CN102140453B - 用于扩增h5n1流感病毒np基因核苷酸片段的引物及检测方法 - Google Patents
用于扩增h5n1流感病毒np基因核苷酸片段的引物及检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102140453B CN102140453B CN 201110026975 CN201110026975A CN102140453B CN 102140453 B CN102140453 B CN 102140453B CN 201110026975 CN201110026975 CN 201110026975 CN 201110026975 A CN201110026975 A CN 201110026975A CN 102140453 B CN102140453 B CN 102140453B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- influenza virus
- primer
- seq
- nucleotide sequence
- sequence shown
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 78
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title claims abstract description 78
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 title claims abstract description 73
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 title claims abstract description 59
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract description 16
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 title 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims abstract description 32
- 241000282341 Mustela putorius furo Species 0.000 claims abstract description 32
- 101150118742 NP gene Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 28
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 22
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 50
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 28
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 23
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 21
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 21
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 20
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 18
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 11
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 11
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 11
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 11
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 11
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 11
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 10
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 10
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 10
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 10
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 9
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 6
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 238000010818 SYBR green PCR Master Mix Methods 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 239000012792 core layer Substances 0.000 description 2
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000436 anus Anatomy 0.000 description 1
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 1
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000004719 natural immunity Effects 0.000 description 1
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了用于扩增H5N1流感病毒NP基因核苷酸片段的引物组，其特征在于，由具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQID NO：2所示核苷酸序列的下游引物组成。本发明还提供了用于扩增H5N1流感病毒NP基因核苷酸片段的引物组在检测雪貂或/和猴子组织中H5N1流感病毒的应用，及利用该引物组检测H5N1流感病毒NP基因的方法，该引物组及扩增方法能够排除动物基因组的非特异性干扰，特异性好，灵敏度高，易于推广。
Description
技术领域
本发明涉及医学技术领域，特别涉及用于扩增H5N1流感病毒NP基因核苷酸片段的引物。
背景技术
流行性流感(简称流感)是由流感病毒引起的一种烈性传染病，对人类与畜禽危害严重，不仅会给养殖业带来打击，对国民经济乃至整个世界经济都会产生影响，而且危害人类健康。流感病毒有甲、乙、丙三个型，其中甲型所引起的流感流行最为广泛和严重。流感病毒颗粒由三层组成，最外层是两种突起的表面抗原，即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，中间层由一层类脂体和一层膜蛋白(MP)构成，核心层是RNA基因及与之结合的蛋白质即核蛋白(NP)，其中，血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)是甲型流感病毒亚型划分的主要依据。禽流感病毒是甲型流感的一种，H5N1是禽流感病毒的一种亚型，具有高致病性，为卫生部新传染病防治法中规定报告的法定传染病，又称人感染高致病性禽流感。H5N1主要影响禽类如鸡、鸭等和多种哺乳动物如小鼠、雪貂、豚鼠、田鼠、猴子等。由于雪貂与人的呼吸道上皮类似，且感染后的症状与人相近，因此雪貂是最理想的动物模型。此外，猴子作为高级灵长类动物，其天然免疫和适应性免疫更接近于人类，因此在流感的药物和疫苗研究中，猴子作为动物模型也有不可替代的作用。
流感病毒变异极为频繁，常造成免疫失败，给防控带来困难。因此，早期快速诊断和血清学监测对防控流感具有重要意义。流感病毒在动物体内的毒力评价和检测主要通过两种方法：病毒分离和病毒的定量PCR检测。其中病毒分离出活病毒是组织感染的最有力的证据，但是该方法只能检测活病毒，对于流感这种急性病毒易漏检；此外，该方法需要在国家认可的生物安全三级实验室进行，且实验操作繁琐、耗时、灵敏度不高，不能满足疫情或疾病早期快速诊断和现场诊断。病毒的定量PCR弥补了病毒分离检测方法的不足，可以快速、特异性地检测样本中痕量病毒，且操作在生物安全二级实验室即可，容易满足安全性要求。流感病毒的定量检测方法有两种，一种是Taqman探针法，该方法特异性好，但探针较昂贵，引物和探针的要求很高，对于大量样品的检测费用过高；另一种是常见的SYBR Green定量PCR，技术成本较前者低，灵敏度高，特异性虽不如探针法，但能够满足流感病毒的检测要求。世界卫生组织(World Health Organization，WHO)推荐了用探针法和染料法检测H5N1时适用的引物，该引物对病人和实验动物的鼻咽拭子、肛拭子的病毒载量检测效果勿容置疑，但是用染料法检测雪貂和猴子组织中H5N1时，有非特异性扩增，不适于雪貂和猴子组织中的病毒定量检测。因此，提供能够特异性检测H5N1流感病毒的引物组及方法具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供用于扩增H5N1流感病毒NP基因核苷酸片段的引物组。该引物组由具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的下游引物组成，能够排除背景基因组的非特异性干扰，特异性扩增H5N1流感病毒中NP蛋白的第1125至第1423位长度为199bp的核苷酸片段。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了用于扩增H5N1流感病毒NP基因核苷酸片段的引物组，由具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的下游引物组成。所述NP基因的Genebank登录号为133711835，本发明提供的引物组特异性扩增NP基因的第1125至第1423位长度为199bp的核苷酸片段。
流感病毒颗粒由三层组成，最外层是两种突起的表面抗原，即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，中间层由一层类脂体和一层膜蛋白(M)构成，核心层是RNA基因及与之结合的蛋白质即核蛋白(NP)。其中，HA和NA是甲型流感病毒亚型划分的主要依据，HA抗体能中和病毒和抑制血凝素，是最主要的保护性抗体，NA抗体能限制病毒的释放和扩散，也有保护作用。M和NP是决定流感病毒型别的型特异性抗原，抗原性较稳定，其抗体无保护作用。尽管流感病毒极易发生变异，但主要集中在血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)上，NP蛋白却高度保守，Shu L L等对从1933年-1990年间分离的人流感病毒NP基因演化变异情况进行研究发现，NP基因变异率为每年2.3×10-3，其中只有32％的碱基突变导致了氨基酸变化，其余均为无意义突变。NP蛋白的这一特点使其成为流感病毒诊断用的理想靶蛋白。因此，以NP为靶基因，提供适于扩增H5N1流感病毒中NP基因核苷酸片段的引物组具有现实意义。
作为优选，本发明提供的引物组特异性扩增雪貂或/和猴子组织中H5N1流感病毒中NP蛋白的第1125至第1423位长度为199bp的核苷酸片段。
本发明还提供了所述的引物组在检测雪貂或/和猴子组织中H5N1流感病毒的应用。
