KR102012690B1

KR102012690B1 - 평행 결합 구조의 이중 혼성화 ｐｎａ 프로브 시스템

Info

Publication number: KR102012690B1
Application number: KR1020147000536A
Authority: KR
Inventors: 김성기; 박창식; 조군호; 박희경; 최지아; 최성록; 김수남; 김용태; 김세련
Original assignee: 주식회사 파나진
Priority date: 2011-07-12
Filing date: 2012-07-10
Publication date: 2019-08-21
Anticipated expiration: 2032-07-10
Also published as: WO2013009070A2; KR20140053945A; WO2013009070A9; WO2013009070A3

Abstract

본 발명은 표적 뉴클레오티드에 2중으로 혼성화가 가능한 평행 결합(Parallel binding) 구조의 2개의 실시간 핵산 증폭용 PNA(Peptide Nucleic Acid) 프로브 시스템, 상기 프로브 시스템을 포함하는 조성물 및 이를 이용한 검출방법에 대한 것이다. 본 발명에 따른 PNA 프로브 시스템을 포함하는 조성물을 이용하면 검출하고자 하는 뉴클레오티드의 존재를 확인하거나, 그 양을 정량적으로 결정할 수 있을 뿐 아니라, 서열 변이, 특히 기존기술로는 검출이 어려웠던 단일염기서열변이(SNP, Single Nucleotide Polymorphism)를 탁월한 민감도로 검출 가능하며, 시료 내에 존재하는 최소 2종류 이상의 뉴클레오티드를 동시에 다중검출 할 수 있다.

Description

평행 결합 구조의 이중 혼성화 PNA 프로브 시스템{NESTED HYBRIDIZATION PNA PROBE SYSTEM HAVING PARALLEL BINDING STRUCTURE}

본 발명은 표적 뉴클레오티드에 2중으로 혼성화가 가능한 평행 결합(Parallel binding) 구조의 2개의 PNA(Peptide Nucleic Acid) 프로브 시스템, 상기 프로브 시스템을 포함하는 조성물 및 이를 이용한 검출방법에 대한 것으로, 본 발명에 따른 PNA 프로브 시스템을 포함하는 조성물을 이용하면 검출하고자 하는 뉴클레오티드의 존재를 확인하거나, 그 양을 정량적으로 결정할 수 있을 뿐 아니라, 서열 변이, 특히 기존방법으로는 검출이 어려웠던 단일염기서열변이(SNP, Single Nucleotide Polymorphism)를 탁월한 민감도로 검출 가능하며, 시료 내에 존재하는 최소 2종류 이상의 뉴클레오티드를 동시에 다중검출 할 수 있는 장점이 있다.

분자진단이란 인간의 유전자(DNA 또는 RNA)를 분석해 질병의 감염 여부를 진단하거나 유전자의 염기서열 변이나 돌연변이를 규명하여, 질병의 발병 여부 등을 예측하고 확인하는 데 효과적인 방법이다. 특히 현존하는 질병 진단 방법 중 가장 최고 수준의 기술로 꼽히고 있으며, 현재 의약학 분야에서 관심이 집중되고 있는 기술 중 하나이다.

분자진단을 위해서 다양한 검출 방법이 사용되고 있다. 대표적인 예로는 실시간(real-time) PCR을 이용하는 방법, DNA 기반 프로브를 이용하는 방법, PNA 기반 프로브를 이용하는 방법 등이 있다. 이하 각 방법의 특징을 간략히 살핀다.

실시간 PCR을 이용한 분자진단 : 실시간 PCR 분석은 중합효소 연쇄반응(PCR: polymerase chain reaction)을 통해 PCR 증폭산물 생성과정을 형광물질로 표지된 프라이머 또는 프로브와의 결합을 통해 형광신호의 세기를 실시간으로 보여주는 방법으로, 보다 정확한 정량적 분석이 가능하다. 실시간 PCR에 사용되는 표적 뉴클레오티드 검출법은 크게 2가지로 나눌 수 있다. 첫 번째는 프라이머 기반의 검출법으로 이 방법은 디자인의 어려움과 정량분석에 취약하다는 단점이 있다. 두 번째 방식은 프로브 기반의 검출법으로서 디자인이 편리하며 정량 및 정성분석에 모두 적용할 수 있다는 장점을 지닌다. 두 가지 검출방법에 대한 장단점을 표 1에 비교하여 나타내었다[Meti Buh Ga, et al., Anal. Bioanal. Chem. 396, 2023, 2010].

DNA 기반 프로브를 이용한 표적 뉴클레오티드의 검출 : 보편적으로 널리 이용되는 DNA 기반의 프로브에는 크게 두 가지 형태가 있다. 태크만(TaqMan) 프로브는 표적 뉴클레오티드와 상보 결합할 수 있는 DNA 서열 말단에 리포터 물질(reporter molecule) 및 소광 물질(quencher molecule)이 결합된 선형 프로브로서 표적 뉴클레오티드와 결합된 프로브 서열의 효소적 분해 단계에서 이탈되는 형광(리포터) 물질의 신호를 검출하는 방식이다[Holland, P. M., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 88, 7276-7280, 1991; Livak, K. J., et al., PCR Methods Appl., 4, 357-362].

이 방법은 단일염기서열변이 구별능 저하의 단점을 가지므로, 단일염기서열변이 구별능 향상을 목적으로 3’ 말단에 소광물질과 함께 MGB(minor groove binder)를 도입하여 서열 길이를 짧게 한 MGB 태크만(TaqMan)도 개발되었다 [Igor V. K.,et al, Nucl. Acids Res. 25, 3718-3723, 1997; Igor V. K., et al, Nucl. Acids Res. 28 (2): 655-661, 2000; I. A. Afonina, ea al, BioThechniques, 32, 940-949, 2002; I. A. Afonina, ea al, Nucleic Acids Research, 25, 2657-2660, 1997].

