CN1323217A - 治疗性接种的新方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于诱导抗细胞抗原的细胞介导的免疫的方法。更具体地,本发明提供了一种用于诱导抗弱抗原特别是自身蛋白的细胞毒性T淋巴细胞免疫的方法。本发明方法包括诱导抗原呈递细胞以呈递所述弱抗原的至少一个CTL表位,并且同时呈递至少一个外源的T辅助淋巴细胞表位。在优选的实施方案中,抗原是癌特异性抗原,如PSM,Her2,或FGF8b。本发明方法不但可以通过传统的多肽接种,而且也可以通过用减毒活疫苗或核酸接种来实施。此外,本发明还提供了PSM,Her2和FGF8b的免疫原性类似物,以及编码这些类似物的核酸分子。也公开了载体和转化的细胞。本发明还提供了鉴定弱抗原或无免疫原性抗原的免疫原性类似物的方法。

Description

治疗性接种的新方法

本发明领域

本发明涉及对抗以无免疫原性的或弱免疫原性的细胞相关基因表达产物的存在为特征的疾病如癌症的新方法。本发明特别涉及诱导由细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)介导的免疫应答的方法，藉此CTLs攻击携带来自所述基因表达产物的表位的细胞并且杀死这些细胞。本发明也涉及制备衍生自弱免疫原性抗原的免疫原性修饰的多肽抗原的方法。

此外，本发明涉及本申请人的AutoVac技术(WO95/05849的主题)在抗癌的治疗性接种领域的一系列应用。

本发明背景

利用接种来抗癌症的想法几百年以来就一直存在并且经常发生活跃的爆发，尤其是进入本世纪以来。

但是，在过去10年中对免疫应答的基础分子机理的理解取得了相当大的进展。在此时期所实现的最重要的里程碑有仍然在不断增加的细胞因子和生长因子的发现，对T和B细胞相互作用机理的理解和对细胞抗原加工途径包括在抗原呈递中MHCⅠ类和Ⅱ类分子作用和结构的建立。关于癌症免疫学的重要发现----尽管还未完全理解----也阐明了在宿主中诱导免疫耐受的机理。为了发展对人类癌症的新的治疗方法，所有的这些研究取得了大量的成果。

根据患者如何获得肿瘤免疫，免疫治疗方式可被分为被动的或主动的。在被动免疫治疗方式中，患者被动接受免疫成分如细胞因子、抗体细胞毒性T细胞或淋巴细胞激活的杀伤细胞(LAK)。相反，特异的主动免疫治疗规程包含通过接种肿瘤细胞或其抗原成分来主动诱导肿瘤免疫。因为免疫被延长了，所以后一种治疗方式是优选的。

被动性或主动性癌症疫苗都已集中于诱导体液免疫应答或细胞免疫应答。对于主动性疫苗来说，已经很明确为了随后诱导抗体或者细胞毒性CD8⁺T细胞产生，CD4⁺T辅助细胞的诱导是必须的。

被动接种抗体

自从70年代中期发现单克隆抗体技术以来，已经发展了大量的针对肿瘤特异性的或肿瘤相关抗原的治疗性单克隆抗体。但是，治疗性单克隆抗体产生了几个严重的问题：

-----注射这些外源物质在患者体内诱发针对注射的抗体的免疫应答，可能在患者体内导致较低的治疗效率以及严重的过敏副反应。

-----通常情况下必须注射大量的单克隆抗体。由于单克隆抗体的制备花费巨大，所以这是一个问题。

-----单克隆抗体必须经肠胃外的途径施与并且由于所需要的量相对较大，在治疗期间患者必须频繁住院治疗。

-----为了维持治疗效果，重复注射单克隆抗体的间隔期必须相当短(几周)。

-----单克隆抗体通常情况下不能激活免疫系统的次级效应系统如补体、NK细胞或巨噬细胞杀伤肿瘤细胞。

后面的缺点在癌症治疗中特别重要并且这可能是为什么单克隆抗体治疗癌症在几个病例中不是特别成功的一个重要原因。现在许多公司使用的所谓人源化单克隆抗体的免疫原性较低，但是非常不幸的是它们在激活次级免疫效应系统的能力也较差。而且，由于这些抗体在不携带肿瘤抗原的肿瘤细胞上不能诱导“无辜的旁观者”效应，已经观察到缺少天然肿瘤抗原的继发的过度生长的肿瘤的实施例。

单克隆抗体的较差的效应器能力已经导致发展与不同的毒素或放射性同位元素化学结合的单克隆抗体。为达到在肿瘤中激活T细胞的目的，Pharmacia Upjohn AB已经发展出了一种肿瘤特异性的单克隆抗体和金黄色葡萄球菌毒A素结合的偶合物。为达到激活巨噬细胞杀伤肿瘤细胞的目的，Medarex公司已经发展出了包含一段肿瘤特异性Fab片段以及Fc受体特异性抗体片段的双特异性抗体。上述两构建物都比单独使用单克隆抗体更有效，但它们的免疫原性更强并且价格更贵。与放射性同位元素结合的单克隆抗体免疫原性也更强并且价格也更贵，并且观察到其它的普通毒素的副作用。

能使定义明确的、高亲和性结合分子产生的单克隆抗体技术的出现是一大进步。但是，作为单克隆这些抗体只与肿瘤抗原上的单一类型的表位反应。这是它们为什么不能激活补体系统或与NK细胞和巨噬细胞的Fc受体结合的主要原因。这些非常强大的效应器系统通常需要对从抗原上突出的多个Fc抗体片段进行共定位。

其他研究者因此试图组合使用两种单克隆抗体并且导致了效果的改善。因此，用针对肿瘤特异性的抗原，或针对肿瘤相关抗原(过量表达)或生长因子受体的高度特异性的多克隆抗体替代单克隆抗体来攻击肿瘤细胞似乎是合理的。这些抗体应能完全激活上面提到的次级效应系统。而且，由这些效应系统引发的局部炎症反应很有可能在讨论中的不表达肿瘤抗原的“无辜的旁观者”细胞上导致次级效应以及在肿瘤组织中肿瘤特异性的TIL(肿瘤浸润淋巴细胞)的激活。Medarex公司使用他们的双特异性的抗体偶合物已经观察到了这种效果。

自从单克隆抗体技术的发现以来，对于多克隆抗体在癌症治疗中的可能应用未进行深入探索(下面讲述的抗原除外)。一个主要原因是定义明确的肿瘤特异性的或肿瘤相关的表面抗原只是在最近几年内才被鉴定，但更重要的是这些抗原中的许多已被证明是自身抗原并且因此它们是无免疫原性的。所以，异源的多克隆抗体很有必要被用于研究其效果。但是，这些抗体诱导产生的针对注射入的外源多克隆抗体的强大的免疫应答迅速消除了治疗效果。

主动接种以诱导产生抗体

最近通过主动接种在癌症患者体内诱导治疗性的多克隆自身抗体已经获得成功。已经发展出抗膜上碳水化合物自身抗原(如O-连接的任意表达的Tn和sTn抗原，和神经节苷脂脂多糖GM2和GD3)的疫苗。但是，这些小的碳水化合物结构的抗原性很差，所以必须使用这些分子与载体分子如匙孔血蓝蛋白(KLH)或绵羊粘蛋白(包含Tn-和sTn)的偶合物。在黑素瘤患者中诱导抗GM2抗体的产生与延长的无疾病间隔期和最少跟踪访问51个月后的总体存活率有关。也使用sTn和KLH在DETOXB佐剂(BIOMIRA公司)中结合的偶合物在乳腺癌患者中进行了Ⅱ期的随机研究，结果显示sTn免疫的患者的平均存活期显著长于对照组患者。另外一个在癌症中主动诱导多克隆抗体的实施例是针对B细胞淋巴瘤使用独特型特异性接种，尽管这个方法一直很有希望，但它仅限于此种类型的癌症。

最后，美国Aphton公司已经发展出抗促性腺素释放激素(GnRH)和胃泌素的主动性偶合物疫苗。已经表明这种疫苗能够控制这些激素的生物学活性，对于某些类型的肿瘤细胞来说它也可以作为自分泌生长因子起作用。在胃肠道癌症患者中已经成功地实施了Ⅱ期临床实验，Ⅲ期临床实验正在进行中。

细胞毒性T细胞

几个研究组已经很清楚地表明肿瘤特异性细胞毒性T细胞(CTL’s)存在于许多肿瘤中。这些CTL’s被定义为肿瘤浸润淋巴细胞(YIL’s)。但是，这些细胞通过几种不同的可能的机制包括由肿瘤细胞分泌免疫抑制细胞因子、缺少共刺激信号、下调MHCⅠ类分子表达等产生无应答或无反应性。

曾经多次试图分离由TILs识别的肿瘤特异性HLAⅠ类分子结合的肽，在一些情况下获得了成功(如来自于黑素瘤相关抗原的肽)。这些肽一直被用于在宿主体内诱导肿瘤特异性的免疫应答，但是由于这些肽狭窄的HLAⅠ类分子结合特异性肿瘤特异性肽在疫苗中的实际应用仅局限于有限的部分群体。而且，由于这些物质的较短的生物半衰期以及异源接触MHCⅠ类分子的困难，通常很难用合成的肽在体内唤起CTL应答。

为了唤起肿瘤特异性的CTL应答已经尝试了许多其他方法，包括使用可溶性的或被转染的肿瘤细胞表达的细胞因子(如IL-2,IFN-γ,IL-6,IL-4,IL-10或GM-CSF)或共刺激分子(B7)。而且，使用同种异体的或自体的整个细胞接种，使用在特化的佐剂中制备的以MHCⅠ类分子抗原呈递途径呈递抗原的肿瘤抗原，或在痘苗载体等载体中表达的肿瘤抗原都获得了各种不同的成功。因此，肿瘤免疫学家仍然普遍认为诱导强大的、特异的抗肿瘤的CTL应答是消除肿瘤的最好方法。

除了这些治疗通常非常昂贵并且难于重复以外，它也已被证实很难获得针对肿瘤的好的免疫应答，这是因为许多肿瘤相关抗原是大多数T细胞对其耐受的真正的自身蛋白。因此，在患者体内诱导一个受到控制的细胞自身免疫状况显得很必要。

本发明的目的

本发明的一个目的是为在宿主机体内诱导抗不希望的抗原如肿瘤抗原的免疫应答提供改善的方法和药剂。本发明更进一步的目的是提供制备这些不希望的抗原的多肽类似物的方法，这些类似物能够诱导抗不希望的抗原的有效的免疫应答。

理论上认为对抗原的呈递使用两种不同的途径：Ⅱ类分子的外源性途径和Ⅰ类分子的内源性途径。

简要地说，来自细胞外或细胞膜上的外源蛋白质作为内涵体被抗原呈递细胞摄取，与含有蛋白水解酶和MHCⅡ类分子的细胞内代谢区融合。所产生的一些肽与MHCⅡ类分子结合，随后被转移到细胞膜上去。

Ⅰ类分子内源性途径以主要呈递胞质蛋白为特征。据认为是蛋白酶体介导的裂解随后肽被位于ER膜上的TAP分子转运到内质网(ER)内。在内质网中肽与Ⅰ类分子结合随后被转运到质膜上。

但是，这两种途径并不是完全不同的。例如，据我们所知树突状细胞和某些巨噬细胞能够内吞(胞饮)细胞外蛋白质并随后将其呈递给MHCⅠ类分子。此前也已经证明使用特化的施与疫苗的方法如与铁氧化珠偶连外源性的抗原也能够进入Ⅰ类分子途径(Rock,1996)。由于为了引发三种细胞类型簇在同一个抗原呈递细胞上同时表达Ⅰ类分子和Ⅱ类分子的重要性，这个机理似乎很重要。相互作用的这三种细胞类型簇已被Mitchison(1987)和后来其他作者所提出。他们显示了在同一个抗原呈递细胞上同时表达Ⅰ类分子和Ⅱ类分子的重要性。根据最近描述的CTL激活的机理(见Lanzavecchia,1998，自然，393:413,Matzinger,1999,Nature Med.5:616,Ridge等，1998，自然，393:474,Bennett等，1998，自然，393:478,Schoenberger等，1998，自然，393:480,Ossendrop等，1998，实验药学杂志，187:693，和Mackey等，1998，免疫学杂志161:2094)，抗原呈递细胞呈递在MHCⅡ类分子上的抗原被T辅助细胞所识别。这导致了抗原呈递细胞的激活(由T辅助细胞上的CD40L和APC细胞上的CD40的相互作用所介导)。这使得APC细胞能够直接刺激CTL细胞，后者因此被激活。见图2。

但是，我们得出结论认为被修饰的自身抗原----在合适的佐剂的帮助下----应该也能够诱导抗MHCⅠ类限制性的自身表位的强大的CTL应答，并且因此在WO95/05849中所描述的技术可适用于提供抗细胞外和其他细胞相关的表位被呈递给MHCⅠ类分子的抗原的接种。

在WO95/05849中所描述的自身疫苗技术具有以下效果，当一个被修饰的自身抗原被施与并被吸收入MHCⅡ类分子抗原呈递途径时，特异性的T细胞辅助被提供给自身反应性B细胞(见图1，和DalumⅠ等，1996，免疫学杂志157:4796-4804以及DalumⅠ等，1999，自然生物工艺学17:666-669)。识别自身抗原的可能的自身反应性B淋巴细胞生理性地存在于正常的个体体内。但是，为了诱导这些B淋巴细胞产生可以与相关的自身抗原反应的抗体，需要产生细胞因子的T辅助淋巴细胞的帮助(T_H细胞或T_H淋巴细胞)。正常情况并下不提供这种帮助，这是因为当被抗原呈递细胞(APCs)呈递时，T淋巴细胞一般情况下不识别来自自身蛋白的T细胞表位。但是，通过在自身蛋白中提供一种“异源”成分(即通过引入一个免疫学上显著的修饰)，一旦识别抗原呈递细胞(例如，首先是单核细胞)上的异源表位时，识别异源成分的T细胞就被激活。能够识别被修饰的自身蛋白上的自身表位的多克隆B淋巴细胞(有T细胞表位)也可以摄入抗原并且随后呈递其外源的T细胞表位，被激活的T淋巴细胞随后提供细胞因子给这些自身反应性多克隆B淋巴细胞。由于由这些多克隆B淋巴细胞产生的抗体可以与被修饰的多肽分子上的不同的表位反应，包括那些也呈现在天然多肽分子上的表位，所以诱导产生了一种与未经修饰的自身蛋白交叉反应的抗体。总之，如果多克隆B淋巴细胞群已经识别整个的异源抗原，T淋巴细胞就被激活作用，然而实际上只有插入的表位对于宿主来说是外源的。通过这种方式，诱导产生了可以与未经修饰的自身蛋白交叉反应的抗体。

如上所述，CTL’s也需要特异性T细胞的辅助，尽管尚不清楚其机制。

我们将本发明基于以下新理论，含有外源MHCⅡ类表位的自身蛋白被外源摄入以后，可以进入如巨噬细胞和树突状细胞的MHCⅠ类抗原呈递途径。通过这种方式，可以诱导产生抗自身蛋白中亚优势表位的强大的CTL应答。另外，编码被修饰的肿瘤抗原的基因可以作为核酸疫苗被接种，最终也导致产生了MHCⅡ类以及MHCⅠ类分子介导的免疫应答。

由于MHCⅠ类分子的不充分表达、缺少共刺激分子或免疫抑制细胞因子的分泌等，肿瘤细胞是非常弱的抗原呈递细胞。使用自身疫苗构建物和上面所述的接种方法肿瘤抗原可以被MHCⅠ类以及MHCⅡ类分子呈递在专门的抗原呈递细胞表面。MHCⅠ类分子上亚优势的自身表位和MHCⅡ类分子上外源的优势免疫表位的共同呈递可能介导一个由激活的MHCⅡ类限制性T辅助细胞给予MHCⅠ类限制性CTLs的直接的细胞因子辅助(图2)。我们认为这将会导致对针对肿瘤抗原的T细胞耐受状态的特异性打破，并且这正是在肿瘤免疫治疗中我们所期望的。

总之，使用上面所概述的技术的疫苗构建物可以诱导产生体液自身抗体应答，次级激活了补体活性和抗体依赖的细胞毒活性(ADCC)。我们也希望它能诱导产生针对肿瘤特异性膜抗原的细胞毒性T细胞应答。

因此，在最广泛的和最普通的范围以内，本发明涉及一种在动物包括人当中诱导抗多肽抗原免疫应答的方法，上述的多肽抗原在动物中是弱免疫原性的或无免疫原性的，本方法包含使来自动物免疫系统的抗原呈递细胞同时呈递免疫原性有效量的下列物质

1)至少一个来自多肽抗原的CTL表位和/或至少一个来自细胞相关抗原的B细胞表位，和

2)至少一个对动物来说是异源的第一T辅助细胞表位(T_H表位)。

在本发明方法的一个更特异的突变体中，本发明涉及一种在动物包括人当中下调细胞相关的多肽抗原的方法，上述的多肽抗原在动物中是弱免疫原性的或无免疫原性的，通过诱导产生抗在其表面携带有细胞相关多肽抗原的或在细胞内胞质区中含有细胞相关多肽抗原的细胞的特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答，本方法包含由合适的抗原呈递细胞(APC)在动物中实现同时呈递以下物质

1)至少一个来自细胞相关多肽抗原的CTL表位，和

2)至少一个对动物来说是异源的第一T辅助细胞表位(T_H表位)。

同样，制备免疫原性制剂的新策略也是本发明的一部分。这种新型策略包含选择和生产细胞相关弱抗原类似物，其中旨在保存大部分的已知的和预测的CTL表位，与此同时至少引入一个外源的T_H表位。

而且，本发明涉及某些基于已知的肿瘤相关抗原的特异性的免疫原性构建物，也涉及含有这些构建物的组合物。

最后，本发明涉及核酸片段、载体、转化的细胞和其他在生产肿瘤相关抗原的类似物的分子生物学方法中有用的工具。

附图的简要说明

图1：传统的AutoVac概念。A：由于T辅助细胞(T_H)所有组成成分(T辅助细胞用带点的线来表示)的耗竭，在抗原呈递细胞(APC)表面上MHCⅡ类分子呈递的耐受优势自身表位被忽略。呈递在MHCⅡ类分子上的插入的外源的免疫优势T细胞表位激活了对自身蛋白的天然部分特异的T辅助细胞和B细胞，呈递在MHCⅡ类分子上的外源的免疫优势T细胞表位被由T辅助细胞所提供的细胞因子帮助所激活。

图2：诱导CTL应答的AutoVac概念。呈递在MHCⅡ类分子上的插入的外源的免疫优势T细胞表位激活了T辅助细胞。识别呈递在MHCⅠ类分子上的亚优势自身表位的CTL’s被邻近的激活的T辅助细胞所激活。

图3:Her2多肽表位区和N端糖基化位点的示意图。4个细胞外功能区、跨膜区(TM)和2个细胞内功能区用不同程度的同源位点和含有推定的/明确的CTL表位的位点来表示。

图4：人PSM多肽P2和P30表位插入区的示意图。

图5:FGF基因和蛋白。A：人和鼠FGF8基因的外显子---内含子结构。其下举例说明了8个不同的剪接形式(自Gemel1996)。B:FGF8不同同种型的氨基酸序列。FGF8b,FGF8f和FGF8e独特的多肽序列分别用粗体、斜体或下划线字体表示。FGF8a是最短的突变体，不含有任何突出显示的序列。信号肽被希望在C末端22位丙氨酸处切断。在成熟的FGF8(所有的同种型)中发现的两个半胱氨酸残基用加粗的下划线表示。FGF8b的两个可能N---端糖基化位点用N.表示，数字根据FGF8b而定。

图6：举例表示计划用于自身疫苗的FGF8b的四种不同的突变体。上面一组：利用FGF2晶体结构做为模板的表位的插入点理论模型。下面一组：野生型FGF8b(WT)和四种突变体F30N,F2I,F30I和F2C的氨基酸序列。信号肽用单下划线标记。插入的肽用双下划线标记。所有突变体的N端序列(MetAla)是为了在真核系统中更好地翻译而产生的一段Kozak序列(Kozak1991)。

本发明的详细描述

定义

为了阐明本发明的边界和范围，在下面将定义和详细解释用于本详细说明和权利要求的许多术语。

在本详细说明和权利要求中“细胞相关的多肽抗原”指局限于某一种细胞以某种方式与一种病理性过程有关的多肽。而且，此细胞呈递此多肽抗原CTL表位使其与表面的MHCⅠ类分子结合。因此，细胞相关的多肽抗原确切地说是细胞内抗原(并且从而体液免疫应答不能达到)或结合在细胞表面的抗原。细胞相关的抗原可以是细胞自己基因的表达产物，细胞内寄生虫、病毒或另外一种细胞的表达产物。在后一种情况中多肽抗原与涉及到病理过程的细胞相关。

