CN1607258A

CN1607258A - 间接法基因芯片线性放大标记技术

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Publication number: CN1607258A
Application number: CN 200310107913
Authority: CN
Inventors: 宋克
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-10-15
Filing date: 2003-10-15
Publication date: 2005-04-20

Abstract

本发明的目的是为基因芯片产品提供一套利用酶学或化学的方法和荧光、生物化学发光等各种纳米微球作为高荷信号载体大幅度提升检测灵敏度，经济实用性的信号放大标记技术及试剂盒。同时解决直接法标记中非线性标记而出现的无法精确定量、灵敏度不足、成本高昂等缺陷，使产生的荧光信号强度与基因表达中或实际杂交到基因芯片上的实际丰度成放大的正比例关系。本发明中的技术方案同时解决了基因芯片直接标记中cDNA的杂交效率对标记过程的影响问题。

Description

间接法基因芯片线性放大标记技术 Indirect Linear Amplification Labeling for Microarray Assays[iLAL]

本发明所引用的技术文献

Su；Sheng-Hui等人美国专利No.6,130,323。Non-nucleotide linking reagents。10月10日，2000。

Nelsen，p.S.等人，Nuclear Acids Research.20：6253，1992。

宋克，中国专利申请，基因芯片酶法微球放大标记。申请号031420818。2003年8月6日。ROBIN L.STEARS等人，“A novel，sensitive detection system for high-density microarraysusing dendrimer technology”。Physiological Genomics3：93-99，2000；1094-8341/00.DeRisi JL等人，Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on agenomic scale.Science 278：680-686，1997。

Schena M等人，Quantitative monitoring of gene expression patterns with acomplementary DNA microarrays.Science 270，467-470.1995。

Duggan D.等人，Expression profiling using cDNA microarrays.Nature Genetic Supplement21：10-14，1999.

Charlie C.Xiang等人。Amine-modified random primers to label probes for DNAmicroarrays.Nature Biotechnology。Vol20，738-742.2002

所属领域

本发明属于基因芯片应用技术领域，特别是涉及到基因芯片的杂交，标记，洗脱，及信号检测技术。

本发明技术背景

目前基因芯片分析中通常用荧光染料(即Cy^TM3或Cy^TM5)作为标记物进行标记。标记物可以在cDNA合成时通过逆转录[reverse transcription]技术直接引入，aRNA放大或者后aRNA逆转录反应[post-aRNA reverse transcription(RT)reaction]，或在任何酶反应之后通过化学偶联反应进行连接。直接标记需要酶反应在cDNA，aRNA或RT产物中引入Cy标记的dNTP/NTP核苷酸结构类似物。

目前，基因芯片在实际操作中，来自实验样品和参照样品的cDNA[代表mRNA转录产品]用不同的荧光染料标记、混合、并被杂交到芯片上。所测得的荧光强度无法与其实际转录产品的丰度成正比。

虽然直接标记法看上去更方便，但却存在一些问题。首先，引入的被标记的碱基U的数量将取决于cDNA的碱基组成，即mRNA中碱基A的含量。其次，参入到标记分子中的核苷数量也取决于转录产物的长度。很长的转录产物或/及含有大量碱基A的模板会产生被更强的荧光信号标记的cDNA。在此情况下，强的信号不代表高的表达丰度，因此，对杂交上的靶序列的标记与实际杂交的靶序列的量不成正比关系，这为对基因芯片检测中的精确定量造成困难。第三，Cy5和Cy3在逆转录反应中引入水平或效率不高，而且各自效率不同，会产生不同的量子效率以及各种各样的荧光强度，因此，对荧光强度的归一化将十分必要，这是对下游数据分析的影响。第四，采用直接法标记进行信号放大受到放大倍数的限制。目前的大多数方法需要最少20微克的总RNA样品，或2微克poly(A)RNA样品[Schena M等人，Duggan D.等人]，对于研究一些稀有组织或样品量比较少的样品往往显得无能为力。第五，过多的参入荧光分子往往导致杂交效率或特异性降低。而且有资料显示，探针或靶基因中多重被标记核苷的参入会减少它们所形成的杂交双链的稳定性。资料显示，带有多重荧光素基团的合成寡聚核苷酸、带有多重生物素基的生物来源的核酸探针、以及兼有生物素基团和荧光素基团的合成寡聚核苷酸的杂交双链的稳定性都下降[Su，Sheng-Hui等人，美国专利No.6,130,323]。

间接标记通常在将要被荧光染料标记的核酸分子上引入一个碱基媒介。这个碱基媒介可以是氨基修饰[氨基烯丙基-]的碱基，然后，用Cy5或Cy3分子与之结合。但在逆转录反应中，间接方法没有克服直接标记中荧光强度取决于cDNA长度和碱基组成的问题。

本发明的目的

本发明的目的是为基因芯片产品提供一套利用酶学或化学的方法、利用高荷信号载体大幅度提升检测灵敏度，经济实用性的信号放大标记技术及试剂盒。同时解决直接法标记中非线性标记而出现的无法精确定量、灵敏度不足、成本高昂等缺陷，使产生的荧光信号强度与基因表达中的实际丰度成放大了的正比例关系。本发明中的技术方案同时解决了基因芯片直接标记中cDNA的杂交效率对标记过程的影响问题。

本发明与背景技术相比所产生的积极效果

本发明中所提供的方法不仅提高了基因芯片检测灵敏度，降低成本，而且克服了直接标记技术中存在的无法准确定量的各种技术因素，如在本发明中可以被视为加尾标记的末端转移酶方法和捕获序列方法所表示的方法。

归纳起来，本发明所带来的有益效果有如下几个方面：

1、为一般的基因芯片技术产品提供了超灵敏检测的技术基础，技术比现有的体外转录[IVT]标记、Cy系列荧光分子标记技术有着更强大的信号放大效果，可以根据需要选择不同规格的高荷信号载体将信号放大倍数提高到10²-10⁷不等。

2、为降低基因芯片处理系统的成本及运行成本提供了技术支持，有利于基因芯片的普及应用；

3、克服了PCR等基因扩增技术中的假阳性问题；

4、克服了利用逆转录反应中Cy3/Cy5荧光分子参入法直接标记技术所产生的荧光信号强度还取决于cDNA长度和碱基组成所造成的不确定性，本发明中的标记方法所产生的荧光信号强度则仅取决于cDNA的分子数目，因此可以线性定量检测。因此，本发明所述的技术方案所产生的荧光信号强度与基因表达的实际丰度成正比例线性关系。

5、间接标记中的末端标记技术的杂交过程在标记反应之前，而且杂交分子的碱基在杂交之前没有被修饰，克服了直接标记中杂交效率低下或错配杂交的问题，提高了杂交分子的稳定性，同时也有利于探针和靶基因的严谨杂交。

专用名词注解

模板[Template，T]

各种酶[如DNA/RNA聚合酶、逆转录酶等]的核酸分子底物，在生物样品中是待检测的核酸分子。模板经过加工

引物[Primer]

位于待合成或转录的DNA或RNA片段的某个特定序列并与该序列序列互补的一段核酸片段，可引导相应的DNA或RNA合成酶等启动DNA活RNA的合成或转录。

探针[Probe]

含有某一特定核酸或肽核酸碱基序列的被固定在基因芯片基片上的DNA、RNA、寡聚核苷酸或肽核酸[peptide nucleic acid，PNA]片段。

靶序列[Target Sequence，TS]

用于与基因芯片上的核酸探针进行杂交的互补核酸或肽核酸序列。

报告基团[Reporter Group，Y-]

在核酸标记反应中，本发明不是直接将信号标记物[如荧光信号分子等]连接到靶序列上，而是首先将一个中介基团连接到靶序列上，或通过合成的方法在靶序列上产生一个报告基团。报告基团作为一个标签、灯塔或接头，其目的是在下一步标记反应中，表明在基因芯片某个位点的某个探针分子上杂交事件的发生，同时准备与标记分子的连接。

报告引物[Reporter Primer]

通过酶学或化学方法合成的，连接有报告基团的引物序列。

报告靶序列[Report Target Sequence，RTS]

在DNA、RNA、寡聚核苷酸或肽氨酸分子末端或其他部位带有一个或若干个报告基团的靶序列。报告核苷酸[Reporter Nucleotide]

各种带有报告基团的[脱氧或双脱氧]核苷酸或核苷酸类似物，如氨基烯丙基脱氧核苷酸[aminoallyl deoxynucleotides，aa-dUTP等]、生物素基双脱氧核苷酸[biotin-ddUTP]等。在酶或化学作用下，这些报告核苷酸被掺入或连接到报告引物或报告靶序列中。

接头基团[Y’-]

通过共价键或非共价键力能够与报告基团可以发生特异性相互作用并与之结合的生物或化学分子或基团。

随机报告引物[Random Reporter Primer，RRP]

通过DNA合成仪合成的具有所有可能碱基序列的报告引物的总和。报告引物的引物部分通常是六聚或八聚核苷酸。

捕获序列

一个连接到靶序列上的一个特定碱基序列的核酸或肽核酸片段。捕获序列起着靶序列报告基团的作用，为下一步与高荷信号载体[HSC]的标记反应做好准备。它可以通过与固定在HSC表面的接头序列互补杂交而形成一条核酸双链的连接。

