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CN1405177A - 一种治疗肝炎的天然药物溪黄草提取物 - Google Patents

一种治疗肝炎的天然药物溪黄草提取物 Download PDF

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CN1405177A
CN1405177A CN 02135069 CN02135069A CN1405177A CN 1405177 A CN1405177 A CN 1405177A CN 02135069 CN02135069 CN 02135069 CN 02135069 A CN02135069 A CN 02135069A CN 1405177 A CN1405177 A CN 1405177A
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CN
China
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extract
xihuangcao
hepatitis
acid
solvent
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Pending
Application number
CN 02135069
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English (en)
Inventor
赖小平
胡英杰
陈建南
朱宇同
刘中秋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou University of Chinese Medicine
Original Assignee
Guangzhou University of Chinese Medicine
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Abstract

本发明涉及一种治疗肝炎的天然药物溪黄草提取物及其制备方法。该药物以溪黄草为原料，采用热水提取法、超临界二氧化碳提取法或有机溶剂提取法等工艺的一种提取，经减压浓缩、真空干燥、喷雾干燥等方法制成溪黄草提取物；其中含有抗病毒活性成分2－羟基熊果酸、2，3一二羟基熊果酸以及抗氧化活性成分迷迭香酸等特征性有效成分；具有抑制乙肝病毒复制、保护免疫性肝损伤、提高细胞免疫力、增加免疫低下实验动物的脾脏和胸腺重量和增加胆汁排泄等作用。将溪黄草提取物作为活性成分，与适宜的赋形剂相结合，制成各种药物制剂，包括颗粒剂、片剂、胶囊、口服液等口服剂型，以及注射剂型，用于各种病毒性肝炎尤其是乙型肝炎的治疗，具有广阔的应用前景。

Description

一种治疗肝炎的天然药物溪黄草提取物
技术领域
本发明涉及一种天然药草提取物，特别涉及可治疗肝炎的天然药物溪黄草提取物。本发明所说的溪黄草，特指学名为狭基线纹香茶菜即Isodonlophanthoides(Buch.-Ham.ex D.Don)Hara var.gerardianus(Benth.)Hara的植物。
背景技术
病毒性肝炎是威胁人类健康的重大疾病。到目前为止，已发现甲、乙、丙、丁、戊、己、庚等7种类型病毒性肝炎。而以乙型病毒性肝炎(HepatitisB)的危害性最大。乙型肝炎是世界性疾病，全球约有3.5亿患者。我国是乙肝大国，乙肝表面抗原(HBsAg)阳性者约占总人口的1/10。鉴于乙肝病毒(HBV)持续性感染和机体的免疫功能失调是乙肝发病的主要环节，因而抗病毒治疗被推崇为肝炎治疗的根本方法。
干扰素和拉米夫定是目前公认的抗HBV效果最好的两类药物，但一部分人对干扰素不敏感，且应用后复发率高，副作用大，价格昂贵。拉米夫定对HBV复制的抑制效果比干扰素更强，但也存在停药后易反跳，有使病毒变异，产生抗药性等缺点。所以，寻找新的抗乙肝病毒药物仍然是医药学家面临的严峻任务。
发明内容
本发明的目的是针对现有的病毒性肝炎治疗药品的局限性(如有使病毒变异，产生抗药性潜在危机，或者是复发率高、副作用大、价格昂贵等)，为社会提供一种具有明确抗病毒、保护肝细胞、提高免疫力等作用的天然药物溪黄草提取物。
本发明的目的是这样实现的：
一种治疗肝炎的天然药物溪黄草提取物，其特征是制备方法之一为取溪黄草干品粗粉用甲醇或乙醇回流提取，提取液减压蒸发或浓缩除去溶剂，加适量水后用石油醚充分提取，石油醚不溶解的部分经蒸发或减压浓缩、冷冻干燥除尽溶剂，即得到溪黄草提取物；制备方法之二为取溪黄草干品粗粉，用超临界二氧化碳流体(内含2。5％-10％乙醇)，在50℃以下至室温，于超临界二氧化碳流体萃取釜内循环提取，提取物减压蒸发除去溶剂，加石油醚充分脱脂脱色，石油醚不溶解的部分经减压蒸馏冷冻干燥除尽溶剂，即得溪黄草提取物；制备方法之三为取溪黄草干品粗粉加水煎煮，提取液经蒸发或减压浓缩，真空冷冻干燥或喷雾干燥除尽溶剂，即得溪黄草提取物。
——所述的溪黄草提取物含有抗乙型肝炎病毒活性成分2-羟基熊果酸和2，3-二羟基熊果酸，还含有保护肝细胞、抗氧化活性成分迷迭香酸。
——所述的溪黄草提取物用于具有以下功效的治疗各种病毒性肝炎尤其是乙型肝炎相关的药物的制造：
(a)抑制鸭乙肝病毒DNA复制，抑制2.2.15细胞表达和产生乙肝炎标志物(乙型肝炎抗原)；