术语“T淋巴细胞”和“T细胞”将互换使用指胸腺来源的负责各种细胞介导的免疫应答以及在体液免疫应答中负责效应器功能如T辅助细胞活性的淋巴细胞。同样，术语“B淋巴细胞”和“B细胞”将互换使用指抗体产生淋巴细胞。

“抗原呈递细胞”(APC)是呈递表位给T细胞的细胞。典型的抗原呈递细胞有巨噬细胞、树突状细胞和其他的吞噬和胞饮细胞。应该注意的是B细胞通过呈递结合在MHCⅡ类分子上的T_H表位也可作为抗原呈递细胞起作用，但在本发明说明以及权利要求中普遍用到的术语APC指上面提到的吞噬和胞饮细胞。

“T辅助淋巴细胞”或“T_H细胞”指通过识别抗原呈递细胞上结合在MHCⅡ类分子上的T_H表位从而给B细胞和细胞毒性T细胞提供帮助的CD4⁺T细胞。

术语“细胞毒性T淋巴细胞”(CTL)指激活需要T_H细胞辅助的CD8⁺T细胞。

“特异性”免疫应答在本文中指主要针对一个分子或一组准相同的分子或，另外，针对呈递此分子或此组准相同的分子CTL表位的细胞的多克隆的免疫应答。

“弱或无免疫原性多肽抗原”在本文中指具有来自讨论中的动物的(例如人)细胞相关的弱蛋白质抗原的氨基酸序列的多肽，而且本术语也包括与分离自其他物种的这样的蛋白质的类似物具有相同氨基酸序列的多肽。由于在异源系统中产生(例如酵母或其他非哺乳动物真核表达系统或甚至原核系统)，所以具有不同糖基化特征的多肽也在本术语的范围之内。但是，应该注意的是，当使用本术语时，讨论中的多肽在待治疗的动物中的天然定位处通常是无免疫原性或仅具有弱免疫原性的。

术语“多肽”在本文中指2到10个氨基酸残基的短肽和11到100个氨基酸残基的寡肽，以及多于100个氨基酸残基的多肽。而且，本术语也包括蛋白质，即含有至少一个多肽的功能性的生物分子；当含有至少两个多肽时，它们可能共价连接或非共价连接形成复合物。蛋白质中的多肽可以是糖基化的和/或脂质化的和/或包含辅基。

术语“亚序列”指任何直接分别来自一天然发生的氨基酸序列或核酸序列的至少3个氨基酸或至少3个核苷酸的连续的一段序列。

术语“动物”在本文中普遍表示一种动物种类(优选哺乳动物)，例Homo sapiens,Canis domesticus等，并且不仅仅指一种动物。但是，本术语也表示某一动物物种的一个群体，因为考虑到根据本发明的方法使用同样的免疫原免疫动物，被免疫个体都完全具有同一种弱的、细胞相关的多肽抗原非常重要。例如，如果在不同群体中存在多肽的遗传突变体，为了在每一群体中打破对弱的、细胞相关的多肽抗原的自身耐受，就很有必要在不同的群体中使用不同的免疫原。

通过术语“下调一个细胞相关的多肽抗原”在本文中指在活的有机体中减少讨论中的抗原的数量和/或活性。可以通过几种原理获得负调节：在这些原理当中，使用抗体结合来干预抗原的活性位点是最简单的方法。但是，在动物体内由于抗体结合而导致游走细胞(例如巨噬细胞和其他吞噬细胞)除去多肽，并且更重要的，由CTLs细胞杀伤携带有或具有此抗原的细胞也在本发明的范围之内。

“由一个合适的抗原呈递细胞实现同时呈递”指动物的免疫系统以一种可以控制的方式经受免疫原性攻击，结果导致抗原呈递细胞同时呈递讨论中的表位。正如将要在下文中出现的一样，有很多方法可以实现这种对免疫系统的攻击，在这些方法中最重要的是使用含“药物疫苗”(即一种接种后可以治疗或缓解进行中的疾病的疫苗)的多肽接种或“药物疫苗”核酸接种。所要达到的最重要的结果是动物体内的免疫感受态细胞以一种免疫学有效的方式面对显示相关表位的抗原呈递细胞。

术语“免疫原性有效量”具有其在本领域中的普遍含义，即能够诱导免疫应答并能和与此免疫原共享免疫学特征的致病因子明显地反应的一定数量的免疫原。

当说到弱的细胞相关的多肽抗原已经被“修饰”在本文中指对构成讨论中多肽骨架的多肽的一个化学改变。这种修饰可以是例如从氨基酸序列中衍生出(如烷基化)某种氨基酸残基，但是正如将要在下文中所描述的那样，优选的修饰包含对氨基酸序列一级结构的改变。

当讨论到“耐受”和“自身耐受”时，可以理解为既然作为本发明目标的多肽在待接种群体中是自身蛋白或怒能诱导产生有效免疫应答的蛋白质，那么此群体中的正常个体不会产生针对此多肽的免疫应答。尽管如此，但并不能排除在一动物群体内某一偶然的个体可以产生抗天然的多肽抗原的抗体，例如作为自身免疫紊乱的一部分。在任何情况下，一个动物通常只对其自身的多肽抗原产生自身耐受，但这并不能排除上述的动物对来自其他物种动物或来自具有不同表型的另一群体动物的类似物也产生耐受。

“异源T细胞表位”是一个能在动物物种中结合MHC分子并能刺激T细胞的肽。优选的外源T细胞表位是“混栖”表位，即在某一动物物种或群体中能够结合大部分的MHCⅡ类分子的表位。目前仅知道非常有限的这种混栖T细胞表位，下面将会详细讨论它们。必须注意的是为了能够让根据本发明所用的免疫原在尽可能的大部分的动物群体中有效，它必须(1)在同一类似物中插入几个外源的T细胞表位，或(2)制备几种类似物，每种类似物中插入不同的混栖表位。还必须注意的是外源T细胞表位的概念也包含使用隐藏的T细胞表位，即来自一个自身蛋白并且只有在单独存在而不是自身蛋白一部分之时才表现免疫学行为的表位。

“外源T辅助淋巴细胞表位”(外源的T_H表位)是一个与MHCⅡ类分子结合并能与MHCⅡ类分子一起被呈递在抗原呈递细胞(APC)表面的外源T细胞表位。

“CTL”表位是能够与MHCⅠ类分子结合的肽。

(生物)分子的“功能性部分”在本文中指至少负责由此分子发挥的生物化学的或生理学效应之一的分子部分。在本领域众所周知的是，许多酶和其他效应分子都具有一个负责由讨论中的分子发挥的效应的活性位点。此分子的其它部分可能起一个增加稳定性或可溶性的作用，并且如果这些作用与本发明的某一实施方案无关的话，可以舍弃这些部分。例如在类似物中可能利用某种细胞因子作为修饰部分(见下面的详细讨论)，并且在此种情形下，既然与类似物的偶联提供了必需的稳定性，稳定性问题就无关紧要了。

术语“佐剂”具有其在疫苗技术领域的普遍含义，即一种物质或其某一组合物，它(1)自身不能产生抗疫苗免疫原的特异性的免疫应答，但是它(2)可以增加抗免疫原的免疫应答。或者，换句话说，仅仅用佐剂免疫不能引起针对免疫原的免疫应答，用免疫原免疫或许可以或许不能引起抗免疫原的免疫应答，但免疫原和佐剂组合使用所引起的抗免疫原的免疫应答比仅用免疫原所引起的免疫应答要强的多。

分子“寻靶”在本文中指一个分子一旦被引入动物体内就会第一出现在某些组织中或第一与某些细胞或细胞类型有关的情况。通过许多方式可以达到这种效果，包括将此分子配制进组合物中促进“寻靶”或在分子中引入促进“寻靶”的基团。下面将会很详细地讨论这个问题。

“刺激免疫系统”指某一物质或某种组合物显示出一种普遍的、非特异性的免疫刺激效应。许多佐剂和推定的佐剂(如某些细胞因子)具有刺激免疫系统的能力。使用免疫刺激剂的结果是免疫系统的“警觉性”增加，意味着与单独用免疫原免疫相比同时或随后用免疫原免疫诱发一个更为有效的免疫应答。

优选的实施方案

为了诱导针对呈递来自多肽抗原的表位在其表面上的细胞的CTL应答，通常情况下至少一种CTL表位，当被呈递时，与APC细胞表面的MHCⅠ类分子相关很必要。而且，优选的情况是至少一种第一外源T_H表位，当被呈递时，与APC细胞表面的MHCⅡ类分子相关。

优选的呈递表位的APCs有树突状细胞和巨噬细胞，但是根据本发明任何能够同时呈递1)与MHCⅠ类分子结合的CTL表位和2)与MHCⅡ类分子结合的T_H表位的吞噬或胞饮抗原呈递细胞也是优选的抗原呈递细胞。

根据本发明，细胞相关的多肽抗原优选自肿瘤相关抗原和其它与病理过程有关的自身蛋白，也优选自病毒抗原和来自细胞内寄生虫或细菌的抗原。本领域众所周知的是，这些致病原相关的抗原通常免疫原性相对较差(例如来自分支杆菌如结核分支杆菌和麻风分支杆菌的抗原，来自原生动物如恶性疟原虫的抗原)。据认为本发明方法，除了提出产生针对实际上是自身蛋白抗原的抗体和CTL应答之外，能够增强由有机体所产生的针对这样的细胞内抗原的通常不充分的免疫应答。

通常情况下，使免疫系统面对作为疫苗目标的多肽抗原的大部分氨基酸序列是有益的。因此，在一个优选的实施方案中，APC对CTL表位和第一外源T_H表位的呈递通过将至少一个细胞相关多肽抗原的第一类似物呈递给动物的免疫系统来实现，上述的第一类似物包含细胞相关多肽抗原氨基酸序列的一个突变，上述的突变含有至少一个CTL表位和第一外源T_H表位。这与例如DNA接种策略的情况形成鲜明对比，在DNA接种中CTL和T_H表位由同一细胞表达但却作为不同的多肽的部分；如此的DNA接种策略也是本发明的一个实施方案，但是据认为将两个表位作为同一个多肽分子的部分通常情况下会增强免疫应答，并且，无论如何，只有一种表达产物是必要的。

为了增加产生有效的免疫应答的可能性，优选的情况是上面所提到的第一类似物含有细胞相关的多肽抗原大部分的已知的和推测的CTL表位，即在一群体中一部分已知的和推测的CTL表位与足够部分的MHCⅠ类分子结合。例如，优选的情况是类似物的氨基酸序列中大部分的已知的和推测的CTL表位被至少50％的识别细胞相关的多肽抗原中所有的已知的和推测的CTL表位的MHCⅠ类分子单倍型所识别，但更高的比例如至少60％，至少70％，至少80％，和至少90％是尤为优选的。特别优选的情况是使用保留了细胞相关的多肽抗原中几乎所有的已知的CTL表位的类似物，即几乎100％的已知的CTL表位。因此，细胞相关的多肽抗原中几乎所有的推测的CTL表位都呈现在至少是第一类似物上也是特别优选的。

推测CTL表位存在的方法是本领域所众所周知的，见例如Rothbard等，EMBO J.7:93-100(1998)。

正如将在本说明和权利要求中所显而易见的那样，我们希望本文中所描述的本发明方法能够使有效诱导针对细胞相关的多肽抗原的CTL应答变得可能。

在细胞相关的多肽抗原实际上是细胞内蛋白的情况下，诱导抗含有此抗原的细胞的CTL应答是通过特异的免疫学的手段获得其负调节的唯一方法。但是，在膜相关抗原的情况下，诱导产生抗弱的、细胞相关的多肽抗原的抗体应答是有益的。然而，当提高抗弱的、细胞相关的体液免疫应答水平时，优选的情况是限制与抗原通常情况下暴露给抗体并与其相互作用的部分相互作用的抗体应答。另外，结果很可能是诱导产生了针对抗原通常情况下不参与体液免疫系统部分的抗体应答，并且这又会增加诱导产生与和任何病理学无关的抗原发生交叉反应的危险性。获得这种限制性的一个文雅的方法是用弱的、细胞相关抗原的一个类似物实施核酸接种，其中其细胞外部分或者未被改变或者含有一个并不改变抗原细胞外部分的三维结构的T_H表位。作为一种可能的选择，可以实施CTL支配的免疫原和B细胞支配的免疫原接种，其中B细胞支配的免疫原不能实现抗目标抗原细胞内部分的免疫(B细胞支配的免疫原可能是例如抗原上缺少任何非细胞外物质)。

被领域熟练技术人员熟知有许多方法可以诱导产生抗体应答。例如，至少一个第一类似物可能包含一个由细胞相关多肽抗原结构修饰所组成的部分，上述的修饰具有下述结果，用此第一类似物免疫动物在动物体内诱导产生了抗细胞相关多肽抗原的抗体-----如上所述的这种突变体尤其适用于核酸接种。另外，本发明方法涉及向动物的免疫系统呈递免疫原性有效量的含有这样一个修饰的细胞相关多肽抗原的至少一个第二类似物。为了使修饰获得期望的抗体诱导效应，一个便利的方法是在第二类似物中包含至少一个第二外源T_H表位，即与用于第一类似物相似的策略。

在也希望产生有效的体液免疫应答的情况下，第一和/或第二类似物包含大部分的细胞相关多肽抗原的B细胞表位是有益的，特别是在相关动物中大部分的如此的B细胞表位位于自然发生的抗原的外部。

上面所讨论的对弱的、细胞相关多肽抗原的突变和修饰可以采取不同的形式。优选的情况是突变和/或修饰涉及氨基酸替换和/或缺失和/或插入和/或添加。这些与一个氨基酸序列有关的基本操作包括单一氨基酸改变和涉及氨基酸几段序列的操作(在多肽抗原内改变氨基酸一段序列的位置；当抗原实际上是细胞内抗原时，这一点非常有趣，这是因为只有关于保存CTL表位的考虑是相关的)。引入例如单一氨基酸插入或缺失可能会导致在类似物序列中异源TH表位的出现，即MHCⅡ类分子结合序列的出现。但是，在大多数情况下优选(甚至是必须)引入一个已知的外源T_H表位，这样的操作需要氨基酸替换和/或插入(在某些情况下添加，通过分子生物学方法采取与载体蛋白或融合多肽结合的形式)。插入、缺失、替换或添加的优选的氨基酸数目至少是2，例如3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20和25个插入、替换、添加或缺失。替换的氨基酸数目最好不超过150，例如最多100，最多90，最多80和最多70。尤其优选的是替换、插入、缺失或添加的氨基酸数目不超过60，并在某些特别的情况下不超过50或甚至是40。最优选的情况是不超过30。

本发明优选的实施方案包括通过引入至少一个外源优势免疫T细胞表位而造成的修饰。将认识到一个T细胞表位的免疫优势取决于所讨论的动物物种。正如在本文中所用的，术语“免疫优势”仅指在被接种的个体/群体中产生一个明显的免疫应答的表位，但众所周知的事实是在一个个体/群体中占免疫优势的T细胞表位在同一物种的另一个体中就未必是免疫优势的，尽管在后者中它可以与MHCⅡ类分子结合。真正的免疫优势T_H表位是那些激活T_H细胞的表位，不依赖于在其中形成序列的多肽----换句话说，一些T_H表位从来都不是隐藏的，因为它们总是被APCs所处理并被呈递给抗原呈递细胞表面的MHCⅡ类分子。

另外很重要的一点是T细胞表位的MHC限制性。通常情况下，自然发生的T细胞表位是MHC限制性的，即组成T细胞表位的某一多肽只与MHCⅡ类分子的某一亚群有效结合。这又具有这样的效果，在大多数情况下使用一个特异的T细胞表位会导致一种疫苗成分只在一部分群体中有效，根据那部分群体的大小，有必要在同一分子中包含更多的T细胞表位，或另外制备一个多成分的疫苗，其中的组分是凭借所引入的T细胞表位的性质来区分彼此的抗原突变体。

如果对所用的T细胞的MHC限制性一无所知(例如在对被接种的动物的MHC组成不甚明了的情况下)，通过下列的公式可决定一个特异性疫苗成分能覆盖的群体比例：

其中Pi指对呈现在疫苗成分中的第i^th个外源T细胞表位的应答者占群体的频率，n是疫苗成分中外源T细胞表位的总数。因此，一个含有3个在群体中应答频率分别是0.8,0.7,0.6的外源T细胞表位的疫苗成分，会得出

                  1-0.2×0.3×0.4=0.976即97.6％的群体在统计学上会对此疫苗产生MHCⅡ类分子介导的应答。

上面的公式并不适用于对所使用的多肽的MHC限制性模式有或多或少精确了解的情况。例如，如果某一多肽只与由HLA-DR等位基因DR1,DR3,DR5和DR7编码的人MHCⅡ类分子结合，那么将此多肽与另一个可与由剩下的HLA-DR等位基因编码的MHCⅡ类分子结合的多肽混合使用足可以达到讨论的群体100％的覆盖率。而且，如果第二种肽只与DR3和DR5结合，加入这种肽根本不会增加覆盖率。如果将应答群体的计算仅仅以疫苗中的T细胞表位的MHC限制性为基础，凭借下列公式可决定由某一特异疫苗成分所覆盖的群体比例：

其中φ_j是编码MHC分子的可与疫苗中的任何一个T细胞表位结合并且属于第j^th个已知的3个HLA的部位(DP,DR和DQ)等位基因单倍型在群体中的频率之和。在实际应用中，应首先确定哪个MHC分子可识别疫苗中的每一个T细胞表位并且随后根据类型将它们列出(DP,DR和DQ)。然后，对每一种类型来说，列出来的不同等位基因单倍型的个体频率被相加，因此产生了φ₁,φ₂和φ₃。

可能会发生公式中p_i值超过相应的∏_i理论值的情况： ${\mathrm{\π}}_i=1-\underset{j=1}{\overset{3}{\mathrm{\Π}}}{(1-v_j)}^2$         (Ⅳ)

其中v_j是编码MHC分子的可与疫苗中的第i^th个T细胞表位结合并且属于第j^th个已知的3个HLA的部位(DP,DR和DQ)等位基因单倍型在群体中的频率之和。这意味着在1-∏i的群体中应答者的频率为f_剩余-i=(p_i-∏_i)/(1-∏_i).因此，调整公式Ⅲ就产生了公式Ⅴ：

其中，如果阴性的话，1-f_剩余-i的值设为0。必须注意的是公式Ⅴ要求相同的单倍型群所有的表位都作出单倍型图谱。

因此，在选择引入类似物中的T细胞表位时，将这些表位的现有的所有知识包括在内非常重要：1)群体对每一表位的应答频率，2)MHC限制性数据，和3)相关的单倍型在群体中的频率。

在一动物物种或动物群体的大部分个体中存在着许多有活性的、自然发生的“混栖”T细胞表位，并且这些“混栖”T细胞表位被优选引入疫苗，籍此降低在同一疫苗中使用很大数量的不同类似物的需要。

根据本发明，混栖表位可能是一自然发生的人类T细胞表位，例如来自破伤风类毒素(如P2和P30表位)、白喉类毒素、流感病毒血凝素(HA)和恶性疟原虫CS抗原的表位。

过去数年中，也已经阐明了许多其他的混栖T细胞表位。特别是可与大部分的由已经阐明的不同HLA-DR等位基因编码的HLA-DR分子结合的多肽，并且根据本发明在所使用的类似物中这些都是可能被引入的T细胞表位。见在下列参考文献中所讨论的表位，文献引入本文作参考：WO98/23635(Frazer IH等，转让给昆士兰大学)；SouthwoodS等，1998，免疫学杂志，160:3363-3373；Sinigaglia F等，1998，自然，336:778-780；Chicz RM等，1993，实验医学杂志，178:27-47；Hammer J等，1993，细胞，74:197-203；和Falk K等，1994，免疫遗传学39:230-242。后一参考文献还涉及到HLA-DR和HLA-DP配体。和与这些表位共享普通基序的表位一样，在这5篇参考文献中所列出的所有表位都是被用于本发明的相关的天然候选表位。

另外，此表位也可以是任何可以与大部分的单倍型结合的人工T细胞表位。根据本发明，本文中在WO95/07707和Alexander J等，1994，免疫1:751-761相应文章中所描述的泛DR表位肽(‘PADRE’)(文献引入本文做参考)都是待用的非常有趣的候选表位。应该注意的是，为了在施与疫苗时增加稳定性，这些文章中所公开的最有效的PADRE肽的C和N末端都带有D氨基酸。但是，本发明的基本目标在于将相关表位合并作为被修饰的抗原的一部分，此被修饰的抗原随后在APC细胞的溶酶体胞中被酶降解掉并随后呈递给MHCⅡ类分子，因此在本发明所用的表位中掺入D氨基酸是不利的。