接头序列

固定[通过共价键或非共价键连接]在HSC表面，与捕获序列碱基互补配对的一段核酸序列。

本发明的技术原理

本发明提出一种间接法基因芯片线性放大标记技术，其原理是，将携带报告基团(Reporter Group)[Y-]的报告核苷酸[Reporter Nucleotides]，以样品中待测基因序列为模板，在酶或化学作用下掺入到靶序列中，合成报告靶序列[Reporter target sequences]，后者与被固定在基因芯片上的探针阵列杂交，形成报告靶序列与其互补探针的杂合双链，用表面修饰有报告基团接头基团[Y’-]的高荷信号载体[HSC]与该杂合双链反应并与之结合，从而实现信号放大标记。

这种基因芯片由基底及其表面的镀层或涂层和固定在基底[缩写为S]或镀层[缩写为C]表面的不少于两个阵列式排列的探针组成，用于检测样品中的生物或化学靶物质。基底和/或镀层或涂层的材料可以由但不限于如下材料中任意一种或一种以上不同材料组合制成：·

(1)无机片状或平板状材料类如玻璃、石英、云母，透明导电材料如透明导电氧化物类[TCO]，如氧化铟锡[indium tin oxide，ITO，或写为In₂O₃：Sn]、InAs、SnO₂:F、砷化镓[GaAs]、氧化镁等镀层，氧化锡[tin oxide，SnO]，ZnO，CdO，CdIn₂O₄，Cd₂SnO₄，Zn₂SnO₄和In₂O₃-ZnO等，以及碳/陶复合导电陶瓷，各种半导体材料等，以及多孔板模式，如微孔板、微滴板，

(2)单质类：铂、金、银、铝、铬[Au，Ag，Pt，Cu，Rh，Pd，Al，Cr]等金属以及硅等非金属，

(3)有机物类：各种有机分子及其由此制成的自组装单分子膜或自组装多分子膜，

(4)高分子类：尼龙膜、塑料、橡胶、树脂，硝酸纤维素膜。

基底的结构可以是但不限于如下种类：

(1)薄片/平板式：如玻璃片、硅片、尼龙膜、塑料片、

(2)多孔板式：如微孔板，微滴板式等，

(3)电极式：在薄片式基因芯片上以一定规律排列而成的各种电极阵列，如在半导体、绝缘体等基底上制成的铂电极、金电极等，

(4)微管式：由毛细管或有毛细管管状内腔结构特点的其它材料，按预先设定的位置对应规则排列而成的各种矩阵式毛细管基因芯片[二维平面排列]、线形毛细管基因芯片[一维线形排列]、以及在基片式结构中制作出的各种不少于一个微管道式空腔结构的矩阵式并行排列[即微流体电泳芯片等]，

本发明所说的基因芯片用来检测的探针、靶序列或者模板[T]可以是，但不限于如下种类之一或不同种类的组合或下面种类的某种成分，提取物：

(1)核糖核酸[RNA]，各种核糖核酸[″ribonucleic acid″and″RNA″]，包括信使RNA[简称mRNA]、转RNA[简称tRNA]、放大核糖核酸[amplified RNA]或反义核糖核酸[anti-sense RNA，简称aRNA]、互补RNA[cRNA]等，

(2)脱氧核糖核酸[DNA]如DNA，互补DNA[cDNA]等，

(3)寡核苷酸[oligonucleotide]，包括寡聚脱氧核糖核酸[oligodeoxynucleotide，简称ODNs]，寡聚核糖核酸[oligoribonucleotide，ORNs]，多聚核苷酸[polynucleotide]，

(4)核酸结构相似物[DNA-DNA，RNA-RNA or RNA-DNA mimic duplexes，triplexes or quadroplexes，等]]如肽核酸[peptide nucleic acids，简称PNA]，

(5)脱氧核糖核酸、核糖核酸、肽核酸及其结构相似物的互补双链、三[重]链、四[重]链等形式的杂交分子如DNA-DNA、RNA-DNA、RNA-RNA、PNA-DNA，PNA-RNA，PNA-RNA-PNA，PNA-DNA-PNA]等。

本发明在基因芯片处理技术中采用高荷信号载体(高分子荧光微球或含有大量荧光染料、半导体纳米晶量子点、电致发光分子等的高分子颗粒，通过合成技术将大量信号分子聚合为一体的各种形式的巨型信号分子，硅氧光学磁珠[silica beads]，胶体金[或纳米金颗粒，colloidal gold nanoparticles]，或通过任何其他手段将荧光染料，非荧光染料，半导体量子点、电致发光、化学发光或生物发光物质信号分子等固定于微粒的表面或包埋于其内部等多种形式的高荷信号载体)作为标记物进行分子信号放大。

本发明所要介绍的基因芯片信号放大标记技术，是以各种形式的高荷信号载体或信号体应用于标记各种形式的基因芯片探针、靶或探针-靶杂交体。

这里所说的基因芯片包括但不限于如下类型：基因芯片[包括各种DNA芯片，如玻璃基因芯片，膜芯片，实验室芯片，微流体芯片等]、以电化学原理或生物电子学原理为基础的各种生物传感器等。

本发明所使用基因芯片的检测原理可以是，但不限于如下种类之一或不同原理的结合：

(1)通过对固相表面定位在不同位置的探针-靶特异性亲合反应结合体或杂交体进行光学信号[如荧光分子、化学发光等]标记，然后经激发产生荧光、化学或生物发光并进行检测。以玻璃、硅片、尼龙膜等为材质的基因芯片、蛋白芯片、免疫芯片多采取这种模式；

(2)通过对标记的或未标记的探针或靶在施加了电压的液相中的移动速度或迁移率进行检测，即电泳技术或由电泳技术与其他技术结合而产生的其他技术，如毛细管电泳[capillaryelectrophoresis，CE]、毛细管区带电泳[capillary zone electrophoresis，CZE]、毛细管凝胶电泳[CGE]、高效毛细管电泳[HPCE]、毛细管等电聚焦[capillary isoelectric focusing(CIEF)]、等速电泳[isotachophoresis(ITP)]、动电色谱[electrokineticchromatography(EKC)]、胶束动电毛细管色谱[micellar electrokinetic capillarychromatography(MECC OR MEKC)]、毛细管电色谱法[capillaryelectrochromatography(CEC)]、非水相毛细管电泳[non-aqueous capillaryelectrophoresis(NACE)]等，

(3)通过探针、靶或探针-靶络合物以及它们的标记物不同的亲和力，进行色谱技术分析，如亲和层析[affinity chromatography]，SEC[size exclusion chromatography]，GPC[gelpermeation chromatography]，MCC[metal chelate chromatography]等，

(4)利用具有氧化还原性质的分子或分子的部分结构[即化学基团或功能团]、金属络合物或(核酸)嵌入剂与被定位并固定在固相表面不同位置或电极上的探针、靶或探针-靶络合物结合并在外加适当方式或适当大小的电压(或电势差)作用(直流电压或交变电流或脉冲电场或电压)下，发生氧化还原反应，致使从还原性分子或基团(电子授体，electrondonor)的电子转移到氧化性分子或基团(电子受体，electron acceptor)，形成电子流，通过电极传送到检测系统进行测量，所测得的电流强度大小与杂交并被标记的双链核酸的量成正比，

(5)利用双链核酸和单链核酸的导电性能差异，或利用由序列完全互补配对的核酸杂交所形成的双链核酸分子与有错配碱基对(Mismatches)存在的双链核酸(nucleic acids duplexes)分子之间在导电性能差异，通过对经由核酸分子传导的电子流大小的测量而对核酸分子由此所反映的其他方面所进行的各种鉴别、检测和考察，如在基因突变、基因多态性、基因测序、基因表达谱研究、疾病机理分析和疾病诊断等方面的应用，

(6)将发生在核酸分子上或由具有氧化还原性质的物质(包括但不限于，具有氧化还原性质的金属络合物以及由金属络合物或金属络合物的衍生物为单体聚合而成的聚合物、荧光分子、核酸嵌入剂等)所发生的电子或电荷转移反应或电子流转换成其他可检测或可考察形式的检测技术，如通过电致发光[Electroluminescence]原理，利用电致发光分子将电子流转换为光信号所进行的检测，

(7)直接或间接以具有氧化还原性物质(如二茂铁基)对探针或靶分子标记物，通过标记后可以使标记物接近电极表面而发生电子转移反应从而实现对发生在电极表面的生物或化学反应的检测。如摩托罗拉公司的eSensor Chips。

(8)通过探针、靶或探针-靶络合物以及它们的标记物不同的亲和力，进行色谱技术分析，如亲和层析[affinity chromatography]，SEC[size exclusion chromatography]，GPC[gelpermeation chromatography]，MCC[metal chelate chromatography]、动电色谱[electrokinetic chromatography(EKC)]、胶束动电毛细管色谱[micellarelectrokinetic capillary chromatography(MECC OR MEKC)]、毛细管电色谱法[capillary electrochromatography(CEC)]等。

