CN1203188C - 一种生物芯片的纳米放大检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及的生物芯片的纳米放大检测方法，其特征在于：方法包括的步骤是：用纳米直径的金属颗粒标记核酸或蛋白；将标记的核酸或蛋白与生物芯片上的探针或组织杂交结合；利用能与该标记的纳米直径的金属颗粒发生金属相反应的金属试剂与已杂交结合在生物芯片上的核酸或蛋白上标记的纳米金属反应，放大纳米金属颗粒并进行普通光学检测。本发明采用的纳米放大技术，能够把杂交的信号放大到10^4-8倍，具有高的检测灵敏度和特异性；可以避免PCR反应，从而简化了样品的处理过程，缩短了检测时间；不需要昂贵的检测仪，降低了芯片的使用成本及实验条件。

Description

一种生物芯片的纳米放大检测方法

技术领域：

本发明涉及生物芯片领域，特别是一种生物芯片的纳米金放大检测方法。

技术背景：

生物芯片技术是近年来发展起来的一种新的生物检测技术。其包括基因芯片、蛋白芯片、组织芯片等。它将半导体工业的微型制造技术与分子生物学结合起来，在一基片表面上产生二维探针阵列。然后将待测定未知目标与芯片上已知探针“杂交”，以确定未知分子。生物芯片技术由于同时将大量不同的探针固定于支持物上，所以可以一次性对样品中多种不同物质进行检测和分析，从而解决了传统检测技术操作繁杂、自动化程度低、检测目标序列数量少、检测效率低等不足。因此该技术具有高速度、高通量、高效率、并行地检测与之杂交的生物样品的特点，与传统的诊断技术相比，芯片技术具有明显的优势。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值。目前该技术已经在基因测序、突变检测、多态性分析、表达谱分析、药物开发、疾病诊断等多个领域广泛应用。

然而到目前为止，国内外均无获得批文的生物芯片产品供应市场用于临床，特别是可直接应用于普通实验室及野外环境的生物芯片及其检测系统尚未见有研制成功的报道。

其主要原因是使用的方法存在着各种不足。如在标记方法上，荧光法是目前使用最多的方法，但它的灵敏度不高、需要避光，杂交完成后要快速检测以免荧光淬灭，另外结果检测需用价格极其昂贵的激光扫描仪等特殊设备；同位素标记法由于需要同位素和放射自显影，有使用不便，操作复杂，耗时较长、有污染的缺点。由于标记技术和杂交信号放大技术的限制，为提高检测灵敏度和特异性，通常的做法是在标记和分析前对样品进行适当程序的扩增，最常用的是PCR技术。然而，用荧光标记会影响PCR扩增效率，同位素标记常用的如³²P和³³P半衰期又太短，均不易推广使用。而且PCR扩增既需要设计引物，又要PCR仪，需要对各检测对象的靶序列建立不同的扩增体系、扩增方法和扩增条件，这便大大增加工作量和工作难度。为了解决这些问题，国内外不少公司进行了各种探索，但目前方法尚未达到实际应用。

总之，尽管芯片技术已经取得了长足的发展，得到世人的瞩目，但在样品的制备、探针合成与固定、分子的标记、数据的读取与分析等几个方面仍然存在着许多难以解决的问题。特别是技术成本昂贵、复杂、检测灵敏度较低、重复性差、分析泛围较狭窄等问题限制了该技术在生物检测中的应用。而这些问题的核心原因主要在这两个方面：即为提高灵敏度使用的是杂交前信号放大技术，以及用于标记杂交样品的信号报告分子存在各种不足。

纳米直径的金颗粒用于生命科学研究中示踪技术已有较长的历史，由于它具有化学性质稳定，可标记于蛋白和核酸。同时，它与银反应后可形成比原来体积大10⁶倍的黑色颗粒，可以用肉眼观察或用普通记录装置如照相、扫描记录的特点，近年来受到了科研人员的重视，特别是用不具备吸附能力离散的纳米金作为信号报告分子的应用则是近年生物信号检测中的一个重要进展。目前，作为信号报告分子的纳米金多采用的是胶体金。胶体金由于不是具有固定结构的单一分子，其表面在生理pH下带正电荷，因此，它不需要特别处理就可以同带负电荷的寡核苷酸结合。但是，这种结合是不牢靠的。后者是由不同数量的金原子构成的一个大分子复合体，金原子位于这个大分子的表面通过卤化物离子使其构成稳定的立体构型。由金原子构成的纳米金颗粒不带电荷，但由于金原子位于颗粒的表面，对其进行特定修饰就可以使其与核酸形成共价结合，那么就将纳米金颗粒标记到特定的核酸、蛋白上，可作为信号报告分子使用。由于是共价结合，因此，它比胶体金有更多的优越性。

1996年NATURE杂志同时发表了两篇将DNA作为连接分子使纳米金自组装成纳米结晶的报道，1997年Zehbe报道了用纳米金作为信号报告分子的原位杂交技术，在结合银显影的情况下，可使对组织中病毒核酸的检测灵敏度由10～50个拷贝提高到1个拷贝，作者认为如此高的灵敏度可以使该方法在很多应用中代替原位PCR技术。但目前尚未见有该技术用于生物芯片检测技术中的报道。

发明内容：

本发明的目的是建立一种以纳米金作为信号报告分子的生物芯片的检测方法。该检测方法，可以将杂交结果的信号进行放大，能够达到绕过对样品进行扩增以便提高检测灵敏度的要求；且产生的信号即稳定，又易于检测，使结果检测、分析的设备和技术大为简化。从而可以利用生物芯片技术的高通量、高敏感、高特异的特性，克服目前检测芯片存在的主要缺点。由于本发明研究提供的这种快速检测的生物芯片具有杂交、检测设备简单，技术稳定易于掌握，灵敏度高，重复性好，应用范围广等的特性，其必将成为可广泛应用于普通实验室，甚至野外环境的新一代生物芯片。

本发明所采用的技术方案是这样的：即一种生物芯片的纳米放大检测方法，其特征在于：方法包括以下三个步骤：

(一)、用纳米金标记核酸或蛋白；

(二)、将标记的核酸或蛋白与生物芯片上的探针杂交结合；

(三)、利用能与该标记的纳米金发生金属相反应的银粒子与已杂交结合在生物芯片上的核酸或蛋白上标记的纳米金反应，放大纳米金并进行普通光学检测。

本发明所使用的术语“生物芯片”是由生物大分子或组织附着于玻璃、陶瓷、金属片或尼龙膜、硝酸纤维素膜等基片物质上构建而成的阵列。生物芯片的实例包括基因(核酸)芯片、细胞芯片、蛋白芯片、抗体芯片或组织芯片等。