분자 비컨(MB, Molecular Beacon)은 표적 뉴클레오티드와 상보적인 염기서열의 루프(loop)와 헤어핀(hairpin) 구조를 형성하기 위한 스템(stem) 구조로 구성된 새로운 형태의 프로브이다. 이 방법은 뛰어난 단일염기서열변이 구별능을 나타내는 장점이 있는 반면, 프로브의 설계(design) 및 합성이 어렵다는 단점이 있다[US 20080064033 A; S. Tyagi, et al., Nat. Biotechnol., 16, 49, 1998; Stryer, L., Ann. Rev. Biochem., 47, 819-846, 1987; S. Tyagi, et al., Nat. Biotechnol., 14, 303-308, 1996; Bonnet,G., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 96, 61716176, 1999].

하지만 DNA 프로브를 기반으로 하는 검출법은 DNA는 뉴클레아제(nucleases)나 프로테아제(protease)와 같은 효소들에 의한 손상에 의해 안정성이 떨어지며[Demidov et al., Biochem. Phamacol. 48, 1310-1313, 1994], 또한 DNA 골격의 음전하(negative charge)들 사이의 전하적 반발력에 따른 약한 DNA-DNA 결합력과 이를 극복하기 위한 긴 서열의 사용으로 인한 낮은 단일염기서열변이 구별능력 등의 단점이 있다.

PNA 기반의 프로브를 이용한 표적 뉴클레오티드의 검출 : DNA 프로브를 이용하는 경우의 단점을 보완하기 위해 DNA의 유사체인 PNA를 사용한 방법들이 연구 되어지고 있다. PNA는 골격에 전하가 없기 때문에 음전하를 가진 상보적인 DNA 올리고머와의 결합에 있어서 반발력이 적어, DNA 프로브보다 빠르고 강하게 표적 뉴클레오티드 서열과 결합할 수 있으며, 효소들에 의한 손상이 없어 높은 안정성을 보인다[Egholm et al., Nature 365, 556-568, 1993,; Nielsen et al., Bioconjugate Chem, 5, 3-7, 1994; Demidov, et al., Biochem. Pharmacol. 48, 1310-1313, 1994].

최근에 이중 선형 프로브 구조를 이용한 새로운 방법이 보고되었다. 이 방법은 긴 서열을 갖는 DNA 프로브의 단점인 낮은 단일염기서열변이 구별능력을 향상시키기 위해 짧은 2차 프로브를 사용하였고, 두 개의 프로브가 서로 역평행 결합(anti-parallel binding)을 이루게 디자인 되어 있다[James M. Coull, et al., US 6607889].

근래에 들어 다양한 분자진단 기술 등이 개발되어 왔지만, 여전히 충분한 민감도와 특이성을 가지는 분자진단 기술에 대한 수요가 있는 상황이며, 특히 단일염기서열변이 등을 높은 민감도 및 특이성을 가지고 짧은 분석시간 안에 검출할 수 있는 기술개발의 필요성은 절실하다.

본 발명에서는 이와 같은 분자진단 기술의 단점을 극복하여 시료 내 표적 뉴클레오티드를 정확하게 검출할 수 있는 PNA 기반의 실시간 PCR 분석법을 제공하고자 한다.

본 발명에서는 표적 뉴클레오티드에 2중으로 혼성화가 가능한 평행 결합(parallel binding) 구조의 2개의 실시간 핵산 증폭용 PNA 프로브를 이용하여 표적 뉴클레오티드의 존재 또는 양을 검출하거나 서열 변이를 검출하는 방법과 시료 내에 존재하는 최소 2종류 이상의 뉴클레오티드를 동시에 다중검출 하는 방법 및 단일염기서열변이에 대한 탁월한 구별능을 이용하여 복수의 단일염기서열변이를 갖는 표적 뉴클레오티드까지도 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 새로운 방법을 제시하고자 하였다.

본 발명에 따른 PNA 프로브는 기존의 태크만(TaqMan) 프로브 또는 분자비컨(MB, Molecular Beacon) 등이 적용가능한 모든 기술, 즉 검출방법에 모두 적용 가능하며, 특정 염기서열의 검출, 특히 다중 검출(multi detection) 및 정량에 적용될 수 있는데, 예를 들어 형광동소보합법(fluorescence in situ hybridization, FISH) 등이 이용될 수 있지만, 이는 한 예일 뿐, 이에 한정되는 것은 아니며 다른 가능한 모든 방법이 사용될 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 장점은 하기의 과제의 해결 수단 및 효과, 발명의 상세한 설명에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명에서는, 기존 DNA 기반의 실시간 PCR 프로브들이 가지고 있는 안정성의 한계를 극복하기 위하여 열 및 생물학적 안정성을 가지며, DNA 보다 표적 뉴클레오티드에 대한 인식 능력 및 결합능력이 뛰어난 PNA를 활용한 검출 시스템을 개발하였다. 이미 알려진 바와 같이, 일반적으로 표적 뉴클레오티드를 검출함에 있어서 프로브 기반의 검출법이 프라이머 기반의 검출법에 비해 많은 장점을 가지고 있다. 이 때 사용되는 프로브는 크게 두 가지 형태로 구분되며, 각 프로브의 장단점을 표 2에 비교하였다.

상기 표 2에서 구조적(Structured) 프로브는 단일염기서열변이에 대한 검출 특이성이 뛰어난 것으로 알려져 있으나, 스템의 결합력에 의해 안정한 헤어핀 구조를 갖도록 설계하지 않으면 소광(quenching)이 불완전하게 되어 비특이적 형광을 발생시킬 수 있다.

따라서, 스템의 결합에너지와 표적 뉴클레오티드와의 결합에너지 차이를 고려하여 프로브를 제작하여야 하므로 디자인 및 합성이 어렵다. 이에 반해 선형 프로브는 제작의 편리성을 비롯하여 여러 가지 장점을 가지고 있으나, 스템의 부재로 인해 단일염기서열변이에 대한 검출 능력이 떨어지는 단점이 있다.

이에 본 발명자들은 디자인과 합성이 용이한 선형 프로브와 단일염기서열변이에 대한 높은 검출능을 나타내는 분자 비컨(Molecular Beacon)의 장점을 모두 갖춘 PNA 프로브 시스템을 제작하고자 하였다.

