原具有连接于所述铰链区的寡-甘氨酸接头。
60.如段落59的重组人Ig分子，其中，所述抗原具有由其延伸出来的侧翼序列，随后是前导序列。
61.如段落59的重组人Ig分子，其中，所述人Ig分子是IgG分子。
62.如段落59的重组人Ig分子，其中，所述抗原是病毒或肿瘤抗原。
63.如段落59的重组人Ig分子，其中，所述CH3区的氨基酸序列为：GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK及其保守性修饰变体[Seq.I.D.No.1]。
64.如段落59的重组人Ig分子，其中，所述CH2区的氨基酸序列为：APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVFNKALPAPIEKTISKAK及其保守性修饰变体[Seq.I.D.No.2]。
65.如段落59的重组人Ig分子，其中，所述铰链区的氨基酸序列为：EPKSCDKTHTCPPCP及其保守性修饰变体[Seq.I.D.No.3]。
66.如段落53的重组人Ig分子，其中，所述侧翼序列的氨基酸序列为：QVQLQ及其保守性修饰变体[Seq.I.D.No.4]。
67.一种增强对抗原的免疫反应的组合物，其中，所述组合物是多核苷酸，其中，所述多核苷酸是由选自下组的化合物构成的：腺嘌呤，尿嘧啶，鸟嘌呤，胞嘧啶和肌苷。
68.如段落67的组合物，其中，所述多核苷酸是dsRNA。
69.如段落68的组合物，其中，所述dsRNA选自下组：pA：pU和pI：pC。
70.如段落69的组合物，其中，所述dsRNA是pA：pU，并且，其中所述腺嘌呤和尿嘧啶中某一些偶然被沿所述多核苷酸链的鸟嘌呤，胞嘧啶或肌苷所取代。
71.如段落69的组合物，其中，所述抗原是病毒。
72.如段落69的组合物，其中，所述抗原连接于免疫球蛋白或其部分，并且体内施用。
73.如段落72的组合物，其中，所述抗原是蛋白或肽。
74.如段落67，68，69或70的组合物，其中，所述抗原是肿瘤相关表位。
75.如段落74的组合物，其中，所述抗原是T细胞表位。
76.如段落67，68，69或70的组合物，其中，所述dsRNA是与所述抗原一起施用的。
77.如段落67的组合物，其中，所述多核苷酸是dsRNA，并且是与所述抗原一起施用的。
78.如段落67的组合物，其中，所述抗原业已存在于体内。
79.如段落67的组合物，其中，所述抗原是在可以药用的载体中施用的。
80.dsRNA在制备用于增强患者对抗原的免疫反应中的用途，包括与所述抗原组合给患者施用所述dsRNA。
81.如段落80的用途，其中，通过免疫球蛋白或其部分将所述抗原的表位送递到所述患者体内。
82.如段落80或81的用途，其中，所述dsRNA由pA：pU组成。
83.如段落80或81的用途，其中，所述dsRNA由pI：pC组成。
84.如段落81的用途，其中，所述dsRNA包括选自下组的碱基：腺嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶，鸟嘌呤和肌苷。
85.如段落81，82或83的用途，其中，所述用途能增强对抗原的Th1和/或Tc1反应。
86.如段落81，82或83的用途，其中，所述用途能诱导对抗原的Tc1细胞反应。
87.如段落81，82或83的用途，其中，所述免疫反应包括增强了的B细胞反应。
88.如段落81，82或83的用途，其中，所述抗原是与其他抗原一起施用的。
89.如段落81，82或83的用途，其中，所述用途诱导了CXC和CC趋化因子的表达。
90.如段落81，82或83的用途，其中，所述dsRNA的施用通过募集和激活CD11b+单核细胞而增强了T或B细胞反应或同时增强了T和B细胞反应。
91.如段落81，82或83的用途，其中，所述dsRNA的施用通过树突细胞的募集和激活增强了T或B细胞反应或同时增强了T和B细胞反应。
92.如段落81，82或83的用途，其中，所述dsRNA组合物通过募集抗原呈递细胞增强了免疫反应。
93.如段落92的用途，其中，所述抗原呈递细胞是专门的抗原呈递细胞。
94.如段落92的用途，其中，所述抗原呈递细胞是幼稚的(naive)抗原呈递细胞。
95.如段落81，82或83的用途，其中，所述抗原是非感染性抗原，并且，其中，所述MHC I类限制的T细胞是通过dsRNA交叉激发的。
96.如段落81，82或83的用途，其中，所述组合物和抗原是通过选自下组的方法之一施用的：粘膜施用，呼吸道施用，静脉内施用，皮下施用，和肌内施用。
97.如段落81的用途，其中，所述抗原是在免疫球蛋白或其部分或在免疫球蛋白主链中施用的。
98.如段落97的用途，其中，所述抗原是肽表位。
99.一种在患者中预防对抗原的高区耐受的方法，包括与dsRNA组合物一起施用所述抗原，其中，所述dsRNA组合物包括选自下组的至少一种化合物：聚-腺嘌呤，聚-尿嘧啶，聚-鸟嘌呤，聚-胞嘧啶，聚-肌苷。
100.如段落99的方法，其中，所述抗原是非感染性的。
101.如段落99的方法，其中，所述抗原是以高剂量施用的或者已经存在于体内。
102.如段落99，100或101的方法，其中，所述dsRNA选自下组：pA：pU和pI：pC。
103.如段落99，100，101或102的方法，其中，所述方法能预防B细胞无反应性。
104.一种增强接触病原体的患者的免疫系统的方法，包括给所述患者施用dsRNA。
105.如段落104的方法，其中，所述dsRNA选自下组：pA：pU和pI：pC。
106.如段落104或105的方法，其中，所述dsRNA是以100μg/ml-1mg/ml的浓度给患者施用的。
107.如段落104，105或106的方法，其中，所述病原体是未知的。
108.如段落104，105，106或107的方法，其中，所述dsRNA是在可以药用的载体中施用的。
109.如段落104的方法，其中，增强了对所述病原体的T细胞反应。
110.一种增强有需要的患者体内的免疫反应的方法，包括通过使用连接于Ig主链的抗原的至少一个肽表位加载抗原呈递细胞，以便形成Ig-肽复合物或分子，并且与dsRNA基序组合体内施用Ig-肽复合物或分子，其中，通过所述抗原呈递细胞的MHC途径对所述表位进行有效加工和呈递，导致了MHC分子的有效加载，并且在体内接触所述抗原之后产生了MHC分子的有效的二次扩增。
111.如段落110的方法，其中，所述MHC途径是MHC I途径。
112.如段落110的方法，其中，所述MHC途径是MHC II途径。
113.如段落111的方法，其中，所述方法导致了I类MHC分子有效加载在所述抗原呈递细胞上。
114.如段落112的方法，其中，所述方法导致了II类MHC分子有效加载在所述抗原呈递细胞上。
115.如段落110，111或112的方法，其中，所述dsRNA是pA：pU。
116.如段落110，111或113的方法，其中，所述方法导致了I类MHC限制的T细胞的二次扩增。
117.如段落115的方法，其中，所述抗原是病毒。
118.如段落117的方法，其中，所述病毒是流感病毒。
119.如段落115的方法，其中，所述抗原是肿瘤相关表位。
120.如段落115的方法，其中，所述T细胞是细胞毒性T淋巴细胞。
121.一种在患者体内产生针对抗原的免疫反应的方法：
给所述患者施用免疫球蛋白或其部分，其中，所述免疫球蛋白具有连接于所述免疫球蛋白或其部分的所述抗原的至少一个肽表位，并且与dsRNA片段组合施用所述免疫球蛋白或其部分。
122.如段落121的方法，其中，所述免疫球蛋白或其部分以及所述RNA片段是同时施用的。
123.如段落121的方法，其中，所述免疫球蛋白或其部分以及所述RNA片段是分开施用的。
124.如段落121的方法，其中，所述患者是人。
125.如段落121的方法，其中，在给所述患者施用所述免疫球蛋白或其部分时，所述免疫球蛋白或其部分通过占据所述抗原呈递细胞的FcγR而加载所述抗原呈递细胞，通过所述抗原呈递细胞的MHC I途径有效加工并且呈递所述肽表位，导致了所述MHC I类分子的有效加载。
126.如段落121的方法，其中，所述肽表位连接于所述免疫球蛋白或其部分的CDR区内。
127.如段落121的方法，其中，所述免疫反应产生了针对所述抗原的有效的T细胞反应。
128.如段落121的方法，其中，所述T细胞是细胞毒性T淋巴细胞。
129.如段落121的方法，其中，所述dsRNA片段选自下组：pA：pU和pI：pC。
130.如段落121的方法，其中，所述肽表位是T细胞表位。
131.如段落121的方法，其中，所述肽表位选自下组：流感病毒M1或M2；丙型肝炎病毒NS3；乙型肝炎病毒核心抗原；人乳头瘤病毒HPV 18-E7，HPV 16-E7，HPV 18 E6，HPV 16 E6；黑素瘤-gp 100；MART-1；TRP-2；癌胚抗原前体；Her-2；破伤风毒素通用T辅助表位；HIV-1：逆转录酶；HIV1：gag；胰岛素前体-人；人Gad 65；前列腺肿瘤抗原；粘蛋白1；单纯疱疹病毒抗原；和，呼吸道合胞病毒抗原。
132.如段落121的方法，其中，所述免疫球蛋白或部分及其dsRNA片段是通过选自下组的方法之一施用的：静脉内施用和弹丸注射。
133.如段落121的方法，其中，所述免疫球蛋白或其部分和所述dsRNA是在可以药用的载体中施用的。
134.如段落121的方法，其中，所述方法能诱导对所述肽表位的有效的记忆反应。
附图简述：
图1A表示(a)天然IgG的示意图(轻链-重链异二聚体)；(B)抗原(Ag)衍生的肽，被插入CDR(互补决定区)3，2，1或构架区内；(C)用抗原或片段取代的VH(重链，可变区)片段；(D)用抗原或抗原片段取代过的VH和CH1片段；
图1B示意性地表示IgG-肽和Fc肽；
图1C表示选定的人IgG主链的特性；
图1D表示重链恒定区的序列以及相应的构建体的示意图；
图1E-1M表示在本发明中披露的各种抗原和表位的序列，并且，可将其插入免疫球蛋白内[序列可以从互联网上获得，网址为ncbi.nlm.nih.gov(加上正确的地址前缀：http：//www.)，通过使用所提供的获取号检索“蛋白”部分。该数据库的内容被以它的整体形式收作本文参考]；
图2A-2B表示尽管注射存在于盐水中的肽表位不是免疫原性的，将类似剂量的肽用于离体加载APC，在过继转移时有效诱导了显著免疫反应；
图3表示在Ig主链内送递表位，显著有利于它在系统循环中的稳定性；
图4A-4B表示用血清预温育肽，导致了减弱了的TcH激活；
图5A-5B表示MHC-肽复合物形成的相对效率在很大程度上根据抗原和APC的性质而改变；
图6A-6B表示与单独的肽相比，IgG主链内的肽表位在通过血液来源的APC控制诱导TcH激活时在摩尔基础上(一个数量级)更为有效；
图7A-7B表示水包油佐剂(不完全弗氏佐剂，IFA)的使用仅仅适度地增强MHC-肽复合物在淋巴结而不是脾或胸腺的APC上的体内形成；
图8A-8D表示利用FcγR介导的肽送递，导致了免疫原性MHC II-肽复合物在CD 1c+和CD11b+APC上的优先形成；
图9A-9C表示肽在DC(树突细胞)和单核细胞上的内源MHC II上的长期持续表达；
图10表示在IgG介导的肽表位送递之后，MHC II-肽复合物在树突细胞和单核细胞上的形成关键取决于包括γ链的ITAM+FcγR；
图11表示的结果证实ITAM+FcγR同种型的γ链的表达是诱导对用IgG主链内的肽加载的APC的T细胞反应所必需的；
图12A-12D表示出人预料的并且与效力/细胞基础(实施例8)相反，在生物体水平上，CD 11b+单核细胞对在IgG主链内送递的肽表位的免疫反应具有最大的影响；
图13A-13B表示FcγR-介导的重组Ig主链内的T细胞表位的送递，导致了Th2而不是Th1反应；
图14表示FcγR-介导的重组Ig主链内的T细胞表位的送递，导致了Th2而不是Th1反应；
图15表示IgG主链内的肽表位引发了Th2谱的细胞反应，该反应是通过常规佐剂(CFA)增强而不是转换的；
图16表示在通过用重组IgG作为送递平台用抗原加载之后通过APC完成的肽呈递，是以限制的共刺激形式进行的；
图17A-17B表示通过施用recHA(I-Ed)-IgG引发的HA(110-120血凝素肽)特异性IL-4生产T细胞的活性取决于CD4而不是CD8；
图18表示IgG介导的T细胞表位的送递对所述扩增和通过激活的T细胞的细胞因子生产具有显著的和不同的影响：IL-2，IFN-γ以及令人吃惊的是IL-4以剂量相关方式下调；
图19A-19B表示与用具有同源肽的流感病毒菌株进行病毒免疫不同，Ig-介导的肽送递在引发细胞毒性反应方面是无效的；
图20A-20D表示通过利用重组IgG共同施用MBP和PLP表位，抑制了疾病的慢性进展；
图21归纳了IgG/FcγR-介导的表位送递对所述T细胞反应的影响，基于实施例2-20中提供的数据；
图22表示在流感病毒感染期间产生的天然的非感染性双链RNA对针对蛋白抗原的特异性免疫反应具有显著影响；
图23A表示合成的RNA基序的广泛的文库；
图23B-23D表示不同的合成的RNAs对针对原型蛋白抗原的B和T细胞反应具有增强作用；
图24A-24B表示选定的RNA基序对先天免疫反应的影响；
图25表示与抗原呈递细胞上的不同受体结合的不同的RNA基序；
图26表示能诱导趋化因子不同的上调的不同的RNA基序；
图27表示流感病毒复制的控制可以通过使用选定的合成的RNA基序实现；
图28表示选定的合成的RNA基序pI：pC和pA：pU能大大抑制高区耐受，这种耐受性通常与施用大量纯化蛋白相关；
图29表示选定的合成的RNA基序能影响人单核细胞；
图30A-30B表示未标记过的pA：pU，而不是未标记过的pI：pC能与标记过的pA：pU竞争结合人THP-1单核细胞；
图31表示dsRNA的纯化和分级分离步骤；
图32表示选定的合成RNA化合物的较低分子量级份赋予了不同的生物学活性；
图33表示pI：pC，而不是pA：pU诱导的对它自身的抗体反应，具有抗另一种RNA基序的交叉反应成分；
图34A-34B表示共同使用选定的合成RNAs在IgG介导的I类MHC-限制的表位送递之后，能促进IL-2和IFN-γ的有效诱导；
图35表示与使用游离的肽本身相比，通过重组IgG离体进行APC加载，在I类MHC-肽复合物的形成和Tc反应的产生方面更有效；
图36表示在共同施用选定的合成RNA时，IgG介导的I类限制的表位的送递在激发I类限制的Tc1反应方面最有效；
图37表示抗病毒细胞毒性T细胞的有效激发需要用通过IgG送递的I类限制的表位有效地体内加载APC，同时通过选定的合成RNA基序适当地指导；
图38表示用具有病毒I类限制的表位的重组IgG以及选定的合成dsRNA免疫，导致了免疫反应的启动，所述免疫反应能够在感染侵袭之后限制病毒复制；
图39表示用于测试基于Ig-肽的分子的效率的肿瘤模型；
图40表示用肿瘤相关抗原有效地体内加载APC，以及通过选定的合成RNA基序同时激活是必需的，并且足以有效控制肿瘤生长和诱导肿瘤排斥；
图41表示用肿瘤相关的抗原有效地体内加载APC，以及通过选定的合成RNA同时激活，可引发针对肿瘤相关抗原的有效的免疫反应；
图42表示展示T细胞受体标记TCRβ的肿瘤浸润性淋巴细胞在用具有肿瘤相关表位的重组免疫球蛋白和特定合成的dsRNA基序处理时，获得了激活标记CD25的表达；
图43表示处理过的小鼠成功地排斥了所述肿瘤产生的针对治疗性Ig上的肿瘤相关表位的Tc1反应，以及Tc2免疫；
图44表示通过所指出的治疗诱导的成功的肿瘤排斥后产生了抗相同肿瘤的随后侵袭的有效预防作用，表明了有效的免疫记忆的形成；和，
图45A-45B表示在指出的治疗之后出现的免疫，它导致了肿瘤排斥，预防了抗原变体消失的侵袭，并且与细胞因子生产细胞的总体扩增相关。
发明详述
定义：
下面的定义是用于起着指导作用的，而不被考虑为限制在本说明书中使用的术语：
佐剂-能加强免疫反应对抗原的适应性的物质；
过继转移-将一种细胞群从一个动物转移到具有相同单倍型的另一个动物体内；
抗原-可以由免疫系统的适应成分(B细胞，T细胞或这两者)特异性识别的分子；
抗原呈递细胞-具有非常有效的免疫刺激能力的白细胞的异源群体；
BALB/C小鼠-广泛分布的，并且是最常使用的自交小鼠株之一；
B细胞-在骨髓中形成的一类淋巴细胞。每一个B细胞编码对特定抗原特异的表面受体。在识别特殊抗原时，B细胞扩增并且产生大量抗体，这些抗体然后与激活了所述B细胞的抗原结合；
B细胞无反应性-B细胞对反应的抗原特异性缺乏；
CDR-互补决定区；免疫球蛋白上的超变区，它能产生抗原结合位点。存在三种CDR区：CDR1，CDR2和CDR3；
趋化因子-一组至少25种小的细胞因子，它们与肝素结合；
完全弗氏佐剂-含有分支杆菌细胞壁成分的水包油乳液；
交叉激发-从受感染的组织获得了抗原并随后将抗原呈递给相关T细胞的抗原呈递细胞；
树突细胞-抗原呈递细胞的一个亚型(即CD11c+)；
下调-减弱特定化合物的表达或活性或作用；
表位-抗原的一部分，它与抗体的抗原结合位点或T细胞受体接触；
Fcγ-细胞表面上的Ig受体，其中存在三种识别类型：FcγRI(CD64)，FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)；
异二聚体-由两种不同蛋白序列组成的二聚体蛋白；
高区耐受-对特定抗原特异的无反应性状态，它是在用高浓度的所述抗原侵袭时诱导的；
IL-2-表示白介素-2；