这里所说基因芯片的高荷信号载体[HSC]是指通过任何方式将信号分子浓缩在微小颗粒内部、表面、挂载在表面上或三者兼而有之。这些HSC包括但不限于如下类型，以各种微小颗粒形式存在的高负荷光学、磁性、电子学或电化学信号载体，它可以是量子点微球[QD-tagged Microbeads]、高聚物荧光微球或高分子荧光微球[polymer microspheres]或胶体微珠[latex beads]，在颗粒表面、内部通过固定、包埋、化学共价键结合等方式将信号分子如荧光染料分子、化学发光分子、发色分子等浓集起来的[磁性]硅氧微珠[silica beads]、胶体发光半导体纳米晶量子点[colloidal fluorescent semiconductornanocrystal quantum dots]、树枝状高聚物纳米球[dendrimers]、星形树枝状高分子或树形分子[stardendrimers，dendrimeric stars or dendrimers]、蛋白质包裹的半导体纳米颗粒或微小颗粒或量子点[如Chaperonin mediated semiconductor nanoparticles.Chaperonin中以Chaperonin GroEL蛋白和T.th cpn蛋白包裹效果最佳]、胶束[micelles]、分子磁体[molecular magnets]、胶囊式微球[encapsulated spheres]、胶体纳米金[colloidal gold nanoparticles]、电致发光分子[electroluminescent molecules]、二茂金属基共聚物微球[polymetalcene block copolymers，如二茂铁基聚合物[polyferrocene block copolymers，PFC，或polyferrocenylsilanes，PFS]微球，多聚二茂锆[polyzirconocene，PZC]、多聚二茂金属基修饰或接枝的树枝状高分子[包括但不限于，聚二茂铁基接枝的树枝状高分子(polyferrocenyl-brancheddendrimers)]、二茂金属基或多聚二茂金属基修饰或接枝的纳米金胶体[包括但不限于，胺基二茂铁基功能化的纳米金胶体(Gold colloids functionalized with amidoferrocenyl structures)等]、共聚物微球或纳米球、含有富勒烯结构的或以富勒烯为单体之一的高聚物或共聚物、其它含荧光染料或化学发光[chemiluminescence]、生物发光[bioluminescence]材料的载体，藻胆蛋白类[phycobiliproteins]及其各种衍生物或生物或化学修饰物，以及上述每一种载体中不同参数[如大小、光学发射光波长、电磁学性质、表面生物或化学功能团修饰等物理或化学性质]载体的组合，或各种不同载体之间的相互组合。

本发明所要介绍的信号放大技术情景之一，是一种末端转移酶[Terminal DeoxyribonucleotidylTransferase，简写为TdT]介导的基因芯片信号放大标记技术，其特征是，将修饰了的核苷[modifiednucleotides]和未经修饰的核苷在该酶的作用下，利用样品中的待测基因(DNA、RNA或寡聚核苷酸)为模板，合成修饰了的靶序列。用此新合成的靶序列与固定在基因芯片表面的基因探针进行杂交。之后，经洗脱过程，再用表面修饰有可与该靶序列上的报告基团发生特异性反应的生物或化学基团的高荷信号载体与基因芯片上具有靶序列的杂交双链进行化学共价键或非共价键偶联，实现对杂交分子的特异性信号放大标记。

TdT是一个作用与模板序列无关的的DNA聚合酶，可以在3’-末端的羟基上加一个脱氧核苷，双链或单链上突出的、缩入的和平头的3’-末端都可以成为TdT的底物。

本发明所要介绍的信号放大技术情景之二，是一种随机报告引物法[Random Reporter Primer，简写为RRP]标记。这种方法是以随机引物法为基础的。即，由DNA聚合酶中具有5’→3’DNA合成活性的Klenow酶介导的基因芯片随机引物放大标记技术，其特征是，将修饰了的核苷[modified nucleotides]和未经修饰的核苷在该酶的作用下，以所有可能序列的寡聚核苷酸的混合物为引物，利用样品中的待测基因(DNA或RNA)为模板，合成修饰了的新核酸序列作为靶序列[Target Sequence，简写为TS]。在这种报告引物合成时，我们掺入氨基烯丙基脱氧核糖核苷[aminoallyl deoxynucleotide triphosphate，简写为aa-dNTPs]，生成带有一个或数个氨基修饰的引物。我们称之为报告引物[Reporter Primer]。所以，以此为引物合成的TS，在5’-末端带有一个或数个氨基。称之为报告靶序列[Reporter Target Sequence，简写为RTS]。报告引物中的氨基数目可以在DNA合成仪合成时进行控制，最佳数目为一个。其实即使不是一个，由于报告引物的长度有限，合成的RTS在后续的标记中会因为空间位阻，达到仅有一个HSC被共价键偶联标记。

用此新合成RTS与固定在基因芯片表面的基因探针进行杂交。之后，经洗脱过程，再用表面修饰有可与该新模板上的功能团发生特异性反应的生物或化学基团的高荷信号载体与基因芯片上具有RTS的杂交双链进行化学共价键或非共价键偶联，实现对杂交分子的特异性线性放大标记。

合成的所有可能序列的随机报告引物[RRP]混合物对样品溶液中的模板进行DNA或RNA合成、逆转录或体外转录等反应，从而合成相应的可用于杂交的报告靶序列[RTS]。在这样的RTS在互补杂交到基因芯片探针上之后，与表面固定了可与报告分子反应并发生共价偶联的HSC反应，实现信号线性放大标记。

本发明所要介绍的技术情景之三，是一种通过捕获序列为逆转录反应进行定量。利用此方法，未修饰或未标记的dNTP被分别加到试验cDNA和参照cDNA中，而oligo(dT)引物被加到RNA溶液中。所不同的是，这里的oligo(dT)引物含有一个捕获序列。比如，TTTTT------表示加到试验RNA溶液中、而TTTTT+++++++表示加到参照RNA溶液中的捕获序列。连接到上述引物上的两种不同的捕获序列分别用------和++++++表示。接着，逆转录反应合成的试验cDNA和参照cDNA混合并与基因芯片杂交。杂交和洗脱之后与高荷信号载体[HSC]标记物一起温浴。每个高荷信号载体[HSC]的表面分别固定有与上述捕获序列互补配对的核酸序列，称为接头序列，用于与基因芯片表面被杂交固定的捕获序列进行杂交。

这样，每一个cDNA分子只会产生一个信号强度。而且，合成的cDNA并不是一开始就被信号标记，而是先在引物上加上一个捕获序列，只是在温育阶段才被信号标记。

本发明所要介绍的技术情景之四，是通过化学法在作为靶基因的DNA、RNA、PNA或寡聚核苷酸或寡聚PNA的5’-端或3’-端合成一个可以特异性地发生化学偶联反应并形成共价键连接的基团，如氨基[-NH₂]、巯基[-SH]等。在该靶基因与基因芯片上的探针杂交之后，该基团作为报告分子可以进一步与标记分子[HSC]上的对应的特异性反应基团进行反应，从而形成牢固的共价键标记。这里的合成可以是在生物来源的DNA、RNA、PNA或寡聚核苷酸或寡聚PNA上进行的合成一个化学功能基团。

本发明所要介绍的技术情景之五，是直接在DNA、RNA或寡聚核苷酸酸分子合成时，在其末端加上一个这样的特异性化学功能团，作为后续标记过程的报告分子。只是这样的核酸或寡聚核苷酸酸序列根据不同的分子生物学过程，可以分别有不同的序列和功能要求。

如果靶基因是mRNA，那么可以通过合成与之5’-末端的poly(A)序列互补的oligo(dT)。同时，在oligo(dT)的5’-末端加上氨基或者巯基等基团，形成5’-H₂N-Oligo(dT)-3’或5’-HS-Oligo(dT)-3’等。之后，通过逆转录反应，在新合成的引物上，以靶基因mRNA为模板合成序列互补的5’-H₂N-Oligo(dT)-cDNA-3’，或5’-HS-Olig(dT)-cDNA-3’新的靶基因序列。该序列将被用于与基因芯片上的基因探针直接杂交。并与后续表面固定有可与上述特异性化学功能团[氨基、巯基等]反应并形成共价键连接的基团的高荷信号载体进行化学偶联标记反应。

通过酶学方法[如末端转移酶[terminal transferase，缩写为TT]、逆转录酶、(Taq)DNA聚合酶、Klenow酶[统称为酶，并用字母E表示]]合成的、或化学方法合成的标记反应可以用如下通式表示，

样品制备、杂交和标记过程的程式可以表示如下，

1.模板(T，可以是各种单链或双链的DNA、RNA、寡聚核苷酸或肽核酸)在酶(E)或化学作用下，形成靶序列ZNA(Y)n[ZNA可以是DNA、RNA、寡聚核苷酸或核酸类似物序列]，

T→ZNA(Y)n [I]

2.靶序列ZNA(Y)n与基因芯片上的核酸探针杂交，

ZNA(Y)n+_XNA→_XNA:ZNA(Y)n [II]