本发明所述的核酸包括DNA、RNA、cDNA或肽核酸。

本发明所述的蛋白包括各种抗体、抗原。

本发明所使用的术语“纳米金”是指直径在1.0-1000nm之间的金颗粒。其实例还包括修饰结合有胺基、巯基、酰基或生物素等基团的纳米金颗粒。本发明使用的优选的纳米金是直径为1.4nm的单顺丁烯二乙酰亚胺修饰的纳米金。

本发明所述的能与该标记的纳米金发生金属相反应的银粒子试剂包括锂银、氢醌银等。本发明使用的优选的能与纳米金发生颗粒增强反应的试剂是锂银。

本发明上述步骤(一)中，纳米金标记核酸的方法包括：

(1)通过寡核苷酸接头实现对核酸的标记；

或(2)通过引物实现对产物核酸的标记；

或(3)直接对核酸实现的标记。

本发明所使用的术语“寡核苷酸接头”是指由1-2000个碱基组成的一段核酸物质，包括进行了修饰有如巯基、氨基、酰基等基团的。本发明使用的优选的与1.4nm的单顺丁烯二乙酰亚胺修饰的纳米金反应的寡核苷酸接头是：5’-AAA AAA AAA AA-(CH₂)₆-SH-3’。

本发明所使用的术语“引物”、“PCR”、“RT-PCR”定义参考：《PCR技术实验指南》，C.W.迪芬巴赫，G.S.得维克斯勒。科学出版社，1998年8月第一版。

本发明所使用的术语“产物核酸”是指由PCR或RT-PCR反应生成的核酸物质，如DNA、cDNA。

上述步骤(一)中的通过寡核苷酸接头实现对核酸的标记方法的步骤包括：

(1)、制备纳米金溶液；

(2)、将纳米金溶液与寡核苷酸混合，纳米金与寡核苷酸分子数之比为1-100∶1，反应获得含纳米金的寡核苷酸接头；

(3)、提取标本DNA，通过去磷酸化反应去除DNA的5’端的磷酸基团，防止其自身连接；

(4)、在连接酶作用下，结合纳米金标记的寡核苷酸接头与上述处理的标本DNA，获得纳米金标记的样本DNA。

所述步骤(一)中通过引物实现对产物核酸标记方法中，采用通过PCR反应引物实现对产物DNA的标记，方法的步骤包括：

(1)、制备纳米金溶液；

(2)、将纳米金溶液与PCR引物混合，纳米金与引物分子数之比为1-100∶1，得到纳米金标记的PCR引物；

(3)、利用该标记引物进行PCR反应，得到纳米金标记的PCR产物DNA。

所述步骤(一)中通过引物实现对产物核酸标记方法中，采用通过RT-PCR反应引物实现对产物cDNA的标记，方法的步骤包括：

(1)、制备纳米金溶液；

(2)、将纳米金溶液与RT-PCR引物混合，纳米金与引物分子数之比为1-100∶1，得到纳米金标记的RT-PCR引物；

(3)、利用该标记引物进行RT-PCR反应，得到纳米金标记的RT-PCR产物cDNA。

上述步骤(一)中采用的直接对核酸实现的标记方法为：通过与核酸的末端基团反应，从而使核酸末端修饰有含硫或含二酰亚胺类的化合物，该类化合物可以和纳米金反应，实现纳米金对核酸的标记。

上述步骤(一)中纳米金标记蛋白的方法步骤为：

(1)、制备纳米金溶液；

(2)、纳米金溶液与还原处理的蛋白混合，纳米金与蛋白浓度比不低于5∶1，得到纳米金标记的蛋白。

所述步骤(二)中的纳米金标记的核酸与生物芯片上的探针杂交的步骤是：

(1)、对纳米金标记的DNA进行变性处理；

(2)、滴加变性处理的纳米金标记的DNA于生物芯片表面，进行杂交反应；

(3)、清洗去除未杂交结合的纳米金标记的DNA；

(4)、干燥处理备用。

所述步骤(二)中的纳米金标记的蛋白与生物芯片上的探针结合的步骤是：

(1)、PBS处理生物芯片，以阻断非特异的蛋白的结合位点及减少非特异性；

(2)、滴加纳米金标记的蛋白于生物芯片上，共育反应；

(3)、漂洗，去除未结合的纳米金标记的蛋白；

(4)、晾干备用。

所述步骤(三)中包括：

(1)、滴加锂银试剂于芯片表面，进行金属相放大反应；

(2)、清洗，去除未反应的锂银试剂；

(3)、观察结果。

本技术发明的优点与效果如下：

(1)本发明采用的纳米放大技术，能够把杂交的信号放大到10^4-8倍，具有高的检测灵敏度和特异性。

(2)本发明采用的纳米放大技术，可以避免PCR反应，从而简化了样品的处理过程，缩短了检测时间。

(3)本发明采用的纳米放大技术，不需要昂贵的检测仪，降低了芯片的使用成本及实验条件。

总之，该技术的研制成功将真正实现芯片技术的高通量、特异、敏感、快速的特点。可对常见感染病原菌和难检病原菌进行快速而准确的检测和鉴定，可以进行某一或多个特定基因、或与其相关的表达产物的研究，可以进行基因和蛋白质与疾病关系的研究、疾病相关基因的验证以及新药物的开发与筛选，疾病的分子诊断，治疗过程的追踪和预后等方面，为临床疾病的预防和治疗提供重要的指导作用；同时该技术也可以应用到在野战条件下由基层检验人员实施战场病原体分布的调查、战伤感染的早期诊断，生物战剂的早期发现等方面，将会产生较好的经济效益和社会效益。

具体实施方式

实施例1  通过寡核苷酸接头实现对核酸的纳米金标记

步骤如下：

(1)、溶解纳米金6nmol在0.02ml异丙醇或DMSO中，去离子水稀释至0.2ml。

(2)、纳米金溶液与寡核苷酸磷酸钠缓冲液混合(最终反应体系中磷酸钠缓冲液浓度为的0.01M，含有150mMNaCl、1mMEDTA，pH 5-8)，纳米金与寡核苷酸分子数比为1-100∶1，4-37℃共育2-24小时。制备成含纳米金的寡核苷酸接头。