IL-4-表示白介素-4；
免疫球蛋白-存在于所有动物的血清和组织液中的一组糖蛋白，并且位于B细胞表面上，并且作为血液或淋巴中的游离抗体。存在五种类型的免疫球蛋白：IgG(70-75％)，IgM(10％)，IgA(15-20％)，IgD(＞1％)和IgE(存在于所有个体的嗜碱性细胞和肥大细胞上)。IgG具有四种人类亚型(IgGI，IgG2，IgG3和IgG4)；
免疫球蛋白主链-表示免疫球蛋白分子或其部分，其中，至少一个CDR区能够接受插入的肽表位；
免疫球蛋白同种型转变-刺激B细胞从一种免疫球蛋白同种型转变到另一种同种型的产生；
不完全弗氏佐剂-不含分支杆菌细胞壁成分的水包油乳液；
先天免疫-先天免疫系统提供了宽的相对非特异性的宿主防御，它缺乏抗原特异性，但是具有指导获得性免疫的能力。这些细胞类型中包括树突细胞和巨噬细胞；
腹膜内-在腹膜腔内；
静脉内-在血管系统内；
同种型-蛋白的不同的糖基化，磷酸化，脱酰胺和其他翻译后修饰；
ITAM-基于免疫受体酪氨酸的激活基序；
ITIM-基于免疫受体酪氨酸的抑制基序；
巨噬细胞-源于骨髓中的单核干细胞的任何单核的，活跃的吞噬细胞；
MHC-表示主要组织相容性复合物；
修饰过的免疫反应-增强或减弱了的免疫反应；
单核细胞-存在于淋巴结，脾，骨髓和疏松的结缔组织中的单核白细胞；
幼稚的-未分化的，未激活的细胞；
肽-由通过肽键结合在一起的两个或两个以上氨基酸组成的化合物；
多核苷酸-核苷酸的聚合物；
专门的抗原呈递细胞-成熟的，能够呈递抗原表位；
募集-将细胞群吸引到炎症部位；
二次扩增-在二次或随后遇到特定抗原之后的免疫反应；
自体抗原-源于宿主的抗原；
皮下-在皮肤下面；
Tc1免疫-1型细胞毒性T细胞，CD8+；
Th1细胞-T辅助1细胞，它参与细胞介导的炎症反应，通过IFNγ，TNFβ和IL-2的产生鉴别；
Th2细胞-T辅助2细胞，它能促进抗体产生，并且是通过IL-4和IL-5的产生鉴别的；
Th3细胞-T辅助调节细胞，已知能产生转化生长因子(TGF)-β；
TR1细胞-T调节细胞，已知能产生白介素10；和，
上调-增强特定化合物的表达或活性或作用；
材料和方法
为了选择性地在体内加载抗原呈递细胞亚型，使用了在图1A中示意性地示出的化合物：(A)天然IgG(轻链-重链异二聚体)的示意图；(B)插入CDR 3，2，1或构架区的抗原(Ag)衍生的肽；(C)用抗原或片段取代过的VH片段；和，(D)用抗原或抗原片段取代过的VH和CH1片段。这种类型的分子是使用本领域公知的方法通过工程方法生产的，并且如下文所述：
模型重组IgG的构建
通过聚合酶链反应(PCR)诱变，用所提到的表位取代VH链的CDR3区。简单地讲，将具有携带鼠抗-胂酸盐抗体91A3的VH基因的5.5-kbEcoRI片段的pUC19质粒用作模板，通过两次PCRs，去除互补决定区3′(CDR3)环的多样性片段(D)，并且插入编码各种抗原表位的DNA片段。然后将这些嵌合的VH和野生型VH基因与质粒pSV2ΔgptDNSVH-hCγ1内的Igγ1重链恒定区连接，从它上面切除了EcoRI丹酰(dns)-缀合的VH基因。通过DNA测序证实VH和插入的表位的序列。为了表达这些具有鼠91A3 VH-人.Cγ1重链基因和小鼠-人嵌合的k轻链基因的嵌合IgGs，将编码完整的鼠91A3κ轻链基因的8-kbBamHI片段亚克隆到pUC19质粒的BamHI位点中。然后，从该质粒上切除具有κ轻链启动子和Vκ区编码序列的HindIII片段，并且亚克隆到pSV184ΔHneoDNSVk-hCk的HindIII位点中，该位点位于编码人k轻链C区(Ck)的基因的上游，从它上面切除了dns-缀合的Vk(dnsVk)。该质粒能编码鼠91A3Vk-人Ck轻链，它被命名为pSV184Δhneo91A3Vk-hCk。
人重组IgG的构建
人IgG主链是通过RT-PCR从IgGA1骨髓瘤细胞系中获得的。重组人IgG是通过插入指出的表位，以便取代人IgG1主链的CDR2或CDR3区克隆的。简单地讲，通过PCR诱变制备T细胞表位，并且亚克隆到CDR2/CDR3区。然后通过BamHI和XbaI位点将所述重组重链亚克隆到pMG载体(Invivogen，San Diego，CA)中。通过hCMV启动子控制所述重链表达。同时，通过StuI和NheI位点将人κ轻链亚克隆到pMG载体中。通过EF-1α和HTLV-1 LTR杂合启动子控制所述轻链表达。然后将携带所述重组重链和轻链的双重表达载体转染到表达细胞系中。
通过切除VH和CH1片段，并且用指出的病毒或肿瘤抗原(8-150Aas)取代而构建Fc-肽。简单地讲，通过EcoRI和XhoI位点将人IgG1重链亚克隆到pCDNA3载体中。然后，通过PCR诱变将指出的抗原插入IgG1的前导序列和铰链区之间。为了提高所述融合抗原的柔性，将寡-甘氨酸接头(5个甘氨酸)添加在所述抗原后面。可以通过采用在图1B中示出的方法之一完成人IgG重组分子的表达。
业已根据与FcγR的结合能力、补体和在各种状态下的细胞因子激活，合理地选择了人IgG主链。在图1C中示出了选定的人IgG主链的特性，并且在图1D中示出了所述重链恒定区的序列，以及相应的构建体的示意图。
在图1E中示出了用于模型重组IgG的表位(小鼠II类MHC-限制的HA表位和小鼠I类MHC限制的NP表位)。重组构建体的命名是recIgG-表位(HA或NP)-限制因子(分别为I-Ed或Kd)。简单地讲，可将其称作IgHA或IgNP。类似地构建了包括特定小鼠自身表位(源于MBP或PLP)的模型分子。在图1E中业已示出了用作主链的抗胂酸盐抗体的重链可变区的序列，并且该方法为本发明所熟知(Zaghouani等，Science 1993 Jan 8；259(5092)：224-7)，该文献的内容被收作本文参考。
在图1E-1M中，提供了抗原和表位(粗体)的例子，它可以插入(跨越一个或多个表位的最多达150AA的较大部分)或连接于所述主链。包括所示出的抗原/表位的所述构建体可以用作抗传感性或肿瘤疾病的药物。在图11中，示出了HLA-A2锚定基序，它允许预测任何蛋白中的潜在治疗性细胞毒性表位的位置，有利于被用于重组免疫球蛋白中的抗原片段的选择。
在图1J中，提供了“通用”T辅助表位的例子(Kumar等J Immunol1992 Mar1；148(5)：1499-505)，从MHC限制的角度看，它是优势的和混杂的，可将它用于构建复合分子，以便诱导或增强对I类MHC-限制的表位的免疫，使用以下化合物：
[抗原片段]-[通用Th表位]-Fc(IgG)。
在图1K中(底部)示意性地示出了所述构建体的例子。
在图1K的顶部，示出了具有用粗体表示的表位的人自身抗原的例子，可将它用于制备抗自身免疫/炎性病症的重组IgG分子。
在图1L和1M中，示出了可用于构建上述免疫球蛋白构建体的其他抗原序列。可以通过使用预测I类MHC表位的方法确定感兴趣的抗原片段(Lim等，Mol Immunol.1996 Feb；33[2]：221-30)。
重组IgG的生产
将SP2/0细胞系(美国典型培养物保藏中心)用于生产本专利申请所提到的所有重组IgGs(rIgG)。使用双转染方法，用编码抗-胂酸盐小鼠IgG的重链和轻链的质粒生产了稳定表达的细胞系(即转染瘤)。每一个转染瘤仅仅在重链的CDR3区的序列上有所不同。用于生长所述细胞系的方法，以及生产用于本申请所提到的实验中的不同的纯化rIgG的方法在所有场合下都相同。
SP2/0转染瘤首先在补充了5％(v/v)热灭活的胎牛血清，0.5mg/mM庆大霉素和2.5μg/mL Fugizone的Quantum Yield培养基(BDBiosciences)中生长。在37℃下，潮湿的CO2培养箱中维持培养物。进行努力，以便使每一种细胞系适应在不同的商购无血清培养基中生长(Lymphocyte Growth Media 2，Clonetics；Cell MAb Growth MediaSerum Free，BD Biosciences；Animal Component Free Cell Media，BD Biosciences)。每一种无血清培养基按上述方法补充了抗体。含有分泌型IgG的培养基是用上面所提到的每一种培养基所生产的。在这项研究过程中，在不同培养基中生产的IgGs中没有发现差别(通过SDS PAGE进行分子量分析[参见下文]，ELISPOT测定，以及在小鼠体内的免疫反应)。
使用ELISA对分泌型rIgG的量进行定量：捕获抗体是山羊抗小鼠IgG(Sigma)，而二级抗体是抗小鼠IgG HRP缀合物(Sigma)。将纯化的小鼠IgG(Sigma)用作标准。
业已将四种不同的方法用于生产含有不同rIgGs的培养基(即条件培养基，“CM”)：烧瓶，搅拌容器，填充床生物反应器(New BrunswickCellagen)，CELLine烧瓶(BD Biosciences)。对于在烧瓶中生产的CM来说，每周饲养和/或收获所述细胞两次，并且保持至少50％的存活力，不过，存活力通常大于70％。对收集的培养基进行过滤，并且保持在4℃。以106细胞/mL的密度用200mL的起始体积接种搅拌容器(1L)。每周添加培养基，以便将细胞数量保持在107-106/mL之间，直到达到800mL的总体积。此时，测定细胞存活力(通常超过80％)，并且将这一过程持续到存活力降低到50％以下。然后收集培养基，并且进行消毒过滤，以便除去细胞，并且保持在4℃下。对于填充床生物反应器来说：每一个单位用存在于400mL培养基中的大约108个细胞接种；在37℃的CO2培养箱中维持，进行恒定搅拌；每隔3-4天更换培养基并且按上述方法对CM进行过滤；通过ELISA监测CM中的rIgGs的产生。继续进行生物反应器处理，直到rIgGs的产生开始下降，或者容器被污染。按照生产商的说明使用1L CELLine烧瓶：每个烧瓶用存在于细胞腔室中的40mL总体积中的107-108个细胞接种；将1L培养基添加到饲养腔室中；在2-3周之后，或者当细胞的存活力降低到20％以下时从所述细胞腔室中收获CM。
rIgG的纯化
通过两种方法中的一种纯化通过上述方法生产的rIgGs。对于含有FBS的CM来说，使用抗小鼠IgG免疫亲和树脂。免疫亲和树脂是用以下方法合成的：按照生产商的说明用1mM HCl洗涤10mL的溴化氰-激活的Sepharose 4B(Sigma)；将10-20mg的山羊抗小鼠IgG(Sigma)以2mg/mL的浓度溶解在偶联缓冲液(0.1M碳酸钠[pH8.4]/0.5MNaCl)中；将所述IgG溶液添加到洗涤过的树脂上，并且在室温下对浆液进行颠倒混合；通过Bradford测定方法确定剩余可溶性IgG的量，以监测偶联程度；当可溶性IgG的量低于起始浓度的10％(大约45分钟)时，以10mM的最终浓度添加乙醇胺淬灭所述偶联。然后用以下缓冲液洗涤所述免疫亲和树脂：PBS，10mM甘氨酸(pH2.4)，20mM Tris/1MNaCl(pH8.0)，PBS。所述树脂在4℃下在PBS中保存。用该树脂纯化rIgG的方法是通过让CM以1-2mL/分钟的速度从柱中通过开始的。然后用以下方法洗掉所述树脂上未结合的蛋白：100mL PBS/0.5M NaCl，然后用50mL 1mM Tris(pH8)。通过Bradford测定方法监测级份中的蛋白。用低pH缓冲液(5mM甘氨酸(pH2.4)/0.5M NaCl)洗脱特异性结合的rIgG。收集洗脱的蛋白，并且在4℃下保持，以便进一步处理(参见下文)。
通过蛋白亲和层析纯化在无血清培养基中生产的rIgG。通常，用PBS平衡5mL rProtein A柱(HiTrap rProtein AFF，购自AmershamPharmacia Biotech)，并且使用FPLC单位(Pharmacia)，让样品以2mL/分钟的速度从所述柱中通过。洗掉所述树脂上非特异性结合的蛋白，洗涤中使用PBS，然后用20mM Tris(pH8.0)/1M NaCl，然后使用水。用1mM甘氨酸(pH2.4)洗脱特异性结合的rIgG。收集洗脱峰，并且保持在4℃下以便进一步处理。
一般，合并rIgG级份，并且用Centricon超滤单位(Amicon)浓缩到1-4mg/mL的最终浓度(Bradford测定，用IgG作标准)。然后将浓缩的级份透析到1mM甘氨酸(pH2.4)中，通过A280测定最终浓度，对于1mg/mL IgG溶液来说，使用1.4的消光系数，并且等分成100μl的级份，将其保存在-80℃的冰箱中。通过SDS凝胶电泳分析纯化的rIgGs的结构完整性和纯度。用考马斯蓝(PierceChemical)对所述凝胶进行染色。在所有场合下，用于报导的实验中的rIgGs与蛋白标准物和对照IgG相比都表现出它们的预期的分子量(减少或未减少)。一般，与在相同凝胶上电泳的已知量的IgG的带相比，通过对染色带进行肉眼检查，确定纯化的rIgG的纯度超过95％。
RNA片段
可以按照以下方法制备本发明的双链RNA(dsRNA)或单链RNA(ssRNA)片段(并且可以通过商业渠道获得)：1)ssRNA：所述多核苷酸(polyA，polyU)是通过酶促方法制备的，使用核苷酸和多核苷酸磷酸化酶，没有动物来源的材料进入该制备过程。2)dsRNA：使聚腺苷酸(polyA或pA)与聚尿苷酸(polyU或pU)退火。
一般，本发明的dsRNA和ssRNA是均聚物，对于dsRNA来说，单一的碱基或核苷酸(例如，腺嘌呤)一致地形成了一条链，而其互补序列一致地形成另一条链。对于ssRNA来说，所述单链是由相同的核苷酸一致地组成。不过，使用由混合的核苷酸组成的dsRNA或ssRNA组合物属于本发明的范围(对于dsRNA来说，有或没有它们的互补序列)。例如，polyA：polyU dsRNA片段具有非互补核苷酸(例如，鸟嘌呤，胞嘧啶或肌苷)的偶然取代。本发明的dsRNA和ssRNA组合物由碱基/核苷酸：腺嘌呤(A)，鸟嘌呤(G)，胞嘧啶(C)，尿嘧啶(U)和肌苷(I)组成，并且还可以由小百分比的DNA碱基胸腺嘧啶(T)组成。表I和图8A中的RNA组合物是用于实施例中的各种RNA组合物的典范。本发明的RNA组合物是按照例30的方法制备和纯化的。
用于本发明的各种RNA链的长度通常为100-2000个碱基对，不过，可以为1-20，20-40，40-60，60-80，80-100，1-100，100-200，200-300，300-400，400-500，500-600，600-700，800-900，1000-1100，1100-1200，1200-1300，1300-1400，1400-1500，1500-1600，1600-1700，1700-1800，1800-1900，1900-2000，2000-2100，2100-2200，2300-2400，2400-2500，2500-3000，3000-4000，4000-5000，5000-10,000个碱基对，以及超过10,000个碱基对，和/或其混合物。
实施例1表示限制包括T细胞表位的肽活性的显著因素是较差的药代动力学，导致了APC的体内加载减弱。
来自1只幼稚BALB/c小鼠的抗原呈递细胞(“APCs”)是从脾组织中获得的。在洗涤之后，在37℃下，在1ml HL-1培养基中，将三百万APC与13.5nM HA 110-120肽一起温育3小时。洗涤所述细胞，分成三等份接种物，并且注射(1/2皮下+1/2腹膜内)到3只幼稚的BALB/c小鼠体内。2周之后处死所述小鼠，并且按以下方法通过ELISPOT分析测定抗HA 110-120肽的免疫反应：ELISPOT平板(Millipore，Molsheim，France)与纯化的抗细胞因子Abs(对于抗-IL2和抗-IL4来说为4μg/ml，而对于抗-IFNγ来说为8μg/ml，购自BD Pharmingen)一起在无菌PBS(50μl/孔)中在4℃下温育过夜。次日，用DMEM培养基洗涤所述平板2次，并且用含有FBS的200μl/孔的完全DMEM，在37℃下封闭1小时。用所述脾制备单细胞悬浮液，裂解红血细胞，洗涤细胞，计数，并且5×105/孔的密度与20μg/ml HA110-120肽或仅仅与培养基一起温育，以便评估背景水平。
在37℃，5％CO2中温育平板72小时。3天之后，用PBS-tween200.05％(洗涤缓冲液)洗涤平板5次，并且用100μl/孔的生物素化的抗-细胞因子Abs，2μg/ml的PBS-tween200.05％-FBS 0.1％(ELISPOT缓冲液)在4℃下温育过夜。次日，用洗涤缓冲液洗涤所述平板5次，并且用ELISPOT缓冲液稀释的1∶1000抗生物素蛋白链菌素-HRP温育1小时。用3-氨基-9-乙基咔唑底物(Sigma，St.Luis，MO)使反应显示，并且，通过用自来水洗涤所述平板两次而终止反应。然后让平板在室温下干燥24小时。数据是使用自动化系统(Navitar，Rochester，NY)用ImagePro-Plus软件(Media Cybernetics，SilverSpring，MD)获得的。同时，3只幼稚的BALB/c小鼠均使用存在于无菌PBS中的4.5nM的HA肽注射，其中的1/2是皮下施用的，另外1/2是腹膜内施用的。2周之后处死小鼠，并且按上述方法，通过ELISPOT分析表征T细胞反应。
在图2(A)中，披露了所述实验方案。在图2(B)中，示出了所述实验的结果：这些结果是以扣除了背景水平之后的IFN-γ，IL-2和IL-4斑点形成集落/脾的数量形式表达的(平均值±SEM)。“HA-APC”相当于在过继转移之前离体加载的抗原呈递细胞(树突细胞)。“HA”相当于直接注射到动物体内的肽。