一个特别优选的PADRE肽是具有AKFVAAWTLKAAA氨基酸序列或其免疫学效应序列的肽。这个以及其它同样缺乏MHC限制性的表位是优选的应该出现在本发明方法中所用的类似物中的T细胞表位。这个超混杂的表位将考虑到本发明中最简单的实施方案，其中仅单一的类似物被呈递给被接种动物的免疫系统。

上面所讨论的优选的突变/修饰的性质包含

------在第一和/或第二类似物中至少包含一个第一部分，上述的第一部分将类似物定位至抗原呈递细胞，和/或

------在第一和/或第二类似物中至少包含一个第二部分，上述的第二部分刺激免疫系统，和/或

------在第一和/或第二类似物中至少包含一个第三部分，上述的第三部分优化将类似物呈递给免疫系统。

将在下面详细讨论与这些第一、第二和第三部分有关的功能和结构特征。

它们可以以侧基团的形式共价或非共价结合在细胞相关多肽抗原或其亚序列的合适的化学基团上。这意味着在未改变氨基酸序列一级结构的情况下从多肽抗原衍生出一段氨基酸残基，或至少未引入链中各氨基酸之间肽键的改变。

这些部分也可以采取连接在来自细胞相关的多肽抗原氨基酸序列上的融合配偶体的形式。就此而言，应该提到双方的可能性包括将氨基酸序列与载体结合的选择，见下面关于这些的讨论。换句话说，在本发明中，术语“融合蛋白”不仅仅局限于通过表达编码构建物的DNA片段所制备的融合构建物，也不仅仅局限于在后来的化学反应中通过肽键连接两个蛋白质而形成的结合物。

如上所述，类似物也可包括引入使类似物定向至APC或B淋巴细胞的第一部分。例如，第一部分可以是B淋巴细胞特异性的表面抗原或APC特异性表面抗原的一个特异的结合配偶体。本领域已经知道很多这样的特异的表面抗原。例如，这个部分可以是在B淋巴细胞或APC细胞上有受体的碳水化合物(如甘露或甘露糖)。另外，第二部分可以是半抗原。可特异性识别APCs或淋巴细胞表面分子的抗体片段也可被用做第一部分(表面分子可以是例如巨噬细胞或单核细胞的Fcr受体，如FcrRⅠ或，另外其他任何特异的表面标志如CD40和CTLA-4)。应该注意的是，所有这些可仿效的寻靶分子也可被用做佐剂的一部分，见下。CD40配体、CD40抗体或其能和CD40结合的突变体将类似物定位至树突状细胞。与此同时，最近的结果表明CD40分子之间的相互作用提出T_H细胞对于获得CTL应答来说不是本质的。因此，我们考虑认为CD40结合分子普遍用做第一部分(或作为佐剂，见下)将大大增强CTL应答；实际上，使用这样的CD40结合分子作为佐剂或“第一部分”在本发明中的意义中是独创性的。

为了获得增强的免疫应答，作为将类似物定位至某一类型细胞的替代或补充方法，可能凭借将上面所提到的刺激免疫系统的第二部分包括在内来提高应答水平。这样的第二部分的典型例子是细胞因子、热休克蛋白和激素以及其有效部分。

根据本发明待用的合适的细胞因子通常情况下也可作为疫苗成分的佐剂起作用，例如γ干扰素(IFN-γ)，Flt3配体(Flt3L)，白细胞介素1(IL-1)，白细胞介素2(IL-2)，白细胞介素4(IL-4)，白细胞介素6(IL-6)，白细胞介素12(IL-12)，白细胞介素13(IL-13)，白细胞介素15(IL-15)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；另外细胞因子分子的功能性部分也足以用做第二部分。关于将这些细胞因子用做佐剂物质，见下面的讨论。

另外，第二部分也可以是一种毒素，例如李斯特氏菌毒素(LLO)、脂质体A和热稳定的内毒素。一些分枝杆菌衍生物如MDP(胞壁二肽)、CFA(完全弗氏佐剂)和海藻糖双酯TDM和TDE也是有趣的可能用做第二部分的物质。

根据本发明，适于用做第二部分的合适的热休克蛋白有HSP70,HSP90,HSC70,GRP94和CRT(钙网蛋白)。

引入一个可以增加类似物呈递给免疫系统的第三部分也是本发明的一个重要的实施方案。本技术领域已经出现了几个这种原理的实施例。例如，据我们所知，在burgdorferi疏螺旋体蛋白OspA上的棕榈酰基脂质化锚蛋白可被利用以提供自身佐剂多肽(见，例WO96/40718)。似乎脂质化的蛋白带有一个由多肽的脂质化锚部分组成的核心，分子的剩余部分从其中突出从而形成一个胶囊样的结构，导致对抗原决定簇的多重呈递。因此，使用这种以及相关利用脂质化锚的方法(例如，肉豆蔻基，法呢基，香叶-香叶基，GPI锚和N酯酰甘油二酯基)是本发明的优选实施方案，特别是因为在重组产生的蛋白质中提供这种脂质化锚很直接并且仅仅需要使用如自然发生的信号肽序列作为类似物的融合配偶体。另外一种可能是使用补体成分C3的C3d片段或C3本身(见Dempsey等，1996，自然271:348-350和Lou&Kohler,1998，自然生物工艺学16:458-462)。

当试图利用本发明方法对付暴露在细胞外部分的膜结合多肽抗原时，最优选的情况是第一和/或第二类似物实质上具有细胞相关的多肽抗原的总体三级结构，知道这一点很重要。在本说明和权利要求中的意思是多肽抗原暴露在细胞外部分的总体三级结构被保留下来，这是由于，如上所述，专性细胞外多肽的三级结构不参与体液免疫系统。实际上，作为接种策略的一部分，常常希望避免来自多肽抗原细胞内部分的推测的B细胞表位暴露在细胞外；通过这种方式，可以降低由与其他抗原发生交叉反应而引起的可能的副作用。

为了本发明的目的，如果在多肽抗原中引入的突变/修饰(插入、添加、缺失或替换)产生了一个异源的T细胞表位并且与此同时保留了大多数的CTL表位(有时是大多数的B细胞表位)，那就足够了。

下面的公式描述了本发明普遍涵括的构建物：(MOD₁)_s1(PAG_e1)_n1(MOD₂)_s2(PAG_e2)_n2....(MOD_x)_sx(PAG_ex)_nx  (Ⅰ)

其中PAG_e1--PAG_ex是含有相关多肽抗原亚序列的X个相同或不相同并且包含或不包含外源侧链基团的CTL和/或B细胞表位。X是一个大于等于3的整数。n1---nX是X个大于等于0的整数(至少一个大于等于1)。MOD₁---MOD_x是在保存的表位中引入的X个修饰，s1---sx是X个大于等于0的整数(如果在序列中没有引入侧链基团则至少有一个大于等于1)。因此，在对构建物的免疫原性做了一个普遍的功能性的限制之后，本发明也考虑到天然序列的所有各种排列，以及其中的所有种类的修饰。因此，包括在本发明中的是通过忽略在体内起副作用的多肽抗原的部分序列或通过忽略部分正常情况下位于胞内并且可能因此引起预料不到的免疫学反应的序列而获得的类似物，见下面的详细讨论。

上述原理的进一步解释包括使用来自几个病理学相关的抗原的CTL和/或B细胞表位。例如，有几种癌症相关抗原只有在以突变形式存在时才具有致癌作用-----例如突变的作为正常细胞循环调节的关键蛋白并且是大多数正常细胞表达产物的K-ras和P53。在某些情况下，已经表明CTLs细胞识别来自这些抗原的突变的肽。因此，如果开始抗原特异性免疫治疗，免疫系统只对突变的肽发生应答而不对未突变的部分应答是很重要的。

我们设计了一个策略，藉此如此疾病相关蛋白的8至25氨基酸的序列可能在一个AutoVac构建物中也被用做表位----在优选实施方案中，在引入表位的同时为最终构建物中T_H表位的出现作准备，见上面的讨论。用做这种目的的表位可以含有疾病相关蛋白的突变区。通过利用这样的方法，可能能够产生只针对疾病相关抗原突变区的CTLs细胞(和可能是抗体)。在疾病相关抗原为T_H表位的出现做准备的情况下，使用正确的外源T_H表位可被完全忽略。本原理的一个实施方案是，例如使用一种编码多肽抗原(例Her2和PSM)类似物的核酸疫苗接种，其中已经引入至少一个T_H表位和至少一个来自另外的疾病相关抗原的表位(例如一个来自致癌蛋白突变部分的肽)。在一个优选实施方案中，至少一个T_H表位是作为引入肽的后果而被引入的。

因此，优选的情况是突变和/或修饰包括当适用时复制至少一个B细胞表位，或细胞相关多肽抗原的至少一个CTL表位。这个策略的结果是优选的表位区的多重拷贝被呈递给免疫系统，从而使产生一个有效的免疫应答的可能最大化。所以，本发明的这个实施方案利用来自多肽抗原的表位的多重呈递(即公式Ⅰ，其中至少一个B细胞表位出现在两个位置上)。

可以凭借不同方法达到此效果，例如通过简单制备包含PAG_m结构的融合多肽，其中m是一个大于等于2的整数，并随后在多肽抗原序列的至少其中之一引入在本文中讨论的修饰。

本发明的另外一个实施方案将抗原、亚序列或其突变体与某些分子共价偶联，从而导致对此抗原重要表位区的多个拷贝的优选呈递。例如，可以使用聚合物，例如碳水化合物如葡聚糖，见如Lees A等，1994，疫苗12:1160-1166；Lees A等，1990，免疫学杂志145:3594-3600。而且甘露聚糖和甘露糖也是有用的替代物。从如大肠杆菌和其他细菌来源的完整的膜蛋白也可是有用的结合配偶体，传统的载体分子例如KLH，破伤风类毒素，白喉类毒素和牛血清白蛋白BSA也是优选的有用的结合配偶体。

可以通过几种方法维持有时有益的大部分的B细胞表位或者甚至是易于被引入文中所讨论的修饰的蛋白质的总体三级结构不变。其中一种方法是简单制备抗多肽抗原的多克隆抗血清(例如在兔子中制备的抗血清)，并且此后使用此种抗血清作为抗所产生的被修饰蛋白的测试试剂(如，在竞争性ELISA中)。与抗血清反应的程度和多肽抗原相似的被修饰的模本(类似物)则被认为是具有与多肽抗原相同的总体三级结构；而与抗血清显示出有限的(但仍然显著的和特异的)反应性的类似物被认为是保持了大部分的天然B细胞表位。

另外，可以选择制备可与多肽抗原上清楚的表位反应的单克隆抗体并且用于一系列测试。这种方法的优点是给予了(1)所讨论的多肽抗原的的表位图谱，和(2)在制备的类似物中保持的表位图谱。

当然，第三种方法可以解决多肽抗原或其生物活性截短部分的三维结构(见上)，并且将其与已经解决了三维结构的所制备的类似物的三维结构比较。在X一射线衍射研究和NMR光谱学的帮助下，可以解决其三维结构。为了提供给定分子的有用的三级结构信息，其他有关三级结构的信息在一定程度上可以从具有仅需要纯度较高的多肽的优点的圆二色性研究中获得(而X射线衍射需要晶体化的多肽并且NMR需要多肽的同位素突变体)。但是，由于圆二色性研究只能凭借其二级结构的信息提供关于正确的三维结构的间接的信息，最终结论仍需要用X射线衍射和/或NMR法获得。

基本上来说，目前有三种可行的方法将相关的多肽呈递给免疫系统：传统的使用多肽抗原的亚单位接种，施与遗传学改变的活疫苗，和核酸接种。下面将分别讨论这三种方法。

多肽接种

这需要对所讨论的动物接种免疫原性有效量的至少一个第一类似物，和当相关时，接种免疫原性有效量的至少一个第二类似物。优选的是，此至少一个第一和/或第二类似物与药物学和免疫学可接受的载体和/或运送工具和，任选的佐剂配制在一起使用。

当通过给予动物类似物来实现向动物的免疫系统呈递此类似物时，多肽的配制遵循本领域所普遍认可的原理。

制备含有多肽序列作为活性成分的疫苗是本技术领域所普遍熟知的，正如在美国专利4608251,4601903,4599231,4599230,4596792和4578770中举例说明的那样，专利引入本文做参考。典型的是，这些疫苗被制备为可注射的溶液或悬液形式，适于溶液中或悬液中的固体形式，也可制备为注射前的液体形式。制备物也可被乳化。活性的免疫原成分常与药物学上可接受的并与此活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂有，例如水、盐、葡萄糖、甘油、酒精或其类似物以及它们的组合物。此外，如果需要的话，疫苗可以含有少量的辅助物质例如加湿剂或乳化剂、pH缓冲剂或增强这些疫苗效果的佐剂；见下面关于佐剂的详细讨论。

通常用传统的肠胃外的方式施与疫苗，例如通过皮下、皮内或肌肉注射。适于其他接种方式的另外的剂型包括栓剂和在一些情况下口服、口腔、舌下、腹膜内、阴道内、肛内和颅内剂型。对于栓剂而言，传统的粘合剂和载体可能包括，例如聚乙二醇和甘油三酸酯；这些栓剂可能形成自含有0.5％到10％，优选1-2％活性成分的混合物。口服剂型包括这些通常使用的赋形剂如制药等级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖化钠、纤维素、碳酸镁及其类似物。这些组分采用溶液、悬液、药片、药丸、胶囊、持久释放的剂型或粉末的形式并且含有10-95％，优选25-70％的活性成分。对于口服剂型而言，白喉类毒素是一种非常有趣的剂型配偶体(并且也是一种可能的结合配偶体)。

多肽可能以中性或含盐的形式被配制进疫苗之中。药物学上可接受的盐包括添加酸的盐(由肽的自由的氨基组成)并且其由无机盐例如盐酸或磷酸或诸如醋酸、草酸、酒石酸和苦杏仁酸及其类似的有机酸组成。由自由的羧基基团组成的盐也可来自无机盐如钠、钾、铵、钙或氧化铁和诸如异丙基胺、三甲胺、2-巯基乙醇、组氨酸、普鲁卡因及其类似的有机盐。

以一种与剂量和剂型相容的方式接种苗，并且这个剂量是治疗上有效的和有免疫原性的。接种疫苗的量取决于被治疗的个体，例如，此个体的免疫系统产生免疫应答的能力和所期望的保护程度。合适的剂量范围约等于每次接种几百微克活性成分，优选的范围是约0.1微克到2000微克(尽管在1-10毫克的较高剂量范围内需慎重考虑)，例如在从约0.5微克到1000微克的范围内，优选的范围是从1微克到500微克尤其是在10微克到100微克的范围内。对于初次免疫和加强免疫的合适的策略也是不定的，但一般以初次免疫后随后加强接种或施与其他免疫方式为典型。

应用的方式可能变化很大。任何一种传统的施与疫苗的方式都是可行的。这些方法包括口服在生理学可接受的固体基础上或在生理学可接受的散剂基础上通过注射或类似的非胃肠道途径。疫苗的剂量将取决于接种疫苗的途径并且根据被接种个体的年龄和抗原的剂型而变化。

疫苗的一些多肽在疫苗中具有足够的免疫原性，但对于另外一些多肽来说如果疫苗进一步包含佐剂物质那么就会增强免疫应答。特别优选使用已被证明可以促进打破对自身抗原自身耐受状态的佐剂。

对于疫苗来说，已经知道有许多方法可以达到佐剂效果。在“佐剂的理论和实际应用”，1995,Ducan ES Stewart-Tull(编者)，约翰威利父子公司，ISBN0-471-95170-6，和在“疫苗：新一代的免疫学佐剂”，1995，Gregoriadis G(编者)，Plenum Press,纽约，ISBN0-306-45283-9中都详细地说明了其一般原理和方法，以上两书引入本文做参考。

优选的佐剂促进抗原呈递细胞如树突状细胞摄入疫苗并且激活它们。合适的佐剂的无限的实施例选自一种免疫定向佐剂；一种免疫调节佐剂如毒素、细胞因子和分枝杆菌衍生物；油剂；聚合物；胶囊形成佐剂；皂角苷；免疫刺激复合物基质(ISCOM基质)；颗粒；DDA；铝佐剂；DNA佐剂；r-菊粉和胶囊化佐剂。通常情况下，应该注意的是在上文中涉及的在类似物中用做第一、二、三部分的有用的复合物和作用剂也同样适用于其在本发明疫苗佐剂中的应用。

佐剂的应用包括使用氢氧化铝或磷酸铝佐剂，通常用0.05-0.1％的缓冲盐溶液，与糖的合成聚合物(例如Carbopol)混合使用0.25％的溶液，通过在70至101℃的范围内分别加热处理30秒至2分钟可使蛋白质聚集，使用胶联剂使蛋白质聚集也是可行的。通过用胃蛋白酶处理过的抗体(Fab片段)与铝的作用聚集蛋白质，与细菌细胞如C.parvun或内毒素或革兰氏阳性菌的脂多糖成分混合，乳化在生理学上可接受的油性介质如mannide mono-oleate(Aracel A)中或用20％的全氟碳(Fluosol-DA)溶液作为阻断替换物来乳化也可实施。油合剂如角鲨烯和IFA也是优选的。

根据本发明，DDA是DNA和r-菊粉的一种非常有效的候选佐剂，而且弗氏完全和不完全佐剂以及皂树皂甙如Quil A和QS21也是有趣的候选佐剂。单磷酰脂质A(MPL)以及上面提到的C3和C3d也是进一步可能的佐剂。

已知脂质体剂型也具有佐剂效果，因此根据本发明脂质体佐剂也是优选的。

根据本发明，免疫刺激复合物基质类型(ISCOM基质)的佐剂也是优选的选择，特别是已经表明这种类型的佐剂能上调APCs细胞MHCⅡ类分子的表达。ISCOM基质由(任意分离的)来自皂树的皂甙(三萜系化合物)，胆固醇和磷脂组成。当与有免疫原性的蛋白质混合时，所产生的呈颗粒状的剂型即已知的ISCOM颗粒，其中皂甙占60-70％，胆固醇和磷脂占10-15％，蛋白质占10-15％，以上比例均为重量/重量比。有关免疫刺激复合物的构成和使用的详细信息可参见上面提到的论及佐剂的教科书，Morein B等，1995，临床免疫治疗3:461-475以及Barr IG和Mitchell GF,1996,免疫和细胞生物学，74:8-25(文献引入本文做参考)对如何制备完全的免疫刺激复合物也都提供了有用的指导。

另外一种很有趣的(并且因此，优选的)可以达到佐剂效果的可能是应用Gosselin等1992年描述的技术(文献引入本文做参考)。简言之，通过将抗原与抗单核/巨噬细胞表面的Fcr受体的抗体(或结合抗原的抗体片段)结合，可加强对相关抗原如本发明中的抗原的呈递。特别是抗原和抗FcrRⅠ抗体的结合已经被证明可以为了接种的目的增加免疫原性。

其他可能的情况包括使用上面提到的定向和免疫调节物质(细胞因子)作为被修饰的类似物的候选的第一和第二部分。就此而言，合成的细胞因子诱导剂如多聚Ⅰ:C也是可能的选择。

合适的分枝杆菌衍生物选自胞壁二肽、完全弗氏佐剂、RIBI和海藻糖二酯如TDM和TDE。

合适的免疫定向佐剂选自CD40配体CD40抗体或其特异性结合片段(见上面的讨论)、甘露糖、Fab片段和CTLA-4。

合适的聚合物佐剂选自碳水化合物如右旋糖苷、PEG、淀粉、甘露聚糖和甘露糖、塑料聚合物如，和乳胶如乳胶珠。

另外一种有趣的调节免疫应答的方式是在“虚拟淋巴结”(VLN)中(一种由位于360 Lexington Avenue,New York,NY10017-6501的免疫治疗公司发展而来的专利性医疗设备)包括OPGL免疫原(与佐剂以及药物学可接受的载体和运送工具任选组合)。VLN(细长的管状设备)模拟淋巴结的结构和功能。在皮肤下插入VLN产生了一个细胞因子和趋化因子迅速增多的无菌的炎症位点，T和B淋巴细胞以及APCs细胞迅速对危险信号发生反应，定位炎症位点并聚集在VLN的可透过的基质中。已经表明当使用VLN时针对某一抗原产生免疫应答的必须抗原剂量减少了，并且使用VLN接种产生的免疫保护超过了传统的使用Ribi作为佐剂的免疫。在“从实验室到临床，摘要书，10月12-15日，1998，海景胜地，Aptos,加州”中Gelber C等“应用名为虚拟淋巴结的新型医疗设备诱发出了针对少量抗原的强大的细胞和体液免疫应答”一文中简要描述了此技术。