PNA는 상보적 염기서열을 갖는 PNA와 역평행 결합(anti-parallel binding) 및 평행 결합(parallel binding)의 두 가지 형태로 혼성화 할 수 있으며[도 1], 이들 간의 결합에너지 크기는 아래의 [도 2]에 나타낸 바와 같다[Stefano Sforza, Eur. J. Org. Chem., 197-204, 1999]. 이러한 결합에너지의 차이에 따라 시료 내에 표적 뉴클레오티드 부재시 평행 결합 서열을 갖는 이중 선형 PNA 프로브는 서로 상보 결합을 통해 형광을 발생하지 않으나, 표적 뉴클레오티드가 존재하면 검출 프로브는 표적 뉴클레오티드와 보다 안정한 상보 결합을 이루게 되고 기존의 PNA-PNA 프로브 간 결합이 해리되면서 형광을 발생하게 된다.

따라서 본 발명에서는 목표 Tm에 맞춰 제 1 PNA 프로브를 합성하고, 상대적으로 결합력이 약하여 그 조절이 용이한 평행 결합을 이용하여 두 PNA 프로브 간 결합세기를 PNA-DNA의 모든 서열이 일치하는 완전한 상보 결합(perfect-match)와 PNA-DNA의 서열 중 일부가 상이한 불완전한 상보 결합(mismatch)의 중간이 되도록 제 2 PNA 프로브를 설계 및 합성하였다. 이러한 2개의 PNA 선형(linear) 프로브를 사용하여 스템의 기능을 갖게 함으로써 단일염기서열변이 검출능을 향상시키면서 서열(sequence)에 제한적이지 않아 디자인 및 합성이 편리한 검출 시스템을 개발하였다(도 3 참조).

본 발명에 따른 PNA 프로브는 일정 염기서열의 PNA 올리고머 한쪽 또는 양쪽말단에 리포터 물질 및 소광 물질이 결합된 형태이다.

본 발명에 따른 PNA 프로브는 하기 화학식 1의 구조와 같이 양 말단에 물성조절용 부위 및/또는 리포터 물질 및 소광 물질이 결합된 형태인 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 것이라면 어떠한 구조를 가지는 PNA 프로브 구조라도 사용가능함은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.

상기 화학식 1에서, P는 표적 뉴클레오티드에 상보적인 서열을 가지는 PNA 염기부분으로 아래 첨자로 표시된 N은 PNA 염기의 개수로서, 바람직하게는 7~25의 정수, 보다 바람직하게는 8~18의 정수를 의미하며 표적 뉴클레오티드에 평행 결합(parallel binding) 또는 역평행 결합(anti-parallel binding)을 이루는 부분이다. A 및 A'은 리포터 물질(reporter molecule) 또는 소광 물질(quencher molecule)로서 서로 같거나 다른 물질일 수 있고, 둘 중 하나만 존재할 수도 있다. X 및 X'는 물성조절 부위로서 서로 같거나 다른 물질일 수 있고, 어느 것도 포함되지 않을 수도 있으며, 하나 이상이 포함될 수도 있다. N’ 및 C’은 각각 N-말단 및 C-말단을 의미한다.

특히 PNA 염기 부분인 P는 하기 화학식 2와 같은 구조를 가질 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 것이라면 어떠한 구조를 가지는 PNA 염기라도 사용가능함은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.

상기 화학식 2에서 B는 핵산염기로서 아데닌, 싸이민, 구아닌, 싸이토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기나 비천연 핵산염기 중에서 선택되며, R 또는 S는 가장 간단한 경우 수소(H)로서 이성질체가 존재하지 않을 수 있으나, 이성질성 치환체로 변형될 수 있다. 또한 R 또는 S는 리포터 물질(reporter molecule) 또는 소광 물질(quencher molecule)이 표지된 이성질성 치환체로 변형된 형태일 수 있다[Ethan A. et al., Organic Lett. 7(16), 3465-3467, 2005].

본 발명에서 개발된 PNA 프로브는 평행 결합을 이루는 이중 선형 구조로서 설계와 합성이 쉽고, 비특이 신호 없이 표적 뉴클레오티드와 신속한 상보 결합을 이루어 정확한 검출이 가능하며, 2개의 PNA 프로브 길이를 비슷하게 제작하여 안정한 이중나선구조를 형성하게 하였으며 이로 인해 단일염기서열변이 검출을 위한 서열 설계가 비교적 용이하고, 또한 인접한 단일염기서열변이를 동시에 분석할 수 있다.

또한 본 발명에 따른 검출 방법은 검출용 PNA 프로브뿐만 아니라 평행 결합 PNA 프로브에도 리포터 물질을 도입함으로써 검출 효율 증가가 가능하며, 단일염기서열변이 검출에 대한 정량법에도 적용가능하고, 유전자형 결정(genotyping), 정량 및 단일염기서열변이 검출 뿐 아니라, 멀티플렉스 PCR을 이용한 표적 뉴클레오티드의 검출에도 용이하게 적용가능하다.