(b)对小鼠免疫性肝损伤有保护作用；
(c)有提高细胞免疫力的作用；
(d)能增加免疫低下实验动物的脾脏和胸腺重量；
(e)显著增加大鼠胆汁排泄量。
——所述的溪黄草提取物可按常规工艺制成符合制剂要求的口服药物剂型如片剂、胶囊、颗粒、口服液或注射剂。
本发明的突出进步和显著效果在于溪黄草是华南地区常见易得的中草药，制作工艺简易，成本低廉，为社会提供了一种具有明确抗病毒、保护肝细胞、提高免疫能力等作用的天然药物。
具体实施方式
本发明所述的溪黄草活性提取物，以及提取物药理活性是按如下实施例所表示的方法制造或发现的。所涉及到的方法是本领域的技术人员能够掌握和运用的技术手段。但是，以下实施例不得理解为任何意义上的对本发明权利要求的限制。
实施例1：溪黄草提取物的制备(方法一)
溪黄草(狭基线纹香茶菜)干品粗粉4kg，用甲醇回流提取3次，每次2小时，过滤，合并滤液减压蒸除甲醇，残留物(甲醇总提取物)加入适量水，用石油醚(bp60-90℃)充分提取，回收溶剂得石油醚可溶物与石油醚不溶物，不溶物经减压浓缩、冷冻干燥除尽溶剂，得到溪黄草干燥提取物，粉碎，过80目筛，即得。
实施例2：溪黄草活性提取物的制备(方法二)
溪黄草(狭基线纹香茶菜)干品20kg，加水，煎煮2次，第1次2小时，第2次1小时，合并提取液，高速(15000rpm)离心除去不溶物。上清液经减压浓缩、喷雾干燥得溪黄草提取物，过80目筛，即得。
实施例3：溪黄草活性提取物的制备(方法三)
溪黄草(狭基线纹香茶菜)干品粗粉2kg，用超临界二氧化碳流体(内含5％乙醇作为夹带剂)，在40℃、压力10Mpa的条件下，在超临界二氧化碳流体萃取釜内进行循环提取，提取2小时后，在室温下，调整解析釜温度压力2Mpa释放出二氧化碳。所得浸膏即为青蒿的超临界二氧化碳流体萃取提取物。取该提取物加石油醚充分脱脂脱色，石油醚不溶解的部分经减压蒸馏、冷冻干燥除尽溶剂，得到溪黄草提取物，粉碎，过80目筛，即得。
实施例4：溪黄草活性提取物中具有抗病毒或肝细胞保护作用的有效成分的分离鉴定
有效部位化学成分的分离
取实施例1所得石油醚不溶物，加适量水，依次加乙酸乙酯和正丁醇充分提取，分别合并乙酸乙酯提取液和正丁醇提取液。分别减压蒸干，得乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物。
取乙酸乙酯部位(40g)用甲醇溶解，分散于适量硅胶，干法装硅胶(200-300目)柱。依次用氯仿-甲醇(98∶2-8∶2)洗脱，每份150ml。用TLC监测，合并相同组成的馏分。从98∶2洗脱物得2个单一成分X-1(210mg)和X-2(90mg)，均为无色颗粒状晶体；从90∶10洗脱物再经过数次中压硅胶(200-300目)柱层析得到2个单一成分X-3(230mg)和X-4(110mg)，均为无色颗粒状晶体；从8∶2洗脱物得1个单一成分X-5(70mg)，为无色颗粒状晶体。
取正丁醇部位(17.5g)用甲醇溶解，分散于适量硅胶，干法装硅胶(200-300目)柱。依次用氯仿-甲醇(9∶1-8∶2)洗脱，每份150ml。用TLC监测，合并相同组成的馏分。从85∶15洗脱物得1个单一成分X-6(230mg)；从8∶2洗脱物得1个单一成分X-7(70mg)。
结构鉴定
1 X-1，C35H60O6，白色无定型粉末，其IR、MS、1H NMR数据与胡萝卜甙标准对照品一致；TLC显紫色斑点，Rf值与对照品相同。鉴定为胡萝卜甙(daucosterol)。
2 X-2，C30H48O5，无色粒状晶体，mp274-276℃；TLC显紫红色斑点，Rf值与标准对照品相同；IRνKBr maxcm-1：3425(νOH)；2927和2872(νCH)；1693(νC＝O)；1458，1386，1277，1030，997。
EIMS(70eV)m/z(rel.abundance)：438(2)[M+.-H2O]，300(4)，248(60)[frag.C16H24O2 +.from RDA cleavage]，219(8)，203(40)[248-COOH]，189(15)，133(65)，105(20)，81(22％)，69(43)，55(100)，43(100)：
以上与熊果酸标准对照品的光谱数据一致；
1H NMR(400MHz，DMSO-d6，δin ppm)：5.11(1H，br.s，12-H)，4.30(1H，d，J＝6Hz，3α-H)，2.10(1H，br.d，J＝12Hz，18β-H)，1.03(3H，s，CH3)，0.88-0.85(6H，s，2×CH3)，0.80 and 0.89(3H each，s，two CH3)，0.73 and0.66(3H each，s，two CH3)；
X-2的13C NMR数据(宽带去偶谱，100MHz，DMSO-d6，δin ppm)见表1，由于18β-H信号δH偏高场，13位δC信号偏高场，12位δC信号偏低场，亦符合熊果酸型五环三萜结构特征，全部数据与标准对照品一致，故鉴定X-2为熊果酸(ursolic acid)。
3 X-3，C30H48O4，无色粒状晶体，mp 255-258℃，TLC显蓝紫色斑点。IRνKBr maxcm-1：3430(broad)(νOH)；2973，2938和2875(νCH)；1693(νC＝O)；1658(weak absorption，νC＝C)；1454，1384，1314，1278，1236，1187，1110，1046，997，962，927。