(3)、超声断裂标本DNA长链后，在微量离心管中分别加入下面的反应液，全量为50μl：DNA片段在TE buffer 1-20pmol，10×Alkaline Phosphatasebuffer 5μl，CIAP(10-30U/ul)1-2ul，灭菌水加至50μl。37-50℃、15-120分钟保温。苯酚/氯仿(1∶1)抽提1-3次。添加3M的NaCL 2.5μl(终浓度150mM)。添加125μl(2.5倍)冷乙醇，在-20℃保冷30-60分钟。离心回收沉淀，用200μl 70％冷乙醇洗净后，减压干燥。用20μl以下的TE buffer溶解沉淀。

(4)、标本DNA加热至90-100℃，5-20分钟后，将其迅速冷却到4℃以下。

(5)、在反应Tube管中调制以下反应液，全量50μl。单链的样本DNA 1-2μl，纳米金标记的寡核苷酸接头5-10μl，10×T4 RNA Ligase Buffer 10μl，0.1％BSA 3μl，T4 RNA Ligase 40-100U，PEG#6000终浓度25％，灭菌水加至50μl。在5℃反应12-24小时。加入2μl的0.5M EDTA终止反应。所述纳米金标记的寡核苷酸接头浓度与单链的样本DNA的浓度比例不低于5∶1。

实施例2通过PCR反应引物实现对产物DNA的纳米金标记

步骤如下：

(1)、溶解纳米金6nmol在0.02ml异丙醇或DMSO中，去离子水稀释至0.2ml。

(2)、纳米金溶液分别与待检DNA特异的PCR引物1和2的磷酸钠缓冲液混合(最终反应体系中磷酸钠缓冲液的浓度为0.01M，含有150mMNaCl、1mMEDTA，pH 5-8)，纳米金与引物分子数比为1-100∶1，4-37℃共育2-24小时。制备含纳米金标记的待检DNA特异的PCR引物1和2。

(3)、反应Tube管中加以下反组成(100μl反应体系)：Taq酶(5U/μl)0.5μl，10×Taq酶Buffer 10μl，MgCl₂(25mM)8μl，dNTP(每种各2.5mM)8μl，样品DNA 1μg，金标记引物1(20μM)1-5μl，金标记引物2(20μM)1-5μl，加灭菌ddH₂O至100μl。

(4)、放到预热的PCR仪中，程序如下：95℃30秒，50℃30秒，72℃45-60秒。进行30-40个循环。最后72℃延伸10分钟。

实施例3通过RT-PCR反应引物实现对产物cDNA的纳米金标记

步骤如下：

(1)、溶解纳米金6nmol在0.02ml异丙醇或DMSO中，去离子水稀释至0.2ml。

(2)、纳米金溶液与聚T引物磷酸钠缓冲液混合(最终反应体系中磷酸钠缓冲液浓度为的0.01M，含有150mMNaCl、1mMEDTA，pH 5-8)，纳米金与随机引物分子数比为1-100∶1，4-37℃共育2-24小时。制备成含纳米金标记的聚T引物。

(3)、在反应Tube管中加以下反应液：dNTP(每种各2.5mmol/L)2.5μl，0.1mol/L巯基乙醇2.0μl，RNasin(40,000U/ml)0.5μl，纳米金标记的聚T引物(20-40U/ml)2.0μl，3.0μg RNA(去离子水稀释)18.8μl。加热混合物5分钟至70℃，冰上冷却。简短离心样品。

(4)、反应Tube管中再加入：反转录酶缓冲液5.0μl，反转录酶200U1.2μl。致反应终体积为2.5μl。37℃保温60分钟后，90℃变性5分钟，冰上冷却5分钟。

实施例4纳米金标记蛋白

步骤是：

(1)、溶解蛋白0.15mg在0.1M磷酸钠缓冲液中，pH 6.0，含有5mM EDTA(1ml)，加入MEA(8mg)。室温孵育1小时；

(2)、凝胶过滤层析法分离还原的蛋白。洗脱液使用0.02M磷酸钠，pH6.5，150mMNaCl，1mM EDTA。还原的蛋白在第一个高峰洗脱液中；

(3)、溶解纳米金试剂6nmol在0.02ml异丙醇中，去离子水稀释至0.2ml。

(4)、活性的纳米金溶液加入还原的蛋白中，其中纳米金与还原蛋白的分子数之比为10∶1，4-37℃共育2-12小时；

(5)、利用凝胶过滤层析法从抗体复合物分离未标记的纳米金颗粒，洗脱液0.02M磷酸钠pH 7.4、150mMNaCl洗脱。第一个淡红色峰为标记复合物，第二个暗色带为未结合的纳米金。重复一次能进一步得到纯化效果。

实施例5纳米金标记的核酸与DNA芯片上的探针杂交

步骤是：

(1)、将制备的DNA芯片置于预热的杂交室内，加入5.0μl 5×SSC-2g/LSDS于杂交室内以保持湿度。

(2)、1.0μl金标记DNA加入9.0μl杂交缓冲液中，于95℃变性5-10分钟，立即冰浴。

(3)、滴加DNA样品杂交缓冲液于芯片表面，加盖一2cm×cm的盖玻片，封闭杂交小室，浸入40-60℃水浴中，杂交1-10小时。

(4)、取出芯片立即浸入室温的1×SSC-0.1％SDS清洗液中，清洗5分钟。移入40-60℃ 0.1×SSC-0.1％SDS清洗液中洗涤5-10分钟。立即再以新鲜0.1×SSC-0.1％SDS清洗5分钟，后移入0.1×SSC清洗5分钟，以去除SDS。

(5)、避光干燥。

实施例6纳米金标记的蛋白与蛋白芯片上的探针结合

步骤是：

(1)、将制备的蛋白芯片置于37℃的湿盒内，滴加10.0μl 1％PBS-BSA缓冲液(20mM磷酸缓冲液pH 7.40，含有150mM NaCl，0.5％BSA，0.1％甘油，0.05％Tween 20)芯片上，以阻断非特异性的蛋白结合位点及减少非特异性的抗体结合。