在图2A-2B中示出的结果表示尽管注射存在于盐水中的肽表位不是免疫原性的，将类似剂量的肽用于离体加载的APC，在过继转移时能有效引发显著的免疫反应。这表示如果直接注射，所述肽不会有效到达APC，而这是有效诱导免疫反应的先决条件。
实施例2表示将肽表位掺入所述IgG内，改善了它的药代动力学谱。
用60nM的SFERFEIFPKE(“HA”)[Seq.I.D.No.5]肽或2.4nM的recHA(I-Ed)-IgG(“Ig-HA”)对BALB/c Scid小鼠(3/组)进行静脉内注射，并且以不同的时间间隔采集血液。立即分离血清，并且在-70℃下快速冷冻。然后，所述血清样品与2×104细胞/孔/50μ1 HA-特异性T细胞杂交瘤(TcH)和1×104细胞/孔/50μl M12 B细胞淋巴瘤APC在无血清HL-1培养基中，在37℃的温度和5％CO2中温育24小时。次日，将所述平板离心15分钟/4℃/1500RPM，然后将上清液倒掉，用冷却的新制备的固定溶液(2％甲醛，0.2％戊二醛，存在于1×PBS中)固定所述细胞，并且对所述平板再次进行离心3分钟/4℃/1500RPM。将固定溶液从所述平板上倒掉，用PBS 200μl/孔洗涤细胞一次，对所述平板进行离心3分钟/4℃/1500RPM。将PBS从所述平板上倒掉，并且，在37℃下，用200μl/孔的按以下方法新制备的X-gal底物温育细胞过夜：将200μl的X-gal母液(40mg/ml，存在于DMSO中)溶于10ml底物缓冲液(5mM亚铁氰化钾，5mM铁氰化钾，2mM MgCl2，存在于1×PBS中)。用显微镜通过肉眼统计蓝色的激活的TcH。
TcH的激活表示为注射后时间的函数。只有在用recHA(I-Ed)-IgG注射小鼠的情况下，在血液中能检测到所述表位，时间间隔为大约1天。相反，尽管使用了很大的摩尔过量(25倍)，HA肽在外周血中检测不到。
因此，在图3中示出的结果表示送递Ig主链内的表位明显有利于它在系统循环中的稳定性。
实施例3表示在存在血清的情况下，包括T细胞表位的肽不能由APC有效呈递到特异性T细胞上，并且它是通过将所述肽表位掺入到IgG主链内而纠正的。
图4(A)表示血清对T细胞表位肽呈递的有害作用：在存在大量的SFERFEIFPKE(HA)肽的条件下，在无血清HL-1培养基(“HA+HL-1”)或补充了来自BALB/c scid小鼠的20％小鼠血清的HL-1培养基(“HA+血清”)中将M12 B细胞淋巴瘤APC与TcH一起温育。温育的细胞的数量为2×104 M12和1×104 TcH/100μl补充了或未补充血清的HL-1培养基。次日，对所述平板进行离心15分钟/4℃/1500RPM，然后将上清液倒掉，用冷却的新制备的固定溶液(2％甲醛，0.2％戊二醛，存在于1×PBS中)固定所述细胞，并且再次将所述平板离心3分钟/4℃/1500RPM。将固定溶液从所述平板上倒掉，并且用PBS 200μl/孔洗涤细胞一次，对所述平板进行离心3分钟/4℃/1500RPM。将PBS从所述平板上倒掉，并且在37℃下，用200μl/孔的按以下方法新制备的X-gal底物温育细胞过夜：将200μl的X-gal母液(40mg/ml，存在于DMSO中)溶于10ml底物缓冲液(5mM亚铁氰化钾，5mM铁氰化钾，2mM MgCl2，存在于1×PBS中)。用显微镜通过肉眼统计蓝色的激活的TcH。
血清会对免疫原性MHC-肽复合物的形成和/或呈递产生负面干扰。
图4B：血清会对免疫原性MHC-肽复合物的形成和/或呈递产生负面干扰。
首先用APC或血清，然后分别在1小时之后添加TcH和血清，或APC和TcH，通过依次温育肽(“HA肽”)或recHA(I-Ed)-IgG(“IgHA”)对这种现象作进一步研究。对照相当于在没有添加血清的条件下用抗原温育的细胞(“Ctrl”)。温育的细胞数量为2×104 M12和1×104TcH/100μl的补充和未补充血清的HL-1培养基。次日，对所述平板进行离心15分钟/4℃/1500RPM，然后将上清液倒掉，用冷却的新制备的固定溶液(2％甲醛，0.2％戊二醛，存在于1×PBS中)固定所述细胞，并且对所述平板再次进行离心3分钟/4℃/1500RPM。将固定溶液从所述平板上倒掉，用PBS 200μl/孔洗涤细胞一次，对所述平板进行离心3分钟/4℃/1500RPM。将PBS从所述平板上倒掉，并且，在37℃下，用200μl/孔的按以下方法新制备的X-gal底物温育细胞过夜：200μl的X-gal母液(40mg/ml，存在于DMSO中)溶于10ml的底物缓冲液(5mM亚铁氰化钾，5mM铁氰化钾，2mM MgCl2，存在于1×PBS中)。用显微镜通过肉眼统计蓝色的激活的TcH。
结果表示为在2μg/ml的recHA(I-Ed)-IgG(“IgHA”)或40μg/ml的HA肽(相对重组Ig过量1,000摩尔)的浓度下激活的T细胞(β-gal+TcH)/孔的百分比。
图4示出的结果表示用血清预温育肽，导致了减弱了的TcH激活。在APC脉冲之后添加血清，对TcH激活没有作用。相反，在使用具有所述肽的重组免疫球蛋白代替单独的肽时，血清没有破坏MHC-肽复合物的形成。
实施例4表示将T细胞肽表位掺入IgG主链内能改善通过APC将它呈递给特异性T细胞，其速度取决于APC的性质。
如图5A所示，按以下方法测定MHC-肽复合物在来自脾的抗原呈递细胞(APCs)上的离体形成：使用抗-MHC II抗体，通过磁力分选分离脾APC。利用与抗-MHC II偶联的磁珠进行分离是使用购自MiltenyiBiotec，Germany的磁性细胞分离器和试剂按以下方法进行的：将脾加工成单细胞悬浮液，裂解红细胞，然后洗涤细胞，计数并且重新悬浮在MACS缓冲液(补充了2mM EDTA和0.5％BSA的PBS)中。让磁标记的细胞通过放置在MACS分离器的磁场中的分离柱。所述磁标记的阳性级份保留在柱中，而阴性级份从柱中通过。在将所述柱从磁场中取出之后，将磁力保留的阳性细胞从所述柱上洗脱，洗涤细胞，计数，并且重新悬浮在HL1完全培养基中，并且与能识别I-Ed+SFERFEIFPKE的特异性T细胞杂交瘤一起在存在各种量的SFERFEIFPKE(“HA”)肽或fecHA(I-Ed)-IgG(“IgHA”)的条件下温育过夜。将每孔2×104APC与1×104TcH一起温育。次日，对所述平板进行离心15分钟/4℃/1500RPM，然后将上清液倒掉，用冷却的新制备的固定溶液(2％甲醛，存在于1×PBS中的0.2％戊二醛)固定所述细胞，并且对所述平板再次进行离心3分钟/4℃/1500RPM。将固定溶液从所述平板上倒掉，用PBS200μl/孔洗涤细胞一次，对所述平板进行离心3分钟/4℃/1500RPM。将PBS从所述平板上倒掉，并且，在37℃下，用200μl/孔的按以下方法新制备的X-gal底物温育细胞过夜：200μl的X-gal母液(40mg/ml，存在于DMSO中)溶于10ml的底物缓冲液(5mM亚铁氰化钾，5mM铁氰化钾，2mM MgCl2，存在于1×PBS中)。用显微镜通过肉眼统计蓝色的激活的TcH。对激活的TcH的数量进行定量，并且结果表示为激活与表位的摩尔数量。
(B)业已将类似于上文所述的方法应用于M12 B细胞淋巴瘤APC。
因此，图5B所示结果表示MHC-肽复合物形成的相对效率在很大程度上根据抗原和APc的性质而改变。在摩尔基础上，与游离的肽本身相比，IgG主链内的肽表位通过来自淋巴器官的MHCII+APC控制的效率高出10倍，并且通过转化的B细胞淋巴瘤控制的效率高出1000倍。因此，在IgG内送递之后，所述表位的细胞控制和MHC-肽复合物的形成根据APC的性质有很大的变化。
实施例5表示FCγR-介导的包括T细胞表位的肽的送递导致了含有数量减少的专门的APC的细胞群(外周血白细胞)更有效的细胞控制和呈递。
(A)为了对APC进行定量，通过Ficoll梯度离心从BALB/c小鼠体内分离外周血单核细胞(PBMC)，并且通过FACS分析CD11c，CD11b和B220的表达。结果在图6A中以APC和T细胞在血液中的百分比与原型二级淋巴器官(脾)形式表示。与脾相比，诸如CD11c+细胞的专门的APC的数量在血液中显著降低(2个对数值)。B220+和CD11b+细胞同样减少(一个数量级)。使用了以下材料和方法。
材料：
Ficoll：Ficoll-hypaque(1.077，Amersham，cat#17-1440-02)
抗体：CD11b cat#01715A，CD11c cat#557401，B220cat#01125A，所有都是PE缀合的(BD PharMingen)
流式细胞计数器：FACSCalibur，Becton Dickinson
FACS缓冲液：PBS，1％FCS，0.1％叠氮化钠。
方法：
1.收获动物血液，并且通过Ficoll梯度分离而分离单核细胞。
2.悬浮细胞，并且用浓度为2μg/ml的荧光标记的抗小鼠CD-11c，CD11b或B220在冰上标记20分钟
3.洗涤细胞1次，并且重新悬浮在300μl的FACS缓冲液中
4.进行流式细胞分析，以便确定用每一种特异性抗体标记过的总细胞群的级份
(B)在存在同源肽或recHA(I-Ed)-IgG的条件下，将PBMC用作具有SFERFEIFPKE(HA)-特异性TcH的APC。将所述细胞共温育24小时(2×104APC+1×104TcH)。次日，对所述平板进行离心15分钟/4C/1500RPM，然后将上清液倒掉，用冷却的新制备的固定溶液(2％甲醛，0.2％戊二醛，存在于1×PBS中)固定所述细胞，并且对所述平板再次进行离心3分钟/4℃/1500RPM。将固定溶液从所述平板上倒掉，用PBS200μl/孔洗涤细胞一次，对所述平板进行离心3分钟/4℃/1500RPM。将PBS从所述平板上倒掉，并且，在37℃下，用200μl/孔的按以下方法新制备的X-gal底物温育细胞过夜：200μl的X-gal母液(40mg/ml，存在于DMSO中)溶于10ml的底物缓冲液(5mM亚铁氰化钾，5mM铁氰化钾，2mM MgCl2，存在于1×PBS中)。用显微镜通过肉眼统计蓝色的激活的TcH。结果表示为在不同摩尔浓度的表位的条件下激活的TcH数量/孔。
在图6A-6B中示出的结果表示与单独的肽相比，在通过血液衍生的APC控制的条件下诱导TcH激活时，IgG主链内的肽表位在摩尔基础上更有效(一个数量级)，表明在与有限数量的专门的APC相关的非最佳条件下，Ig主链大大促进了MHC-肽复合物的形成。
实施例6表示送递IgG主链内的T细胞表位能显著改善二级淋巴器官(引流淋巴结+脾)而不是中枢淋巴器官中的APC对表位的加载和呈递。将所述肽表位乳化在IFA中或将剂量提高100倍不能再现相同程度的加载。因此，将表位插入所述IgG主链内，消除了与基于肽的方法相关的限制因素，所述方法不能通过增大剂量或储存效应补偿。
MHC-肽复合物体内形成的评估以及与存在于盐水或标准水包油乳液中的肽的比较是用I-Ed+BALB/c小鼠进行的。通过皮下和腹膜内注射(剂量如图7B所示)用recHA(I-Ed)-IgG，存在于盐水中的肽或乳化在不完全弗氏佐剂(IFA)中的肽处理BALB/c小鼠。24小时，收获局部(肠系膜)淋巴结(LN)、脾和胸腺，制备单细胞悬浮液，裂解红细胞，用胶原酶消化溶解自脾、淋巴结和胸腺的细胞。洗涤所有细胞，计数并且用识别I-Ed+SFERFEIFPKE(II类MHC-HA)复合物的TcH温育。TcH的数量为1×104/孔。通过用恒定数量的TcH滴定APC的数量，并且在温育过夜之后测定TcH激活，评估所述MHC-肽复合物的形成。次日，对所述平板进行离心15分钟/4℃/1500RPM，然后将上清液倒掉，用冷却的新制备的固定溶液(2％甲醛，0.2％戊二醛，存在于1×PBS中)固定所述细胞，并且对所述平板再次进行离心3分钟/4℃/1500RPM。将固定溶液从所述平板上倒掉，用PBS 200μl/孔洗涤细胞一次，对所述平板进行离心3分钟/4℃/1500RPM。将PBS从所述平板上倒掉，并且，在37℃下，用200μl/孔的按以下方法新制备的X-gal底物温育细胞过夜：200μl的X-gal母液(40mg/ml，存在于DMSO中)溶于10ml的底物缓冲液(5mM亚铁氰化钾，5mM铁氰化钾，2mM MgCl2，存在于1×PBS中)中。用显微镜通过肉眼统计蓝色的激活的TcH。
数据表示为TcH激活与APC数量(图7A)并且表示为根据体外标准曲线估算的表达MHC-肽复合物的APC的百分比(图7B)，所述标准曲线是按前面的实施例5和实施例6所示获得的。
图7A-7B中示出的数据表示水包油佐剂(IFA)的使用中度地增强了MHC-肽复合物在淋巴结的APC上的体内形成，但不能在脾或胸腺上起作用。显著增加盐水或乳液中肽的剂量不能同时成比例地增加加载过的APC的产生和/或在体内APC上的MHC-肽复合物。相反，使用Ig主链内的肽显著增强了MHC肽复合物在来自诸如淋巴结和脾的二级淋巴器官的APC上的形成。MHC II-肽复合物在来自胸腺的APC上的形成仍然是有限的，与使用肽自身导致的形成类似。将肽掺入IgG内赋予的增强因数出乎预料的高(大约为2-3个数量级)，表明涉及除了细胞控制以外的其他因素(例如，上述药代动力学和保护作用)。即使将存在于盐水或IFA中的肽自身的剂量提高100倍，也不能恢复使用IgG主链内的肽所达到的APC的体内加载。
实施例7表示在表达FcγR的三种主要APC亚型(DC，单核细胞/巨噬细胞和B细胞)中，CD11c+(DC)和CD11b+(大部分为单核细胞)而不是B细胞在通过IgG主链进行体内送递之后，在以每个细胞为基础的肽表位呈递方面是最有效的。APC加载的效率，以及所得到的呈递明显比来自游离肽送递所得到的效率高。
业已在施用IgG主链内的肽表位之后，通过分离各种APC亚型评估了MHC-肽复合物在APC上的体内形成。
(A)通过使用与抗-MHC II或抗-CD11c mAb偶联的磁珠进行的分离是使用购自Miltenyi Biotec，Germany的磁性细胞分离器和试剂按以下方法进行的：将脾加工成单细胞悬浮液，裂解红细胞，然后洗涤细胞，计数并且重新悬浮在MACS缓冲液(补充了2mM EDTA和0.5％BSA的PBS)。让磁标记的细胞通过放置在MACS分离器的磁场中的分离柱。磁标记的阳性级份保留在柱中，而阴性级份从柱中通过。在将所述柱从磁场中取出之后，将通过磁力保留的阳性细胞从所述柱上洗脱，洗涤细胞，计数，重新悬浮在HL1完全培养基中，并且在ELISPOT平板上温育。通常，在总数为大约9000万个分离的体细胞/1只BALB/c小鼠中，有大约2000万个细胞结合在与抗-MHC II抗体结合的磁珠上，有300万个细胞与-CD1 1c mAb相互作用。因此，只有不到20％的体细胞能够呈递II类MHC限制的表位，并且大约2-3％的细胞是树突细胞(参见图8A)。这些数据通过FACS分析使用特异性抗体得到了验证。
(B)业已在用0.72μM的recHA(I-Ed)-IgG(“IgHA”)或18μM的HA肽进行静脉内注射的Balb/c小鼠体内比较性地评估了APC的体内加载和MHC II-肽复合物在MHC II+脾细胞上的形成。在第24小时，按照上述MACS从脾中分离II类MHC+APC，并且与肽特异性TcH(1×104/孔)一起以剂量反应方式温育。次日，对所述平板进行离心15分钟/4℃/1500RPM，然后将上清液倒掉，用冷却的新制备的固定溶液(2％甲醛，0.2％戊二醛，存在于1×PBS中)固定所述细胞，并且对所述平板再次进行离心3分钟/4℃/1500RPM。将固定溶液从所述平板上倒掉，用PBS200μl/孔洗涤细胞一次，对所述平板进行离心3分钟/4℃/1500RPM。将PBS从所述平板上倒掉，在37℃下，用200μl/孔的按以下方法新制备的X-gal底物温育细胞过夜：将200μl的X-gal母液(40mg/ml，存在于DMSO中)溶于10ml底物缓冲液(5mM亚铁氰化钾，5mM铁氰化钾，2mM MgCl2，存在于1×PBS中)中。用显微镜通过肉眼统计蓝色的激活的TcH。
以上结果在图8B中以激活的TcH数量/孔的形式表达。作为对照，将来自幼稚的BALB/c小鼠的MHC II+APC与最佳浓度的HA肽(50μg/ml)在体外温育过夜，充分洗涤，并且按上述方法以不同数量与TcH一起温育。结果表明，在IgG主链内送递所述表位时，脾APC上的MHC II-肽复合物的形成的效率提高了至少2个数量级。
(C)业已通过CD11c+，CD11b+和CD19+APC的磁力分离在施用recHA(I-Ed)-IgG之后对各种APC亚型的体内加载进行了各种比较性评估，使用上述相同的方法，使用购自Miltenyi Biotec的CD11c，CD11b和CD19微型珠。在用0.72μM的重组免疫球蛋白静脉内注射24小时之后，分离APC，并且以剂量效应方式与恒定数量的肽特异性TcH一起温育。再经过24小时之后，按上述方法进行显影，并且结果表示为激活的TcH数/孔。图8C中的结果表示，以每个细胞为基础，使用IgG主链内的肽导致了免疫原性MHC II-肽复合物在CD11c+APC(树突细胞)上的优势形成，随后是在CD11b+单核细胞上的形成，在CD19+B细胞上的形成是效率很低的。
