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CN1409640A - 稳定性改善的多肽组合物 - Google Patents

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CN1409640A
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M·R·德菲利皮斯
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A·D·沙克纳斯
A·M·普罗凯
J·V·J·里尼拉
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Eli Lilly and Co
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Eli Lilly and Co
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Abstract

本发明提供改善包含多肽和甘油的水性胃肠外药用组合物化学稳定性的方法。鉴定商品甘油中的活性醛，提供降低甘油中活性醛的方法。提供测定甘油中活性醛的简便方法，并且证实甘油中的活性醛水平与包含多肽和甘油的组合物的化学稳定性呈密切的线性关系。本发明包括化学稳定性提高(与以前的已知组合物相比)的包含多肽和甘油的组合物。

Description

稳定性改善的多肽组合物
                      发明领域
本发明属于人类医药领域。更具体地说，本发明属于用于治疗各种疾病(包括糖尿病和高血糖症)的药用组合物领域。
                      发明背景
已经利用多种多肽药用组合物来治疗人类和其它哺乳动物的疾病。由于多肽药物在口服传递后的高度不稳定性，通常必须通过胃肠外途径传递它们。胃肠外途径主要有皮下途径、肌肉内途径和静脉内途径。
传统上将多肽药物产品以溶液、悬浮液或冻干产品提供给药房、医院和患者。当多肽药物制剂采用液体形式时，每种制剂需要在规定时间内保持某个最低水平的化学和物理稳定性，保持稳定性的时间由治疗方案、患者便利性、患者安全和管理指南决定。
为避免疼痛或可能的组织损伤，设计液体多肽药物组合物，使其提供与给予位点或给予位点周围的体液相似张力或摩尔渗透压浓度。为此常常使用赋形剂如甘油、葡萄糖、甘露醇、乳糖以及盐如氯化钠。使用甘油作为等渗剂的多肽药物产品实例包括含人类胰岛素、胰岛素lispro、胰岛素aspart和胰高血糖素作为活性成分的产品。
甘油还用作药用组合物中的增溶剂、湿润剂、乳化剂、溶剂、膨胀物质、抗氧化剂、螯合剂和防腐剂[Spiegel，A.J.等，J.Pharm.Sci.52：917-927(1973)；Wang，Y-C.J等，J.Parenteral Drug Assoc.34：452-462(1980)；Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack PublishingCompany，第十八版，第1316页(1990)；Li，S.等，J.Pharm.Sci.85：868-872(1996)；Sieger，G.M.等，1977年4月5日颁布的美国专利第4,016,273号；Heinz，D.N.，WIPO公开WO98/29131，1998年7月9日]。
对于一些多肽制剂，物理性不稳定性不能使用盐等渗化，常常使用甘油来解决这个问题。然而，已知甘油造成多肽产品化学不稳定性。具体地说，据信甘油中存在的杂质如醛引起形成多肽二聚体和多聚体的共价交联反应。见例如，Bello，J.等[Arch.Biochem.Biophys.172：608-610(1976)]。对于胰岛素产品，已经将这样的二聚体和多聚体与免疫原性与皮肤的变态反应联系起来，如Robbins，D.C.等[Diabetes 36：838-841(1987)]；Robbins，D.C.等，[Diatetes 36：147-151(1987)]；Ratner，R.E.等[Diabetes 39：728-732(1990)]所述。Brange，J.等[Pharm.Res.9：727-734(1992)]得出结论：应当最小化共价胰岛素二聚体和多聚体以避免这些变态反应，但没有公开或建议达到这个目标的方法。
对于制备用于胃肠外给予的包含甘油的可靠稳定的多肽组合物的问题，可以进行三项观察。第一，缺乏简单而精确的测定方法来确定甘油中存在的引起交联多肽杂质的活性醛水平。第二，在先技术没有这样的教导或建议：应当评估不同来源生产的不同批号甘油，确定某些来源对于最小化所述多肽交联反应是否比其它来源更好。第三，以前没有降低甘油活性醛含量的简便有效的方法，以去除或最小化水性药用多肽组合物中醛引起的交联反应。下面将更详细地描述这三项观察中的每一项。
                          测量甘油中的活性醛
缺乏简单可靠的测定方法测定甘油中引起交联多肽杂质形成的活性醛杂质，这阻碍了解决含甘油制剂的多肽交联问题。
甲醛可以通过活性亚胺键引起多肽交联[Schwendeman，S.P.等，PNAS 92：11234-11238(1995)和Fraenkel-Conrat，H.等，JACS 70：2673-2684(1948)]。甘油醛和乙醇醛与多肽溶液中的氨基基团反应，形成交联的多肽，如Acharya，A.S.等[PNAS 80：3590-3594(1983)]和Acharya，A.S.等[Biochemistry 27：4522-4629(1988)]所述。
据推测，甘油中的醛杂质涉及胰岛素制剂中的高分子量多聚体形成[Brange J.等，Pharm.Res.9：727-734(1992)；Brange，J.，Stability ofInsulin，Kluwer Academic Publishers，Boston，第23-36页(1994)；Brangem，J.等，Hormone Drugs，US Pharmacopoeial Convention出版，Rockville，Maryland，第95-105页(1982)]，但没有公开定量测量或去除醛杂质以改善胰岛素制剂化学稳定性的方法。
文献中有许多测定醛的方法，但使用它们测量作为药用制剂中多肽交联指标的甘油活性醛含量是值得怀疑的。
欧洲药典附录(European Pharmacopoeia Supplement 2000)2000[欧洲委员会，Strasbourg，法国，第747-751页(1999)]在其甘油专论中描述了醛测试。该测试使用盐酸副品红试剂和作为参比的5ppm甲醛标准溶液。
英国药典1999[英国药典委员会，伦敦，第710-711页(1999)]公开了测定甘油中醛和还原物质的测试，该测试使用盐酸副品红并与含5ppm甲醛的标准溶液进行目测比较。
“Purpald”试剂4-氨基-3-肼基-5-巯基-1，2，4-三唑[Dickinson，R.G.等，Chem.Commun.第1719页(1970)]与醛反应，已经使用该试剂测定空气、乙二醇、疫苗、树脂和塑料制品中的醛，并用于检测肝组织切片和水果中的乙醛[Aldrich Technical Information Bulletin No.AL-145，Aldrich Chemical Co.；Hopps，H.B.，Aldrichimica Acta 33：28-29(2000)]。
Nash，T.描述了甲醛与乙酰丙酮反应，形成有色产物[Biochem.J.55：416-425(1953)]。乙酰丙酮试剂看起来对于甲醛具有相当特异性，因为乙醛的干扰在一摩尔的基础上仅有1％。
国际药典[第三版，WHO，4：176-181(1994)]的甘油专论描述了使用品红/亚硫酸溶液检测醛和还原物质的测试。将显色强度与0.2M高锰酸钾溶液相比较。
在Dow Chemical Company(Freeport，TX，USA)名为“发现某些世界上最恒定纯产品的来源：合成甘油产品”的促销公报第10-11页中，使用UV光谱法将OPTIMTM甘油99.7％和纯度差一些的甘油样品进行比较。没有提供醛或其它有机杂质水平的定量评估。
甘油醛与3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐(MBTH)反应。在Sawicki，E.等[Anal.Chem.33：93-96(1961)]中，显示MBTH试剂与DL-甘油醛反应，但仅公开了测量汽车尾气和污染空气中的甲醛。Paz，M.A.等[Arch.Biochem.Biophys.109：548-559(1965)]证实L-甘油醛与MBTH反应，公开了在生化反应进行过程中、在酮、酮酸和各种类型吡喃糖的存在下测量痕量醛的测定方法。Eberhardt，M.A.等[MarineChemistry 17：199-212(1985)]公开了使用MBTH测量海水和细菌培养物中的醛，尤其是甲醛。在一个使用戊二醛或1，5-戊二醇作为标准品的商业测试[GT-1型戊二醛检测试剂盒，Hach(Loveland，CO，USA)]中使用MBTH。该测试使用色轮测量低至1mg/L的戊二醛水平。
Bailey，B.W.等[Anal.Chem.43：782-784(1971)]表明：试剂对苯二胺与甲醛、乙醛和苯甲醛反应，但对甲醛具有高度选择性。使用该试剂测量空气中的低浓度甲醛。
惊人的是，我们发现一种使用甘油醛作为标准品的新型MBTH测试，该测试可以有效用于准确测定甘油样品中存在的活性醛水平。我们还发现：含甘油的多肽制剂交联水平与用于制备所述制剂的甘油中的活性醛水平(用上述测定方法测定)呈密切线性关系。因此，我们的新型MBTH测试可以用于容易地预测包含甘油的水性胃肠外多肽组合物的相对化学稳定性，并且可以用于选择用于制备所述制剂的合适批号甘油。
                    不同来源的甘油
另一个阻碍解决包含甘油的制剂中多肽交联问题的障碍是以前没有认识到考虑以下因素的重要性：商品甘油的生产来源以及甘油的生产方法。具体地说，以前没有这样的教导或建议：应当评估不同来源生产的不同批号的商品甘油，确定某些来源对于最小化所述多肽交联反应是否比其它来源更好。
甘油中的醛通过自身催化氧化或热氧化形成，如Mohr，J.等所述[加拿大专利申请2,242,591，1998年7月13日公布]。Ziels，N.W.[J.Amer.Oil Chemists’Soc.33：556-565(1956)]报道，不管原料如何，工业生产和纯化甘油的方法对于甘油的最终纯度有重大影响。已经从许多来源生产甘油，包括动物脂肪、植物、发酵、从更小的有机分子化学合成以及从丙烯合成。从这些来源和其它来源生产甘油的方法是本领域技术人员众所周知的。然而，还没有系统研究或确定什么因素使来源对许多工业生产甘油存在的活性醛水平产生影响，以及来源对包含甘油的水性胃肠外多肽组合物的最终化学稳定性产生的影响。
Rohde，T.D.等[Trans.Am.Soc.Artif.Intern.Organs，33：316-318(1987)]公开了含有约80％甘油的植入泵式新型胰岛素制剂，其中使用非特定合成来源并且作者用混合离子交换柱床进一步纯化的甘油，取代在以前制剂中使用的动物精炼甘油。新型制剂和以前的制剂的pH也不同，而pH是影响胰岛素制剂中交联反应程度的一个关键因素。在治疗糖尿病患者时，使用新制剂的流动循环(flow cycle)更长，胰岛素用量更少，说明新制剂的稳定性改善，人们将这归因于pH差异和合成甘油的额外纯化。
使用本文所述的MBTH测试，我们最令人惊奇的发现是：非动物来源生产的各批商品甘油比动物来源的各批甘油含有更低水平的活性醛。植物来源和丙烯来源的甘油证明了这一点。丙烯来源的甘油含有尤其低水平的活性醛。我们还发现：随着时间的增加，植物来源和丙烯来源的工业生产各批甘油的每月平均活性醛含量比动物来源的甘油低得多，提示动物来源的甘油中活性醛水平随时间的增加比植物和丙烯来源的甘油要快。
此外，我们发现含丙烯来源甘油的水性胃肠外药用多肽组合物与用动物来源甘油制备的类似组合物相比，化学稳定性得到改善。
             降低甘油中的活性醛水平
最后，以前没有公开降低甘油中活性醛水平以改善包含甘油的药用多肽组合物的化学稳定性的简单有效方法。