(2)、弃去芯片上的PBS-BSA，不冲洗，滴加10倍PBS-BSA缓冲液稀释的纳米金结合物，共育0.5-3小时并不时轻振反应液。

(3)、漂洗，PBS-BSA(3×1min)，PBS(3×1min)。

(4)、晾干。

实施例7信号放大反应试验

利用锂银试剂与已杂交结合在生物芯片上的核酸或蛋白上标记的纳米金反应，放大纳米金颗粒并用肉眼或普通光学仪器检测的步骤包括：

(1)、锂银试剂2ml加入芯片表面，室温反应3-7分钟，0.1×SSC清洗5分钟。晾干。

(2)、普通光学仪器(如显微镜、扫描仪等)或肉眼直接观察结果，黑色颗粒即代表杂交阳性结果。

实施例8通过寡核苷酸接头标记核酸实施基因芯片的检测

试剂：单顺丁烯二乙酰亚胺修饰的纳米金试剂(直径1.4nm)，锂银液购自Nanoprobes公司。

3’二硫双己基脱氧寡核苷酸：5’-AAA AAA AAA AA-(CH₂)₆-SH-3’及铜绿假单胞菌特异探针：5’-TCC TAT GGT AAA GAG CGT CCG-3’由上海Sangon公司提供。

DNA提取试剂盒购自上海申能博彩生物科技有限公司

CIAP及10×T4 RNA Ligase由宝生物公司提供。

步骤：

(1)、DNA芯片自制(参考：Linda A.Chrisey，Gil U Lee and C.ElizabethO’Ferrall.Covalent attachment of synthetic DNA to self-assembled monolayerfilms.Nucleic Acids Research，1996，24(15)：3031-3039)，制备的DNA芯片置于预热的杂交室内，加入5.0μl 5×SSC-2g/LSDS于杂交室内以保持湿度。

(2)、寡核苷酸9.6nmol与TECP-HCl 6.2mmol，0.1M磷酸钠缓冲液(pH8.0，含有51mMEDTA)混合。温度37℃下进行还原反应。

(3)、溶解纳米金6nmol在0.02ml异丙醇中，去离子水稀释至0.2ml。

(4)、纳米金溶液与已还原的SH修饰的寡核苷酸磷酸钠缓冲液混合(最终反应体系中磷酸钠缓冲液浓度为的0.01M，含有150mMNaCl、1mMEDTA，pH 6.5)，纳米金与巯基分子数比为10∶1，4℃共育6小时，制备成含纳米金的寡核苷酸接头。反应产物用HPLC分离纯化，第一个淡红色峰为标记复合物，重复一次能进一步得到纯化效果。标记复合物储存在0.02M磷酸钠、150mM NaCl、0.05％叠氮化钠(pH7.5)。

(5)、病人血液中提取基因组DNA。(参考试剂盒说明书)

(6)、超声断裂标本DNA长链后，在微量离心管中分别加入下面的反应液，全量为50μl：DNA片段在TE缓冲液中1-20pmol，10×Alkaline磷酸缓冲液5μl，CIAP(10-30U/ul)1-2ul，灭菌水加至50μl。37℃、15分钟保温。苯酚/氯仿(1∶1)抽提1次。添加3M的NaCL 2.5μl(终浓度150mM)。添加125μl(2.5倍)冷乙醇，在-20℃保冷30分钟。离心回收沉淀，用200μl 70％冷乙醇洗净后，减压干燥。用20μl以下的TE缓冲液溶解沉淀。

(7)、标本DNA加热至98℃，10分钟后，将其迅速冷却到4℃以下。

(8)、在反应Tube管中调制以下反应液，全量50μl。单链的样本DNA 1-2μl，纳米金标记的寡核苷酸接头5-10μl，10×T4 RNA Ligase Buffer 10μl，0.1％BSA 3μl，T4 RNA Ligase 40-100U，PEG#6000终浓度25％，灭菌水加至50μl。在5℃反应12小时。加入2μl的0.5M EDTA终止反应。

(9)、1.0μl金标记DNA加入9.0μl杂交缓冲液中，于95℃变性10分钟，立即冰浴。

(10)、滴加该DNA样品杂交缓冲液于芯片表面，加盖一2cm×cm的盖玻片，封闭杂交小室，浸入42℃水浴中，杂交1小时。

(11)、取出芯片立即浸入室温的1×SSC-0.1％SDS清洗液中，清洗5分钟。移入40℃ 0.1×SSC-0.1％SDS清洗液中洗涤5分钟。立即再以新鲜0.1×SSC-0.1％SDS清洗5分钟，后移入0.1×SSC清洗5分钟，以去除SDS。避光干燥。

(12)、锂银液2ml加入芯片表面，室温反应5分钟，0.1×SSC清洗5分钟。晾干。

(13)、普通光学仪器(如显微镜、扫描仪等)或肉眼直接观察结果，黑色颗粒即代表杂交阳性结果。

实施例9通过逆转录PCR(RT-PCR)标记产物cDNA实施基因芯片的检测

试剂：单顺丁烯二乙酰亚胺修饰的纳米金试剂(直径1.4nm)，锂银液购自Nanoprobes公司。

5’二硫双己基随机引物及丙型肝炎病毒特异探针：5’-GGG AGT GATCTA TGG TGG AG-3’由上海Sangon公司提供。

RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒购自上海申能博彩生物科技有限公司

步骤：

(1)、DNA芯片自制(参考：Linda A.Chrisey，Gil U Lee and C.ElizabethO’Ferrall.Covalent attachment of synthetic DNA to self-assembled monolayerfilms.Nucleic Acids Research，1996，24(15)：3031-3039)，制备的DNA芯片置于预热的杂交室内，加入5.0μl 5×SSC-2g/LSDS于杂交室内以保持湿度。

(2)、5’二硫双己基随机引物9.6nmol与TECP-HCl 6.2mmol，0.1M磷酸钠缓冲液(pH 8.0，含有51mMEDTA)混合。温度37℃下进行还原反应。

(3)、溶解纳米金6nmol在0.02ml异丙醇或DMSO中，去离子水稀释至0.2ml。

(4)、纳米金溶液与已还原的SH修饰的随机引物磷酸钠缓冲液混合(最终反应体系中磷酸钠缓冲液浓度为的0.01M，含有150mMNaCl、1mMEDTA，pH 6.5)，纳米金与巯基分子数比为10∶1，4℃共育6小时，制备成含纳米金的随机引物。反应产物用HPLC分离纯化，第一个淡红色峰为标记复合物，重复一次能进一步得到纯化效果。标记复合物储存在0.02M磷酸钠、150mMNaCl、0.05％叠氮化钠(pH7.5)。

