CN112472729B

CN112472729B - 香青藤在制备用于治疗人胶质瘤的药物中的应用

Info

Publication number: CN112472729B
Application number: CN202011506930.6A
Authority: CN
Inventors: 李冬梅; 韦洁; 施祝梅; 何俊慧; 何飞; 苏启表; 韦桂宁; 李懿; 韦冬梅; 李梦蝶
Original assignee: Guangxi Institute Of Chinese Medicine & Pharmaceutical Science
Current assignee: Guangxi Institute Of Chinese Medicine & Pharmaceutical Science
Priority date: 2020-12-18
Filing date: 2020-12-18
Publication date: 2022-03-29
Anticipated expiration: 2040-12-18
Also published as: CN112472729A

Abstract

本发明公开了香青藤在制备用于治疗人胶质瘤的药物中的应用，所述香青藤(Illigera aromaticfa S.Z.Huang et S.L.Mo)为莲叶桐科青藤属香青藤的干燥藤茎，对香青藤进行水提得到香青藤的水提物或采用有机溶剂对香青藤进行提取得到香青藤的有机溶剂提取物，提取方法为：取香青藤，加入溶剂进行浸泡处理，再加热进行提取，合并多次提取的药液进行浓缩即得。本发明首次发现香青藤及其提取物具有治疗人胶质瘤的成药潜力，可用于制备治疗人脑部肿瘤的药物，为人脑部肿瘤的内科治疗开辟一条新途径，且药物制剂的制备方法简单，成本低，成药经济效益好。

Description

香青藤在制备用于治疗人胶质瘤的药物中的应用

技术领域

本发明属于中医药技术领域，具体涉及一种香青藤在制备用于治疗人胶质瘤的药物中的应用。

背景技术

胶质瘤是指起源于神经胶质细胞的肿瘤，是最常见的原发性颅内肿瘤，WHO中枢神经系统肿瘤分类将胶质瘤分为WHOI-Ⅳ级，WHOI、Ⅱ级为低级别胶质瘤，Ⅲ、Ⅳ级为高级别胶质瘤。胶质瘤是全球最常见和死亡率最高的脑肿瘤，成年人中，胶质瘤占所有脑部肿瘤的30％～40％，占脑部恶性肿瘤的80％左右，具有高发病率、术后高复发性、高病死率及低治愈率的特点，即所谓的“三高一低”。由于胶质瘤在生物学行为上呈现浸润性生长，而且多位于脑的重要功能区，要在保证患者脑组织功能完整的情况下将肿瘤完全切除极为困难，所以药物对胶质瘤的防治显得极为重要。替莫唑胺是目前临床上唯一可单独用于胶质瘤治疗的一线药物(金标药)。但是包括替莫唑胺和传统的第一代抗胶质瘤药物卡莫司汀、洛莫司汀、丙卡巴肼和顺铂等均是细胞毒的烷化剂，具有毒副作用大、耐药性和疗效有限等严重不足，而且，新型靶向药物对胶质瘤的效果也不理想。因此，迫切需要研发新型抗胶质瘤药物。