Bello，J.[Biochemistry 8：4535-4541(1969)]和Bello，J.等[Arch.Biochem.Biophys.172：608-610(1976)]寻求通过纯化甘油来预防包含甘油的蛋白质溶液中的交联。首先用还原剂硼氢化钠处理甘油。在该还原步骤后，用MB-3树脂处理甘油，除去无机盐，最后真空蒸馏。没有指出在该处理之前和之后的活性醛水平。通过该甘油纯化步骤获得的交联降低是短暂的。
在以下文献中也描述了各种甘油纯化技术：Riddick，J.A.等[Techniques of Chemistry II：Organic Solvents，Physical Properties andMethods of Purification，Wiley-Interscience，New York，第689-690页(1970)]，Diaz，Z.等[美国专利第4,683,347号，1987年7月28日颁布]，Stromquist，D.M.等[Ind.Eng.Chem.43：1065-1070(1951)]和Ziels，上文引用，但没有一份文献涉及通过使甘油接触包含自由氨基基团的聚合物树脂而降低活性醛的水平。
Washabaugh，M.W.等[Anal.Biochem.134：144-152(1983)]描述了一种降低乙二醇中醛水平的繁琐方法，该方法涉及用硼氢化钠还原，用水稀释4倍并使所述水溶液通过装载有不同树脂的四个层析柱。据使用MBTH和甘油醛标准品定量测定，溶液中的醛减少了86％。
Mohr，J.等，上文引用，描述了使溶液与还原性磷化合物接触而纯化乙二醇。根据MBTH测量，该方法降低了醛水平。Murao等[美国专利第5,969,175号，1999年10月19日颁布]描述了纯化含有醛的腈的方法：使所述腈与载有多胺的阳离子交换树脂接触。当时没有建议这些方法中的任何一种将可用于降低甘油的活性醛含量以改善包含甘油的多肽组合物的化学稳定性。
我们已经发现了一种降低甘油样品中活性醛水平的简单有效的方法，该方法改善了包含甘油的多肽组合物的化学稳定性。该方法不需要使用还原剂，不必稀释甘油，并且适合纯化甘油直接用于包含多肽的制剂。
综合上述各项发现获得了用于胃肠外给予的含甘油新型多肽组合物制剂，该制剂与以前已知的多肽组合物相比化学稳定性得到改善。这些稳定的多肽组合物为使用它们治疗疾病或病症的患者提供更高的安全性。
                      发明简述
因此，本发明的一个方面是使用非动物来源的甘油作为包含多肽和甘油的水性胃肠外药用组合物中的甘油成分，以改善所述组合物的化学稳定性。化学稳定性改善是指：由于用于制备所述组合物的甘油中的活性醛水平降低，因此降低形成共价交联的多肽水平。更具体地说，本发明提供使用植物来源或丙烯来源的甘油改善包含多肽和甘油的水性胃肠外药用组合物的化学稳定性。
本发明的另一方面是使用活性醛含量低于8ppm的甘油作为包含多肽和甘油的水性胃肠外药用组合物中的甘油成分，以改善所述组合物的化学稳定性。
本发明的又一方面是包含多肽和甘油的水性胃肠外药用组合物，其中所述甘油源自非动物来源。
本发明的再一方面是包含多肽和甘油的水性胃肠外药用组合物，其中所述甘油的活性醛含量低于8ppm。
本发明的另一方面是制备水性胃肠外药用组合物的方法，该方法包含将水、多肽和非动物来源甘油组合在一起。
本发明的另一方面是制备水性胃肠外药用组合物的方法，该方法包含将水、多肽和活性醛含量低于8ppm的甘油组合在一起。
本发明的又一方面是降低甘油中活性醛水平的方法，该方法包括使甘油与固体干燥剂以及包含自由氨基基团的聚合物树脂接触。
本发明的组合物可以为溶液形式或者其中多肽在所述组合物中部分或完全不溶的悬浮液形式。所述组合物也可以由两种包装生产产品构成，其中在胃肠外给予前将固体形式的多肽与独立包含甘油的稀释液混合。
可以化学合成或使用重组DNA技术生物合成本发明药用组合物中的多肽。
本发明包括使用本发明的组合物用作药物，或使用本发明的组合物制备用于治疗哺乳动物疾病的药物。
                    附图简述
图1显示了采用本发明MBTH测试和改良10X-GST测试得到的对非动物来源商业批号甘油的分析之间的线性关系(R2＝0.90)。
                    发明详述
术语“甘油”指化学品丙烷-1，2，3-三醇，CAS注册号[56-81-5]。甘油的实验式是C(3)H(8)O(3)，结构是OH-CH2-CH(OH)-CH2-OH。在一些文献报道中，术语“glycerol”用于指该化合物，“glycerin”指包含95％或更多甘油的纯化商业产品，而“glycerine”用作其主要成分是甘油的产品的商品名。在本说明书中，使用任何包含化学品丙烷-1，2，3-三醇的溶液，可以将甘油(指化学品丙烷-1，2，3-三醇)掺入本发明的水性胃肠外药用组合物。在本发明药用多肽组合物中的甘油浓度定义为每毫升组合物所含丙烷-1，2，3-三醇的毫克数，并且该浓度低于500mg/mL。
Carl W.Scheele在1779年首次发现甘油，他加热橄榄油和一氧化铅获得甘油。自那时开始，人们已经使用至少5种不同材料来源生产甘油。
甘油的一种来源是动物。在一种方法中，人们酯化动物如牛和绵羊的牛脂或脂肪，然后皂化，这种方法产生作为肥皂生产副产品的甘油。人们也直接水解或皂化动物脂肪来生产甘油。
甘油的第二种商业来源是植物。一般地说，人们使用与动物脂肪生产甘油相似的方法，用椰子油、棕榈油、低芥酸菜籽油、大豆油或其它植物油生产甘油。
甘油的第三种来源是发酵。从天然来源如甜菜糖蜜发酵生产甘油，或使用重组DNA技术改造的微生物发酵生产甘油，如Bulthuis，B.A.等[WIPO公开WO98/21340，1998年5月22日]和Nair，R.V.等[WIPO公开WO98/28480，1999年6月10日]所述。
甘油的第四种来源是从含有少于三个碳原子的有机分子开始化学合成。一种这样的方法使用甲醇，该方法见Owsley，D.C.等[美国专利第4,076,758号，1978年2月28日颁布]。
甘油的第五种来源是丙烯，而丙烯本身是从石油产品中获得。从约1948年开始由丙烯生产的甘油。可以利用许多转化丙烯成为甘油的合成途径，包括在Owsley，D.C.等，前面引用，Kirk-Othmer[Encyclopedia of Chemical Technology 12：681-694(1994)]和Remington’s Pharmaceutical Science[Mack Publishing Company，第18版，第1316页(1990)]中所述的途径。例如，在一种合成途径中，丙烯氯化成为烯丙基氯，然后用次氯酸转化形成二氯丙醇，与氢氧化钙反应生成表氯醇，最后水解成为甘油。
在商业上，可以从多种来源、不同的供应商和分销商获得甘油[见Chemical Week，Special Issue Buyer’s Guide，159：321-322(1997)，和Chemical Industry Europe 93；The Leading Guide for Today’s EuropeanChemical Industry(1993)]。
用植物生产的甘油产品包括Pricerine 9091[Unichema NorthAmerica，Chicago，IL，美国]、Kosher Superol甘油[Proctor and GambleChemicals，Cincinnati，OH，美国]、甘油-99.7％[Chemical Associates ofIllinois，Inc.，Copley，OH，美国]、Emery甘油-99.7％ Kosher[HenkelCorporation，Cincinnati，OH，美国]和无水超纯甘油[EM Industries，Hawthorne，NY，美国]。
丙烯来源的甘油产品包括OptimTM甘油99.7％USP[DowChemical Company，Freeport TX，美国]、合成甘油[Solvay Fluorides，IncGreenwich，CT，美国]和OptimTM甘油99.7％[Dow Chemical Company，Stade，Germany]。已经使用丙烯来源的甘油作为包被爆米花仁的香味促进剂[Schellhaass，S.R.，美国专利第5,750,166号，1998年5月12日颁布]以及以低浓度用于外科洗液中[Scholz，M.T.等，美国专利第5,951,993号，1999年9月14日颁布]。也已经在食品和药用制剂中使用丙烯来源的甘油[Food Engineering，International Edition(ChiltonCompany)，第14页(1997)]。
术语“非动物来源的甘油”指不是从动物脂肪或任何其它动物原料成分得到的甘油。非动物来源甘油的生产来源包括植物、丙烯、发酵和从小有机分子化学合成。
本发明提供包含多肽和甘油的水性胃肠外药用组合物，其中所述组合物中的甘油浓度低于500mg/mL。甘油浓度指化学品丙烷-1，2，3-三醇的浓度。所述药用组合物中的甘油浓度最好约1mg/mL到约300mg/mL。更优选所述药用组合物中的甘油浓度约3mg/mL到约100mg/mL。更优选所述水性药用多肽组合物中的甘油浓度约10mg/mL到约30mg/mL。更优选所述组合物中的甘油浓度约20mg/mL到约25mg/mL。更优选所述组合物中的甘油浓度约22mg/mL。所述组合物中另一个优选甘油浓度范围约15mg/mL到约18mg/mL。更优选所述组合物中的甘油浓度约16mg/mL。
术语“醛”指包含CHO基团或官能团的有机化合物类。
术语“活性醛”指下列醛：a)在各批商品甘油中作为杂质存在，和b)与水性药用组合物中多肽的氨基基团反应，导致形成共价多肽二聚体和/或多聚体。活性醛的一个实例是甘油醛。
术语“MBTH”指化合物3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐，CAS注册号[14448-67-0]。
术语“MBTH测试”指使用甘油醛作为标准品测量甘油样品中活性醛含量的方法，该方法作为方法1详细描述。
缩写“ppm”指质量百万分率。对于本发明目的，ppm指甘油样品中活性醛的百万分率。更具体地说，ppm指相对于甘油质量的活性醛质量。例如，具体批号甘油的MBTH测试值是2ppm，这指在一百万份质量的甘油中含有2份质量的活性醛。这等于在甘油中浓度为2ug/g或2mg/kg。假如在分析前用其它溶剂稀释甘油样品，则该测试的ppm结果必须乘上稀释倍数才能反映在一百万份原始未稀释的甘油中活性醛的份数。
本发明的一个实施方案提供包含非动物来源甘油的水性药用多肽组合物。人们可以制备本发明该实施方案内的药用组合物，而不必在使用前测量甘油中的醛含量。然而，最好在使用前测量用于制备多肽组合物的甘油，所述甘油的活性醛含量低于33ppm。更优选所述甘油的活性醛含量低于24ppm。更优选所述甘油的活性醛含量低于15ppm或更低。更优选所述甘油的活性醛含量低于8ppm。最优选在本发明多肽组合物中使用的甘油的活性醛含量为3ppm或更低。
如果人们决定测量在制备本发明的多肽组合物中使用的甘油中的活性醛含量，那么可以使用多种测试方法。一种测试方法是在本文方法4中描述的新型HPLC方法。或者，可以使用本领域技术人员已知的醛测定方法。最好使用其中使用甘油醛作为标准品的测定方法，测量本发明多肽组合物中使用的甘油的活性醛含量。更优选通过本文所述的MBTH测试测量甘油的活性醛含量。
术语“10X-GST”指甘油应激测试，该测试在可溶性胰岛素制剂中加入正常使用量约10倍的甘油，其目的是加速形成胰岛素共价二聚体和多聚体。该测试在下面作为方法2详细描述。
术语“改良10X-GST”指甘油应激测试，该测试在胰岛素悬浮液组合物中加入正常使用量约10倍的甘油，该测试设计为加速胰岛素共价二聚体和多聚体的形成。该测试在下面作为方法3详细描述。
术语“多肽”指包含三个或更多氨基酸以及至少一个自由氨基基团的化合物，并且包括它们的类似物和衍生物。可以通过化学合成和/或使用重组DNA技术生物合成产生多肽。多肽可以包含一条氨基酸链或通过共价键(如二硫键)或通过非共价相互作用连接在一起的多条氨基酸链。在本文中小多肽也可称为“肽”。在本文中大多肽也可称为“蛋白质”。