(5)、病人血液中提取基因组RNA。(参考试剂盒说明书)

(6)、在反应Tube管中加以下反应液：dNTP(每种各2.5mmol/L)2.5μl，0.1mol/L巯基乙醇2.0μl，RNasin(40,000U/ml)0.5μl，纳米金标记的随机引物(20-40U/ml)2.0μl，3.0μg RNA(去离子水稀释)18.8μl。加热混合物5分钟至70℃，冰上冷却。简短离心样品。

(7)、反应Tube管中再加入：反转录酶缓冲液5.0μl，反转录酶200U1.2μl。致反应终体积为2.5μl。37℃保温60分钟后，90℃变性5分钟，冰上冷却5分钟。

(8)、1.0μl金标记cDNA加入9.0μl杂交缓冲液中。滴加该cDNA样品杂交缓冲液于芯片表面，加盖一2cm×cm的盖玻片，封闭杂交小室，浸入42℃水浴中，杂交1小时。

(9)、取出芯片立即浸入室温的1×SSC-0.1％SDS清洗液中，清洗5分钟。移入40℃ 0.1×SSC-0.1％SDS清洗液中洗涤5分钟。立即再以新鲜0.1×SSC-0.1％SDS清洗5分钟，后移入0.1×SSC清洗5分钟，以去除SDS。避光干燥。

(10)、锂银液2ml加入芯片表面，室温反应4分钟，0.1×SSC清洗5分钟。晾干。

(11)、普通光学仪器(如显微镜、扫描仪等)或肉眼直接观察结果，黑色颗粒即代表杂交阳性结果。

实施例10通过PCR反应标记产物DNA实施基因芯片的检测

试剂：单顺丁烯二乙酰亚胺修饰的纳米金试剂(直径1.4nm)，锂银液购自Nanoprobes公司。大肠埃希氏菌5’二硫双己基脱氧寡核苷酸引物1：5’SH-(CH₂)₆-TAT GAA CTG TGC GTC ACA GCC-3’，5’二硫双己基脱氧寡核苷酸引物2：5’SH-(CH₂)₆-CAT CAG CAC GTT ATC GAATCC-3’及大肠埃希氏菌特异探针：5’-TTC TAC TTT ACT GGC TTTGGT CG-3’由上海Sangon公司提供。

DNA提取试剂盒、PCR扩增试剂盒购自上海申能博彩生物科技有限公司步骤：

(1)、DNA芯片自制(参考：Linda A.Chrisey，Gil U Lee and C.ElizabethO’Ferrall.Covalent attachment of synthetic DNA to self-assembled monolayerfilms.Nucleic Acids Research，1996，24(15)：3031-3039)，制备的DNA芯片置于预热的杂交室内，加入5.0μl 5×SSC-2g/LSDS于杂交室内以保持湿度。

(2)、寡核苷酸引物1和2各9.6nmol分别与TECP-HCl 6.2mmol，0.1M磷酸钠缓冲液(pH 8.0，含有51mMEDTA)混合。温度37℃下进行还原反应。

(3)、溶解纳米金6nmol在0.02ml异丙醇或DMSO中，去离子水稀释至0.2ml。

(4)、纳米金溶液分别与已还原的SH修饰的寡核苷酸引物1和2的磷酸钠缓冲液混合(最终反应体系中磷酸钠缓冲液浓度为的0.01M，含有150mMNaCl、1mMEDTA，pH 6.5)，纳米金与巯基分子数比为10∶1，4℃共育6小时，分别制备成含纳米金的寡核苷酸引物1和2。反应产物分别用HPLC分离纯化，第一个淡红色峰为标记复合物，重复一次能进一步得到纯化效果。标记复合物储存在0.02M磷酸钠、150mM NaCl、0.05％叠氮化钠(pH7.5)。

(5)、病人血液中提取基因组DNA。(参考试剂盒说明书)

(6)、反应Tube管中加以下反应组成(100μl反应体系)：Taq酶(5U/μl)0.5μl，10×Taq酶Buffer 10μl，MgCl₂(25mM)8μl，dNTP(每种各2.5mM)8μl，样品DNA 1μg，金标记引物1(20μM)1-5μl，金标记引物2(20μM)1-5μl，加灭菌去离子H₂O至100μl。

(7)、放到预热的PCR仪中，程序如下：95℃30秒，50℃30秒，72℃60秒。进行32个循环。最后72℃延伸10分钟。

(8)、1.0μl金标记PCR产物DNA加入9.0μl杂交缓冲液中。于95℃变性10分钟，立即冰浴。

(9)、滴加该DNA杂交缓冲液于芯片表面，加盖一2cm×cm的盖玻片，封闭杂交小室，浸入42℃水浴中，杂交1小时。

(10)、取出芯片立即浸入室温的1×SSC-0.1％SDS清洗液中，清洗5分钟。移入40℃0.1×SSC-0.1％SDS清洗液中洗涤5分钟。立即再以新鲜0.1×SSC-0.1％SDS清洗5分钟，后移入0.1×SSC清洗5分钟，以去除SDS。避光干燥。

(11)、锂银液2ml加入芯片表面，室温反应5分钟，0.1×SSC清洗5分钟。晾干。

(12)、普通光学仪器(如显微镜、扫描仪等)或肉眼直接观察结果，黑色颗粒即代表杂交阳性结果。

实施例11通过直接反应标记核酸实施基因芯片的检测

试剂：单胺修饰的纳米金试剂(直径1.4nm)，锂银液购自Nanoprobes公司。

      肺炎链球菌特异探针：5’-TTT CGA GTG TTG CTT TTTATG GGC-3’

      由上海Sangon公司提供。

EDC(1-ethyl-3，3′-dimethylaminopropyl carbodiimide)购自Sigma公司。

步骤：

(1)、DNA芯片自制(参考：Linda A.Chrisey，Gil U Lee and C.ElizabethO’Ferrall.Covalent attachment of synthetic DNA to self-assembled monolayerfilms.Nucleic Acids Research，1996，24(15)：3031-3039)，制备的DNA芯片置于预热的杂交室内，加入5.0μl 5×SSC-2g/LSDS于杂交室内以保持湿度。