最近的发现已经表明同时施与H2拮抗剂增加了肿瘤内自然杀伤细胞和CTLs细胞的存活。因此，在本发明方法中也考虑将H2拮抗剂包括在佐剂之中。

我们希望每年至少接种此疫苗1次，例如每年至少1,2,3,4,5,6和12次。更明确地说，我们希望每年接种1至12次，例如每年给需要它的个体接种疫苗1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12次。先前已经表明根据本发明使用优选的自身疫苗所引起的记忆免疫是短暂的，因此需要用类似物周期性地攻击免疫系统。

由于遗传变异，不同的个体针对相同的多肽所产生的免疫应答强度不同。因此，根据本发明为了增强免疫应答，疫苗应当包含几种不同的多肽，见上面关于引入外源T细胞表位的选择的讨论，此疫苗可以含有2个或更多的多肽，其中所有的多肽在上面已经阐释过了。

因此疫苗可以含有3至20个不同的经修饰的或未经修饰的多肽，例如3至10个不同的多肽。但是，正常情况下肽的数目将被保持在最小值如1或2个肽。

活疫苗

第二种将抗原呈递给免疫系统的方法是使用活疫苗技术。在活疫苗接种中，抗原呈递给免疫系统这一过程是通过给予动物一种已经被用一段编码必需的表位区的或完整的第一和/或第二类似物的核酸片段所转化的非致病性的微生物来实现的。另外，也可以使用含有此核酸片段的载体来转化此微生物。这种非致病性的微生物可以是任何合适的减毒的细菌菌株(通过传代的方法或利用重组DNA技术去除致病性表达产物的方法减毒)，例如牛结核杆菌卡介苗、非致病性的脓毒败血症链球菌、大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌和志贺氏细菌等。关于制备最先进的活疫苗的综述见Saliou P,1995,应用综述45:1492-1496和Walker PD,1992,疫苗10:977-990，文献都引入本文做参考。关于用于这些活疫苗的核酸片段和载体的细节参见下面的讨论。

至于多肽疫苗，T_H表位和/或第一和/或第二和/或第三部分，如果有的话，可以采取来自细胞相关多肽抗原的氨基酸序列的融合配偶体的形式。

作为细菌活疫苗的另外一种选择，下面所讨论的本发明的核酸片段可被插入到一个无毒性的病毒疫苗载体中。一种可能是使用痘病毒例如痘苗病毒，MVA(修饰的痘苗病毒)，金丝雀痘病毒，鸟痘病毒和禽痘病毒等。另外，也可使用单纯疱疹病毒的突变体。

正常情况下，非致病性的微生物或病毒仅被接种到动物体内一次，但在某些情况下一生中有必要接种这种微生物多于一次。

微生物也可被用含有第一、二、三部分编码区的核酸所转化，例如采用上面所描述的免疫调控物质的形式例如细胞因子作为有用的佐剂。本实施方案的一个优选的样本包括将类似物的编码区和免疫调节子的编码区处于不同的读码框内或至少在不同的启动子的控制之下，由此避免了所产生的类似物或表位作为免疫调节子的融合配偶体的情况。另外，可以使用两种不相同的核酸片段作为转染作用剂。

核酸接种

作为传统的接种以肽为基础的疫苗的另外一种选择，核酸接种技术(也称为“核酸免疫”“遗传免疫”和“基因免疫”)具有许多引人注目的特征。

首先，与传统的疫苗接种方法相比，核酸免疫并不需要用来大规模地生产免疫原性物质的资源消耗(例如，采用工业微生物发酵的形式以产生在多肽接种中所必需的类似物)。而且，不需要免疫原纯化设备和再折叠方案。最后，由于核酸免疫依赖于被免疫个体自身的生物化学装置去产生被引入的核酸的表达产物，所以希望对表达产物进行最佳的翻译后处理；这在自身接种的情况下尤其重要，如上所述，这是因为在类似物分子中应当保留大部分的来自细胞外暴露的多肽序列的天然B细胞表位，并且在理论上B细胞表位可被任何(生物)分子(如碳水化合物、脂类、蛋白质等)的部分所替换。因此，免疫原天然的糖基化和脂质化特征对于总体的免疫原性来说是非常重要的，并且使宿主产生免疫原很好地确保了这一点。

因此，本发明方法的一个重要的实施方案通过体内向抗原呈递细胞引入编码和表达至少一个CTL表位和/或至少一个B细胞表位，和至少一个第一外源T_H表位的至少一段核酸片段来实现呈递(另外一种方法包含接种至少两种不同的核酸片段，其中一个编码至少一个CTL表位，另一个编码至少一个外源T_H表位)。优选使用编码和表达上面所讨论的第一类似物的核酸片段完成呈递。如果第一类似物与上面所详细讨论的T_H表位和/或第一和/或第二和/或第三部分装配在一起，它们以来自细胞相关多肽抗原的氨基酸序列的融合配偶体的形式出现，融合构建物由核酸片段所编码。

至于传统的疫苗接种途径，核酸接种可以结合体内向抗原呈递细胞引入至少一种编码和表达第二类似物的核酸片段使用。有关第一、第二和第三部分以及T_H表位的考虑在此同样适用。

在本实施方案中，被引入的核酸优选是DNA，可采用裸DNA的形式，DNA与带电荷的或不带电荷的脂类配制在一起，DNA配制在脂质体中，DNA被包含在病毒载体上，DNA与促进转染的蛋白或多肽配制在一起，DNA与寻靶定向蛋白或多肽配制在一起，DNA与钙沉淀试剂配制在一起，DNA与惰性载体分子结合在一起，和DNA与佐剂配制在一起。在本文中需要注意的是，在实际应用中所有与在传统疫苗配制物使用佐剂有关的设想同样适用于DNA疫苗。因此，在多肽疫苗中涉及佐剂使用的所有说明同样适用于核酸接种技术。其他关于剂型和接种方式和接种途径的考虑以及上面所讨论的关于传统疫苗的考虑同样适用于核酸接种技术中。

一种特别优选的核酸疫苗剂型类型是含有DNA的微小颗粒。例如在WO98/31389中描述了合适的微小颗粒。

而且，用做免疫作用剂的核酸可包含编码第一、第二和/或第三部分的区域，例如采取上面所描述的免疫刺激物质的形式如细胞因子作为有用的佐剂。本实施方案的一个优选的样本包括将类似物的编码区和免疫调节子的编码区处于不同的读码框内或至少在不同的启动子的控制之下，由此避免了所产生的类似物或表位成为免疫调节子的融合配偶体的情况。另外，可以使用两种不相同的核酸片段，但这是次优选的，这是因为当将两个编码区包含在同一个分子中时具有确保其共同表达的优点。

在正常情况下，疫苗的核酸被引入载体中，其中表达被控制在病毒启动子之下。根据本发明关于载体更为详细的讨论参见下面的讨论。关于核酸疫苗配制和使用的详细说明见Donnelly JJ等，1997，免疫学年度评论，15:617-648和Donnelly JJ等，1997，生命科学，60:163-172，文献都引入本文做参考。

本发明的一个重要部分是关于在动物中选择免疫原性较弱或无免疫原性的细胞相关多肽抗原的合适的免疫原性类似物的新型方法，上述的免疫原性类似物能够在动物体内诱导产生抗其上有MHCⅠ类分子与来自细胞相关多肽抗原的一个表位结合在一起的细胞的CTL应答。这种方法包含以下步骤

    a)鉴别细胞相关多肽抗原氨基酸序列的至少一个亚序列，

其中上述的亚序列不含有已知的或推测的CTL表位。

    b)在步骤a)所鉴别的至少一个亚序列中，通过向细胞相关

多肽抗原氨基酸序列中引入至少一个对动物来说是外源的T_H表

位来制备细胞相关多肽抗原的至少一个推定的免疫原性类似物。

    c)选择在步骤b)中所制备的证实能够在动物体内诱导产生

CTL应答的那个/那些类似物。

另外，上面的选择方法涉及为核酸接种的目的制备核酸片段。在那种情况下，要求所编码的肽包含至少一个T_H表位。

如果类似物来自于暴露在细胞外相的抗原，优选的情况是在步骤a)中所鉴别的亚序列不含有半胱氨酸残基，或者，在步骤b)中引入的T_H表位在本质上不改变半胱氨酸残基的特征。这种方法促进了在产物构建物中对与弱的细胞相关多肽抗原的B细胞表位相似的空间B细胞表位的保存。

为了同样的理由，优选的情况是在步骤a)中所鉴别的亚序列不含有已知的或推测的糖基化位点，或者，在步骤b)中引入的T_H表位在本质上不改变糖基化位点的特征。

由于某些弱的细胞相关多肽抗原具有病理生理学作用，所以它们会造成我们所不希望的后果。我们希望疫苗构建物不产生这些后果，因此优选的情况是在步骤a)中所鉴别的亚序列负责主要的由细胞相关多肽抗原所造成的病理生理学后果，并且在步骤b)中引入的T_H表位可以减少或除去上述的病理生理学影响。本方法的一个实施例是去除酶、激素或细胞因子中的活性位点并用外源T_H表位替换它。

另外一个重要的考虑是关于疫苗的多肽产物与不涉及病理学的自身蛋白发生免疫交叉反应的问题。最好应该避免这样的交叉反应，因此在本发明方法的一个重要的实施方案中在步骤a)中所鉴别的亚序列与动物体内另外的蛋白抗原的氨基酸序列是同源的，并且在步骤b)中引入的T_H表位充分地去除了这种同源性。

与这个实施方案有关的一个实施方案中，在类似物中不保存1)通常情况下不暴露在细胞外相并且2)可能含有弱的细胞相关多肽抗原的B细胞表位的任何氨基酸序列。通过用不含有B细胞表位T_H表位替换这样的氨基酸序列、彻底去除它们或部分去除它们来做到这一点。

另一方面，优选的情况是高度保存弱的细胞相关多肽抗原的任何“真的”B细胞表位，因此本发明选择方法的一个重要的实施方案涉及由于在步骤b)中引入的外源T_H表位而导致细胞相关多肽抗原的大部分B细胞表位被保存下来。尤其优选的是类似物中保存了细胞相关多肽抗原的总体三级结构。

在步骤b)中的制备最好是通过分子生物学方法或固相或液相肽合成技术来完成。短肽优选使用众所周知的固相或液相肽合成技术来制备。但是，本技术的最新进展已经提出用此方法制备全长的多肽或蛋白质的可能，因此，通过合成技术制备长构建物也在本发明的范围之内。

根据上面所讨论的方法已经鉴别出有用的类似物之后，有必要大规模生产这种类似物。多肽的制备采用本技术领域众所周知的方法。

通过分子生物学手段可以完成这点，其中包括第一步制备转化细胞，根据本方法选择出来的编码类似物的核酸片段被克隆到载体中并用此载体转化合适的宿主细胞。第二步是在能够促进编码细胞相关抗原的类似物的核酸片段表达的条件下培养转化的细胞，随后从培养物上清或直接从细胞中，例如在被裂解后，提取类似物。另外，可以通过大规模的固相或液相肽合成方法来制备类似物，见上。

最后，根据所选择作为宿主细胞的细胞或所使用的合成方法，产物进行人工的翻译后修饰。这些修饰可以是本领域所熟知的再折叠方案，用酶处理(为了获得糖基化或去除所不希望的融合配偶体)，化学修饰(为了获得糖基化)，和结合，例如与传统的载体分子结合。

应该注意的是本发明优选的类似物(和本发明方法使用的相关类似物)包含可导致与多肽抗原具有70％一致性的多肽或与其亚序列至少具有10个氨基酸一致的修饰。较高一些的序列一致性是更为优选的。例如只少是75％，或甚至是至少80％或85％。可用(Nref-Ndif)100/Nref来计算蛋白质和核酸的序列一致性，其中Ndif是在序列比较时两序列中不相同的氨基酸残基的总数，Nref是其中一个序列中的残基数目。因此，AGTCAGTC DNA序列与AATCAATC序列具有75％的序列一致性(Ndif=2并且Nref=8)。

本发明方法的典型靶

如上所述，优选的弱的细胞相关多肽抗原是肿瘤相关的抗原。在下面的表中给出了这些抗原的无数的例子。抗原          参考文献5-α还原酶    Delos S,Carsol JL,Fina F,Raynaud JP,Martin PM．来自人的恶性增生的前列

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在下面，将详细讨论一些特异的肿瘤相关的抗原。

前列腺特异的膜抗原，PSM

在美国，前列腺癌是癌症死亡的第二致死原因(大约40,000人每年)，每年大约诊断出200000位患者(Boring,1995)。11个男人中大约有1人最终发展成为前列腺癌。而且，大约40-60％的前列腺癌患者最终发展成为前列腺外疾病(Babaian,1994)。本发明的主要策略是为了消除残存的癌组织和癌转移使用一种治疗性疫苗作为前列腺切除术的辅助治疗。

几种病理性情况存在于前列腺中，包括良性生长(BPH)、感染(前列腺炎)和瘤形成(前列腺癌)。

前列腺癌的生物学侵害性是多变的。在一些患者中所检测出的肿瘤停留在潜伏的组织学肿瘤阶段，不会发展成为临床显著性的肿瘤。在另外一些患者之中，肿瘤发展很快，在很短的时间内(2-5年)转移并且使患者死亡。

现在对前列腺癌的初期治疗是施行前列腺切除术。但是，由于前列腺癌细胞的延伸性扩散，大多数的前列腺癌患者不是由地方医院治疗的。患有不受限制的疾病的患者最终接受系统的雄性激素部分剥夺治疗，但是自从雄性激素部分剥夺治疗成为转移的疾病的标准的治疗

以后50多年内，前列腺癌的每年死亡率根本没有下降。

PSM是一种良性的或恶性的前列腺组织高度特异性的膜蛋白，尽管在其他组织内诸如直肠组织和直肠肿瘤、小肠、脑和新血管组织中也观察到PSM的表达。因此，如果手术成功，在理论上已经切除前列腺的患者在残存的恶性前列腺肿瘤组织或肿瘤转移中应该能够表达PSM。通过诱导针对PSM的强大的CTL应答和/或强大的多克隆抗体，我们希望能够除去残存的肿瘤组织。

有趣的是，在对前列腺癌患者施行雄性激素剥夺治疗之后观察到PSM表达的上调(Wright,1996)。这使得在传统的雄性激素剥夺治疗之后非常适于施行以PSM为靶的治疗。

PSM在1987年作为生产抗一种分离的人前列腺癌细胞LNCaP的单克隆抗体7E11-C5.3的结果首次被鉴定出来(Horoszewicz1987)。这种抗体识别正常的和恶性的前列腺上皮细胞，并于1993年纯化PSM蛋白并确定了它的氨基酸序列，最终克隆出了此基因(Israeli,1993)。

PSM是Ⅱ型跨膜糖蛋白，从其核酸序列推测其分子量为84KD，而糖基化的蛋白的实际分子量是100到120KD。对编码PSM蛋白的基因进行测序揭示了一个推测的与3个胞质内精氨酸锚残基连接的跨膜区。PSM的细胞外部分含有此蛋白总共750个氨基酸的707个，而胞内区据预测是19个氨基酸长度(Israeli,1993)。在前列腺肿瘤组织中已经检测出了PSM特异的mRNA(Israeli,1994)，表明肿瘤抗原并不是任意糖基化的蛋白如Tn或sTn肿瘤抗原的情况。

已经用全长的PSM cDNA转染一种PSM阴性的人前列腺癌细胞系PC-3并且表达PSM蛋白(Kahn,1994)。此外，已经在体外转录和翻译了全长的PSM cDNA(2.65千碱基)(Kahn,1994)。

最近证实PSM具有类似于N-乙酰化α连接的酸二肽酶(NAALADase)的水解活性----实际上已经证实这两种蛋白是相同的。NAALADase是神经系统的膜结合水解酶，它分解代谢N-乙酰天冬氨酰谷氨酸(NAAG)去影响谷氨酸的信号传导过程。至今仍不知道PSM这种活性是否具有相关的生物学功能。

预测是否在用能够诱导PSM特异性的免疫应答的自身疫苗治疗之后我们所不希望的与CTLs蛋白或抗体的交叉反应是否出现有一定的重要性。已经显示出PSM基因的部分编码区(418---567位氨基酸)与人转移素受体具有54％的同源性(Israeli,1993)。也已经发现了NAALADase所识别的全长序列，见上。尚不能鉴定与其它已知的肽酶之间具有功能性相关的一致性。

与转移素受体的同源性很低，在本发明的一些构建物中将优选破坏它们。我们不希望人NAALADase所识别的序列对PSM疫苗来说是一个障碍，部分是因为抗体和CTLs穿过血脑屏障的能力较低。总而言之，甚至使用大多数的PSM样构建物，不希望在患者体内出现与其它蛋白的所不希望发生的交叉反应。

从早期的研究中可以清楚地看到PSM表达在大多数前列腺癌细胞和检测出的前列腺癌转移中。而且，所检测的其它癌症，如不同组织的癌、黑素瘤、肉瘤以及一大系列的非前列腺的人类癌细胞系已经被证实是PSM阴性的。

除了这个以外，绝大多数的其它组织也已经被发现是PSM阴性的。这些组织包括结肠、乳房、肺、卵巢、肝、膀胱、子宫、支气管、脾、胰腺、舌、食道、胃、胸腺、甲状旁腺、肾上腺、淋巴结、主动脉、大静脉、皮肤、乳腺和胎盘。但是在以上的一些组织中RT-PCR检测到了PSM mRNA的存在。

尽管PSM作为膜结合分子主要在前列腺组织中发现，在正常的人血清中也可以检测出少量的PSM，在前列腺癌患者血清中检测出增高的PSM水平(Rochon,1994；Murphy,1995)。因此，这些患者体内的循环PSM水平可以作为PSM疫苗是否有效的血清学监测指标。

总之，在至今现有的全部数据的基础上，PSM是一种对人前列腺组织和起源于其的肿瘤具有高度特异性的抗原。这意味着在已经施行前列腺切除的患者中，PSM是一种准肿瘤特异性的自身抗原。因此，一种有效的PSM疫苗可能以主要的前列腺组织或起源于前列腺的转移组织为靶。

正如将要在实施例1中清楚地阐明的一样，本发明优选将外源T_H细胞表位引入到部分PSM氨基酸序列中已由SEQ ID NO:2所阐明的16-52和/或87-108和/或210-230和/或269-289和/或298-324和/或442-465和/或488-514和/或598-630和/或643-662和/或672-699位氨基酸位置。而且，已经将外源T_H细胞表位引入到这些位置的修饰的PSM分子也是本发明的一部分。

因此，本发明也涉及在人体内具有免疫原性人PSM类似物，上述的类似物包含PSM所有已知的和推测的CTL和B细胞表位的大部分，并且至少包括本文中所讨论的一个外源T_H表位。优选的PSM类似物至少存在一个外源T_H表位，这些表位插入到PSM氨基酸序列之中或替换PSM氨基酸序列的一部分或是由于PSM部分氨基酸序列缺失的结果。最优选的类似物是在由SEQ ID NO:2所阐明的16-52和/或87-108和/或210-230和/或269-289和/或298-324和/或442-465和/或488-514和/或598-630和/或643-662和/或672-699位氨基酸位置引入了一个外源T_H细胞表位。

人绒毛膜促性腺激素(HCG)

几个世纪以来就一直在讨论胚胎标志和恶性表型之间的关系。越来越多的数据表明至少有一种这样的标志，人绒毛膜促性腺激素β(hCGβ)，在各种不同组织来源的癌细胞中持续性检出，这种蛋白的表达与增加的转移特征有关。抗这种可溶性蛋白的体液免疫应答可以减少肿瘤扩散的机会和/或可能抑制手术后新的原发生长的复发。

人绒毛膜促性腺激素属于糖蛋白激素家族，此家族包括促卵泡激素(FSH)、促胸腺激素(TSH)和促黄体素(LH)，以上所有的激素是生殖表达和胚胎生存的重要调控因素。此激素家族的成员是异二聚体，它们都有一个共同的α链。对于每一种激素来说其β链是独特的并且提供特异性。带有β链的LH与hCGβ具有很强的同源性(大约80％)。完整的hCG分子的分子量是37KD，其中三分之一是碳水化合物。翻译后的糖修饰包括N端连接的和O端连接的碳水化合物，其中存在丰富的唾液酸，这使得蛋白质带有很多的负电荷。已经研究清楚了hCG分子的晶体结构(Lapthorn等，1994)。

