CN102559484B - 对虾传染性肌肉坏死病毒荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
对虾传染性肌肉坏死病毒荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及对虾传染性肌肉坏死病毒的检测试剂盒及检测方法，属于海洋生物病原检测技术领域。包括盒体，盒体内设有管孔支架，管孔支架上摆放有以下管件：（1）、荧光定量PCR反应液管；正向引物序列；反向引物序列；TaqMan探针序列；（2）、去离子水管，内装无菌去离子水；（3）、阴性对照管，内装SPF（无特定病原体）对虾核酸；（4）、标准品管，分别内装传染性肌肉坏死病毒107,106,105,104,103,102,10,1拷贝cDNA阳性克隆。本发明具有很高的推广应用价值，检测方法灵敏、特异、便于操作。
Description
技术领域
本发明涉及对虾传染性肌肉坏死病毒的检测试剂盒及检测方法，属于海洋生物病原检测技术领域。
背景技术
传染性肌肉坏死病为2002年在巴西发现的一种危害对虾生产的新的病毒性传染病，2004年美国亚利桑纳大学LightnerDV博士研究发现该病由一种新的病毒引起并将之定名为传染性肌肉坏死病毒（Infectiousmyonecrosisvirus,简称IMNV）。这种新型病毒为双链RNA病毒，属于整体病毒科。对虾传染性肌肉坏死病毒的易感对虾种类为南美白对虾，主要是感染60-80天的幼虾。该病毒能造成染病对虾全身肌肉组织坏死，一般情况下，病理死亡发生缓慢，死亡率不高，但整个养殖过程都有死亡，累积死亡率可达70%。该病毒目前已传入亚洲，正威胁着中国的南美白对虾养殖。
AndradeTPD等2007年建立了IMNV的荧光定量PCR检测方法，最低可检测到10拷贝的IMNV，此检测方法灵敏度有待进一步提高。因荧光定量PCR检测方法是进行对虾病毒定量及早期预防的重要有效手段，所以建立高灵敏度的荧光定量PCR检测方法，以及配合该检测方法使用的病毒检测试剂盒极为重要。
发明内容
本发明的目的在于解决现有荧光定量PCR检测方法中存在的灵敏度不高的问题，提供对虾传染性肌肉坏死病毒荧光定量PCR检测试剂盒，同时还提供了利用该试剂盒进行检测的检测方法，该检测方法灵敏、特异，便于操作。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
对虾传染性肌肉坏死病毒荧光定量PCR检测试剂盒，包括盒体1，盒体1内设有管孔支架5，其特殊之处在于管孔支架5上摆放有以下管件：
（1）、荧光定量PCR反应液管6，内装2×荧光定量PCRbuffer、对虾传染性肌肉坏死病毒正反引物及荧光标记的TaqMan探针的混合液；
正向引物序列：5’-GATGGCAGCACGTCAAAATG-3’；
反向引物序列：5’-CAGCTGTTCCTGGGACTTCCT-3’；
TaqMan探针序列：5’-CTATTTCCTCCACTAATTCAGAGC-3’，探针序列的5’端用FAM标记，3’端用TAMRA标记；
（2）、去离子水管3，内装无菌去离子水；
（3）、阴性对照管4，内装SPF（无特定病原体）对虾核酸；
（4）、标准品管2，分别内装传染性肌肉坏死病毒107,106,105,104,103,102,10,1拷贝cDNA阳性克隆。
对虾传染性肌肉坏死病毒荧光定量PCR检测方法如下：
（1）荧光定量PCR反应体系：
| 试剂 | 体积/体系(μl) | 终浓度 |
| 荧光定量PCR 反应液 | 11.2 | 1×real-time PCR buffer, 0.2μM正反引物， 0.4μM探针 |
| 标准品或模板cDNA | 1 | |
| 无菌去离子水 | 7.8 | |
| 总体积 | 20 | - |
（2）荧光定量PCR反应：
95℃变性30s，1个循环；
95℃变性5s，62℃退火延伸20s，40个循环。