现有研究发现：紫河车提取物可抑制人脑胶质瘤细胞增殖，并诱导其凋亡（惠青山,等.中医临床研究,2017,9(17)）。大黄素能通过阻滞细胞周期于G0/G1期而抑制胶质瘤SHG44细胞的增殖，降低细胞的体外迁移及侵袭能力（魏长杰,等.山西医科大学学报,2015,46(10)）。银杏叶提取物(GBE)可抑制人脑胶质瘤U251细胞增殖，并诱导其凋亡（李国臣.中国医学工程,2013,(5)）。半枝莲提取物(ESB)可能通过下调端粒酶活性抑制人脑胶质瘤U251细胞的增殖、诱导U251细胞凋亡（孟辉.中华神经医学杂志,2010,9(8)）。葡萄籽提取物F2不仅能显著抑制人恶性胶质瘤细胞U-87的增殖，还能通过抑制甲酰肽受体（FPR）激动剂fMLF诱导的U-87细胞的趋化而抑制肿瘤细胞迁移，能抑制其FPR的表达，是一种很有开发潜力的新型抗胶质瘤药物（张凤娇,等.沈阳药科大学学报,2008,(S1)）。专利申请CN106860456 A公开了市售普通的青藤碱(无需经碱溶并重结晶处理)对人源性胶质瘤U87MG和SF767细胞株具有抑制作用，并随剂量和时间的递增而提高。并且，本发明的青藤碱能够诱导自噬体的增加，能够增加自噬囊泡的数量，促进人胶质瘤细胞LC3B-Ⅱ的表达增加，能够诱导人胶质瘤细胞自噬性死亡，能够抑制U87MG细胞异种移植瘤生长。专利申请CN110575456 A公开了从乳香中提取得到的11-羰基-β-乙酰乳香酸( AKBA ) 对人胶质瘤细胞A172和人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的生长具有显著有抑制作用，可用作神经胶质瘤和乳腺癌的治疗药物。可见，现有公开文件中也提出了不少中药材的提取物在治疗人胶质瘤方面具有一定的活性的，由于中药具有副作用小、综合治疗能力强等优点，因此，开发中药材提取物的新应用，积极探索新的可治疗人胶质瘤的潜在药物靶标，寻找新型的治疗人胶质瘤的药物是当今临床亟需解决的重要问题。

香青藤(Illigera aromaticfa S.Z.Huang et S.L.Mo)为莲叶桐科青藤属香青藤的干燥藤茎，气香，味辛、凉，主要分布在广西，是我国特有的藤本资源。香青藤具有祛风除湿、行气止痛、舒筋活络等功效，用于风湿骨痛、跌打损伤、肥大性脊柱炎等。香青藤中含有糖、多糖、苷类、皂苷、有机酸、黄酮类、蒽醌类、香豆素、内酯、植物甾醇、三萜、挥发油、油脂等成分。目前针对香青藤研究较少，主要集中在香青藤的化学成分分析方面，另外，还有一些是从香青藤中提取抗肿瘤活性成分；如，专利CN107384983B公开一种通过罗杰斯无性穗霉(Clonostachys rogersoniana 828H2)固体发酵处理香青藤(Illigera aromatica)产生新的抗肿瘤细胞毒活性化合物dimericilligerates E-F的方法；专利CN107286172B公开了以香青藤藤茎为原料，经甲醇浸提、乙酸乙酯萃取、一次柱层析、二次柱层析、洗涤除杂五步制备得到一种阿朴啡生物碱Illigerine B，该化合物抑制肿瘤细胞活性明确，具有潜在的开发为抗肿瘤药物的价值；专利CN107043383B公开了以香青藤藤茎为原料，经甲醇浸提、乙酸乙酯萃取、一次柱层析、二次柱层析、三次柱层析、洗涤除杂五步制备得到一种阿朴啡生物碱Illigerine A，该化合物抑制肿瘤细胞活性明确，具有潜在的开发为抗肿瘤药物的价值。但是阿朴啡生物碱Illigerine A-B以及化合物dimericilligerates E-F的提取纯化方法复杂，成本高，且目前研究仅表明，阿朴啡生物碱Illigerine A-B高浓度时对人宫颈癌HeLa细胞，人乳腺癌Bcap37细胞及人肝癌SMMC7721细胞具有显著的体外增殖抑制作用，化合物dimericilligerates E-F对人白血病细胞HL-60、人肝癌细胞SMMC-7721、肺癌细胞A-549、乳腺癌细胞MCF-7和人结肠癌细胞SW480五株肿瘤细胞均具有良好的抑制作用，对于其他肿瘤是否具有抑制活性是未知的。所以，如何提高香青藤的利用率，使之产生最大的功效，发挥出应有的效能，仍是医学医药研究的主攻方向。

发明内容

本发明的目的是提供一种香青藤或其提取物在制备用于治疗人胶质瘤的药物中的应用，本发明首次发现香青藤及其提取物具有治疗人胶质瘤的成药潜力，可用于制备治疗人脑部肿瘤的药物，为人脑部肿瘤的内科治疗开辟一条新途径，且药物制剂的制备方法简单，成本低，成药经济效益好。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