(D)在按照上述B部分所述对小鼠进行处理之后，业已比较了在使用肽和重组Ig送递之后在CD11c+APC上的MHC II-肽复合物的体内形成的效率。CD11c+脾DC是通过MACS分离的，使用CD11c微型珠，并且以不同的数量与1×104TcH/孔一起温育。按上述方法对激活的TcH进行定量，并且结果表示为X-gal+T的细胞数/孔。作为对照，将来自幼稚小鼠的用肽进行离体加载的CD11c+APC按B部分所述使用。图8D中的结果表示在所述肽表位是在IgG主链内送递时，MHC II肽复合物的效率形成至少高出3个数量级。
总之，IgG主链内的肽表位的送递导致了MHC II-肽复合物在CD11c+DC上的更有效的形成。另外，当所述肽是在IgG主链内送递时，APC加载的效率和MHC II-肽复合物的形成效率明显更高。图8A-8D中的结果表示使用FcgR介导的肽送递，导致了免疫原性MHC II-肽复合物在CD11c+和CD11b+APC上的优先形成。
实施例8表示在通过IgG主链施用之后MHC-肽复合物在APC(DC和单核细胞)上的长时间的存在。
MHC II-肽复合物在特定APC亚型上的存在是通过在静脉内注射2μM的recHA(I-Ed)-IgG之后以不同时间间隔通过磁力分离CD11c+DC和CD11b+单核细胞测定的。简单地讲，使用购自Miltenyi Biotec，Germany的磁性细胞分离器和试剂按以下方法进行磁力分离：将脾加工成单细胞悬浮液，裂解红细胞，然后洗涤细胞，计数并且重新悬浮在MACS缓冲液(补充了2mM EDTA和0.5％BSA的PBS)中。让磁标记的细胞通过放置在MACS分离器的磁场中的分离柱。磁标记的阳性级份保留在柱中，而阴性级份从柱中通过。在将所述柱从磁场中取出之后，将磁力保留的阳性细胞从所述柱上洗脱，洗涤细胞，计数，重新悬浮在HL1完全培养基中，并且温育。将不同数量的分离的APC(A-CD11b+单核细胞，B-CD11c+树突细胞，C-完整的脾细胞群)与1×104个对HA肽特异的TcH一起温育过夜。
作为对照，使用来自幼稚小鼠的APC，用最佳量的HA肽(50μg/ml)体外加载过夜，并且在温育之前洗涤(“ctrl”)。次日，对所述平板进行离心15分钟/4℃/1500RPM，然后将上清液倒掉，用冷却的新制备的固定溶液(2％甲醛，0.2％戊二醛，存在于1×PBS中)固定所述细胞，并且对所述平板再次进行离心3分钟/4℃/1500RPM。将固定溶液从所述平板上倒掉，用PBS200μl/孔洗涤细胞一次，对所述平板进行离心3分钟/4℃/1500RPM。将PBS从所述平板上倒掉，在37℃下，用200μl/孔的按以下方法新制备的X-gal底物温育细胞过夜：将200μl的X-gal母液(40mg/ml，存在于DMSO中)溶于10ml底物缓冲液(5mM亚铁氰化钾，5mM铁氰化钾，2mM MgCl2，存在于1×PBS中)。用显微镜通过肉眼统计蓝色的激活的TcH，并且将激活的TcH的数量/孔对在处理之后不同时间间隔收获的APC的数量进行作图。
以上结果表明了肽在DC和单核细胞上的内源MHC II上的持续表达。在本实验所采用的条件下，所述复合物在这两种APC亚型上存在1-2周时间(APC分离方法和MHC II-肽检测)。
因此，在图9A-9中示出的结果表示在通过Ig体内送递表位之后在选定的APC上形成的MHC-肽复合物是长效的。
实施例9表示Fc受体(I和III)的γ链是由DC和单核细胞对IgG主链内送递的T细胞表位进行有效的体内加载和呈递所必须的。
通过给缺少功能性FcRγ基因的BALB/c小鼠施用2μM的recHA(I-Ed)-IgG，研究了APC加载对与FcRγ的相互作用的依赖性。在静脉内处理1天之后，通过MACS从脾中分离CD11c+和CD11b+APC。分离是通过使用与抗-CD11c和抗-CD11b抗体偶联的磁珠，使用购自Miltenyi Biotec，Germany的磁性细胞分离器按以下方法进行的：将脾加工成单细胞悬浮液，裂解红细胞，然后洗涤细胞，计数并且重新悬浮在MACS缓冲液(补充了2mM EDTA和0.5％BSA的PBS)中。让磁标记的细胞通过放置在MACS分离器的磁场中的分离柱。磁标记的阳性级份保留在柱中，而阴性级份从柱中通过。在将所述柱从磁场中取出之后，将磁力保留的阳性细胞从所述柱上洗脱，洗涤细胞，计数，重新悬浮在HL1完全培养基中，并且它们以不同的数量与对HA肽特异的1×104TcH一起温育过夜。作为对照，使用了来自FcRγ成分BALB/c小鼠的APC。次日，对所述平板进行离心15分钟/4℃/1500RPM，然后将上清液倒掉，用冷却的新制备的固定溶液(2％甲醛，0.2％戊二醛，存在于1×PBS中)固定所述细胞，并且对所述平板再次进行离心3分钟/4℃/1500RPM。将固定溶液从所述平板上倒掉，用PBS 200μl/孔洗涤细胞一次，对所述平板进行离心3分钟/4℃/1500RPM。将PBS从所述平板上倒掉，在37℃下，用200μl/孔的按以下方法新制备的X-gal底物温育细胞过夜：将200μl的X-gal母液(40mg/ml，存在于DMSO中)溶于10ml底物缓冲液(5mM亚铁氰化钾，5mM铁氰化钾，2mM MgCl2，存在于1×PBS中)。用显微镜通过肉眼统计蓝色的激活的TcH。所述结果表示为不同APC亚型的激活的TcH的数量/孔：CD11c+DC(A)和CD11b+单核细胞(B)，或作为对照的完整的细胞群(C)。
以上结果(图10)清楚地表明了在IgG介导的肽表位送递之后，MHC II-肽复合物在DC和单核细胞上的形成关键取决于包括γ链的ITAM+FcgR。另外，就此而言，γ链阴性FcR同种型不能补偿γ链+FcR同种型的缺乏。
实施例10表示通过IgG主链内送递的肽激活T细胞的效率取决于γ链+FcγR(它能促进活性)和FcγRIIB(它能限制活性)在APC上的表达。另外，该实验表明了具有ITIM的FcγRIIB限制了IgG主链内送递的肽的免疫反应。
通过离体加载APC以及随后的过继转移研究了FcRγ+与γ-同种型对通过IgG主链内的肽表位引发的免疫反应的不同的作用。按以下方式在37℃下将来自野生型，FcRγ-或FcRIIB-BALB/c小鼠的脾细胞温育3小时：将1000万细胞/1ml无血清HL-1培养基与50μg/ml的HA110-120肽或10μg/ml的recHA(I-Ed)-IgG混合。然后，洗涤所述细胞，并且过继转移到幼稚的BALB/c小鼠体内(将100万个细胞悬浮在200μl无血清HL-1中，并且分成2份相等的接种物，皮下和腹膜内施用)。2周之后，处死受体小鼠，收获脾，并且按以下方法通过ELISPOT分析而测定对HA110-120肽的T细胞反应：在4℃下，用存在于无菌PBS(50μl/孔)中的纯化的抗-细胞因子Abs(对于抗-IL2和抗-IL4来说为4μg/ml，而对于抗-IFNγ来说为8μg/ml，购自BD Pharmingen)温育ELISPOT平板(Millipore，Molsheim，France)过夜。次日，用DMEM培养基洗涤所述平板2次，并且，在37℃下用200μl/孔完全含有FBS的DMEM封闭1小时。用脾制备单细胞悬浮液，裂解红细胞，洗涤细胞，计数并且以5×105/孔的密度与50μg/ml HA110-120肽或仅与培养基一起温育，以便评估背景。
在37℃，5％CO2中温育平板72小时。3天之后，用PBS-tween200.05％(洗涤缓冲液)洗涤平板5次，并且用100μl/孔的溶解在PBS-tween20 0.05％-FBS 0.1％(ELISPOT缓冲液)中的生物素化的抗-细胞因子Abs，2μg/ml在4℃下温育过夜。
次日，用洗涤缓冲液洗涤平板5次，并且用通过ELISPOT缓冲液稀释的1∶1000抗生物素蛋白链菌素-HRP温育1小时。用3-氨基-9-乙基咔唑底物(Sigma，St.Luis，MO)对所述反应显影，并且，用自来水洗涤所述平板两次而终止反应。让所述平板在室温下干燥24小时。数据是用具有ImagePro-Plus)软件(Media Cybernetics，SilverSpring，MD)的自动化系统(Navitar，Rochester，NY)获得的。所述结果在图11中表示为细胞因子生产(A：IL-2，B：IL-4，和C：IFN-γ)成斑点集落的频率，是通过单独用培养基，或用补充了HA110-120肽(10μg/ml)的培养基温育获得的(3次重复的平均值+SEM，相当于3小鼠/组)。
结果(图11)表明，ITAM+FcgR同种型的γ链的表达是诱导对用IgG主链内的肽加载的APC的T细胞反应所必须的。它对于用肽脉冲的APC的所述免疫原性作用来说不是必须的。相反，ITIM+FcgRII的缺乏导致了对用重组IgG而不是HA肽脉冲的APC的T细胞反应的显著增强。总之，以上数据表明，对具有肽表位的重组IgG的T细胞反应是通过APC上的ITAM+和ITIM+Fcγ受体之间的复杂的相互作用决定的。
实施例11出乎预料的表示用插入IgG主链的表位进行体内加载的各种亚型的APC能以不同的方式诱导不同的调控亚型：单核细胞能更有效地诱导Th2和Tr1细胞，树突细胞和单核细胞都能诱导Th3细胞。另外，在细胞群水平上，在IgG-介导的T细胞表位送递之后，CD11b+单核细胞在引发调控反应方面比树突细胞更有效。
用2μM的recHA(I-Ed)-IgG对四只BALB/c小鼠进行静脉内注射。一天之后收获脾，并且通过MACS，使用与磁珠偶联的抗-CD11c，抗-CD11b或抗-CD19单克隆抗体分离APC。分离是通过使用与抗-CD11b，抗-CD11c和抗-CD19mAb结合的磁珠，使用购自MiltenyiBiotec，Germany的磁性细胞分离器按以下方法进行的：将脾加工成单细胞悬浮液，裂解红细胞，然后洗涤细胞，计数并且重新悬浮在MACS缓冲液(补充了2mM EDTA和0.5％BSA的PBS)中。让磁标记的细胞通过放置在MACS分离器的磁场中的分离柱。磁标记的阳性级份保留在柱中，而阴性级分从柱中通过。在将所述柱从磁场中取出之后，将磁力保留的阳性细胞从所述柱上洗脱，洗涤细胞，计数，按以下方法重新悬浮在无血清HL-1培养基中：3×106/ml CD11c+DC，28×106/mlCD11b+或84×106/ml的CD19+B细胞。该数字分布相当于从脾组织中分离的APC亚型的比例。通过皮下和腹膜内注射将细胞转入幼稚的BALB/c小鼠体内(100+100μl/小鼠，n＝2小鼠/组)。在过继转移2周之后，处死小鼠，并且通过ELISPOT测定T细胞反应(IL-4和IFN-γ)或通过ELISA TGF-β1试剂盒(R&D Systems，cat#DY240)和IL-10试剂盒(Biosource international，cat#KMC0104)测定细胞培养上清液中的细胞因子的产量。
以上结果在图12中表示为成斑点集落数量/脾(两次重复的平均值；图片A，B)或在用于再刺激的各种浓度的HA肽的条件下在上清液中测定的细胞因子的量(μg/ml，两次重复的平均值；图片C，D)。
以上结果(图12，图片A-D)清楚地表明，出乎预料地，并且与在生物体水平上的效力/细胞基础(实施例8)相比，CD11b+单核细胞对针对IgG主链内送递的肽表位的免疫反应具有最强的影响。因此，CD11b+APC亚型能诱导Th2，Tr1和Th3细胞。相反，CD11c+DC诱导了Th3细胞，并且具有更弱的Th2反应。最后，尽管它们具有较大的数量，CD19+B细胞是对IgG主链内的肽表位的T细胞免疫的较差的诱导剂。通过试验过的任一种APC亚型都未能诱导显著的Th1反应。
实施例12表示在体内用IgG主链内送递的肽加载APC导致了Th2而不是Th1免疫的诱导。
通过皮下注射用100μg的recHA(I-Ed)-IgG(“IgHA”)或等摩尔量的HA肽表位(2μg)对BALB/c小鼠进行免疫，并且在2周之后处死。通过ELISPOT分析，使用来自处理过的小鼠的体细胞作为应答物，并且用来自幼稚小鼠的丝裂霉素-处理的脾细胞作为刺激剂按以下方法测定所述免疫反应：在4℃下，用存在于无菌PBS(50μl/孔)中的纯化的抗-细胞因子Abs(对于抗-IL2和抗-IL4来说为4μg/ml，而对于抗-IFNγ来说为8μg/ml，购自BD Pharmingen)温育ELISPOT平板(Millipore，Molsheim，France)过夜。次日，用DMEM培养基洗涤所述平板2次，并且，在37℃下用200μl/孔完全含有FBS的DMEM封闭1小时。用脾制备单细胞悬浮液，裂解红细胞，洗涤细胞，计数并且以5×105/孔的密度与20μg/ml HA 110-120肽或仅与培养基一起温育，以便评估背景。
按以下方法用幼稚小鼠制备刺激剂细胞：用脾制备单细胞悬浮液，裂解红细胞，洗涤细胞，重新悬浮在HL1完全培养基中，并且用丝裂霉素处理30分钟。然后，将细胞洗涤3次，计数并且重新悬浮在无血清HL1培养基中。在37℃，5％CO2中温育平板72小时。3天之后，用PBS-tween20 0.05％(洗涤缓冲液)洗涤平板5次，并且用100μl/孔的溶解在PBS-tween20 0.05％-FBS 0.1％(ELISPOT缓冲液)中的生物素化的抗-细胞因子Abs，2μg/ml在4℃下温育过夜。
次日，用洗涤缓冲液洗涤平板5次并且用通过ELISPOT缓冲液稀释的1∶1000抗生物素蛋白链菌素-HRP温育1小时。用3-氨基-9-乙基咔唑底物(Sigma，St.Luis，MO)对所述反应显影，并且，用自来水洗涤所述平板两次而终止反应。然后让所述平板在室温下干燥24小时。数据是用具有ImagePro-Plus)软件(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)的自动化系统(Navitar，Rochester，NY)获得的。
结果在图13中表示为IL-4-生产(A)或IFN-γ生产(B)T细胞集落/脾的数量(三次重复的平均值±SEM)，此时，用10μg/ml的HA肽或单独用细胞培养基再刺激脾细胞。因此，该实施例表示FcgR-介导的重组Ig主链内的T细胞表位的送递导致了Th2而不是Th1反应。
实施例13表示用IgG主链内送递的肽重复体内加载APC导致了Th3和Trl免疫的诱导。
通过鼻内灌输用40μg的热聚集的(15分钟，63℃)recHA(I-Ed)-IgG(“IgHA”)对BALB/c小鼠进行免疫，并且在2周之后通过皮下注射溶解在盐水中的100μg的重组免疫球蛋白进行加强免疫。作为对照，使用了用热聚集的IgG2b同种型对照激发的小鼠。又过了2周之后，处死所述小鼠，并且通过ELISPOT分析按以下方法用HA肽再刺激脾细胞以评估T细胞反应：在4℃下，用存在于无菌PBS(50μl/孔)中的纯化的抗-细胞因子Abs(对于抗-IL2和抗-IL4来说为4μg/ml，而对于抗-IFNγ来说为8μg/ml，购自BD Pharmingen)温育ELISPOT平板(Millipore，Molsheim，France)过夜。次日，用DMEM培养基洗涤所述平板2次，并且，在37℃下用200μl/孔含有FBS的完全DMEM封闭1小时。
用脾制备单细胞悬浮液，裂解红细胞，洗涤细胞，计数并且以5×105/孔的密度与20μg/ml HA 110-120肽或仅与培养基一起温育，以便评估背景。在37℃，5％CO2中温育平板72小时。3天之后，用PBS-tween20 0.05％(洗涤缓冲液)洗涤平板5次，并且用100μl/孔的溶解在PBS-tween20 0.05％-FBS 0.1％(ELISPOT缓冲液)中的生物素化的抗-细胞因子Abs，2μg/ml在4℃下温育过夜。
次日，用洗涤缓冲液洗涤平板5次并且用通过ELISPOT缓冲液稀释的1∶1000抗生物素蛋白链菌素-HRP温育1小时。用3-氨基-9-乙基咔唑底物(Sigma，St.Luis，MO)对所述反应显影，并且，用自来水洗涤所述平板两次而终止反应。让所述平板在室温下干燥24小时。
数据是用具有ImagePro-Plus)软件(Media Cybernetics，SilverSpring，MD)的自动化系统(Navitar，Rochester，NY)获得的。通过ELISA TGF-β1试剂盒(R&D Systems，cat#DY240)和IL-10试剂盒(Biosource international，cat#KMC0104)测定TGF-β和IL-10产量。结果表示为扣除背景之后的细胞因子浓度(三次重复的平均值)。
在图14中示出的数据表明了用重组免疫球蛋白携带的表位进行粘膜激发导致了Th3和Tr1细胞的分化，它们在通过系统加强之后扩增。
实施例14表示只有病毒，而不是常规佐剂CFA能够引发对插入IgG主链内的肽表位的显著的Th1反应。
用乳化在完全弗氏佐剂(“CFA”)中的存在于盐水中的100μgrecHA(I-Ed)-IgG，或用具有HA表位的105 TCID50的流感病毒菌株WSN对BALB/c小鼠进行腹膜内免疫。在免疫之后2周，处死所述小鼠(n＝3/组)，并且通过ELISPOT分析按以下方法测定对HA肽的T细胞反应：在4℃下，用存在于无菌PBS(50μl/孔)中的纯化的抗-细胞因子Abs(对于抗-IL2和抗-IL4来说为4μg/ml，而对于抗-IFNγ来说为8μg/ml，购自BD Pharmingen)温育ELISPOT平板(Millipore，Molsheim，France)过夜。次日，用DMEM培养基洗涤所述平板2次，并且，在37℃下用200μl/孔含有FBS的完全DMEM封闭1小时。用脾制备单细胞悬浮液，裂解红细胞，洗涤细胞，计数并且以5×105/孔的密度与20μg/ml HA 110-120肽或仅与培养基一起温育，以便评估背景。