本发明还提供了一种检测H5N1流感病毒NP基因的方法，包括：
步骤1：用具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ IDNO：2所示核苷酸序列的下游引物扩增生物样品；
步骤2：对扩增产物进行检测。
本发明提供的方法适于普通PCR、染料法实时荧光定量PCR，适合于H5N1流感病毒NP基因的检测。作为优选，本发明提供的方法适于雪貂或/和猴子简单临床样品或复杂的组织样品中H5N1流感病毒NP基因的检测。
作为优选，步骤1所述扩增与步骤2所述检测同时进行。
优选地，采用实时荧光定量PCR法进行步骤1所述扩增与步骤2所述检测。
优选地，所述实时荧光定量PCR法具体为染料掺入法。
更优选地，所述实时荧光定量PCR反应程序为：94℃，3min；94℃，30s；55℃，30s；72℃，30s为一个循环，设定35个循环；95℃，15s；60℃，1min；95℃，15s。
利用具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列的下游引物的引物组，以H5N1流感病毒标准病毒株(SZ406H)为模板，按照Power SYBR Green PCR Master Mix(ABI，4367659)试剂盒反应体系在stepone 2.0定量PCR仪上进行定量扩增。扩增曲线整体平行性好；模板进行10倍比梯度稀释时，各浓度间隔性好；各浓度的平行试验重复性好。溶解曲线具有单一峰，无引物峰或杂峰出现，且各浓度的峰对称轴重合，表明本发明提供的引物组能够特异性扩增H5N1流感病毒标准病毒株(SZ406H)。标准曲线中，各浓度间呈线性关系，表明加样时误差较小，样品稀释较准确；R2＝0.99，标准曲线斜率为-3.2，扩增效率为101％，表明本发明提供的引物组在扩增时生成的引物二聚体较少，扩增效果较好。
回收产物，送中美泰和生物工程公司测序，结果显示与H5N1流感病毒的NP基因第1125至第1423位长度为199bp的核苷酸片段序列一致。测产物浓度并换算成拷贝数值，10倍倍比稀释制备成102-106拷贝的样品，常规凝胶电泳检测，结果如图4所示。经凝胶电泳检测，106拷贝的样品具有较强的单一条带，表明特异性好；102拷贝的样品具有微弱的单一条带，表明灵敏度高。
综合上述试验结果，本发明提供的具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的下游引物的引物组具有特异性好、灵敏度高的特点，能够特异性扩增H5N1流感病毒标准病毒株(SZ406H)NP基因第1125至第1423位长度为199bp的核苷酸片段，可以应用于日常H5N1流感病毒的检测工作中。
本发明提供的引物组用于扩增雪貂或/和猴子组织中H5N1流感病毒NP基因核苷酸片段及利用该引物组检测雪貂和猴子组织中H5N1流感病毒NP基因的方法，该方法能够排除动物基因组的非特异性干扰，特异性好，灵敏度高，易于推广。
附图说明
图1示感染H5N1流感病毒的雪貂肺、肠组织提取的总RNA逆转录后得到cDNA，经SYBR Green定量PCR体系扩增后的凝胶电泳图。其中，泳道1为DL2000分子标准物；泳道2为扩增产物的阳性对照；泳道3-5分别针对已经感染H5N1流感病毒的雪貂肺组织，选用WHO推荐的引物组N1-1/N1-2、M30F/M264R、H5-1/H5-3扩增的产物；泳道6-8分别针对已经感染H5N1流感病毒的雪貂肠组织，选用WHO推荐的引物组N1-1/N1-2、M30F/M264R、H5-1/H5-3扩增的产物；泳道9-13分别针对已经感染H5N1流感病毒的雪貂肺组织，选用具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的下游引物的引物组扩增得到的产物；泳道14-18分别针对已经感染H5N1流感病毒的雪貂肠组织，选用具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的下游引物的引物组扩增得到的产物；19为阴性对照。
图2示感染H5N1流感病毒的猴子肺、肠组织提取的总RNA逆转录后得到cDNA，经SYBR Green定量PCR体系扩增后的凝胶电泳图。其中，泳道1为DL2000分子标准物；泳道2为扩增产物的阳性对照；泳道3-5分别针对已经感染H5N1流感病毒的猴子肺组织，选用WHO推荐的引物对N1-1/N1-2、M30F/M264R、H5-1/H5-3扩增的产物；泳道6-8分别针对已经感染H5N1流感病毒的猴子肠组织，选用WHO推荐的引物对N1-1/N1-2、M30F/M264R、H5-1/H5-3扩增的产物；泳道9-13分别针对已经感染H5N1流感病毒的猴子肺组织，选用具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的下游引物的引物组扩增得到的产物；泳道14-18分别针对已经感染H5N1流感病毒的猴子肠组织，选用具有SEQID NO：1所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的下游引物的引物组扩增得到的产物；19为阴性对照。
图3示针对感染H5N1流感病毒的雪貂、猴子的肺、肠组织提取的总RNA逆转录后得到cDNA，以具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的下游引物的引物组经SYBR Green定量PCR体系扩增的扩增曲线图。
图4示针对感染H5N1流感病毒的雪貂、猴子的肺、肠组织提取的总RNA逆转录后得到cDNA，以具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的下游引物的引物组经SYBR Green定量PCR体系扩增的溶解曲线。
图5示针对感染H5N1流感病毒的雪貂、猴子的肺、肠组织提取的总RNA逆转录后得到cDNA，以具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的下游引物的引物组经SYBR Green定量PCR体系扩增的产物经纯化后做标准品，再以10倍比稀释成102-106拷贝的标准品绘制的标准曲线。
