CN118615343B - 一种抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物及其制备方法与复合药物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物及其制备方法与复合药物，本发明先通过水提取方法得到溪黄草水提取物，然后以乙酸乙酯为溶剂进行萃取得到溪黄草提取物，体外实验表明，该方法富集溪黄草抗幽门螺杆菌的主要活性物质，对幽门螺杆菌标准菌株SS1具有显著的抑菌效果，最小抑菌浓度(MIC)为32μg/ml，显著抑制幽门螺杆菌标准菌株SS1生物膜形成，此外还发现，本发明的溪黄草提取物与临床治疗HP感染常用的抗生素联用，与甲硝唑和左氧氟沙星呈协同效应，与克拉霉素、阿莫西林呈相加效应，具有减少临床应用抗生素用量的效果，对于改善抗生素的耐药现状具有潜在的应用价值。与水提物相比，本发明提取得到的溪黄草提取物抗幽门螺杆菌的MIC大幅度变小，体外抗菌活性明显增强。

Description

一种抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物及其制备方法与复合药物

技术领域

本发明属于提取物及提取技术领域，具体涉及一种抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物的制备方法。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，Hp)是一种螺旋状、鞭毛状、微需氧的革兰氏阴性菌，它位于胃和十二指肠的各个部位，能持续定植于人类胃黏膜，几乎均可导致胃黏膜活动性炎症，在活动性炎症的基础上还可发生慢性胃炎、慢性萎缩性胃炎、消化性溃疡和胃癌等一系列常见疾病，长期慢性炎症可导致胃黏膜形态学和病理学改变，如不采取治疗措施，导致肠上皮化生和异形增生甚至癌变，严重地危害公众健康。幽门螺杆菌在世界范围内具有较高的患病率，被世界卫生组织(WHO)认定为classΙ致癌物。

目前，国内外根除Hp方案的主要包括标准三联和四联疗法，抗菌药物主要包括甲硝唑、克拉霉素、左氧氟沙星等。但随着抗生素的长时间使用和滥用，Hp耐药性越来越高，导致肠道菌群失调，且病人依从性差，副作用大。中药具有多成分、多途径、多靶点的作用特点，并且中药疗法耐药发生率低，不良反应少，患者服药依从性好，相比于传统抗生素疗法，中药疗法在抗Hp方面有着独特的优势。因此，从中药材中开发新的抗HP感染药物具有重要的意义。

溪黄草为唇形科香茶莱属植物线纹香茶菜的干燥全草，又名溪沟草，常生于山坡、田边、溪旁等地，其味苦，性寒，归肝、胆、大肠经，具有清热利湿，退黄，凉血散瘀之功效，可用于治疗湿热黄疸，胆囊炎，跌打伤痛、疮肿等。溪黄草的主要活性成分包括二萜类、黄酮类、酚酸类、多糖类、香豆素类等，具有保肝、抗癌、抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、免疫调节等多种药理活性。溪黄草长期以来一直被用作民间中药治疗黄疸、肝炎、急性胆囊炎和肠炎(Jun Wan,Hua-Yi Jiang,Jian-Wei Tang,et al.Ent-Abietanoids Isolated fromIsodon serra[J].Molecules,2017,22(02):309),其在广东、广西、江西、福建等南方地区已有悠久的使用历史,为临床及民间常用中草药,也是多种保健品、中成药的主要原料，如复方溪黄草颗粒、十味溪黄草颗粒、胆石通胶囊、消炎利胆片、参灵肝康胶囊等，它还是广式凉茶的重要成分，市场潜力较大(邱佳佳,刘军民,詹若挺,王德勤,徐友阳.基于UPLC-Q-TOF-MS和UPLC-DAD的不同品种溪黄草主要化学成分分析[J].中国中药杂志，2022，47(13)：3539-3547)。

目前尚未发现有溪黄草提取物抗幽门螺杆菌感染的相关研究。

发明内容

针对现有技术治疗幽门螺杆菌存在的不足，本发明提出了一种抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物的制备方法，该方法富集溪黄草抗HP的主要活性物质，从而大幅度地提高抗菌活性。