掺入本发明组合物的多肽可以含有天然L-氨基酸或非天然氨基酸如D-氨基酸。所述多肽的氨基酸序列可以与动物或其它生物天然多肽氨基酸序列相同，或者可以是其中以不同方法改变所述序列的类似物。在多肽类似物中，可以添加、缺失或用其它氨基酸取代在所述多肽N末端、C末端或内部部分的一个或多个氨基酸。多肽类似物是本领域内众所周知的。
也可以在要掺入本发明组合物的多肽的氨基酸侧链、N末端氨基基团或C末端羧基基团上带有有机化学基团。这样的化合物是多肽“衍生物”实例。多肽衍生物的其它实例包括糖肽，其中天然多糖连接在氨基酸天冬酰胺或苏氨酸的侧链上。其它可以连接到多肽上的衍生基团包括酰基基团和聚乙二醇。多肽衍生物是本领域内众所周知的。
掺入本发明组合物的多肽可以以多种形式存在，包括药学上可接受的盐形式。多肽的药学上可接受的盐形式是指在所述多肽的任何一个或多个带电基团与任何一种或多种药学上可接受的无毒阳离子或阴离子形成的盐。有机盐和无机盐包括例如铵盐、钠盐、钾盐、Tris、钙盐、锌盐或镁盐以及由酸制备的盐如盐酸盐、硫酸盐、磺酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、乙醇酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、乙酸盐、硝酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、对甲苯磺酸盐、苯磺酸盐、萘磺酸盐、丙酸盐、碳酸盐等等。
掺入本发明组合物的多肽可以从诸如转基因植物或转基因动物等来源分离，或者可以用化学合成技术制备，所述化学合成技术包括经典(液相)方法、固相方法、半合成方法或其它本领域技术人员众所周知的方法。
也可以使用重组DNA技术生物合成产生掺入本发明组合物的多肽。例如，见Chance，R.E.等，美国专利第5,514,646号，1996年5月7日颁布；Chance，R.E.等，EPO公布号383,472，1996年5月7日颁布；EPO公布号214,826，1987年3月18日；和Belagaje，R.M.等，美国专利第5,304,473号，1994年4月19日颁布。使用rDNA技术，可以在任意数量的宿主细胞中生物合成多肽或其前体，所述宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母或真菌。更优选在细菌、酵母或哺乳动物细胞中进行的生物合成。最优选是在大肠杆菌(E.coli)或酵母中进行的生物合成。在哺乳动物细胞和转基因动物中进行生物合成实例见Hakola，K.[Molecular and Cellular Endocrinology，127：59-69，(1997)]。
明确排除不能掺入本发明组合物的多肽是从非转基因动物的组织、腺体、器官、血液、尿或任何其它主要组分分离的天然多肽。被排除的多肽的一个实例是用猪胰腺产生的猪胰岛素。
据信本发明可以应用于任何多肽，其中包括抗体、细胞因子、受体、多肽激素和它们的片段。本发明的组合物也可以包含一种以上多肽。在不限制本发明范围普遍性的同时，可以举出几种特定的多肽和多肽类以更好地指导读者。
本发明组合物包含的优选多肽类包括重组人类胰岛素、重组猪胰岛素和重组牛胰岛素。
另一类优选的本发明组合物包含的多肽包括单体胰岛素类似物。例如，见Balschmidt，P.等，美国专利第5,164,366号，1992年11月17日颁布；Brange，J.等，美国专利第5,618,913号，1997年4月8号颁布；Chance，R.E.等，美国专利第5,514,646号，1996年5月7日颁布；和Ertl，J.等，EPO公布号885,961，1998年12月23号。尤其优选的是这样的单体胰岛素类似物：B28位的氨基酸残基是Asp、Lys、Ile、Leu、Val或Ala，B29位的氨基酸残基是Lys或Pro。最优选的单体胰岛素类似物是Lys(B28)Pro(B29)-人胰岛素、Asp(B28)-人胰岛素和Lys(B3)Ile(B28)-人胰岛素。
另一类优选的本发明组合物包含的多肽包括等电点约7.0到约8.0的胰岛素类似物。这些类似物称为pI漂移胰岛素类似物。一类最优选的pI漂移类似物包括Arg(B31)Arg(B32)-人胰岛素和Gly(A21)Arg(B31)Arg(B32)-人胰岛素。
另一类优选本发明组合物包含的多肽包括胰岛素的衍生物和胰岛素类似物的衍生物。一类更优选本发明组合物包含的多肽包括胰岛素的酰化衍生物和胰岛素类似物的酰化衍生物。一类更优选的多肽包括胰岛素的酰化衍生物和胰岛素类似物的酰化衍生物，其中所述酰基基团包括直链饱和脂肪酸。直链饱和脂肪酸实例包括碳链长度C4、C6、C8、C10、C12、C14、C16和C18的脂肪酸。一类最优选本发明组合物包含的多肽包括棕榈酰-ε-Lys(B29)-人胰岛素和肉豆蔻酰-ε-Lys(B29)-des(B30)-人胰岛素，其中棕榈酰(C16)和肉豆蔻酰(C14)直链脂肪酸与Lys(B29)残基的ε残基连接。
另一类优选掺入本发明组合物的多肽包括胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、GLP-1类似物、GLP-1衍生物和GLP-1类似物的衍生物。根据本领域习惯，GLP-1(7-37)OH的氨基末端指定为7号，而羧基末端指定为37号。关于GLP-1类似物和衍生物的更详细描述见Hoffmann，J.A.[WO99/29336，1999年6月17日公布]和Knudsen，L.B.等[J.Med.Chem.43：1664-1669(2000)]。GLP-1类似物的衍生物的一个实例是Nielson，J.等[WO00/07617，2000年2月17日公布]所述的Arg(34)、N-ε-(γ-Glu(N-α-十六烷酰))-Lys(26)-GLP-1(7-37)OH。一类更优选掺入本发明组合物的多肽包括天然GLP-1(7-36)NH2、天然GLP-1(7-37)OH、Val(8)-GLP-1(7-37)OH、(Gly(8)-GLP-1(7-37)OH和Arg(34)、N-ε-(γ-Glu(N-α-十六烷酰))-Lys(26)-GLP-1(7-37)OH。
另一类优选包括入本发明组合物的多肽包括exendin、exendin类似物、exendin衍生物和exendin类似物的衍生物。Exendin多肽和类似物包括exendin-3和exendin-4，如Young，A.等[WIPO公开WO00/41546，2000年7月20日]所述。Exendin衍生物和exendin类似物的衍生物实例如Knudsen等[WIPO公布WO99/43708，1999年9月2日]所述。更优选在本发明组合物中使用的多肽是exendin-4。
另一类优选掺入本发明组合物的多肽包括如Goldenberg，M.S.等[WIPO公布WO00/38652，2000年7月6日]所述的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，以及G-CSF类似物、G-CSF衍生物和G-CSF类似物的衍生物。本发明的G-CSF组合物可以采用溶液形式或悬浮液形式。优选G-CSF悬浮液组合物。
另一类优选掺入本发明组合物的多肽包括苗条蛋白、苗条蛋白类似物、苗条蛋白衍生物和苗条蛋白类似物的衍生物。一类更优选的多肽包括糖基化苗条蛋白类似物。关于天然苗条蛋白序列和苗条蛋白类似物实例的详细介绍见Beals，J.M.等[EPO公布号849,276，1998年6月24日]。
另一类优选掺入本发明组合物的多肽包括全长人甲状旁腺素PTH(1-84)、片段如PTH(1-38)和PTH(1-34)以及它们的类似物和衍生物[见Chang，C-M.等，WIPO公布WO99/29337，1999年6月17日]。一类更优选的多肽包括人PTH(1-34)和人PTH(1-84)。
另一类优选掺入本发明组合物的多肽包括重组促卵泡激素(FSH)及其重组类似物和衍生物。FSH是异二聚体糖蛋白，其中α亚单位和β亚单位非共价结合，如Shome等[J.Prot.Chem.，7：325-339，(1988)]所述。一类更优选的多肽包括重组人FSH和其中缺失天然编码β亚单位一个、二个、三个或更多个C末端氨基酸残基的重组FSH类似物，以及它们的糖基化衍生物。
另一类优选掺入本发明组合物的多肽包括重组人生长激素(HGH)、重组牛生长激素(BGH)和它们的类似物和衍生物。一类更优选的多肽包括重组HGH和重组BGH。
优选掺入本发明的水性胃肠外药用组合物的多肽是FSH或其类似物或衍生物、PTH或其片段、类似物或衍生物、HGH或其类似物、人苗条蛋白或其类似物或衍生物、GLP-1或其类似物或衍生物、人胰岛素或其类似物或衍生物、或人胰岛素类似物的衍生物。
可以在本发明的水性胃肠外药用组合物中掺入一种以上多肽。这样的组合实例其中包括糊精或糊精激动剂肽与胰岛素的混合物，如Cooper，G.J.S.[美国专利第5,124,314号，1992年6月23日颁布]和L’Italien，J.等[美国专利第6,136,784号，2000年10月24日]所述。
本发明药用组合物中的多肽是生物活性多肽。所述活性在体外或在体内呈现，源于所述多肽与受体和/或其它细胞内或细胞外位点相互作用产生生物学效应。
术语“水性”描述了包含水的液体溶剂。水性溶剂系统可以只包含水，或者可以包含水以及一种或多种可混溶溶剂，并且可以包含溶解的溶质如糖或其它赋形剂。
本发明使用的术语“水性胃肠外药用组合物”指用于胃肠外给予的药用组合物，其中水含量是500mg/mL或更高。
术语“药用的”指含有用于治疗疾病的药用物质或制品。本发明的药用组合物含有具有生物学活性的多肽。以适合所述组合物的药用用途并且与药用用途一致的方式制备所述组合物。
术语“胃肠外”指通过肠道以外的途径将药物传递或给予其需要患者。本发明多肽组合物的优选胃肠外给予途径是皮下途径、肌肉内途径、静脉内途径、颊途径、鼻途径、肺途径、眼内途径和经皮途径。
术语“化学稳定性”指多肽组合物中由活性醛引起的共价结合多肽二聚体和多聚体形成的相对速率。“稳定”制剂是这样的制剂：其中共价多肽二聚体和多聚体的形成速率受到合适的控制，并且不随时间超标性增加。关于特定组合物化学稳定性的术语“改善”指：其高分子量多肽二聚体和多聚体在一段时间后增加的水平低于对比制备和处理的组合物水平。可以通过本领域内众所周知的方法评估化学稳定性。本文描述的10X-GST和改良-10X-GST方法包括通过尺寸排阻HPLC测量化学稳定性实例。
早期发展药用多肽制剂时，进行实验来确定在所述制剂中应当包括那些赋形剂。通常设计制剂以便包含满足患者和管理机构的安全和稳定性需要的有效产品所需的最少数目和数量的赋形剂。稳定性要求包括物理稳定性和化学稳定性。
在使用甘油的制剂中，在制造产品的正常贮藏过程中必须最小化活性醛引起的多肽共价交联。例如对于胰岛素溶液，在产品的冷藏保存期内，必须保持高分子量蛋白的水平低于1.5％[USP 2000，United States Pharmacopeial Convention，Inc.，Rockville，MD，美国(1999)]。生产商争取始终如一地满足这种保存期要求，以保证产品对于患者的安全性。
对于含有甘油的多肽组合物，活性醛引起的共价聚合反应是关注的问题。在没有进行适当活性测试的情况下就将任何批号的商品甘油掺入人用多肽制剂是不谨慎的。事实上，可以用某种方法评估从商业来源获得的每一批甘油，以保证用其配制的多肽产品满足稳定性技术要求。
一种测试甘油合适性的方法是制备小批的实际药品，然后在正常贮藏条件下，一般通过HPLC评估整个正常保存期内的聚合体形成。Underberg，W.J.M.等[J.Chromatography B 742：401-409(2000)]描述了在稳定性研究中分析多肽的多种分离和检测技术。然而，该测试方法不是切实可行的，因为该方法耗时太长，并且需要过多分析资源。
一种评估商业化成批甘油的合适性的更好方法是加速共价多肽多聚物的形成速率。可以通过增加贮藏温度[Brange，J.，Galenics ofInsulin，Springer-Verlag(1987)]、增加甘油到正常水平以上或使用这二者来加速所述反应。加速“应激”测试的两个实例是下面方法2和方法3所述的10X-GST测试和改良10X-GST测试。