在37℃，5％CO2中温育平板72小时。3天之后，用PBS-tween200.05％(洗涤缓冲液)洗涤平板5次，并且用100μl/孔的溶解在PBS-tween20 0.05％-FBS 0.1％(ELISPOT缓冲液)中的生物素化的抗-细胞因子Abs，2μg/ml在4℃下温育过夜。次日，用洗涤缓冲液洗涤平板5次，并且用通过ELISPOT缓冲液稀释的1∶1000抗生物素蛋白链菌素-HRP温育1小时。用3-氨基-9-乙基咔唑底物(Sigma，St.Luis，MO)对所述反应显影，并且，用自来水洗涤所述平板两次而终止反应。让所述平板在室温下干燥24小时。
数据是用具有ImagePro-Plus)软件(Media Cybernetics，SilverSpring，MD)的自动化系统(Navitar，Rochester，NY)获得的。结果表示为脾中生产细胞因子的集落的频率的平均值±SEM。
图15中的结果表示IgG主链内的肽表位引发了具有Th2谱的细胞反应，该反应是通过常规佐剂(CFA)增强而不是转变的。相反，通过活的病毒接种产生的谱是偏向Th1的。
实施例15表示在IgG介导的送递之后肽表位的呈递导致了T细胞反应，该反应可以通过用抗-CD40mAb，重组IL-12或合成dsRNA加强共刺激进一步操纵。
通过MACS按照以下方法从脾细胞悬浮液中收获来自幼稚BALB/c小鼠的树突细胞：分离是通过使用与抗-CD11c偶联的磁珠，使用购自Miltenyi Biotec，Germany的磁性细胞分离器按以下方法进行的：将脾加工成单细胞悬浮液，裂解红细胞，洗涤细胞，计数并且重新悬浮在MACS缓冲液(补充了2mM EDTA和0.5％BSA的PBS)。让磁标记的细胞通过放置在MACS分离器的磁场中的分离柱。磁标记的阳性级份保留在柱中，而阴性级分从柱中通过。在将所述柱从磁场中取出之后，将磁力保留的阳性细胞从所述柱上洗脱，洗涤细胞，计数，重新悬浮在HL1完全培养基中，并且在无血清HL-1培养基中进行来自离体脉冲2小时，浓度为3百万/ml，单独使用50μg/ml的recHA(I-Ed)-IgG或补充5ng/ml的recIL-12，50μg/ml的双链RNAs(pA：pU或pI：pC)。另外，用重组Ig温育所述细胞，并且用10μg/ml的抗-CD40mAb对孔进行预包被。收获所述细胞，洗涤并且在无血清HL-1培养基中过继转移到幼稚BALB/c小鼠体内(300,000个细胞，1/2皮下送递，1/2腹膜内送递)。
在第2周，处死所述小鼠，并且通过ELISPOT分析按以下方法测定对HA的T细胞反应：在4℃下，用存在于无菌PBS(50μl/孔)中的纯化的抗-细胞因子Abs(对于抗-IL2和抗-IL4来说为4μg/ml，而对于抗-IFNγ来说为8μg/ml，购自BD Pharmingen)温育ELISPOT平板(Millipore，Molsheim，France)过夜。次日，用DMEM培养基洗涤所述平板2次，并且，在37℃下用200μl/孔含有FBS的完全DMEM封闭1小时。
用脾制备单细胞悬浮液，裂解红细胞，洗涤细胞，计数并且以5×105/孔的密度与50μg/ml HA 110-120肽或仅与培养基一起温育，以便评估背景。在37℃，5％CO2中温育平板72小时。3天之后，用PBS-tween20 0.05％(洗涤缓冲液)洗涤平板5次，并且用100μl/孔的溶解在PBS-tween20 0.05％-FBS 0.1％(ELISPOT缓冲液)中的生物素化的抗-细胞因子Abs，2μg/ml在4℃下温育过夜。次日，用洗涤缓冲液洗涤平板5次并且用通过ELISPOT缓冲液稀释的1∶1000抗生物素蛋白链菌素-HRP温育1小时。用3-氨基-9-乙基咔唑底物(Sigma，St.Luis，MO)对所述反应显影，并且，用自来水洗涤所述平板两次而终止反应。让所述平板在室温下干燥24小时。
数据是用具有ImagePro-Plus)软件(Media Cybernetics，SilverSpring，MD)的自动化系统(Navitar，Rochester，NY)获得的。结果表示每一种离体刺激组合的扣除背景之后的与IL-2或IL-4生产相关的成斑点集落的频率的平均值+SEM(n＝3)。
图16中的结果表示通过使用重组IgG作为送递平台用抗原加载之后APC对肽的呈递，是以限制的共刺激形式发生的。IL-12，抗-CD40或合成dsRNA都能够通过FcgR用抗原加载APC，以便激发IL-2并且增强抗相关(HA)肽的生产IL-4的T细胞免疫。
实施例16：通过用IgG-肽体内加载APC诱导的生产长效IL-4的Th2细胞的活性取决于与内源APC的连续的相互作用，并且需要感受态CD4。
用100μg的recHA(I-Ed)-IgG或HA肽对BALB/c小鼠进行皮下免疫接种，在第2周处死，并且通过ELISPOT分析按以下方法测定T细胞反应：在4℃下，用存在于无菌PBS(50μl/孔)中的纯化的抗-细胞因子Abs(对于抗-IL2和抗-IL4来说为4μg/ml，而对于抗-IFNγ来说为8μg/ml，购自BD Pharmingen)温育ELISPOT平板(Millipore，Molsheim，France)过夜。次日，用DMEM培养基洗涤所述平板2次，并且，在37℃下用200μl/孔含有FBS的完全DMEM封闭1小时。
用脾制备单细胞悬浮液，裂解红细胞，洗涤细胞，计数并且以5×105/孔的密度与20μg/ml HA 110-120肽或仅与培养基一起温育，以便评估背景。所述平板在37℃，5％CO2中温育72小时。3天之后，用PBS-tween20 0.05％(洗涤缓冲液)洗涤平板5次，并且用100μl/孔的溶解在PBS-tween20 0.05％-FBS 0.1％(ELISPOT缓冲液)中的生物素化的抗-细胞因子Abs，2μg/ml在4℃下温育过夜。
次日，用洗涤缓冲液洗涤所述平板5次，并且用通过ELISPOT缓冲液稀释的1∶1000抗生物素蛋白链菌素-HRP温育1小时。用3-氨基-9-乙基咔唑底物(Sigma，St.Luis，MO)对所述反应显影，并且，用自来水洗涤所述平板两次而终止反应。然后让所述平板在室温下干燥24小时。数据是用具有ImagePro-Plus)软件(MediaCybernetics，Silver Spring，MD)的自动化系统(Navitar，Rochester，NY)获得的。
(A)在HA刺激阶段，以10μg/ml的用量在选定的孔中封闭抗-CD4或抗-CD8mAb。所述结果在图17A中表示为在扣除背景(n＝3小鼠/组)之后每个脾的HA-刺激的IL-4生产集落的数量的平均值+SEM。
(B)来自用上述重组Ig免疫的小鼠的脾细胞直接在elispot平板上温育，或者在通过磁力消除幼稚BALB/c小鼠体内的具有MHCII+的内源MHC II+APC之后温育，仅使用培养基或在存在10μg/ml的HA肽的条件下温育。分离是通过使用与抗-MHC II偶联的磁珠，使用购自Miltenyi Biotec，Germany的磁性细胞分离器按以下方法进行的：将脾加工成单细胞悬浮液，裂解红细胞，然后洗涤细胞，计数并且重新悬浮在MACS缓冲液(补充了2mM EDTA和0.5％BSA的PBS)中。让磁标记的细胞通过放置在MACS分离器的磁场中的分离柱。磁标记的阳性级份保留在柱中，而阴性级分从柱中通过。在将所述柱从磁场中取出之后，将磁力保留的阳性细胞从所述柱上洗脱，洗涤细胞，计数，重新悬浮在HL1完全培养基中，并且随后在ELISPOT测定中温育。在4℃下，用存在于无菌PBS(50μl/孔)中的纯化的抗-细胞因子Abs(对于抗-IL2和抗-IL4来说为4μg/ml，而对于抗-IFNγ来说为8μg/ml，购自BD Pharmingen)温育ELISPOT平板(Millipore，Molsheim，France)过夜。次日，用DMEM培养基洗涤所述平板2次，并且，在37℃下用200μl/孔含有FBS的完全DMEM封闭1小时。用脾制备单细胞悬浮液，裂解红细胞，洗涤细胞，计数并且以5×105/孔的密度与50μg/ml HA 110-120肽或仅与培养基一起温育，以便评估背景。
在37℃，5％CO2中温育平板72小时。3天之后，用PBS-tween200.05％(洗涤缓冲液)洗涤平板5次，并且用100μl/孔的溶解在PBS-tween20 0.05％-FBS 0.1％(ELISPOT缓冲液)中的生物素化的抗-细胞因子Abs，2μg/ml在4℃下温育过夜。
次日，用洗涤缓冲液洗涤平板5次，并且用通过ELISPOT缓冲液稀释的1∶1000抗生物素蛋白链菌素-HRP温育1小时。用3-氨基-9-乙基咔唑底物(Sigma，St.Luis，MO)对所述反应显影，并且，用自来水洗涤所述平板两次而终止反应。让所述平板在室温下干燥24小时。
数据是用具有ImagePro-Plus)软件(Media Cybernetics，SilverSpring，MD)的自动化系统(Nayitar，Rochester，NY)获得的，并且结果表示为生产IL-4的T细胞频率的平均值±SEM。图17A-17B中的结果表示通过施用recHA(I-Ed)-IgG引发的HA特异性IL-4生产T细胞的活性取决于CD4而不是CD8。另外，通过激发T细胞产生的长效IL-4取决于内源APC的稳定的相互作用。
实施例17表示FcγR-介导的T细胞表位的送递与肽相比在以不同的方式影响激活的，特异性T细胞的表型方面更有效：IL-2，IFN-γ，和IL-4的剂量依赖型下调，IL-10和TGF-β的上调。
从2周之前用存在于CFA中的100μg肽免疫的BALB/c小鼠体内分离激活的SFERFEIFPKE-特异性T细胞。在存在各种量的recHA(I-Ed)-IgG或相应的肽的条件下，将它们与丝裂霉素处理过的脾细胞一起温育。通过ELISPOT分析按以下方法评估扩增和细胞因子生产(IFN-γ，IL-4，IL-2)：在4℃下，用存在于无菌PBS(50μl/孔)中的纯化的抗-细胞因子Abs(对于抗-IL2和抗-IL4来说为4μg/ml，而对于抗-IFNγ来说为8μg/ml，购自BD Pharmingen)温育ELISPOT平板(Millipore，Molsheim，France)过夜。次日，用DMEM培养基洗涤所述平板2次，并且，在37℃下用200μl/孔含有FBS的完全DMEM封闭1小时。用脾制备单细胞悬浮液，裂解红细胞，洗涤细胞，计数并且以5×105/孔的密度与20μg/ml HA 110-120肽或仅与培养基一起温育，以便评估背景。
在37℃，5％CO2中温育平板72小时。3天之后，用PBS-tween200.05％(洗涤缓冲液)洗涤平板5次，并且用100μl/孔的溶解在PBS-tween20 0.05％-FBS 0.1％(ELISPOT缓冲液)中的生物素化的抗-细胞因子Abs，2μg/ml在4℃下温育过夜。次日，用洗涤缓冲液洗涤平板5次，并且用通过ELISPOT缓冲液稀释的1∶1000抗生物素蛋白链菌素-HRP温育1小时。用3-氨基-9-乙基咔唑底物(Sigma，St.Luis，MO)对所述反应显影，并且，用自来水洗涤所述平板两次而终止反应。让所述平板在室温下干燥24小时。
数据是用具有ImagePro-Plus)软件(Media Cybernetics，SilverSpring，MD)的自动化系统(Nayitar，Rochester，NY)获得的。另外，在用TGF-β1试剂盒(R&D Systems，cat#DY240)和IL-10试剂盒(Biosource international，cat#KMC0104)温育48小时之后通过ELISA测定TGF-和IL-10产量。结果表示为成斑点细胞(SFC)的频率或细胞因子浓度与体外添加的抗原量。
图18的结果表示IgG介导的T细胞表位的送递对激活的T细胞的扩增和细胞因子的产生具有显著的和不同的影响：IL-2，IFN-γ以及令人吃惊的是IL-4以剂量相关方式下调。与所述肽本身，Ig-肽在调节细胞因子产生方面明显更有效。相反，只有Ig-肽能够以剂量依赖方式有效地启动IL-10和TGF-β的产生。因此，Ig主链内的T细胞表位，而不是分开的T细胞表位，能以不同方式调节激活细胞的功能。
实施例18表示令人吃惊的是Ig主链送递内送递的肽既不是免疫复合物又不是受体交联抗体，它导致了I类限制的免疫反应.的诱导。这种反应具有不同于通过活的病毒诱导的谱(Tc2型，由IL-4而不是IFN-γ的产生组成)。
通过皮下注射用包括I类MHC-限制的肽TYTQTRALV(Seq.I.D.No.6)的50μg的recNP(Kd)-IgG注射BALB/c小鼠。2周之后处死所述小鼠，并且通过ELISPOT分析按以下方法测定肽-特异性细胞因子：在4℃下，用存在于无菌PBS(50μl/孔)中的纯化的抗-细胞因子Abs(对于抗-IL2和抗-IL4来说为4μg/ml，而对于抗-IFNγ来说为8μg/ml，购自BD Pharmingen)温育ELISPOT平板(Millipore，Molsheim，France)过夜。次日，用DMEM培养基洗涤所述平板2次，并且，在37℃下用200μl/孔含有FBS的完全DMEM封闭1小时。
用脾制备单细胞悬浮液，裂解红细胞，洗涤细胞，计数并且以5×105/孔的密度与各种浓度的NP肽一起温育。在37℃，5％CO2中温育平板72小时。3天之后，用PBS-tween20 0.05％(洗涤缓冲液)洗涤平板5次，并且用100μl/孔的溶解在PBS-tween20 0.05％-FBS 0.1％(ELISPOT缓冲液)中的生物素化的抗-细胞因子Abs，2μg/ml在4℃下温育过夜。次日用洗涤缓冲液洗涤平板5次，并且用通过ELISPOT缓冲液稀释的1∶1000抗生物素蛋白链菌素-HRP温育1小时。用3-氨基-9-乙基咔唑底物(Sigma，St.Luis，MO)对所述反应显影，并且，用自来水洗涤所述平板两次而终止反应。让所述平板在室温下干燥24小时。
数据是用具有ImagePro-Plus)软件(Media Cybernetics，SilverSpring，MD)的自动化系统(Navitar，Rochester，NY)获得的。所述结果在图19A中表示为成斑点集落(SFC)的总数/脾(平均为n＝3)。作为对照，使用了幼稚小鼠或用105TCID50的活的WSN流感病毒进行腹膜内注射的小鼠。
19A-19B中的结果表示与用具有相关肽的流感病毒菌株进行病毒免疫相反，Ig-介导的肽送递在引发IFN-γ生产Tc1细胞方面是无效的.不过，施用Ig-肽仍然导致了I类MHC-肽复合物的形成，并且诱导了存在于由产生IL-4的Tc2细胞组成的显著的NP-特异性I类MHC-限制的T细胞免疫。
实施例19表示用疾病相关表位体内加载选定的APC通过扩增而不是减少表位-特异性自身反应性T细胞抑制了加重形式的自身免疫。
用乳化在完全弗氏佐剂中的200μl大鼠脑匀浆物对SJL小鼠进行皮下注射，并且在6小时和2天之后用50ng的百日咳毒素进行加强免疫。所述小鼠产生了恶化的，进展形式的瘫痪疾病。半数小鼠通过皮下注射分别接受具有MBP和PLP表位的重组免疫球蛋白的组合(recMBP(I-As)-IgG；recPLP(I-As)-IgG)(150μg/分子，在诱导疾病之后第8，12，18天)。在图片A中，分别示出了处理过的和未处理过的小鼠平均临床得分(n＝8)。
在观察70天之后，处死所述小鼠，收集脾，并且按以下方法进行ELISPOT分析：在4℃下，用存在于无菌PBS(50μl/孔)中的纯化的抗-细胞因子Abs(对于抗-IL2和抗-IL4来说为4μg/ml，而对于抗-IFNγ来说为8μg/ml，购自BD Pharmingen)温育ELISPOT平板(Millipore，Molsheim，France)过夜。次日，用DMEM培养基洗涤所述平板2次，并且，在37℃下用200μl/孔含有FBS的完全DMEM封闭1小时。用脾制备单细胞悬浮液，裂解红细胞，洗涤细胞，计数并且以1×106/孔的密度与20μg/ml的肽(PLP或MBP)或仅与培养基一起温育，以便评估背景。
在37℃，5％CO2中温育平板。3天之后，用PBS-tween20 0.05％(洗涤缓冲液)洗涤平板5次，并且用100μl/孔的溶解在PBS-tween20 0.05％-FBS 0.1％(ELISPOT缓冲液)中的生物素化的抗-细胞因子Abs，2μg/ml在4℃下温育过夜。次日，用洗涤缓冲液洗涤平板5次，并且用通过ELISPOT缓冲液稀释的1∶1000抗生物素蛋白链菌素-HRP温育1小时。用3-氨基-9-乙基咔唑底物(Sigma，St.Luis，MO)对所述反应显影，并且，用自来水洗涤所述平板两次而终止反应。让所述平板在室温下干燥24小时。
数据是用具有ImagePro-Plus)软件(Media Cybernetics，SilverSpring，MD)的自动化系统(Navitar，Rochester，NY)获得的。结果(图20B)表示为在没有添加PLP肽的情况下产生IL-4的T细胞集落的频率对在肽刺激条件下产生IFN-γ的T细胞频率作图。进展成完全的肢体瘫痪的小鼠(得分数等于或大于1.5)用实心的符合表示。没有出现肢体瘫痪的小鼠用空心的符号表示。在图20C中，在体外刺激条件下IL-4成斑点集落/脾(平均值±SEM)的总数用零，MBP或PLP肽表示。包括由来自用IgG2b同种型对照处理过的小鼠的脾细胞组成的其他对照。同时，在存在中和性抗-IL-4mAb(40μg/ml)的条件下进行体外培养，并且在图片D中示出了产生IFN-γ的T细胞的数量。