EIMS(70eV)m/z(rel.abundance)：454(1)[M+.]，248(60)[frag.C16H24O2 +.from RDA cleavage]，219(8)，203(42)[248-COOH]，133(35)，105(20)，81(22％)，69(43)，55(100)，43(100)；
FABMS m/z(rel.abundance)：632(6)，496(12)，495(43)，437(6)，409(9)，329(6)，301(7)，248(18)，203(21)，119(70)，91(97)，55(100)；
1H NMR(500MHz，C5D5N，δin ppm)：5.455(1H，m，12-H)，4.077(1H，ddd，J＝9.5，7.0，4.0Hz，2β-H)，3.387(1H，d，J＝9.5Hz，3α-H)，2.614(1H，d，J＝11.5Hz，18β-H)，1.267、1.209、1.066 and 1.038(each 3H，s，4×CH3)，0.980(6H，s，2×CH3)，0.960(3H，d，J＝6.5Hz，19-CH3)
13C NMR数据(宽带去偶谱和DEPT谱，125MHz，C5D5N，δin ppm)(表1)表明X-3亦为熊果酸型三萜，比X-2多一个羟基[δC68.54(CH)，同碳氢(2β-H)δH4.07]取代，与3α-H的偶合关系表明该羟基是2α-OH；综合各种光谱分析结果，认为X-3应与2α-羟基熊果酸(亦即corosolic acid)[1]一致；
X-3的乙酰化物AcX-3，无色针晶，mp237-238℃，TLC显蓝紫色斑点；其光谱数据与结构分析如下：
IRνKBr maxcm-1：2973，2945和2875(νCH)；1743和1693(νC＝O)；1658(νC＝C)；1454，1370，1250，1152，1110，1039，962，920。
FABMS m/z：580(8)，579(23)，511(6)，437(16)，391(6)，248(18)，201(24)，189(28)，119(70)，91(94)，55(100)；
1H NMR(500MHz，CDCl3，δin ppm)：5.227(1H，m，12-H)，5.100(1H，ddd，J＝10.5，8.0，4Hz，3α-H)，4.753(1H，d，J＝10.5，2β-H)，2.184(1H，d，J＝11.5Hz，18β-H)，2.057 and 1.985(each 3H，s，2×CH3CO)，1.070(6H，s，2×CH3)，0.955，0.900，0.892 and 0.731(each 3H，s，4×CH3)，0.847(3H，d，J＝7.0Hz，19-CH3)；与X-3的氢谱对照表明，2个被乙酰化的羟基为2α-OH和3β-OH；综上分析，X-3可确定为2α-羟基熊果酸(2α-hydroxy ursolic acid)。
4X-4，C30H48O5，无色粒状晶体，mp240-243℃，TLC显蓝紫色斑点，极性比X-5略大。其光谱数据与结构分析如下：
IRνKBr maxcm-1：3571 and 3423(νOH)，2973，2938和2875(νCH)；1686(νC＝O)；1651(weak absorption，νC＝C)；1461，1384，1271，1236，1154，1110，1046，997，962，934。
EIMS(70eV)m/z(rel.abundance)：442(2)，246(2)，219(2)，205(5)，146(8)，119(5)，105(6)，72(24)，55(38)，43(100)；
FABMS m/z(rel.abundance)：512(4)，511(12)，397(6)，329(15)，307(15)，279(12)，235(5)，205(13)，176(58)，154(100)，107(50)，77(56)，55(65)；
1H NMR(500MHz，C5D5N，δin ppm)：5.581(1H，m，12-H)，4.953(1H，s，)，4.090(1H，ddd，J＝9.5，7.0，4.0Hz，2β-H)，3.370(1H，d，J＝9.5Hz，3α-H)，3.118(1H，ddd，J＝9.5，7.0，4.0Hz，)3.039(1H，s，18β-H)，1.705、1.432、1.265、1.104、1.078 and 1.017(each 3H，s，6×CH3)，1.120(3H，d，J＝6.5Hz，CH3)
X-4的乙酰化物AcX-4，无色针晶，mp228-230℃，TLC显蓝紫色斑点；其光谱数据与结构分析如下：
IRνKBr maxcm-1：2973，2938和2875(νCH)；1743(νC＝O)；1651(weakabsorption，νC＝C)；1454，1370，1250，1152，1039，962。
FABMS m/z：692(6)，596(10)，595(30)，526(6)，453(9)，407(11)，187(24)，145(38)，91(90)，55(100)；
1H NMR(500MHz，CDCl3，δin ppm)：5.329(1H，m，12-H)，5.100(1H，ddd，J＝10.5，8.0，4Hz，3α-H)，4.757(1H，d，J＝10.5，2β-H)，2.531(1H，s，18β-H)，2.060 and 1.984(each 3H，s，2×CH3CO)，1.254，1.200，1.061 and 0.715(each 3H，s，4×CH3)，0.948(3H，d，J＝7.0Hz，19-CH3)，0.899(6H，s，2×CH3)；与X-4的氢谱对照表明，2个被乙酰化的羟基为2α-OH和3β-OH；