(2)、病人血液中提取基因组DNA。(参考试剂盒说明书)

(3)、标本DNA加热至98℃，10分钟后，将其迅速冷却到4℃以下。

(4)、在反应Tube管中加以下反应组成：变性的DNA-磷酸缓冲液20pmol，EDC 2nmol，1nmol EDTA，pH 6.5，去离子水家至50μl，4℃反应6小时。凝胶过滤层析法分离去除未反应的EDC。

(5)、溶解纳米金6nmol在0.02ml异丙醇或DMSO中，去离子水稀释至0.2ml。

(6)、纳米金溶液与已经修饰反应的DNA-磷酸缓冲液(磷酸缓冲液浓度为的0.01M，含有150mMNaCl、1mMEDTA，pH7.5)混合，纳米金与DNA分子数比为10∶1，4℃共育6小时。反应产物用HPLC分离纯化，第一个淡红色峰为标记复合物，重复一次能进一步得到纯化效果。标记复合物储存在0.02M磷酸钠、150mM NaCl、0.05％叠氮化钠(pH7.5)。

(7)、1.0μl金标记DNA加入9.0μl杂交缓冲液中。于95℃变性10分钟，立即冰浴。

(8)、滴加该DNA杂交缓冲液于芯片表面，加盖一2cm×cm的盖玻片，封闭杂交小室，浸入42℃水浴中，杂交1小时。

(9)、取出芯片立即浸入室温的1×SSC-0.1％SDS清洗液中，清洗5分钟。移入40℃ 0.1×SSC-0.1％SDS清洗液中洗涤5分钟。立即再以新鲜0.1×SSC-0.1％SDS清洗5分钟，后移入0.1×SSC清洗5分钟，以去除SDS。避光干燥。

(10)、锂银液2ml加入芯片表面，室温反应5分钟，0.1×SSC清洗5分钟。晾干。

(11)、普通光学仪器(如显微镜、扫描仪等)或肉眼直接观察结果，黑色颗粒即代表杂交阳性结果。

实施例12利用纳米金-银放大反应实施蛋白芯片的检测

试剂：单胺修饰的纳米金试剂(直径1.4nm)，锂银液购自Nanoprobes公司。

      戊型肝炎抗原购自3V诊断技术公司

      DTT购自Sigma公司。

步骤：

(1)、蛋白芯片自制。(参考：Gavin Mac Beath and Stuart L.Schreiber.Printing proteins as microarrys for high-throughput function determination.Science，289：1760-1763.)

(2)、病人血清0.5ml在0.1M磷酸钠缓冲液中，pH 6.0，含有5mM EDTA(1ml)，加入MEA(8mg)。室温孵育1小时。

(3)、凝胶过滤层析法分离还原的蛋白。洗脱液使用0.02M磷酸钠，pH 6.5，150mMNaCl，1mM EDTA。还原的蛋白在第一个高峰洗脱液中。

(4)、溶解纳米金试剂6nmol在0.02ml异丙醇中，去离子水稀释至0.2ml。

(5)、活性的纳米金溶液加入还原的蛋白中，4-37℃共育2-12小时。

(6)、利用凝胶过滤层析法从抗体复合物分离未标记的纳米金颗粒。洗脱液0.02M磷酸钠pH 7.4、150mMNaCl洗脱。第一个淡红色峰为标记复合物，第二个暗色带为未结合的纳米金。重复一次能进一步得到纯化效果。

(7)、将制备的蛋白芯片置于37℃的湿盒内，滴加10.0μl 1％PBS-BSA缓冲液(20mM磷酸缓冲液pH 7.40，含有150mM NaCl，0.5％BSA，0.1％甘油，0.05％Tween 20)芯片上，以阻断非特异性的蛋白结合位点及减少非特异性的抗体结合。

(8)、弃去芯片上的PBS-BSA，不冲洗，滴加10倍PBS-BSA缓冲液稀释的纳米金结合物，共育0.5-3小时并不时轻振反应液。

(9)、漂洗，PBS-BSA(3×1min)，PBS(3×1min)。晾干。

(10)、锂银液2ml加入芯片表面，室温反应5分钟，0.1×SSC清洗5分钟。晾干。

(11)、普通光学仪器(如显微镜、扫描仪等)或肉眼直接观察结果，黑色颗粒即代表杂交阳性结果。

实施例13利用纳米金-银放大反应实施组织芯片的检测

试剂：单胺修饰的纳米金试剂(直径1.4nm)，锂银液购自Nanoprobes公司。

      抗ICAM-1抗体购自晶美公司。

步骤：

(1)、组织芯片自制。(参考：Nocito A，Kononen J，Kallioniemi OP.Tissuemicroarrays(TMAs)for high-throughput molecular pathology research.Int JCancer.2001 Oct 1；94(1)：1-5.)。

(2)、溶解抗体(0.15mg)在0.1M磷酸钠缓冲液中，pH 6.0，含有5mMEDTA(1ml)，加入MEA(8mg)。室温孵育1小时。

(3)、凝胶过滤层析法分离还原的蛋白。洗脱液使用0.02M磷酸钠，pH 6.5，150mMNaCl，1mM EDTA。还原的蛋白在第一个高峰洗脱液中。

(4)、溶解纳米金试剂6nmol在0.02ml异丙醇中，去离子水稀释至0.2ml。

(5)、活性的纳米金溶液加入还原的抗体中，4-37℃共育2-12小时。

(6)、凝胶过滤层析法从抗体复合物分离未标记的纳米金颗粒。洗脱液0.02M磷酸钠pH 7.4、150mMNaCl洗脱。第一个淡红色峰为标记复合物，第二个暗色带为未结合的纳米金。重复一次能进一步得到纯化效果。

(7)、将制备的蛋白芯片置于37℃的湿盒内，滴加10.0μl 1％PBS-BSA缓冲液(20mM磷酸缓冲液pH 7.40，含有150mM NaCl，0.5％BSA，0.1％甘油，0.05％Tween 20)芯片上，孵育5分钟，以阻断非特异性的蛋白结合位点及减少非特异性的抗体结合。