在典型的U100胰岛素产品中，胰岛素浓度为3.5mg/mL或约600nM/mL。在正常胰岛素制剂中的甘油水平是16mg/mL或约174,000nM/mL。假如一批甘油的活性醛水平是例如10ppm，那么活性醛在正常胰岛素制剂中的浓度将仅约1.74nM/mL，或比胰岛素的浓度低345倍。增加该甘油浓度10倍将提供其中活性醛摩尔数仍比胰岛素摩尔数低34倍的组合物，但将增加活性醛和胰岛素分子之间反应的速率。对于在方法2和方法3中描述的加速测试，同时增加温度(30℃)和甘油水平(10倍)。
在适当控制的条件下，加速稳定性测试可靠地预期所生产的多肽制剂的相对稳定性。这是因为测试溶液中包含所有在最终溶液中使用的成份。
根据加速稳定性测试的结果，共价多聚物形成的相对速率与在正常贮藏条件下的形成速率相关。这种相关关系建立在分析判断的基础上，例如使用Arrhenius方程计算温度范围、基于提出的每个活性醛分子与最多2个多肽分子反应的机制的定量计算、和/或比较制剂相对多聚体形成速率。建立多肽组合物稳定性的技术要求限制的方法是本领域技术人员众所周知的。根据这些考虑，加速测试中最高水平多聚体形成可以作为技术要求限制，例如30℃每周1％，必须满足该技术要求限制，以高度保证在正常保存期条件下可以获得满意的稳定性。
尽管获得了可靠的结果，评估各批制剂的加速方法仍有许多缺点。首先，药用组合物的多个样品制备费时，尤其是假如必须以用于制备生产组合物的相同方法制备所述样品时更是这样。由于在每种不同制剂中活性醛与每种肽的反应速率是无法预期的，因此必须分别独立测试每种多肽制剂。第二，制备多肽组合物的多个样品浪费宝贵的材料，尤其浪费治疗性多肽本身。第三，虽然可以加速交联反应，但产生足够交联杂质以便可靠定量所需的时间可能需要一周或更长。第四，确定多肽组合物中交联产物水平的测定程序是复杂、费时和昂贵的。测定方法一般涉及HPLC分析，这需要专门的柱子、对操作者进行专业训练，并且需要相当长的时间运行测定、收集数据和解释结果。
直接分析每批甘油则避免了加速稳定性测试的缺点。
本发明的一方面是测定甘油中活性醛成分和水平的方法。具体地说，开发了新型HPLC程序(方法4)来测定在各批商品甘油中存在哪些醛以及它们的相对浓度。结果显示：对于所测试的所有来源甘油，甘油醛是主要的醛杂质，同时存在水平低得多的甲醛和甚至更低水平的乙醇醛。植物来源甘油中的甲醛水平比动物来源和丙烯来源甘油中的水平要稍高一些。
然而，作为各批甘油的筛选测试，该方法具有与上文所述HPLC分析相关的缺点。
本发明的另一方面提供使用甘油醛作为标准品的新型比色测定，该方法简单可靠地定量各批商品甘油中的活性醛含量。该测定是作为下文的方法1而详细描述的MBTH测试。如实施例1所述，该测定在与甘油醛反应时产生非常高的摩尔吸光系数，而HPLC分析(方法4)鉴定甘油醛为各批商品甘油中主要醛。
最有用的是，MBTH测试显示甘油活性醛含量与加速稳定性实验(即改良10X-GST测试)测量到的共价二聚体和多聚体升高水平具有极好的线性相关关系(见实施例2和图1)。从动物来源、植物来源和丙烯来源的各批甘油获得了良好的相关因子。已经发明了使用MBTH测定对各批甘油进行简单直接的分析，以取代使用多肽制剂、长温育时间和复杂HPLC系统的缺乏效率的加速测试。
为了获得MBTH测试确定的活性醛水平技术要求限制，人们可以简单地使用相关直线(如图1所示)了解MBTH活性醛水平，该水平与加速稳定性实验确定的技术要求限制在相关直线上相交。例如，由图1看到，由改良10X-GST测试确定的1％多聚体生长的技术要求限制获得的MBTH测试技术要求限制是14ppm。技术要求限制是用于制备制造多肽组合物的各批甘油中允许的最高活性醛水平(如根据MBTH测试测量)。假如需要交联多肽的水平更低或更大程度地保证所述组合物可以达到所需的保存期稳定性，那么可以建立更低的技术要求限制。
根据这些考虑，如果进行测定，则用于制备本发明水性胃肠外药用组合物的非动物来源甘油活性醛含量的最大一般技术要求限制是33ppm。非动物来源甘油更优选的技术要求限制是24ppm。更优选的技术要求限制是15ppm。更优选的技术要求限制是8ppm。最优选的技术要求限制是3ppm。假如在使用甘油制备组合物前测量所述甘油中活性醛的含量，则该测定最好使用甘油醛作为标准品。假如在使用甘油制备组合物前测量所述甘油中活性醛的含量，更优选所使用的测定是本文所述的MBTH测试。
我们已经使用MBTH测试评估了从几个生产商获得的新鲜和陈化的各批商品甘油。最惊人的是，我们发现动物来源甘油活性醛含量范围(10-1069ppm，n＝19)比植物来源甘油(4-153ppm，n＝29)或丙烯来源甘油(0-169ppm，n＝41)更高。动物来源各批甘油的平均活性醛水平也比非动物来源各批甘油高。
也使用本文所述的MBTH测试来评估已知生产日期的各批商品甘油，它们的生产日期在测定前1-48月。在实施例3中描述的这些测试清楚地表明：在可比较的时期，植物来源或丙烯来源的各批甘油的平均活性醛水平比从动物生产的各批甘油低得多。由于甘油生产商、供应商和销售商所使用的生产方法和贮藏时间以及贮藏条件固有的不确定性，这些数据显示了选择非动物来源的甘油制备胃肠外使用多肽组合物的明显益处。由于活性醛水平随保存时间增加而增加，甚至对于非动物来源甘油也是如此(见表2)，因此选择最新鲜的可获得的各批甘油用于制备多肽组合物也是有利的。
在考虑用于制备多肽组合物的各种商业化来源甘油时，非动物来源甘油明显是优选的。更优选的是丙烯来源或植物来源的各批商品甘油。在水性胃肠外药用多肽组合物中使用非动物来源甘油而不是动物来源甘油一般由于甘油活性醛含量降低而使化学稳定性改善。在本文所述的实施例4-8中，针对苗条蛋白类似物组合物、人类胰岛素组合物和胰岛素类似物组合物，举例说明了化学稳定性改善与甘油中低活性醛水平之间的相关关系。
本发明的优选实施方法是使用非动物来源的甘油作为包含多肽和甘油的水性胃肠外药用组合物中的甘油成分，以改善所述组合物的化学稳定性。更优选的实施方案是使用丙烯或植物来源甘油作为包含多肽和甘油的水性胃肠外药用组合物中的甘油成分，以改善所述组合物的化学稳定性。最优选的实施方案是使用丙烯来源的甘油作为包含多肽和甘油的水性胃肠外药用组合物中的甘油成分，以改善所述组合物的化学稳定性。实施例9-26和28-34描述了掺入非动物来源甘油的多肽组合物的制备。
本发明多肽组合物的化学稳定性改善是指：所述组合物中高分子量多肽二聚体和多聚体在一段时间后增加的水平低于相似处理的比较组合物水平。根据在多种条件、时间和温度下进行的测试，可以定量形成的共价二聚体和多聚体。本说明书的实施例4-8提供了测试结果，其中在经过特定时间和温度后，本发明多肽组合物中高分子量二聚体和多聚体增加的水平明显更低。本发明多肽组合物化学稳定性的改善最好导致高分子量二聚体和多聚体增加的水平比以前已知相当组合物的水平低至少3％。更优选二聚体和多聚体形成增加的水平至少低10％。更优选二聚体和多聚体形成增加的水平至少低30％。最优选本发明组合物中高分子量二聚体和多聚体增加的水平比以前所知组合物中的水平低至少60％。
本发明的另一优选实施方案是包含多肽和甘油的水性胃肠外组合物，其中所述甘油源于非动物来源。更优选的实施方案是包含甘油的多肽组合物，其中所述甘油源于植物来源或丙烯来源。最优选的实施方案是包含甘油的多肽组合物，其中所述甘油源于丙烯来源。
由表2数据可知，选择非动物来源的各批商品甘油并不保证可以获得极低的活性醛水平，如3ppm或更低。对于要制备的任何药用多肽组合物，购买动物来源或非动物来源的各批商品甘油可能不具有满足所需技术要求限制的足够低的活性醛水平。
因此，本发明的再一方面是降低甘油活性醛含量的方法。具体地说，如实施例8所述，所述方法包括使甘油接触固体干燥剂以及包含自由氨基基团的聚合物树脂。
据认为含胺树脂的类型、干燥剂的性质以及甘油、聚合物和干燥剂之间接触的物理形式对于去除活性醛不是关键的。
在本发明的这一方面中可以利用的含胺聚合物树脂包括聚苯乙烯型树脂如Tris(2-氨基乙基)胺聚苯乙烯树脂、TantaGelS NH2树脂和氨基甲基聚苯乙烯树脂。优选树脂为氨基甲基聚苯乙烯树脂。
在所述降低醛的方法中可以利用广泛范围数量的含胺聚合物树脂。优选使用显著过量摩尔量(与甘油中的醛相比)的含胺聚合物树脂，以加速所述过程并最大化降低活性醛的效应。
可以使甘油通过包含固体干燥剂和聚合物树脂的固定化固体聚集体使甘油、树脂和干燥剂接触。可以将固定化的固体聚集体本身装载在圆柱形柱中。这种类型的物理构型可以便利甘油通过所述固定化固体聚集体，以便可以快速有效地获得大量低活性醛水平的甘油。
或者，可以以分批方法实现所述接触，其中在甘油中加入干燥剂和聚合物树脂以形成悬浮液。在所述批方法中，优选的随后步骤包括加热所述悬浮液到约40℃和约100℃之间，搅拌加热的悬浮液约1分钟到约100小时，将所述悬浮液通过截留固体干燥剂和聚合物树脂的滤器，然后收集通过所述滤器的甘油。用所述分批方法处理的甘油的活性醛含量将降低。也可以使用该分批方法非常快速有效地降低非常大量甘油中的活性醛水平。
许多分离纯化甘油与聚合物和干燥剂的技术也是切实可行的。可以用于本发明这一方面的相分离技术包括离心和过滤。过滤是优选的方法。多种过滤设备和程序适于用于相分离，包括由纤维素或玻璃纤维组成的滤膜。优选玻璃纤维滤膜。更优选的滤膜是Corning 5微米玻璃纤维膜，目录号#25981-PF(Corning Inc.，Corning，NY，美国)。
在所述分批方法中，优选尽量保持正在进行纯化的甘油周围的非氧化性环境，尤其是在加热和搅拌步骤时，尽管这并不是必要的。可以通过在甘油上方提供惰性气体环境而获得这种非氧化性环境，例如使用套袋、或向甘油中通入氩气或氮气、或通过提供还原性气体环境或部分真空。更优选在甘油加热和搅拌步骤中提供氮气环境。
虽然据信所述干燥剂的性质对于所述降低醛的方法的成功不是关键的，但在本发明该方面优选使用的干燥剂包括硫酸镁(MgSO4)和氯化钙(CaCl2)。更优选的干燥剂是硫酸镁。
在本发明降低醛的方法中使用的干燥剂的数量取决于许多因素，包括所使用的干燥剂、甘油中存在的醛和水的水平、所使用的含胺聚合物树脂的水平和性质、加热甘油的温度以及加热甘油搅拌的时间长度。本领域内的技术人员知道这些因素中的每一个因素如何影响所述降低甘油中活性醛水平的反应，并可以根据经验或通过计算确定在该方法中需要使用的干燥剂适当数量。优选在该方法中使用过量干燥剂。
虽然本文所述的降低活性醛的方法对于任何来源的甘油都有利，但优选动物来源、丙烯来源或植物来源的甘油。更优选丙烯来源或植物来源的甘油。最优选丙烯来源的甘油。
因此，在选定一批非动物来源的商品甘油、最好是植物来源或丙烯来源、更优选是丙烯来源的新鲜生产的甘油后，就可以通过合适的测定确定活性醛含量。如果活性醛含量低于针对特定药用多肽组合物设定的技术要求限制，那么可以将所述甘油直接掺入所述组合物，同时保证将会获得所需的化学稳定性水平。
假如活性醛含量高于针对特定药用多肽组合物设定的技术要求限制，那么可以通过用本文所述的方法处理，降低所述甘油的活性醛含量。这样可以在掺入多肽组合物前，将活性醛含量例如为45ppm或更高的一批非动物来源甘油的活性醛含量降到33ppm以下。
或者，可以选定一个工业批号的动物来源甘油，在将其用于制备多肽组合物前测定其活性醛含量。如果进行测量，则最好通过使用甘油醛标准品的测定方法来确定甘油中的活性醛含量，更优选所述测定是本文所述的MBTH测试。如果活性醛含量低于8ppm，那么可以直接将所述甘油掺入所述组合物，同时可以保证将获得所需的化学稳定性水平。如果活性醛水平是8ppm或更高，那么可以通过本文所述的方法进行处理，降低所述甘油的活性醛水平。这样可以在将活性醛含量例如为24ppm的一批动物来源甘油掺入多肽组合物前，对其进行处理，将其活性醛含量降到例如2ppm。
本发明的水性胃肠外药用组合物可以包含非动物来源的甘油以改善其化学稳定性。本说明书的实施例5-7清楚显示：与包含动物来源甘油的类似多肽组合物相比，包含非动物来源甘油的药用多肽溶液和悬浮液组合物的化学稳定性得到改善。
本发明的水性胃肠外药用组合物可以包含非动物来源的甘油。如果测量甘油的活性醛含量，所述甘油的活性醛含量最好低于33ppm，以进一步改善所述多肽组合物的化学稳定性。本说明书的实施例4和8清楚地显示：与包含活性醛含量高于33ppm的非动物来源甘油的相似多肽组合物相比，包含活性醛含量低于33ppm的非动物来源甘油的药用多肽溶液和悬浮液组合物的化学稳定性提高。