香青藤或其提取物在制备用于治疗人胶质瘤的药物中的应用。

所述香青藤(Illigera aromaticfa S.Z.Huang et S.L.Mo)为莲叶桐科青藤属香青藤的干燥藤茎，香青藤提取物为香青藤的水提物或香青藤的有机溶剂提取物。

所述香青藤水提物的提取方法为：

（1）取香青藤，加入5～7倍质量蒸馏水先浸泡45～75min，然后加热至80～100℃提取45～75min，过滤，收集滤液；

（2）滤渣再加入5～7倍质量蒸馏水加热至80～100℃提取45～75min，过滤，收集滤液；

（3）重复提取滤渣1～3次，合并多次提取得到的滤液并进行浓缩，即得。

所述香青藤的有机溶剂提取物为香青藤的乙醇提取物，提取方法为：

（1）取香青藤，加入5～7倍量体积浓度为85～95%的乙醇先浸泡45～75min，然后加热进行回流提取45～75min，过滤，收集滤液；

（2）滤渣再加入5～7倍量体积浓度为85～95%的乙醇，继续加热进行回流提取45～75min，过滤，收集滤液；

（3）重复提取滤渣1～3次，合并多次提取得到的滤液并进行浓缩回收乙醇，即得。

以上所述的香青藤提取物选择性添加常规辅料，按照常规工艺制成临床可接受的用于预防或治疗人胶质瘤及其相关疾病的药物制剂。

所述制剂包括片剂、胶囊剂、滴丸或颗粒剂等。

所述的常规辅料包括淀粉、乳糖、微晶纤维素、糊精、磷酸钙、聚乙二醇-4000、聚乙二醇-6000、豆油、蜂胶、羧甲基纤维素钠、羟丙纤维素或交联聚维酮等中一种以上。

本发明的有益效果是：

1、本发明首次发现香青藤及其提取物具有治疗人胶质瘤的成药潜力，可用于制备治疗人脑部肿瘤的药物，为人脑部肿瘤的内科治疗开辟一条新途径。

2、本发明的香青藤资源丰富，提取制备方法简单易行，香青藤来源方便易得，可用于香青藤药材及其提取物的大量制备；成本低、污染小，利于节能减排条件下的大规模生产，产业化前景好。

3、本发明通过研究香青藤提取物对人胶质瘤细胞U87MG和U251的增殖抑制作用、诱导凋亡作用以及对人胶质瘤细胞U87MG侵袭能力的抑制作用，有力证明了本发明的香青藤提取物对人胶质瘤细胞具有明显的抑制和致亡作用。

4、本发明的香青藤或香青藤提取物还具有祛风活血的功效，可用于风湿骨痛、跌打损伤、肥大性脊柱炎等症，可以在用于预防或治疗人胶质瘤的同时起到治疗其他合并症的效果。

5、香青藤可以与其他药材进行配伍组成复方药用于预防或治疗人胶质瘤，还可以将香青藤提取物与辅料混合制成片剂、胶囊、滴丸或颗粒剂，这些制剂较为方便服用，能单独或者搭配其他药剂服用，通过内服能将药性通过血液快速输送至病症部位进行有效治疗。

附图说明

图1显示不同浓度香青藤提取物对人胶质瘤细胞U87MG存活率的影响作用；

图2显示不同浓度香青藤提取物对人胶质瘤细胞U251存活率的影响作用；

图3显示香青藤提取物对人胶质瘤细胞U87MG增殖的影响作用；

图4显示香青藤提取物对人胶质瘤细胞U251增殖的影响作用；

图5显示香青藤提取物对人胶质瘤细胞U87MG和U251凋亡的影响作用；

图6显示香青藤提取物对人胶质瘤细胞U87MG凋亡影响的统计学分析；

图7显示香青藤提取物对人胶质瘤细胞U251凋亡影响的统计学分析；

图8显示香青藤提取物对人胶质瘤细胞U87MG侵袭的影响作用；

图9显示香青藤提取物对人胶质瘤细胞U87MG侵袭能力影响的统计学分析。

具体实施方式

为了更加详细的介绍本发明，下面结合实施例，对本发明做进一步说明。

实施例1 香青藤提取物的制备

取香青藤1kg，加入6L蒸馏水浸泡60min，然后加热至80℃提取60min，过滤，收集滤液；滤渣再加入6L蒸馏水加热至80℃提取60min，过滤，收集滤液；滤渣再加入6L蒸馏水加热至80℃提取60min，过滤，收集滤液；合并3次提取液，浓缩至1.0～1.2g/mL，即得。