图6示针对感染H5N1流感病毒的雪貂、猴子的肺、肠组织提取的总RNA逆转录后得到cDNA，以具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的下游引物的引物组经SYBR Green定量PCR体系扩增的产物经纯化后做标准品，再以10倍比稀释成102-106拷贝的标准品凝胶电泳图。其中，泳道1为DL2000分子标准物；泳道2-6分别为102、103、104、105、106拷贝的标准品。
具体实施方式
本发明公开了用于检测雪貂和猴子组织中H5N1流感病毒核苷酸片段的引物，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
利用具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列的下游引物的引物组，以H5N1流感病毒标准病毒株(SZ406H)为模板，按照Power SYBR Green PCR Master Mix(ABI，4367659)试剂盒反应体系在stepone 2.0定量PCR仪上进行定量扩增。扩增曲线如图1所示，溶解曲线如图2所示，标准曲线如图3所示。
由图1所示，扩增曲线整体平行性好；模板进行10倍比梯度稀释时，各浓度间隔性好；各浓度的平行试验重复性好。由图2所示，溶解曲线具有单一峰，无引物峰或杂峰出现，且各浓度的峰对称轴重合，表明本发明提供的引物组能够特异性扩增H5N1流感病毒标准病毒株(SZ406H)。由图3所示，各浓度间呈线性关系，表明加样时误差较小，样品稀释较准确；R2＝0.99，标准曲线斜率为-3.2，扩增效率为101％之间，表明本发明提供的引物组在扩增时生成的引物二聚体较少，扩增效果较好。
利用具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列的下游引物的引物组扩增H5N1流感病毒标准病毒株(SZ406H)，回收产物，送中美泰和生物工程公司测序，结果显示与H5N1流感病毒的NP基因第1125至第1423位长度为199bp的核苷酸片段序列一致。测产物浓度并换算成拷贝数值，10倍倍比稀释，换算成拷贝数，制备成102-106拷贝的样品，常规凝胶电泳检测，结果如图4所示。经凝胶电泳检测，102-106拷贝的样品均具有单一条带，表明本发明提供的引物组特异性好；102拷贝具有微弱的单一条带，表明本发明提供的引物组灵敏度高。
综合上述试验结果，本发明提供的具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的下游引物的引物组具有特异性好、灵敏度高的特点，能够特异性扩增H5N1流感病毒标准病毒株(SZ406H)NP基因第1125至第1423位长度为199bp的核苷酸片段，可以应用于日常H5N1流感病毒的检测工作中。
实施例2
分别采用Roche，Cat.12033674001；Ambion，AM1912；BioMIGA；Qiagen，cat.74106；Trizol invitrogen，Cat.No.15596-026 5种试剂盒提取待测雪貂和猴子肺、肠组织样品中的总RNA。
将提取的雪貂和猴子肺、肠组织总RNA，用invitrogen公司的SuperScriptIII First-Strand Synthesis System试剂盒逆转录，得到cDNA。
WHO推荐的用普通PCR和染料法定量PCR检测雪貂或/和猴子组织中H5N1流感病毒NP基因的引物，见表1。
表1：WHO推荐的应用于普通PCR和染料法定量PCR的引物
针对H5N1(SZ406H)NP基因(Genebank登录号：133711835)设计的引物组由具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列的下游引物组成。
以雪貂和猴子肺、肠组织待测样品的cDNA为模板，按照Power SYBRGreen PCR Master Mix(ABI，4367659)试剂盒反应体系，在stepone 2.0定量PCR仪上进行定量扩增，评价WHO推荐的引物组及本发明提供的引物组的扩增效果，结果如图5、图6所示。
由图5所示，待测样品雪貂肺、肠组织提取的总RNA逆转录后得到cDNA，经SYBR Green定量PCR体系扩增后的凝胶电泳图中，9-18泳道具有与阳性对照同一位置的清晰单一条带，鉴于本发明提供的具有SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的下游引物的引物组能够特异性扩增H5N1流感病毒NP基因的核苷酸片段，因此判断待测样品雪貂肺、肠组织感染了H5N1流感病毒；3-8泳道上无扩增条带，表明WHO推荐的N1-1/N1-2引物组(由具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的上游引物和具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的下游引物组成)、M30F/M264R引物组(由具有如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的上游引物和具有如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列的下游引物组成)、H5-1/H5-3引物组(由具有如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的上游引物和具有如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列的下游引物组成)不具有特异性，不能够特异性扩增雪貂肺、肠组织中的H5N1流感病毒NP基因的核苷酸片段，也就不能有效检测待测样品雪貂肺、肠组织是否感染了H5N1流感病毒。