本发明对虾传染性肌肉坏死病毒荧光定量PCR检测试剂盒，根据传染性肌肉坏死病毒的全基因序列重新设计引物及探针，采用荧光定量PCR实时检测标记探针的荧光强度，并根据分析软件确定样品病毒含量，此试剂盒可应用于定量研究传染性肌肉坏死病毒在对虾体内的增殖、对虾健康苗种培育等过程的传染性肌肉坏死病毒检测，具有很高的推广应用价值。该方法灵敏、特异、便于操作。
附图说明
图1：对虾传染性肌肉坏死病毒荧光定量PCR检测灵敏度示意图；
（a）荧光定量PCR检测灵敏度，107-1拷贝的传染性肌肉坏死病毒cDNA均超过了阈值；（b）荧光定量PCR检测传染性肌肉坏死病毒标准曲线；
图2：对虾传染性肌肉坏死病毒荧光定量PCR特异性检测示意图；
图3：对虾传染性肌肉坏死病毒荧光定量PCR检测试剂盒的结构示意图。
具体实施方式
以下参考附图给出本发明的具体实施方式，用来对本发明做进一步的说明。
实施例1
对虾传染性肌肉坏死病毒荧光定量PCR检测试剂盒，包括盒体1，盒体1内设有管孔支架5，管孔支架5上摆放有以下管件：
（1）、荧光定量PCR反应液管6，内装2×荧光定量PCRbuffer、对虾传染性肌肉坏死病毒正反引物及荧光标记的TaqMan探针的混合液；
正向引物序列：5’-GATGGCAGCACGTCAAAATG-3’；
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TaqMan探针序列：5’-CTATTTCCTCCACTAATTCAGAGC-3’，探针序列的5’端用FAM标记，3’端用TAMRA标记；
（2）、去离子水管3，内装无菌去离子水；
（3）、阴性对照管4，内装SPF（无特定病原体）对虾核酸；
（4）、标准品管2，分别内装传染性肌肉坏死病毒107,106,105,104,103,102,10,1拷贝cDNA阳性克隆。
对虾传染性肌肉坏死病毒荧光定量PCR检测方法如下：
（1）荧光定量PCR反应体系：
| 试剂 | 体积/体系(μl) | 终浓度 |
| 荧光定量PCR 反应液 | 11.2 | 1×real-time PCR buffer, 0.2μM正反引物， 0.4μM探针 |
| 标准品或模板cDNA | 1 | |
| 无菌去离子水 | 7.8 | |
| 总体积 | 20 | - |
（2）荧光定量PCR反应：
95℃变性30s，1个循环；
95℃变性5s，62℃退火延伸20s，40个循环。
通过附图1-2可以直观的看出检测过程，其中，图1中的（a）为荧光定量PCR检测灵敏度，107-1拷贝的传染性肌肉坏死病毒cDNA均超过了阈值，图2中超过阈值的是106和103拷贝传染性肌肉坏死病毒cDNA，在阈值下的曲线分别为白斑综合征病毒DNA，传染性皮下及造血组织坏死病毒DNA，肝胰腺细小病毒DNA，斑节对虾杆状病毒DNA，SPF对虾DNA，灭菌水。
本方法优点：(1)灵敏度高：可以检测到1拷贝的传染性肌肉坏死病毒。(2)特异性好：与图2中其它4种常见对虾病毒及对虾组织不发生交叉
反应。
(3)操作简单、快速：将传染性肌肉坏死病毒正反引物及探针加入荧光定量PCR反应液中，简化了操作步骤。
Claims (1)
1.对虾传染性肌肉坏死病毒荧光定量PCR检测试剂盒，包括盒体（1），盒体（1）内设有管孔支架（5），其特征在于管孔支架（5）上摆放有以下管件：
1）、荧光定量PCR反应液管（6），内装2×荧光定量PCRbuffer、对虾传染性肌肉坏死病毒正反引物及荧光标记的TaqMan探针的混合液；
正向引物序列：5’-GATGGCAGCACGTCAAAATG-3’；
反向引物序列：5’-CAGCTGTTCCTGGGACTTCCT-3’；
TaqMan探针序列：5’-CTATTTCCTCCACTAATTCAGAGC-3’，探针序列的5’端用FAM标记，3’端用TAMRA标记；
2）、去离子水管（3），内装无菌去离子水；
3）、阴性对照管（4），内装SPF对虾核酸；
4）、标准品管（2），分别内装传染性肌肉坏死病毒107,106,105,104,103,102,10,1拷贝cDNA阳性克隆。
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