3.表面修饰有可与Y-报告基团特异性反应的生物或化学接头基团Y’-的高荷信号载体与基因芯片上的XNA:ZNA(Y)n进行化学共价键或非共价键偶联，

_XNA:ZNA(Y)n+HSC(Y’)m→_XNA:ZNA(Y)_n-p[-Y-Y’-]_p-HSC(Y’)_m-p[III]

上述n，m，p为从0到无穷大的任一自然数数值1，2，3...。但对上述技术情景之一、之三，p＝1时为最佳值。

XNA为基因芯片上的核酸探针或肽核酸探针序列，HSC为高荷信号载体。

Y-可以是但不限于：地高辛-，抗地高辛抗体-、氨基[如氨基烯丙基-，aa-，N-羟基琥珀酰亚胺基]等[见下表]。

由模板制备靶序列的酶[E]和酶学作用可以是，但不限于如下方式之一或不同方式之组合，

1.末端转移酶，[Terminal Deoxyribonucleotidyl Transferase，简称TdT]及在DNA的3’-末端加上一个[双脱氧核苷(dideoxynucleotides，如2’，3’-双脱氧腺嘌呤-5’-三磷酸(2′，3′-Dideoxy-adenosine 5′triphosphate，ddATP)，ddUTP，ddTTP，ddCTP)]或多个[脱氧核苷(deoxynucleotides，如(dUTP，dTTP，dCTP等)]碱基的末端转移反应，

2.逆转录酶，包括但不限于Superscript II RT、禽白血病毒(Avian MyoblastosisVirus，AMV)逆转录酶和小鼠反转录病毒(MMLV)逆转录酶，或者StrataScript逆转录酶、PowerScript逆转录酶，可用于逆转录过程中掺入媒介核苷，如Taq酶，

3.DNA聚合酶，如Taq酶，大肠埃希菌或大肠杆菌DNA聚合酶I，

4.具有5’→3’DNA合成活性的DNA聚合酶的Klenow片段，

5.RNA聚合酶，如SP6，T7和T3噬菌体RNA聚合酶[phage RNA polymerases]，可用于体外转录[in vitro transcription]法标记，Superscript II RT，

6.DNA聚合酶I[polymerase I]。

Y-功能团修饰核苷[modified nucleotides]可以是，但不限于：

1.氨基烯丙基-核苷，如氨基烯丙基-dUTP[aa-dUTP]，

2.生物素化的双脱氧核苷，如生物素化的双脱氧尿嘧啶[biotin-16-ddUTP]、

3. 地高辛修饰的双脱氧核苷，如DIG-11-ddUTP，双脱氧尿嘧啶三磷酸[djdeoxyuridine-triphosphate]，如(e.g-，IG-ddUTP)，

其中的Y-和Y’-可以分别是，但不限于如下表所示的反应对之一或它们的组合；

Y-或Y’-

ZNA-Y、NTP-Y、

ZNA-、NTP、

	dNTP-Y和ddNTP实例	dNTP、ddNTP实例
	dNTP-Y和ddNTP实例	dNTP、ddNTP实例	Phenyldiboronic acid，PDBA，SHA-地高辛-，DIG-地高辛-，抗地高辛抗体-氨基，如氨基烯丙基-，aa-，N-羟基琥珀酰亚胺基-，氨基-[aminolinker-]，地高辛-，DIG-NHS酯，N-羟基琥珀酰亚胺基[NHS-]-，抗地高辛抗体-，生物素基-，亲和素-，链霉亲和素-氯甲基[chloromethyl]、氨基巯基[sulfhydryl]，卤乙酸基[Haloacetyls]、烷基卤[Alkylhalide]衍生物、马来酰亚胺[Maleimides]、吖啶[Aziridines]；丙烯酰[Acryloyl]衍生物；芳基化[Arylating]试剂；巯基-双硫化合物置换试剂等捕获序列，5’-ATTCGGAA-3’；接头序列，3’-TAAGCCTT-5’	PDBA-UTPDIG-11-UTPDigoxigenin-11-ddUTPaa-dUTP，aa-UTP[Ambion，(Cat.#8437)DIG-X-NHS酯Biotin-UTP，biotin-dCTP，biotin-dUTP，biotin-ddUTP等aa-dUTP，aa-UTP[Ambion，(Cat.#8437)5’-HS-C6-Oligo(dT)-cDNA-OH-3’，5’-HS-cDNA-OH-3’等携带捕获序列的寡聚核苷酸酸引物[oligodeoxynucleotideprimers containing capturesecquences]，如3’-oligo(dT)-TAAGCCTT-5’或3’-oligo(dT)-GTAGCAAT-5’	核苷三磷酸-，UTP-、ATP-、CTP-、GTP-、TTP-双脱氧核糖核苷三磷酸-[ddNTP-]，如ddATP-，ddCTP-，ddUTP-，ddGTP-，ddTTP-.脱氧核糖核苷三磷酸[dNTP]，如dATP，dCTP，dUTP，dGTP，dTTP.同上5’-cDNA-OH-3’，5’-Oligo(dT)-3’寡聚核苷酸酸引物，如oligo(dT)，oligo(dA)...

这些修饰核苷的特点是，可以在核酸合成、转录或逆转录过程中，能够在酶的作用下，被掺入到合成后的靶基因序列中去。

本发明的间接标记反应，可以是，但不限于如下过程之一或不同过程之组合，

(1)末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxyribonucleotidyl Transferase，缩写为TdT)作用下将三磷酸脱氧核苷酸中的单磷酸核苷转移到DNA分子的3′-端羟基上的反应。末端脱氧核苷酸[TdT]转移过程。

(2)用Klenow酶的5’→3’DNA合成活性、以所有可能的碱基序列的寡聚核苷酸酸之混合物为引物的DNA合成过程，随机引物标记反应，

(3)在逆转录酶[Reverse transcriptase]作用下对mRNA的逆转录反应，

(4)用捕获序列连接的寡聚核苷酸酸引物进行的杂交标记反应。

HSC表示以各种微小颗粒形式存在的高负荷光学、磁性、电子学或电化学信号载体，它可以是高聚物或共聚物荧光微球、表面或内部固定有荧光染料或其他信号分子的硅氧[或者二氧化硅]微小颗粒[silicabeads]、半导体等无机物的量子点[quantum dots]、半导体等无机物纳米晶[nanocrystal particles]、树枝状高聚物纳米球[dendrimers]、星形树枝状高聚物纳米球[dendrimeric stars]、胶束[micelles]、分子磁体[molecular magnets]、胶囊式微球[encapsulated spheres]、胶体纳米金[colloidal gold nanoparticles]、电致发光分子[electroluminescent molecules]、多聚二茂金属共聚物微球[polymetalcene block copolymers，如多聚二茂铁共聚物[polyferrocene block copolymers，PFC]微球，多聚二茂锆[polyzirconocene，PZC]共聚物微球或纳米球、含有富勒烯结构的或以富勒烯为单体之一的高聚物或共聚物、其它含荧光染料或化学发光[chemiluminescence]、生物发光[bioluminescence]材料的载体，以及上述每一种载体中不同参数[如大小、光学发射光波长、电磁学性质、表面生物或化学功能团修饰等物理或化学性质]载体的组合，或各种不同载体之间的相互组合，其表面修饰有可以与通式(I)，(II)，(III)化合物中的探针分子接头Y’-特异性反应的功能团或作用对Y-。

实例一用生物素或地高辛修饰的双脱氧核苷的末端标记

该种方法的特点是只在每个被标记模板基因或靶基因的末端仅定量标记一个特异性功能团Y-，从而可以保障信号线性比例放大。当Y-为生物素基-、或地高辛基时，技术过程如下：

一、样品制备

用地高辛修饰的双脱氧尿嘧啶三磷酸[简写为DIG-ddUTP]或生物素化的双脱氧尿嘧啶三磷酸[简写为Biotin-ddUTP]核苷进行寡核苷酸的3’-末端标记。

末端转移酶[Terminal Transferase]可用来在单链[ssDNA]、双链[dsDNA]以及寡聚核苷酸[oligonucleotides]的3’-末端加上单个经修饰的双脱氧尿嘧啶三磷酸[dideoxyuridine triphosphate]，如(e.g ，DIG-ddUTP)。过程如下：

1.将纯化的试验组寡聚核苷酸溶解在无菌的双蒸水中，

2.在双蒸水中，制备1mM的X-ddUTP[X＝DIG-，Biotin-，氨基烯丙基(aminoallyl-)或氨基己基(aminocaproyl-)等]，

3.将下述成分在冰浴中加入到微离心管：1)4μl的5×反应缓冲溶液[1M钾，0.125M Tris-HCl，1.25mg/mlBSA；pH6.6，25℃](试管1)。2)4μl的25mM CoCl₂(试管2)。3)100pmole寡聚核苷酸[模板或靶基因，或cDNA]。4)1μl 1mM DIG-ddUTP(试管3)，或1μl 1mM Biotin-ddUTP。5)1μl(50U)末端转移酶(200mM甲次砷酸钾[potassium cacodylate]，1mM EDTA，200mM KCl，0.2mg/ml，小牛血清蛋白[BSA])，50％丙三醇[glycerol]，pH6.5[25℃](试管4).6)加入双蒸水直至中容量20μl.