도 1은 PNA-PNA 사이의 평행 결합(parallel binding)과 역평행 결합(anti-paralle binding) 구조를 나타내는 도면.
도 2는 PNA-PNA 및 PNA-DNA의 상대적 결합력 세기를 나타내는 도면.
도 3은 이중 혼성화 PNA 프로브 시스템을 이용한 표적 뉴클레오티드 검출방법을 나타내는 도면.
(a) 평행 결합 구조의 이중 혼성화 PNA 프로브 시스템을 이용한 표적 뉴클레오티드의 검출방법 중 제1 PNA 프로브를 검출용 프로브로 사용한 경우.
(b) 평행 결합 구조의 이중 혼성화 PNA 프로브 시스템을 이용한 표적 뉴클레오티드의 검출방법 중 제 2 PNA 프로브를 검출용 프로브로 사용한 경우.
도 4는 프로브의 안정성을 나타내는 도면.
(a) 제 1 프로브와 제 2 프로브를 혼합한 직후 수행한 PCR 결과.
(b) 제 1 프로브와 제 2 프로브를 혼합한 상태로 6개월 간 상온보관 후 수행한 PCR 결과.
도 5는 이중 형광 표지를 통한 형광 세기 증가를 나타내는 도면.
(a) 형광표지되지 않은 제 2 프로브와 제 1 프로브를 혼합하여 PCR을 수행한 결과.
(b) 형광표지된 제 2 프로브와 제 1 프로브를 혼합하여 PCR을 수행한 결과.
도 6은 본 발명의 방법을 이용한 실시예 8과 관련하여, 와파린 단일염기서열변이 검출 민감도 확인 및 정량법 적용 가능성 확인을 위해 PCR을 수행한 결과 및 검량선을 나타내는 도면.
도 7은 본 발명의 방법을 이용한 실시예 9와 관련하여, ITS유전자 검출 민감도 확인 및 정량법 적용 가능성 확인을 위해 PCR을 수행한 결과 및 검량선을 나타내는 도면.
도 8은 DNA 프로브를 이용한 PCR 결과를 나타내는 도면.
(a) DNA 프로브를 이용하여 와파린 대사관련 유전자 CYP2C9 430 유전자의 야생형과 단일 염기서열 변이체를 이용한 PCR 결과 (○는 야생형 유전자 검출선이고, ×는 단일염기서열변이체의 검출선을 의미).
(b) DNA 프로브를 이용하여 와파린 대사관련 유전자 VKORC1 3730 유전자의 야생형과 단일 염기서열 변이체를 이용한 PCR 결과 (○는 야생형 유전자 검출선이고, ×는 단일염기서열변이체의 검출선을 의미).
(c) PNA 프로브를 이용하여 와파린 대사관련 유전자 CYP2C9 430 유전자의 야생형과 단일 염기서열 변이체를 이용한 PCR 결과 (○는 야생형 유전자 검출선이고, 직선은 단일염기서열변이체의 검출선을 의미).
(d) PNA 프로브를 이용하여 와파린 대사관련 유전자 VKORC1 3730 유전자의 야생형과 단일염기서열변이체를 이용한 PCR 결과 (○는 야생형 유전자 검출선이고, 직선은 단일염기서열변이체의 검출선을 의미).
도 9는 서로 다른 형광으로 표지된 PNA 프로브를 이용하여 결핵균(Mycobacterium tuberculosis, MTB)과 비결핵항산균(Non - tuberculous mycobacteria, NTM)을 각각 특이적으로 동시에 검출한 PCR 결과를 나타내는 도면 (○는 결핵균의 검출선이고, △는 비결핵항산균의 검출선을 의미).
도 10은 제 2 프로브에 의한 단일 염기서열 변이체에 대한 용융온도의 변화를 나타내는 도면 (오른쪽 봉우리는 야생형의 용융온도를 나타내고, 왼쪽 봉우리는 단일 염기서열 변이체의 용융온도를 의미).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 아래의 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위는 실시예에 한정되는 것이 아님은 명확한 것이다.

본 발명은 PNA 기반의 실시간 PCR 프로브를 이용하여 목적 샘플 속에 존재하는 표적 뉴클레오티드의 존재 유무 또는 양을 검출하거나 서열 변이를 검출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 사용된 용어 및 약어의 정의는 다음과 같다.

혼성화 : 상보적 관계의 염기쌍이 수소결합을 통해 이중나선구조를 형성한 상태를 의미한다.

평행 결합(parallel binding) : 한 쌍의 PNA가 혼성화될 때 N-말단(N-term)이 같은 방향으로 상보적 관계를 이루고 있는 형태로서, DNA의 경우 5’-말단(5’-end)이 같은 방향으로 상보 결합을 이루고 있는 형태를 의미하며, PNA와 DNA가 혼성화 될 때 PNA의 N-말단과 DNA의 5’-말단이 같은 방향으로 상보적 관계를 이루고 있는 형태를 의미한다.

역평행 결합(anti-parallel binding) : 한 쌍의 PNA가 혼성화될 때 N-말단이 서로 반대 방향으로 상보 결합을 이루고 있는 형태로서, DNA의 경우 5’-말단이 서로 반대 방향으로 상보적 관계를 이루고 있는 형태를 의미하며, PNA와 DNA가 혼성화될 때 PNA의 N-말단과 DNA의 3’-말단(3’-end)이 서로 같은 방향으로 상보 결합을 이루고 있는 형태를 의미한다.

상보 결합 : 염기(A, T, G, C)가 수소결합을 통해 이중가닥(double strand) 구조를 형성하는 결합을 의미하며, 본 발명에서는 이중가닥을 형성하는 단일가닥(single strand)의 5’-말단은 서로 반대 방향을 향하는 상태에서 상보적 관계에 있는 염기가 수소결합하는 역평행결합 뿐 아니라, 5‘-말단이 서로 같은 방향을 향하는 상태에서 상보적 관계에 있는 염기가 수소결합하는 평행결합도 의미한다.

이중 혼성화 : 두 개의 PNA 프로브가 센스(sense) 및 안티-센스(anti-sense) DNA에 각각 결합하여 두 개의 이중나선 구조를 형성하는 것을 의미한다.

리포터 물질(reporter molecule) : 특정 파장의 빛을 흡수, 방출하여 형광을 발하는 물질로써, 프로브에 표지하여 표적 핵산과 프로브 사이의 혼성화가 이루어졌는지 확인할 수 있는 물질을 의미한다.

소광 물질(quencher molecule) : 리포터 물질이 발생시킨 빛을 흡수하여 형광세기를 감소시키는 물질을 의미한다.

물성조절 부위 : 링커(linker) 또는 스페이서(spacer) 등, 프로브의 용해도를 조절하거나 리포터 물질 또는 소광 물질을 표지하는데 이용하기 위한 물질을 의미하며, 그러한 물질로는 PNA와 형광물질 또는 소광물질 사이에 연결을 용이하게 하기 위한 링커, 거리를 조절하기 위한 스페이서, 당업계에 공지된 용해도 향상 및 표적 뉴클레오티드와의 결합력 향상을 위한 물질 등이 포함된다. 링커는 Akira Kishimoto, Chem. Commun., 742743, 2003; Peter E. Nielsen, ChemBioChem, 6668, 2005; Vladimir Guelev, JACS, 2864-2865, 2002; Ethan A. Englund and Daniel H. Appella, Organic Lett., 3465-3467, 2005 등에 기재된 것들이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니고, 스페이서는 OlafKchler, ChemBioChem, 6977, 2005; Liisa D., J. Med. Chem., 2326-2340, 2007 등에 기재된 것들이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 용해도 및 결합력 조절을 위해 사용되는 물질은 Irina V. Smolina, Vadim V. Demidov, Nucleic Acids Research, e146, 2005; I.S. Blagbrough, Biochemical Society Transactions part 2, 397-406, 2003; Nathalie Berthet, J. Med. Chem., 3346-3352, 1997 등에 기재된 물질 등이 가능하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 특징을 만족하는 경우 그 어떤 물질도 사용될 수 있음은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 자명할 것이다.