实施例2 香青藤提取物的制备

取香青藤1kg，加入6L蒸馏水浸泡60min，然后加热至90℃提取60min，过滤，收集滤液；滤渣再加入6L蒸馏水加热至90℃提取60min，过滤，收集滤液；滤渣再加入6L蒸馏水加热至90℃提取60min，过滤，收集滤液；合并3次提取液，浓缩至1.0～1.2g/mL，即得。

实施例3 香青藤提取物的制备

取香青藤1kg，加入6L蒸馏水浸泡60min，然后加热至98℃提取60min，过滤，收集滤液；滤渣再加入6L蒸馏水加热至98℃提取60min，过滤，收集滤液；滤渣再加入6L蒸馏水加热至98℃提取60min，过滤，收集滤液；合并3次提取液，浓缩至1.0～1.2g/mL，即得。

实施例4 香青藤提取物的制备

取香青藤1kg，加入7L蒸馏水浸泡75min，然后加热至80℃提取75min，过滤，收集滤液；滤渣再加入6L蒸馏水加热至90℃提取60min，过滤，收集滤液；滤渣再加入5L蒸馏水加热至98℃提取45min，过滤，收集滤液；合并3次提取液，浓缩至1.0～1.2g/mL，即得。

实施例5 香青藤提取物的制备

取香青藤1kg，加入6L体积浓度为90%的乙醇先浸泡60min，然后加热进行回流提取60min，过滤，收集滤液；滤渣再加入6L体积浓度为90%的乙醇，继续加热进行回流提取60min，过滤，收集滤液；滤渣再加入6L体积浓度为90%的乙醇，继续加热进行回流提取60min，过滤，收集滤液；合并3次提取液并进行浓缩回收乙醇成膏，即得。

实施例6 香青藤提取物片剂的制备

【处方】由实施例3的方法制得的香青藤水提物（取相当于香青藤药材3kg的量）、干淀粉550g；

【制备方法】将所得的香青藤水提物、干淀粉混匀，加入适量羧甲基纤维素钠、滑石粉，制成颗粒，干燥，压制成1000片，所得的香青藤提取物片，每片含香青藤药材3g。

以上所述的干淀粉、羧甲基纤维素钠和滑石粉均可在市场上购买得到。

实施例7 香青藤提取物胶囊的制备

【制备方法】将所得的香青藤水提物、干淀粉混匀，加入适量羧甲基纤维素钠、滑石粉，制成颗粒，干燥，分装成1000 粒，所得的香青藤提取物胶囊，每粒含香青藤药材3g。

以上所述的干淀粉、羧甲基纤维素钠和滑石粉均可在市场上售得到。

实施例8 香青藤提取物颗粒剂的制备

【处方】由实施例3的方法制得的香青藤水提物（取相当于香青藤药材10kg的量）、干淀粉550g；

【制备方法】将所得的香青藤水提物、干淀粉混匀，加入适量羧甲基纤维素钠、滑石粉，制成颗粒，干燥，分装成1000袋，所得的香青藤提取物颗粒，每袋含香青藤药材10g。

药性试验

为了验证本发明香青藤提取物治疗人胶质瘤的药效，本申请人进行了以下试验：

1、香青藤提取物对人胶质瘤细胞U87MG和U251存活率的影响

供试品：所述香青藤提取物均是由实施例3中所述方法制备而成。

处理方法：取对数期生长的人胶质瘤细胞U87MG和U251，以每孔2×10⁴个/mL的密度接种于96 孔细胞培养板中，培养12h待细胞贴壁后，加入含不同药物浓度的培养液，每孔100μL，同一浓度设置6个复孔。继续孵育细胞48h后，检测细胞存活率，通过SPSS 16.0统计软件计算得到。