在其晶体结构的基础上发现hCG与生长因子家族具有同源性，包括PDGF和TGFβ(Lapthorn等，1994)，。这表明hCG表达可能辅助调控癌细胞生长。

人绒毛膜促性腺激素是一种糖蛋白激素，它是在受孕后不久由胎盘的合胞滋养层产生的。在怀孕的妇女中它对于成功的妊辰是必不可少的。

现在还不知道胚胎标志在发展或维持癌物质中的病理生理学作用。但是，我们所感兴趣的是滋养层(这些蛋白通常情况下在此产生)具有血管生成和侵害性特征，这也是癌细胞所必不可少的特征。而且，已经表明hCG(或其亚单位)可以抑制母体针对胎儿组织的细胞免疫应答。例如，研究表明hCG直接抑制T细胞应答(Jacoby等，1984)，并且已经提出由于淋巴结引流(在这种情况下)，可能为转移的肿瘤的建立造成更合适的环境，原发的黑素瘤肿瘤被免疫抑制。因此，hCGβ的表达帮助癌细胞扩散进入二级淋巴器官。最后，如上所述，已经表明hCG与一些生长因子之间具有结构同源性。因此，另一种可能是癌细胞分泌hCG给肿瘤提供了一种生长优势。

已经在许多不同类型的癌症中观察到了hCGβ的表达，例如：a)前列腺腺癌：不论肿瘤的组织学等级如何，在预后较差的患者中均观察到了hCGβ阳性的组织部分(Sheaff等，1996),b)不同类型的肺癌；鳞状上皮细胞(SQCC)、腺癌(AC)、和大细胞(LCC)对hCGβ均显示出高的反应百分率(Boucher等，1995),c)胰腺腺癌(Syrigos,1998)，d)成神经细胞瘤、脑瘤、成视网膜细胞瘤(Acevedo等，1997),e)恶性黑素瘤(Doi等，1996),f)膀胱癌(Lazar等，1995)。最近一篇文献描述了一种DNA方法，其中用一hCGβ表达构建物免疫小鼠(Geissler等，1997)。在这之中，抑制肿瘤生长的体内模型与CTL活性强相关，但也检测到高滴度的抗体(可以与其细胞受体作用而中和完整的hCG的生物学效应)。

在几篇文献中均叙述了用hCG作为免疫原，集中于它作为避孕疫苗的使用上(Talwar等，1976和Talwar等，1994)。使用抗完整的hCG分子的疫苗，已经在抗受精力临床试验中观察到了非常高程度的效率和安全性(Talwar等，1994)。已经用抗与白喉类毒素结合在一起的hCGβ合成的羧基端肽的疫苗对癌症患者施行了Ⅰ期临床试验(Triozzi等，1994),Ⅱ期临床试验正在进行之中。不管使用hCGβ作为癌症疫苗的靶这个想法已经存在一段时间这个事实，与AutoVac结合在一起使用还从未探索过。

我们都知道来自于非胚胎组织或良性肿瘤的细胞并不表达hCGβ。因此，抗这种分子的接种应该不会有什么潜在的副作用(除了对怀孕有影响以外)。由于如此多的不同种类的癌症都表达此分子，所以此分子已经被提议为“确定性的肿瘤生物标志”(Acevedo等，1995和Regelson W,1995)，并且同样是一个有诱惑力的追逐的目标。

在Acevedo等，癌症检测和预防增刊(1987)1:477-486和在Kellen等，癌症免疫学和免疫治疗(1982)13:2-4中可以发现适于对以hCG为基础的疫苗的效率做进一步研究的合适的动物模型。

Her2

酪氨酸激酶受体Her2和EGFr被认为在正常细胞的恶性转化和癌细胞的继续生长中起关键性作用。过量表达常常与非常差的预后有关。在过去的几年中已经有许多关于使用抗这些受体的抗体作为治疗过量表达任一种或这两种受体的癌症的报道。基因技术公司使用抗Her2的单克隆抗体已经成功完成了几例乳腺癌患者的临床试验，并且最近已经获得了FDA关于销售抗Her2单克隆抗体制备Herceptin的许可。

在本文中所说明的自身接种技术中当适用于Her2分子上时可能引发可与Her2显著反应的多克隆抗体。据认为这样的抗体可以攻击和清除肿瘤细胞以及阻止转移的癌细胞发展成为转移癌。这种抗肿瘤效应的效应器机制可能经由补体和抗体依赖的细胞毒作用所介导。

根据对构建物的选择，所诱导出的自身抗体也可通过抑制生长因子依赖的寡二聚体形成和受体的内化来抑制癌细胞的生长。并且，更重要的是，据认为Her2类似物能够诱导针对于已知的和/或推测的显示在肿瘤细胞上的Her2表位的CTL应答。

Her2是上皮生长因子受体家族(c-erbB)的一员，至今为止此家族包含以下四种不同的受体：c-erbB-1(EGFr),c-erbB-2(Her2.c-Neu),c-erbB-3和c-erbB-4(Salomon等，1995)。与EGFr和Her2相比，c-erbB-3和c-erbB-4未完全鉴定。Her2是一个完整的糖蛋白。成熟的蛋白分子量是185KD，其结构特征与EGFr受体非常类似(Prigent等，1992)。EGFr也是一个由一个亚单位构成的完整的膜受体，其分子量为170KD并且由一个621氨基酸的表面配体结合区；一个单一的23氨基酸的疏水的跨膜区；和一个542氨基酸的高度保守的胞内酪氨酸激酶区所组成。蛋白质是N端糖基化的(Prigent等，1994)。

此家族的所有蛋白都是酪氨酸激酶。与配体的相互作用导致受体二聚体化，这增加了酪氨酸激酶的催化作用(Bernard,1995；Chantry,1995)。此家族内的蛋白质可以同源或异源二聚体化，这对它们的活性很重要。EGFr具有生长促进效应并且刺激细胞摄取葡萄糖和氨基酸(Prigent等，1992)。Her2也带有生长促进信号。只有EGFr与EGF和EGFα结合，这些配体不与此家族的其它受体结合(Prigent等，1992)。Her2的配体并未完全确定。但是已经显示Heregulin可以通过激活Her2来诱导磷酸化作用。这似乎并不是由于与受体直接结合造成的，但是据认为Heregulin是c-erbB-3和c-erbB-4的配体，随后通过寡二聚体形成激活了Her2(Solomon等，1995)。

EGF受体家族蛋白质之间的同源性在其分子的胞内酪氨酸激酶区最明显(EGFr和Her2之间是80％)，在细胞外的部分同源性较差------对于不同的结构区来说从41％到46％(Prigent等，1992)。

上皮生长因子受体在正常的组织中表达量很低，但在多种类型的癌症中其过量表达。EGFr在乳腺癌(Earp等，1993；Eppenberger1994)、神经胶质瘤(Schlegel等，1994)、胃癌(Tkunaga等，1995)、鳞状皮肤癌(Fujii,1995)、卵巢癌(Van Dam等，1994)以及其他癌中均过量表达，Her2在一些正常的组织中也少量表达，最具特征性的是在分泌性上皮中。在大约30％的乳腺癌、胃癌、胰腺癌、膀胱癌和卵巢癌中Her2过量表达。

根据肿瘤类型和肿瘤的分化程度这些受体的表达不同，例如在乳腺癌中，所有受体均原发肿瘤性的过量表达；而在胃癌中，过量表达在癌转移的后一时期才发生(Solomon等，1995)。对于从患者体内分离出的某些头部和颈部癌症、阴部、乳腺和卵巢癌细胞系中，肿瘤细胞上过量表达的受体数量在每个细胞中大于10⁶个(Dean等，1994)。

为什么EGFr受体家族构成用做肿瘤免疫治疗的合适的靶？有以下几点原因：首先，在许多类型的癌症中它们均过量表达，这可以使免疫应答针对肿瘤。其次，肿瘤经常表达或过量表达这个受体家族的配体，并且一些是对由这些配体介导的增殖效应高度敏感的。最后，过量表达生长因子受体的肿瘤患者常常预后较差。特别是在乳腺癌、肺癌和膀胱癌中过量表达与预后较差紧密相关，并且过量表达与侵害性/转移性表型明显相关，而这些对于传统的治疗来说是不敏感的(Eccles等，1994)。

Her2的过量表达在某些情况下是基因扩增的结果，而在另外的一些情况下是增加的转录和翻译的结果。Her2的过量表达与乳腺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌和可能的非小细胞肺癌相关(Solomon等，1995)。

已经在深度乳腺癌和卵巢癌患者中用双特异性抗体施行了Ⅰ期临床试验。抗体是抗Her2和FcrRⅠ双特异性的(Weiner等，1995)。使用抗Her2和CD3的双特异性抗体观察到了Her2有效裂解过量表达的肿瘤细胞(Zhu等，1995)。

用抗Her2的单克隆抗体对外源嫁接入人胃癌的SCID小鼠的治疗延长了小鼠的存活期(Ohnisk等，1995)。抗Her2的单克隆抗体的抗肿瘤活性在体外和体内的作用机制是不同的；它们可能作为部分配体拮抗剂起作用，改变了Her2受体的周转和磷酸化或可能影响二聚体化(Lupu等，1995)。

相似的，已经表明EGFr受体可干扰生长因子的相互作用(Baselga等，1994；Modjtahedi等，1993a；Wu等，1995；Modjtahedi等，1993b；Tosi等，1995；Dean等，1994；Bier等，1995；Modjtahedi等，1996；Valone等，1995)。

因此，在本发明方法的一个重要的实施方案中外源T细胞表位被引入到Her2氨基酸序列中已由SEQ ID NO:3所阐明的下述位置：5-25和/或59-73和/或103-117和/或149-163和/或210-224和/或250-264和/或325-339和/或369-383和/或465-479和/或579-593和/或632-652和/或653-667和/或661-675和/或695-709和/或710-730氨基酸位置，见

实施例。

所以，本发明也涉及在人体内具有免疫原性的人Her2类似物，上述的类似物含有Her2大部分的所有已知的和推测的CTL和B细胞表位并且包括至少一个外源T_H表位，正如在文中讨论的那样。优选的情况是，至少有一个外源的表位出现，插入到Her2氨基酸序列中，或替换Her2部分氨基酸序列，或作为缺失Her2部分氨基酸序列的结果。最优选的类似物是上面解释的类似物，即外源T细胞表位被引入到Her2氨基酸序列中已由SEQ ID NO:3所阐明的下述位置：5-25和/或59-73和/或103-117和/或149-163和/或210-224和/或250-264和/或325-339和/或369-383和/或465-479和/或579-593和/或632-652和/或653-667和/或661-675和/或695-709和/或710-730氨基酸位置。

FGF8b

一些研究已经表明FGF8b能够诱导增殖、转化、分化和在一些情况下大大增强哺乳动物细胞和组织的致瘤性(Tanaka1992,Kouhara1994,Lorenzi1995,MacArthur1995a,Crossley1996b,Ghosh1996,Ohuchi1997a,Rudra-Ganguly1998)。这些效应基本上是通过FGF8b与成纤维生长因子受体家族成员FGFR2、FGFR3和FGFR4的结合而介导的(MacArthur1995b,Blunt1997,Tanaka1998)。因此，已经表明表达这些受体其中之一和FGF8(b)的细胞提供了导致细胞自分泌生长信号的级联。FGF8b的生物学效应很可能部分通过JAK/STAT3途径介导的，因为我们以及其他研究者已经观察到在某些细胞的生长培养液中加入FGF8b确实促进了STAT3的磷酸化，一个怀疑是使细胞抵抗调亡的特征(Catlett-Falcone1999)。

除了上面提到的体外观察结果之外，最近已经表明在前列腺癌和乳腺癌中FGF8(b)的表达被显著上调(Marsh1999,Dorkin1999)。因此，我们认为抗FGF8(b)的自身疫苗会是一种非常有效的治疗表达FGF8的肿瘤的方法，或者可能增加了它们对调亡诱导剂的敏感性。

前列腺癌

前列腺癌的生物学侵害性是多变的。在一些患者中所检测出的肿瘤停留在潜伏的组织学肿瘤阶段，不会发展成为临床显著性的肿瘤。在另外一些患者之中，肿瘤发展很快，在很短的时间内(2-5年)转移并且使患者死亡。

为了诊断的目的，并且为了跟踪对潜力县癌的治疗的应答，基本上已经使用了确定两种蛋白前列腺酸磷酸酶(PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)的循环水平的方法(Nguyen1990,Henttu1998)。由于癌症进展导致前列腺正常结构的破裂，这些可溶性的蛋白被释放进入循环中，在循环中它们可被检测作为例如癌转移扩散的标志。

目前对前列腺癌的初期治疗是施行前列腺切除术。但是，由于前列腺癌细胞的延伸性扩散，大多数的前列腺癌患者不是由地方医院治疗的。患有不受限制的疾病的患者最终接受系统的雄性激素部分剥夺治疗，但是自从雄性激素部分剥夺治疗成为转移的疾病的标准的治疗以后50多年内，前列腺癌的每年死亡率根本没有下降。

RT-PCR分析表明FGF8 mRNA分别由人前列腺上皮肿瘤细胞系LNCaP,PC-3,ALVA-31和DU145产生，FGF8b具有显著的同种型(Tanaka1995,Ghosh1996)。通过加入重组的FGF8b可以刺激雄激素应答的LNCaP细胞生长(Tanaka1995)，而利用表达反义FGF8b的病毒转染DU145细胞其生长被抑制(Rudra-Gangully1998)。这个以及与下面讨论的发育研究的证据一起，显示了FGF8b在维持这些细胞系的患病状态中的一个作用。

使用FGF8a cDNA进行原位杂交实验，Leung和其同事已经表明很高比例(80％(n=106)和71％(n=31))的前列腺癌患者产生FGF8mRNA，并且FGF8 mRNA与肿瘤的严重程度相关(p值分别小于0.0016和0.05)(Leung1996,Dorkin1999)。使用抗FGF8b的单克隆抗体，显示这种同种型负责FGF8b的过量表达(Dorkin1999)。此外，表达高水平FGF8的男性肿瘤患者存活较差(p值等于0.034)，并且在雄性激素不依赖的前列腺癌中FGF8持续性表达(Dorkin1999)。根据Dorkin和其同事的实验数据，FGF8b在前列腺癌中的表达可以预测患者的存活期。

使用抗FGF8的单克隆抗体进行的免疫组化分析在93％(n=43)的前列腺癌患者中也检测出了此蛋白(Tanaka1998)正常的前列腺组织或良性的前列腺增生的确产生低水平的FGF8 mRNA，但并不含有可以检测出的FGF8蛋白(Leung1996,Yoshimura1996,Ghosh1996,Tanaka1998,Dorkin1999)。

这些结果表明抗FGF8(b)的自身疫苗可能对前列腺肿瘤组织是反应性的，并且因此在治疗前列腺癌中非常有用。

乳腺癌

目前对乳腺癌的治疗是施行手术。但是，由于乳腺癌组织的延伸性扩散，大部分乳腺癌患者不是由地方一员治愈的。患有非限制疾病的患者最终接受雄性激素剥夺治疗、化疗和或放疗。但是乳腺癌每年的死亡率仍然相当高。

FGF8是从鼠乳腺癌细胞系(SC-3)中初次分离出来的，向培养液中加入雄性激素可以诱导表达(Nonomura1990)。也已经知道这种蛋白可以诱导这些以及其他哺乳动物细胞的增殖。最近显示出FGF8bmRNA存在于8种(n=8)人乳腺癌细胞系中(MDA-AB-231,MDA-AB-415,ZR75-1,T-47-D,SK-BR-Ⅲ,PMC-42,HBL-100和MCF-7)(Tanaka1995,Payson1996,Wu1997,Marsh1998)。

被鼠乳癌病毒(MMTV)感染的wnt-1转基因鼠发展为乳癌。FGF8的转录在50％的这些肿瘤中被激活(MacArthur1995c,Kapoun1997)。

携带有在非常特异的鼠乳癌病毒(MMTV)启动子控制之下的FGF8b cDNA的转基因鼠自发发展为FGF8b表达的乳癌(Coombes,私人通讯)。

最近的数据显示FGF8(b)的表达在乳腺癌中被上调(Tanaka1998,Marsh1999)。Tanaka及其同事在免疫组化研究中使用了一种新的FGF8单克隆抗体，他们发现乳腺癌存在于67％(n=12)的乳腺癌中，并在89％的FGF8阳性的乳房疾病(增生、成纤维腺瘤、管内乳头状瘤和癌症)中存在雄性激素受体，这就使得自分泌生长促进环被包含在乳腺癌的疾病进程中(Tanaka1998)。使用一种半定量的RT-PCR方法，发现与非恶性的乳房组织相比在恶性乳房组织中FGF8 mRNA水平升高。更为显著的是，更多的恶性组织以显著较高的水平(p=0.031)表达FGF8(p=0.019)(68例乳腺癌和24例非恶性乳房组织)(Marsh1999)。

仍然未完全确立FGF8(b)作为自分泌生长因子起作用。但是，大多数肿瘤过量表达FGF8b这个事实强烈论证了抗FGF8b的自身疫苗对大多数的乳腺癌和前列腺癌可能也是有效的。Marsh,Dorkin和Tanaka报道的数据表明抗FGF8(b)的自身疫苗可被用于治疗乳腺癌和前列腺癌，并且Dorkin等所提供的相当模糊的数据进一步支持了FGF8b与人癌细胞的增殖有关这一观点。

对FGF8b的描述

FGF8属于成纤维细胞生长因子(FGFs)家族。这些生长调控蛋白是约200个氨基酸残基的小分子蛋白质，所有这些蛋白都与增殖和广泛范围细胞的分化有关。对于最近的一个关于成纤维生长因子在脊椎动物肢发育中的作用的综述，见Johnson1997。FGF家族成员是进化相关的并且享有20-50％的氨基酸序列一致性。

FGF8b是FGF8的剪接突变体，起初定义为雄性激素诱导生长因子(AIGF)。AIGF是作为由于雄性激素刺激鼠乳癌来源的细胞系(SC-3)分泌的蛋白质被首次鉴定出来(Nomomura1990)。鼠FGF8基因含有6个外显子，可能编码8个不同的FGF8同种型(FGF8a-h)，只是在分子的N端部分不同(Crossley1195,MacArthur1995b)。人FGF8与鼠基因具有相同的基因结构。但是，由于在外显子1B位置存在的一个终止子，人FGF8可能存在四种不同的同种型即FGF8a,FGF8b,FGF8e，和FGF8f(Gemel1996)。图5中显示了四种人同种型分子的基因结构和氨基酸序列。

成熟的FGF8b含有193个氨基酸残基，计算其分子量为22.5KD。这个高度碱性的蛋白质含有21个精氨酸和14个赖氨酸残基，导致其计算的等电点为10.84，在pH7.0时计算的阳性电荷为19.8，它含有两个半胱氨酸残基和两个潜在的N端糖基化位点。但是，已经在细菌中异源表达了此蛋白质并通过使用C端的6个组氨酸标志纯化了这种蛋白，并且在体外再折叠成为一个可溶性的和生物学活性的状态(MacArthur1995a,Blunt1997)。

FGF8b的生物学活性

如上所述，FGF8(b)是作为由雄性激素依赖的鼠乳癌细胞系释放的因子被首次分离而来的，已经表明这种蛋白能够诱导这些细胞的增殖。形态学改变与由睾丸素诱导的形态学改变相似，已知后者也可以诱导FGF8(b)mRNA的合成(Tanaka1992)。增殖可被FGF8(b)反义链所抑制(Nomomura1990,Tanaka1992,Yamanish1994)。实际上，用表达FGF8b反义链的病毒转染人前列腺癌细胞系DU145也可以抑制其生长(Rudra-Gangly1998)。最机的数据显示FGF8b诱导STAT3的磷酸化，STAT3是一种被怀疑与抗调亡有关的蛋白质(Catlett-Falcone1999,Johnston C.L.，未发表结果)。

一些研究者已经表明FGF8b在诱导NIH3T3或SC115细胞转化中很有效(Miyashita1994,Kouhara1994,Lorenzi1995,MacArthur1995a)。通过使用重组表达的蛋白质，也已经表明当使用FGF8a或FGF8c时用FGF8b诱导这种形态学改变更为有效(MacArthur 1995a,Ghosh1996)。非常有趣的是，研究显示FGF8b分子的N端部分单独就可以有效转化NIH3T3细胞，甚至FGF8b特异性的小肽(QVTVQSSPNFT)也能够使细胞生长时间比在0.1％的血清中生长的正常细胞长2-3倍(Rudra-Gangly1998)。而且，已经报道用编码FGFSb的表达载体稳定转染NIH3T3细胞通过眼内注射入裸鼠的时候，是具有很强的致肿瘤性的。

在体内，已知FGF8b在脊椎动物发育的某些阶段才表达。表1中总结了FGF8(b)的生物学作用。对于FGFSb涉入在脊椎动物发育中的综述，见Goldfarb1999和Johnston1997。

  表：已知产生FGF8的不同位点/组织以及预计的生物学作用

作用/机制/存在(物种)                  参考文献

存在于发育中的肢芽中(小鼠)            Heikinheimo1994,Ohuchi1994

肢芽突起(小鸡)                        Kuwana1997,Xu1998

诱导异位肢从中胚叶形成(小鸡)          Crossley,1996b

诱导中脑从间脑尾部形成(小鸡)          Crossley,1996a

引发翅从无翅突变体中突起(小鸡)        Ohuchi1997a

在原胚肠背腹图式发育中的作用(斑马鱼)  Fyrthauer1997

在原胚肠形成心、颅面、前脑、中脑      Meyers1998

和小脑发育中必需(组织特异性敲除鼠)