이성질성 치환체 : 분자식 및 구성원자의 연결 방법은 같으나 원자 사이의 공간적 배치가 서로 다른 화합물을 이성질체라 일컫는데, 주로 탄소에 연결된 4개의 원자단이 모두 다른 비대칭 탄소를 가진 탄소화합물의 경우에 존재하게 된다. 즉, 치환체의 입체적 배치에 따라 서로 다른 두 종류의 이성질체를 형성하며, 본 발명에서의 이성질성 치환체는 한쪽 방향의 이성질체만을 형성하게 하는 치환체를 의미한다. 본 발명의 화학식 2에서 R 또는 S는 수소(H)인 것을 기본으로 하나 천연 아미노산이나 비천연 아미노산 잔기(Anca Dragulescu-Andrasi, JACS, 10258-10267, 2006; Filbert Totsingan, Chirality, 245253, 2009; Stefano Sforza, Eur. J. Org. Chem., 1056-1063, 2003), 및 알킬기, 아민, 알코올, 카르복시산(Shabih Shakeel, Sajjad Karim, J. Chem. Technol. Biotechnol., 892899, 2006) 등이 이성질성 치환체로서 사용될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

단일염기서열변이(SNP) : 특정 유전자의 DNA 염기서열 하나가 다른 것을 의미하며, 생식세포 돌연변이(germline mutation)와 체세포 돌연변이(somatic mutation)를 모두 포함한다.

구조적 프로브(structured probe) : 2차 구조를 형성하는 프로브를 의미한다.

선형 프로브(linear probe) : 5’ 말단을 형광 물질로, 3’ 말단을 소광 물질로 표지한 올리고뉴클레오티드로, 스템이 없어 2차 구조를 형성하지 않는 프로브를 의미한다.

이중 선형 프로브 : 리포터 물질과 소광 물질이 각각 결합된 두 개의 선형 올리고뉴클레오티드가 서로 상보 결합을 이루는 형태의 프로브를 의미한다.

완전 상보 결합(perfect match) : 두 가닥의 DNA 또는 PNA가 혼성화 될 때 상보적 관계에 있는 염기쌍이 완벽하게 맞는 상태를 의미한다.

불완전 상보 결합(mis-match) : 두 가닥의 DNA 또는 PNA가 혼성화 될 때 상보적 관계에 있는 염기쌍이 하나 이상 맞지 않는 상태를 의미한다.

FAM : 6 - Carboxyfluorescein

Dabcyl : 4,4 - Dimethylamino-azobenzene-4'-carboxylic acid

블랙 홀 소광물질(Black Hole Quencher, BHQ^TM) : Biosearch Technologies Inc.(미국)에서 판매하는 소광 물질로서, 구조 및 파장 차이에 따라 BHQ1, BHQ2, BHQ3로 구분된다.

블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher) : 미국 Berry & Associates에서 판매하는 소광 물질로서, 다음의 구조를 갖는 화합물.

형광동소보합법(fluorescence in situ hybridization, FISH): 특정 뉴클레오티드의 존재유무를 규명하기 위하여 세포배양이나 핵산의 추출과정을 거치지 않고 염색체나 핵의 형태를 그대로 유지한 채 세포를 슬라이드에 도말하고 여기에 표적유전자의 특정 염기서열과 상보적인 유전자 인식물질(DNA, PNA 또는 기타의 변형 DNA)에 형광물질을 붙인 여러 종류의 프로브를 반응시켜 표적유전자의 유무와 위치를 확인함으로써 염색체 또는 유전자의 변이를 형광현미경으로 관찰하는 방법을 의미한다. 염색체에 프로브를 부착시키는 검사과정을 교잡반응(hybridization)이라 부르고, 염색체에 부착되는 프로브는 자외선에 노출될 때 형광을 내면서 표적 뉴클레오티드의 유무 및 위치를 보여주는 방법을 의미한다.

[ 실시예 1] PNA 프로브의 설계 및 제작

본 발명의 PNA 프로브는 결핵균의 IS6110 유전자와 비결핵항산균의 ITS 유전자에 각각 특이적으로 결합할 수 있도록 제작되었다. 또한 와파린 대사관련 유전자인 CYP2C9 430 및 VKORC1 3730 야생형 유전자와 단일염기서열변이체 유전자에 각각 완벽하게 결합할 수 있도록 설계 및 제작되었다.

예를 들어, 본 발명의 PNA 프로브는 하기 표 3에 기재한 서열번호 1 내지 14 중 어느 하나의 염기서열로 구성될 수 있다. 상기 염기서열로부터 당업자가 통상의 지식을 이용하여 용이하게 변형 할 수 있는 범위 내의 PNA 프로브 서열은 모두 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 보아야 할 것이다. 평행 결합을 할 수 있는 PNA 프로브 시스템으로서 본 발명에 따른 PNA 실시간 PCR을 이용하여 표적 뉴클레오타이드를 검출해 낼 수 있는 것인 한, 본 발명의 권리범위 내에 포함되는 것이다.

상기 표 3에서 O는 링커, 굵은 글씨체 및 밑줄로 표시된 문자는 γ-라이신(lysine) 또는 γ-글루탐산(glutamic acid)-PNA 모노머(monomer), K는 라이신(lysine), (+)는 aeg[N-(β-alanine)], (-)는 aeg[N-(succinicacid)]를 의미한다.

PNA 프로브는 한국등록특허 제 464,261호에 기재된 방법에 따라 PNA 올리고머를 벤조티아졸설포닐(Bts : Benzothiazolesulfonyl)기로 보호된 PNA 단량체와 기능화된 레진으로부터 고체상 합성법(solid phase synthesis)으로 합성하였다[Lee et al., Org. Lett., 2007, 9, 3291-3293]. 이 방법 이외에도 알려진 9-플루오레닐메톨시카르보닐(Fmoc : 9-flourenylmethloxycarbonyl) 또는 t-Boc(t-butoxycarbonyl) 합성법을 사용하여 PNA를 합성할 수도 있다[Kim L. et al., J. Org. Chem. 59, 5767-5773, 1994; Stephen A. et al., Tetrahedron, 51, 6179-6194, 1995]. 리포터 물질 및 소광 물질은 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 PNA 프로브에 표지하였다.