结果：如图1-2所示，香青藤提取物作用于肿瘤细胞48h的IC50值为：1.25mg/mL（U87MG）；3.15mg/mL（U251）。

2、香青藤提取物对人胶质瘤细胞U87MG和U251增殖的影响

处理方法：取对数期生长的人胶质瘤细胞U87MG，以每孔2×10³个/mL密度接种于96孔细胞培养板中，培养12h待细胞贴壁后，设置正常对照组、香青藤提取物（IA）组（加入香青藤提取物1.50 mg/mL），每组6个复孔，继续置于细胞培养箱中培养。检测0、24、48、72、96、120h各孔的吸光度值。

取对数期生长的人胶质瘤细胞U251，以每孔2×10³个/mL密度接种于96孔细胞培养板中，培养12h待细胞贴壁后，设置正常对照组、香青藤提取物（IA）组（加入香青藤提取物2.50 mg/mL），每组6个复孔，继续置于细胞培养箱中培养。检测0、24、48、72、96、120h各孔的吸光度值。

结果：见图3-4，与对照组相比，香青藤提取物能显著抑制人胶质瘤细胞U87MG和U251的增殖，比较有统计学意义（**P<0.01）。

3、香青藤提取物对人胶质瘤细胞U87MG和U251凋亡能力的影响

处理方法：设置正常对照组、香青藤提取物高剂量组（1.5mg/mL）和香青藤提取物低剂量组（0.75mg/mL），每组6个平行孔，药物处理U87MG细胞48h后，胰酶消化收集细胞，PBS离心洗涤1次，加入Binding buffer 500μL重悬细胞，制成单细胞悬液后，依次加入5μLAnnexin V-FITC 和5μL PI，避光孵育，流式细胞仪测定凋亡率。

设置正常对照组、香青藤提取物高剂量组（2.50 mg/mL）和香青藤提取物低剂量组（1.25 mg/mL），每组6个平行孔，药物处理U251细胞48h后，胰酶消化收集细胞，PBS离心洗涤1次，加入Binding buffer 500μL重悬细胞，制成单细胞悬液后，依次加入5μL Annexin V-FITC 和5μL PI，避光孵育，流式细胞仪测定凋亡率。

结果：见图5-7，流式细胞分析结果显示，香青藤提取物对U87MG和U251细胞的凋亡率明显高于对照组（**P<0.01）。

4、香青藤提取物对人胶质瘤细胞U87MG侵袭能力的影响

在小室接种细胞前一晚将Matrigel（基质胶）在4℃过夜缓慢融化，用无血清RPMI1640培养基稀释成浓度为1:5，每个侵袭小室加100μL Matrigel稀释液，于37℃、5%CO₂培养箱中培养。调整细胞的浓度为1×10⁵个/mL，每个侵袭小室上室加100μL细胞悬液。实验组每个侵袭小室下室加500μL含香青藤提取物和10% FBS（胎牛血清）的RPMI1640培养基，对照组每个侵袭小室下室加500μL含10% FBS（胎牛血清）的RPMI1640培养基，放入培养箱培养24h后，取出小室用0.1%结晶紫溶液染色，置于显微镜下观察并拍照，随机选取6个低倍视野（10×）进行细胞计数，并计算平均值。

结果：见图8-9，与对照组相比，给药组细胞侵袭明显减少，显示香青藤提取物能明显抑制U87MG细胞的侵袭能力（**P<0.01）。

Claims

1.香青藤或其水提物在制备用于治疗人胶质瘤的药物中的应用，所述香青藤为莲叶桐科青藤属香青藤的干燥藤茎，所述香青藤水提物的提取方法为：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，香青藤水提物添加常规辅料，按照常规工艺制成临床可接受的用于预防或治疗人胶质瘤的药物制剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述制剂包括片剂、胶囊剂、滴丸或颗粒剂。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的常规辅料包括淀粉、乳糖、微晶纤维素、糊精、磷酸钙、聚乙二醇-4000、聚乙二醇-6000、羧甲基纤维素钠、羟丙纤维素或交联聚维酮中一种以上。