为了改善化学稳定性，本发明的水性胃肠外药用组合物或者可以包含活性醛含量低于8ppm的任何来源甘油，包括丙烯来源甘油、植物来源甘油或动物来源甘油。本说明书的实施例4、5和8清楚地显示：与包含活性醛含量为8ppm或更高的甘油的相似多肽组合物相比，包含活性醛含量低于8ppm的甘油的药用多肽溶液和悬浮液组合物的化学稳定性提高。
据信本发明可以应用于任何包含甘油的水性多肽组合物。这样的多肽组合物常常包含其它成分和赋形剂，并且以通常用于制备所述组合物的方法制备。在不限制本发明的普遍性的同时，公开下面的组合物、赋形剂和制备它们的方法，以更好地指导读者。
本发明提供包含水、多肽和活性醛水平低于8ppm的非动物来源甘油或任何来源甘油的组合物。具体地说，本发明提供包含至少一种多肽或其药学上可接受的盐形式的组合物。本发明中可以使用的多肽浓度范围根据给予途径从约1.0μg/mL到约100mg/mL，尽管更低或更高的浓度也是可操作的。多肽浓度最好约5.0μg/mL到约20mg/mL，最优选约20μg/mL到约10mg/mL。根据所需剂量、多肽的效力以及所述多肽在所述多肽中的稳定性，技术人员将知道要掺入本发明组合物中的适当多肽浓度。
根据常规多肽制剂，在本发明的组合物中可以使用其它赋形剂，例如除甘油以外的等渗剂、防腐剂、鱼精蛋白、缓冲剂、增溶剂、去污剂、抗氧化剂、溶液稳定剂和金属阳离子。但在本发明的多肽组合物中也可以使用其它赋形剂。
本发明组合物的水含量是500mg/mL或更高。本发明多肽组合物的甘油浓度低于500mg/mL。
可以用多种本领域内众所周知的程序制备本发明的药用组合物。本发明并不要求按规定顺序加入所述组合物的各成分。根据所述多肽的性质、治疗应用和所需制剂，技术人员将知道制备本发明组合物的合适程序和加入顺序。
根据本发明，如果植物来源或丙烯来源的甘油足够新鲜，那么可以放心地将其直接用于改善多肽组合物的化学稳定性，这与动物来源甘油在同样组合物中的已知应用相比有优势。然而，如果首先测量要在多肽组合物中使用的甘油的活性醛含量，那么可以最大限度地实现本发明。最好在将甘油掺入多肽组合物前两周内测定甘油中的活性醛含量。更优选在将甘油掺入多肽组合物前三天内测定甘油中的活性醛含量。如果在将非动物来源甘油用于制备多肽组合物前测量其活性醛含量，则该含量最好低于33ppm。更优选所述甘油的活性醛含量低于24ppm。更优选所述甘油的活性醛含量低于15ppm。更优选所述甘油的活性醛含量低于8ppm。最优选所述甘油的活性醛含量为3ppm或更低。用于测量甘油活性醛含量的测定方法最好使用甘油醛作为标准品。更优选用于测量甘油活性醛含量的测定方法是本文所述的MBTH测试。
或者，假如按照上文所述方法和期限测试的动物来源甘油活性醛含量低于8ppm，那么就可以在本发明的多肽组合物中使用它们，同时保证化学稳定性得到改善。
因此，本发明的一方面提供包含多肽和甘油的水性胃肠外药用组合物，其中所述甘油来自任何来源，包括丙烯来源、植物来源或动物来源甘油，并且所述甘油的活性醛含量低于8ppm。所述甘油的活性醛含量最好是3ppm或更低。用于测量甘油活性醛含量的测定方法最好使用甘油醛作为标准品。更优选用于测量甘油活性醛含量的测定方法是本文所述的MBTH测试。
本发明的水性药用多肽组合物用作药物，或用于制备治疗哺乳动物疾病的药物。更具体地说，当所述多肽是胰岛素或胰岛素的类似物或衍生物、或GLP-1或GLP-1的类似物或衍生物时，就可以使用所述药物治疗糖尿病或高血糖症。
可以将要求保护的多肽组合物以澄清溶液、悬浮液混合物或双瓶包装提供给患者，其中所述双瓶包装包含一瓶冻干或干燥的多肽，该瓶多肽用另一瓶溶剂重建。优选的多肽组合物是澄清溶液和悬浮液混合物。
可以通过多种技术人员了解的各种胃肠外传递途径将所要求保护的组合物给予需要它们的患者。优选的方法包括皮下注射、肌肉内注射、静脉内注射或输注、肺给予、颊传递、鼻传递、眼内传递或经皮传递、以及内部或外部泵给予。更优选的传递途径是皮下注射和肌肉内注射。
在保存时，所要求保护的组合物比以前所知的组合物在化学上更加稳定。
                      方法1
                     MBTH测试
在总体积100ml的水中，溶解约250mg约20-25％(重量)的3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐(MBTH)及约75-80％(重量)氯化钠的混合物，制备“MBTH溶液”。
取约5.4g在丙二醇中含约20-35％(重量)氯化铁(FeCl3)和约5％(重量)盐酸的溶液，加入约1.5g氨基磺酸，制备“氯化铁溶液”。用水将该混合物稀释到100ml总体积。
用15ml试管准确称取约50mg到约400mg要测定的各批甘油样品。加入1.0mL水。然后加入4.0mL MBTH溶液并充分混合所述制品。在沸水浴中加热所述溶液60±5秒钟。在室温下冷却5分钟后，加入5.0mL氯化铁溶液并充分混合。
在室温下冷却30分钟或更长时间后，在分光光度计上测量所述溶液在624nm处的吸光度。
如上文所述制备空白测试溶液，只是不加入甘油。用水稀释100μg/mL甘油醛水溶液，制备约0.5μg/ml到约10μg/ml的甘油醛标准品，获得标准曲线。然后用测试试剂处理所述标准溶液。
从标准溶液和测试溶液的吸光度减去空白的吸光度后，根据甘油醛标准曲线定量所述甘油样品中的活性醛水平。对于其中活性醛水平低于0.5μg/ml甘油醛标准的甘油样品，通过外推用甘油醛标准品获得的最优拟合线，确定其活性醛含量。所述样品一般一式三份进行检测。在该测试中使用的所有水最好都是无醛的。
                    方法2
            10X甘油应激测试(10X GST)
10X甘油应激测试(10X GST)测量胰岛素组合物中形成的共价二聚体和多聚体。将要测试的甘油加入HumulinR(U40，Eli Lilly & Co.，Indianapolis IN，美国)达到160mg/mL甘油终浓度，即10倍于该制剂中的通常使用的甘油水平。将1等份所获得的制剂在30℃温育7天，第二等份在同样时间内冰冻保存。然后在变性条件下通过尺寸排阻HPLC层析(如Zorbax GF 250 Special柱；流动相为65份0.1M磷酸铵缓冲液pH7.5和35份乙腈；在214nm处检测)测量所述两个等份中的高分子量蛋白(HMWP)水平。测试制剂中HMWP的增加水平是30℃样品HMWP的浓度减去冰冻对照HMWP的浓度。
                       方法3
           改良10X甘油应激测试(Mod.10X-GST)
一毫升HumulinN(U40，Eli Lilly & Co.，Indianapolis IN，美国)与约160mg(约128μl)需测试的甘油掺合。该甘油水平是商业化产品中正常水平的约10倍。将另一毫升HumulinU40与128μL水掺合。两种样品都在30℃保存7天。然后在变性条件下通过尺寸排阻HPLC层析[如标识为“合格Protein-Pak 125胰岛素测定”的Waters柱，Waters Corporation(Milford，MA，美国)目录号20574；流动相为65份的1mg/mL L-精氨酸溶液、20份的乙腈和15份的冰乙酸]测量两种样品中的高分子量蛋白(HMWP)水平。分析前用少量9.6N HCl酸化，溶解测试样品。
测试制剂中HMWP增加水平计算方法是所述30℃测试样品中的HMWP水平减去所述掺水对照中的HMWP水平。报告的增加百分率为7天的增加百分率。
                     方法4
             HPLC分析甘油中的衍生醛
在3.5mL玻璃小瓶中的乙腈中，用1mL 0.5mg/ml 2-二苯乙酰基-1，3-(2，3-二氢-1，3-茚二酮)-1-腙[(DPIH)，见Rideout，J.M.等，Clin.Chim.Acta 161：29-35(1986)和Swarin，S.等，J.Liquid Chromatography6：425-444(1983)]衍化160mg要测试的一批甘油样品。加入10μL三氟乙酸，盖紧小瓶，室温下在20rpm离心3小时。甘油与乙腈-DPIH试剂溶液不能混溶，但离心该管使甘油分布到小管表面的薄层中，最大化了两层表面的接触。甘油中的醛和酮与DPIH反应，形成吖嗪，吖嗪被提取到乙腈-DPIH试剂溶液中。
然后将该溶液注射入Zorbax Rx C8 HPLC柱(Mac-Mod AnalyticalInc.，Chadds Ford，PA，美国)。用溶液A(0.1％ TFA水溶液)和溶液B(0.1％TFA乙腈溶液)从48％B混合物步进到66％B混合物的步进梯度运行30分钟，分离吖嗪。使用分光光度计在290nm处检测衍生物，或使用分光荧光计在425nm激发和525nm发射检测衍生物。分离醛标准品，它们的洗脱顺序是：甘油醛、乙醇醛、羟基丙醛、甲醛、乙醛和丙醛。
仅为说明本发明的目的提供下面的实施例。不应当解释为本发明的范围仅包括下面的实施例。
                     实施例1
                  醛测试的选择性
将植物来源甘油的样品与表1所示的确定醛水平掺合。然后通过本文所述的MBTH测试(方法1)和其它三种测试测定掺合的甘油样品。
对于“Nash”测试，用pH7.5磷酸缓冲液提取甘油中的醛，然后在过量乙酸铵存在下用乙酰丙酮衍化[du Chatinier等，AnalyticalLetters 22：875-883(1989)]。使用分光光度计在415nm处定量颜色反应产物。
对于“Purpald”测试，将试剂4-氨基-3-肼基-5-巯基-1，2，4-三唑[Aldrich Chemical Company]溶解于1N NaOH中。然后将该溶液加入用水稀释的甘油溶液。通气后，用分光光度计在401nm处测定溶液的吸光度。
对于欧洲药典(Ph.Eur.)测试，将甘油溶液与盐酸副品红盐酸盐溶液[欧洲药典1997，第906-907页，欧洲委员会，Strasbourg]混合。一小时后，用分光光度计测量550nm处的吸光度。
对加入的每种化合物，从掺入甘油的反应中减去未掺入甘油样品的反应，计算每个测试的吸光度值。在摩尔基础上计算每种醛的吸光度值并显示于表1。负值表示加入醛实际上降低了吸光度读数。
                            表1
                   加入甘油的醛的摩尔吸光度
  Nash测试 MBTH测试 Purpald测试 Ph.Eur.测试
  甲醛     363     3567     114     1090
  乙醛     3     2138     -532     nd
  甘油醛     34     1525     -108     85
  乙醇醛     10     3379     3924     nd
nd＝未测定
Nash测试对于任何一种醛都没有产生高吸光度。Purpald方法对于乙醇醛高度敏感，但对甘油醛没有产生吸光度。欧洲药典方法对甲醛产生了中等吸光度，但对于测量甘油醛相对不灵敏。
该实验清楚地显示：在所比较的四种测试中，用MBTH测试获得最高的每摩尔甘油醛吸光度信号。HPLC分析(方法4)显示甘油醛是各批商品甘油中发现的主要醛。在MBTH测试中，对甲醛和乙醇醛也获得了高吸光度值，而HPLC分析(方法4)显示这两种醛在各批商品甘油中以低水平存在。因此，MBTH测试是测定甘油中活性醛水平的灵敏方法。
                         实施例2
           MBTH测试与改良10X-GST测试之间的相关关系
用上文所述的MBTH测试测量新鲜和陈化的各批商品甘油中活性醛的含量。也使用10X-GST测试(方法3)评估每种甘油样品。对于丙烯来源和植物来源的组合的甘油样品(分别是n＝39和n＝25)，图1的结果显示MBTH测试测量的活性醛含量(＜100ppm)与改良10X-GST测试测量的HumulinN胰岛素制剂中共价HMWP峰增加之间呈强线性相关关系(对于通过原点的最优拟合直线，R2＝0.90)。动物来源甘油的样品(n＝19)在这两种测试间也显示了强线性相关关系(R2＝0.93，数据未显示)。
                      实施例3
           多批陈化商品甘油中的活性醛含量
将生产日期已知的各批商品甘油从生产日期开始在室温下保存1到48月。对于每一批甘油，用本文所述的MBTH测试测量活性醛含量。各批甘油的数据显示于下面表2。
