CN1635163A - 一种检测h5n1亚型禽流感病毒的方法及其专用试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测H5N1亚型禽流感病毒的方法及其专用试剂盒。本发明提供的检测H5N1亚型禽流感病毒的专用试剂盒，包括A型禽流感病毒通用引物NPF和NPL，H5亚型禽流感病毒血凝素的特异性引物H5F和H5L以及N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶特异性引物N1F和N1L；所述NPF具有序列表中序列1的核苷酸序列，所述NPL具有序列表中序列2的核苷酸序列，所述H5F具有序列表中序列3的核苷酸序列，所述H5L具有序列表中序列4的核苷酸序列，所述N1F具有序列表中序列5的核苷酸序列，所述N1L具有序列表中序列6的核苷酸序列。本发明的方法及试剂盒不但可用于实验室的诊断与科研，还可用于大规模的流行病学调查。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检测领域中一种检测H5N1亚型禽流感病毒的方法及其专用试剂盒。
背景技术
高致病性禽流感是由高致病性禽流感病毒所引起的禽类烈性传染病，发病急，传播快，致死率高，对养殖业可造成致命性的打击。高致病性禽流感病毒的亚型通常为H5和H7亚型；2004年，发生于中国和亚洲其他国家和地区的流感病毒亚型主要为H5N1亚型，由于该亚型不仅对亚洲的养殖业造成了严重的经济损失，而且在泰国、越南还造成了人的感染与死亡，因而又具有重要的公共卫生学意义。在流禽感的控制环节中，最重要的是要进行快速的诊断，及时划定疫点、疫区，并采取封锁等控制措施，防止疫情的扩散。因此，建立一种灵敏、特异、快速的诊断方法具有重要的现实意义。
传统的流感病毒检测方法为采用鸡胚进行病毒的分离培养，然后采用血凝抑制试验和神经氨酸酶抑制试验进行亚型的鉴定，试验费时、费力，不能做出快速而及时的诊断。因此，临床上，迫切需要一种能快速诊断H5N1亚型禽流感病毒的检测方法，不但能够确定病毒是否为A型流感病毒，而且能确定是否为H5血凝素亚型和N1神经氨酸酶亚型。
发明创造内容
本发明的目的是提供一种能快速检测H5N1亚型禽流感病毒的专用试剂盒。
本发明所提供的检测H5N1亚型禽流感病毒的试剂盒，包括A型禽流感病毒通用引物NPF和NPL，H5亚型禽流感病毒血凝素的特异性引物H5F和H5L以及N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶特异性引物N1F和N1L；所述NPF具有序列表中序列1的核苷酸序列，所述NPL具有序列表中序列2的核苷酸序列，所述H5F具有序列表中序列3的核苷酸序列，所述H5L具有序列表中序列4的核苷酸序列，所述N1F具有序列表中序列5的核苷酸序列，所述N1L具有序列表中序列6的核苷酸序列。
序列表中的序列1由20个碱基组成，序列表中的序列2由20个碱基组成，序列表中的序列3由19个碱基组成，序列表中的序列4由19个碱基组成，序列表中的序列5由20个碱基组成，序列表中的序列6由21个碱基组成；其中，m＝a或c，y＝t或c，r＝a或g，k＝g或t，w＝a或t。
所述A型禽流感病毒通用引物NPF和NPL的PCR扩增产物长度为467bp；所述H5血凝素特异性引物H5F和H5L的PCR扩增产物长度为543bp；所述N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶特异性引物N1F和N1L的PCR扩增产物长度为368bp。
所述引物NPF，NPL，H5F，H5L，N1F和N1L包含于多重RT-PCR反应液中，每43.8μl所述多重RT-PCR反应液含有RNase free水，17.3μl；10×PCR Buffer，7μl；2.5mM each dNTPs，7.5μl；25mM MgCl2，5μl；引物共7μl(NPF、NPL、H5F和H5L各1μl，N1F和N1L各1.5μl，引物浓度均为20μM)。
为了便于现场检测，所述试剂盒还包括RNA酶抑制剂，Taq DNA聚合酶，AMV反转录酶，提取样品总RNA所需试剂(如裂解液，氯仿，异丙醇，乙醇，RNase free水)以及电泳检测试剂(如溴化乙锭，TAE电泳缓冲液，上样缓冲液，标准PCR产物)。
所述标准PCR产物为从已鉴定的H5N1亚型流感病毒提取RNA，反转录后以cDNA为模板，以H5F和H5L为引物扩增并回收的545bp PCR扩增产物；以NPF和NPL为引物扩增并回收的467bp PCR扩增产物以及以N1F和N1L为引物扩增并回收的368bp PCR扩增产物的混合产物。