图20A-D中的结果表示通过使用重组IgG同时施用MBP和PLP表位能显著抑制疾病的慢性进展。没有出现瘫痪的小鼠出乎预料地产生了对自身表位MBP和PLP的增强了的反应性，分别表现为增强了的基础和肽刺激的IL-4或IFN-γ生产。最后，通过IL-4抑制产生IFN-γ的T细胞的反应性表明通过IgG-介导的表位送递诱导了复杂的免疫调节机制。
实施例20根据在实施例1-19中提供的数据归纳了IgG/FcγR-介导的表位送递对T细胞反应的影响。
首先，反应于IgG-介导的T细胞表位的送递的APC T细胞的加载受两种功能上相反的受体的控制：APC上的具有ITIM和ITAM Fc(γ+)的受体。ITIM+FcγRIIB+能限制T细胞的激活程度，而γ+FcRs是在通过IgG主链送递表位时有效形成MHC-肽复合物所需要的。这种体内送递的表位导致了MHC-肽复合物在外周CD11c+和CD11b+APC，而不是胸腺APC上的形成。不过，ITIM+和ITAM+FcγRs之间的相互影响使得所造成的T细胞反应的性质和强度在不进行实验的情况下难于预测。
图21中的数据表示肽表位的IgG送递导致了T细胞在有限的共刺激情况下接触肽加载的APC，对幼稚的和激活的T细胞具有不同的作用：1)Th2，Tc2，Th3，Tr1细胞的从头诱导，和，2)下调激活的Th1，Th2细胞，同时刺激激活的Tr1和Th3细胞。总体效果是免疫调控，而不是促炎(与Th1和Tc1免疫相关)。
实施例21.天然存在的dsRNA将先天和获得性免疫反应联系在一起。
实施例21表示在流感病毒感染期间产生的天然的，非感染性双链RNA对针对蛋白抗原的特异性免疫反应具有显著影响。
用WSN流感病毒(108 TCID50/1×109细胞)感染允许性MDCK细胞，并且在24小时之后收获所述细胞，洗涤，并且用RNA分离试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)提取总RNA。通过用无RNAse的DNAseI(Stratagene，San Diego，CA)处理进一步纯化所述RNA。然后通过在37℃下用5U的S1核酸酶(Ambion，Inc.，Austin-TX)/μg的RNA温育30分钟，除去样品中的单链RNA。在消化之前和之后，通过凝胶电泳分析所述RNA。通过标准流感病毒滴定证实纯化的dsRNA的感染性的缺乏。作为对照，使用了用类似方法纯化并且处理的来自109非感染性MDCK细胞的材料。通过分光光度分析测定核酸浓度(A260nm)，并且通过Limulus测定证实内毒素的缺乏。分别使用纯化的RNA和对照RNA，或作为与gp140重组抗原混合物使用(25μg的RNA和2μg的抗原，存在于25ml的无菌PBS中)。
在证实缺乏感染性之后，将40μg的dsRNA或对照RNA与40μg的重组截短的抗原(HIV外被的gp140)混合，并且通过鼻腔灌输给BALB/c小鼠施用(n＝3/组)。其他对照是用存在于盐水中的40μg的gp140蛋白免疫的(n＝3/组)。在激发2周之后对所述小鼠进行一次加强免疫。在加强免疫2周之后采集血液，制备血清，并且通过ELISA测定对gp140的抗体反应。简单地讲，用抗原(2μg/ml的gp140)对孔进行包被，并且用SeaBlock(Pierce，Rockford-IL，catalog#37527)封闭。在室温下将血清的系列稀释液和支气管灌洗液温育至少2小时。在洗涤之后，用碱性磷酸酶(Sigma，cat#A7434)偶联的抗小鼠IgG抗体，然后添加底物(pNPP，Sigma，cat#N2765)而对测定进行显影，并且通过使用装有SoftMax软件的自动化微量滴定板读数器(Molecular Devices，ThermoMax)进行测定。
在图22A中，示出了所述实验的一般原理。在图22B中，示出了在进行测定显影之后的吸收，相当于对于完整IgG来说的各种血清稀释液。在图22B中，示出了对于IgG2a和IgG1抗体同种型来说的1/50血清稀释液的吸收。
总体上讲，图22A-B中的数据表示来自流感病毒感染的MDCK细胞的天然的，非感染性dsRNA对原型抗原的适应性反应具有出人意料的增强了的作用。IgG1和IgG2a抗体反应同时增强表明诱导了强的T辅助1和T辅助2反应。
实施例22.选定的RNA基序对先天免疫反应的影响：异源基序。该实施例出乎意料地证实了不同合成的RNA基序对针对蛋白抗原的获得性特异性免疫反应具有不同作用。
图23A表示合成的RNA基序的广泛的文库，将所述文库分组为合并物，并且按以下方法用于双重筛选过程：
(A)用RNA合并物对所述小鼠进行气管内免疫，随后间隔2周进行2次加强免疫，是通过鼻腔灌输进行的。通过ELISA测定的抗体反应(图23B)表示为IgG终点滴度的平均值±SEM(n＝4/组)。作为对照，使用了存在于无菌PBS中的剂量匹配的OVA，OVA分别具有霍乱毒素亚基B(CTB)和单独的PBS。简单地讲，用抗原对孔进行包被(10μg/ml的OVA)并且用SeaBlock(Pieree，Rockford-IL，catalog#37527)封闭。在室温下将血清和支气管灌洗液的系列稀释液温育至少2小时。在洗涤之后，用碱性磷酸酶(Sigma，cat#A7434)偶联的抗小鼠IgG抗体，然后添加底物(pNPP，Sigma，cat# N2765)而对测定进行显影，并且通过使用装有SoftMax软件的自动化微量滴定板读数器(Molecular Devices，ThermoMax)进行测定。
(B)各种dsRNA基序对针对OVA的抗体反应诱导的影响：结果如图23C所示。数据是两次独立实验的结果。插图：对OVA的平均IgG2a和IgG1滴度的比值。为此，使用了生物素-缀合的抗小鼠IgG1和IgG2a抗体，随后与抗生物素蛋白链菌素-AKP缀合物温育。从左到右的序列与图23C中的主图类似：PBSOVA，CTBOVA，pC：pGOVA，pI：pCOVA和pA：pUOVA。
(C)通过OVA和各种dsRNA基序在雌性C57BL/6小鼠体内诱导的T细胞反应的强度和谱。为了测定细胞反应，通过让器官从70微米的尼龙Falcon过滤器(Becton Dickinson，cat#352350)中通过获得脾细胞悬浮液，然后用红细胞裂解冲液(Sigma，cat#R7757)裂解红细胞。来自肺相关淋巴组织的淋巴细胞是通过用胶原酶(Sigma，cat#C9891)消化肺组织，然后通过Ficoll-Paque(Amersham Pharmacia，cat# 17-1440-02)梯度离心而分离的。通过ELISPOT分析按以下方法测定T细胞反应：用4μg/ml的大鼠抗小鼠抗-IFNγ，IL-2或IL-4单克隆抗体(分别为BD-PharMingen，cat#554430，cat#18161D，cat#554387)对96孔45微米混合的纤维素酯平板(Millipore，cat#MAHAS4510)进行包被。在37℃下用通过无菌盐水中的10％FCS封闭1小时，然后以5×105细胞/孔的密度添加脾细胞悬浮液，有或没有抗原/肽。为了刺激，使用了分级数量的抗原(OVA)。在刺激72小时之后，用生物素化的大鼠抗小鼠细胞因子抗体(BD-PharMingen)，然后用抗生物素蛋白链菌素-HRP(BioSource Int.，Camarillo，CA)和不溶性AEC底物进行显影。结果是使用装配有多参数测定分析软件(ImagePro，Media Cybernetics)的自动成像系统(Navitar/Micromate)测定的。结果在图23D中以每个脾的IFN-γ和IL-4成斑点集落(SFC)的平均值±SEM的形式表示(n＝4/组)。结果是两次独立实验的值。
图23B-D中的结果表示不同的合成的RNAs对针对原型蛋白抗原的B和T细胞反应具有增强的作用。另外，包括特定核苷酸组合的不同的基序在T1与T2诱导方面具有特定作用，并且随后发生了免疫球蛋白同种型转变。
实施例23.用选定的合成RNA基序促进产生IFN-γ的I类MHC-限制的Tcl细胞的诱导。
(A)用10μg的重组工程生产的HIVgp140抗原与pA：pU处理过的BALB/c小鼠(激发加上两次加强)研究了通过dsRNA基序刺激的交叉激发。按照实施例22所披露的ELISPOT分析测定所述反应，用源于V3结构域的I类MHC-限制的相关肽R10K进行体外刺激。作为对照，使用了剂量匹配的gp140抗原。所述结果在图24A中表示为IFN-γ和IL-4 SFC/脾的数量的平均值±SEM(n＝4/组)。
(B)通过实施例22所披露的ELISPOT分析，用100μg完整OVA与pA：pU处理的C57BL/6小鼠研究了通过dsRNA基序刺激的交叉激发，用I类MHC-限制的肽SIINFEKL(Seq.ID No.)进行体外刺激。作为对照，使用了存在于盐水或无茵PBS中的剂量匹配的OVA抗原。结果在图24B中表示为IFN-γ和IL-4 SFC/脾的数量的平均值±SEM(n＝4/组)。
图24A-B表示选定的合成RNA基序能够促进对包括在较大抗原(多肽)内的不同I类MHC-限制的肽的增强了的T细胞免疫。该免疫反应包括Te1成分，由能产生IFN-γ的I类MHC-限制的T细胞组成。
实施例24表示出人预料的是，不同的合成的RNA基序与不同的受体结合；换句话说，存在多种能分辨RNA基序的受体。
通过FACS分析测定了荧光标记的pA：pU对CD11b+APC的体外结合。在4℃下将MACS-分离的APC与10μg/ml的标记过的pA：pU([pA：pU]-F)一起温育30分钟，洗涤并且分析。另外，将APC分别与20或100μg/ml的未标记过的pA：pU，pA或pI：pC温育10分钟，然后用标记过的pA：pU染色并且进行FACS分析。在每一幅图中通过对数x轴示出了染色的(空心区)，未染色的(实心区)细胞的谱和高度染色的APC的百分比。数据表示每一个样品获得的10,000次事件的两次独立测定的结果。
材料：
1.小鼠CD11b，CD11c磁力分离珠：Miltenyi Biotec，分别为cat#130-049-601，cat# 130-052-001；
2.ULYSIS核酸标记试剂盒：Alexa 488，Molecular Probes cat#U21650；
3.RNA基序：
●pA：pU，(Sigma，Lot# 22K4068)；
●pI：pC，(Sigma，Lot# 52K4047)；
●pA，(Sigma，Lot# 22K4022)；
4.FACS缓冲液：PBS，1％FCS，0.1％叠氮化钠；
5.MACs缓冲液：PBS，2mM EDTA，0.5％BSA；
6.胶原酶缓冲液：0.225mg BSA，0.0062mg胶原酶，存在于50mlRPMI；和，
7.70μm细胞过滤器：(Falcon/Becton Dickinson，cat#352350)。
方法：
I.RNA基序的标记：
1.在以下方法中，用ULYSIS Alexa 488标记来标记每一种RNA基序。
II.脾细胞制备：
1.从4只雌性C57 BL/6小鼠体内分离脾细胞和肺细胞；
●与脾细胞不同，肺细胞必须切碎并且在37℃下在胶原酶缓冲液中温育30分钟，然后进行随后的步骤；
●通过70μm falcon细胞过滤器；
●洗涤并且重新悬浮在MACS缓冲液中：
2.按照推荐的方法用CD11b或CD11c特异性MACS珠进行标记；
3.然后用以下成分处理细胞：
●在室温下用未标记过的pA，pA：pU，或pI：pC(20或100μg/ml)处理10分钟；
●分别以1.5μg/管和10μg/管的用量添加ULYSIS标记过的pA或pA：pU，以便与每一种基序的染料：dsRNA比例匹配。
4.混合并且在冰上温育30分钟。
5.洗涤1次，并且重新悬浮在FACS缓冲液中。
III.流式细胞术：
进行流式细胞分析，以便测定/比较标记过的和未标记过的RNA基序的竞争性抑制作用和细胞受体结合。
图25中的结果表示pA：pU和pI：pC结合不同的T细胞受体。由于pI：pC结合TLR3，它导致了不同于TLR3的其他受体参与了RNA识别免疫功能。
实施例25表示选定的合成RNA基序引发了对免疫学活性重要的趋化因子基因的体内表达。
通过DNA阵列技术测定了通过dsRNA基序诱导的趋化因子基因表达的局部上调，其中使用来自肺组织的RNA，所述RNA是在通过呼吸道用药之后1天提取的。利用Rneasy试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)从肺中分离总RNA。通过用无RNase的DNase I(Stratagene，SanDiego，CA)处理进一步纯化RNAs。DNA阵列是通过使用购自SuperArray Inc.(Bethesda，MD)的Nonrad-GEArray试剂盒进行的。简单地讲，使用MMLV逆转录酶与含有生物素-16-dUTP的dNTP合成cDNA探针。在68℃下将所述GEArray膜预杂交1-2小时。通过与生物素标记的cDNA一起温育所述膜而进行杂交。杂交过的膜用2×SSC-1％SDS洗涤2次，并且用0.1×SSC-0.5％SDS洗涤2次。所述膜用碱性磷酸酶-缀合的抗生物素蛋白链菌素(BioSource Int.，Camarillo，CA)进一步温育，并最终用CDP-Star化学发光底物显影。用装有Gel-Pro软件的Image-Pro分析系统(Media Cybernetics，Silver Springs，MD)测定信号强度。
结果表示为相对在未处理过的小鼠的肺组织中测定的表达水平的基因表达的增加倍数。将通过dsRNAs引发的趋化因子表达模式(分别为50μg的pA：pU和pI：pC)与通过1μg的LPS诱导的表达模式进行比较。能选择性地结合Th1和Th2细胞上的受体的趋化因子分别用连续的和不连续的线条表示。
图26中的结果表示pA：pU和pI：pC能引发多种趋化因子的表达，并且所述表达模式是基序依赖型的，并且不同于通过LPS(内毒素)引发的表达。
实施例26表示选定的合成RNA基序能够动员免疫防御，这种防御能够控制肺部病毒的感染。
dsRNA基序具有动员抗流感病毒感染的免疫防御的不同的能力。在用亚致死剂量的流感病毒进行肺部感染之前和之后1天，通过呼吸途径用50μg的pI：pC，pA：pU或50μl的盐水处理C3H/HeJ小鼠。为了进行病毒侵袭，通过鼻腔途径用亚致死剂量的(104组织培养物感染剂量50％-TCID50)的活的WSN病毒感染用Metofane麻醉的C57BL/6和TLR4-/-C3H/HeJ小鼠。在感染之后1天，处死所述小鼠，取出肺，匀浆并且在-70℃下保存。通过以下方法测定病毒滴度：将样品的系列稀释液与允许性MDCK细胞温育48小时，然后用鸡红细胞(购自AnimalTechnologies)进行标准红细胞凝聚。用内插法通过三次测定估算终点滴度，并且表示为TCID50/器官(平均值±SEM；n＝6/组；结果是用C3H/HeJ TLR-4-/-和感受态小鼠进行两次独立研究的结果)。用TLR4感受态C57BL/6小鼠获得了类似结果。
因此，在图27中示出的结果表示通过使用选定的合成RNA基序(dsRNA1是pA：pU，而dsRNA2是pI：pC)可以实现对流感病毒复制的控制。
实施例27表示共同施用选定的合成RNA基序能打破对高剂量标准抗原的耐受性。
dsRNA基序能防止在用IgG注射的小鼠体内出现高区耐受性。首先用致耐受剂量的单独的200μg的hIgG(实心符号)或与100μg的pI：pC或pA：pU一起(空心符号)对所述小鼠(C57BL/6)进行静脉内注射，并且随后用乳化在CFA中的免疫原性剂量的100μg的hIgG进行皮下加强免疫。通过ELISA测定抗hIgG的抗体滴度(正如在实施例23中所详细推论的，不同的是将10μg/ml的hIgG用于包被)，测定是在首次注射之后的不同间隔时间进行的。作为对照，包括用乳化在CFA中的100μg的hIgG免疫的小鼠，并且在曲线上示出了最大滴度(虚线)。
所述结果在图28中表示为终点滴度的平均值±SEEM(n＝5/组)。在TLR4缺陷型(C3H/HeJ)和LPS-反应型C3H/SnJ小鼠体内获得了类似结果。因此，图28中的结果表示选定的合成RNA基序pI：pC和pA：pU能大大抑制高区耐受，这种耐受性通常与施用大量的纯化的蛋白相关。
实施例28表示选定的RNA基序能诱导人APC的细胞因子生产。
将分化之后的人THP-1单核细胞与不同浓度的合成的RNA(pA：pU，pI：pC或pA)一起温育24小时，并且收集细胞上清液。通过ELISA测定IL-12或TNF-α的浓度。结果在图29中以每一种细胞因子的pg/ml(浓度)和培养条件形式表示。
材料：
1.THP-1人单核细胞系：ATCC，cat # TIB-202；
2.IL-12细胞因子：人ELISA，IL-12超敏(US)cat# KHC0123；
3.TNFα细胞因子：人ELISA，TNF αcat# KHC3012；
4.RNA基序：
●pA：pU，(Sigma，Lot# 22K4068)；
●pI：pC，(Sigma，Lot # 52K4047)；和，
●pA，(Sigma，Lot # 22K4022)。
方法：
1.在添加存在于含有10％FCS的培养基中的10ng/ml PMA之后，让THP-1细胞分化。
2.轻柔地洗涤细胞并且添加不含FCS的培养基(HL-1)，然后将浓度为3-100μg/ml的处理剂(RNA基序和对照)添加到贴壁的THP-1细胞顶部。