在牙齿形态发生中的作用(小鼠)          Kettunen1998

据认为FGF8(b)通过与成纤维细胞生长因子受体(FGFR’s)结合而介导其作用。特别的是，已知FGF8b能够活化FGFR2c,FGFR3c,FGFR4c，并在一定程度上也活化FGFR1c，但它不能活化FGFR1b,-2b，或-3b(MacArthur1995b,Nlunt1997)。在诱导小鸡异位肢突起中，按时FGF10,FGFR2和FGF8相互作用，并且这对于突起来说足够了(Kuwana1997,Xu1998)。

这些结果支持了FGF8(b)可以以自分泌或旁分泌的方式起作用从而导致在脊椎动物发育过程中几种解剖结构的正常突起和图式发育。重要的是，FGF8“全基因敲除”鼠不能存活很可能是因为这种蛋白在胚胎发育过程中复杂地干涉于其中有关。

与其它蛋白的同源性

用自身疫苗诱导抗FGF8b特异性自身抗体治疗后预测我们所不希望的与抗体可以接近的其它蛋白质发生交叉反应是否发生非常重要。由于FGF8b和其它FGF8分子之间序列的高度一致性，认为自身疫苗可以与这些蛋白发生交叉反应。但是，这可能是有益的，因为这些蛋白质中没有一个被报道在已经不表达FGF8b的组织或细胞中被表达。

FGF8b的55到175位氨基酸残基与其它的FGFs分子相比显示出较低但显著性的序列一致性。两种蛋白结构域之间显著性程度的序列一致性也反映了三级结构高度一致这一观点已被普遍接受(并且已经被证明几次)。因此，普遍认为FGF家族成员是结构相似的。已经解决了FGF2晶体形式以及溶液形式的三维结构(Ago1991,Zhang1991,Zhu1991,Erikson1993,Blaber1996,Moy1996)。FGF2完全由β折叠结构构成，包含四线反向平行β迂回的三折叠重复。这种β折叠桶结构在IL-1、FGF2(或碱性FGF)和FGF1(或酸性FGF)之间是完全保守的。溶液中FGF2的核磁共振分析已经表明分子的N端部分形成了一个相对柔软的结构。FGF8b的剩余部分(1-54和176-215位氨基酸残基)只显示出与已知的蛋白的低程度的序列一致性。

根据结构和序列比较数据，普遍假定认为其他成纤维细胞生长因子的三维结构核心部分密切模仿FGF1和FGF2的核心部分。在我们设计FGF8b突变体自身疫苗分子中这些结构上的考虑是重要的因素。

重要的是，由于FGF8和FGF家族其他任何成员之间的序列一致性相当低，FGF8的表面可能与其他FGFs分子的表面不同，籍此模仿FGF8b自身疫苗产生的抗体与FGF家族其他成员之间的交叉反应。由于与成纤维细胞生长因子相比，与其他蛋白的同源性非常低，我们不希望抗FGFSb的自身疫苗与任何其他蛋白质发生交叉反应。

但是，应该强调的是抗FGFSb的自身疫苗可能与FGF8的所有同种型发生交叉反应。但是，由于在成人中这些FGF8同种型都不能显著性水平地表达，所以着将可能不是一个问题。甚至可能这种交叉反应在癌症的治疗中是有益的，因为已经表明至少一些癌细胞系表达除FGFSb以外的其他同种型。

FGF8b的组织分布

理想的情况是，由自身疫苗引发的自身抗体和随后的效应器机制以及所预期的CTL应答仅仅针对于患者体内将要被清除的组织。因此，考虑到疫苗的安全性问题，作为自身疫苗的靶的抗原的组织分布是一个很重要的问题。

表：FGF8b在不同组织及细胞中的表达

人

乳腺癌细胞系                 ((RT-PCR)Tanaka1995,Payson1996.

MDA-MB-231,MDA-MB=415,ZR-    Wu1997,Marsh1999)

75-1,T-47-D,SK-BR-m,PMC-42,

HBL-100和MCF-7)

乳癌                         ((单抗)Taka1998,

                             (RT-PCR)Marsh1999)

正常的乳组织                 ((RT-PCR)Wu1997,Marsh1999

                                (单抗)Tanaka1998)

前列腺癌(93％)                  ((原位杂交)Leurng1996,Dorkin1999,

                                (单抗)Tanaka1998)

乳房疾病                        ((单抗)Tanaka1998)

前列腺肿瘤细胞                  ((RT-PCR)Tanaka1995,Ghosh1996,

(LNCaP,PC-3,DU145和             Schmitt1996)

ALVA-31)

胚肾                            ((RNA印迹)Ghosh1996)

成人前列腺、睾丸、肾、神经元    ((RT-PCR)Ghosh1996,Wu1997,Dorkin

                                1999)

畸胎瘤(Tera-2)                  ((RT-PCR)Wu1997)

鼠

乳腺癌细胞系                    ((RT-PCR)Yoshimura1996)

(SC-115,RENCA)

下丘脑、睾丸                    ((RT-PCR)Yoshimura1996)

乳癌(wnt-1转基因)               ((RNA印迹)MacArthur1995c)

胚脑                            ((原位杂交)Crossley1995,Heikinheimo

                                1994,Ohuchi1994,Schimamura1997

                                (RT-PCR)Blunt1997)

卵巢、睾丸                      ((RNA印迹)Valve1997)

发育中的脸和肢芽                ((多抗)MacArthur1995b,(原位杂交)

                                Heikinheimo1994,Ohuchi1994,Crossley

                                1995)

原胚肠                          ((原位杂交)Crossley1995)

小鸡

胚脑                            ((原位杂交)Crossley1996a)

发育中的肢芽                    ((原位杂交)Ohuchi1997a,b)

大鼠

前列腺和睾丸                    ((RT-PCR)Schmitt1996)

上面的表显示了组织分布的广泛选择和表达FGF8b的细胞系数据。正如表中所示，关于组织分布的大多数数据是利用敏感的RT-PCR方法产生的。这是因为RNA印迹分析在除了胎肾以外的任何正常的组织中均检测不到FGF8b mRNA。从这些稀有的数据中，普遍假定认为FGF8b mRNA在成人中的表达非常有限，并且因此，抗FGF8b的自身疫苗可能不与正常组织反应。由于在成人未知的系统中只有少量的FGF8b能够相互作用这一事实，此蛋白质的组织分布仍需进一步分析。但是，我们认为这并不表明抗FGF8b的自身疫苗会在患者体内导致严重的无正当理由的后果。

抗FGF8b抗体的效应

目前为止，尚未发表试图使用单克隆抗体治疗前列腺癌的文章。但是，在乳腺癌治疗研究中正在用单克隆抗体进行Ⅰ期临床试验。

抗FGF8b的单克隆抗体可能阻断了FGF8b和受体之间的相互作用，这将会抑制细胞膜变皱和细胞增殖，很可能降低了癌细胞的运动能力和侵害力。

因此，本发明也涉及本文所描述的方法的实施方案，其中外源T细胞表位被引入到已由SEQ ID NO:6所阐明的FGF8b部分氨基酸序列的下述位置：1-54和/或178-215和/或55-58和/或63-68和/或72-76和/或85-91和/或95-102和/或106-111和/或115-120和/或128-134和/或138-144和/或149-154和/或158-162和/或173-177位氨基酸位置。应该注意的是特别优选在26-45位氨基酸位置和自186-215位氨基酸起始的C端不引入突变或修饰，因为这些序列与最近发现的一种在一系列非肿瘤组织中表达的蛋白FGF-18之间的同源性最低。

因此，本发明也涉及人/鼠FGF8b的在人体内具有免疫原性的类似物，上述的类似物含有FGF8b大部分的所有已知的和推测的CTL和B细胞表位，并且至少包括一个正如在本文中讨论的外源T_H表位。优选的情况是至少存在一个外源T_H表位，插入到FGF8b部分氨基酸序列中，或替换FGF8b部分氨基酸序列或作为缺失FGF8b部分氨基酸序列的结果。本实施方案中最优选的类似物是在由SEQ ID NO:6所阐明的FGF8b部分氨基酸序列的下述位置：1-54和/或178-215和/或55-58和/或63-68和/或72-76和/或85-91和/或95-102和/或106-111和/或115-120和/或128-134和/或138-144和/或149-154和/或158-162和/或173-177位氨基酸位置引入了外源T细胞表位的类似物。

粘蛋白

本发明也涉及本发明的运用特别修饰的人粘蛋白分子，特别是MUC-1到MUC-4中的任何一个，优选MUC-1的方法。类似物含有以下结构

        TR(-S-P-S-(TR)_m)_n

其中TR是一个来自于自然发生的粘蛋白的串联重复，P是本文中所讨论的外源T_H表位，S是一个具有0到15个氨基酸残基优选0到10个氨基酸残基的惰性空间肽，n是一个从1到30的整数，m是一个从1到10优选从3到5的整数。

当在例如人细胞系中生产这样的一种粘蛋白类似物或从组织中纯化粘蛋白类似物时，直接产物通常情况下将不具备所希望的糖基化特征，即与肿瘤来源的粘蛋白相似的异常的糖基化特征。但是，可以通过合成的方法在例如大肠杆菌中重组生产这种类似物，随后酶促产物糖基化以使之获得肿瘤表达的MUC-1特异的Tn或s-Tn糖基化特征。另外，多肽可在哺乳动物或昆虫细胞系如果蝇细胞中制备，这些细胞缺少相关的酶或通过不发生糖基化过程的细胞内表达蛋白质(省略了分泌信号肽)。

本发明的核酸片段和载体

如上所述，类似物既可以通过重组基因技术又可通过化学合成或半合成的方法来制备。当修饰包含与一蛋白质载体(如KLH，白喉类毒素，破伤风类毒素和BSA)和非蛋白质分子如碳水化合物多聚物偶联时，并且当修饰也含有多肽来源的肽链加入侧链或侧基团，后两种方法尤其有用。

就重组基因技术而言，和当然就核酸免疫而言，编码必需的表位区和类似物的核酸片段也是重要的化学产物。因此，本发明的一个重要部分涉及编码上面所述的任何一种相关的肿瘤特异性多肽的类似物的核酸片段，优选的多肽其中已经通过插入和/或添加，优选通过替换或缺失的方法引入外源T_H细胞表位。本发明的核酸片段是DNA或RNA片段。

本发明的核酸片段通常情况下被插入到合适的载体中以形成携带有本发明核酸片段的克隆或表达载体，这些新型的载体也是本发明的一部分。关于构建本发明这些载体的细节将在下面转化细胞和微生物一文中讨论到。依据应用的目的和类型，载体可以是质粒、噬菌体、粘粒、微小染色体或病毒的形式，只在某些细胞中瞬时表达的裸DNA也是一种重要载体。本发明优选的克隆和表达载体是可以自主复制的，因此为了高水平表达或用于随后克隆的高水平复制的目的，可以获得高拷贝数。

本发明载体的一般轮廓是在5’-3’方向和可操作的联接处包含以下特征：起始本发明的核酸片段表达的启动子，任选的一编码可使多肽片段分泌或结合在膜上的引导肽的核酸片段，本发明的核酸片段，和编码终止子的核酸片段。当在生产菌株或细胞系上操作表达载体时，为了转化细胞的遗传稳定性优选的方法是当载体被导入宿主细胞后整合到宿主细胞基因组上。相反，当在动物体内操作将导致体内表达的载体时(即当使用DNA接种中的载体时)，为安全起见优选的是此载体不能整合到宿主细胞基因组中；典型的是，当用到裸DNA或非整合的病毒载体时，本领域熟练技术人员熟知应该选择哪一个。

本发明的载体被用于转化宿主细胞以产生本发明的类似物，也作为本发明的一部分的这些转化的细胞可以是用于本发明核酸片段和载体增殖的细胞和细胞系，也可以是用于重组生产本发明的类似物的细胞和细胞系。另外，被转化的细胞也可以是合适的活疫苗株，其中核酸片段(单一或多个拷贝)已经被插入以造成类似物的分泌或者结合到细菌细胞膜或细胞壁上。

本发明优选的转化细胞是微生物如细菌(如艾希氏杆菌属(例大肠杆菌)，杆菌(例subtilis杆菌)，沙门氏菌，或分支杆菌(优选非致病性的，例牛结核杆菌卡介苗))，酵母(酿酒酵母)和原生动物。另外，被转化的细胞也可以来自多细胞的有机体，如真菌类，昆虫细胞，植物细胞或哺乳动物细胞。最优选的是人的细胞，见下面关于细胞系和载体的讨论。

为了克隆或优化表达的目的，优选的情况是被转化的细胞可以复制本发明的核酸片段。表达核酸片段的细胞是本发明优选的有用的实施方案；它们可被用于在非致病性细菌中小规模或大规模地制备类似物或在活疫苗中作为疫苗成分。

当使用转化细胞生产本发明的被修饰的OPGL时，表达产物或者是被分泌到培养液中或者是被运送到转化细胞的表面上是很方便的，尽管不是最重要的。

当一株有效的生产细胞已经被鉴别出时，在其基础上，优选的情况是建立携带有本发明的载体并能表达编码类似物核酸片段的稳定的细胞系。更优选的情况是，这个稳定的细胞系分泌或携带有本发明的类似物，因此利于其纯化。

通常情况下，含有复制子和来自与宿主细胞相容的物种的控制序列的质粒载体常与宿主细胞一起使用。此载体通常带有一个复制位点，以及可在转化细胞中提供表型选择的标记序列，例如，最典型的是用来自大肠杆菌种的pBR322质粒转化大肠杆菌(见，例Boliver等，1997)。pBR322质粒含有氨苄青霉素和四环素抗性基因，因此为鉴定转化细胞提供了简单的方法。pBR质粒或其他细菌质粒或噬菌体也必须含有、或被修饰后含有可被真核微生物用于表达的启动子。

最常被用于重组DNA构建的启动子包括B-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子系统(Chang等，1978；Itakura等，1977；Goeddel等，1979)和色氨酸启动子系统(Goeddel等，1979；EP-A-0036776)。在经常使用这些最常用的启动子的同时，也发现和使用其他的微生物启动子，关于它们的核酸序列的资料已经发表，以使本领域熟练技术人员能将其与质粒连接使用(Siebwenlist等，1980)。在大肠杆菌中某些原核基因可在它们自己启动子控制下有效地表达，从而排除了通过人工方法加入另外一个启动子的需要。

除了原核生物外，真核微生物如酵母培养物也可以使用，并且在此启动子能够启动表达。酿酒酵母和面包酵母是在真核微生物中最常用的，尽管其它一些菌株也是可用的。对于在酵母中的表达而言，YRp7质粒是普遍使用的(Stinchcomb等，1977；Kingsman等，1979；Tschemper等，1980)。这个质粒已含有为在色氨酸例如ATCC NO44076或PEP4-1(Jones,1977)中失去生长能力的酵母突变株提供选择标记的trp1基因。trp1基因损伤作为酵母宿主细胞基因组的一个特征，为利用在色氨酸不存在的情况下生长来检测转化提供了一个有效的环境。

在酵母载体中合适的启动子序列包括3-磷酸甘油激酶的启动子(Hitzman等，1980)或其它糖酵解酶(Hess等，1968；Holland等，1978)，例如烯醇酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，葡萄糖-6-磷酸异构酶，3-磷酸甘油变位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖异构酶，磷酸葡萄糖异构酶和葡(萄)糖激。在构建合适的表达质粒时，与这些基因有关的终止序列也被连接到表达载体序列的3’端以期望表达产生mRNA多聚腺苷酸尾巴并终止。

具有转录被控制在生长条件之下的额外优点的启动子有酒精磷酸脱氢酶2，细胞色素C，磷酸(酯)酶，与氮代谢有关的降解酶，和前述的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，以及和麦芽糖和半乳糖代谢有关的酶的启动子区。任何含有酵母相容的启动子、复制起始区和终止序列的质粒载体都是合适的。

除了微生物，来自多细胞生物的细胞培养也可被用做宿主细胞。在理论上，任何这样的细胞培养都是可行的，无论来自脊椎动物培养还是来自无脊椎动物培养。但是，我们对脊椎动物细胞最感兴趣，并且近年来在培养中繁殖脊椎动物(组织培养)已经成为常规方法(组织培养，1973)。这些有用的细胞系有VERO和Hela细胞系，中国仓鼠卵巢细胞系(CHO)，和W138,BHK,COS-7,293和MDCK细胞系。

这些细胞的表达载体通常包括(如果需要的话)复制的起始子，存在于被表达基因之前的沿着任何必要的核酶结合位点的启动子，RNA剪接位点，多聚腺苷酸化位点和转录终止序列。

为用于哺乳动物细胞，表达载体上的控制功能常由病毒成分提供，例如，普遍使用的启动子来自polyma，腺病毒2型，以及最常用的猴病毒40(SV40)。SV40的早期和晚期启动子尤其有用，因为它们作为含有SV40病毒的复制起始的片段很容易从病毒中获得(Fiers等，1978)。如果在病毒的复制起始区从HindⅢ位点到BglⅠ位点大约250bp的序列被包含在内的话，SV40的稍大一些的片段或稍小一些的片段也可被使用。而且，如果这控制序列与宿主细胞系统相容的话，使用与所期望的基因序列有关的启动子或控制序列也是可能的，并且常是我们所希望的。

复制起始区可由构建载体时包括一外源的起始区例如可能由SV40或其他病毒(例如polyma，腺病毒，VSV,BPV)提供，也可由宿主细胞染色体复制机制提供。如果载体整合入宿主细胞染色体的话，后者就足够了。

本发明的组合物

本发明也涉及一种免疫原性组合物，此组合物含有至少一种本文所描述的与药物学和免疫学可接受的载体、运送工具、稀释剂、赋形剂和任选的佐剂混合在一起的作为有效的免疫原性作用剂的类似物，也见上面关于本发明方法的叙述中对这些实体的讨论。

而且，本发明也涉及可以诱发抗上面所讨论的任何一种肿瘤抗原的抗体产生的组合物，此组合物含有

------本发明的核酸片段或载体，和

------药物学和免疫学可接受的稀释剂和/或运送工具和/或载体和/或赋形剂和/或佐剂

在上面关于核酸免疫的相关部分讨论了这些组合物的配制和其它细节。

实施例1

抗PSM接种

下面将会叙述如何通过插入一个或多个混栖外源T细胞表位对分子进行修饰成为一系列具有免疫原性的PSM分子而发展抗PSM的人自身疫苗的。

将测试构建物诱发特异的针对带有PSM的肿瘤细胞的CTL应答的能力。而且，将测试这些构建物诱发能与PSM分子的天然部分发生交叉反应的抗体生成的能力，随后，将在几例体外分析和体内动物模型中评价不同构建物的效率。将测试所诱发的抗体通过经典途径激活补体的能力和通过Fc受体启始ADCC的能力。最后，将在人前列腺的动物模型中测试不同的分子。

设计PSM自身疫苗的策略

简言之，PSM接种计划包含下列实验任务：

设计和生产一系列的人PSM突变体

------克隆人和大鼠/小鼠的PSM序列。

------进行突变以产生具有免疫原性的hPSM分子。

------在大肠杆菌和/或Pichia Pastoris和/或哺乳动物和/或昆虫细胞(如S2细胞)中表达野生型和免疫原性的hPSM分子。

------纯化、再折叠和鉴定免疫原性的hPSM分子。抗PSM DNA接种

------构建编码免疫原性hPSM分子的hPSM DNA接种载体。

------体外或体内实验测试hPSM接种载体。候选hPSM的选择

------接种小鼠/兔子

------ELISA

------FACS分析

------当有抗体应答时，进行肿瘤增殖分析

------T细胞分析

体内测试hPSM突变体

------小鼠中实体瘤/转移瘤模型

概念研究：由自身疫苗引发的CTL

------构建与选择出的候选hPSM一致的具有免疫原性的小鼠/大鼠

PSM(如以DNA疫苗的形式)。

------体外分析测试由大鼠/小鼠PSM产生的免疫应答：免疫组化分

析、ELISA、FACS分析、细胞分析、补体裂解带有PSM的细胞、

ADCC分析、CTL活性分析、肿瘤细胞增殖分析、T细胞呈递分

析

------在一个小鼠实体瘤/转移瘤模型中测试mPSM突变体

hPSM构建物的命名

PSM是一个750氨基酸的Ⅱ型膜蛋白，见SEQ ID NO:2的野生型序列，其中由于引入了一个NcoⅠ酶切位点在位置2上用Gly代替了Trp；和SEQ ID NO:1的Kozak序列，其中在位置4-6上用ggt替换了tgg。但是，天然的PSM分子(即在位置2上有Trp的PSM分子)也已被用于一些以人PSM为基础的自身疫苗。

在PSM分子中，细胞外部分含有707个C末端氨基酸，而预测细胞内部分为19个氨基酸，蛋白的跨膜部分由24个氨基酸组成(20-43氨基酸)。

剪接突变体PSM’也被用于作为构建物的起始点。我们的这种剪接突变体分子具有与SEQ ID NO:2中58-750位氨基酸对应的氨基酸序列。为易于命名，根据在PSM分子中的编号而对PSM’中的区进行编号(意思是例如区2由PSM中87-108位氨基酸和PSM’中30-51位氨基酸组成)，也见下面关于区的讨论。

所有人PSM的构建物被命名为hPSM_._(或hPSM’_._，如果PSM’被用做起始点的话)，其中，第一个_指P2插入区，第二个_指P30插入区。如果此蛋白中无P2或P30区，则命名为0。全长的野生型hPSM被命名为hPSM0.0，并且缺少细胞内部分和跨膜部分的野生型hPSM被命名为hPSM÷0.0。设计的13个具有免疫原性的并且都含有一个P2表位和一个P30表位的hPSM基因分别被命名为hPSM1.1,hPSM6.1,hPSM8.1,hPSM10.1,hPSM1.6,hPSM1.8,hPSM1.10,hPSM1.2,hPSM1.3,hPSM1.5,hPSM2.1,hPSM3.1,hPSM10.3,hPSM6.3,hPSM’10.3,hPSM’6.3,hPSM8.3,hPSM’8.3，和hPSM5.1，见下面的详细讨论。

在hPSM1.1中，P2和P30表位串联插入到1号插入区(跨膜区)。理论上来讲，hPSM1.1这个突变体被认为是可以诱发抗体生成的最具有吸引力的候选疫苗，因为这个分子的整个细胞外结构域是完整的。对于使用核酸免疫诱导CTL应答，构建物如hPSM10.3和hPSM6.3被认为是有用的。

为了简化克隆和诱变流程，很多的分子构建工作使用hPSM基因的N端(1-436氨基酸)或C端(437-750氨基酸)作为启始材料。HPSM基因的这两部分被命名为HpsmⅠ_._和HpsmⅡ_._，第一个_指P2插入区，第二个指P30插入区。同样，如果此蛋白中无P2或P30区，则命名为0。野生型被命名为hPSMⅠ0.0和hPSMⅡ0.0,hPSMⅠ0.0的一个不带hPSM细胞内部分的特别突变体被命名为hPSMⅠ÷0.0。

实际操作中，大多数的诱变工作使用hPSMⅠ0.0和hPSMⅡ0.0作为启始材料。

表达的hPSM突变体蛋白被命名为PROS_._，其中，第一个_指P2插入区，第二个指P30插入区。如果此蛋白中无P2或P30区，则命名为0。野生型hPSM被命名为PROS0.0,PROSⅡ0.0是hPSM437-750位氨基酸的蛋白质产物。HIS标记的蛋白被称做HIS-PROS_._。SEQ IDNO:21被用于在细菌和酵母中表达组氨酸标记，而SEQ ID NO:23被用于在哺乳动物细胞中表达组氨酸标记。

克隆人PSM序列

起源于人前列腺腺瘤的一个转移病灶的LNCaP细胞系购自美国典型培养物收集公司(ATCC)。从此细胞中提取mRNA并用标准试剂盒对其进行逆转录以获得编码人PSM的cDNA。使用不同组的hPSM特异的引物，得到编码PSM(437-750氨基酸)的PCR产物，然后将其克隆入pUc19(质粒编号pMR300)质粒中并测序证实。这个野生型PSM的C末端部分被命名为hPSM第Ⅱ部分(hPSMⅡ0.0)。

相似的，使用用于扩增带有(hPSMⅠ0.0)和不带有(hPSMⅠ÷0.0)跨膜区和细胞内结构区的第一部分的引物，野生型hPSM第一部分(hPSMⅠ0.0)已被克隆入pUc19质粒中。克隆被测序证实，在EcoRⅠ位点连接hPSMⅠ0.0和hPSMⅡ0.0并使其融合。hPSM0.0(SEQ ID NO:2)和hPSM÷0.0的产物克隆已被亚克隆入一些蛋白和真核表达载体中并再次测序证实。使用cDNA作为启始材料，也构建了人PSM的细胞内表达形式(命名为hPSM’-SEQ ID NO:2中58-750氨基酸)。这个序列也已被亚克隆入哺乳动物表达载体中并被用做一些hPSM自身疫苗构建物的启始材料，例如hPSM’10.3和hPSM’6.3。

克隆大鼠和小鼠的PSM序列

两个含有鼠PSM cDNA序列(分别来自鼠胚肾和鼠巨噬细胞)的EST(表达标记物序列)克隆购自美国典型培养物收集公司(ATCC)。这两个EST克隆都覆盖有鼠PSM cDNA序列，因此全长的小鼠PSM(SEQ ID NO:7和8)以及书PSM’(SEQ ID NO:9和10)被亚克隆入细菌载体和哺乳动物表达载体，通过将P30插入到PSM cDNA中也已构建了鼠PSM AutoVac构建物。

在大肠杆菌中表达野生型hPSM

为了获得易于大规模纯化和易于用抗多聚组氨酸抗体进行鉴定的带有N末端多聚组氨酸(HIS)尾巴的产物，hPSM的C末端部分(437-750氨基酸)，hPSMⅡ0.0已被克隆到细菌表达载体pET28b中，在大肠杆菌中表达带有多聚组氨酸标记的hPSMⅡ0.0蛋白产物(蛋白产物被命名为HIS-PROSⅡ0.0)。

编码野生型hPSM截短部分hPSM÷cyt0.0DNA也已被克隆到pET28b中并在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中表达，其中表达产物存在于包涵体内。细菌裂解物的SDS-PAGE分析显示出一个带有我们所希望的迁移率的产物，用大鼠抗HIS-PROSⅡ0.0的抗体进行蛋白印迹分析也得到了希望的条带。而且，对从凝胶中洗脱出来的这个蛋白产物的N末端5个氨基酸进行测序也得到了我们所希望的氨基酸序列。

为了能够在大肠杆菌中获得更有效的表达和重组蛋白一定程度的折叠，野生型hPSM的构建物hPSM0.0,hPSM÷0.0(以及两个hPSM突变体hPSM1.1和hPSM6.1，见下)已被克隆到不同的大肠杆菌表达载体中。所选择的表达系统是：

能够对所表达的重组蛋白产生N末端组氨酸标记的pMCT6。

能使表达的重组蛋白与一个22氨基酸的pelB引导序列连接而引导蛋白到大肠杆菌间质区的PGH433，和

pMa1-p2，其中表达的重组蛋白C末端与含有天然MBP间质引导序列的麦芽糖结合蛋白(MBP)融合。抗MBP的抗体可用于检测此融合蛋白并且碳水化合物偶联柱可用于这个蛋白产物的亲和纯化。

但是，只有在pMCT6中这些载体的野生型hPSM蛋白的大肠杆菌表达实验才显示出相当好的表达水平。至今尚未解决野生型hPSM蛋白的间质表达这个问题。

在Pichia pastoris中表达野生型hPSM

由于PSM蛋白相对较高的分子量及其相对较高的糖基化程度(分子量的16％)，并且为了通过去除再折叠步骤而简化纯化流程，已经决定实施重组蛋白真核表达的替代技术。已经评价了几种鉴定良好的真核表达系统，为了最初筛选hPSM突变体，Pichia pastoris酵母被选择以替换大肠杆菌表达系统。

一个基于Pichia pastoris酵母之上的表达系统以被用于PSM构建。由于重组蛋白较少分枝的甘露糖糖基化特征，我们希望在这种有机体中表达出来的重组蛋白的糖基化特征与哺乳动物而不是Saccharomycescerevisiae的糖基化特征相似。已经表明，与液相胞饮摄取相比，由甘露糖受体介导的树突状细胞摄取此种抗原导致呈递给T细胞的效率提高大约100倍。因此，对于hPSM突变体的抗原性(特别是诱导CTL应答的能力)以及其他希望得到针对其CTL应答的抗原来说甘露糖糖基化可能起一个重要作用。

Pichia pastoris菌株以及两个不同的表达载体已购自Invitrogen公司。PPICZαA载体携带有甲醇诱导多克隆位点的上游启动子，而pGAPZαA载体能持续表达蛋白。为了将重组蛋白输出到培养液中，上两载体都编码α因子分泌信号。这些载体的选择系统是Zeocin抗性的。编码hPSM0.0和hPSM÷0.0(以及一种hPSM突变体hPSM1.1，见下)的序列已被亚克隆入这些载体中(框内带有一个C末端的c-myc鉴定表位，SEQ ID NO:2)。

利用电穿孔技术使每一种这些(线性的)质粒转化生长要求不同的4中Pichia pastoris菌株(X-33,SMD1168,GS115和KM71)。为了获得大量的Zeocin抗性的克隆，转化流程几乎不做改变被重复几次。在Pichia pastoris系统中也表达了野生型hPSM÷0.0(以及hPSM1.1，见下)。使用抗hPSM的单克隆抗体和抗c-myc的单克隆抗体作为一抗对转化的Pichia pastoris菌株的裂解物进行蛋白印迹可以检测出表达产物，但是表达产物被检测出是在细胞内。

在哺乳动物细胞中表达野生型hPSM

一种使用CHO(中国仓鼠卵巢)细胞的表达系统也将被用于最终检测以及生产选择的分子。

目前为止，已经使用在哺乳动物表达载体pcDNA3.1中带有或不带有框内引导序列的野生型hPSM和hPSM1.1转染CHO细胞，已经得到遗传霉素抗性的细胞。用同样的构建物瞬时转染COS细胞，使用抗hPSM的单克隆抗体对细胞沉淀进行蛋白印迹分析检测出了hPSM0.0和hPSM1.1。

hPSM的组织分布

为了确定能否在不同的人体组织包括前列腺、血液和脑中检测出hPSM的表达而购买了商用试剂盒。此方法是基于斑点印迹检测从50种不同的人体组织中提取的含有多聚腺苷酸尾巴的mRNA。初步结果并未显示在组织如血液或脑中hPSM过量表达。但是，本发明实施的优先期后，其他人已经证明了PSM在其他组织中的存在，见上。

设计hPSM突变体

当在hPSM中设计突变时，此分子的一些区很重要应该保存在修饰的构建物中，例如潜在的和鉴定的T细胞表位，B细胞表位以及二硫桥半胱氨酸残基。因此，在PSM序列中已经鉴定出这些“禁止”区，剩下少许约20个或更多氨基酸的用于插入P2和P30外源T辅助表位的“开放”区。每一个定义中，跨膜区也被认为是“开放”区，因为抗此区的抗体是无关抗体并且认为清除此序列增加了突变的PSM蛋白的可溶性，但不能排除此区含有重要的CTL表位，因此，在例如hPSM10.3中保存了跨膜区。

根据我们关于自身疫苗将引发CTL应答这个预期，在构建物中鉴定和保存潜在的亚优势的CTL表位很重要。从文献中已经知道两个这样的表位：1)含有PSM 4-12氨基酸(LLHETDSAV)的肽能被呈递到人MHCⅠ类分子HLA-A2.1上(Tjo1996)，和2)PSM(711-719氨基酸)(ALFDIESKV)也结合HLA-A2.1(ref25)。为了鉴定如Rammensee等所述的(Rammensee,1995)HLAⅠ类分子集合基序的初始锚残基，我们也已在PSM中寻找最丰富的HLAⅠ类分子类型(HLA-A1,HLA-A2,HLA-A3,HLA-A23,HLA-A24，和HLA-A28)，总共构成群体中HLA-A类型的80％。而且，可能的HLA-B和HLA-C表位也已被鉴定并命名为“禁止”区。

由于最初想用C57/黑×SJL F1杂交鼠以防万一决定使用转基因鼠检测PSM自身疫苗构建物，某些潜在的鼠H-2^b和H-2^sT辅助表位已被鉴定并被认为是“禁止”区。

在PSM分子中保存已知的抗体结合区也很重要，因为它们可能在诱发特异的抗PSM自身抗体产生中很重要。已经描述了5个这样的结合区：PSM(63-68),PSM(132-137),PSM(482-487)(WO94/09820),PSM(716-723)和PSM(1-7)(Murphy,1996)。使用Hopp和woods的方法计算机预测抗原性决定簇，预测了5个区：PSM(63-69),PSM(183-191),PSM(404-414),PSM(479-486)和PSM(716-723)(Hopp,1983)，其中一些与实验发现的B细胞表位重叠。这些区也将被保存在PSM候选疫苗分子汇总。

PSM蛋白含有4个半胱氨酸残基(22,196,466和597位氨基酸残基位置)，由于它们可能在形成二硫桥时很重要，所以它们将被保存在免疫原性构建物中。

根据上面提到的hPSM蛋白中的“禁止”区和“开放”区，鉴定出10个适合于插入外源T细胞表位的区：

在hPSMⅠ(从起始位点到EcoRⅠ位点，1-437氨基酸)中的插入区：

1区：PSM中16-52位氨基酸(跨膜区前面4个氨基酸。跨膜区

     (24个氨基酸)和跨膜区后面9个氨基酸，工37个氨基

     酸)

2区：PSM中87-108位氨基酸，PSM’中30-51位氨基酸(22个

     氨基酸)

3区：PSM中210-230位氨基酸，PSM’中153-173位氨基酸(21

     个氨基酸)

4区：PSM中269-289位氨基酸，PSM’中212-232位氨基酸(21

     个氨基酸)

5区：PSM中298-324位氨基酸，PSM’中241-267位氨基酸(27

     个氨基酸)

在hPSMⅡ(从EcoRⅠ位点到终止位点，437-750氨基酸)中的插入区：

6区：PSM中442-465位氨基酸，PSM’中385-408位氨基酸(24

     个氨基酸)

7区：PSM中488-514位氨基酸，PSM’中431-457位氨基酸(27

     个氨基酸)

8区：PSM中598-630位氨基酸，PSM’中541-573位氨基酸(33

     个氨基酸)

9区：PSM中643-662位氨基酸，PSM’中586-605位氨基酸(20

     个氨基酸)

10区：PSM中672-699位氨基酸，PSM’中615-642位氨基酸(28

      个氨基酸)

在图4中图解表示了插入区和“禁止”区。

通过使用P2或P30从上面所列出的插入区中的2个位置替换部分氨基酸，将构建许多不同的免

疫原性PSM构建物。每一个突变体蛋白将会因此含有P2和P30，尽管这样的构建只是值得模仿的——单一突变体也在本发明的范围之内。在实验中，将分别在hPSMⅠ和hPSMⅡcDNA克隆中进行突变，随后连接(在EcoRⅠ位点)而结合这两个突变的部分。为产生突变体，P2和P30表位最初被插入1,2,3,5,6,8和10插入区中。

P2和P30的序列是：

P2:QYIKANSKFIGITEL(SEQ ID NO:12,15个氨基酸)，在此例中由核苷酸序列cag tac atc aaa gct aac tcc aaa ttc atc ggt atc acc gag ctg编码(SEQ ID NO:11,45个核苷酸)，其中粗黑体序列是SacⅠ位点。也可能根据克隆载体和表达系统而选择使用其他密码子。

P30:FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ ID NO:14,21个氨基酸)，在此例中由核苷酸序列ttc aac aac ttc acc gta agc ttc tgg ctg cgt gttccg aaa gtt agc gCT AGC cac ctg gaa所编码(SEQ ID NO:13,63个氨基酸)，其中粗黑体表示HindⅢ位点，单下划线表示Eco47Ⅲ位点，大写字母为BstNⅠ位点，双下划线为NheⅠ位点。

下面的表总结了本文中使用的人PSM构建物：

构建物      P2在蛋白中的位置    P30在蛋白中的位置

hPSM0.0       ÷                                     ÷

hPSM÷0.0     ÷                                     ÷

hPSM’0.0     ÷                                     ÷

hPSM1.1       17-31               32-52

hPSM6.1       448-462             21-41

hPSM8.1       606-620             21-41

hPSM10.1      674-688             21-41

hPSM1.6       24-38               443-463

hPSM1.8       24-38               607-627

hPSM1.10      24-38               673-693

hPSM1.2       24-38               87-107

hPSM1.3       24-38               210-230

hPSM1.5       24-38               301-321

hPSM2.1       91-105              21-41

hPSM3.1       213-227             21-41

hPSM5.1       305-319             21-41

hPSM8.0       606-620             ÷

hPSM10.0      674-688             ÷

hPSM0.1       ÷                                     21-41

hPSM1.0       24-38               ÷

hPSM6.3       448-462             210-230

hPSM8.3       606-620             210-230

hPSM10.3      674-688             210-230

hPSM’6.3     391-405             153-173

hPSM’8.3     549-563             153-173

hPSM’10.3    617-631             153-173

hPSM突变体的分子构建

已经使用hPSMⅠ0.0和hPSMⅡ0.0作为起始材料进行了突变以插入P2和P30编码序列。

为了产生大多数的hPSM突变体，P2和P30首先在插入位置1处被插入到hPSMⅠ0.0中。随后产物(分别是hPSMⅠ1.0和hPSMⅠ0.1)被用做诱变的起始材料以在2,3和5位置处插入P2和P30，并被用做与表位突变的hPSMⅡ连接的起始材料。使用SOE(单重叠延伸)PCR构建hPSMⅠ1.0并随后测序证实。使用“快速改变”技术构建hPSMⅠ0.1并经测序证实。

使用SOE-PCR将P2表位插入到hPSMⅠ1.0的2,3和5位置处以产生hPSMⅠ1.2,hPSMⅠ1.3和hPSMⅠ1.5。这些构建物与hPSMⅡ0.0组合以产生hPSM1.2,hPSM1.3和hPSM1.5。

利用SOE-PCR技术以hPSMⅠ0.1为起始材料构建了hPSMⅠ2.1,hPSMⅠ3.1和hPSMⅠ5.1。为了生成全长突变体hPSM2.1,hPSM3.1和hPSM5.1，这个材料已经在EcoRⅠ位点通过连接与hPSMⅡ0.0组合在一起。

为了使用“快速改变”技术产生hPSMⅡ6.0,hPSMⅡ8.0和hPSMⅡ10.0,P2表位被插入到hPSMⅡ0.0的三个不同位置上，这些克隆随后经测序证实。

然后，hPSMⅠ0.1分别与hPSMⅡ6.0,hPSMⅡ8.0和hPSMⅡ10.0连接以获得hPSM6.1,hPSM8.1和hPSM10.1，并且克隆经测序证实。

现在已经使用SOE-PCR方法在hPSMⅡ中插入了P30表位以产生hPSMⅡ0.6,hPSMⅡ0.8和hPSMⅡ0.10。

使用两次双步骤PCR突变随后在表位序列中HindⅢ位点通过连接构建了hPSM1.1。全长构建物经测序证实。

使用SOE-PCR已经构建了hPSM10.3,hPSM’10.3和hPSM6.3。其它几种P2和P30插入到hPSM分子细胞外部分的hPSM突变体正在构建之中(hPSM’6.3,hPSM8.3和hPSM’8.3)。

出来当初构想的每个都含有P2和P30的突变体以外，已经构建并测序证实了只含有单一外源表位的4种突变体hPSM1.0,hPSM8.0,hPSM10.0和hPSM0.1。

在大肠杆菌中表达hPSM突变体

在小规模实验中，用pET28b载体在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中表达了七种hPSM突变体hPSM1.1,hPSM6.1,hPSM8.1,hPSM10.1,hPSM2.1,hPSM3.1和hPSM5.1，并且用考马斯亮蓝对SDS-PAGE凝胶染色鉴定显示有预期大小的IPTG诱导产物。但是未检测到hPSM1.1产物。与野生型构建物hPSM÷0.0相比，这些hPSM突变体的表达水平非常低。从这一点上来说，要想使用pET系统在大肠杆菌中相当高水平地表达hPSM突变体似乎不可能，因此有必要使用其它的大肠杆菌表达系统和/或其它的宿主有机体。

如上所述，hPSM0.1和hPSM1.1已经被亚克隆到不同的大肠杆菌表达载体中以产生

------使用pMCT6载体表达的带有N末端组氨酸标记的重组蛋白，

------使用pGH433载体表达的带有pelB前导序列，可引导蛋白至大肠杆菌细菌的间质区的蛋白，和

------使用pMal-p2载体表达的与麦芽糖结合蛋白(MBP)在C末端融合的重组蛋白

目前为止，以上任何一种构建物均未获得足够水平的表达。

既然hPSM0.0能够在大肠杆菌中很好地表达，并且与此同时并未观察到全长hPSM0.0或hPSM突变体具有相似的表达水平，因此可能是hPSM分子的细胞内部分的存在不知何原因“抑制”了全长hPSM构建物在大肠杆菌中的表达。为了验证这种假设，我们首先构建了两种不带细胞内结构区的基因构建物hPSM1.1和hPSM6.1。但是，在大肠杆菌中的表达实验显示这些不带胞内结构区的产物只有微弱表达。