为此，本发明所采用的技术方案是：

本发明提供了一种抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物的制备方法，包括以下步骤：

S1、药材的处理：将溪黄草粉碎成药材粗粉。

S2、水提取：采用水提取的方法对步骤S1的药材粗粉进行提取，得到溪黄草水提物。

S3、乙酸乙酯萃取：以乙酸乙酯为溶剂，对步骤S2的溪黄草水提物进行萃取即可得到溪黄草提取物。

优选的，步骤S3所述的乙酸乙酯萃取方法为：步骤S3所述的乙酸乙酯萃取方法为：溪黄草水提物中加入乙酸乙酯，萃取至水层与有机层无明显颜色变化为止，合并萃取液，旋转蒸发仪浓缩即得溪黄草提取物。

进一步的，步骤S2的水提取方法为：按1:10的料液比往药材粗粉中加水，然后置于100℃下热回流提取3h，收集滤液经浓缩后得到溪黄草水提物。

优选的，步骤S1中，粉碎后的溪黄草过1～3号筛得到药材粗粉。具体地，粉碎后的溪黄草过2号筛得到药材粗粉。

本发明还提供了采用上述的制备方法制备得到的抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物；所述的溪黄草提取物作为制备抗幽门螺杆菌的药物的应用。

本发明还有一个技术方案是提供一种抗幽门螺杆菌的复配药物，包括上述方案制备的抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物，以及甲硝唑、左氧氟沙星、克拉霉素、阿莫西林中的至少一种。

进一步的，上述的抗幽门螺杆菌的复配药物，其特征在于，所述的抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物由抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物与甲硝唑按照质量比1：0.0125组成；或者由抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物与克拉霉素按照质量比1：0.0039组成；或者由抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物与阿莫西林按照质量比1：0.00049组成；或者由抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物与左氧氟沙星按照质量比1：0.0156组成。

与现有技术相比，本发明涉及的溪黄草提取物在制备抗幽门螺杆菌药物中的用途属于首次公开，其对幽门螺杆菌具有抑制活性，对幽门螺杆菌生物膜的形成有抑制作用，其可用于幽门螺杆菌感染的防治。

体外实验表明，该提取物具有很强的抗幽门螺杆菌的活性，对幽门螺杆菌标准菌株SS1具有显著的抑菌效果，最小抑菌浓度(MIC)为32μg/ml,并且对HP的抑制效果呈浓度依赖性，浓度越大，抑制效果越明显。该提取物还能够显著抑制幽门螺杆菌标准菌株SS1生物膜形成，此外还发现，本发明的溪黄草提取物与临床治疗HP感染常用的抗生素联用，与甲硝唑和左氧氟沙星呈协同效应，与克拉霉素、阿莫西林呈相加效应，具有减少临床应用抗生素用量的效果，对于改善抗生素的耐药现状具有潜在的应用价值。水提物最小抑菌浓度(MIC)为1024μg/ml，相比之下，本发明提取得到的溪黄草提取物抗幽门螺杆菌的MIC大幅度变小，体外抗菌活性明显增强，本发明方法得到的溪黄草提取物能够富集溪黄草抗Hp的主要活性物质，从而提高溪黄草提取物的抗菌活性。

附图说明

图1是本发明的溪黄草提取物作用72h对HP SS1生长的影响；

图2是本发明的溪黄草提取物抗HP SS1的时间-抑菌曲线；

图3是本发明的溪黄草提取物的结晶紫染色图：

图4是本发明的溪黄草提取物对的HP SS1生物膜形成的影响。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式做进一步说明，在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