                         表2
             三种来源各批甘油中活性醛的分析
    动物     植物     丙烯
  分析的批数     6     10     26
陈化时间范围(月) 3-47 1-29 1.5-48
平均陈化时间     22.0     10.6     19.9
  (月)
醛范围(ppm) 24-1069 4-43 0-169
平均醛含量(ppm±SEM) 301.5±162.5 23.6±4.5 25.2±6.2
平均陈化时间的平均醛含量(ppm/月) 13.7 2.2 1.3
每月每批的平均醛含量(ppm±SEM) 16.5±7.1* 3.6±1.3*
SEM＝平均值标准差
*＝根据Wilcoxon Rank-Sum检验存在统计学差异，p＝0.003
这些数据清楚地显示：丙烯来源和植物来源的各批陈化甘油比动物来源的各批陈化甘油有更低的活性醛水平范围。这些数据还显示：在平均陈化时间内，植物来源和丙烯来源的各批甘油比动物来源的各批甘油具有低得多的平均活性醛含量。
用每批甘油的活性醛含量除以其自生产日期起始的陈化时间，得到表2中最后一行的数据。这些计算显示：每陈化月内非动物来源的甘油比动物来源的甘油具有在统计学上显著更低的活性醛水平。这些数据的合理解释是：动物来源甘油活性醛含量随时间的增加比植物或丙烯来源甘油活性醛含量随时间的增加更快。
根据这项研究，我们相信：假如在同等条件下保存具有同等活性醛含量的植物来源、丙烯来源和动物来源甘油，那么动物来源甘油活性醛含量随时间的增加将比植物或丙烯来源甘油活性醛含量随时间的增加更快。
                      实施例4
                苗条蛋白制剂的稳定性
用人苗条蛋白类似物Asp(72)、Asp(100)-Ob，[1998年6月24日公布的Beals，J.M.等，WO 98/28335中的SEQ.ID.6]制备含甘油浓度为220mg/ml的制剂。甘油样品1(根据MBTH测试，活性醛＝1ppm)来自丙烯，甘油样品2(根据MBTH测试，活性醛＝85ppm)来自植物来源。每种制剂在调整到pH7.8的10mM磷酸缓冲液中含有15.2mg/mL苗条蛋白。
同时制备每种样品制剂50mL体积，并无菌过滤。无菌操作，将等份(3mL)加入无菌5mL玻璃管，加塞、密封，保存在5℃和25℃下3、7、10和24天。使用TosoHaas TSK-GEL G3000SW-XL柱(TosoHaas，Montgomeryville，PA，美国)，流动相为pH 8.5的0.1M磷酸钠，0.1M硫酸钠和0.6％十二烷基硫酸钠，通过尺寸排阻层析HPLC在离解条件下分析所述溶液。根据在214nm处的紫外吸光度检测洗脱多肽峰。
除主要蛋白峰外，还观察到两个更早的洗脱峰(即更大分子量)。其中一个是共价二聚体，代表多于90％的早期洗脱峰面积。另一个早期洗脱峰包含比二聚体更大的共价蛋白多聚体。在样品制备的那一天，合并的早期洗脱峰代表样品总色谱峰面积的0.31％到0.33％，而二聚体峰代表样品总色谱峰面积的0.30％到0.32％。
在整个研究过程中所有样品保持澄清和无色。下面表3显示了高分子量蛋白峰(合并的二聚体和更大分子量峰)占总蛋白百分率的增加。至于初始蛋白质溶液，在所有样品中的早期洗脱峰主要是二聚体。
                               表3
              高分子量蛋白峰的增加(相对于总蛋白的％)
  天数   温育温度     甘油样品1     甘油样品2
    3     5℃     0.06     0.06
    7     5℃     0.11     0.12
    10     5℃     0.10     0.18
    24     5℃     0.11     0.22
    3     25℃     0.15     0.29
    7     25℃     0.26     0.63
    10     25℃     0.32     0.80
    24     25℃     0.50     1.53
该实验显示：对于人苗条蛋白类似物Asp(72)Asp(100)-Ob，包含活性醛含量更低的甘油(样品1)的制剂与包含活性醛含量更高的甘油(样品2)的类似制剂相比，在5℃和25℃保存时高分子量蛋白杂质的形成更少。在5℃下24天后，用活性醛含量为1ppm的甘油(样品1)制备的组合物中高分子量蛋白增加的水平比用活性醛含量为85ppm的甘油(样品2)制备的组合物低约50％。在25℃下24天后，用甘油样品1制备的组合物中高分子量蛋白增加的水平比用甘油样品2制备的组合物中该水平低约67％。
                 实施例5
       胰岛素和胰岛素类似物制剂的稳定性
通过MBTH测试定量三批不同商品甘油中的活性醛含量。甘油样品3是来自丙烯(1ppm活性醛)，甘油样品4和5是动物来源甘油(活性醛含量分别是45ppm和156ppm)。
将两种人胰岛素制造制剂(可溶的HumulinR和结晶悬浮液HumulinN)、四种Lys(B28)Pro(B29)-人胰岛素制造制剂[可溶的Humalog、结晶悬浮液HumalogNPL和它们名为LisPro Low Mix(25∶75，Humalog∶HumalogNPL，见Roach，P.等，Diabetes Care 22：1258-1261(1999))和LisPro Mid Mix(50∶50，Humalog∶HumalogNPL))的固定混合物]各以100单位每mL的强度与甘油样品3、4和5掺合，使最终甘油浓度为160mg/ml。
在30℃下7天后，如方法3测定每种制剂中高分子量蛋白(HMWP)增加的百分率。下面的表4显示了HMWP水平的增加。
                       表4
     在30℃下7天后高分子量蛋白峰的增加(总蛋白的％)
    制剂   甘油样品3   甘油样品4   甘油样品5
 HumulinN     0.04     1.85     5.18
 HumalogNPL     0.11     1.69     4.61
 LisPro Low Mix     0.17     1.38     4.27
 LisPro Mid Mix     0.05     1.05     3.78
 HumulinR     0.05     0.78     3.21
 Humalog     0.05     0.46     2.68
该实验的结果清楚地显示：与用动物来源甘油制备的相似组合物相比，使用非动物来源的甘油提供了化学稳定性改善的多肽溶液、悬浮液和混合溶液/悬浮液。在30℃下7天后，用丙烯来源甘油(样品3)制备的组合物中高分子量蛋白增加的水平从LisPro Low Mix降低约87％(与动物来源甘油样品4相比)到HumulinN降低约99％(与动物来源甘油样品5相比)。
                   实施例6
         制备Lys(B28)Pro(B29)-人胰岛素悬浮液
使用四批没有进一步纯化的商品甘油制备相当于U100规格的Lys(B28)Pro(B29)-人胰岛素类似物悬浮液的组合物(HumalogNPL，Eli Lilly & Co.，Indianapolis，IN，美国)。
首先，如方法1所述通过MBTH测试测定三批甘油中的活性醛含量。同时使用10X甘油应激测试(方法2)和改良10X甘油应激测试(方法3)评估所述各批甘油。下面的表5报道了这些分析的结果。
                        表5对用于制备Lys(B28)Pro(B29)-人胰岛素悬浮液的各批甘油的分析
甘油样品 来源 MBTH测试 10X-GST测试 改良10X-GST测试
 6 丙烯 1  0.13  0.13
 7 丙烯 2  0.22  0.09
 8 丙烯 1  0.01  0.17
 9 动物 nd  nd  nd
nd＝未测定
为制备Lys(B28)Pro(B29)-人胰岛素制剂，制备几种中间体溶液。
“防腐剂贮液”用去离子水制备，含有3.52mg/mL间甲酚和1.43mg/mL苯酚(计算值为89％(重量))。
用水制备每种甘油样品的160mg/mL“甘油贮液”。
用10％HCl酸化氧化锌溶液，制备“锌贮液”。
将合适体积的“防腐剂贮液”、“甘油贮液”和“锌贮液”混合，制备“防腐剂-甘油-锌溶液”，该溶液含有1.76mg/mL间甲酚、0.715mg/mL苯酚、16mg/mL甘油，并且当该溶液的锌浓度与主要成分Lys(B28)Pro(B29)-人胰岛素物质中存在的锌合并时，总浓度达到25μg/mL。此时所述“防腐剂-甘油-锌”溶液约是pH4.7。
然后将一定量Lys(B28)Pro(B29)-人胰岛素(大量锌结晶)加入所述防腐剂-甘油-锌溶液，所述加入量足以在下文所述的“U200Lys(B28)Pro(B29)-人胰岛素溶液中达到浓度200单位(U)/mL或约7.0mg/mL在室温下加入小份等量的10％HCl，将pH降到约2.8，溶解Lys(B28)Pro(B29)-人胰岛素。在使所述溶液澄清后，加入小量等份10％NaOH，将所述溶液的pH调到约7.3。加入一定量用去离子水配制的75.6mg/mL七水合磷酸氢二钠溶液，所述加入量足以在该溶液中达到3.78mg/mL七水合磷酸氢二钠的浓度。搅拌使该溶液中的所有物质完全溶解后，加入10％NaOH，将四种Lys(B28)Pro(B29)-人胰岛素溶液中每一种调整到约pH74。加入去离子水得到200U/mLLys(B28)Pro(B29)-人胰岛素溶液，然后将该溶液通过0.22微米SterivexGV滤膜(Millipore Products Division，Bedford，MA，美国)过滤。这四种溶液名为“U200 Lys(B28)Pro(B29)-人胰岛素溶液”。
将固体硫酸鱼精蛋白(大麻哈鱼(Chum salmon))溶解于“防腐剂贮液”中，达到等同于在下文所述的最终“鱼精蛋白-防腐剂-甘油溶液”中0.6mg/mL鱼精蛋白游离碱的浓度，获得“鱼精蛋白贮液”。搅拌45分钟后，加入一定体积75.6mg/mL七水合磷酸氢二钠去离子水溶液，使最终“鱼精蛋白-防腐剂-甘油溶液”中七水合磷酸氢二钠浓度为3.78mg/mL。加入小量等份10％盐酸，将该溶液调整到pH7.4。然后加入一定体积160mg/mL“甘油贮液”，获得在每种溶液中含16mg/mL甘油的溶液。加入去离子水调整最终体积，并将四种“鱼精蛋白-防腐剂-甘油”溶液通过0.22微米Sterivex GV滤膜过滤。
在15℃平衡四种U200 Lys(B28)Pro(B29)-人胰岛素溶液和四种鱼精蛋白-防腐剂-甘油溶液后，混合等体积的每种溶液并在15℃温育61小时。
在该实验中制备的最终四种悬浮液制剂中每mL大致含有：3.5mg Lys(B28)Pro(B29)-人胰岛素、3.78mg七水合磷酸氢二钠、16mg甘油、1.76mg间甲酚、0.715mg苯酚、25μg锌和0.3mg鱼精蛋白。
                      实施例7
       Lys(B28)Pro(B29)-人胰岛素悬浮液的稳定性
如实施例6所述，用不同批甘油制备的Lys(B28)Pro(B29)-人胰岛素四种悬浮液制剂在30℃温育直到12周。在不同时间，通过改良10X-GST测试(方法3)中所述的尺寸排阻HPLC层析，测量样品中高分子量蛋白(HMWP)水平，即占总蛋白的百分率。该稳定性测试的结果显示于下面的表6。
                        表6
用不同批甘油制备的Lys(B28)Pro(B29)人胰岛素悬浮液中
                  的HMWP水平
在30℃的周数 甘油样品6 甘油样品7 甘油样品8 甘油样品9
    0     0.24     0.20     0.20     0.23
    1     0.41     0.39     0.40     0.64
    2     0.55     0.51     0.54     0.92
    4     0.75     0.71     0.77     1.43
    8     1.24     1.21     1.28     2.15