所述RNA酶抑制剂规格为30U/μl。
为了在实验中避免由于人为操作所造成的假阴性或假阳性，该试剂盒还包括阳性对照液(H5N1亚型灭活病毒液)和阴性对照液(RNase free水)。
本发明的第二个目的是提供一种快速检测H5N1亚型禽流感病毒的方法。
本发明所提供的检测H5N1亚型禽流感病毒的方法，是以被检样品的总RNA为模板，利用上述检测H5N1亚型禽流感病毒的专用试剂盒进行多重RT-PCR反应，被检样品若同时出现467bp、543bp和368bp的扩增带，被检样品为H5N1亚型禽流感病毒阳性；被检样品若同时出现467bp和543bp的扩增带，被检样品为H5亚型禽流感病毒阳性；被检样品若同时出现467bp和368bp的扩增带，被检样品为N1亚型禽流感病毒阳性；被检样品若只出现467bp的扩增带，被检样品为A型禽流感病毒阳性；被检样品若不出现扩增带，被检样品为A型禽流感病毒阴性。
所述多重RT-PCR反应的50μl反应体系包括43.8μl多重RT-PCR反应液(含有RNase free水，17.3μl；10×PCR Buffer，7μl；2.5mM each dNTPs，7.5μl；25mMMgCl2，5μl；引物共7μl(NPF、NPL、H5F和H5L各1μl，N1F和N1L各1.5μl，引物浓度均为20μM)；0.8μl RNA酶抑制剂(规格为30 U/μl，Genview公司生产)，0.8μl Taq DNA聚合酶，0.6μl AMV反转录酶，4.0μl待检样品总RNA。
所述多重RT-PCR反应的循环程序为42℃ 45min；95℃ 3min；95℃ 30s，55℃ 40s，65℃ 2min进行35个循环；65℃延伸10min。
本发明巧妙地利用了多重RT-PCR方法，制备了一步法快速检测H5N1亚型禽流感病毒的试剂盒。该试剂盒能特异、灵敏地检测出H5N1亚型禽流感病毒的感染。而且其制备容易，操作简单，敏感性高，反应快速(可在5小时内完成对H5N1亚型禽流感病毒的检测与鉴定)。不但可用于实验室的诊断与科研，还可用于大规模的流行病学调查，具有良好的应用前景。
具体实施方式
实施例1、样品的采集和处理
1、样品的采集
组织样品：病死或扑灭病禽，取肝、脑、肺等组织；棉拭子：鼻腔拭子、泄殖腔拭子。2-8℃保存，送实验室检测。要求送检病料新鲜。
2、样品处理：每份样品分别处理
(1)组织样品处理：称取待检病料100mg置研磨器中，加入0.8ml裂解液(硫氰酸胍，0.8M；硫氰酸铵，0.4M；醋酸钠缓冲液，0.1M；甘油5％和苯酚38％，混匀)研磨，把研磨好的病料移至1.5ml离心管中，4℃ 8000rpm离心5min，取上清250μl，置于1.5ml灭菌离心管中，加入750μl上述裂解液，剧烈振荡混匀，室温放置5min。
(2)全血样品处理：待血凝后，取血清于1.5ml灭菌离心管中，4℃ 8000rpm离心5min，取上清250μl，置于1.5ml灭菌离心管中，加入750μl裂解液(硫氰酸胍，0.8M；硫氰酸铵，0.4M；醋酸钠缓冲液，0.1M；甘油5％和苯酚38％，混匀)，剧烈振荡混匀，室温放置5min。
(3)棉拭子处理：将浸液中的棉拭子充分捻动，拧干后弃去拭子，4℃ 8000rpm离心5min，取上清液250μl，置于1.5ml灭菌离心管中，加入750μl裂解液(硫氰酸胍，0.8M；硫氰酸铵，0.4M；醋酸钠缓冲液，0.1M；甘油5％和苯酚38％，混匀)，剧烈振荡混匀，室温放置5min。
3、阳性对照处理：取阳性对照液(H5N1亚型灭活病毒液)250μl，置于1.5ml灭菌离心管中，加入750μl裂解液(硫氰酸胍，0.8M；硫氰酸铵，0.4M；醋酸钠缓冲液，0.1M；甘油5％和苯酚38％，混匀)，剧烈振荡混匀，室温放置5min。
4、阴性对照(RNase free水)：取灭菌双蒸水250μl，置于1.5ml灭菌离心管中，加入750μl裂解液(硫氰酸胍，0.8M；硫氰酸铵，0.4M；醋酸钠缓冲液，0.1M；甘油5％和苯酚38％，混匀)，剧烈振荡混匀，室温放置5min。
实施例2、检测H5N1亚型禽流感病毒
1、检测H5N1亚型禽流感病毒的专用试剂盒10头份试剂盒由表1所示的试剂组成。
表1.试剂盒(10头份)的组成
| 名称 | 数量(10头份) |
| 阳性对照液 | 3.0ml |
| 裂解液 | 30.0ml |
| 氯仿 | 8.0ml |
| 异丙醇 | 18.0ml |
| 75％乙醇 | 35.0ml |
| RNase free水 | 6.0μl |
| RNA酶抑制剂 | 60.0μl |