[ 실시예 2]: CYP2C9 430, VKORC1 3730 및 결핵/ 비결핵항산균의 표적핵산을 증폭하기 위한 프라이머 합성 및 사용

본 발명에서는 와파린 대사관련 유전자 CYP2C9 430, VKORC1 3730 및 결핵균(Mycobacterium tuberculosis, MTB)과 비결핵항산균(Non - tuberculous mycobacteria, NTM) 유전자의 표적핵산 증폭을 위하여 각 유전자의 부위를 분석하여 특이적인 증폭이 이루어지도록 프라이머를 제작하였다. CYP2C9 430 유전자 확인을 위하여 서열번호 15, 16 프라이머 세트와 VKORC1 3730 유전자 확인을 위하여 서열번호 17, 18 프라이머 세트를 디자인 하였다. 또한 결핵균(Mycobacterium tuberculosis, MTB)의 IS6110 유전자 확인을 위하여 서열번호 19, 20 프라이머 세트와 비결핵항산균(Non - tuberculous mycobacteria, NTM) 유전자 ITS(Internal transcribed spacer)의 확인을 위하여 서열번호 21, 22 프라이머 세트를 디자인 하였다. 디자인된 프라이머는 ㈜ 바이오니아(한국)에 합성 의뢰하여 사용하였다.

상기 표 4에서 Y는 C와 T의 혼합된 염기를 의미한다.

[ 실시예 3] 와파린 대사관련 유전자 CYP2C9 430 및 VKORC1 3730 클론 확보

CYP2C9 430 및 VKORC1 3730의 클론 확보를 위하여 각각 서열번호 23, 24번의 조합, 25, 26번의 조합으로 증폭산물을 Labopass^TMPCR 정제 키트(코스모진텍, 한국)을 사용하여 정제한 다음, pGEM-T 이지 벡터(프로메가, 미국)에 결합시키고 대장균(E. coli) JM109세포에 형질 전환하여 DNA를 대량 확보하였다. 단일 염기 서열 변이체를 확보하기 위하여 상기의 방법으로 제조된 정상 클론을 이용하고 부위특이적 돌연변이유발 키트(스트라타진, 미국)를 사용하여 변이 유전자를 가진 클론을 확보하고 염기서열 분석으로 변이 여부를 확인 하였다. 유전자형이 확인된 클론은 본 발명의 유전자 증폭 시에 표준물질로 사용하였다.

[ 실시예 4] 결핵균 유전자 IS6110 및 비결핵 항산균 유전자 ITS 의 클론 확보

표적 핵산을 위한 클론을 확보하기 위하여 Mycobacterium tuberculosis {ATCC 25177, 미국}와 Mycobacterium asiaticum{KCTC 9503, 한국생명자원센터, 한국}을 분양받았다. 분양받은 균주로부터 InstaGene Matrix(바이오라드, 미국)를 이용하여 DNA를 추출하였고, 서열번호 27, 28번의 조합, 29, 30번의 조합으로 각각 결핵균(Mycobacterium tuberculosis, MTB) IS6110 유전자와 비결핵항산균(Non -tuberculous mycobacteria, NTM)의 ITS 유전자를 증폭하였다. 증폭산물을 Labopass^TMPCR 정제 키트(코스모진텍, 한국)을 사용하여 정제한 다음, pGEM-T 이지 벡터(프로메가, 미국)에 결합시키고 대장균(E. coli) JM109에 형질 전환하여 DNA를 대량 확보하였다.

[ 실시예 5] 실시간 PCR 반응

상기의 실시예 3, 4의 방법으로 확보된 클론을 사용하여 PNA 프로브를 사용한 실시간 검출 방법을 확립하였다. 주형 DNA(10⁵ copies/㎕) 2 ㎕, 제 1 프로브 (5 pmoles/㎕)와 제 2 프로브 (10 pmoles/㎕)의 혼합 용액 10 ㎕, 프라이머 세트(서열번호 15, 16 세트 또는 17, 18 세트 또는 19, 20 세트 또는 21, 22 세트, 정방향 프라이머 50 pmoles/㎕, 역방향 프라이머 6.25 pmoles/㎕) 2 ㎕, 10X Taq 중합효소 완충용액(솔젠트, 한국) 5 ㎕, 10mM dNTP 혼합용액(솔젠트, 한국) 1 ㎕, Taq 중합효소 (5 U/㎕, 솔젠트, 한국) 0.4 ㎕, 증류수 27.6 ㎕를 혼합한 뒤 실시간 유전자 증폭기(Real-time PCR machine, CFX96^TM Real-time PCR System, 바이오라드, 미국)를 이용하여 95℃ 에서 3분 동안 반응 후, 95℃ 10초, 그리고 프라이머와 함께 제 1 프로브 및 제 2 프로브가 혼성화되도록 60℃ 30초, 72℃ 15초 반응과정을 반복하였다. 형광 세기는 60℃ 혼성화 반응 뒤에 측정하였다.

[ 실시예 6] 평행 결합 PNA 기반 실시간 PCR 프로브의 안정성

제 1 프로브(서열번호 2)와 제 2 프로브(서열번호 5)의 보관 안정성을 시험하기 위하여, 상기 실시예 5의 방법대로 제 1 프로브와 제 2 프로브 혼합 용액을 각각 이용하여 실시간 검출 PCR을 수행하였고, 6 개월간 상온에 보관한 뒤에 동일한 방법으로 실시간 검출 PCR을 수행하고 그 효과를 비교하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다. 그 결과 상온에서 6개월간 보관하여도 형광 세기가 감소하지 않음을 확인하였다.