将X-4与X-3的13C NMR数据(表1)对照，发现X-4比X-3多一个δC72.71的季碳，同时其18β-H信号成为单峰并向低场位移至3.090，说明相邻的19α-H被取代，成为19α-OH[δC72.71(C)]，综合各种光谱分析结果，认为X-4应与2α，19α-二羟基熊果酸(亦即corosolic acid)[1]一致。
5X-5，C18H16O8，无色粒晶；极性比X-4大，TLC对10％硫酸乙醇溶液显黑色，对5％三氯化铁显蓝黑色。其EI MS未出现分子离子信号，大质量碎片区内出现了苄基二酚碎片离子[(C7H7O2)+，m/z 123]基峰以及二羟基肉桂酸碎片[(C9H8O4)+，m/z 180，相对丰度20％]存在。1H NMR(500MHz，C5D5N，δin ppm)数据分析如下：
9.638，9.163，8.788和8.730(1H each，s，4×OH)；7.454(1H，d，J＝15.6Hz)和6.233(1H，d，J＝15.6Hz)表明含有反式肉桂酰的烯氢；7.045和6.665的微小裂分双峰(均为1H，J＝1.5Hz)与7.000(1H，dd，J＝8.4，1.5Hz)、6.757(1H，d，J＝8.0Hz)；6.626(1H，dd，J＝8.0Hz)、6.516(1H，dd，J＝8.4，1.5Hz)两组质子信号表明两个1，2，4-取代苯环的存在；此外5.020(1H，dd，J＝8，4Hz)和2.920(1H，ddd，J＝12.5，8，2Hz)揭示含有ArCH2CH(OH)片段，相应地X-5的13C NMR谱数据显示18个碳信号，其中有2个饱和碳(δ72.8的仲醇和δ32.1的亚甲基)。各化学位移值与迷迭香酸的一致(表1)；故推定X-7为迷迭香酸(Rosmarinicacid)[孙文基、绳金房主编.天然活性成分简明手册，488页，中国医药科技出版社，北京，1998年]。为首次从香茶菜属植物中分离获得的天然有机化合物。
经2.2.15细胞试验，2α-羟基熊果酸和2α，19α-二羟基熊果酸分别在125和250μg/ml浓度下对乙肝表面抗原HBsAg的分泌有明显抑制作用，抑制率分别为74.34％-85.84％和88.71％-97.58％，治疗指数分别为0.57和1.08；但对乙肝e抗原HBeAg的分泌没有明显影响，这与阳性对照品病毒唑在2.2.15细胞模型上的作用特点相似。
而迷迭香酸则有很强的抗氧化作用。其对由维生素C-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或由Fe2+-半胱氨酸诱发的大鼠脑、肝、肾微粒体的脂质过氧化都有强抑制作用，该作用是维生素E的102-103倍；并且有促纤维蛋白溶解活性；对单纯疱疹病毒也有一定的抑制作用[孙文基、绳金房主编.天然活性成分简明手册，488页，中国医药科技出版社，北京，1998年]。表1  溪黄草(狭基线纹香茶菜)中三萜成分的13C NMR(DEPT)数据
  C       X-2          X-3        X-4          X-5
  1       27.0         47.89CH2 47.84CH2    165.9C
  2       27.5         68.54CH    68.60CH      121.6CH
  3       76.8         83.73CH    83.88CH      148.6CH
  4       38.5         39.76C     39.52C       1’-170.8C
  5       54.8         55.85CH    55.98CH      2’-72.8CH
  6       18.0         18.77CH2 19.00CH2    3’-36.1CH2
  7       32.7         33.45CH2 33.55CH2    1”-127.3C
  8       38.4         39.97C     39.84C       2”-120.1CH
  9       46.8         48.03C     48.28C       3”-144.9C
  10      36.5         39.76C     40.44C       4”-145.9C
  11      23.3         23.67CH2  24.13CH2   5”-116.7CH
  12      124.6        125.49CH   127.97CH     6”-114.9CH
  13      138.2        139.27C    139.97C      1-125.4C
  14      41.6         42.48C     42.16C       2-121.6CH
  15      28.2         28.57CH2  28.47CH2   3-144.0C
  16      23.8         24.83CH2  24.13CH2   4-145.6C
  17      47.0         47.97C     48.28C       5-115.8CH