4.将上述反应成分充分混合并简单离心，

5.在37℃下温育15分钟，然后放置到冰上。

6.用下述方法之一终止反应：

1)将200μl 0.2M EDTA(pH8.0)和1μl的糖原质溶液混合[浓度为20mg/ml的双蒸水]。

2)在反应混合物加2μl的糖原质-EDTA混合液。

7.用下述步骤沉淀标记了的寡聚核苷酸[可选步骤]：[1]在反应试管中，加入2.5μl 4M的LiCl和75μl预先在-15℃到-25℃冰镇的绝对乙醇。充分混匀：[2]在-70℃沉淀30分钟；[3]在13,000×g和2-8℃条件下离心15分钟；[4]弃上清液；[5]用50μl冰镇的70％(v/v)洗涤沉淀小粒；[6]在2-8℃条件下离心5分钟；[7]弃上清液；[8]在真空下干燥沉淀小粒。

8.将沉淀小粒溶解在微量无菌、双蒸水中，然后在杂交缓冲溶液中稀释等量的探针溶液以适合直接使用。

9.用上述与步骤1-8同样方法制备一个参照组报告分子标记的cDNA或寡聚核苷酸溶液。

生物素化的双脱氧尿嘧啶三磷酸[Biotin-16-ddUTP]、地高辛修饰的双脱氧尿嘧啶三磷酸[Digoxigenin-11-ddUTP]、重组末端转移酶[自E.Coli]等购自Roche Applied Science公司。其它常规试剂有市售。

二、杂交

下述过程介绍将两种样品[标记了的参照组cDNA和试验组cDNA]杂交到一个寡聚核苷酸微点阵上去。

材料：总容积为42ul试验组和对照组报告分子标记了的cDNA或寡聚核苷酸溶液[各21ul]20×，SSC(Ambion Cat#9765)，10％SDS，杂交室，寡聚核苷酸微点阵；98℃ heating block；42℃水浴；2X杂交缓冲溶液：50％甲醛，10x SSC，0.2％SDS

技术流程：

1.加入12ul竞争性DNA mix；

2.确定样品体积，并加水直到总体积为54微升，

3.将样品在98℃加热3分钟，

4.将2x杂交缓冲溶液和上述cDNA或寡聚核苷酸报告分子标记溶液在42℃下温育20分钟，

5.将玻片微点阵在100℃的dH2O中加热10min，再用轻缓空气流干燥，

6.将盖玻片洗净、干燥并放置在玻片微点阵上，

7.将60ul(1x体积)的2X杂交缓冲液加入到上述cDNA或寡聚核苷酸报告分子标记溶液并充分混合，

8.将杂交溶液加载到盖玻片下面；通过毛细管作用让杂交溶液缓慢从微点阵的一端被吸向另一端，并覆盖微点阵的全部面积。

9.将2个各5ul的2X SSC加注到杂交溶液未覆盖的部位。

10.封闭杂交室并沉浸在42℃的水浴中过夜。

11.将玻片微点阵从杂交室中移走。

12.将其浸入一个50ml的装有45ml 2X SSC/0.1％SDS的试管中，并使盖玻片通过重力作用自然与玻片微点阵分离。

13.将微点阵转移到一个新装有45ml 2X SSC/0.1％SDS的试管中，并在室温下轻轻振动5分钟。

14.重复步骤13。

15.将微点阵转移到一个新装有45ml 2X SSC的试管中，并在室温下轻轻振动5分钟。

16.重复步骤15。

17.将微点阵转移到一个新装有45ml 2X SSC的试管中，并在室温下轻轻振动5分钟。

18.重复步骤17。

19.将微点阵浸入到0.06X SSC的溶液中并转移到一个离心管中。

20.将玻片微点阵从0.06X SSC溶液中那走，并放入一个空试管中，并立即在800rpm离心2-3min。

要确保微点阵在离心前处于湿润状态。

三、标记

标记过程即是使高荷信号载体[HSC]表面固定的可与靶基因上连接的报告分子特异性反应的基团或分子与之反应并形成共价键偶联的过程。为此，需首先合成这种HSC。以本实施例中作为报告分子的生物素而言，应该合成表面固定有亲和素的HSC。[合成过程参见本人的中国发明专利申请：基因芯片酶法微球放大标记。申请号，031420818]。

四、洗脱

洗脱缓冲溶液A：SDS 2％，2X SSC。洗脱缓冲溶液B：SDS 1％，0.06X SSC。

洗脱缓冲溶液C：ddH₂O。

1.将cDNA或寡聚核苷酸微点阵从经过标记处理过程的反应室中取出，

2.转移到装有400ml 1X洗脱缓冲溶液A的Wash Station。

3.在20-25℃下强力洗涤5min。

4.转移到装有400ml 1X洗脱缓冲溶液B的Wash Station.

5.在20-25℃下强力洗涤5min.

6.转移到装有400ml 1X洗脱缓冲溶液C的Wash Station.

7.在20-25℃下强力洗涤2min。

8.用实验用擦纸将微点阵上的剩余缓冲溶液沥干。

9.在500×g条件下离心。

10.在扫描上对微点阵进行扫描，获取荧光图像。

实例二用氨基修饰的双脱氧腺嘌呤的末端标记

该种方法的原理和过程与实例一相同。其中，Y-为氨基-[-NH₂]。而Y’-为NHS酯。

胺基修饰的双脱氧核苷三磷酸为3’-氨基-2’，3’-双脱氧腺嘌呤-5’-三磷酸(3′-amino-2′，3’-dideoxyadenosine-5′-triphosphate)，简写为3’-amino-ddATP，或AddATP。(TriLinkBiotechnologies Inc，San Diego，CA)]。

实例三用氨基修饰的双脱氧胞嘧啶的末端标记

胺基修饰的双脱氧核苷三磷酸为3’-氨基-2’，3’-双脱氧胞嘧啶-5’-三磷酸(3’-amino-2’，3’-dideoxycytidine-5’-triphosphate)，简写为3’-amino-ddCTP，或AddCTP.(TriLinkBiotechnologies Inc，San Diego，CA)]。

实例四用氨基修饰的双脱氧鸟嘌呤的末端标记

胺基修饰的双脱氧核苷三磷酸为3’-氨基-2’，3’-双脱氧鸟嘌呤-5’-三磷酸(3’-amino-2’，3’-dideoxyguanosine-5’-triphosphate)，简写为3’-amino-ddGTP，或AddGTP。(TriLinkBiotechnologies Inc，San Diego，CA)]。

实例五用氨基修饰的双脱氧鸟嘌呤的末端标记

胺基修饰的双脱氧核苷三磷酸为3’-氨基-2’，3’-双脱氧尿嘧啶-5’-三磷酸(3’-amino-2′，3’-dideoxyuridine-5’-triphosphate)，简写为3’-amino-ddUTP，或AddUTP。(TriLinkBiotechnologies Inc，San Diego，CA)]。

实例六通过捕获序列和逆转录反应对基因表达进行定量

Stears，Robin L.等人利用树状分子[Dendrimer]通过捕获序列对微点阵进行信号放大可以将RNA样品需求量减少16倍。本实施例使用荧光微球等为HSC。本方法允许在单个基因芯片上进行多通道检测。和树状分子一样，由于荧光微球等在信号放大能力上优于前者，所以会产生更高的信噪比，并更容易对杂交在基因芯片上的cDNA单个计数，从而确立较之于树状分子更好的计数标准。

另外，本实施例所使用的方法比DNA树状分子方法更简单、快捷。

在逆转录反应中，目前通用的将荧光分子修饰核苷酸掺入进去的Cy3/Cy5方法需要大量的起始样品，多达50μg的总RNA或1μg的mRNA。

本实施例以高分子荧光微球或二氧化硅荧光微球为HSC。

1.HSC结合探针的合成经修饰的逆转录(Modified RT，简称mRT)引物序列合成如下(由Integrated DNA Technologies公司)(5’to 3’)：cap3D1，g gCg ggA CAg AAg ACg CgC AgT gAgTCg gCC，oligo d(T)，cap3D2，A CCg gAg Cgg CAC ggg AAA ATg AgC AAC Agg，oligo dT。1皮摩尔的mRT引物可用于40μg的总RNA分析。

2.HSC含有下列接头序列用于RT反应：cpl3D1(与cap3D1互补)，ggC CgA CTC ACT gCg CgTCTT CTg TCC CgC C；cpl3D2(与cap3D2互补)，CCT gTT gCT CTA TTT CCC gTg CCgCTC Cgg T(Genisphere)。

3.RT反应根据标准的GIBCO，SuperScript RT II技术流程进行。反应进行完成之后，加入3.5μl的0.5M NaOH/50mM EDTA，并且被加热到65℃ 10min以使DNA/RNA杂交双链变性解链。

4.用5μl的1M Tris，pH 7.5溶液中和该反应。对于双重标记(双色标记)的检测，用直接掺入法Cy3/Cy5RT反应技术流程见Stears R.L.等人和DeRisi JL等人的所介绍的高密度DNA微点阵直接标记法进行。