| 多重RT-PCR反应液 | 1.5ml |
| TaqDNA聚合酶 | 26.0μl |
| AMV反转录酶 | 20.0μl |
| 溴化乙锭溶液 | 30.0μl |
| 50×TAE电泳缓冲液(50倍稀释用) | 20.0ml |
| 上样缓冲液 | 200μl |
| 标准PCR产物 | 35.0μl |
其中，部分试剂的组成、配制方法如下：
裂解液：硫氰酸胍，0.8M；硫氰酸铵，0.4M；醋酸钠缓冲液，0.1M；甘油5％和苯酚38％，混匀；RNase free水：1mlDEPC加到1L蒸馏水中，摇匀，高压灭菌。
每43.8μl多重RT-PCR反应液含有RNase free水，17.3μl；10×PCR Buffer，7μl；2.5mM each dNTPs，7.5μl；25mM MgCl2，5μl；引物共7μl(NPF、NPL、H5F和H5L各1μl，N1F和N1L各1.5μl，引物浓度均为20μM)。
10mg/ml溴化乙锭(EB)贮存液：100mg EB溶于10ml双蒸水中，剧烈搅拌，完全溶解后，室温下闭光保存。
50×TAE电泳缓冲液(50倍稀释用)：Tris碱，121g；冰醋酸，28.55ml；0.5M EDTA(pH8.0)，50ml。加双蒸水，混合，定容至500ml，工作液浓度为1×TAE。
0.5M EDTA(pH8.0)：186.1g EDTA溶于800ml水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用10M NaOH调节PH值至8.0，定容至1L。
75％乙醇：75ml乙醇加25ml水，-20℃保存。
6×凝胶加样缓冲液：溴酚蓝，0.025g；二甲苯青FF，0.025g；甘油，3ml。加入一定量去离子水溶解，定容到10ml。
RNA酶抑制剂：规格为30U/μl，Genview公司生产。
标准PCR产物为从已鉴定的H5N1亚型流感病毒提取RNA，反转录后以cDNA为模板，以H5F和H5L为引物扩增并回收的545bp PCR扩增产物，以NPF和NPL为引物扩增并回收的467bp PCR扩增产物以及以N1F和N1L为引物扩增并回收的368bp PCR扩增产物的混合产物。
2、检测方法
(1)病毒RNA的提取
1)取疑为禽流感病禽肌肉或脏器100mg，按照实施例1的方法进行样品处理，每管加入200μl氯仿，剧烈摇匀，冰浴10min，4℃ 12000rpm离心15min。
2)取上清500μl于新的1.5ml灭菌离心管中，加入等体积的异丙醇，置液氮中3min，4℃ 12000rpm离心15min。
3)弃上清，沿管壁缓缓加入1ml 75％乙醇，4℃ 8000rpm离心3min，倒掉乙醇，将离心管倒扣于吸水纸上1min，真空干燥10min。
4)用50μl RNase free水和1μl RNA酶抑制剂(规格为30U/μl，Genview公司生产)溶解沉淀，即用或-80℃保存备用。
(2)多重RT-PCR反应
每管反应体系为50μl，反应体系如下：
多重RT-PCR反应液 43.8μl
RNA酶抑制剂(购自Genview公司) 0.8μl
Taq DNA聚合酶 0.8μl
AMV反转录酶 0.6μl
样品总RNA 4.0μl
混匀，并作好标记，在自动PCR仪上进行42℃ 45min；95℃ 3min；95℃ 30s，55℃ 40s，65℃ 2min，进行35个循环；65℃延伸10min。4℃保存。
(3)电泳
配制1％琼脂糖凝胶，加入EB，工作浓度为0.5μg/ml；10μl PCR产物、3μl标准PCR产物各混合3μl 6×凝胶加样缓冲液，分别上样，于1×TAE电泳缓冲液中电泳，用紫外检测仪观察结果。结果判定时，阳性对照应同时出现543bp、467bp和368bp扩增带，阴性对照无条带出现(引物带除外)。被检样品中同时出现543bp、467bp和368bp的扩增带，表明样品中含有H5N1亚型禽流感病毒。
序列表
<160>6
<210>1
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<213>人工序列
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<400>1
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<212>DNA
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<220>
<223>
<490>2
ataacaatag agagaatggt 20