  18      52.4         53.45CH    54.60CH      6-113.3CH
  19      38.6         39.42CH    72.71C
  20      38.2         39.34CH    42.37CH
  21      30.2         31.02CH2  33.55CH2
  22      36.3         37.42CH2  38.47CH2
  23      28.2         29.30CH3  29.35CH3
  24      17.0         16.97CH3  16.77CH3
  25      15.2         17.45CH3  17.89CH3
  26      16.1         17.41CH3  17.26CH3
  27      22.8         23.86CH3  24.70CH3
  28      178.3        179.80C    180.61C
  29      16.9         17.62CH3  27.12CH3
  30      21.1         21.35CH3  21.35CH3
Figure A0213506900101
X-2 熊果酸(ursolic acid)R1＝R2＝HX-3 2α-羟基熊果酸(2α-hydroxy ursolic acid)R1＝OH，R2＝H
X-4 2α，19-二羟基熊果酸(2α，19α-dihydroxy ursolic acid)R1＝R2＝OH
X-5 迷迭香酸(rosmarinic acid)R＝H
实施例5：溪黄草提取物的抗病毒作用
(一)体外抗乙肝病毒实验
1材料和方法
1.1药物：狭基线纹香茶菜水提取物、狭基线纹香茶菜醇取提物、溪黄草醇提物乙酸乙酯可溶物，均为自制；三氮唑核苷(Ribavirin，病毒唑)，由湖北省医药工业研究所提供。
1.2 2215细胞：引自北京302医院病毒室，用DMEM培养液(GBICO公司产品)，培养液添加10％小牛血清，100u/ml青霉素，100u/ml链霉素，G418 100ug/ml(GBICO公司产品)，0.03％谷氨酰氨，用0.238％Hepes调pH至6.8。
1.3药物应用：用0.6％胰蛋白酶将2215细胞分散成单个细胞悬液，按3×104细胞/孔分种于96孔板，3-4d后换用含药培养液，每个浓度加四孔，药物与细胞作用四天后，再加10％DMEM(含G418)0.1ml/孔，第八天吸上清做ELISA测定HBsAg、HBeAg，余下细胞用MTT法测定药物细胞毒性，实验另设培养液空白对照组四孔。
1.4 MTT法测定药物对细胞生长的半数毒性浓度：药物与细胞作用四天后，再加10％DMEM(含G418)0.1ml/孔，第八天吸上清做ELISA测定HBsAg、HBeAg，余下细胞加入400ug/ml MTT0.1ml/孔(Sigma公司产品)，37℃5％CO2孵育4小时，可见黄黑色甲瓒颗粒，弃去MTT液，加入100％DMSO 0.1ml/孔，待甲瓒颗粒完全溶解(约10分钟)后，用紫外分光光度计570nm波长测定吸光度A值，空白对照加四孔100％DMSO 0.1ml/孔。细胞存活率(％)＝(实验孔A值/对照孔A值)×100％，50％毒性浓度(TC50)为实验孔存活细胞为对照孔50％时的药物浓度。治疗指数(TI)为评价药物临床应用前景的参数，TI＝TC50/IC50。
1.5 HBsAg、HBeAg的检测：采用华美公  ELISA测定盒检测。抑制率(％)＝[(对照孔P/N值一实验孔P/N值)/(对照孔P/N值-2。1)]×100％，50％抑制浓度(IC50)为HBsAg或HBeAg抑制率为50％时的药物浓度。
2..结果
2.1选择HBsAg、HBeAg作为药物效果的初步筛选指标，通过MTT法测定药物的细胞毒性浓度，并相应计算出治疗指数来评价药物临床应用前景，其中TI＞2为有效低毒，1＜TI＜2为低效有毒，TI＜1为毒性作用。研究结果显示，受试药物对细胞存活影响较小，治疗指数大于2(表1)，均属有效低毒，狭基线纹香茶菜提取物对HBsAg和HBeAg的分泌呈抑制作用。
表1：狭基线纹香茶菜三种提取物对HBsAg和HBeAg的抑制效果及其细胞毒性
           药物     TC50           HBsAg        HBeAg
  IC50   TI   IC50   TI
  溪黄草水提物(1)     ＞100   5.29   ＞18.90   8.51   ＞11.75
  溪黄草醇提物(1)     ＞100   0.34   ＞294.11   ＞100   -
  溪黄草醇提物乙酸乙酯可溶物     ＞100   0.16   ＞628.9   63.1   ＞1.58
注：浓度单位为mg/ml，(1)表示以生药量计，其余以样品量计。
(二)体内抗鸭乙肝病毒实验
    1 材料和方法
1.1 药物：狭基线纹香茶菜水提取物、狭基线纹香茶菜醇取提物、溪黄草醇提物乙酸乙酯可溶物，均为自制；无环鸟苷(ACV)由湖北省医药工业研究所提供。
1.2 动物：雄性一日龄广州麻鸭，购自广州辛村孵化场，批号96-4-17及97-12-4，体重40-50克/只，每组5-11只。
1.3 病毒：鸭乙型肝炎病毒DHBV-DNA强阳性血清，采自上海麻鸭，-70℃保存。