[ 실시예 7] 제 2 프로브에 추가 리포터 물질 도입을 통한 신호세기 증가

제 1 프로브 뿐만 아니라 제 2 프로브에도 리포터 물질을 도입한 경우의 형광 세기의 변화를 측정하기 위하여 서열번호 4의 제 1 프로브와 서열번호 6의 제 2 프로브 혼합 용액을 사용하고 상기 실시예 5의 방법을 이용하여 실시간 검출 PCR을 수행하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. 제 2 프로브에 리포터 물질을 도입한 경우, 제 1 프로브에만 리포터 물질을 도입한 경우에 비해 형광 세기가 약 50% 증가함을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 8] 제 1 프로브의 단일염기서열변이 검출에 대한 민감도 확인 및 정량법 적용 가능성 확인

제 1 PNA 프로브(서열번호 1)과 제 2 PNA 프로브(서열번호 5)를 이용하여 단일염기서열변이 검출에 대한 민감도 및 정량법 적용 가능성을 확인하기 위한 테스트를 실시하였다. CYP2C9 430 야생형과 단일 염기서열 변이체 클론을 각각 10⁹ copies/㎕에서 10¹ copies/㎕까지 10배씩 순차적으로 희석하여 검출 한계를 측정하였으며, 10¹ copies/㎕까지 검출이 가능함을 확인하였다. 또한 단일염기서열변이 유전자의 카피(copy) 수에 따른 C_T(cycle threshold) 사이의 상관관계를 분석한 결과 표준물질의 농도가 감소함에 따라 검출 C_T 값이 증가함을 나타내어 본 발명은 핵산의 정량에도 적용할 수 있음을 확인하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

[ 실시예 9] 제 1 프로브의 표적 뉴클레오티드 검출에 대한 민감도 확인 및 정량법 적용 가능성 확인

제 1 PNA 프로브(서열번호 12)와 제 2 PNA 프로브(서열번호 13)을 이용하여 표적 뉴클레오티드 검출에 대한 민감도 및 정량법 적용 가능성을 확인하기 위한 테스트를 실시하였다. 비결핵항산균 클론을 각각 10⁹ copies/㎕에서 10¹ copies/㎕까지 10배씩 순차적으로 희석하여 검출 한계를 측정하였으며, 10¹ copies/㎕까지 검출이 가능함을 확인하였다. 또한 표적 뉴클레오티드의 카피 수에 따른 C_T 사이의 상관관계를 분석한 결과, 표준물질의 농도가 감소함에 따라 검출 C_T 값이 증가함을 보이므로, 본 발명은 핵산의 정량에도 적용할 수 있음을 확인하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

[ 실시예 10] PNA 프로브 및 DNA 프로브의 단일염기서열변이 검출능 비교

PNA 프로브와 마찬가지로 DNA 프로브(태크만 프로브)을 이용할 경우 단일염기서열변이의 검출이 가능한지를 확인하기 위하여 서열번호 30 및 31의 와파린 대사관련 유전자 CYP2C9 430, VKORC1 3730의 단일염기서열변이 검출용 DNA 프로브를 ㈜ 바이오니아(한국)에 합성 의뢰하여 사용하였으며(표 5 참조). 이에 상응하는 PNA 프로브는 서열번호 8, 9를 사용하였다. 각 프로브를 이용하여 단일염기서열변이 검출능을 비교한 결과를 도 8에 나타내었다. 두 가지 표적 유전자 검출용 DNA 프로브는 모두 단일염기서열변이를 검출하지 못한 반면, PNA 프로브는 서로 다른 두 가지 표적 유전자의 단일염기서열변이를 확실하게 검출할 수 있었다.

상기 표 5에서 굵은 글씨체는 단일 염기서열 변이 위치를 나타낸다.

[ 실시예 11] 서로 다른 리포터 물질을 사용한 결핵균( Mycobacterium tuberculosis, MTB)과 비결핵항산균(Non - tuberculous mycobacteria, NTM)의 동시 검출 방법

서로 다른 리포터 물질을 표지한 PNA 프로브를 이용하여 서로 다른 두 종류의 표적 핵산을 동시에 검출할 수 있는지를 확인하였다. 서열번호 10 및 14에 따른 결핵균(Mycobacterium tuberculosis, MTB) 특이적 PNA 프로브와 서열번호 11 및 13에 따른 비결핵 항산균(Non - tuberculous mycobacteria, NTM) 특이적 PNA 프로브를 이용하여, 결핵균과 비결핵 항산균을 각각 특이적으로 동시에 검출하였고, 그 결과는 도 9에 나타내었다.

[ 실시예 12] 단일염기서열변이에 대한 검출 특이성 확인

제 1 프로브와 제 2 프로브를 혼합하여 사용할 경우 단일염기서열변이에 대한 검출 특이성을 높일 수 있음을 확인하기 위하여 와파린 대사관련 유전자 CYP2C9 430을 타겟 유전자로 한 제 1 프로브(서열번호 3), 제 2 프로브(서열번호 7)을 이용하여 상기 실시예 5의 방법대로 실시간 PCR 반응을 수행한 뒤, 25℃부터 95℃까지 0.5℃씩 상승시키며 형광을 측정하는 용융곡선 분석을 수행하였다. 그 결과는 도 10에 나타내었다. 제 2 프로브를 함께 사용한 경우와 그렇지 않은 경우 모두 야생형에 대한 용융온도에는 변화가 없었다. 하지만 제 2 프로브를 함께 혼합한 경우 단일염기서열변이에 대한 용융 온도가 4~6℃ 가량 하강하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 단일염기서열변이에 대한 용융 온도 하강으로 인하여 제 2 프로브를 함께 사용한 경우 단일염기서열변이에 대한 검출 특이성이 향상되는 결과를 확인 되었다.

서열목록 Free Text

서열목록 1 내지 14는 본 발명에 따른 PNA 프로브의 서열이다.

서열목록 15 내지 30은 본 발명에 따른 프라이머의 서열이다.

서열목록 31 및 32는 본 발명에 따른 DNA 프로브의 서열이다.