由图6所示，待测样品猴子肺、肠组织提取的总RNA逆转录后得到cDNA，经SYBR Green定量PCR体系扩增后的凝胶电泳图中，9-18泳道具有与阳性对照同一位置的清晰单一条带，鉴于本发明提供的具有SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的下游引物的引物组能够特异性扩增H5N1流感病毒NP基因的核苷酸片段，因此判断待测样品猴子肺、肠组织感染了H5N1流感病毒；第3泳道和第6泳道无扩增条带，第4、5、7、8泳道扩增出多条条带，表明WHO推荐的N1-1/N1-2引物组(由具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的上游引物和具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的下游引物组成)、M30F/M264R引物组(由具有如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的上游引物和具有如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列的下游引物组成)、H5-1/H5-3引物组(由具有如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的上游引物和具有如SEQ IDNO：8所示的核苷酸序列的下游引物组成)不具有特异性，不能够特异性扩增猴子肺、肠组织中的H5N1流感病毒NP基因的核苷酸片段，也就不能有效检测待测样品猴子肺、肠组织是否感染了H5N1流感病毒。
由此可见，WHO推荐的引物不适于扩增雪貂和猴子组织中H5N1流感病毒NP基因，而具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的下游引物的引物组对上述组织中H5N1流感病毒NP基因核苷酸片段的扩增具有特异性，因而适合应用于雪貂或/和猴子组织中H5N1流感病毒的检测工作。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.用于扩增H5N1流感病毒NP基因核苷酸片段的引物组，其特征在于，由如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的上游引物以及如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的下游引物组成。
2.如权利要求1所述的引物组在制备检测雪貂或/和猴子组织中H5N1流感病毒的试剂的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201110026975 CN102140453B (zh) | 2011-01-25 | 2011-01-25 | 用于扩增h5n1流感病毒np基因核苷酸片段的引物及检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201110026975 CN102140453B (zh) | 2011-01-25 | 2011-01-25 | 用于扩增h5n1流感病毒np基因核苷酸片段的引物及检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102140453A CN102140453A (zh) | 2011-08-03 |
| CN102140453B true CN102140453B (zh) | 2013-03-20 |
Family
ID=44408250
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201110026975 Active CN102140453B (zh) | 2011-01-25 | 2011-01-25 | 用于扩增h5n1流感病毒np基因核苷酸片段的引物及检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102140453B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104388599B (zh) * | 2014-12-15 | 2016-08-24 | 中国医学科学院医学实验动物研究所 | 流感病毒h5n1亚型和h7n9亚型的液相芯片检测试剂盒 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1635163A (zh) * | 2004-11-01 | 2005-07-06 | 中国农业大学 | 一种检测h5n1亚型禽流感病毒的方法及其专用试剂盒 |
| CN1904068A (zh) * | 2006-05-10 | 2007-01-31 | 浙江省疾病预防控制中心 | 一种h5n1型禽流感病毒荧光扩增检测试剂盒及检测方法 |
| CN101671747A (zh) * | 2009-10-21 | 2010-03-17 | 中山大学 | 用于检测禽流感h5n1和新城疫病毒的引物及其检测方法和试剂盒 |
-
2011
- 2011-01-25 CN CN 201110026975 patent/CN102140453B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1635163A (zh) * | 2004-11-01 | 2005-07-06 | 中国农业大学 | 一种检测h5n1亚型禽流感病毒的方法及其专用试剂盒 |
| CN1904068A (zh) * | 2006-05-10 | 2007-01-31 | 浙江省疾病预防控制中心 | 一种h5n1型禽流感病毒荧光扩增检测试剂盒及检测方法 |
| CN101671747A (zh) * | 2009-10-21 | 2010-03-17 | 中山大学 | 用于检测禽流感h5n1和新城疫病毒的引物及其检测方法和试剂盒 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 胡媛媛等.H5N1亚型禽流感病毒NP基因的克隆与表达.《黑龙江畜牧兽医》.2007,(第2期),全文. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102140453A (zh) | 2011-08-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lu et al. | Real-time reverse transcription-PCR assay panel for Middle East respiratory syndrome coronavirus | |