(8)、PBS-BSA漂洗1分钟。

(9)、室温与纳米金复合物孵育30分钟。纳米金复合物PBS-BSA稀释50倍，其中含有1％正常纳米金标记抗体的同种血清。

(10)、漂洗，PBS-BSA 1分钟，共3次，PBS漂洗1分钟，共3次。

(11)、1％戊二醛的PBS固定10分钟。

(12)、去离子水漂洗5分钟，2次。

(13)、滴加适量锂银试剂染色3分钟。

(14)、去离子水漂洗5分钟，2次。

(15)、使用低温树脂常规方法脱水包埋。

(16)、显微镜下观察结果。

实施例14利用纳米金标记采用原位杂交技术实施组织芯片的检测

试剂：单顺丁烯二乙酰亚胺修饰的纳米金试剂(直径1.4nm)，锂银液购自Nanoprobes公司。

SH修饰的IL-8寡核苷酸探针：5’-GTT GGC GCA GTG TGG TCC ACTCTC AAT CAT-(CH₂)₆-SH-3’由上海Sangon公司提供。

蛋白酶K购自宝林曼公司。

Buffer I(Ph7.4)自配：马来酸0.1M，NaCl 0.15M。

步骤：

(1)、组织芯片自制。(参考：Nocito A，Kononen J，Kallioniemi OP.Tissuemicroarrays(TMAs)for high-throughput molecular pathology research.Int JCancer.2001 Oct 1；94(1)：1-5.)。

(2)、寡核苷酸9.6nmol与TECP-HCl 6.2mmol，0.1M磷酸钠缓冲液(pH8.0，含有51mMEDTA)混合。温度37℃下进行还原反应。

(3)、溶解纳米金6nmol在0.02ml异丙醇中，去离子水稀释至0.2ml。

(4)、纳米金溶液与已还原的SH修饰的寡核苷酸磷酸钠缓冲液混合(最终反应体系中磷酸钠缓冲液浓度为的0.01M，含有150mMNaCl、1mMEDTA，pH 6.5)，纳米金与巯基分子数比为10∶1，4℃共育6小时，制备成含纳米金的寡核苷酸探针。反应产物用HPLC分离纯化，第一个淡红色峰为标记复合物，重复一次能进一步得到纯化效果。标记复合物储存在0.02M磷酸钠、150mMNaCl、0.05％叠氮化钠(pH7.5)。

(5)、将制备的蛋白芯片置于37℃的湿盒内，0.1M PBS漂洗5分钟3次。

(6)、3％Triton X-100/0.1M PBS漂洗5分钟以增加组织的通透性。

(7)、2×SSC漂洗5分钟。

(8)、蛋白酶K(20μg/ml)消化，37℃孵育5分钟。

(9)、0.1M甘氨酸/0.1MPBS漂洗5分钟。

(10)、4％多聚甲醛漂洗5分钟。

(11)、1M PBS漂洗5分钟×3次，再用2×SSC漂洗10分钟。

(12)、预杂交：取预杂交液适量滴加在细胞片上，置42℃水浴孵育2小时。

(13)、杂交：按1∶50(标记的探针液∶预杂交液)比例配制杂交液。将杂交液滴加在组织芯片上，再用DEPC水处理的Parafilm膜覆盖置于湿盒内，42℃水浴孵育20小时。

(14)、取出芯片，去膜，37℃条件下依次在4×SSC、2×SSC、1×SSC、0.5×SSC中各漂洗5分钟×3次。

(15)、0.1M PBS室温漂洗5分钟。

(16)、Buffer I室温浸洗5分钟。

(17)、Buffer II(含1％封阻剂的Buffer I)37℃孵育1小时。

(18)、Buffer I室温漂洗5分钟。

(19)、滴加滴加适量锂银试剂染色3分钟。

(20)、0.1M PBS充分漂洗，终止反应。

(21)、芯片常规脱水、透明、中性树胶封片。

(22)、显微镜下观察结果。

对比试验1荧光标记检测法实验步骤

(1)、DNA芯片自制(参考：Linda A.Chrisey，Gil U Lee and C.ElizabethO’Ferrall.Covalent attachment of synthetic DNA to self-assembled monolayerfilms.Nucleic Acids Research，1996，24(15)：3031-3039)，制备的DNA芯片置于预热的杂交室内，加入5.0μl 5×SSC-2g/LSDS于杂交室内以保持湿度。

(2)、自金黄色葡萄球菌感染败血症患者50μl血清中，参照上海申能博彩生物科技有限公司DNA提取试剂盒说明书提取DNA，取2μl该DNA提取液为模板进行PCR反应。反应体系如下：总体积为25μl。50mM KCl，10mM Tis-HCl(pH9.0)，5mM MgCl₂，200μM dATP，200μM dGTP，200μM dCTP，80μM dTTP，40μM CY5标记dUTP，1.25U DNA聚合酶，各0.2μM的上游及下游引物。引物序列为：上游5’-gTC ggT ACA CgA TAT TCT TCA Cg-3’，下游5’-CTC TCg TAT gAC Cag CTT Cgg TAC-3’。扩增条件为：94℃ 5分钟，以94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 1分钟循环40次，72℃延伸10分钟。电泳检测PCR产物。

(3)、1.0μl荧光标记DNA加入9.0μl杂交缓冲液中，于95℃变性10分钟，立即冰浴。

(4)、滴加该DNA样品杂交缓冲液于芯片表面，加盖一2cm×cm的盖玻片，封闭杂交小室，浸入42℃水浴中，杂交1小时。

(5)、取出芯片立即浸入室温的1×SSC-0.1％SDS清洗液中，清洗5分钟。移入40℃0.1×SSC-0.1％SDS清洗液中洗涤5分钟。立即再以新鲜0.1×SSC-0.1％SDS清洗5分钟，后移入0.1×SSC清洗5分钟，以去除SDS。避光干燥。

(6)、将杂交完毕的芯片用激光共聚焦扫描仪在适当条件下扫描检测杂交信号。

对比试验2同位素标记检测法实验步骤

(1)、DNA芯片自制(参考：Linda A.Chrisey，Gil U Lee and C.ElizabethO’Ferrall.Covalent attachment of synthetic DNA to self-assembled monolayerfilms.Nucleic Acids Research，1996，24(15)：3031-3039)，制备的DNA芯片置于预热的杂交室内，加入5.0μl 5×SSC-2g/LSDS于杂交室内以保持湿度。

(2)、自金黄色葡萄球菌感染败血症患者50μl血清中，参照上海申能博彩生物科技有限公司DNA提取试剂盒说明书提取DNA，取2μl该DNA提取液为模板进行PCR反应。反应体系如下：总体积为25μl。50mM KCl，10mM Tis-HCl(pH9.0)，5mM MgCl₂，200μM dATP，200μM dGTP，200μM dCTP，200μM dTTP，1.25U DNA聚合酶，各0.2μM的上游及下游引物。引物序列为：上游5’-gTC ggT ACA CgA TAT TCT TCA Cg-3’，下游5’-CTC TCg TATgAC Cag CTT Cgg TAC-3’。扩增条件为：94℃5分钟，以94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟循环40次，72℃延伸10分钟。电泳检测PCR产物。

(3)、用博大泰克DNA片段回收纯化试剂盒回PCR产物，并采用随机引物标记法进行同位素标记。

(4)、1.0μl同位素标记DNA加入9.0μl杂交缓冲液中，于95℃变性10分钟，立即冰浴。

(5)、滴加该DNA样品杂交缓冲液于芯片表面，加盖一2cm×cm的盖玻片，封闭杂交小室，浸入42℃水浴中，杂交1小时。

(6)、取出芯片立即浸入室温的1×SSC-0.1％SDS清洗液中，清洗5分钟。移入40℃0.1×SSC-0.1％SDS清洗液中洗涤5分钟。立即再以新鲜0.1×SSC-0.1％SDS清洗5分钟，后移入0.1×SSC清洗5分钟，以去除SDS。避光干燥。

(7)、将杂交完毕的芯片进行放射自显影检测杂交信号。

根据具体实施例1方法，采用纯培养的金黄色葡萄球菌提取其DNA与两种对比试验进行的不同浓度检测结果比较如下：(注结果表示为x∶y，x表示检出阳性次数，y表示检测次数)

由上述对比试验的比较可看出：

(1)本发明采用的纳米放大技术，能够把杂交的信号放大到10^4-8倍，具有高的检测灵敏度和特异性。

(2)本发明采用的纳米放大技术，可以避免PCR反应，从而简化了样品的处理过程，缩短了检测时间。

(3)本发明采用的纳米放大技术，无污染，不需要昂贵的检测仪，降低了芯片的使用成本及实验条件。

Claims (9)

1、一种生物芯片的纳米放大检测方法，其特征在于：方法包括以下步骤：

(一)、用纳米金标记核酸或蛋白；

(二)、将标记的核酸或蛋白与生物芯片上的探针或组织杂交结合；

(三)、利用能与纳米金发生金属相反应的银粒子与已杂交结合在生物芯片上的核酸或蛋白上标记的纳米金反应，放大纳米金并进行普通光学检测。

2、根据权利要求1所述的生物芯片的纳米放大检测方法，其特征在于：所述步骤(一)中纳米金标记核酸的方法包括：

(1)通过寡核苷酸接头实现对核酸的标记；

或(2)通过引物实现对产物核酸的标记；

或(3)直接对核酸实现的标记。

3、根据权利要求1、2所述的生物芯片的纳米放大检测方法，其特征在于：通过寡核苷酸接头实现对核酸的标记，方法的步骤包括：

(1)、制备纳米金溶液；

(2)、将纳米金溶液与寡核苷酸混合，纳米金与寡核苷酸分子数之比为1-100∶1，反应获得含纳米金的寡核苷酸接头；

(3)、提取标本DNA，通过去磷酸化反应去除DNA的5’端的磷酸基团，防止其自身连接；

(4)、在连接酶作用下，结合纳米金标记的寡核苷酸接头与上述处理的标本DNA，获得纳米金标记的样本DNA。

4、根据权利要求1、2所述的生物芯片的纳米放大检测方法，其特征在于：通过引物实现对产物核酸标记方法中，采用通过PCR反应引物实现对产物DNA的标记，方法的步骤包括：

(1)、制备纳米金溶液；

(2)、将纳米金溶液与PCR引物混合，纳米金与引物分子数之比为1-100∶1，得到纳米金标记的PCR引物；

(3)、利用该标记引物进行PCR反应，得到纳米金标记的PCR产物DNA。

5、根据权利要求1、2所述的生物芯片的纳米放大检测方法，其特征在于：通过引物实现对产物核酸的标记方法中，采用通过RT-PCR反应引物实现对产物cDNA的标记，方法的步骤包括：

(1)、制备纳米金溶液；

(2)、将纳米金溶液与RT-PCR引物混合，纳米金与引物分子数之比为1-100∶1，得到纳米金标记的RT-PCR引物；

(3)、利用该标记引物进行RT-PCR反应，得到纳米金标记的RT-PCR产物cDNA。

6、根据权利要求1、2所述的生物芯片的纳米放大检测方法，其特征在于：直接对核酸实现的标记的方法是：通过与核酸的末端基团反应，从而使核酸末端修饰有含硫或含二酰亚胺类的化合物，该类化合物可以和纳米金反应，实现纳米金对核酸的标记。

7、根据权利要求1所述的生物芯片的纳米放大检测方法，其特征在于：所述步骤(一)中纳米金标记蛋白的方法步骤为：

(1)、制备纳米金溶液；

(2)、纳米金溶液与还原处理的蛋白混合，纳米金与蛋白分子数之比为为不低于5∶1，得到纳米金标记的蛋白。

8、根据权利要求1所述的生物芯片的纳米放大检测方法，其特征在于：所述步骤(二)中的纳米金标记的核酸与生物芯片上的探针杂交的步骤是：

(1)、对纳米金标记的DNA进行变性处理；

(2)、滴加变性处理的纳米金标记的DNA于生物芯片表面，进行杂交反应；

(3)、清洗去除未杂交结合的纳米金标记的DNA；

(4)、干燥处理备用。

9、根据权利要求1所述的生物芯片的纳米放大检测方法，其特征在于：所述步骤(二)中的纳米金标记的蛋白与生物芯片上的探针结合的步骤是：

(1)、PBS处理生物芯片，以阻断非特异的蛋白的结合位点及减少非特异性；

(2)、滴加纳米金标记的蛋白于生物芯片上，共育反应；

(3)、漂洗，去除未结合的纳米金标记的蛋白；

(4)、晾干备用。