5.对于HSC检测，2.0μl两种各自不同激发/发射波长[分别为543nm/570nm和640nm/675nm]的二氧化硅荧光微球[激发/发射波长接近Cy3-和Cy5-标记系统](上海迈克沃生物科技公司)被重新悬浮于15μl的4×SSC-2％SDS并被施加到微点阵玻璃片上。微点阵用盖玻片盖好，在基因芯片杂交室(Telechem International)中和65℃条件下温育6-8h。按Stears R.L.等人和DeRisiJL等人的所介绍的方法杂交、洗脱并在ScanArray 3000激光共聚焦扫描仪(GSI Lumonics)上进行检测。

6.信号和本底噪音用Imagene的定量软件进行定量分析。以微点阵网格中每个圆圈中的平均像素光强度信号作为信号测定值。以微点阵中没有cDNA的空白点的平均像素光强度为平均本底噪音[背景]并被作为网格圆圈外部平均像素的光强度，用于计算特定的信号值。

7.HSC试剂制备选取表面修饰有伯胺基的上述两种光学特性的二氧化硅荧光微球[上海迈克沃生物科技公司]为HSC。通过DNA合成仪合成5′-末端为巯基的5′-SH-mRT引物序列。进行化学偶联时，通过离心沉淀将HSC沉淀为固态小粒，溶解在绝对乙醇中。在室温条件下，在试管内加入上述HSC、5′-SH-mRT引物序列以及双异功能基的聚乙烯醇[PEG]连接臂[NHS-PEG-MAL]的绝对乙醇溶液，经化学偶联反应合成表面固定有接头序列的HSC-(NH-CO-PEG-MAL-S-5′-mRT-3′)_n，简写为HSC-(mRT)_n。反应混合物再经离心沉淀、弃去上清液、再次将沉淀溶解在绝对乙醇中、用绝对乙醇洗涤沉淀小粒。在避光、-20℃存储。使用时，用无菌双蒸水制备的1％SDS溶液溶解沉淀小粒至固体物浓度为1-5％。

8.半导体量子点作为HSC 因为每个半导体量子点的荧光强度一致性比较强，标准误差较小，一般可以控制在4-5％，所以，作为标记试剂的标准问题参见Stears Robin L.等人的方法确定。

9.高分子或二氧化硅荧光微球作为HSC试剂的标准化对这两种光学微球，虽然它们的标准误差较树状分子大，一般随着体积增大，直径标准误差变小。比如Duke Scientific公司的高分子荧光微球的CV[coefficient of variation]一般直径在0.90um时，CV＜3％；0.03微米时，直径的CV＜-20％。由于基因芯片的标记实验通常是大量分子的标记，所以，比较可行的方法是对这种标记进行统计学数据分析。首先，用体式荧光显微镜[Nikon或Olympus]对散布在空白玻片上限定区域内的荧光微球进行人工计数。然后，在基因芯片激光共聚焦扫描仪上，对该限定区域上在激发光激发下发生的荧光信号总强度进行积分。这样就可以求得平均每个HSC的信号强度。获得这个平均值之后，可以根据基因芯片的检测中测得的某个基因点的荧光总强度求的其统计学意义上的固定在该点上的杂交基因的个数。

实例七通过报告分子和逆转录反应对基因表达进行定量

本实施例与实例六相近。逆转录反应条件和过程与实例六相同或相近。它是直接在DNA、RNA或寡聚核苷酸酸分子合成时，在其末端加上一个特异性生物或化学功能团，作为后续标记过程的报告分子。通式I、II、III中，XNA为mRNA，ZNA为5’-Oligo(dT)-引物序列-cDNA-3’，ZNA(Y)n为5’-H₂N-Oligo(dT)-引物序列-cDNA-3’或5’-HS-Oligo(dT)-引物序列-cDNA-3’等，HSC-Y′_n中的Y′-为琥珀酰亚胺酯或马来酰亚胺酯，E为逆转录酶[Reverse Transcriptase，RT]，化学偶联标记反应过程同实例六。

实例八随机报告引物法(Random Reporter Primer Method，简称RRP方法)

使用TriLink Biotechnologies公司生产的5’-末端带有C12连接臂的氨基修饰的寡聚核苷酸。合成带有5′-C12-NH₂各种可能序列的六聚核苷酸[Hexamers]或八聚核苷酸[Octomers][3′-oligonucleotide-5′-OPO₃ ^--(CH2)_n-NH₂，n为自然数。产品号：0-0003、0-0004、0-0005等]作为RT反应引物，即RRP。用Charlie C.Xiang等人的RNA纯化、逆转录、杂交、洗脱及检测条件，进行试验。

HSC可以选取Duke Scientific，Molecular Probes等公司的表面修饰氨基的荧光聚苯乙烯微球。HSC标记反应过程—化学偶联参见实例六。

实例九用氨基烯丙基核苷酸合成RRP

在合成cDNA时，以氨基烯丙基核苷酸，如氨基烯丙基dUTP[5-Aminoallyl—2′-deoxyuridine-5′-Triphosphate(TriLink Biotechnologies，Inc)]为RRP，通过逆转录反应合成用于与基因芯片杂交的cDNA。其他反应过程及条件可参见实例六。

实例十用氨基烯丙基核苷酸合成RRP

在合成cDNA时，以氨基烯丙基核苷酸，如氨基烯丙基dCTP[5-Aminoallyl-2′-deoxycytidine-5′-Triphosphate，TriLink Biotechnologies，Inc]为RRP，通过逆转录反应合成用于与基因芯片杂交的cDNA。其他反应过程及条件可参见实例九。

实例十一5’-氨基-Oligo-dT报告引物法(5’-amino-Oligo-dT Reporter Primer Method，简称5’-H₂N-OT-RP)

在cDNA合成中，用5’-NH₂修饰过的Oligo-dT合成5’-NH₂-Linker-Oligo(dT)-OH-3’为报告引物，通过逆转录反应合成5’-NH₂-Linker-Oligo(dT)-cDNA-OH-3’。其他反应过程及条件可参见实例九。

实例十二5′-巯基-Ollgo-dT-3’报告引物法(简称5’-HS-OT-RP)

在cDNA合成中，用5’-末端C6巯基连接臂修饰过的Oligo-dT合成5’-HS-C6-Oligo(dT)-OH-3’[TriLink Biotechnologies，Inc]]为报告引物，通过逆转录反应合成5’-HS-C6-Oligo(dT)-cDNA-OH-3’。HSC(Y’)中的Y’为氨基，双异功能团连接臂仍然选用NHS-PEG-MAL或NHS-PEG-VS[琥珀酰亚胺基-聚乙二醇(连接臂)-乙烯基砜]。偶联反应过程见实例六。其他反应过程及条件见实例九。

实例十三5′-巯基-RP-3’报告引物法(简称5’-HS-RRP-3’)

在cDNA合成中，用客户订做的方法合成各种可能序列的5’-末端-C6-巯基连接臂修饰过的六聚核苷酸或八聚核苷酸5’-HS-C6-RP-OH-3’，作为5’-巯基随机报告引物(5′-HS-RRP-3)[TriLinkBiotechnologies，Inc提供此业务。产品编号：O-0016]，通过逆转录反应合成5’-HS-cDNA-OH-3’。HSC(Y’)中的Y’为氨基，双异功能团连接臂仍然选用NHS-PEG-MAL或NHS-PEG-VS[琥珀酰亚胺基-聚乙二醇(连接臂)-乙烯基砜]。偶联反应过程见实例六。其他反应过程及条件见实例九。

实例十四 5′-羧基-RP-3′报告引物法(简称5’-HOOC-RRP-3′)

在cDNA合成中，用客户订做的方法合成各种可能序列的5’-末端-羧基-DADE连接臂修饰过的六聚核苷酸或八聚核苷酸5’-HOOC-DADE-RP-OH-3’，作为5’-巯基随机报告引物(5′-HOOC-RRP-3)[TriLink Biotechnologies，Inc提供此业务。产品编号：O-0015]，通过逆转录反应合成5’-HOOC-cDNA-OH-3’。RP为六聚核苷酸或八聚核苷酸。

HSC(Y’)中的Y’为氨基。偶联反应过程无须使用双异功能团连接臂。选用水溶性碳二亚胺[1-ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)carbodiimide，EDAC]为偶联剂。其他反应过程及条件见实例九。共价偶联反应如下：

荧光微球，10％固体浓度，250μl。EDAC，40mg。

缓冲液A：NaH₂PO₄-10mM，pH 6.0。

偶联方法：

1.将所有可能序列的5′-HOOC-RRP-3′混合物溶解在缓冲溶液A中。

2.在5毫升的玻璃试管中，将1000μl的缓冲溶液A与250微升10％的HSC混合。

3.将EDAC溶解在缓冲溶液A中，至最终浓度为20mg/ml。

4.将125μl的溶解的EDAC加入到稀释的HSC悬浮液中，混合。

5.将上述混合物在室温下轻微振荡温育2小时，或在4℃下过夜。

6.用缓冲溶液A洗涤两次并重新悬浮于下述杂交缓冲溶液中。

实例十五氯甲基化的HSC与氨基烯丙基-RRP

在合成cDNA时，以氨基烯丙基核苷酸，如氨基烯内基dCTP[5-Aminoallyl-2′-deoxycytidine-5′-Triphosphate，TriLink Biotechnologies，Inc]合成RRP，再通过逆转录反应合成用于与基因芯片杂交的cDNA。