除特殊说明，本实施例中所用的设备均为常规实验设备，所用的材料、试剂无特殊说明均为市售得到，无特殊说明的实验方法也为常规实验方法。

溪黄草购于安徽惠丰国药有限公司。

实施例1

本实施例提供的一种抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物的制备方法，包括以下步骤：

S1、将溪黄草粉清洗干净，晒干碎成药材粗粉，过1号筛得到药材粗粉；

S2、水提取：按1：14的料液比向药材粗粉中加水，然后置于100℃下回流提取3h，收集滤液后得到溪黄草水提物。

S3、乙酸乙酯萃取：在S2溪黄草水提物中加入溪黄草水提物体积2倍的乙酸乙酯，萃取至水层与有机层无明显颜色变化为止，合并萃取液，旋转蒸发仪浓缩即得溪黄草提取物。

实施例2

本实施例提供的一种抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物的制备方法，包括以下步骤：

S1、将溪黄草粉清洗干净，晒干碎成药材粗粉，过2号筛得到药材粗粉；

S2、水提取：按1：13的料液比向药材粗粉中加水，然后置于90℃下回流提取4h，收集滤液后得到溪黄草水提物。

S3、乙酸乙酯萃取：在S2溪黄草水提物中加入溪黄草水提物体积3倍的乙酸乙酯，萃取至水层与有机层无明显颜色变化为止，合并萃取液，旋转蒸发仪浓缩即得溪黄草提取物。

实施例3

本实施例提供的一种抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物的制备方法，包括以下步骤：

S1、将溪黄草清洗干净，晒干后用粉碎机进行粉碎，过3号筛得到药材粗粉；

S2、水提取：按1：12的料液比向药材粗粉中加水，然后置于110℃下回流提取1h，收集滤液后得到溪黄草水提物。

S3、乙酸乙酯萃取：在S2溪黄草水提物中加入溪黄草水提物体积3倍的乙酸乙酯，萃取至水层与有机层无明显颜色变化为止，合并萃取液，旋转蒸发仪浓缩即得溪黄草提取物。

实施例4

本实施例提供的一种抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物的制备方法，包括以下步骤：

S1、将溪黄草清洗干净，晒干后用粉碎机进行粉碎，过2号筛得到药材粗粉；

S2、水提取：按1：10的料液比向药材粗粉中加水，然后置于100℃下回流提取3h，收集滤液后得到溪黄草水提物。

S3、乙酸乙酯萃取：在S2溪黄草水提物中加入溪黄草水提物体积3倍的乙酸乙酯，萃取至水层与有机层无明显颜色变化为止，合并萃取液，旋转蒸发仪浓缩即得溪黄草提取物。

对比例1

本对比例提供的一种抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物的制备方法，包括以下步骤：

S1、将溪黄草清洗干净，晒干后用粉碎机进行粉碎，过2号筛得到药材粗粉；

S2、水提取：按1：10的料液比向药材粗粉中加水，然后置于100℃下回流提取3h，收集滤液后得到溪黄草水提物。

对比例2

本对比例提供的一种抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物的制备方法，包括以下步骤：

S1、将溪黄草清洗干净，晒干后用粉碎机进行粉碎，过2号筛得到药材粗粉；

S2、醇提取：按1：10的料液比向药材粗粉中加90％乙醇，然后置于100℃下回流提取3h，收集滤液后得到溪黄草醇提物。

对比例3

本对比例提供的一种抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物的制备方法，包括以下步骤：

S1、将溪黄草清洗干净，晒干后用粉碎机进行粉碎，过2号筛得到药材粗粉；

S2、按1:10的料液比药材粗粉中加入90％乙醇，然后置于100℃下热回流提取2h，收集滤液得到溪黄草醇提物。

S3、乙酸乙酯萃取：在S2溪黄草醇提物中加入溪黄草醇提物体积3倍的乙酸乙酯，萃取至水层与有机层无明显颜色变化为止，合并萃取液，旋转蒸发仪浓缩即得溪黄草提取物。

为了验证本申请提供的技术方案的效果，下面对实施例4、对比例1-3中的抗幽门螺杆菌的体外活性进行测试。

1.1材料

1)菌株：幽门螺杆菌标准菌株SS1。HP SS1由南方医科大学陈烨教授赠予，菌株保存在-80℃冰箱。

2)培养基和主要试剂：脑心浸液培养液(BHI)、哥伦比亚培养基、小牛血清(FCS)和无水乙醇。

3)主要仪器：恒温培养箱、多功能酶标仪、离心机和电子天平等。

1.2测定方法：按二倍稀释法配制多个浓度梯度的溪黄草提取物药液(512μg/mL、256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL等)，用含10％FCS的BHI培养液配制，分别吸取50μL上述药液加入到96孔板中，每个药物浓度设置3个复孔，并设置无菌对照孔(含10％FCS BHI培养液、不接种菌株)、生长对照孔(不含任何药物、只接种菌株)。从培养箱中取出菌株，用灭菌环刮取菌苔至含10％FCS BHI培养液中制成菌悬液，用BHI培养液调节菌悬液的浊度为1McF，稀释10倍后，于上述含药96孔板中每孔接种50μL，立即将96孔板置于厌氧盒中，并加入微需氧袋，37℃培养72h，观察结果并测试OD600吸光值。当生长对照孔(即不含药物)内细菌明显生长以及无菌对照组无菌生长时，且OD600吸光值测试结果趋势与肉眼观察浑浊度一致时，实验才有意义，可观察到澄清孔的最小药物浓度即为MIC，该实验重复3次。