1.4 实验材料：鸭乙型肝炎病毒(DHBV)DNA质粒引自中国医学院医药生物技术研究所；NC膜购自Amersham公司；缺口翻译药盒为Promega公司产品；缺口翻译药盒购自promega公司；α-32p-dCTP，购自北京亚辉公司；Sephadex G-50，购自Pharmacia公司；96孔杂交点样器为美国Bio-rad公司产品；盖革氏计数器为美国S.E.International公司产品。
1.5 DHBV病毒感染及药物治疗试验：一日龄广州麻鸭，经腿静脉注射上海麻鸭DHBV-DNA阳性血清，每只0.2ml，在感染后13天取血，分离血清，-70℃保存待检。DHBV感染雏鸭13天后随机分组进行药物治疗试验，每组5-11只不等，给药组分狭基线纹香茶菜水提物和药材粉末胶囊，各一个剂量(10g/kg/天)组，以及狭基线纹香茶菜醇提物乙酸乙酯可溶物组，剂量为10mg/kg/天；均口服。1天2次，14天为一疗程。另设病毒对照组(DHBV)，以生理盐水代替药物，阳性药用无环鸟苷口服，给药200mg/kg/天，1天2次，14天一疗程，在感染后第13天即用药前(T0)，用药第7天(T7)用药第14天(T14)和停药后第3天(P3)，自鸭腿胫静脉取血，分离血清-70℃保存待检。
1.6 DHBV-DNA检测方法：取上述鸭血清，每批同时点膜，测定鸭血清中DHBV-DNA水平的变化，按缺口翻译试剂盒说明书方法，用32P标记DHBV-DNA探针，并作鸭血清斑点杂交，放射自显影膜片斑点，在酶标检测仪上测定490nm处OD值，计算血清DHBV-DNA密度。
2..结果
表2 狭基线纹香茶菜在鸭体内对DHBV-DNA的抑制作用实验    组别         鸭数                       OD490值(X±SD)批次                 (只)   T0          T7               T14              P3
    病毒对照组    5     1.53±0.11   1.37±0.43        1.36±0.21        1.10±0.331       狭基叶线纹香  11    1.36±0.29   1.24±0.33        0.97±0.35*Δ        1.13±0.41
    菜水提物
    (10g/kg)
    ACV200mg/kg   5     1.75±0.22   1.66±0.47*      1.19±0.24**     1.75±0.20
    病毒对照组    8     0.84±0.37   0.91±0.24        0.85±0.26        0.78±0.292       狭基线纹香茶  8     0.90±0.22   0.89±0.23        0.72±0.35        0.53±0.36*
    菜胶囊
    (10g/kg)
    ACV200mg/kg   7     0.95±0.24   0.26±0.13**ΔΔ     0.08±0.07**ΔΔ    0.63±0.19*
注：*与自身给药前(T0)对比P＜0.05，**与自身给药前(T0)对比P＜0.01，Δ与同期对照组比较P＜0.05；ΔΔ与同期对照组比较P＜0.01。结果表明：狭基线纹香茶菜水提物10g/kg/天剂量组给药14天(T14)时有显著体内降低DHBV感染鸭血清DHBV-DNA水平作用，给药7天(T7)亦能降低DHBV感染鸭血清DHBV-DNA水平，停药3天(P3)后病毒水平稍有反跳；而狭基线纹香茶菜胶囊10g/kg/天剂量组给药7天(T7)和给药14天(T14)时能降低DHBV感染鸭血清DHBV-DNA水平，停药3天(P3)后有显著降低DHBV-DNA水平作用，未见反跳现象。
表3狭基线纹香茶菜提取物在鸭体内对DHBV-DNA的抑制作用
组别          鸭数                        OD490值(X±SD)
              (只)     T0           T5               T10              P3
病毒对照组     8       1.48±0.28    0.98±0.39        1.39±0.35        1.46±0.34
溪黄草醇提物   8       1.57±0.26    1.07±0.45        1.13±0.47*      1.07±0.48*
乙酸乙酯可溶
物(10mg/kg)
ACV200mg/kg    6       1.56±0.48    0.13±0.07**ΔΔ      0.05±0.02**ΔΔ    1.84±0.31
注：*与自身给药前(T0)对比P＜0.05，**与自身给药前(T0)对比P＜0.01，Δ与同期对照组比较P＜0.05；ΔΔ与同期对照组比较P＜0.01。
结果表明：溪黄草醇提物乙酸乙酯可溶物10g/kg/天剂量组给药5天(T5)、10天(T5)和停药3天(P3)时有显著体内降低DHBV感染鸭血清DHBV-DNA水平作用，停药后3天未见有病毒水平反跳现象。
实施例6：溪黄草提取物对免疫肝损伤的保护作用
1.材料与方法
1.1药品：狭基线纹香茶草水提物为自制，卡介苗为购买品。