HSC(Y’)n选用Merck Eurolab France公司的表面修饰了氯甲基的荧光微球。Y’-为氯甲基[CH₂Clgroup]。HSC-[CH₂Cl]n与氨基的共价偶联方法如下：

1.将10％(100mg/ml)的ESTAPOR^_微球用洗涤/偶联缓冲溶液(1ml/10ml)洗涤两次。缓冲溶液为：PBS，pH7.5。

2.在5毫升的洗涤/偶联缓冲溶液中重新悬浮[超声波或摇摆法振荡]。

3.将RRP溶解在5毫升的洗涤/偶联缓冲溶液中。

4.在室温和不断振荡下，反应3-4小时。洗涤，并将之重新悬浮在10毫升的反应终止溶液中，室温下轻度振摇混合30分钟。反应终止溶液的伯胺基来源：30-40mM羟胺[hydroxylamine]，乙醇胺[ethanolamine]或甘氨酸[glycine]等，含有0.05-1％(w/v)封闭分子[Blocking molecules](BSA，Casein，Pepticase，Tween 20，Triton X-100，PE G，Sera，或者IgG).

5.洗涤，并以10mg/ml浓度重新悬浮于存储缓冲溶液[存储缓冲溶液：pH 7-7.5有0.01-0.1％(w/v)封闭分子和NaN3(0.09％).]。

6.存储到4℃直到应用。

其他反应过程及条件可参见实例九。

Claims

1.一种间接法基因芯片线性放大标记技术，其特征是，以各种核酸分子、核酸分子结构类似物或其分子的某个片段为模板，在通过生物或化学作用下制备成可直接与基因芯片上的探针分子进行杂交的靶序列，在该靶序列的末端连接有报告基团[Y-]，该报告基团用来与杂交后通过特异性分子识别作用与其进行连接、并被固定在高荷信号载体[HSC]表面的映象基团[Y’-]进行化学或生物偶联，从而形成针对杂交事件的特异性的信号放大标记。

2.根据权利要求1所述的基因芯片，是由基底及其表面的镀层或涂层和固定在基底[缩写为S]或镀层[缩写为C]表面的不少于两个阵列式排列的捕获探针组成，用于检测样品中的基因靶基因，基底和/或镀层或涂层的材料可以由但不限于如下材料中任意一种或一种以上不同材料组合制成：

(1)无机物片状材料类如玻璃、石英、云母，透明导电材料如透明导电氧化物类[TCO]，如氧化铟锡[indium tin oxide，ITO，或写为In₂O₃:Sn]、SnO₂:F、砷化镓[GaAs]、氧化镁等镀层，氧化锡[tin oxide，SnO]，ZnO，CdO，CdIn₂O₄，Cd₂SnO₄，Zn₂SnO₄和In₂O₃-ZnO等，以及碳/陶复合导电陶瓷，各种半导体材料等，

(2)单质类：铂、金、银、铝、铬[Au，Ag，Pt，Cu，Rh，Pd，Al，Cr]等金属以及硅非金属等，

(4)高分子类：尼龙膜、醋酸纤维素膜、各种塑料、橡胶、树脂，基底的结构可以是但不限于如下种类：

(1)薄片式：如玻璃片、硅片、尼龙膜、塑料片、微孔板，微滴板式等，

(2)电极式：在薄片式基因芯片上以一定规律排列而成的各种电极阵列，如在半导体、绝缘体等基底上制成的铂电极、金电极等，

(3)微管式：由毛细管或有毛细管管状内腔结构特点的其它材料，按预先设定的位置对应规则排列而成的各种矩阵式毛细管基因芯片[二维平面排列]、线形毛细管基因芯片[一维线形排列]、以及在基片式结构中制作出的各种不少于一个微管道式空腔结构的矩阵式并行排列[即微流体电泳芯片等]，

(4)微粒式：以微小颗粒为固相载体，生物分子或化学分子被固定在其表面，通过微小颗粒的大小、[发光]颜色、表面电势、表面电荷密度等性质元素进行分类组合从而产生出大量不同组合的微粒，分别用某一特定组参数的组合[某一尺寸和某发光波长等的特殊组合---编码]的微小颗粒作为某生物或化学分子的载体，从而可以用大量不同且特殊编码微小颗粒制成基因芯片。

3.根据权利要求1所述的模板[T]、探针[P]和靶序列[TS]可以是，但不限于如下种类之一或不同种类的组合：

(1)核糖核酸[RNA]，各种核糖核酸[″ribonucleic acid″ and″RNA]，包括信使RNA[简称mRNA]、转录RNA[简称tRNA]、反义核糖核酸[aRNA]、互补RNA[cRNA]等，

(2)脱氧核糖核酸[DNA]如DNA，互补DNA[cDNA]等，

(4)核酸结构相似物[DNA-DNA，RNA-RNA or RNA-DNA mimic duplexes，triplexes or quadroplexes，等]]如肽核酸[pcptide nucleic acids，简称PNA]，

(5)脱氧核糖核酸、核糖核酸及其结构相似物的互补双链、三[重]链、四[重]链等形式的杂交分子如DNA-DNA、RNA-DNA、RNA-RNA、PNA-DNA，PNA-RNA，PNA-RNA-PNA，PNA-DNA-PNA]等，基因芯片的检测原理可以是，但不限于如下种类之一或不同原理的结合：

(1) 通过对固相表面定位在不同位置的探针-靶特异性杂交反应进行光学信号[如荧光分子、化学发光等]标记，然后经激发产生荧光、化学或生物发光并进行检测，

(2)通过对标记的或未标记的探针或靶在施加了电压的液相中的移动速度或迁移率进行检测，即电泳技术或由电泳技术与其他技术结合而产生的其他技术，如毛细管电泳[capillary electrophoresis，CE]、毛细管区带电泳[capillary zone electrophoresis，CZE]、毛细管凝胶电泳[CGE]、高效毛细管电泳[HPCE]、毛细管等电聚焦[capillary isoelectric focusing(CIEF)]、等速电泳[isotachophoresis(ITP)]、动电色谱[electrokinetic chromatography(EKC)]、胶束动电毛细管色谱[micellar electrokinetic capillary chromatography(MECC OR MEKC)]、毛细管电色谱法[capillary electrochromatography(CEC)]、非水相毛细管电泳[non-aqueous capillary electrophoresis(NACE)]等，

(3)通过探针、靶或探针-靶络合物以及它们的标记物不同的亲和力，进行色谱技术分析，如亲和层析[affinity chromatography]，SEC[size exclusion chromatography]，GPC[gel permeationchromatography]，MCC[metal chelate chromatography]等，

(4)利用具有氧化还原性质的分子或分子的部分结构[即化学基团或功能团]、金属络合物或(核酸)嵌入剂与被定位并固定在固相表面不同位置或电极上的探针、靶或探针-靶络合物结合并在外加适当方式或适当大小的电压(或电势差)作用(直流电压或交变电流或脉冲电场或电压)下，发生氧化还原反应，致使从还原性分子或基团(电子授体，electron donor)的电子转移到氧化性分子或基团(电子受体，electron acceptor)，形成电子流，通过电极传送到检测系统进行测量，所测得的电流强度大小与杂交并被标记的双链核酸的量成正比，

(7)直接或间接以具有氧化还原性物质(如二茂铁基)对探针或靶分子标记物，通过标记后可以使标记物接近电极表面而发生电子转移反应从而实现对发生在电极表面的生物或化学反应的检测。

4.根据权利要求1所述的基因芯片线性放大标记技术，其样品制备、杂交、标记反应模式可以是，但不限于如下通式所描述的情景之一或不同情景之组合，样品制备、杂交和标记过程的程式可以表示如下，

a)模板(T，可以是各种单链或双链的DNA、RNA、寡聚核苷酸或肽核酸)在酶(E)学作用、化学作用或酶学作用和化学作用共同作用下，形成靶序列ZNA(Y)n[ZNA可以是DNA、RNA、寡聚核苷酸或核酸类似物序列]，

T→ZNA(Y)n [I]

b)靶序列ZNA(Y)n与基因芯片上的核酸探针杂交，

ZNA(Y)n+_XNA→_XNA:ZNA(Y)n [II]

c)表面修饰有可与Y-报告基团特异性反应的生物或化学映象基团Y’-的高荷信号载体与基因芯片上的XNA:ZNA(Y)n进行化学共价键或非共价键偶联，

_XNA:ZNA(Y)n+HSC(Y’)m→

_XNA:ZNA(Y)_n-p[-Y-Y’-]_p-HSC(Y’)_m-p [III]