结果见表1，由表1可知，实施例4的MIC小于对比例1-3，说明该方法得到的提取物富集了溪黄草抗HP的活性成分，从而使其抗菌活性增强。由图1可知无菌对照孔澄清、生长对照明显浑浊，该实验结果有意义，通过肉眼观察，实施例4的MIC为32μg/mL。

表1溪黄草不同提取方法获得的提取物对Hp SS1的最小抑菌浓度(MIC)

实施例5

一种抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物由实施例4制备的抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物与甲硝唑按照质量比1：0.0125组成；

实施例6

一种抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物由实施例4制备的抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物与与克拉霉素按照质量比1：0.0039组成；

实施例7

一种抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物由实施例4制备的抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物与与阿莫西林按照质量比1：0.00049组成；

实施例8

一种抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物由实施例4制备的抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物与左氧氟沙星按照质量比1：0.0156组成。

通过棋盘稀释法测定溪黄草提取物与抗生素联用对Hp SS1的效果。

1.测试样品：本发明的溪黄草提取物、阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星

2.测定方法：按二倍稀释法配制多个浓度梯度的溪黄草提取物药液(128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL)，并以相同的方法配制不同浓度的抗生素药液(阿莫西林0.031～0.25μg/mL、克拉霉素0.002～0.015μg/mL、甲硝唑1～8μg/mL、左氧氟沙星0.25～2μg/mL)。从培养箱中取出菌株SS1，用灭菌环刮下细菌至肉汤中，用含10％FCS的BHI培养液将菌悬液的浊度调节至1McF后稀释10倍，根据微量肉汤棋盘稀释法按照菌悬液：溪黄草提取物药液：抗生素药液＝2：1：1的比例于96孔板中每孔接种100μL菌悬液—溪黄草提取物药液—抗生素药液的混合液，然后放置于厌氧盒中，并加入微需氧袋，37℃培养72h，可以观察到明显澄清孔时的浓度为最小联合抑菌浓度，联合抑菌指数FICI＝MIC(联合给药的溪黄草提取物MI C)/MIC(单独给药的溪黄草提取物M I C)+MIC(联合给药的抗生素M I C)/MIC(单独给药的抗生素MIC)，当FICI≤0.5时，为协同效应；当0.5<FICI≤1时，为相加效应；当1<FICI≤4时为无关效应，FICI>4.0，拮抗作用。

由表2可知，本发明的溪黄草提取物与临床治疗Hp感染常用的抗生素联用时，与甲硝唑和左氧氟沙星呈协同效应，与克拉霉素、阿莫西林呈相加效应，联用可以降低抗生素的MIC，具有减少临床应用抗生素用量的效果，对于改善抗生素的耐药现状具有潜在的应用价值。

表2溪黄草提取物与抗生素联用抗Hp的效果

通过时间-抑菌曲线动态监测溪黄草提取物对HP SS1的抑菌效果

1.测试样品：本发明的溪黄草提取物。

2.测定方法：按二倍稀释法配制多个浓度梯度的溪黄草提取物药液(256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL)，以不含药液的肉汤(无药肉汤)作为生长对照组。从培养箱中取出菌株SS1，用灭菌环刮下细菌至脑心浸出液中制成菌悬液，用含10％FCS的BHI培养液将菌悬液的浊度调节至1McF后稀释10倍，按照菌悬液：药液/无药肉汤＝1：1的比例于6孔板中每孔接种2mL菌悬液—药液/无药肉汤的混合液，然后放置于厌氧盒中，并加入微需氧袋，37℃培养，在0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h吸取100μL培养液测量OD600nm，吸光度值越大则代表细菌数量越多。