    12     2.00     1.95     2.02     3.16
该实验的结果清楚地显示：与用动物来源甘油制备的Lys(B28)Pro(B29)-人胰岛素悬浮液制剂相比，丙烯来源的甘油改善所述悬浮液制剂的化学稳定性。在30℃下12周后，在用丙烯来源甘油(样品6到8)制备的悬浮液制剂中高分子量蛋白增加的水平平均比用动物来源甘油(样品9)制备的所述制剂中HMWP增加的水平低约39％。
                       实施例8
                  降低甘油中活性醛水平
将一批丙烯来源甘油(3.0ml)放入装有搅拌棒的五个烧杯中。用一批植物来源甘油相似地准备五个烧杯。将约50mg固体无水硫酸镁(MgSO4)加入每一组的四个烧杯中。在每一组加入了硫酸镁的三个烧杯中，加入称好重量的下列Advanced Chem Tech Inc.(Louisville，KY，美国)聚合物树脂中的一种：树脂A，0.1g Tris(2-氨基乙基)胺树脂(0.7mmol/g，100-200目；树脂B，0.2g TantaGelS NH2树脂(0.3mmol/g，90um)；树脂C，0.1g氨基甲基聚苯乙烯树脂(0.7mmol/g，100-200目)。
所有十个烧杯置于手套袋内氮环境下的搅拌器上，加热到约60℃。搅拌24小时后，将样品活塞过滤(plug-filter)通过纤维素膜，并通过如方法1中所述的MBTH测试分析它们的活性醛含量(ppm)。也通过改良10X-GST测试(方法3)评估几个甘油样品。下面的表7报道了本实验的结果。
                          表7
            用聚合物胺树脂处理甘油样品的结果
  样品 甘油来源   MgSO4   树脂 MBTH测试   改良10X-GST测试
    1   丙烯     否     无     21     1.84
    2   丙烯     是     无     25     1.58
    3   丙烯     是     A     2     nd
    4   丙烯     是     B     1     nd
    5   丙烯     是     C     1     -0.27
    6   植物     否     无     36     4.68
    7   植物     是     无     45     3.65
    8   植物     是     A     10     nd
    9   植物     是     B     3     nd
    10   植物     是     C     1     -0.03
nd＝未测定
这些数据清楚地显示：所使用的纯化方法大大降低各批商品甘油中的活性醛浓度。在用改良10X-GST测试测定的胰岛素悬浮液中，用氨基甲基聚苯乙烯(树脂C)纯化的各批甘油不导致HMWP峰增加，而未纯化各批甘油导致HMWP峰水平显著增加。
                         实施例9
                      人胰岛素溶液
将重组人胰岛素(35mg)溶于约5m l0.01N HCl。加入氧化锌溶液(1mL，0.17mg/mL锌，氧化锌溶解于0.1N HCl中)，然后加入25mg间甲酚。然后加入160mg新鲜生产的丙烯来源甘油。将该溶液用1NNaOH调整到约pH7.4，并用水稀释到约10mL总体积。每一mL该多肽组合物含约3.5mg人胰岛素、约16mg甘油、约2.5mg间甲酚和约0.017mg锌。
                         实施例10
                      人胰岛素溶液
将重组人胰岛素(35mg)溶于约5ml 0.01N HCl。加入氧化锌溶液(1mL，0.17mg/mL锌，氧化锌溶解于0.1N HCl中)，然后加入16mg间甲酚、6.5mg苯酚和1mL 140mM磷酸钠缓冲水溶液。然后加入160mg新鲜生产的丙烯来源甘油。该溶液用1N NaOH调整到约pH7.4，并用水稀释到约10mL总体积。每一mL该多肽组合物含约3.5mg人胰岛素、约16mg甘油、14mM磷酸钠、约1.6mg间甲酚、约0.65mg苯酚和约0.017mg锌。
                    实施例11
                人胰岛素悬浮液
首先将35mg重组人胰岛素溶解于5ml 0.01N HCl，然后加入16mg间甲酚和6.5mg苯酚，制备人胰岛素-鱼精蛋白结晶悬浮液。加入1ml 160mg/mL丙烯来源甘油的水溶液、1mL在0.1N HCl中的氧化锌(0.25mg/ml锌)溶液和2.7mg鱼精蛋白(以游离碱计)，然后用水稀释到约9mL总体积。然后加入38mg/mL七水合磷酸氢二钠溶液(1ml)，导致pH约8。将得到的溶液调整到pH7.4，并在约19℃结晶约24小时。每一mL该悬浮液含约3.5mg人胰岛素、约16mg甘油、约0.27mg鱼精蛋白(以游离碱计)、约0.025mg锌、约1.6mg间甲酚、约0.65mg苯酚和约3.8mg磷酸二氢钠。
                    实施例12
               人胰岛素70/30混合物
一种包含70份实施例11所述悬浮液和30份实施例10所述人胰岛素溶液的组合的混合物。这两种制剂都使用丙烯来源的甘油。
                   实施例13
              人胰岛素50/50混合物
一种包含50份实施例11所述悬浮液和50份实施例10所述人胰岛素溶液的组合的混合物。这两种制剂都使用丙烯来源的甘油。
                  实施例14
             人胰岛素30/70混合物
一种包含30份实施例11所述悬浮液和70份实施例10所述人胰岛素溶液的组合的混合物。这两种制剂都使用丙烯来源的甘油。
                  实施例15
             Lys(B28)Pro(B29)-人胰岛素溶液
将重组Lys(B28)Pro(B29)-人胰岛素(35mg)溶于约5ml 0.01NHCl。加入1mL溶解于0.1N HCl中的氧化锌溶液(0.2mg/mL锌)，然后加入31.5mg间甲酚和1mL 70mM磷酸缓冲水溶液。然后加入160mg丙烯来源甘油。该溶液用1N NaOH调整到约pH7.4，并用水稀释到约10mL总体积。每一mL该多肽组合物含约3.5mgLys(B28)Pro(B29)-人胰岛素、约16mg甘油、7mM磷酸钠、约3.15mg间甲酚和约0.02mg锌。
                      实施例16
            Lys(B28)Pro(B29)-人胰岛素溶液
将重组Lys(B28)Pro(B29)-人胰岛素(35mg)溶于约5ml 0.01NHCl。加入1mL溶解于0.1N HCl中的氧化锌溶液(0.2mg/mL锌)，然后加入16mg间甲酚、6.5mg苯酚和1mL 140mM磷酸缓冲水溶液。然后加入160mg丙烯来源甘油。该溶液用1N NaOH调整到约pH7.4，并用水稀释到约10mL总体积。每一mL该多肽组合物含约3.5mg Lys(B28)Pro(B29)-人胰岛素、约16mg甘油、14mM磷酸钠、约1.6mg间甲酚、约0.65mg苯酚和约0.02mg锌。
                      实施例17
          Lys(B28)Pro(B29)-人胰岛素悬浮液
使用如实施例6所述程序，用丙烯来源甘油制备Lys(B28)Pro(B29)-人胰岛素NPH样结晶的悬浮液。
                      实施例18
          Lys(B28)Pro(B29)-人胰岛素75/25混合物
一种包含75份实施例17所述Lys(B28)Pro(B29)-人胰岛素悬浮液和25份实施例16所述Lys(B28)Pro(B29)-人胰岛素溶液的组合的混合物。这些制剂的每一种都使用丙烯来源的甘油。
                      实施例19
         Lys(B28)Pro(B29)-人胰岛素50/50混合物
一种包含50份实施例17所述Lys(B28)Pro(B29)-人胰岛素悬浮液和50份实施例16所述Lys(B28)Pro(B29)-人胰岛素溶液的组合的混合物。这些制剂的每一种都使用丙烯来源的甘油。
                       实施例20
         Lys(B28)Pro(B29)-人胰岛素25/75混合物
一种包含25份实施例17所述Lys(B28)Pro(B29)-人胰岛素悬浮液和75份实施例16所述Lys(B28)Pro(B29)-人胰岛素溶液的组合的混合物。这些制剂的每一种都使用丙烯来源的甘油。
                       实施例21
                Asp(B28)-人胰岛素溶液
将重组Asp(B28)-人胰岛素(35mg)溶于约5ml 0.01N HCl。加入1mL溶解于0.1N HCl中的氧化锌溶液(0.2mg/mL锌)，然后加入17mg间甲酚和15mg苯酚。然后加入160mg丙烯来源甘油，并加入1mL70mM磷酸缓冲水溶液。该溶液用1N NaOH调整到约pH7.4，并用水稀释到约10mL总体积。每一mL该多肽组合物含约3.5mgAsp(B28)-人胰岛素、约16mg甘油、约7mM磷酸、约1.7mg间甲酚、约1.5mg苯酚和约0.02mg锌。
                       实施例22
             Asp(B28)-人胰岛素70/30混合物
将76.5mg Asp(B28)-人胰岛素溶解于含约0.32mL 0.2N HCl的水中，加入约0.16mL 0.4mg/mL氯化锌溶液，制备Asp(B28)-人胰岛素溶液。加入硫酸鱼精蛋白(相当于约4.5mg鱼精蛋白游离碱)水溶液，随后加入溶解于水中的17.2mg间甲酚、15mg苯酚和160mg丙烯来源甘油的混合物。得到的溶液约pH2.7，用水稀释到10mL，并平衡到约30℃。在该溶液中加入10mL含17.2mg间甲酚、15mg苯酚、25mg二水合磷酸氢二钠和160mg丙烯来源的甘油、pH9的溶液，并平衡到约30℃。在约30℃2天后，完成结晶化，获得悬浮液混合物，该混合物中约70％Asp(B28)-人胰岛素存在于不可溶的NPH样结晶中，而30％Asp(B28)-人胰岛素存在于溶液中。
                    实施例23
           Asp(B28)-人胰岛素50/50混合物
将76.5mg Asp(B28)-人胰岛素溶解于含约0.32mL0.2N HCl的水中，并加入约0.16mL 0.4mg/mL氯化锌溶液，制备Asp(B28)-人胰岛素溶液。加入硫酸鱼精蛋白(相当于约3.2mg鱼精蛋白游离碱)水溶液，随后加入溶解于水中的17.2mg间甲酚、15mg苯酚和160mg丙烯来源甘油的混合物。得到的溶液约pH2.7，用水稀释到10mL，并平衡到约30℃。在该溶液中加入10mL含17.2 mg间甲酚、15mg苯酚、25mg二水合磷酸氢二钠和160mg丙烯来源的甘油、pH9的溶液，并平衡到约30℃。在约30℃2天后，完成结晶化，获得悬浮液混合物，该混合物中约50％Asp(B28)-人胰岛素存在于不可溶的NPH样结晶中，而50％Asp(B28)-人胰岛素存在于溶液中。
                      实施例24
            Asp(B28)-人胰岛素30/70混合物
将76.5mg Asp(B28)-人胰岛素溶解于含约0.32mL 0.2N HCl的水中，并加入约0.16mL 0.4mg/mL氯化锌溶液，制备Asp(B28)-人胰岛素溶液。加入硫酸鱼精蛋白(相当于约2.0mg鱼精蛋白游离碱)水溶液，随后加入溶解于水中的17.2mg间甲酚、15mg苯酚和160mg丙烯来源甘油的混合物。得到的溶液约pH2.7，用水稀释到10mL，并平衡到约30℃。在该溶液中加入10mL含17.2mg间甲酚、15mg苯酚、25mg二水合磷酸氢二钠和160mg丙烯来源的甘油、pH9的溶液，并平衡到约30℃。在约30℃2天后，完成结晶化，获得悬浮液混合物，该混合物中约30％Asp(B28)-人胰岛素存在于不可溶的NPH样结晶中，而70％Asp(B28)-人胰岛素存在于溶液中。