3.在温育24小时之后，收获细胞上清液，并且通过ELISA测定IL-12和TNFα浓度。
图29中的结果表示选定的合成RNA基序能影响人单核细胞；另外，根据所述基序的化学结构(核苷酸组成)，这种作用是多种多样的。选定的，而不是所有的合成的RNA基序能够引发人单核细胞产生IL-12，它是重要的T1调控细胞因子。
实施例29表示两种不同的合成的RNA基序以表现出与不同受体的相互作用的方式与人THP-1单核细胞结合。
在室温下将THP-1细胞与不同量的未标记过的合成RNA一起温育15分钟。然后，添加标记过的pA：pU，在4℃下温育30分钟，洗涤细胞，并且通过FACS分析进行荧光定量。结果在图30A-30B中表示为相当于大的细胞亚型(A)和总的细胞群(B)的分布图。在每一幅图上示出了染色细胞的百分比。
材料：
1.ULYSIS：核酸荧光标记(Molecular Probes，cat#U-21650)。
2.RNA基序：
●pA：pU，(Sigma，Lot # 22K4068)；
●pI：pC，(Sigma，Lot # 52K4047)；
3.Detoxi-凝胶柱：(Pierce，cat# 20344)。
方法：
聚腺苷酸-聚尿苷酸(pA：pU)的标记：
1.在用Detoxi-柱除去内毒素之后，利用ULYSIS核酸标记系统，用Alexa Fluor 488荧光标记标记pA：pU。
2.简单地讲：
●在-70℃下用乙酸钠和乙醇沉淀pA：pU；
●使pA：pU热变性，并且在90℃下用Alexa Fluor 488试剂进行标记；和
●终止所述反应，并且对标记过的pA：pU进行乙醇沉淀。
细胞处理：
1.以2×106细胞/ml的密度悬浮THP-1细胞；
2.将50μl的上述悬浮液(5×104细胞)放入12×75mm的试管中；
3.以20或100μg/ml的浓度将未标记过的pA：pU或pI：pC添加到THP-1细胞中，并且温育15分钟；
以100μg/ml的浓度添加ULYSIS标记的pA：pU，在冰上温育30分钟。
4.洗涤THP-1细胞一次，并且悬浮在FACS缓冲液中，然后进行流式细胞分析，以便确定不同处理群体之间的相对荧光差别。
图30A-30B中的结果表示未标记过的pA：pU，而不是未标记过的pI：pC能够与标记过的pA：pU竞争结合人THP-1单核细胞，在大的细胞亚类和完整群体水平上都是如此。
实施例30表示应当如何制备所述佐剂合成的RNA并且在使用之前以它的最有效的形式纯化。
总体的合成RNA材料是通过有机合成的标准方法获得的。然后，将所述材料溶解在无菌的无内毒素的盐水中，通过除去内毒素的柱，直到LPS的浓度低于0.005EU/μg。LPS的测定是通过标准Limulus测定方法进行的。然后，通过从具有特定孔度的过滤器中通过的一系列离心步骤分离所述材料(参见图31)。
有用的级份包括小于20到最大100bp的合成的RNA，不过，可以使用更大的RNA片段。在纯化之后，测定所述材料，并且通过标准测定验证：光谱测定(OD260nm)；凝胶电泳；通过Limulus测定进行的内毒素定量；对人THP-1细胞的生物活性(参见实施例28)。
实施例31表示出乎意料的是，选定的合成RNA化合物的不同的级份根据大小赋予了不同的生物学活性。
将分化的人THP-1单核细胞与不同浓度的合成的RNA(pA：DU，按实施例3所述方法分级分离)一起温育24小时，并且收集上清液。通过ELISA方法，使用BioSource International试剂盒(Camarillo，CA)测定TNF-α的浓度。结果在图32中表示为每一种温育条件的pg/ml(浓度)。
图32中的结果表示选定的合成RNA化合物的较低分子量的级份在人单核THP-1细胞的细胞因生产方面赋予了较高的生物学活性。
实施例32.出乎意料的是，选定的合成RNA基序在产生抗-RNA抗体方面具有不同的免疫谱。
用50μg+50μg的hIgG和合成的RNA(pI：pC或pA：pU)对BALB/c小鼠进行腹膜内和皮下免疫，并且在1周之后制备血清样品。作为对照，使用了用存在于盐水中的hIgG注射小鼠。通过ELISA测定抗pA：pU，pI：pC，pA和hIgG的dsRNA IgG抗体滴度。简单地讲，用抗原(10μg/ml的hIgG或合成的RNAs)对孔进行包被，并且用SeaBlock(Pierce，Rockford，IL，catalog # 37527)进行封闭。将血清和支气管灌洗液的系列稀释液在室温下温育至少2小时。在洗涤之后，用碱性磷酸酶偶联的抗小鼠IgG抗体(Sigma，cat# A7434)进行所述测定，然后添加底物(pNPP，Sigma，cat# N2765)，并且利用装有SoftMax软件的自动微量滴定板读数器(Molecular Devices，ThermoMax)进行测定。
结果在图33中表示为终点滴度的平均值±SEM(n＝3/组)。图33中的结果表示pI：pC，而不是pA：pU诱导了针对它自身的抗体反应。具有抗另一种RNA基序的交叉反应性成分。
实施例33.通过重组IgG体内加载APC导致了只有在满足其他条件的情况下才能产生Tcl型的I类MHC反应。
用与50μg的选定的合成RNA(pA：pU或pI：pC)混合的50μg的recIgG-NP(Kd)对BALB/c小鼠进行皮下免疫。作为对照，使用了幼稚小鼠或仅用重组IgG免疫的小鼠。在免疫3周之后，通过ELISPOT分析按以下方法测定T细胞反应：在4℃下，用存在于无菌PBS(50μl/孔)中的纯化的抗-细胞因子Abs(对于抗-I L4来说为4μg/ml，而对于抗-IFNγ来说为8μg/ml，购自BD Pharmingen)温育ELISPOT平板(Millipore，Molsheim，France)过夜。次日，用DMEM培养基洗涤所述平板2次，并且，在37℃下用200μl/孔含有FBS的完全DMEM封闭1小时。用脾制备单细胞悬浮液，裂解红细胞，洗涤细胞，计数并且以5×105/孔的密度与NP 147-155肽或仅与培养基一起温育，以便评估背景。在37℃，5％CO2中温育平板72小时。3天之后，用PBS-tween20 0.05％(洗涤缓冲液)洗涤平板5次，并且用100μl/孔的溶解在PBS-tween20 0.05％-FBS 0.1％(ELISPOT缓冲液)中的生物素化的抗-细胞因子Abs，2μg/ml在4℃下温育过夜。
次日，用洗涤缓冲液洗涤平板5次并且用通过ELISPOT缓冲液稀释的1∶1000抗生物素蛋白链菌素-HRP温育1小时。用3-氨基-9-乙基咔唑底物(Sigma，St.Luis，MO)对所述反应显影，并且，用自来水洗涤所述平板两次而终止反应。让所述平板在室温下干燥24小时。
数据是用具有ImagePro-Plus)软件(Media Cybernetics，SilverSpring，MD)的自动化系统(Navitar，Rochester，NY)获得的。测定了与NP肽起反应的能产生细胞因子的T细胞的频率，并且表示为相对用于刺激的肽的量。结果表示为三次重复的平均值±SEM(n＝3小鼠/组)。
正如在前面的图19中所示出的，施用具有NP I类MHC-限制的表位的重组IgG，导致了Tc2免疫的产生，而不是Tc1反应，意味着具有特定共刺激谱的I类-肽复合物的体内形成。图34A和34B中的结果表示共同使用选定的合成RNAs促进了在IgG介导的I类MHC-限制的表位的送递之后IL-2和IFN-γ的有效诱导(dsRNA1是pA：pU而dsRNA2是pI：pC)。
实施例34：通过FcγR的APC加载和通过RNA受体的激活的同时操作有效形成了I类MHC-肽，并且指导所产生的T细胞反应。
从幼稚的BALBc小鼠体内分离脾APC，并且用1μg NP肽，或50UgrecIgG-NP(Kd)进行离体的刺激过夜，使用或不使用50μg/ml选定的合成dsRNA(pA：pU)。洗涤所述细胞，并且通过给幼稚BALB/c小鼠皮下和腹膜内注射等量的5×106细胞进行施用。3周之后通过ELISPOT分析按以下方法测定所述反应：在4℃下，用存在于无菌PBS(50μl/孔)中的纯化的抗-细胞因子Abs(对于抗-IL4来说为4μg/ml，而对于抗-IFNγ来说为8μg/ml，购自BD Pharmingen)温育ELISPOT平板(Millipore，Molsheim，France)过夜。次日，用DMEM培养基洗涤所述平板2次，并且，在37℃下用200μl/孔含有FBS的完全DMEM封闭1小时。用脾制备单细胞悬浮液，裂解红细胞，洗涤细胞，计数并且以5×105/孔的密度与30μg/ml，10μg/ml，或3μg/ml NP肽或仅与培养基一起温育，以便评估背景。在37℃，5％CO2中温育平板72小时。3天之后用PBS-tween20 0.05％(洗涤缓冲液)洗涤平板5次，并且用100μl/孔的溶解在PBS-tween20 0.05％-FBS 0.1％(ELISPOT缓冲液)中的生物素化的抗-细胞因子Abs，2μg/ml在4℃下温育过夜。次日，用洗涤缓冲液洗涤平板5次，并且用通过ELISPOT缓冲液稀释的1∶1000抗生物素蛋白链菌素-HRP温育1小时。用3-氨基-9-乙基咔唑底物(Sigma，St.Luis，MO)对所述反应显影，并且，用自来水洗涤所述平板两次而终止反应。让所述平板在室温下干燥24小时。
数据是用具有ImagePro-Plus)软件(Media Cybernetics，SilverSpring，MD)的自动化系统(Navitar，Rochestcr，NY)获得的。结果在图35中表示为产生细胞因子的成斑点集落的频率与用于离体刺激的肽的浓度(平均值±SEM，n＝3小鼠/组)。另外，对于IFN-γ和IL-4来说，对平均面积/集落与用于刺激的肽的浓度进行作图(任意单位)。
图35中的结果表示通过重组IgG进行的离体APC加载与使用肽自身相比，在形成I类MHC-肽复合物和产生Tc反应方面明显更有效。另外，在通过IgG/FcγR进行的表位送递之后仅有的I类MHC-肽复合物的形成，导致了能产生IL-4而不是IFN-γ的Tc2细胞的分化。用选定的合成RNA同时处理APC，导致了所述T细胞谱拓宽到产生IFN-γ的Tc1细胞。
实施例35表示用IgG-肽和选定的共刺激基序共同激发，导致了在病毒感染之后I类MHC-限制的T细胞的更有效的二次扩增。
分别用recIgG-NP(Kd)，pA：pU，或组合注射BALB/c小鼠(50μg/注射)。作为对照，使用了幼稚小鼠。处理3周之后，通过呼吸道用104 TCID50的A/WSN/32 H1N1流感病毒感染所述小鼠。感染四天之后，在用NP肽进行离体刺激之后，通过ELISPOT分析按照以下方法测定脾中的T细胞特征：在4℃下，用存在于无菌PBS(50μl/孔)中的纯化的抗-细胞因子Abs(对于抗-IL2和抗-IL4来说为4μg/ml，而对于抗-IFNγ来说为8μg/ml购自BD Pharmingen)温育ELISPOT平板(Millipore，Molsheim，France)过夜。次日，用DMEM培养基洗涤所述平板2次，并且，在37℃下用200μl/孔含有FBS的完全DMEM封闭1小时。用脾制备单细胞悬浮液，裂解红细胞，洗涤细胞，计数并且以5×105/孔的密度与20μg/ml NP肽或仅与培养基一起温育，以便评估背景。在37℃，5％CO2中温育平板72小时。3天之后，用PBS-tween20 0.05％(洗涤缓冲液)洗涤平板5次，并且用100μl/孔的溶解在PBS-tween20 0.05％-FBS 0.1％(ELISPOT缓冲液)中的生物素化的抗-细胞因子Abs，2μg/ml在4℃下温育过夜。次日，用洗涤缓冲液洗涤平板5次，并且用通过ELISPOT缓冲液稀释的1∶1000抗生物素蛋白链菌素-HRP温育1小时。用3-氨基-9-乙基咔唑底物(Sigma，St.Luis，MO)对所述反应显影，并且，用自来水洗涤所述平板两次而终止反应。让所述平板在室温下干燥24小时。
数据是用具有ImagePro-Plus)软件(Media Cybernetics，SilverSpring，MD)的自动化系统(Navitar，Rochester，NY)获得的。结果在图36中表示为形成产生细胞因子的集落的NP-特异性I类MHC-限制的T细胞的频率(平均值±SEM，n＝4小鼠/组)。
图36中的结果表示IgG介导的I类限制的表位的送递在共同施用选定的合成RNA时在激发I类限制的Tc1反应方面最有效。在用流感病毒感染之后，所述激发的前体快速扩增。
实施例36表示通过共同施用选定的RNA基序和插入IgG主链内的肽表位发生了能最有效地激发识别I类MHC-限制的表位的细胞毒性淋巴细胞。
按前面的实施例所披露的方法用recIgG-NP(Kd)对BALBc小鼠进行免疫和侵袭，并且在流感病毒感染4天之后处死。制备脾细胞，以5百万/ml的密度悬浮在HL-1培养基中，并且与10μg/ml的NP147-155肽一起，并且在存在5U/ml的重组IL-2的条件下共同温育5天时间。合并来自4只小鼠/组的脾细胞，并且在烧瓶中温育。
在扩增之后，通过Ficoll梯度离心回收活的细胞，洗涤并且以各种数量与固定数量的sp20目标T细胞一起在V形底平板上温育5小时，有或没有NP肽(20μg/ml)。在对平板离心之后收获上清液，并且通过使用Promega试剂盒(cat # G1780)测定LDH浓度。结果表示为在不同E∶T比例(效应物与目标比例)下的百分特异性裂解。
图37中的结果表示抗-病毒细胞毒性T细胞的有效激发需要用通过IgG送递的I类限制的表位有效地体内加载APC，同时通过选定的合成RNA基序，即pA：pU进行合适的指导。
实施例37表示用具有病毒I类MHC-限制的表位的IgG和选定的合成RNA基序进行免疫，提供了抗原型病毒的感染性侵袭的保护作用。
通过皮下注射用50μg的recIgG-NP(Kd)和50μg的选定的合成RNA(pA：pU)对BALB/c小鼠进行免疫。在免疫3周之后，用104TCID50的感染性WSN流感病毒侵袭所述小鼠，并且在5天之后处死。通过标准MDCK红细胞凝聚测定，按以下方法滴定肺匀浆物中的肺部病毒：在第一天，将MDCK细胞以2×104/孔/200μl的密度铺板到96孔平板上，并且在37℃，5％CO2中温育24小时。次日，将25μl的所述肺匀浆物在DMEM培养基中的10倍稀释液放在短时间(1分钟)胰蛋白酶处理过的MDCK平板上温育，重复三次，并且在37℃下温育。1小时之后，添加175μl的DMEM完全培养基，并且在37℃，5％CO2中温育平板48小时。两天之后，用鸡红细胞进行红细胞凝聚-抑制，与来自MDCK平板的细胞培养上清液一起在室温下温育30分钟，并且，结果表示为总的肺部病毒的平均值±SEM(n＝4小鼠/组)。作为对照，使用了未免疫过的小鼠。
图38中的结果表示用具有病毒I类限制的表位的重组IgG和选定的合成dsRNA(pA：pU)免疫接种，导致了能够在感染侵袭之后限制病毒复制的免疫反应的激发。
实施例38.图39表示用于测试基于Ig-肽的分子的效力的肿瘤模型。
业已将Balb-c小鼠(Kd限制的)用于建立肿瘤模型。通常将肿瘤细胞(1-15百万细胞，存在于100μL体积中)注射到所述小鼠的肋部(参见图39中上部照片中的箭头)。首先通过触诊所述部位检测原发肿瘤(即注射部位的肿瘤)，并且，随后通过用卡尺测定肿瘤尺寸进行定量(参见图39)。在一系列实验中，将所述小鼠骨髓瘤细胞系(SP2/0)——未转染过的细胞或稳定转染的能表达异源蛋白(在重链的CDR3区表达不同表位肽的重组IgG或完整的NP蛋白)的稳定转染过的细胞，用于在所述小鼠体内诱导肿瘤。异源蛋白在SP2/0细胞中的表达，提供了用于在免疫感受态小鼠体内检验各种抗肿瘤方法的特异性肿瘤相关的抗原(TAA)。通常，未处理过的小鼠在注射之后一周形成了可触摸到的原发实体瘤，它在随后的四周时间内会致病和导致死亡。对注射过的小鼠进行的尸体剖检发现了转移性病变(参见图39)。Sp2/0细胞是从原发肿瘤组织以及携带肿瘤的小鼠的脾培养的(数据未示出)。用表达重组IgG的质粒稳定地转染SP2/0细胞，除了导入所述重链的CDR3区的特定表位序列之外，所有部分都相同，例如，MHC I限制的NP表位(147-155号氨基酸，参见图39)。SP2/0细胞还可以用含有WSN病毒的完整的NP蛋白的编码序列的质粒稳定地转染，所述序列受CMV启动子的控制。所有转染过的细胞系产生的原发性肿瘤与野生型SP2/0细胞产生的肿瘤处在相同的框架内。
该肿瘤模型扩展到包括腺癌细胞系(4T1，ATCC CRL-2539，Kd限制的)，以前证实了能在Balb-c小鼠体内诱导转移性肿瘤。4T-1细胞系与上面所披露的SP/0细胞系类似。将1-1500万个4T-1细胞注射到Balb-c小鼠肋部，在与注射SP2/0细胞类似的时间框架内产生了可触摸到的原发性肿瘤，并最终导致死亡。通过尸体检查从各种器官中采集的组织证实了4T-1能够从脾，肺以及原发性肿瘤中回收(未示出)。4T-1是用上述NP-表达质粒稳定地转染的。与SP2/0细胞类似，4T-1细胞的转染不会影响肿瘤生长过程和疾病的致命性。
实施例39证实了通过使用重组IgG内的与肿瘤相关的T细胞表位和选定的共刺激RNA基序能在临床诊断之后成功地控制并且治疗肿瘤。
用SP2/0细胞(1500万个细胞，存在于100μL体积中)注射的Balb/c小鼠，所述细胞稳定表达重组IgG，它具有存在于重链(IgNP)的CDR3区的MHC I(Kd)NP表位肽。在注射后7天，所有小鼠都具有可触摸到的肿瘤，并且将所述小鼠随机分成三组：单独的共刺激基序(即由聚合pApU组成的dsRNA)；纯化的IgTAA蛋白(IgNP)；以及dsRNA pA：pU和纯化的IgTAA蛋白。治疗时间在图40中用箭头表示，并且每一次注射包括50μg的标明的化合物。出现转移性疾病并且死亡的小鼠在附图中用“D”表示。