1.2将实验小鼠随机分组，造模组及用药组(15g/Kg体重)每只尾静脉各注射卡介苗(BCG，含菌量约5×106/只)0.2ml，对照组注射等容积生理盐水0.2ml。12天后每只尾静脉注射脂多糖(LPS，浓度约10ug/尾)0.2ml，用药组每日给药1次，感染BCG后12天，末次给药2h后，ivLPS10ug/鼠，16h后测血清转氨酶水平。
2.结果
实验结果见下表
表 狭基线纹香茶菜水提物对BCG+LPS诱导的小鼠免疫肝损伤的保护作用(x±s)组别           动物数(只)        剂量(g/Kg)   ALT(U/L)BCG+LPS对照组  11                -            117.36±81.90溶媒对照组     12                -            51.27±16.48*联苯双酯组     10                0.75         73.50±65.00*给药组         8                 15           59.75±74.10*
注：*与BCG+LPS对照组比较，p＜0.01。
实验结果表明，用BCG+LPS诱导的免疫性肝损伤模型鼠血清ALT活性明显升高，而狭基水提物能显著降低血清ALT水平，且接近溶媒对照组，说明狭基线纹香茶菜水提物对小鼠有很好的保护作用。
实例7  溪黄草水提物的利胆、免疫作用
1、材料和方法
1.1药物：狭基线纹香茶草水提物为自制；植物凝集素(PHA)，由暨南大学生物系提供，批号950425；去氧胆酸钠由上海中国生物化学试剂商店提供，批号910710；醋酸泼尼松由广东省制药工业公司华南制药厂提供，批号940703。
1.2动物：NIH小鼠，购自广东省卫生厅实验动物场。
1.3仪器：日立200-10分光光度计。
1.4对免疫力的影响实验
1.4.1对细胞免疫的影响
取体重18-22g NIH小鼠50只，♀♂各半，随机分为五组，按20ml/kg体重灌胃给药，每天一次，连续15天，于给药后7天，给各鼠肌肉注射PHA 10ml/kg体重，每天一次，连续3天，其中四组同时灌服醋酸泼尼松0.05ml/kg，每天1次，连续6天造模，并继续给药至15天，末次给药后12小时，按PHA刺激淋巴细胞转化试验——小鼠体内诱导法(3)取血，镜检并计算淋巴细胞转化情况。
1.4.2对体液免疫的影响
分组和给药方法与2.1.1相同，于给药后7天，ip 5％的生理盐水鸡红细胞混悬液0.2ml进行免疫，其中四组同时灌服醋酸泼尼松同2.1.1，并继续给药至15天，末次给药后12小时按鸡红细胞作免疫原的溶血素测定法(3)取血，用日立200-10分光光度计测定各鼠溶血素含量。
1.4.3对非特异性免疫力的影响
1.4.3.1对单核吞噬细胞功能的影响
分组和给药方法同2.1.1，于药后7天，其中四组灌服醋酸泼尼松0.05ml/kg造模同1.4.1，并继续给药至15天，末次给药后12小时，按小鼠碳粒廓清法(3)取血，用日立200-10分光光度计下测定计算各鼠吞噬指数(k)和吞噬活性(a)。
1.4.3.2选用16-20g小鼠，分组，给药，造模方法同2.2.1，于末次给药后12小时，按免疫器官重量法(3)剪取并称量免疫器官重量。
1.5利胆作用实验
选用220-250g♂SD大鼠，按麻醉大鼠胆法分泌量测定法(3)测定大鼠药前30min的胆法分泌量，然后由十二指肠给药，分别测定药后30，60，90min的胆法分泌量。
2.实验结果
2.1对免疫力的影响
2.1.1对细胞免疫的影响
实验结果表明，狭基线纹香茶菜可显著提高醋酸泼尼松致小鼠免疫低下时淋巴细胞的转化率，与模型组比较，P＜0.01，说明狭基线纹香茶菜有提高细胞免疫力的作用，结果见表一。
表一 对醋酸泼尼松致小鼠免疫力低下时淋巴细胞转化率的影响(n＝10，X±SD)组别            剂量        淋巴细胞％    过度期细胞％    淋巴细胞转化率％
            (g/kg体重)正常组          20ml        45.23±6.23   38.93±5.24     84.16±45.52模型+水组       20ml        30.40±                25.20±                   55.60±4.38###
                        7.14###      7.98###模型+狭基线纹香茶菜组      4.00        42.00±                31.00±9.07*  72.90±8.23***
                        9.94***
注：#指P值与正常组比较     *# P＞0.05
*指P值与模型组比较    **## P＜0.05
****###  P＜0.01(下同)
2.1.2对体液免疫的影响
实验结果提示，狭基线纹香茶菜对醋酸泼尼松致小鼠免疫低下时溶血素的含量无显著影响，P＞0.05；说明对体液免疫影响不大，结果见表二。
表二 对醋酸泼尼松致小鼠免疫力低下时溶血素的影响(n＝10，X±SD)组别                       剂量                       溶血素OD值
                       (g/kg体重)正常组                     20ml                       0.42±0.13模型+水组                  20ml                       0.21±0.15###模型+狭基线纹香茶菜组      4.0                        0.18±0.09*