3.由图2可知，溪黄草提取物对Hp的抑制效果呈浓度依赖性，溪黄草提取物浓度越大，抑制效果越明显，溪黄草提取物的浓度为32μg/mL时，基本抑制了Hp的增长。

溪黄草提取物对HP SS1生物膜形成的影响

1.测试样品：本发明的溪黄草提取物。

2.测定方法：

在48孔板的各组中加入200μL浓度为1×106CFU/mL的细菌悬浮液中，在37℃微需氧、饱和湿度环境下培养72h，形成Hp生物膜。吸去培养液上清，然后添加新鲜的培养基清洗和去除悬浮的Hp，按二倍稀释法配制多个浓度梯度的溪黄草提取物药液(256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL)，以不含药液的BHI作为生长对照组，在37℃的微需氧条件下敷育24h。待敷育结束时，吸去培养液上清，用200μL的PBS清洗培养板以除去细菌非粘附细胞，待干燥后，在室温下用0.1％(w/v)结晶紫染色15min。弃去结晶紫染色液，使用PBS清洗直至无颜色残留，在室温下干燥后加入75％乙醇溶液溶解，使用酶标仪测其在570nm处的吸光值以测量其生物膜量。

3.由图4可知，256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL溪黄草提取物能够显著抑制Hp生物膜的形成(p**＜0.01，p****＜0.001)。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将溪黄草粉碎成药材粗粉；

S2、水提取：分别采用水提取的方法对步骤S1的药材粗粉进行提取，得到溪黄草水提物；

S3、乙酸乙酯萃取：以乙酸乙酯为溶剂，对步骤S2的溪黄草水提物进行萃取即可得到溪黄草提取物。

2.根据权利要求1所述的一种抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物的制备方法，其特征在于，步骤S3所述的乙酸乙酯萃取方法为：在溪黄草水提物中加入乙酸乙酯，萃取至水层与有机层无明显颜色变化为止，合并萃取液，旋转蒸发仪浓缩即得溪黄草提取物。

3.根据权利要求2所述的一种抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物的制备方法，其特征在于，所述的乙酸乙酯与溪黄草水提物的体积比例为（2～4）：1。

4.根据权利要求1所述的一种抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物的制备方法，其特征在于，步骤S2的水提取方法为：按1：（10～14）的料液比向药材粗粉中加水，然后置于（90～110℃）下回流提取（1～4）h，收集滤液后得到溪黄草水提物。

5.根据权利要求4所述的一种抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物的制备方法，其特征在于，步骤S2的水提取方法为：按1:10的料液比药材粗粉中加水，然后置于100℃下热回流提取3h，收集滤液经浓缩后得到溪黄草水提物。

6.根据权利要求5所述的一种抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物的制备方法，其特征在于，所述浓缩是浓缩至药材粗粉与滤液的料液比为1:3。

7.根据权利要求1所述的一种抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物的制备方法，其特征在于，步骤S1，粉碎后的溪黄草过1～3号筛得到的药材粗粉。

8.采用权利要求1-7任一项所述的制备方法制得的抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物，其特征在于，所述的溪黄草提取物作为制备抗幽门螺杆菌的药物的应用。

9.一种抗幽门螺杆菌的复配药物，包括权利要求8所述的抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物，以及甲硝唑、左氧氟沙星、克拉霉素、阿莫西林的中的至少一种。

10.根据权利要求9所述的抗幽门螺杆菌的复配药物，其特征在于，所述的抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物由权利要求8所述的抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物与甲硝唑按照质量比1：0.0125组成；或者由权利要求8所述的抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物与克拉霉素按照质量比1：0.0039组成；或者由权利要求8所述的抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物与阿莫西林按照质量比1：0.00049 组成；或者由权利要求8所述的抗幽门螺杆菌的溪黄草提取物与左氧氟沙星按照质量比1：0.0156组成。