以上数据表明，dsRNA(共刺激基序)和IgTAA(IgNP)的组合，在小鼠体内产生了显著的保护性反应，这些小鼠在治疗的开始阶段都具有原发性肿瘤。尽管用dsRNA或IgTAA化合物单独治疗的所有小鼠都会发病，用这两种化合物治疗的小鼠在治疗开始3周之后100％仍然活着，并且在处死时仍然处在良好的临床状态下，以便测定T细胞反应。以上数据表明，用TAA体内加载AFC(通过APC的Fc受体摄取IgNP而实现)不足以有效抗肿瘤反应。用IgNP和pApU dsRNA的组合处理过的小鼠表现出的肿瘤排斥和存活，突出了共刺激在用肿瘤相关的抗原治疗肿瘤时起到出来的重要作用。
总之，图40中的结果表示用肿瘤相关的抗原在体内有效加载AFC以及通过选定的合成RNA基序同时激活是有效控制肿瘤生长和诱导肿瘤排斥所必须的。
实施例40.在亚致死接种肿瘤细胞时，该实施例证实了对肿瘤抗原的亚最佳的反应可以通过用IgG主链内的肽表位和共刺激基序治疗纠正。
用SP2/0细胞注射Balb/c小鼠，该细胞能稳定地表达重组IgG(IgNP)，它包括存在于重链CDR3中的WSN病毒核蛋白的MHC I(Kd)表位(147-155号氨基酸)。所述细胞接种物为每只小鼠1百万个细胞(存在于100μL体积中)。观察所述小鼠直到在注射位点检测到可以触摸到的肿瘤。在这里测定所述肿瘤，留下8只小鼠不进行处理(对照)，而6只小鼠用纯化的IgTAA(即纯化的IgNP，2mg/kg)和dsRNA(pApU，4mg/kg)每周在肿瘤内进行注射。每周取出肿瘤进行测定。
图41的图片A表示8只对照小鼠中的6只中诱导的肿瘤是进展性的，并最终致死，其中这些小鼠中的2只完全自发排斥了肿瘤。图41的图片B表示用IgNP/dsRNA进行三次的每周治疗(由箭头表示)在6只小鼠中的4只刺激了完全的肿瘤排斥，并且在另一只小鼠中显著缓解。
图41中的结果表示用肿瘤相关的抗原对APC进行有效的体内加载，以及通过选定的合成RNA同时激活，能够引发对肿瘤相关的抗原的有效的免疫反应。
实施例41表示用IgG主链内的肿瘤表位和共刺激的合成dsRNA治疗携带肿瘤的小鼠导致了肿瘤浸润性淋巴细胞的激活状态的恢复。
用能表达NP-Kd表位的1千万个sp20转染瘤注射两只BALB/c小鼠。在形成肿瘤之后，用存在于盐水中的50μg选定的dsRNA基序(pApU)和50μg的“IgNP”-recIgG-NP(Kd)对一只小鼠进行肿瘤内注射。24小时之后处死所述小鼠，切除肿瘤，用胶原酶消化，通过70μm的过滤器过滤，并且在Ficoll梯度上分离活的细胞。用抗TCRβ，CD25或同种型对照的mAbs对细胞进行染色，并且通过FACS分析进行评估。所述结果表示为分布图，示出了染色细胞的百分比。
材料：
1.SP20细胞系(ATCC)；
2 BALB/c小鼠(Harland Sprague Dawley)；
2.Falcon 70微米过滤器(Becton Dickinson，cat# 352350)；
3.胶原酶(Sigma，cat# C-9891)；
4.BSA，级份V(Sigma，cat# A-4503)；
5.胶原酶缓冲液：0.225gm BSA+0.00625gm，存在于50ml RPMI中；
6.Ficoll-hypaque(1.077，Amersham，cat# 17-1440-02)；
7.FACS缓冲液：1％胎牛血清+0.1％叠氮化物，存在于PBS中；
8.抗体：均购自BD Pharmingen；和，
9.流式细胞计数器：FACSCalibur(Becton Dickinson)。
方法：肿瘤细胞分离和FACS分析：
1.6周之前按上述方法进行肿瘤诱导；
2.从BALB/c小鼠体内分离肿瘤；
3.用无菌剪刀将肿瘤切碎，并且添加10ml的胶原酶缓冲液；
4.温育40分钟，37℃；
5.使用3ml注射器柱塞迫使肿瘤通过70μm Falcon过滤器进入50ml试管中，同时用RPMI洗涤；
6.洗涤1次并且重新悬浮在4ml的热的RPMI缓冲液中；
7.将等体积的细胞悬浮液铺放在Ficoll上，在室温下以2000RPM的速度离心15分钟；
8.分离层，并且用HL-1缓冲液洗涤一次，并且重新悬浮在FACS缓冲液中，达到2×106/ml的密度，并且进行流式细胞分析；
9.将其余细胞用于ELISPOT分析；
10.将细胞放入12×75mm的试管中，50μl/试管，并且用FITC标记的抗小鼠抗体染色，2μg/管加10μl/管小鼠血清：
●同种型对照；
●抗-CD40；
●抗-CD8；
●抗-CD4；
●抗-CD25；
●抗-TCRγδ；
●抗-TCRβ；
11.在冰上温育30分钟；和，
12.用FACS缓冲液洗涤1次，并且重新悬浮在300μl FACS缓冲液中。
图42中的结果表示展示所述T细胞受体标记TCRβ的肿瘤浸润性淋巴细胞在用具有肿瘤相关表位的重组免疫球蛋白和选定的合成dsRNA基序治疗时获得了激活标记CD25的表达。
实施例42表示用IgG主链内的肽表位和选定的共刺激分子成功地治疗携带肿瘤的小鼠与Tc的特定分化形式相关，除了Tc2之外还包括Tc1。
正如在实施例40中所披露的，在用具有肿瘤相关表位的重组Ig和选定的合成dsRNA基序治疗之后小鼠成功地排斥了肿瘤，处死这种小鼠，并且通过ELISPOT分析测定抗肿瘤相关表位的T细胞反应。在4℃下，用存在于无菌PBS(50μl/孔)中的纯化的抗-细胞因子Abs(对于抗-IL2和抗-IL4来说为4μg/ml，而对于抗-IFNγ来说为8μg/ml，购自BD Pharmingen)温育ELISPOT平板(Millipore，Molsheim，France)过夜。次日，用DMEM培养基洗涤所述平板2次，并且，在37℃下用200μl/孔含有FBS的完全DMEM封闭1小时。
用脾制备单细胞悬浮液，裂解红细胞，洗涤细胞，计数并且以5×105/孔的密度与各种浓度的NP肽一起温育。在37℃，5％CO2中温育平板72小时。3天之后，用PBS-tween20 0.05％(洗涤缓冲液)洗涤平板5次，并且用100μl/孔的溶解在PBS-tween20 0.05％-FBS 0.1％(ELISPOT缓冲液)中的生物素化的抗-细胞因子Abs，2μg/ml在4℃下温育过夜。次日，用洗涤缓冲液洗涤平板5次，并且用通过ELISPOT缓冲液稀释的1∶1000抗生物素蛋白链菌素-HRP温育1小时。用3-氨基-9-乙基咔唑底物(Sigma，St.Luis，MO)对所述反应显影，并且，用自来水洗涤所述平板两次而终止反应。让所述平板在室温下干燥24小时。
数据是用具有ImagePro-Plus)软件(Media Cybernetics，SilverSpring，MD)的自动化系统(Nayitar，Rochester，NY)获得的。结果表示为成斑点集落的数量(平均值±SBM)相当于IL-4，IL-2和IFN-γ。作为对照，使用了未处理过的小鼠，这些小鼠不能排斥肿瘤(n＝4/组)。
图43中的结果表示能成功地排斥肿瘤的处理过的小鼠产生了针对治疗性Ig上的肿瘤相关表位的Tc1反应，以及Tc2免疫。相反，未能排斥肿瘤的小鼠仅产生了Tc2免疫。
实施例43表示在用IgG主链内的T细胞表位和选定的共刺激基序对携带肿瘤的小鼠进行特定处理之后诱导了有效的记忆反应。
按实施例40所述方法通过注射具有TAA的重组Ig和选定的合成RNA基序对携带sp2/0肿瘤的能表达NP-Kd TAA的小鼠进行治疗。在肿瘤排斥之后，通过用能表达NP-Kd表位的1500万个SP2/0细胞进行对侧的皮下注射侵袭所述小鼠。同时，用致肿瘤的/致死剂量的相同类型的细胞对4只对照幼稚小鼠进行类似注射。监测所述肿瘤的发展和大小，并且表示为从刺激开始的直径(mm)与时间。
图44中的结果表示通过所标明的治疗诱导的对肿瘤的成功的排斥之后是对用相同肿瘤随后进行侵袭的有效保护作用，表明了有效免疫记忆的产生。
实施例44令人吃惊地表示通过具有TAA的IgG和共刺激剂dsRNA基序诱导肿瘤排斥，导致了对缺乏TAA或展示TAA变体的多种肿瘤细胞变体的交叉保护作用。
对按实施例43所述方法进行过抗同源侵袭保护的小鼠用1500万个肿瘤细胞进行顺序刺激，这些肿瘤细胞是代表缺乏TAA(缺少抗原变体)或具有缺少NP-Kd表位的TAA变体的相同的肿瘤细胞。另外，作为对照，用不同类型的肿瘤细胞系(4T-1腺癌)侵袭小鼠，在图45A所附表格中示出。在每一种情况下，都包括幼稚的对照。
业已通过ELISPOT分析，用TAA(NP-Kd肽)，HA(II类MHC-限制的肽)，或从细胞裂解物中提取的蛋白刺激过的体细胞悬浮液，评估了小鼠对用多种肿瘤变体进行侵袭的T细胞免疫的状态。在4℃下，用存在于无菌PBS(50μl/孔)中的纯化的抗-细胞因子Abs(对于抗-IL2和抗-IL4来说为4μg/ml，而对于抗-IFNγ来说为8μg/ml，购自BD Pharmingen)温育ELISPOT平板(Millipore，Molsheim，France)过夜。次日，用DMEM培养基洗涤所述平板2次，并且，在37℃下用200μl/孔含有FBS的完全DMEM封闭1小时。
用脾制备单细胞悬浮液，裂解红细胞，洗涤细胞，计数并且以5×105/孔的密度与各种浓度抗原一起温育。在37℃，5％CO2中温育平板72小时。3天之后，用PBS-tween20 0.05％(洗涤缓冲液)洗涤平板5次，并且用100μl/孔的溶解在PBS-tween20 0.05％-FBS 0.1％(ELISPOT缓冲液)中的生物素化的抗-细胞因子Abs，2μg/ml在4℃下温育过夜。次日，用洗涤缓冲液洗涤平板5次，并且用通过ELISPOT缓冲液稀释的1∶1000抗生物素蛋白链菌素-HRP温育1小时。用3-氨基-9-乙基咔唑底物(Sigma，St.Luis，MO)对所述反应显影，并且，用自来水洗涤所述平板两次而终止反应。让所述平板在室温下干燥24小时。
数据是用具有ImagePro-Plus)软件(Media Cybernetics，SilverSpring，MD)的自动化系统(Nayitar，Rochester，NY)获得的。结果表示为成斑点集落的数量(平均值±SEM)，相当于IL-4，IL-2和IFN-γ。作为对照，使用了不能排斥肿瘤的未处理过的小鼠(n＝4/组)。作为对照，包括天然小鼠。数据表示为能产生细胞因子的细胞/器官的数量(平均值±SEM)(n＝3/组)。
图45A-45B中的结果(包括图45A中的表格)表示在所标明的处理之后出现的免疫，导致了肿瘤排斥，能免受用丧失抗原变体的侵袭，并且与产生细胞因子的细胞的总体扩增相关。这表明了通过推荐的方案促进了将抗肿瘤淋巴细胞的所有组成成分拓宽到免疫治疗分子所不具有的肿瘤相关抗原。

Claims (45)

1.一种在患者体内产生针对患者体内的抗原的免疫反应的方法，包括：
给所述患者施用免疫球蛋白或其部分，其中，所述免疫球蛋白具有连接于所述免疫球蛋白或其部分的所述抗原的至少一个肽表位，以及与RNA片段组合施用所述免疫球蛋白或其部分。
2.如权利要求1的方法，其中，所述免疫球蛋白或其部分以及所述RNA片段是同时施用的。
3.如权利要求1的方法，其中，所述免疫球蛋白或其部分以及所述RNA片段是分开施用的。
4.如权利要求1的方法，其中，所述患者是人。
5.如权利要求1的方法，其中，在给所述患者施用所述免疫球蛋白或其部分时，所述免疫球蛋白或其部分通过占据所述抗原呈递细胞的FcγR，对所述抗原呈递细胞进行加载，并且，通过抗原呈递细胞的MHC I途径有效加工并且呈递所述肽表位，导致I类MHC分子的有效加载。
6.如权利要求1的方法，其中，所述肽表位连接在所述免疫球蛋白或其部分的CDR区内。
7.如权利要求1的方法，其中，所述免疫反应产生了针对所述抗原的有效的T细胞反应。
8.如权利要求7的方法，其中，所述T细胞是细胞毒性T淋巴细胞。
9.如权利要求1的方法，其中，所述RNA片段是dsRNA，并且选自pA:pU和pI:pC。
10.如权利要求1的方法，其中，所述肽表位是T细胞表位。
11.如权利要求1的方法，其中，所述肽表位选自下组：流感病毒M1或M2；丙型肝炎病毒NS3；乙型肝炎病毒核心抗原；人乳头瘤病毒HPV 18-E7，HPV 16-E7，HPV 18 E6，HPV 16 E6；黑素瘤-gp 100；MART-1；TRP-2；癌胚抗原前体；Her-2；破伤风毒素通用T辅助表位；HIV-1：逆转录酶；HIV1：gag；胰岛素前体-人；人Gad 65；前列腺肿瘤抗原；粘蛋白1；单纯疱疹病毒抗原；和，呼吸道合胞病毒抗原。
12.如权利要求1的方法，其中，所述免疫球蛋白或其部分和RNA片段是通过选自下组的方法之一施用的：静脉内施用和弹丸注射。
13.如权利要求1的方法，其中，所述免疫球蛋白或其部分和RNA是在可以药用的载体中施用的。
14.如权利要求1的方法，其中，所述方法诱导了对所述肽表位的有效的记忆反应。
15.一种加载抗原呈递细胞并且产生T细胞反应的方法，包括使用连接于Ig主链或其部分的至少一个肽表位，以便形成Ig-肽分子，其中，当在体内施用时，可以通过MHC I途径对所述表位进行有效加工和呈递，导致I类MHC分子的有效加载，从而得到I类MHC-肽复合物。
16.如权利要求15的方法，其中，所述Ig主链是IgG主链。
17.如权利要求15的方法，其中，所述APC是通过FcγR的单价占据而加载的。
18.如权利要求15的方法，其中，所述APC可以在体内或离体加载。
19.如权利要求15的方法，其中，所述肽表位共价连接于所述IgG主链。
20.如权利要求15的方法，其中，所述肽表位连接于所述IgG主链，而不修饰所述IgG的Fc部分。
21.如权利要求15的方法，其中，所述I类MHC-肽复合物导致了强Tc2反应的产生，该反应以IL-4而不是IL-2或IFN-γ-产生为特征。
22.如权利要求15的方法，其中，所述肽表位选自下组：流感病毒M1或M2；丙型肝炎病毒NS3；乙型肝炎病毒核心抗原；人乳头瘤病毒HPV 18-E7，HPV 16-E7，HPV 18 E6，HPV 16 E6；黑素瘤-gp 100；MART-1；TRP-2；癌胚抗原前体；Her-2；破伤风毒素通用T辅助表位；HIV-I：逆转录酶；HIV1：gag；胰岛素前体-人；人Gad 65；前列腺肿瘤抗原；粘蛋白1；单纯疱疹病毒抗原；和，呼吸道合胞病毒抗原。
23.如权利要求15的方法，其中，避免了血清的负面影响。
24.如权利要求15的方法，其中，所述方法导致了MHC-肽复合物的形成。
25.如权利要求15的方法，其中，所述IgG肽分子是通过皮下或腹膜内注射施用的。
26.如权利要求15的方法，其中，所述抗原呈递细胞选自下组：树突细胞，单核细胞，巨噬细胞和B细胞。
27.如权利要求15的方法，其中，所述抗原呈递细胞选自下组：CD11 c+和CD 11b+APC。
28.如权利要求15的方法，其中，通过体内送递形成的得到的MHC-肽复合物表达了最多达1-2周。
29.如权利要求15的方法，其中，所述MHC-肽复合物导致了T细胞的激活。
30.如权利要求29的方法，其中，所述T细胞反应是通过APC上的ITAM+和ITIM+Fcγ受体确定的。
31.如权利要求30的方法，其中，ITAM+FcγR同种型的γ链的表达诱导了T细胞反应，其中，ITIM+FcγRII限制了所述T细胞反应。
32.如权利要求15的方法，其中，当在体内加载APC时，所述APC诱导了独特的调控亚型。
33.如权利要求26的方法，其中，单核细胞诱导Th2和Tr1细胞，树突细胞和单核细胞都诱导Th3细胞，并且，其中，在引发IgG-介导的T细胞表位送递之后的调控反应的过程中，CD 11b+单核细胞比树突细胞更有效。
34.如权利要求15的方法，其中，在体内用IgG主链内送递的肽加载APC，导致了Th2免疫的诱导。
35.如权利要求15的方法，其中，在体内用IgG主链内送递的肽加载APC，导致了Th3和Tr1免疫的诱导。
36.如权利要求15的方法，其中，所述T细胞反应通过用选自下组的成分之一共刺激得到加强：抗-CD40mAb，重组IL-12或合成dsRNA。
37.如权利要求15的方法，其中，IL-2，IFN-γ和IL-4是以剂量依赖方式下调，而IL-10和TGF-β是以剂量依赖性方式上调的。
38.如权利要求15的方法，其中，所述肽表位是recNP，并且诱导由产生IL-4的Tc2细胞组成的NP-特异性I类MHC-限制的T细胞免疫。
39.如权利要求15的方法，还包括使用RNA基序，以便导致免疫反应增强。
40.如权利要求39的方法，其中，所述RNA基序是dsRNA。
41.如权利要求39的方法，其中，所述IgG1和IgG2a抗体反应加强，并且与增强的Th1和Th2反应相关。
42.如权利要求40的方法，其中，所述dsRNA选自下组：pA:pU，pI:pC和pC:pG。
43.如权利要求39的方法，其中，所述dsRNA是pA:pU，并且诱导I类MHC-限制的Tc1细胞，以便产生IFN-γ。
44.如权利要求40的方法，其中，所述dsRNA为10-50Kd。
45.如权利要求39的方法，其中，所述RNA基序是选自下组的ssRNA：p(A)，p(C)，p(G)，p(I)和p(U)。
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