2.1.3对非特异性免疫的影响实验
实验结果表明，狭基线纹香茶菜能增加胸腺重量，与模型组比较，P＜0.05，结果见表三、四。
表三 对醋酸泼尼松致小鼠免疫力低下时吞噬细胞吞噬力的影响(n＝10，X±SD)组别                   剂量             吞噬指数K            吞噬活性a
                   (g/kg体重)正常组                 20ml             0.0201±0.0032       5.2915±0.2765模型+水组              20ml             0.0058±0.0012###   3.4364±0.6819###模型+狭基线纹香茶菜组  4.00             0.0101±0.0028***   3.7640±0.7873*
表四 对醋酸泼尼松致小鼠免疫力低下时免疫器官的影响(n＝10，X±SD)组别                   剂量                脾                胸腺
                   (g/kg体重)          (mg/kg体重)       (mg/kg体重)正常组                 20ml模型+水组              20ml                39.11±8.39       13.96±2.66模型+狭基线纹香茶菜    4.00组                                         42.73±8.13*     17.35±4.04**2.1.4利胆作用实验
实验结果表明，狭基线纹香茶菜可显著增加大鼠胆汁排泄量，与对照组比较，P＜0.05，说明狭基线纹香茶菜有一定的利胆作用。结果见表五。
   表五 对大鼠胆汁排泄量的影响(n＝10，X±SD)组别               剂量                                胆汁排液量
               (g/kg        药前           药后差值
               体重)                       30min                60min               90min蒸馏水组           10.00     0.192±0.029                          ↓0.010±0.057       ↓0.026±0.076
                                           ↓0.002±0.067#狭基线纹香茶菜     6.00      0.190±0.057
                                           ↑0.080±0.124#    ↑0.092±0.076##    ↑0.092±0.079##组去氧胆酸钠组       0.06      0.162±0.067                                               ↑0.132±
                                           ↑0.144±0.034###  ↑0.104±0.069##
                                                                                     0.074###

Claims (4)

1、一种治疗肝炎的天然药物溪黄草提取物，其特征是制备方法之一为取溪黄草干品粗粉用甲醇或乙醇回流提取，提取液减压蒸发或浓缩除去溶剂，加适量水后用石油醚充分提取，石油醚不溶解的部分经蒸发或减压浓缩、冷冻干燥除尽溶剂，即得到溪黄草提取物；制备方法之二为取溪黄草干品粗粉，用超临界二氧化碳流体(内含2.5％-10％乙醇)，在50℃以下至室温，于超临界二氧化碳流体萃取釜内循环提取，提取物减压蒸发除去溶剂，加石油醚充分脱脂脱色，石油醚不溶解的部分经减压蒸馏冷冻干燥除尽溶剂，即得溪黄草提取物；制备方法之三为取溪黄草干品粗粉加水煎煮，提取液经蒸发或减压浓缩，真空冷冻干燥或喷雾干燥除尽溶剂，即得溪黄草提取物。
2、根据权利要求1所述的提取物，其特征在于溪黄草提取物含有抗乙型肝炎病毒活性成分2-羟基熊果酸和2，3-二羟基熊果酸，还含有保护肝细胞、抗氧化活性成分迷迭香酸。
3、根据权利要求1所述的提取物，其特征在于溪黄草提取物用于具有以下功效的治疗各种病毒性肝炎尤其是乙型肝炎相关的药物的制造：
(a)抑制鸭乙肝病毒DNA复制，抑制2.2.15细胞表达和产生乙肝炎标志物(乙型肝炎抗原)；
(b)对小鼠免疫性肝损伤有保护作用；
(c)有提高细胞免疫力的作用；
(d)能增加免疫低下实验动物的脾脏和胸腺重量；
(e)显著增加大鼠胆汁排泄量。
4、根据权利要求1所述的提取物，其特征在于溪黄草提取物可按常规工艺制成符合制剂要求的口服药物剂型如片剂、胶囊、颗粒、口服液或注射剂。
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