上述n，m，p为从0到无穷大的任一自然数数值1，2，3...，

XNA为基因芯片上的核酸探针或肽核酸探针序列，

HSC为高荷信号载体。

5.根据权利要求4所述的由模板制备靶序列的酶和酶学作用可以是，但不限于如下方式之一或不同方式之组合，

a)末端转移酶[Terminal Deoxyribonucleotidyl Transferase，简称TdT]，及在DNA的3’-末端加上一个[双脱氧核苷酸(dideoxynucleotides，如2’，3’-双脱氧腺嘌呤-5’-三磷酸(2′，3′-Dideoxy-adenosine 5′-triphosphate，ddATP)，ddUTP，ddTTP，ddCTP)]或多个[脱氧核苷酸(deoxynucleotides，如(dUTP，dTTP，dCTP等))带有报告基团的碱基的末端转移反应，从而生成报告靶序列，

b)具有5’→3’DNA合成活性的DNA聚合酶的Klenow片段[酶]，通过随机报告引物法[Random Reporter Primer，简写为RRP]在该酶的作用和由一个报告基团和一个核酸或肽核酸引物两部分通过共价键连接而成的报告引物[Reporter Primer]的驱动下，合成报告靶序列[Reporter Target Sequence，RTS]，

c)逆转录酶，包括但不限于Superscript II RT、禽白血病毒(AvianMyoblastosis Virus，AMV)逆转录酶和小鼠反转录病毒(MMLV)逆转录酶，或者StrataScript逆转录酶、PowerScript逆转录酶，可用于逆转录过程中掺入媒介核苷，如Taq酶，

d)DNA聚合酶，如Taq酶，大肠埃希菌或大肠杆菌DNA聚合酶I，，DNA聚合酶I[polymerase I]，

e)RNA聚合酶，如SP6，T7和T3噬菌体RNA聚合酶[phage RNA polymerases]，可用于体外转录[in vitro transcription]法标记，Superscript II RT。

6.根据权利要求4所述的由模板制备靶序列的化学作用可以是，但不限于如下方式之一或不同方式之组合，

a)随机报告引物法[Random Reporter Primer，简写为RRP]标记，通过合成所有可能序列的报告引物[Reporter Primer]为从模板合成报告靶序列做好准备，

b)合成修饰了的脱氧核苷酸或双脱氧核苷酸，为末端转移法合成靶序列提供带有报告基团的核苷酸结构类似物，

c)合成带报告基团的寡聚核苷酸作为报告引物，如合成带有5’-氨基报告基团的寡聚胸腺嘧啶[5’-氨基-Oligo-dT]，为合成带有5’-氨基报告基团的cDNA靶序列做好准备，所带的报告基团[Y-]还可以是，但不限于巯基、羧基、羟基、氯甲基、生物素和地高辛。

7.根据权利要求1、权利要求4和权利要求6所述的Y-和Y’-可以分别是，但不限于如下表所示的反应对之一或它们的组合： Y-或Y’-[举例，但不限于] ZNA-Y、NTP-Y、dNTP-Y和ddNTP实例 ZNA、NTP、dNTP、ddNTP实例 Phenyldiboronic acid，PDBA，SHA-地高辛-，DIG-地高辛-，抗地高辛抗体-氨基，如氨基烯丙基，aa-，N-羟 PDBA-UTPDIG-11-UTPDigoxigenin-11-ddUTPaa-dUTP，aa-UTP[Ambion，(Cat.# 核苷三磷酸，UTP、ATP、CTP、GTP、TTP双脱氧核糖核苷三磷酸[ddNTP]，如ddATP，ddCTP，ddUTP，ddGTP，ddTTP。

基琥珀酰亚胺基，氨基[aminolinker-]，地高辛-，DIG-NHS酯，N-羟基琥珀酰亚胺基[NHS-]，抗地高辛抗体-，生物素基，亲和素-，链霉亲和素-氯甲基[chloromethyl]、氨基、羧基巯基[sulfhydryl，HS-]，卤乙酸基[Haloacetyls]、烷基卤[Alkylhalide]衍生物、马来酰亚胺[Maleimides]、吖啶[Aziridines]；丙烯酰[Acryloyl]衍生物；芳基化[Arylating]试剂；巯基-双硫化合物置换试剂等捕获序列，5’-ATTCGGAA-3’；接头序列，3’-TAAGCCTT-5’ 8437)DIG-X-NHS酯Biotin-UTP，biotin-dCTP，biotin-dUTP，biotin-ddUTP等aa-dUTP，aa-UTP[Ambion，(Cat.#8437)5’-HS-C6-Oligo(dT)-cDNA-OH-3’，5’-HS-cDNA-OH-3’携带捕获序列的寡聚核苷酸酸引物[oligodeoxynucleotideprimers containing capturesequences]，如3’-oligo(dT)-TAAGCCTT-5’或3’-oligo(dT)-GTAGCAAT-5’ 脱氧核糖核苷三磷酸[dNTP]，如dATP，dCTP，dUTP，dGTP，dTTP。同上5’-cDNA-OH-3’，5’-Oligo(dT)-3’寡聚核苷酸酸引物，如oligo(dT)，oligo(dA)...

8.据权利要求1中所述的高荷信号载体[HSC]可以是，但不限于，以各种微小颗粒形式存在的高负荷光学、磁性、电子学或电化学信号载体，它可以是量子点微球[QD-tagged Microbeads]、高聚物荧光微球或高分子荧光微球[polymer microspheres]或胶体微珠[latex beads]，在颗粒表面、内部通过固定、包埋、化学共价键结合等方式将信号分子如荧光染料分子、化学发光分子、发色分子等浓集起来的[磁性]硅氧微珠[silica beads]、胶体发光半导体纳米晶量子点[colloidal fluorescent semiconductor nanocrystal quantumdots]、树枝状高聚物纳米球[dendrimers]、星形树枝状高分子或树形分子[stardendrimers，dendrimeric starsor dendrimers]、蛋白质包裹的半导体纳米颗粒或微小颗粒或量子点[如Chaperonin mediatedsemiconductor nanoparticles.Chaperonin中以Chaperonin GroEL蛋白和T.th cpn蛋白包裹效果最佳]、胶束[micelles]、分子磁体[molecular magnets]、胶囊式微球[encapsulated spheres]、胶体纳米金[colloidal goldnanoparticles]、电致发光分子[electroluminescent molecules]、二茂金属基共聚物微球[polymetalcene blockcopolymers，如二茂铁基聚合物[polyferrocene block copolymers，PFC，或polyferrocenylsilanes，PFS]微球，多聚二茂锆[polyzirconocene，PZC]、多聚二茂金属基修饰或接枝的树枝状高分子[包括但不限于，聚二茂铁基接枝的树枝状高分子(polyferrocenyl-branched dendrimers)]、二茂金属基或多聚二茂金属基修饰或接枝的纳米金胶体[包括但不限于，胺基二茂铁基功能化的纳米金胶体(Gold colloidsfunctionalized with amidoferrocenyl structures)等]、共聚物微球或纳米球、含有富勒烯结构的或以富勒烯为单体之一的高聚物或共聚物、其它含荧光染料或化学发光[chemiluminescence]、生物发光[bioluminescence]材料的载体，藻胆蛋白类[phycobiliproteins]及其各种衍生物或生物或化学修饰物，以及上述每一种载体中不同参数[如大小、光学发射光波长、电磁学性质、表面生物或化学功能团修饰等物理或化学性质]载体的组合，或各种不同载体之间的相互组合。

9.根据权利要求4所述的酶法标记反应，可以是，但不限于如下过程之一或不同过程之组合，

(2)反转录或逆转录过程[Reverse Transcription]，

(3)体外转录过程，[in vitro transcription]

(4)缺口翻译过程或缺口转移过程或缺口平移过程[Nick Translation]，

(5)末端脱氧核苷酸转移过程，

(6)末端核苷酸转移过程，

(7)DNA合成反应过程或RNA合成反应过程，

(8)DNA连接反应，

(9)DNA[限制性内切酶作用下的]酶切反应，

(10)磷酶酶作用下将DNA末端中的5’-端磷酸基除去，使其5’-端变成了OH基的反应，

(11)T4多聚核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase)作用下将ATP中γ位上的磷酸基转移到具有5′-端羟基的DNA或RNA分子上的反应，

(12)末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxyribonucleotidyl Transferase，缩写为TdT)作用下将三磷酸脱氧核苷酸中的单磷酸核苷转移到DNA分子的3′-端羟基上的反应，

(13)牛胰腺脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)作用下降解双链DNA为5′-磷酸低聚核苷酸的反应，

(14)核酸酶RNaseA作用下特异性地作用于嘧啶核苷酸的反应，

(15)核酸酶RNaseH作用下，专一性地分解DNA/RNA杂交分子中的RNA分子，从而在cDNA合成过程中除去eDNA-RNA中的RNA链的反应。

10.一种根据权利要求1制作的间接法基因芯片线性放大标记[iLAL]试剂盒，即iLAL试剂盒，包含了基因芯片处理各过程所需要的全部生化试剂，其特征是，含有但不限于权利要求4的如下通式中所涉及的核心组分：通式(I)、通式(II)、通式(III)。