| Foord et al. | Real-time RT-PCR for detection of equine influenza and evaluation using samples from horses infected with A/equine/Sydney/2007 (H3N8) | |
| Spackman et al. | Multiplex real-time reverse transcription–polymerase chain reaction for the detection of three viruses associated with poult enteritis complex: turkey astrovirus, turkey coronavirus, and turkey reovirus | |
| US11639532B2 (en) | Method for Influenza A virus and Influenza B virus detection | |
| Zhang et al. | Multiplex one-step Real-time PCR by Taqman-MGB method for rapid detection of pan and H5 subtype avian influenza viruses | |
| Liu et al. | Variation and molecular basis for enhancement of receptor binding of H9N2 avian influenza viruses in China isolates | |
| CN105543414A (zh) | 一种呼吸道合胞病毒a/b亚型多重荧光定量pcr检测引物组和探针组及其试剂盒和制备方法 | |
| CN106636472B (zh) | 检测禽流感病毒与鸡细小病毒的成套试剂与方法 | |
| Aouini et al. | Viral interference between low pathogenic avian influenza H9N2 and avian infectious bronchitis viruses in vitro and in ovo | |
| Kim et al. | Pathogenic assessment of avian influenza viruses in migratory birds | |
| Sidoti et al. | Development of real time RT-PCR assays for detection of type A influenza virus and for subtyping of avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes | |
| CN103820574B (zh) | 人疱疹病毒6型实时荧光定量pcr分型检测试剂盒 | |
| Nidzworski et al. | Detection and differentiation of Newcastle disease virus and influenza virus by using duplex real-time PCR | |
| Zhang et al. | Multiplex one-step real-time PCR assay for rapid simultaneous detection of velogenic and mesogenic Newcastle disease virus and H5-subtype avian influenza virus | |
| CN102140453B (zh) | 用于扩增h5n1流感病毒np基因核苷酸片段的引物及检测方法 | |
| CN102304591B (zh) | 鉴定h3亚型禽流感病毒的pcr引物对及其应用 | |
| WO2016078215A1 (zh) | 一步法反转录pcr检测和分型埃博拉病毒5种亚型的引物、探针及试剂盒 | |
| Ferrando et al. | Cell-intrinsic genomic reassortment of pandemic H1N1 2009 and Eurasian avian-like swine influenza viruses results in potentially zoonotic variants | |
| CN110846437A (zh) | 鸡细小病毒与h9亚型禽流感病毒二重pcr检测引物组、试剂盒及方法 | |
| CN110777219A (zh) | 鸡细小病毒与h9亚型禽流感病毒三重pcr检测引物组、试剂盒及方法 | |
| CN110951918A (zh) | 一种基于rna恒温扩增-金探针层析技术联合检测甲、乙型流感病毒的试剂盒及其应用 | |
| CN112011644A (zh) | 甲型流感病毒和乙型流感病毒的检测方法 | |
| CN103014176B (zh) | 用于猪流感病毒实时荧光定量pcr检测的引物集 | |
| Nidzworski et al. | Detection of avian influenza virus and newcastle disease virus by duplex one step RT PCR | |
| Takahashi et al. | Cocirculation of Influenza C Viruses with Distinct Internal Genome Constellations in Iwate Prefecture, Japan, in 2016 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |