CN1434863A

CN1434863A - 突变的bmp1b受体作为排卵率的调节因子

Info

Publication number: CN1434863A
Application number: CN00819163A
Authority: CN
Inventors: 特里萨·M·威尔逊; 吴希阳
Original assignee: AGRES Ltd
Current assignee: AGRES Ltd
Priority date: 1999-12-23
Filing date: 2000-12-22
Publication date: 2003-08-06
Also published as: EP1242597A4; US20030153035A1; NZ502058A; WO2001048204A1; EP1242597A1; AU2413701A; HK1051383A1; AU772907B2

Abstract

一种分离的突变核酸分子，所述核酸分子编码BMP1B受体多肽，其中所述分子：(a)具有不同于野生型BMP1B受体多肽的序列，区别在于编码第249个氨基酸残基的密码子编码精氨酸而非谷氨酰胺；(b)可在严谨条件下与(a)中所述的分子杂交；(c)是(a)中定义的序列的变体；(d)是(a)，(b)，或(c)中定义的分子的互补序列；或(e)是一种反义序列，所述反义序列相应于(a)到(d)中的任一序列。

Description

突变的BMP1B受体作为排卵率的调节因子

本发明有关动物排卵率的变化。一个方面，基因突变与杂合和纯合的雌性脊椎动物中排卵率的增加有关。所述突变的基因序列可用于检测中，以鉴定携带所述突变基因的杂合或纯合雌性和雄性脊椎动物。另一个方面，本发明涉及对负责决定脊椎动物排卵率的蛋白的鉴定。另一个方面中，本发明有关对所述蛋白活性的调节，以控制雌性脊椎动物的排卵率。

发明背景

应清楚地理解，尽管在本文中引用了多篇现有技术的出版物，这种引用并非承认，在新西兰或其他任何国家中，这些文献任一篇构成本领域常识的一部分。

在排卵率方面，Booroola Merino是世界上最好的绵羊品种之一。源自Booroola Merino品系的绵羊包含一个主要的常染色体突变，所述突变增加排卵和胎仔数(Davis等，1982)，所述突变被命名为FecB(产卵力，fecundity)。对于排卵率而言，FecB的效果是累加的(每个拷贝可增加排卵率约1.5倍)，平均一个拷贝的FecB可增加约一只羔羊，而两个拷贝增加约1.5只羔羊。Booroola基因的纯合子FecB^B/FecB^B(BB)，杂合子FecB^B/FecB⁺(B+)和非携带者FecB⁺/FecB⁺(++)可基于排卵率的记录来分开。FecB基因的生理作用已被全面的定义(McNatty等，1986，1987，Hudson等，1999)。有证据表明，FecB^BFecB^B母羊的高排卵率可能与卵巢内调节的变化有关(Fry等，1988，McNatty等，1993)。

Booroola基因在绵羊产业上的应用

如果已知Booroola公羊的携带状态，则其价值将会上涨。带有Booroola基因的公羊已被出口到许多国家，包括法国、英国、南非、波兰、智利、以色列、荷兰和美国，目的在于将Booroola上发现的高产仔能力引入其本国的畜群。

遗传性检测

绵羊中的FecB突变与来自人染色体4q21-25同线同源区的标记连锁，并且在图谱上位于绵羊染色体6q23-31(Montgomery等，1994)。这种与已知标记的连锁可鉴定绵羊Booroola基因的携带状态。由Genomnz(在新西兰AgResearch的一个商业单位)提供的一种商业上的检测基于由多态微卫星标记所定义的染色体区域的遗传。只有当至少一只动物在所述染色体区域和FecB之间有已知关系时，才能确定Booroola基因型，因此该检测只能局限于这种客户：其在畜群中已分离有FecB，以及对于那些有已确认的FecB携带者的样品的客户。该检测的另一个问题是Booroola检测标记在遗传上相距较远，足以在这些标记之间发生交换。只要发生这种交换，就不可能确定动物的Booroola状态，而且约10％的样品可能出现这种情况。

转化生长因子β家族

转化生长因子β(TGF-β)超家族蛋白包括TGF-βs和骨形态发生蛋白(BMPs)，是多功能蛋白，其在许多细胞类型中调节生长，分化和细胞外基质的产生(Helden等，1997，Massague 1998)。该家族成员在哺乳动物，两栖动物和昆虫的胚胎形成，以及骨的发育中有必不可少的作用。TGF-β和相关因子介导这些生物学效果的机制非常有趣。近来的研究阐明了该家族的几个成员是如何从细胞表面引发信号的。他们通过独特的I型和II型丝氨酸/苏氨酸激酶复合物发挥其细胞作用。这两种受体类型都是信号传递所必须的；I型受体作用于II型受体的下游，决定信号的特异性。结合后，II型受体磷酸化I型受体并活化该激酶。反过来，活化的I型受体利用Smad蛋白作为信号的载体将信号传送到下游底物(Kretzschmar等1997)。

BMP1B受体

BMP1B受体是转化生长因子β家族的一个成员，与Smad蛋白相互作用，所述Smad蛋白在TGF-β家族成员的胞内信号传导中有轴心的作用。已确认卵巢中存在具有功能的BMP系统。BMP受体家族，BMPR-IA，-IB和-II以细胞类型特异地方式在正常循环的大鼠卵巢中表达，在围绕优势卵泡(dominant follicle)的颗粒细胞(granulosa cell)中表达水平高(Shimasaki等1999)。

申请人发现在绵羊BMP1B受体基因上的一个突变，可导致携带Booroola基因的绵羊增加排卵率。

BMP1B受体对于产卵力的作用在先前是未知的。

发明概述

相应的，一个方面中，本发明提供了一种分离的突变核酸分子，所述核酸分子编码骨形态发生蛋白1B(BMP1B)受体，其中所述分子的序列与野生型不同，区别在于编码第249位氨基酸残基的密码子编码精氨酸而非谷氨酰胺(下文被称为突变的BMP1B受体序列)，或者所述序列是该突变序列的生物学功能等价物。

应清楚地理解，本发明也包括多种序列的核酸分子，使它们能在严谨条件下与突变的BMP1B受体序列杂交，或与该突变序列有大于80％的序列同一性，前提是本发明这方面排除了野生型BMP1B受体序列。本发明也包含上述定义的核酸分子的互补序列。

所述核酸分子可以是RNA，cRNA，基因组DNA或cDNA分子。

本发明进一步提供了一种鉴定携带突变BMP1B受体核酸分子的脊椎动物的方法，所述方法包含以下步骤：

i)从脊椎动物中获得组织或血液样品；

ii)从样品中分离DNA；

iii)可选地，从步骤(ii)所得的DNA中分离BMP1B受体DNA；

iv)可选地，用探针检测所述DNA，从而鉴定突变的BMP1B受体，所述探针与权利要求1中突变的BMP1B受体分子互补；

v)可选地，扩增突变的BMP1B受体DNA的量，并且；

vi)确定步骤(ii)中获得的哺乳动物BMP1B受体序列DNA是否携带与排卵率的增加或降低相关的突变。

优选该突变位于BMP1B受体DNA的胞内信号传递结构域，更优选位于编码相应于图3a的序列或SEQ ID NO2中第249位氨基酸残基的密码子内。

步骤(v)的扩增可以任何已知的便捷方法进行，如聚合酶链反应(PCR)。

应用本发明的脊椎动物可以是雄性或者雌性，还可以是人；或家养动物，宠物或动物园动物或野生哺乳动物；或者其他温血的脊椎动物。

本检测可广泛地用来评估脊椎动物的产卵力，所述脊椎动物如人和其他商业上重要的哺乳动物，以及鸟类，包括绵羊、牛、马、山羊、鹿、猪、猫、狗、负鼠和家禽。

根据进一步的方面，本发明提供了一种遗传标记，其可用于鉴定排卵率增加的脊椎动物。所述标记包含核酸分子，该核酸分子与编码BMP1B受体序列的核苷酸序列杂交。优选该标记能特异性地与以下杂交：

a)图2中的Booroola BMP1B DNA序列，其中第249位以精氨酸取代

谷氨酰胺，或者在SEQ ID NO3中定义的序列；或者其变体

b)基因组DNA或者其变体，所述DNA位于突变BMP1B受体基因内，

或与突变BMP1B受体基因相连；或

c)a)和b)中任一序列的互补序列。

优选该脊椎动物是人或一种商业上重要的动物；更优选该脊椎动物选自绵羊、牛、马、山羊、鹿、猪、猫、狗、小鼠、大鼠和家禽。

优选所述遗传标记包含以下的Booroola DNA序列：

a)图2，其中黑体的A被G取代；或

b)SEQ ID NO3；或

c)a)或b)中任一序列的互补序列。

更优选所述遗传标记至少包含以下的Booroola DNA序列：

a)图3c，或

b)SEQ ID NO3，位于包括编码第243位氨基酸残基的密码子的区域；

或

c)a)或b)中任一序列的互补序列。

根据进一步的方面，本发明提供一种鉴定排卵率增加的脊椎动物的方法，所述方法包含检测雌性脊椎动物中突变BMP1B受体多肽的水平，所述突变BMP1B受体多肽的水平与具有较高排卵率的脊椎动物相关。

一个方面中，本发明提供了一种与野生型不同的突变BMP1B受体多肽，区别在于249位的残基是精氨酸而非谷氨酰胺；或者其功能变体，所述变体具有调节雌性脊椎动物排卵的能力。

一个方面中，本发明提供一种分离的多肽，其选自以下的氨基酸序列：

a)图3a；或

b)SEQ ID NO2；或

c)a)或b)中序列的变体，具有调节雌性哺乳动物排卵的能力。

一个方面中，本发明提供了一种调节雌性脊椎动物排卵率的方法，所述方法包含给予所述脊椎动物以有效剂量的BMP1B受体抑制剂或激动剂。

本方面一个优选的方法使用BMP1B受体抗体。应清楚地理解，为此方法的目的，术语“抗体”包含抗体的保留有结合BMP1B受体的能力的片段或类似物，包括但不限于Fv，F(ab)，和F(ab)₂片段，scFv分子及其同类。优选该抗体是单克隆抗体。

进一步的方面中，本发明提供一种组合物，所述组合物包含有效剂量的BMP1B受体抑制剂或激动剂，以及一种可药用或兽用的载体。优选该组合物包含有效剂量的选自以下的试剂和一种可药用或兽用的载体：

a)野生型或突变的BMP1B受体多肽，或其免疫原性区；

b)靶向野生型或突变的BMP1B受体多肽的抗体，或其抗原结合片段；

c)靶向编码突变或野生型BMP1B受体多肽的核酸的反义核酸；

d)野生型或突变的BMP1B受体多肽的拟受体；以及

e)结合野生型或突变的BMP1B受体多肽的配体，该配体通过结合可抑

制脊椎动物内源BMP1B受体的活性。

进一步的方面中，本发明提供了一种鉴定纯合和/或杂合的雄性和雌性脊椎动物的试剂盒，所述脊椎动物携带有突变的BMP1B受体基因，该试剂盒鉴定突变BMP1B基因的核酸序列本身或鉴定其所表达的蛋白。

尽管本发明在以上进行广泛定义，本领域技术人员应理解这并非是对其的限制，这也包括下述说明出给出的实施例的实施方案。

附图说明

本发明优选的方面将根据以下附图进行说明：

图1显示绵羊6号染色体的遗传连锁图谱。遗传距离以KosamabicentiMorgans(cM)计。Booroola(FecB)基因经作图位于黑体条带显示的区域内。

图1(B)是被分析的性状沿6号染色体的检验统计量分布(F-比(ratio))的量化性状座位(Quantitative Trait Loci，QTL)分析。对两岁半和三岁半的动物在四月初和四月末进行排卵率检测。将这四种性状组合，在分析中使用所有这四种性状总平均的平均残余偏差。标记的位置沿x轴表示。

图2显示野生型绵羊中BMP1B受体的核苷酸序列。Booroola绵羊中核苷酸取代的位置是以黑体表示的830位的A。Booroola绵羊中该核苷酸是G。起始密码子(ATG)和终止密码子(TGA)被下划线。

图3a显示野生型绵羊中BMP1B受体多肽的推算的氨基酸序列，所述多肽由图2中的核苷酸序列编码。位置249处的氨基酸因在249处的Booroola碱基取代而改变，以黑体表示。

图3b显示第249位氨基酸残基周围的野生型序列。

图3c显示第249位氨基酸残基周围的Booroola序列。

图4显示在物种绵羊、人、鼠和鸡中BMP1B受体基因序列之间的高度同源性，以及在Booroola动物中发现的突变位置。

图5显示BMP1B受体在绵羊不同组织(包括卵巢)内的表达。

图6显示一种检测的实例，所述检测可用于筛选所述突变。该检测被称为强迫性RFLP(Forced RFLP)，在携带Booroola突变的动物中产生酶AvaII的一个限制性切点。

发明内容

我们首次表明BMP1B受体基因内的突变负责动物排卵率的增加，所述动物是Booroola基因的杂合子或纯合子。

相应的，一方面，本发明提供了一种分离的突变核酸分子，所述核酸分子编码BMP1B受体多肽，其中所述分子

(a)具有与野生型BMP1B受体多肽不同的序列，区别在于编码第249位氨基酸残基的密码子编码精氨酸或赖氨酸而非谷氨酰胺；

(b)可在严谨条件下与(a)中所述分子杂交；

(c)是(a)中定义的序列的变体；

(d)是(a)，(b)或(c)中定义的分子的互补序列；或

(e)是对应(a)-(d)中任一序列的反义序列。

所述核酸分子可以是RNA，cRNA，基因组DNA或cDNA分子。

术语“分离的”是指基本上从天然产生所述核酸分子的细胞或生物中的含杂质序列中分离或纯化，包括通过标准纯化方法纯化的核酸，通过重组技术(包括PCR技术)制备的核酸，以及合成的核酸。优选，该核酸分子分离自表达Booroola表型的绵羊基因组DNA。

术语“排卵调节”是指与在未处理的哺乳动物中观察到的排卵率相比，排卵率的增加或降低。

根据一个方面，本发明涉及鉴定脊椎动物的方法，所述脊椎动物携带突变的BMP1B受体核酸分子，所述方法包含以下步骤：

i)从脊椎动物中获得组织或血液样品；

ii)从样品中分离DNA；

iii)可选地，从步骤ii)所得的DNA中分离BMP1B受体DNA；

v)可选地，扩增突变的BMP1B受体DNA的量，并且；

vi)确定步骤ii)中获得的哺乳动物BMP1B受体序列DNA是否携带与排卵率的增加或降低相关的突变。

可用于本方法的探针和引物也构成本发明的一部分。所述探针和引物可包含本发明核酸分子的一个片段，所述片段可在严谨条件下与突变的BMP1B受体基因序列杂交。这种探针和引物也可用于研究所述突变基因的结构和功能，用于获得来自除绵羊以外表达Booroola表型的其他动物的该基因同系物。

核酸探针和引物可基于本发明的核酸制备，如图2黑体A被G取代的序列，或SEQ ID NO3中定义的序列；或与这些序列互补的序列。“探针”包含一种连接于可检测标签或报道分子上的分离的核酸。典型的标签包括放射性同位素、配体、化学发光剂和酶。

“片段”是核酸的一部分，其比全长短并包含至少一段最短的在下述严谨条件下可与本发明核酸分子或其互补序列特异性杂交的序列。本发明的片段至少具有本发明核酸或多肽的一种生物活性。

“引物”是短的核酸，优选是长度为15个核苷酸或更长的寡核苷酸，其可通过核酸杂交，与互补的靶DNA链退火，在所述引物和所述靶DNA链间形成杂合体，然后利用聚合酶(优选DNA聚合酶)沿靶DNA链延伸。引物对可用于扩增核酸序列，如通过聚合酶链反应(PCR)或其他本领域熟知的扩增方法。PCR引物对可来自本发明的核酸序列，例如通过使用为此目的的计算机程序，如Primer(Version 0.5^1991，Whitehead Institute of BiomedicalResearch，Cambridge，MA)。

制备和使用探针和引物的方法在，如Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2^nd ed，vol.1-3，ed Sambrook等.Cold Spring HarbourLaboratory Press，Cold Spring Harbour，NY，1989中有说明。

探针或引物可以是在溶液中自由存在，也可以标准方法共价或非共价连接于一种固相支持物上。

对于使用特异性扩增引物对扩增靶核酸序列(如通过PCR)，严谨条件是许可该引物对只与靶核酸序列杂交的条件，其中具有相应野生型序列(或其互补序列)的引物可与所述靶核酸结合。

除碱基组成、互补链长度和杂交核酸之间核苷酸碱基错配的数目外，核酸杂交还可被如下条件影响，如盐浓度、温度、或有机溶剂，这些是本领域技术人员很容易理解的。

当涉及探针或引物时，术语“特异于(靶序列)”表示，在包含靶序列的指定样品中，所述探针或引物在严谨条件下仅与所述靶序列杂交。

另一个实施方案中，本发明提供了一种遗传标记，所述标记是人和其他脊椎动物(如绵羊、牛、鹿和猪，或任何其他商业上重要的脊椎动物)排卵率增加的标记。本发明提供了使用一种核酸分子鉴定动物个体中序列变体的工具(means)，其中所述核酸分子包含源自突变BMP1B受体DNA序列，或与突变BMP1B受体基因相连的基因组DNA的序列，所述序列变体与该动物的排卵率增加有关。尽管这些变体不一定直接导致排卵增加或不育的性状，但其与这些性状非常相关，而足以预测这种性状。鉴定这些序列变体的方法是本领域所熟知的，包括但不限于，限制性片段长度多态性(RFLP)，扩增片段长度多态性(AFLP)，突变BMP1B受体基因内DNA或与突变BMP1B受体基因相连的DNA的直接测序，或者对串联重复的可变数量(VNTR)，又被称为微卫星多态性进行鉴定和定性。因此，所述遗传标记可用于对排卵增加的动物的DNA选择。

所述遗传标记可至少包含选自以下的DNA序列之一：图2的序列(其中黑体的A被G所取代)或SEQ ID NO3中定义的序列。

进一步的方面中，本发明提供了一种与野生型不同的突变的BMP1B受体多肽，其区别在于249位的残基是精氨酸而非谷氨酰胺；或其功能变体，所述变体具有在雌性哺乳动物中调节排卵的能力。

一个方面中，本发明提供一种分离的多肽，选自图3a或SEQ ID NO2

的氨基酸序列，或这些序列的变体，所述变体具有在雌性哺乳动物中调节排卵的能力。

该多肽可通过在适当的宿主细胞中表达合适的载体而产生，所述载体包含编码以下多肽的核酸分子：

a)图3a或SEQ ID NO2的多肽或这些序列的变体，或

b)图3a的多肽，其在第249位残基有精氨酸的氨基酸取代(在图3c和SEQ ID NO4中表示)；或这些序列的变体。

这是本领域技术人员所能理解的。所述多肽可被包含在一种药用或兽用载体(如等渗盐水溶液)中，用来给予人或动物以调节排卵。所述多肽也可用于产生抗体，用于本发明的其他方面。

所述克隆载体的选择要根据所使用的宿主或宿主细胞。有用的载体通常具有以下特征：

(a)自我复制的能力；

(b)对任何特定的限制性内切酶都具有一个唯一靶点；以及

(c)更希望携带编码易于筛选的标记(如抗生素抗性)的基因。

具有这些特性的两种主要载体是质粒和细菌病毒(噬菌体)。目前优选的载体包括质粒pMOS-Blue，pGem-T，pUC8和pcDNA3。

本发明的DNA分子可通过与适当的控制序列可操作连接在可复制的表达载体中而被表达。控制序列可包括如复制起始位点，启动子，增强子和转录终止序列。对表达载体中控制序列的表达取决于被用来表达所述DNA的宿主或宿主细胞的类型。

通常，原核生物，酵母或哺乳动物细胞是有用的宿主。宿主这一术语也包含质粒载体。合适的原核宿主包括大肠杆菌(E.coli)，芽孢杆菌属(Bacillus)，和假单胞菌属(Pseudomonas)的许多种。通常使用的启动子，如β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)启动子系统是本领域熟知的。可使用任何与所选宿主相容的现有启动子系统。酵母中使用的载体也是现有的并被熟知的。一个合适的例子是2μ复制起始点质粒。

类似的，在哺乳动物细胞中使用的载体也是众所周知的。这样的载体包括，SV-40，腺病毒，反转录病毒来源的DNA序列，单纯疱疹病毒的已知衍生物，以及衍生自质粒和噬菌体DNA组合的载体。

另外的真核表达载体是本领域所熟知的(如，P.J.Southern & P.Berg，J.Mol.Appl.Genet.1 327-341(1982)；S.Subramani等，Mol.Cell.Biol.1，854-864(1981)；R.J.Kaufmann & P.A.Sharp，“Amplification and Expression ofSequences Cotransfected with a Modular Dihydrefolate ReducaseComplementary DNA Gene，J.Mol.Biol.159，601-621(1982)；R.J.Kaufmann& P.A.Sharp，Mol.Cell.Biol.159，601-664(1982)；S.I.Scahill等，“ExpressionAnd Characterization Of The Product Of A Human Immune InterferonDNAgENE In Chinese Hamster Ovary Cells，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA.80，4654-4659(1983)；G.Urlaub & L.A.Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.77，4216-4220(1980)。

本发明中有用的表达载体包含至少一个表达控制序列，所述序列与将要表达的DNA序列或片段可操作地连接。所述控制序列插入载体以便控制并调节克隆的DNA序列的表达。有用的表达控制序列如 lac系统， trp系统，tac系统， trc系统，λ噬菌体的主要操纵子和启动子区域，酵母酸性磷酸酶的糖酵解启动子，如Pho5，酵母α接合因子启动子，以及来源于多形瘤、腺病毒、反转录病毒、和猿猴病毒的启动子，如SV40的早期和晚期启动子，以及其他已知可以控制原核和真核细胞和它们的病毒的基因表达的序列，或其组合。

在构建载体中，通过简便快捷的分析就可区分未经修饰的载体和包含异源DNA的载体是有利的。这些分析中使用的报道系统包括报道基因，和其他可检测标签(产生可检测的颜色变化)，抗生素抗性等。一种优选的载体中使用了β-半乳糖苷酶报道基因，该基因通过在X-gal平板上有蓝色表型的克隆检测。这便于选择。一个实施方案中，所述β-半乳糖苷酶基因被编码多角体蛋白的基因所取代，该基因通过用X-gal染色使克隆呈现白色表型而检测。这种蓝-白颜色选择可用做检测重组载体的有用标记。

一旦选定，就可按照常规方法从培养物中分离载体，如冻融抽提，接着纯化。

包含本发明DNA和控制信号的载体被插入或转化入宿主或宿主细胞以便表达。一些有用的表达宿主细胞包括众所周知的原核和真核细胞。合适的原核宿主包括，如大肠杆菌，如 E.coli，S G-936， E.coli HB101， E.coli W3110，E.coli X1776， E.coli X2282， E.coli DHT，和 E.coli MR01，假单胞菌属，芽孢杆菌属，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和链霉菌属(Streptomyces)。合适的真核细胞包括酵母和其他真菌、昆虫、动物细胞，如组织培养中的COS细胞，CHO细胞，人细胞和植物细胞。

基于所使用的宿主，转化根据适合于所述细胞的标准技术进行。对于原核细胞或包含细胞壁的其他细胞，可使用钙处理方法(Cohen，S N Proceedings，National Academy of Science，USA 69 2110(1972))。对于没有这种细胞壁的哺乳动物细胞，优选Graeme和Van Der Eb的磷酸钙沉淀法(Graeme & Van DerEb，Virology 52：546(1978))。可用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)进行植物的转化(Shaw等，Gene 23：315(1983))或用Van Solingen等(J.Bact.130：946(1977))和Hsiao等(Proceedings，National Academy of Science，76：3829(1979))的方法进行酵母转化。

当合适的载体转化选定的宿主后，通过培养宿主细胞，可产生所述被编码的多肽或肽，通常是融合蛋白的形式。本发明的多肽或肽可通过上述快速分析方法检测。然后回收本发明的多肽或肽，如有需要再进行纯化。回收和纯化可利用本领域任何已知方法进行，如通过吸附于阴离子交换树脂，并随后洗脱。产生本发明多肽或肽的方法组成了本发明进一步的方面。

转化有本发明载体的宿主细胞也形成本发明进一步的方面。

本文所用术语“变体”是指核苷酸和多肽序列，其中所述核苷酸或氨基酸序列与附图中的核苷酸或氨基酸序列有基本上是60％或更高的同源性，优选与本发明序列有75％的同源性，更优选有90-95％的同源性，通过GAP或BESTFIT(核苷酸和肽)，或BLASTP(肽)或BLAST X(核苷酸)进行评估。这种变体可能源自对天然核苷酸或氨基酸序列的修饰，所述修饰是通过一个或多个核苷酸或氨基酸的插入、取代或缺失实现的，或者所述变体也可能是天然产生的变体。术语“变体”也包括与本发明序列杂交的同源序列，所述杂交是在标准条件下(定义为2x SSC，65℃)进行，或优选在严谨条件下(定义为6x SSC，55℃)进行，只要所述变体可调节雌性哺乳动物的排卵率。当期望这种变体时，天然DNA的核苷酸序列被适当地改变。这种改变可通过DNA的合成或天然DNA的修饰来实施，如通过位点特异性诱变或盒式诱变。优选，对于cDNA或基因组DNA上需要序列修饰的部分，用本领域的标准技术，进行位点特异性引物介导的诱变。

术语“蛋白(或多肽)”是指由本发明核酸分子编码的蛋白，所述核酸分子包括具有相同生物活性(即调节排卵率的能力)的片段、突变和同系物。本发明多肽可从天然来源分离，通过重组核酸分子的表达产生，或者化学合成。

此外，与本发明核苷酸和氨基酸序列基本上相同的核苷酸和肽也可用于优选实施方案。此处“基本上相同”是指两个序列，当任选用GAP或BESTFIT程序(核苷酸和肽)以缺省的缺口权重值进行最佳的序列对比，或用计算机算法BLASTP(肽)和BLASTX(核苷酸)测定时，具有至少60％，优选75％，最优选90-95％的序列同一性。优选，不相同的残基位点是由保守氨基酸取代产生的不同。例如，具有相似化学特性(如电荷或极性)的氨基酸的取代不太可能影响蛋白的特性。这种取代的例子包括谷氨酰胺对天冬酰胺的取代，或谷氨酸对天冬氨酸的取代。

一个其他的方面中，本发明提供了在雌性脊椎动物中降低排卵率的方法，所述方法包含诱导对突变的或野生型BMP1B受体多肽免疫应答的步骤。这可能代表主动或被动的免疫。或者也可使用反义核酸，拟受体或抑制性配体。

因此，该方法提供了在雌性脊椎动物中降低排卵率的方法，所述方法包含给予有效剂量的试剂的步骤，所述试剂选自：

(a)免疫有效量的野生型或突变的BMP1B受体多肽，或其免疫原性区；

(b)靶向野生型或突变的BMP1B受体多肽的抗体，或其抗原结合片段；

(c)靶向编码野生型或突变的BMP1B受体多肽的核酸的反义核酸；

(d)野生型或突变的BMP1B受体的拟受体；以及

(e)结合野生型或突变的BMP1B受体多肽，并因此抑制脊椎动物内源BMP1B受体的活性的配体。

另外，反义核酸(如稳定的反义RNA)可用来调控BMP1B受体的活性，从而调控排卵率。这可以通过与Hussainus等(1999)中和LDL受体相关蛋白的活性的方法相类似的方法实施。

其他的取代方法是使用与Onichtchouck等(1999)所述使TGF-β信号传递沉默的拟受体类似的拟受体。

本发明另一个方面提供了配体，所述配体与本发明多肽结合，并抑制其活性。更普遍的，所述配体是一种抗体或其抗原结合片段。所述配体也组成了本发明的部分。

应理解，排卵率的降低可能很彻底和/或长期持续，直到使脊椎动物不育。

因此，本发明可能可用于减少不需要的野生脊椎动物群。

进一步的方面中，本发明提供了产生针对本发明多肽的抗体的方法，包含以下步骤：

(a)在合适的宿主细胞中表达合适的载体，所述载体包含本发明的核酸分子或其功能变体；

(b)回收表达的多肽或肽；和

(c)利用本领域已知方法产生针对所述多肽或肽的单克隆或多克隆抗体。

根据另一个方面，提供了一种组合物，所述组合物包含本发明的多肽或核酸以及本领域技术人员所知的药用或兽用载体。当然，可在该组合物中包含多于一种的本发明多肽或核酸。所述载体可以是等渗盐水溶液。

根据本发明的另一方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒鉴定携带有本发明突变的BMP1B受体核酸分子的单拷贝(杂合的)的雄性和雌性脊椎动物，以及携带有本发明突变的BMP1B受体核酸分子的两个拷贝(纯合的)的雄性和雌性脊椎动物，所述试剂盒包含：

X用于扩增BMP1B受体基因合适区域的引物对；以及可选择的，一或多种

X用于扩增(如PCR扩增)的缓冲盐溶液；

X脱氧核苷酸混合物；

X热稳定性DNA聚合酶；

X来自被检测物种的对照DNA；

X合适的标准物；

X适当的检测系统，其可以包含一种各对均被标记有荧光或其他物质的引物，或检测产物的标记探针；和

X扩增以及对扩增产物后续检测的说明和方案以及结果的解释。

本发明也提供一种试剂盒，所述试剂盒检测脊椎动物中循环的突变BMP1B受体蛋白，所述动物包含针对该突变BMP1B受体蛋白的特异性抗体。这种试剂盒可包含本领域技术人员熟悉的标准ELISA或酶免疫分析试剂盒，如其可包含所述抗体，以及用于增强信号的标准第二抗体放大组分。所述抗体可与荧光基团或放射性或发光标签偶联，或可对所述第二抗体进行标记。也可任选应用合适的溶液，对照，缓冲液，说明及方案。

现在将提供本发明的实施例，所述实施例并非是作为对本发明的限制。

实施例

动物

在基因作图实验中使用的动物来自AgResearch Booroola半同胞(half-sib)和回交群体。15只B+公羊与++母羊交配，产生540只半同胞雌性后代(daughter)。对于回交家族，将BB公羊与++母羊交配，其B+雌性后代与++公羊交配，继续遗传3-4代(总共239只动物)。雌性后代在约19和31月龄时，对其连续进行两次腹腔镜检查，鉴定携带Booroola表型的动物还通过微卫星标记的遗传分析检测得知所述微卫星在基因图上与FecB基因相邻。

基因作图

对于初始的作图实验，对半同胞和回交群体的DNA样品中来自6号染色体的标记进行分型。FecB基因型的排布是基于对排卵率的记录，如前所述(Montgomery等，1994)，除了在基因型被排布之前，对半同胞家族成员有一个额外的限制因素。这种限制要求平均排卵率不处于该家族平均排卵率的中心10％以内，并且被用于解释各家族间平均排卵率的差异。利用CRI-MAP的“所有”选项(如上所述，Crawford等，1995)来寻找带有lod 3 support的间隔，可将FecB基因型作图于OOV6图谱上。

DNA的纯化和测序

从各动物采集的5-10ml全血中的白细胞中纯化DNA(Montgomery和Sise，1990)。所有亚克隆和PCR产物的测序都由University of Otago Center forGene Research(ABI373自动测序仪)提供的商业服务完成。

DNA标记

从绵羊中扩增DNA的微卫星(二核苷酸重复)标记如前所述(Lord等，1998)，在AgResearch Molecular Biology Unit内进行，或来自关于牛和绵羊基因作图的文献。还对来自人4号染色体的已知基因进行了与FecB的连锁分析，并置于图谱上。

单元型分析

对半同胞家族中所有的雌性后代筛选位于FecB基因座关键区侧翼的标记。鉴别在FecB基因座周围20cM区域内具有遗传重组的个体，以备后续研究。所述关键区域内鉴定的其他标记在家族中和/或在重组组中分型。该关键区域进一步通过连锁和单元型分析确定位于PDHA2和JP27之间(表2)。

BMP1B受体基因产物的PCR扩增

使用标准条件对基因组DNA进行聚合酶链反应(PCR)扩增。包含单核苷酸突变的PCR产物用以下引物扩增

5’AGTGTTCTTCACCACAGAG；和5’CATGCCTCATCAACACCG。

PCR产物与商品化DNA分子量标记物一起，在2.5％的琼脂糖凝胶中电泳分离，使用凝胶抽提试剂盒从凝胶中回收，并送去测序。

强制的RFLP

要筛选绵羊群体中所述突变，使用了一种特意在引物之一中引入点突变的方法，从而该PCR产物将包含一个AvaII限制性切点。来自非携带型动物的PCR产物不包含限制性切点。引物5’GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG和5’CAAGATGTTTTCATGCCTC ATCAACACGGTC扩增出140bp的片段，使用AvaII消化后，BB动物将有110bp的片段，B+动物将有140和110bp的片段，++动物将有140bp的片段。所述片段是按以下程序扩增：35个循环的94℃，15sec，60℃30sec，72℃30sec，接着72℃5min，99℃15min。然后将所述片段在2.5％的琼脂糖凝胶中电泳，对所述突变的存在评级。

反转录-PCR

BMP1B受体在不同组织中的表达通过对cDNA的PCR确定，所述cDNA产生自BB母羊或BB公羊的组织中分离的0.1μg总RNA。引物5’AGCTGTGAAAGTGTTCTTCACC和5’TCTTTTGCTCTGCCCAC AAAC扩增BMP1B受体的1.2kb内含子，从cDNA产生一个880bp片段。β-肌动蛋白引物5’GCATGGGCCAGAAGGACTCC和5’CGTAGATGGGCACCGTGTGG被用做对照。

结果

已发现人BMP1B受体位于4号染色体的4q23-q24。绵羊中FecB基因位于6号染色体(图1)的标记JL2和JP27之间，并且我们认为其位置与JP36很接近。这基于对在已知标记间经历了重组的动物的单元型分析(表2和图1B QTL图)；并且其增加排卵的Booroola表型被丧失或被保留。

通过对从卵巢组织中分离的cDNA扩增的PCR产物测序，测定来自Booroola绵羊和野生型绵羊的完整BMP1B受体基因的序列。我们发现一个单核苷酸的多态性，既野生型绵羊中的一个A在Booroola中被一个G所取代(图2)。这使蛋白序列从谷氨酰胺(Q)改变为Booroola动物的精氨酸(R)(图3a-b和图3c)。这表示从中性氨基酸到碱性氨基酸的转变。所述突变的位置处于BMP1B受体的胞内信号传递结构域内。

该单碱基变化通过PCR和对携带Booroola表型的绵羊基因组DNA的序列分析得以验证(表1)。我们在BMP1B受体上发现的该突变在野生型动物中不存在。我们对自己的BB，B+和++动物群体进行了采样，也分析了80只由沙特阿拉伯(Saudi Arabia)、荷兰和美国送到Genomnz(AgResearch中诊断性商业化单位)的动物，这些动物都是经商业检测评级的动物，我们的结果是一致的。我们发现在来自其育种计划中所用Booroola公羊的群体中该突变有分支(segregating)。

目前我们已从我们的回交和半同胞群体中筛选了300只动物，并发现该突变一致地与增加排卵的表型相关。我们也在非Booroola的美利奴羊(merinos)中寻找过这种突变，但不存在。我们还检测了来自6种不同绵羊品系(Coopworths，Perindale，Romney，Texel，Finn和Gotland)的65只动物，但在这些动物中未发现该突变。因此，我们记述的该突变目前仅被发现存在于Booroola美利奴羊来源的动物中。

表1

对来自己知携带状态的动物的DNA进行PCR扩增，对产物测序。对于杂合B+动物，G和A核苷酸均发现于代表两种等位基因的相同峰中。动物号基因型序列OA771 BB CGGOA1012 ++ CAGOA1692 B+ CG/AGOA1482 B+ CG/AGOA2850 ++ CAGOA1331 BB CGGOA1035 ++ CAGOA1684 B+ CG/AGOA3725 ++ CAGOA8015 BB CGGOA8017 BB CGGOA5020 ++ CAGOA5026 ++ CAG93-W7798-TAM BB CGG97-B9938-AKH ++ CAG97-B9341-AKH B+ CG/AG95-W3232-AKH ++ CAG97-B9453-AKH B+ CG/AG97-2607-TEX B+ CG/AG97-2506-TEX ++ CAG97-2609-TEX ++ CAG97-2553-TEX B+ CG/AG99-990105-IDL BB CGG99-990106-IDL BB CGG98-980315-IDL B+ CG/AG98-980312-IDL B+ CG/AG98-980272-IDL ++ CAG98-980228-IDL ++ CAG

我们在BMP1B受体上发现的突变在野生型动物中没有发现。我们对自己的BB，B+和++动物群体进行了检测，也检测了来自沙特阿拉伯、荷兰和美国的动物，这些动物都经Genomnz商业检测，结果与商业检测获得的结果一致。

BMP1B受体基因编码的蛋白与人和鼠的序列高度同源(图4)，在人和绵羊间只有两个氨基酸的差异，差异在位置298和308处。第249位关键氨基酸周围的序列在人和野生型绵羊中是相同的。因此应理解，该基因活性的调节有应用于体外受精项目以及动物育种的潜力。

本说明书全文使用的术语“包含”或其语法上的变体并不是用来限制。因此该术语不应被理解为排除除本发明以外的其他特点或因素的存在。因此，此处所用“包含”一词是“包括”一词的等价物。

本发明各方面仅通过实施例的方式进行说明，应理解在不背离所附权利要求的范围时，可对其进行修改和补充。

表2 Booroola单元型分析

分析以下列出的重组动物的等位基因遗传性，或者来源于Booroola●，或者来源于非Booroola□染色体，-表示这些动物的标记来源不清。断点由表型栏表示，其中显示了各动物携带有(B)或未携带(+)FecB的状态。

标记
标记														动物	9231MB	SDG	95OMSSC	62LJ	2LJ	2AHDP	63LJ	型表	72PJ	07MH	101EA	55HH	341MB
880257870019890156911023850096900007890037900028890124890173900085890011880261850055880086850087911003880457	-□□□●-●●●●---□--●-	--□----------□-□-●	-□---●-●-●●□□□□□-●	□□□□●●●●●●●-□□□□●●	□□□□●●●●●●●□□□□□●●	---□----●●---□□□--	□□□□●●●●-●-●●●●---	++++BBBBBBBBBBB+++	●●●-□□□□□-□●●●●●□□	●●●●□□-□□□□●●●●●--	---●--□--□----●-□□	●---□□-□-□--●●-●□-	--●-□□□□□□-●-●●●□□	动物	9231MB	SDG	95OMSSC	62LJ	2LJ	2AHDP	63LJ	型表	72PJ	07MH	101EA	55HH	341MB

参考文献Crawford AM，Dodds KG，Ede AJ，Pierson CA，Montgomery GW，Garmonsway HG，Beattie AE，Davies K，Maddox JF，Kappes SW，Stone RT，Nguyen TC，Penty JM，LordEA，Broom JE，Buitkamp J，Schwaiger W，Epplen JT， Matthew P，Matthews ME，HulmeDJ，Beh KJ，McCraw RA，Beattie CW. An autosomal genetic linkage map of the sheepgenome. Genetics 1995；140；703-724.Davis GH，Montgomery GW，Allison AJ，Kelly RW and Bray AR (1982). Segregation ofa major gene influencing fecundity in progeny of Booroola sheep. New Zealand JournalAgricultural Research 25：525-529Fry RC，Clarke IJ，Cummins JT，Bindon BM，Piper LR and Cahill LP (1988) Inductionof ovulation in chronically hypophysectomized Booroola ewes. Journal of Reproductionand Fertility 82：711-715.Heldin，C-H，Miyazona K，ten Dijke P(1997)TGF-βsignalling from cell membrane tonucleus through SMAD proteins. Nature 390：465-471.Hogan et al(1966)In“Manipulating the Mouse Embryo”，Cold Spring Habor Lab. Press.Hudson NL，O’Connell AR，Shaw L，Clarke IJ and McNatty KP.(1999) Effect ofexogenous FSH on ovulation rate in homozygous carriers or noncarriers of the BooroolaFecB gene after hypothalamic-pituitary disconnection or after treatment with a GnRHagonist.Domestic Animal Endocrinology 16：69-80.Hussainus et al 1999 Stable antisense RNA expression neutralises the activity of low-density lipoprotein receptor-related protein and promotes urokinase accumulation in themedium of an astrocytic tumor cell line. Antisense Nucleic Acid Drug Developmentvolume 9：183-190.Kretzschmar M，Liu F，Hata A，Doody J and Masague J(1997)The TGF-B familymediator Smadl is phosphorylated directly and activated functionally by the BMPreceptor kinase. Genes and Development 11：984-995.Lord EA，Davis GH，Dodds KG，Henry HM，Lumsden JM，Montgomery GW.(1998)Proceedings of the 6^th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production.27：19-22.Massague J(1998)TGF-β signal transduction. Annual Review Biochemistry 67：753-791.McNatty KP，Lun S，Heath DA，Ball K，Smith P，Hudson NL，McDiarmid J，Gibb M andHenderson KM(1986)Differences in ovarian activity between Booroola x Merino eweswhich were homozygous，heterozygous and non-carriers of a major gene influencingtheir ovulation rate. Journal of Reproduction and Fertility. 77：193-205.McNatty KP，Hudson N，Henderson KM，Gibb M，Morrisson L，Ball K and Smith P.(1987)Differences in gonadotrophin concentrations and pituitary responsiveness toGnRH between Booroola ewes which were homozygous(FF)，heterozygous(F+)andnon-carriers(++)of a major gene influencing their ovulation rate.Journal ofReproduction and Fertility 80：577-588.McNatty KP，Hudon NL，Lun S，Heath DA，Shaw L，Condell L，Phillips DJ and ClarkeIJ(1993)Gonadotrophin-releasing hormone and the control of ovulation rate by theFecB^B gene in Booroola ewes. Journal of Reproduction and Fertility 98：97-105.Montgomery GW and Sise JA(1990)Extraction of DNA from sheep white blood cells.New Zealand Journal of Agricultural Research 33：437-441.Montgomery GW，Lord EA，Penty JM，Dodds KG，Broad TE，Cambridge L，SundenSLF，Stone RT，Crawford AM(1994)The Booroola fecundity(FecB)gene maps tosheep chromosome 6.Genomics 22：148-153.Onichtchouck et al 1999 Silencing of TGF-beta signalling by the pseudoreceptor BAMBINature 401：480-485.Shimasaki S，Zachow RJ，Li D，Kim H，Iemura S-I，Ueno N，Sampath K，Chang RJ，Erickson GF(1999)A functional bone morphogenetic protein system in the ovary.Proceedings National Academy Science 96：7282-7287.

序列表<110> 农业研究有限公司(AGRESEARCHLIMITED)

特里萨·M·威尔逊(WILLSON，Theresa，Mary)

吴希阳(Wu Xi-Yang)<120> 突变的BMP1B受体作为排卵率的调节因子<130> 30782/14X131<150> NZ 502058<151> 1999-12-23<160> 4<170> PatentIn version 3.0<210> 1<211> 1612<212> DNA<213> Ovis aries<220><221> 启动子<222> (1)..(84)<220><221> CDS<222> (85)..(1593)<223> 这是野生型绵羊BMP1B受体的开放阅读框<400> 1ttttccgttg agctatgaca agagaggata caaaaagtta aacaagcaag cctgtcatac 60gtagaagcaa acttccttga taac atg ctt ttg cga agt tca gga aaa tta 111

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110 115 120cct ata cac cac aaa gct tta ctt ata tct gtg act gtg tgt agt ttg 495Pro Ile His His Lys Ala Leu Leu Ile Ser Val Thr Val Cys Ser Leu

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该位置编码所述蛋白第249位的精氨酸<400> 3ttttccgttg agctatgaca agagaggata caaaaagtta aacaagcaag cctgtcatac 60gtagaagcaa acttccttga taac atg ctt ttg cga agt tca gga aaa tta 111

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220 225 230ttc act aca gag gag gcc agc tgg ttc cga gag aca gaa ata tat cgg 831Phe Thr Thr Glu Glu Ala Ser Trp Phe Arg Glu Thr Glu Ile Tyr Arg

315 320 325cat cga gat ctg aaa agt aag aac atc ctg gtg aag aaa aat gga sct 1119His Arg Asp Leu Lys Ser Lys Asn Ile Leu Val Lys Lys Asn Gly Thr330 335 340 345tgc tgt ata gct gac ctg ggc ttg gct gtt aag ttt att agt gac acg 1167Cys Cys Ile Ala Asp Leu Gly Leu Ala Val Lys Phe Ile Ser Asp Thr

475 480 485acc ctt gcc aaa atg tca gag tcccaggaca ttaagctctg aggcaagagt 1602Thr Leu Ala Lys Met Ser Glu490 495aagtgtctct 1612<210> 4<211> 496<212> PRT<213> Ovis aries<223> Booroola已突变的BMP1B受体蛋白：与野生型不同，区别在于

第249位的氨基酸残基是精氨酸而非谷氨酰胺<400> 4Met Leu Leu Arg Ser Ser Gly Lys Leu Ser Val Gly Thr Lys Lys Glu1 5 10 15Asp Gly Glu Ser Thr Ala Pro Thr Pro Arg Pro Lys Ile Leu Arg Cys

20 25 30Lys Cys His His His Cys Pro Glu Asp Ser Val Asn Asn Ile Cys Ser

35 40 45Thr Asp Gly Tyr Cys Phe Thr Met Ile Glu Glu Asp Asp Ser Gly Met

85 90 95Thr Glu Arg Asn Glu Cys Asn Lys Asp Leu His Pro Thr Leu Pro Pro

100 105 110Leu Lys Asn Arg Asp Phe Val Asp Gly Pro Ile His His Lys Ala Leu

115 120 125Leu Ile Ser Val Thr Val Cys Ser Leu Leu Leu Val Leu Ile Ile Leu

165 170 175Arg Asp Leu Ile Glu Gln Ser Gln Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Leu

180 185 190Pro Leu Leu Val Gln Arg Thr Ile Ala Lys Gln Ile Gln Met Val Lys

195 200 205Gln Ile Gly Lys Gly Arg Tyr Gly Glu Val Trp Met Gly Lys Trp Arg

210 215 220Gly Glu Lys Val Ala Val Lys Val Phe Phe Thr Thr Glu Glu Ala Ser225 230 235 240Trp Phe Arg Glu Thr Glu Ile Tyr Arg Thr Val Leu Met Arg His Glu

245 250 255Asn Ile Leu Gly Phe Ile Ala Ala Asp Ile Lys Gly Thr Gly Ser Trp

260 265 270Thr Gln Leu Tyr Leu Ile Thr Asp Tyr His Glu Asn Gly Ser Leu Tyr

275 280 285Asp Tyr Leu Lys Ser Thr Thr Leu Asp Thr Lys Ser Met Leu Lys Leu

325 330 335Asn Ile Leu Val Lys Lys Asn Gly Thr Cys Cys Ile Ala Asp Leu Gly

340 345 350Leu Ala Val Lys Phe Ile Ser Asp Thr Asn Glu Val Asp Ile Pro Pro

355 360 365Asn Thr Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Pro Pro Glu Val Leu Asp

405 410 415Gly Gly Ile Val Glu Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr His Asp Leu Val Pro

420 425 430Ser Asp Pro Ser Tyr Glu Asp Met Arg Glu Ile Val Cys Ile Lys Lys

435 440 445Leu Arg Pro Ser Phe Pro Asn Arg Trp Ser Ser Asp Glu Cys Leu Arg

485 490 495

Claims

1、一种分离的突变核酸分子，所述核酸分子编码BMP1B受体多肽，其中所述分子：

(a)具有与野生型BMP1B受体多肽不同的序列，其区别在于编码第249位氨基酸残基的密码子编码精氨酸而非谷氨酰胺；

(b)可在严谨条件下与(a)中所述分子杂交；

(c)是(a)中定义的序列的变体；

(d)是(a)，(b)或(c)中定义的分子的互补序列；或

(e)是相应于(a)-(d)中所述任一序列的反义序列。

2、一种寡核苷酸探针，所述探针可在严谨条件下与权利要求1中核酸分子杂交，其中所述探针包含：

(a)编码突变的BMP1B受体第249位氨基酸残基的密码子，或

(b)具有与(a)互补的序列。

3、权利要求1的分离的核酸分子，其中权利要求1的(a)中所述分子的核苷酸序列在SEQ ID NO3中公布。

4、一种方法，所述方法鉴定携突变的BMP1B受体核酸分子的脊椎动物，所述方法包含以下步骤：

i)从所述脊椎动物中获得组织或血液样品；

ii)从所述样品中分离DNA；

iii)可选的，从步骤ii)中获得的DNA中分离BMP1B受体DNA；

iv)可选的，利用与权利要求1的突变BMP1B受体分子互补的探针探测所述DNA，从而鉴定突变的BMP1B受体；

v)可选的，扩增突变的BMP1B受体DNA的量，并且；

viii)确定在步骤(ii)中获得的哺乳动物BMP1B受体序列DNA是否携带与排卵率增加或降低相关的突变。

5、权利要求3的方法，其中所述脊椎动物是雄性或雌性，并且携带单拷贝的所述突变BMP1B受体核酸分子。

6、权利要求4的方法，其中所述脊椎动物是雌性，并且携带两个拷贝的所述突变BMP1B受体核酸分子。

7、权利要求4到6中任一项的方法，其中所述脊椎动物选自人、绵羊、牛、马、山羊、鹿、家禽、猪、猫、狗和负鼠。

8、一种针对脊椎动物中排卵率增加的遗传标记，所述遗传标记包含一种核酸分子，所述核酸分子特异性地与权利要求1的核酸序列，或其变体或其互补序列杂交。

9、权利要求8的遗传标记，所述遗传标记在包含编码第249位氨基酸残基的密码子的区域内包含突变核苷酸序列的片段。

10、权利要求8或9的遗传标记，其中所述脊椎动物选自人、绵羊、山羊、牛、马、鹿、猪、家禽、猫、狗和负鼠。

11、一种分离的BMP1B受体多肽，所述多肽具有与野生型不同的氨基酸序列，区别在于残基249是精氨酸而非谷氨酰胺。

12、权利要求11的分离的BMP1B受体多肽，其中所述多肽的氨基酸序列公布于SEQ ID NO4中。

13、一种分离的BMP1B受体多肽，所述多肽的氨基酸序列在249位的残基是谷氨酰胺，但其另有与野生型BMP1B多肽序列不同之处，并且其具有调节雌性哺乳动物排卵的能力。

14、一种分离的BMP1B受体多肽，所述多肽具有SEQ ID NO2中公布的氨基酸序列。

15、一种分离的核酸分子，其编码权利要求11到14中任一项的多肽。

16、一种载体，所述载体包含权利要求1或15的核酸分子。

17、一种宿主细胞，所述宿主细胞被权利要求16的载体所转化。

18、一种调节雌性脊椎动物排卵率的方法，所述方法包含将有效剂量的突变或野生型BMP1B受体给予所述脊椎动物的步骤。

19、一种增加雌性脊椎动物排卵率的方法，所述方法包含将有效剂量的权利要求11或12的多肽给予所述脊椎动物，或将权利要求13中能增加雌性脊椎动物排卵率的多肽给予所述脊椎动物。

20、一种减少雌性脊椎动物排卵的方法，所述方法包含给予有效剂量试剂的步骤，所述试剂选自：

a)免疫有效量的野生型或突变的BMP1B受体多肽，或其免疫原性区；

c)靶向编码野生型或突变的BMP1B受体多肽的反义核酸；

d)野生型或突变的BMP1B受体的拟受体；以及

e)结合野生型或突变的BMP1B受体多肽，并因此抑制所述脊椎动物内源BMP1B受体的活性的配体。

21、权利要求20的方法，其中所述试剂是权利要求20(b)中定义的抗体。

22、权利要求21的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。

23、权利要求20的方法，其中所述试剂是一种反义核酸。

24、权利要求23的方法，其中所述反义核酸靶向编码权利要求11到14中任一项的BMP1B受体多肽的核酸。

25、权利要求20的方法，其中所述试剂是一种拟受体。

26、权利要求25的方法，其中所述拟受体靶向权利要求11到14任一项的受体。

27、权利要求20的方法，其中所述试剂是一种配体。

28、权利要求27的方法，其中所述配体结合权利要求11到14任一项的BMP1B受体多肽。

29、一种组合物，所述组合物包含权利要求11到14任一项的突变或野生型多肽，和一种可药用或兽用的载体。

30、一种组合物，所述组合物包含权利要求1的核酸分子，或编码权利要求11到14任一项的多肽的核酸分子，以及一种可药用或兽用的载体。

31、一种组合物，所述组合物包含有效剂量的试剂和一种可药用或兽用的载体，所述试剂选自：

(a)野生型或突变的BMP1B受体多肽，或其免疫原性区；

(d)野生型或突变的BMP1B受体多肽的拟受体；以及

(e)结合野生型或突变的BMP1B受体多肽，并因此抑制所述脊椎动物内源BMP1B受体的活性的配体。

32、一种试剂盒，其用于鉴定携带有突变BMP1B受体的脊椎动物，所述试剂盒包含：

a)用于扩增BMP1B受体基因合适区域的引物对，以及可选择的，一或多种；

b)用于DNA扩增的缓冲溶液；

c)脱氧核苷酸混合物；

d)DNA扩增的工具；

e)来自被检测物种的对照DNA；

f)合适的标准物；和

g)检测系统。

32、权利要求32的试剂盒，其中所述DNA扩增的工具是一种热稳定性聚合酶，而扩增通过聚合酶链反应进行。

33、一种试剂盒，所述试剂盒用来检测脊椎动物中循环的突变BMP1B受体多肽，其中所述试剂盒包含靶向所述突变多肽的抗体。

34、权利要求34的试剂盒，其中所述抗体是单克隆抗体。

35、一种分离的突变核酸分子，所述分子基本与本文中任何实施例、附图或序列表所述一致。

36、一种寡核苷酸探针，所述探针基本与本文中任何实施例、附图或序列表所述一致。

37、一种鉴定携带有突变BMP1B受体核酸分子的脊椎动物的方法，所述方法基本与本文中任何实施例和/或附图所述一致。

38、一种遗传标记，其基本与本文中任何实施例或附图所述一致。

39、一种分离的突变BMP1B受体多肽，所述多肽基本与本文中任何实施例、附图或序列表所述一致。

40、一种分离的野生型BMP1B受体多肽，所述多肽基本与本文中任何实施例、附图或序列表所述一致。

41、一种调节雌性脊椎动物排卵率的方法，所述方法基本与本文中任何实施例和/或附图所述一致。

42、一种包含突变的或野生型多肽的组合物，所述组合物基本与本文中任何实施例和/或附图所述一致。

43、一种包含核酸分子的组合物，所述核酸分子基本与本文中任何实施例和/或附图所述一致。

44、一种鉴定携带突变BMP1B受体的脊椎动物的试剂盒，所述受体基本与本文中任何实施例和/或附图所述一致。