                       实施例25
       肉豆蔻酰-ε-Lys(B29)-des(B30)-人胰岛素溶液
将胰岛素类似物衍生物肉豆蔻酰-ε-Lys(B29)-des(B30)-人胰岛素(37mg)溶解于约5ml 0.01N HCl中，加入1mL溶解于0.1N HCl中的氧化锌溶液(0.17mg/ml锌)，然后加入32mg间甲酚、1ml 70mM磷酸缓冲水溶液，然后加入160mg丙烯来源甘油。将所述溶液调整到约pH7.9，并用水稀释到约10ml总体积。每一mL该多肽组合物含有约3.7mg肉豆蔻酰-ε-Lys(B29)-des(B30)-人胰岛素、约16mg甘油、7mM磷酸钠、约3.2mg间甲酚和约0.017mg锌。
                      实施例26
         Gly(A21)Arg(B21)Arg(B32)-人胰岛素溶液
将胰岛素类似物Gly(A21)Arg(B31)Arg(B32)-人胰岛素(37mg)溶解于约5ml 0.01N HCl。加入1mL溶解于0.1N HCl中的氧化锌溶液(0.80mg/ml锌)。加入苄醇(100mg)，然后加入188mg植物来源的甘油。将该溶液调整到约pH4.0，并用水稀释到约10mL总体积。每一mL该多肽组合物含约3.7mg Gly(A21)Arg(B21)Arg(B32)-人胰岛素、约16mg甘油、约0.08mg锌和10mg苄醇。
                      实施例27
                  Gly(8)-GLP-1溶液
将Gly(8)-GLP-1(10mg)溶解于约5.0ml 0.01N NaOH。然后加入间甲酚(20mg)，然后加入160mg根据本文所述MBTH测试测量活性醛含量为2ppm的动物来源甘油。将该溶液调整到pH8.0，并用水稀释到10mL总体积。每一mL该多肽组合物含约1mg Gly(8)-GLP-1、约16mg甘油和2mg间甲酚。
                  实施例28
               人苗条蛋白溶液
将重组人苗条蛋白(10mg)溶解于约5ml 0.01N NaOH。加入间甲酚(30mg)，随后加入160mg植物来源甘油和1mL 70mM磷酸缓冲水溶液。将该溶液调整到pH8.0，并用水稀释到10mL总体积。每一mL该多肽组合物含约1mg人苗条蛋白、约16mg甘油、7mM磷酸钠和3mg间甲酚。
                     实施例29
                    人FSH溶液
将重组人FSH(5mg)溶解于10mM磷酸钠pH7.4溶液中。加入30mg间甲酚，然后加入160mg丙烯来源甘油。用10mM磷酸钠pH7.4溶液将该溶液稀释到10mL总体积。每一mL该多肽组合物含0.5mgFSH、约10mM磷酸钠、3mg间甲酚和16mg甘油。
                         实施例30
           Gly(A21)Arg(B21)Arg(B32)-人胰岛素溶液
将胰岛素类似物Gly(A21)Arg(B31)Arg(B32)-人胰岛素(36mg)溶解于约5ml 0.01N HCl。加入1mL溶解于0.1N HCl中的氧化锌溶液(0.30mg/ml锌)。加入间甲酚，然后加入200mg 85％甘油-15％水溶液，其中所述甘油是丙烯来源。将该溶液调整到约pH4.0，并用水稀释到约10mL总体积。每一mL该多肽组合物水溶液含约3.6mgGly(A21)Arg(B21)Arg(B32)-人胰岛素、约17mg丙烯来源甘油、约0.03mg锌和2.7mg间甲酚。
                      实施例31
                Asp(B28)-人胰岛素溶液
将重组Asp(B28)-人胰岛素(35mg)溶于约5ml 0.01N HCl。加入1mL溶解于0.1N HCl中的氧化锌溶液(0.2mg/mL锌)，然后加入17mg间甲酚和15mg苯酚。然后加入160mg丙烯来源甘油，并加入1mL含5.8mg/ml氯化钠(NaCl)的70mM磷酸缓冲水溶液。该溶液用1NNaOH调整到约pH7.4，并用水稀释到约10mL总体积。每一mL该多肽组合物含约3.5mg Asp(B28)-人胰岛素、约16mg甘油、约7mM磷酸盐、约1.7mg间甲酚、约1.5mg苯酚、约0.58mg NaCl和约0.02mg锌。
                        实施例32
Arg(34)，N-ε-(γ-Glu(N-α-十六烷酰))-Lys(26)-GLP-1(7-37)OH
                          溶液
将Arg(34)，N-ε-(γ-Glu(N-α-十六烷酰))-Lys(26)-GLP-1(7-37)OH(10mg)溶解于约5ml 0.01N NaOH。加入间甲酚(20mg)，然后加入160mg丙烯来源甘油。将该溶液调整到pH8.0，并用水稀释到10mL总体积。每一mL该多肽组合物含约1mgArg(34)，N-ε-(γ-Glu(N-α-十六烷酰))-Lys(26)-GLP-1(7-37)OH、约16mg甘油和约2mg间甲酚。
                   实施例33
                 Exendin-4组合物
将Exendin-4(1mg)加入5ml含5mg/ml乙酸钠的pH4.5溶液。加入间甲酚(27mg)，然后加入160mg丙烯来源甘油。如果需要，将该溶液调整到pH4.5，并用水稀释到10mL总体积。每一mL该多肽组合物含约0.1mg exendin-4、约2.5mg乙酸钠、约16mg甘油和约2.7mg间甲酚。
                   实施例34
           Lys(B3)Ile(B28)-人胰岛素溶液
将重组Lys(B3)Ile(B28)-人胰岛素(35mg)溶于约5ml 0.01NHCl。加入1mL溶解于0.1N HCl中的氧化锌溶液(0.2mg/mL锌)，然后加入31.5mg间甲酚和1mL 70mM磷酸缓冲水溶液。然后加入160mg丙烯来源甘油。将该溶液用1N NaOH调整到约pH7.8，并用水稀释到约10mL总体积。每一mL该多肽组合物含约3.5mgLys(B3)Ile(B28)-人胰岛素、约16mg甘油、约7mM磷酸钠、约3.15mg间甲酚和约0.02mg锌。
已经在上面的说明书中描述了本发明的原理、优选实施方案和操作模式。然而，不应当认为本文所要求保护的本发明限于所公开的具体形式，因为所公开的具体形式应当认为是说明性的，而不是限制性的。本领域内的技术人员可以作出变更和改变，而不偏离本发明的精神。

Claims (48)

1.一种包含多肽和甘油的水性胃肠外药用组合物，其中所述甘油来自非动物来源。
2.依照权利要求1的组合物，其中所述组合物为溶液。
3.依照权利要求1的组合物，其中所述组合物为悬浮液。
4.依照权利要求1到3中任一项的组合物，其中所述药用组合物中的甘油浓度约1mg/mL到约300mg/mL。
5.依照权利要求4的组合物，其中所述甘油浓度约3mg/mL到约100mg/mL。
6.依照权利要求5的组合物，其中所述甘油浓度约10mg/mL到约30mg/mL。
7.依照权利要求6的组合物，其中所述甘油浓度约15mg/mL到约18mg/mL。
8.依照权利要求1到7中任一项的组合物，其中所述甘油来自植物来源或丙烯来源。
9.依照权利要求8的组合物，其中所述甘油来自丙烯来源。
10.依照权利要求1到9中任一项的组合物，其中所述多肽通过生物合成制得。
11.依照权利要求10的组合物，其中所述多肽在细菌或酵母中合成。
12.依照权利要求11的组合物，其中所述多肽在大肠杆菌(E.coli)中合成。
13.依照权利要求1到12中任一项的组合物，其中所述多肽是FSH或其类似物或衍生物、PTH或其片段或类似物、HGH或其类似物、人苗条蛋白或其类似物或衍生物、GLP-1或其类似物或衍生物、人胰岛素或其类似物或衍生物、或人胰岛素类似物的衍生物。
14.依照权利要求13的组合物，其中所述多肽是人胰岛素或其类似物或衍生物、或人胰岛素类似物的衍生物。
15.依照权利要求14的组合物，其中所述多肽是人胰岛素。
16.依照权利要求14的组合物，其中所述多肽是人胰岛素类似物。
17.依照权利要求16的组合物，其中所述类似物是Lys(B28)-Pro(B29)-人胰岛素。
18.依照权利要求16的组合物，其中所述类似物是Asp(B28)-人胰岛素。
19.依照权利要求16的组合物，其中所述类似物是Gly(A21)Arg(B31)Arg(B32)-人胰岛素。
20.依照权利要求14的组合物，其中所述多肽是人胰岛素衍生物或人胰岛素类似物的衍生物。
21.依照权利要求20的组合物，其中所述人胰岛素类似物的衍生物是肉豆蔻酰-ε-Lys(B29)-des(B30)-人胰岛素。
22.依照权利要求20的组合物，其中所述人胰岛素衍生物是棕榈酰-ε-Lys(B29)-人胰岛素。
23.依照权利要求1到22中任一项的组合物，其中所述甘油的活性醛含量低于33ppm。
24.依照权利要求23的组合物，其中所述甘油的活性醛含量低于24ppm。
25.依照权利要求24的组合物，其中所述甘油的活性醛含量低于15ppm。
26.依照权利要求25的组合物，其中所述甘油的活性醛含量低于8ppm。
27.依照权利要求26的组合物，其中所述甘油的活性醛含量为3ppm或3ppm以下。
28.一种包含多肽和甘油的水性胃肠外药用组合物，其中所述甘油的活性醛含量低于8ppm。
29.依照权利要求28的组合物，其中所述甘油的活性醛含量为3ppm或3ppm以下。
30.依照权利要求28或29中任一项的组合物，其中所述甘油来自动物来源。
31.非动物来源甘油用作依照权利要求1到27中任一项的水性胃肠外药用组合物中的甘油成分的应用，所述甘油的应用使所述组合物的化学稳定性提高。
32.甘油在依照权利要求28到30中任一项的水性胃肠外药用组合物中的应用，所述甘油的应用使所述组合物的化学稳定性提高。
33.一种制备权利要求1到27中任一项的水性胃肠外药用组合物的方法，所述方法包含将水、所述多肽和所述非动物来源甘油组合在一起。
34.一种制备权利要求28到30中任一项的水性胃肠外药用组合物的方法，所述方法包含将水、所述多肽和所述甘油组合在一起。
35.一种降低甘油中活性醛水平的方法，所述方法包括使甘油与固体干燥剂和包含游离氨基基团的聚合物树脂接触。
36.依照权利要求35的方法，其中使所述甘油通过包含所述固体干燥剂和所述聚合物树脂的固定化固体聚集体，从而实现所述接触。
37.依照权利要求36的方法，其中所述固定化固体聚集体盛装在圆柱体柱中。
38.依照权利要求35的方法，其中通过将所述固体干燥剂和所述聚合物树脂加入所述甘油中形成悬浮液，从而实现所述接触。
39.依照权利要求38的方法，所述方法还包含下列步骤：
a)加热权利要求38的所述悬浮液到约40℃和约100℃之间；
b)搅拌步骤(a)的所述加热悬浮液约1分钟到约100小时；
c)将步骤(b)的悬浮液通过截留所述固体干燥剂和所述聚合物树脂的滤膜；
d)收集通过步骤(c)的滤膜的甘油。
40.依照权利要求35到39中任一项的方法，其中所述聚合物树脂是包含游离氨基基团的聚苯乙烯树脂。
41.依照权利要求40的方法，其中所述聚苯乙烯树脂选自Tris(2-氨基乙基)胺聚苯乙烯树脂、TantaGel S NH2树脂和氨基甲基聚苯乙烯树脂。
42.依照权利要求41的方法，其中所述聚苯乙烯树脂是氨基甲基聚苯乙烯树脂。
43.依照权利要求35到42中任一项的方法，其中所述固体干燥剂是硫酸镁或氯化钙。
44.依照权利要求43的方法，其中所述固体干燥剂是硫酸镁。
45.依照权利要求35到44中任一项的方法，其中所述甘油来自丙烯来源、植物来源或动物来源。
46.依照权利要求45的方法，其中所述甘油来自丙烯来源或植物来源。
47.依照权利要求45的方法，其中所述甘油来自动物来源。
48.一种制备水性胃肠外药用组合物的方法，所述方法包括将水、多肽和甘油组合在一起，其中在将所述甘油用于制备所述组合物前，应用依照权利要求35到47中任一项的方法降低所述甘油的活性醛含量。
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