<110> PANAGENE INC. <120> Parallel binding structured PNA probe system <160> 32 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMB-3 PNA probe <400> 1 acacggtcct caa 13 <210> 2 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMB-1 PNA probe <400> 2 acacggtcct caa 13 <210> 3 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DFP-0207-26 PNA probe <400> 3 acacggtcct caak 14 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DFP-0207-22 PNA probe <400> 4 kkacacggtc ctcaakkk 18 <210> 5 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Q-B-13 PNA probe <400> 5 tgtgccagga gtt 13 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMB-0125-2 PNA probe <400> 6 kktgtgccag gagttkkk 18 <210> 7 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DFP-0208-10 PNA probe <400> 7 tgtgccagga gttk 14 <210> 8 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Warfarin-W-4 PNA probe <400> 8 aacacggtcc tc 12 <210> 9 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3730-M1-2 PNA probe <400> 9 atgtgtgggt 10 <210> 10 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB-10608-2 PNA probe <400> 10 ttcgcctacg tg 12 <210> 11 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS-20608-1 PNA probe <400> 11 gtgtggtgtt tga 13 <210> 12 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS-20608-3 PNA probe <400> 12 gtggtgtttg a 11 <210> 13 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS-20608-4 PNA probe <400> 13 cacaccacaa actkkk 16 <210> 14 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB-10616-1 PNA probe <400> 14 agcggatgca ck 12 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 15 gctgcggaat tttgggatgg 20 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 16 gatgtggggc ttctagatta cc 22 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 17 gatgtggggc ttctagatta cc 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 18 tgtaaaaaag agcgagcgtg tg 22 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 19 cgcttcggac caccagca 18 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 20 caggatcctg cgagcgtag 19 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 21 ccacctccyt tctaaggagc acc 23 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 22 gggatgctcg caaccactat yca 23 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 23 gaagcctgtg tggctgaata 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 24 ccattcccac catgttgact 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 25 gcaaggctaa gaggcactga 20 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 26 accacagtcc atggcagac 19 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 27 tcgtccagcg ccgcttcg 18 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 28 cgggtccaga tggcttgc 18 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 29 gattgggacg aagtcgtaac aag 23 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 30 agcctcccac gtccttcatc ggc 23 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2C9-430W DNA probe <400> 31 cctcttgaac acggtcctca atgct 25 <210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VKORC1-3730M DNA probe <400> 32 cattgtcatg tgtgggtatg gcagg 25

Claims

표적 뉴클레오티드와 상보 결합하는 제 1 PNA 프로브 및 상기 제 1 PNA 프로브와 평행 결합을 이루는 제 2 PNA 프로브를 포함하는 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 각 PNA 프로브는 하나 이상의 말단에 물성조절 부위를 더 포함함을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 또는 제2항에 있어서,
상기 각 PNA 프로브는 리포터 물질(reporter molecule) 및 소광물질(quencher molecule)에서 선택된 하나 이상의 물질을 추가로 포함함을 특징으로 하는 조성물.
제 3 항에 있어서,
상기 리포터 물질 또는 소광물질은 PNA 말단에 직접 결합되거나, PNA 말단에 연결된 물성조절 부위를 통해 결합된 것임을 특징으로 하는 조성물.
제 3 항에 있어서,
상기 리포터 물질은 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 형광물질임을 특징으로 하는 조성물.
제 3 항에 있어서,
상기 소광물질은 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀸처(Black Hole Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ, IRDye QC-1 군으로부터 선택된 하나 이상임을 특징으로 하는 조성물.
제 2 항에 있어서,
상기 PNA 프로브 말단에 결합되어 있는 물성조절 부위는 친수성 잔기, 소수성 잔기, 이온성 잔기 및 수소 결합 잔기로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
제 2 항에 있어서,
상기 각 PNA 프로브 말단에 결합되어 있는 물성조절 부위는 이온성 잔기로서, 양전하, 음전하 또는 쯔비터 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 3 항에 있어서,
상기 제 1 PNA 프로브는 두 개 이상의 동일하거나 서로 다른 리포터 물질을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
표적 뉴클레오티드와 상보 결합하는 제 1 PNA 프로브 및 상기 제 1 PNA 프로브와 평행 결합을 이루는 제 2 PNA 프로브를 포함하는 조성물을 이용하여 시료내의 표적 뉴클레오티드의 존재 유무를 결정하는 단계를 포함하는 뉴클레오티드의 검출 방법.
표적 뉴클레오티드와 상보 결합하는 제 1 PNA 프로브 및 상기 제 1 PNA 프로브와 평행 결합을 이루는 제 2 PNA 프로브를 포함하는 조성물을 이용하여 시료내의 표적 뉴클레오티드의 돌연변이 유무를 결정하는 단계를 포함하는 표적 뉴클레오티드의 돌연변이 검출 방법.
표적 뉴클레오티드와 상보 결합하는 제 1 PNA 프로브 및 상기 제 1 PNA 프로브와 평행 결합을 이루는 제 2 PNA 프로브를 포함하는 조성물을 이용하여 시료내의 표적 뉴클레오티드의 양을 결정하는 단계를 포함하는 표적 뉴클레오티드의 정량적 검출 방법.
삭제
제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 각 PNA 프로브는 리포터 물질 및 소광물질에서 선택된 하나 이상의 물질을 추가로 포함함을 특징으로 하는 검출 방법.
제 14 항에 있어서,
상기 각 PNA 프로브는 PNA와 리포터 물질 또는 소광 물질 사이에 물성조절 부위를 더 포함함을 특징으로 하는 검출 방법.
제 15 항에 있어서,
상기 리포터 물질 또는 소광물질은 PNA 말단에 직접 결합되거나, PNA 말단에 연결된 물성조절 부위를 통해 결합된 것임을 특징으로 하는 검출 방법.
제 14 항에 있어서,
상기 리포터 물질은 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 형광물질임을 특징으로 하는 검출 방법.
제 14 항에 있어서,
상기 소광물질은 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀸처(Black Hole Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ, IRDye QC-1 군으로부터 선택된 하나 이상임을 특징으로 하는 검출 방법.
제 16 항에 있어서,
상기 각 PNA 프로브 말단에 결합되어 있는 물성조절 부위는 친수성 잔기, 소수성 잔기, 이온성 잔기 및 수소 결합 잔기로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 검출 방법.
제 16 항에 있어서,
상기 각 PNA 프로브 말단에 결합되어 있는 물성조절 부위는 이온성 잔기로서, 양전하, 음전하 또는 쯔비터 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
제 14 항에 있어서,
상기 제 1 PNA 프로브는 두 개 이상의 동일하거나 서로 다른 리포터 물질을 포함함을 특징으로 하는 검출 방법.
제 10항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 시료내의 표적 뉴클레오티드의 검출은 형광동소보합법(fluorescence in situ hybridization, FISH)을 이용하는 것을 특징으로 하는 검출 방법.