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<213>人工序列
<220>
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<211>19
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<213>人工序列
<220>
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<220>
<221>misc-feature
<222>(5)
<223>r＝a或g
<400>4
tytgrttyag tgttgatgt 19
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<220>
<221>misc-feature
<222>(11)
<223>r＝a或g
<400>5
ctgtkgctgt rttgaaatac 20
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc-feature
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<223>w＝a或t
<220>
<221>misc-feature
<222>(13)
<223>y＝t或c
<400>6
gtcwccgaaa acyccactgc a 21
Claims (7)
1、一种检测H5N1亚型禽流感病毒的专用试剂盒，包括A型禽流感病毒通用引物NPF和NPL，H5亚型禽流感病毒血凝素的特异性引物H5F和H5L以及N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶特异性引物N1F和N1L；所述NPF具有序列表中序列1的核苷酸序列，所述NPL具有序列表中序列2的核苷酸序列，所述H5F具有序列表中序列3的核苷酸序列，所述H5L具有序列表中序列4的核苷酸序列，所述N1F具有序列表中序列5的核苷酸序列，所述N1L具有序列表中序列6的核苷酸序列。
2、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述引物NPF，NPL，H5F，H5L，N1F和N1L包含于多重RT-PCR反应液中，每43.8μl所述多重RT-PCR反应液含有RNasefree水，17.3μl；10×PCR Buffer，7μl；2.5Mm dNTPs，7.5μl；25mM MgCl2，5μl；浓度均为20μM的NPF、NPL、H5F和H5L各1μl，浓度均为20μM的N1F和N1L各1.5μl。
3、根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括RNA酶抑制剂，TaqDNA聚合酶，AMV反转录酶，提取样品总RNA所需试剂以及电泳检测试剂。
4、根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阳性对照液和阴性对照液。
5、一种检测H5N1亚型禽流感病毒的方法，是以被检样品的总RNA为模板，利用权利要求1至4中任一项所述的检测H5N1亚型禽流感病毒的专用试剂盒进行多重RT-PCR反应，被检样品若同时出现545bp、467bp和368bp的扩增带，被检样品为H5N1亚型禽流感病毒阳性；被检样品若同时出现467bp和545bp的扩增带，被检样品为H5亚型禽流感病毒阳性；被检样品若同时出现467bp和368bp的扩增带，被检样品为N1亚型禽流感病毒阳性；被检样品若只出现467bp的扩增带，被检样品为A型禽流感病毒阳性；被检样品若不出现扩增带，被检样品为A型禽流感病毒阴性。
6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述多重RT-PCR反应的50μl反应体系包括43.8μl多重RT-PCR反应液，0.8μl RNA酶抑制剂，0.8μl Taq DNA聚合酶，0.6μl AMV反转录酶，4.0μl待检样品总RNA。
7、根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述多重RT-PCR反应的循环程序为42℃ 45min；95℃ 3min；95℃ 30s，55℃ 40s，65℃ 2min进行35个循环；65℃延伸10min。
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