在Pichia pastoris中表达hPSM突变体

为了在Pichia pastoris中表达hPSM1.1突变体蛋白，hPSM1.1序列被亚克隆(框内带有一个C末端c-myc鉴定表位，SEQ ID NO:27)到两个不同的表达载体pPICZαA和pGAPZαA中，并经测序证实。在转化的Pichia pastoris菌体内检测到了hPSM1.1的表达(以及hPSM÷0.0，见上)。

在哺乳动物细胞内表达hPSM突变体

如上所述，hPSM1.1已经被克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3.1(+)和pZeoSV2中，这些构建物(以及其它的构建物)可被用于在CHO细胞中表达。已经在COS细胞中获得并证实了hPSM1.1和hPSM0.0的瞬时表达。

如果有效的话，DNA接种非常适合于PSM自身疫苗--特别是因为已经表明这种接种方式可以增强CTL介导的免疫反应和抗体产生。因此，有意施行一项平行研究，目的在于研究用合适的编码具有免疫原性的小鼠泛素和/或鼠TNFα的载体对小鼠进行DNA接种的效果。也将使用编码hPSM(和/或突变体)的裸DNA进行DNA接种。

使用免疫原性的泛素进行DNA接种的可行性研究

使用带有插入的来自于模蛋白卵清蛋白(UbiOVA)的T_H细胞表位的泛素进行了一项旨在揭示免疫原性自身蛋白DNA接种效果的可行性研究。编码UbiOVA以及野生型泛素的序列被亚克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3.1(-)中。

每组5只BALB/c小鼠四头肌肌内注射或皮内接种40微克pcDNA-UbiOVA构建物或者pcDNA-泛素构建物。对照组接种混合在完全弗氏佐剂中的UbiOVA蛋白，3到6周后重复免疫一次，但UbiOVA蛋白此次是乳化在不完全弗氏佐剂中。

定期对小鼠采血并测定抗泛素抗体的滴度。在UbiOVA DNA接种组，只获得了非常弱的抗泛素抗体滴度。随后，所有各组都用乳化在不完全弗氏佐剂中的UbiOVA蛋白加强免疫并采血以确定是否和UbiOVA(而不是泛素)一起进行DNA接种能够使抗体应答针对UbiOVA蛋白。这个实验的结果表明在UbiOVA组和对照组之间无显著差异，UbiOVA乳化在不完全弗氏佐剂中单一加强棉衣往后，所有小鼠都发展出强的抗泛素的抗体。

使用hPSM构建物进行DNA接种

目前，正在进行各种使用hPSM构建物的DNA接种实验。各种不同的人野生型PSM和AutoVac构建物(如hPSM0.0,hPSM÷0.0,hPSM’0.0,hPSM1.1,hPSM10.3)已经被亚克隆到DNA接种载体(如pcDNA3.1(+),pcDNA3.1(-),pVAX和pZeoSV2)中。在一些这样的构建物中，不同的引导序列(如CD11a,tPA和IL-5引导序列；SEQ ID Nos：分别是29,25和31)已经被直接包括在N末端或框内以引导体内所表达的hPSM的分泌。所有这些在DNA接种载体中的构建物都已经被测序和体外翻译所证实。

已经对不同品系的小鼠(如Balb/cA,Balb/cJ,DAB/2和A/J)皮内或肌内接种上述的hPSM DNA疫苗，并用同样的构建物加强免疫几次。

在免疫过程中采集血清并-20℃冻存。将分析这些样品中是否存在可与野生型hPSM反应的抗体。

同时，也在这些小鼠中建立了监测CTL和T辅助增殖应答的分析方法，初步结果表明能够诱发针对hPSM的CTL以及抗体应答。

纯化/鉴定组氨酸标记的hPSM(437-750)(HIS-PROSⅡ0.0)

使用pET28b系统表达组氨酸标记的野生型hPSMⅡ(HIS-PROSⅡ0.0)，已溶解的包涵体经过凝胶过滤FPLC柱并洗脱在含有8M尿素的缓冲液中。含有hPSMⅡ的主要部分经受各种再折叠条件以优化流程，通过SDS-PAGE银染分析估计在Tris缓冲液中透析过的可溶性产物的纯度在90％以上。

使用纯化的HIS-PROSⅡ0.0免疫大鼠以产生抗血清，用于后来的检测和可能用于hPSM突变体的亲和纯化。

纯/鉴定可溶性的hPSM(PROS÷0.0)

已经在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中表达了缺少胞内结构区和跨膜区部分的野生型hPSM,PROS÷0.0，用IPTG诱导之后可在包涵体内检测到此蛋白。对这种细菌裂解物进行SDS-PAGE电泳随后使用大鼠的抗HIS-PROSⅡ0.0抗体进行蛋白印迹显示出具有我们预期的迁移率的产物。从SDS-PAGE凝胶中洗脱出来的这种产物的N末端头5个氨基酸测序的结果显示与人PSM一致的序列。产物经过一大系列的溶解和再折叠实验，在没有变性剂或还原剂的Tris缓冲液中可以得到一种可溶形式的产物，但SDS-PAGE分析显示这种产物可能形成大的聚合物。为了分析的目的，已用这种产物免疫大鼠和小鼠以产生抗PSM抗体--抗血清不与LNCaP hPSM反应。

已经制备了PROS÷0.0一批洗过的包涵体用于免疫大鼠以期产生抗hPSM的多克隆抗血清。在湿沉淀中所含的大约50％的蛋白内容物是PROS÷0.0。在蛋白印迹中抗血清不与LNCaP hPSM反应。

制备用于免疫的KLH结合的hPSM肽

为了制备hPSM已知的B细胞表位和免疫学的载体分子结合的免疫原性偶联物以获得能够识别hPSM的多克隆抗血清，合成了3条肽。这些肽含有hPSM的B细胞表位并在其每一端加有5到6个旁侧hPSM氨基酸。

这些肽是通过自动合成、HPLC纯化和利用Edman降解控制测序而制备的。

使用一个标准的一步法用戊二醛作为交联剂通过交联含有hPSM多肽KLH的B细胞表位而制备了化学联结的偶联物。

用hPSM旁侧序列合成P2和P30肽

已经设计了6条与P2和P30表位一致的并在每一端都带有5个hPSM旁侧氨基酸的肽。旁侧氨基酸对应于表位插入点6,8和10。这些肽将被用于例如T细胞增殖分析，而且也可用于其它目的如ELISA或其他的体外分析。肽序列为：

PSMpep007         P2插入到hPSM插入位置6

QERGVOYIKANAKFIGITELRVDCT(SEQ ID NO:15)

PSMpep008         P2插入到hPSM插入位置8

AVVLRQYIKANAKFIGITELEMKTY(SEQ ID NO:16)

PSMpep009         P2插入到hPSM插入位置10

MFLERQYIKANAKFIGITELHVIYA(SEQ ID NO:17)

PSMpep010         P30插入到hPSM插入位置6

NSRLLFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEVDCTP(SEQ ID NO:18)

PSMpep011         P30插入到hPSM插入位置8

VVLRKFNNFTVSFWLRVPKVSASHLESFDSL(SEQ ID NO:19)

PSMpep012         P30插入到hPSM插入位置10

LMFLEFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEPSSHN(SEQ ID NO:20)

P2和P30表位用下划线表示。这些肽是通过自动合成制备的并且经HPLC纯化随后利用Edman降解控制测序。

免疫原性分析

为了生产材料并且为将来检测和选择突变的PSM构建物建立免疫原性分析方法，已经启始不同的实验设置。

产生大鼠抗HIS-PROSⅡ0.0和抗KLH-PSM肽偶联物的多克抗血清

使用纯化的HIS-PROSⅡ0.0,hPSM蛋白组氨酸标记的C末端部分按1∶1的比例乳化在完全弗氏佐剂中免疫两只大鼠，用乳化在不完全弗氏佐剂中的相同抗原加强免疫两次(在第28天和55天)。

用由KLH-PSM肽偶联物加上3个自由的肽中的每一个组成的混合物免疫两只大鼠。这三个肽中的每一个都含有一个早已明确的hPSM的B细胞表位。此混合物与完全弗氏佐剂按1∶1乳化。用乳化在不完全弗氏佐剂中的相同抗原加强免疫两次(在第28天和55天)。

ELISA分析表明在抗HIS-PROSⅡ0.0抗体和PSMpep005之间以及在抗KLH-PSM肽偶联物加肽抗体和HIS-PROSⅡ0.0之间存在交叉反应。在蛋白印迹中抗HIS-PROSⅡ0.0抗体能够识别LNCaP细胞裂解物中的天然hPSM。

使用逆转录病毒表达的hPSM0.0免疫小鼠

在PSM计划的这个阶段，缺少能够识别正确折叠的天然hPSM分子的抗体一直是一个严重的障碍。因此，使用逆转录病毒表达的hPSM0.0进行了免疫实验。

6组Balb/c小鼠被用以下任何一种物质免疫：1)丝裂霉素C处理过的用hPSM0.0 cDNA(CMV-Koz-hPSM)转导的BALB/c纤维肉瘤细胞(79.24.H8),2)丝裂霉素C处理过的用空载体(CMVBipep)转导的BALB/c纤维肉瘤细胞(79.24.H8),3)用hPSM0.0 cDNA(CMV-Koz-hPSM)转染的包装细胞(BOSC),4)用空载体(CMVBipep)转染的包装细胞(BOSC),5)表达hPSM0.0 cDNA(CMV-Koz-hPSM)的逆转录病毒原液，或6)带有空载体(CMVBipep)的逆转录病毒原液。

在几个时间点上对小鼠采集血清，并且检测所获得的血清在ELISA中抗HIS-PROSⅡ0.0的反应性。不幸的是，没有一个小鼠被诱发产生能够特异性识别HIS-PROSⅡ0.0制备物的抗体。

建立一种抗hPSM的ELISA方法

为了建立一种检测例如杂交瘤上清液或大鼠和小鼠抗血清的ELISA分析方法，用纯化的HIS-PROSⅡ0.0包被聚苯乙烯微量滴定板。使用马的萝卜过氧化物酶标记的大鼠抗小鼠的Ig作为二抗，用HIS-PROSⅡ0.0相同制备物免疫的BALB/c小鼠的血清可以与0.5微克每孔的固定的HIS-PROSⅡ0.0反应。

如上所述，这种ELISA分析方法表明大鼠抗与自由的肽混合在一起的KLH-PSMpep004-PSMpep005-PSMpep006偶联物的抗血清能够与固定的HIS-PROSⅡ0.0反应。

使用AquaBind微量滴定板(见WO94/03530中使用注册商标为AquaBind的tresyl活化的葡聚糖包被微量滴定板的叙述)，建立了一种使用固定的PSM肽(PSMpep004,PSMpep005和PSMpep006)的ELISA方法。用这些肽包被的AquaBind微量滴定板能够检测由相同抗原制备物引发的大鼠抗血清。如上所述，在PSMpep005包被的AquaBind微量滴定板上能够检测大鼠抗HIS-PROSⅡ0.0抗体。

使用LNCaP细胞和7E11C5单克隆抗体建立一种抗包被的AquaBind微量滴定板能够检测hPSM的蛋白印迹方法

分泌抗人PSM的细胞外表位的鼠IgG₂₃单克隆抗体7E11C5的B细胞杂交瘤购自ATCC。当细胞生长至90％死亡时收集培养物上清液用于蛋白印迹检测LNCaP细胞的膜富集制备物以及LNCaP细胞裂解物中人的PSM。这种抗体经蛋白G柱纯化并且已经在蛋白印迹中证实了其与LNCaP的反应性。

建立一种检测LNCaP细胞上的hPSM的流氏细胞术方法

我们已经建立了相互独立的检测LNCaP细胞上的hPSM的流氏细胞术方法。但是现在面临着几个问题：LNCaP细胞生长非常慢并且不规则成团，因此制备单细胞悬液的方法应该优化。其次，本文中由7E11C5单克隆抗体识别的表位已经明确在hPSM分子的胞内结构域上，因此，已经发展了固定和穿透细胞膜的方法。就这点而言，经蛋白G柱纯化的7E11C5抗体已经与FITC偶联并且不用第二抗体即可用于流氏细胞术分析中。

同样，也已经建立了一种使用能够识别hPSM分子的细胞外部分的表位的抗hPSM单克隆抗体J591的流氏细胞术方法。抗体是从BZL生物制品中获得并与FITC偶联，随后用于流氏细胞术分析和细胞分选如LNCaP细胞和hPSM转染的细胞(见下)。

建立一种细胞毒性分析方法

已经实施了一种从小鼠骨髓中纯化树突状细胞的方法。使用蛋白模型，用Ⅰ类分子和蛋白模型刺激的树突状细胞来免疫小鼠的方法也已经被优化。同样，也已使用配制在ISCOMs中的蛋白模型(β半乳糖苷酶)免疫小鼠。在体外用不同形式的相应抗原重刺激从免疫小鼠中纯化的T细胞，随后测量这些重刺激的CTLs裂解不同类型靶细胞(包括激活的树突状细胞以及表达逆转录病毒表达的胞质Ⅰ类肽的转染细胞)的能力。使用铬释放或DNA断裂(JAM方法)作为细胞毒性的测量手段已经建立了两种不同的体外测量CTL活性的分析方法。使用β半乳糖苷酶蛋白模型和各种不同的MHCⅠ类分子和MHCⅡ类分子结合的肽模型得到了很好的结果。

在小鼠中建立打破针对鼠PSM的自身耐受的研究工具

目的在于研究使用鼠PSM AutoVac分子通过针对鼠PSM的免疫和/或DNA接种方法是否能够打破针对小鼠PSM的自身耐受。

如上所述，已经得到了编码鼠PSM(mPSM)的cDNA并进行了测序。在全长的mPSM或mPSM’中明确确立的位置处插入P30产生了4种mPSM突变体分子。构建物如下：

        P30所替换mPSM分子氨基酸长度    氨基酸数mPSM P20.0              ÷                                       752mPSM’0.0               ÷                                       694mPSMx          255-271(SEQ ID NO:8)          756mPSMY          689-700(SEQ ID NO:8)          760mPSM’X        197-213(SEQ ID NO:10)         698PSM’Y         631-642(SEQ ID NO:10)         702

最初，野生型mPSM和类似物分子被亚克隆入DNA接种载体中并被用于小鼠的DNA免疫。

研究意图是分析小鼠体内的免疫应答如CTL应答和肿瘤清除。为了实现这一点，将用野生型的鼠PSM(为易于检测，框内融合有一个鉴别标记如c-myc表位，SEQ IN NO:27)转染鼠肿瘤细胞系。

体内PSM肿瘤模型

用P2和P30进行鼠T细胞增殖分析

为了在各种不同的小鼠品系(BALB/cA(H-2^d),C3H/Hen(H-2^k),DAB/1(H-2^q)和C57BL/6(H-2^b))中建立P2和P30肽的T细胞免疫原性，已经进行了一系列的T细胞增殖实验。众所周知这些表位在人体内是混栖的，但在小鼠中T细胞混栖性也需要用M&Es实验设置来证实。结果表明P30在BALB/cA和C57BL/6品系中是T细胞免疫原性的，而在C3H/Hen品系中P2和P30都不是T细胞免疫原性的。在DAB/l品系中，能够产生针对P2的B细胞。

产生表达hPSM的鼠肿瘤细胞

为了在小鼠中应用hPSM特异的肿瘤模型以及为了用于肿瘤细胞增殖分析，已经建立了一系列的表达hPSM的鼠肿瘤细胞。

一种方法是通过用编码全长的野生型hPSM0.0cDNA的逆转录病毒载体转导鼠肿瘤细胞系而产生这些细胞系。

构建了三种不同的编码全长野生型的构建物，其中编码人PSM的cDNA插入到逆转录病毒载体CMVBipep的多克隆位点中，在这三种构建物中有两种含有一段起始密码子上游的短Kozak序列。

通过使用BOSC包装细胞系，这些构建物被导入不同的鼠肿瘤细胞系：P815(肥大细胞瘤，H2^d)、B16-F10(黑素瘤，H-2^b)和79.24.H8(纤维肉瘤，H-2^d)中。在这三种细胞类型中都得到了遗传霉素抗性的克隆，PCR分析基因组DNA模板证实了逆转录病毒构建物整合到了宿主细胞中。现在仍然不能用7E11C5单克隆抗体在蛋白印迹或流氏细胞术分析中检测到表达的PSM基因产物。

通过转染的方法建立了两株携带有膜结合野生型人PSM的稳定的肿瘤细胞系。这是通过将hPSM0.0cDNA亚克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3.1(+)中处于CMV启动子的控制之下，和包含起始密码子上游的Kozak序列而完成的。

产物质粒被转染进两株不同的鼠肿瘤细胞系：79.24.H8(纤维肉瘤，Balb/c来源的)和SalN(纤维肉瘤，A/J来源的)中。得到遗传霉素抗性的培养物并使用J591和7E11C5抗hPSM的单克隆抗体进行蛋白印迹和流氏细胞术分析。使用J591抗体，用流氏细胞仪分选细胞几次直至得到hPSM阳性的细胞群。使用7E11C5抗体通过流氏细胞仪进行胞内染色再次证实了hPSM的表达。也通过流氏细胞术分析验证了MHCⅠ类分子的表达水平与亲代细胞的水平相同。

通过有限稀释克隆了表达hPSM的79.24H8和SalN细胞系培养。获得了几个克隆，并且使用抗hPSM的单克隆抗体J591通过流氏细胞术分析检测到不同的hPSM表达水平。

使用编码B7.1的基因转染表达hPSM的79.24.H8细胞以用于例如体外分析监测hPSM特异的CTL应答和/或γ干扰素释放。使用抗B7.1的抗血清对细胞进行了一次流氏细胞术分选。

在小鼠体内建立一种hPSM特异的肿瘤模型

为了确定小鼠体内产生的抗免疫原性hPSM分子的抗体的抗肿瘤效果，已经决定在免疫活性的小鼠中建立至少两个体内肿瘤模型。通过给小鼠注射经过修饰的在其膜表面表达野生型hPSM的同源鼠肿瘤细胞系很有希望做到这一点。将使用组成实体瘤的细胞和/或已知可以转移的细胞。由于外源hPSM分子的出现，不需注射并能够被移植入同源鼠体内的细胞系将被用于本模型。HPSM疫苗清除这样的肿瘤细胞的能力将被用于选择候选hPSM疫苗。

为了评价全长人PSM转染的SalN细胞的生长，在各组A/J小鼠的右下侧皮下注射不同剂量(2×10⁶和5×10⁶)hPSM转染的SalN细胞(S-PSM，分选5次)。但是并未建立实体瘤。随后，具有不同hPSM表达水平的S-PSM细胞的三种克隆被皮下注射到3组A/J小鼠体内，折射剂量为10⁷细胞/每只鼠。建立的肿瘤的测量是通过测量两个不同的直径然后将其相乘而得到的面积大小，用平方毫米来表示。比较3组小鼠的这些数值。在3-6天内，所有小鼠都产生了一个实体瘤样的结构，在约15天左右消失。这很有可能是由于人PSM出现在肿瘤细胞表面的结果，尽管仍未能证实这一点。在小鼠体内只用pcDNA3.1空载体转染的SalN细胞持续生长成为实体瘤。

用hPSM转染的并经几次流氏细胞术分选表达hPSM的79.24.H8细胞注射小鼠，也得到了类似的结果。这些细胞(定义为79PSM)在Balb/c和DAB/2小鼠体内也不能建立肿瘤。但是，当一株hPSM转染的细胞克隆被注射到Balb/c和DAB/2小鼠体内时，小鼠产生了实体瘤样的结构，10-20天后重又消失。空载体转染的79.24.H8细胞在Balb/c小鼠体内持续生长。

结论

在分子构建工作中我们成功地克隆了人PSM基因并且得到了鼠PSM cDNA。生产了一系列已经完全测序的具有免疫原性的hPSM自身疫苗构建物。在大肠杆菌中表达了hPSM突变体以及不同的野生型hPSM分子，并发现和证实了这些构建物在大肠杆菌中的表达水平很低。在大鼠中诱发了抗C端一半hPSM分子的多克隆抗体。已经努力实施不同的表达标记物(组氨酸标记和麦芽糖结合蛋白融合)以及替代大肠杆菌包涵体的表达系统。在转染的Pichia pastoris和哺乳动物细胞中检测到了野生型和/或hPSM自身疫苗。关于DNA疫苗技术已经有很多的构想，并且施行了一项初步的可行性研究。使用hPSM自身疫苗的自身接种实验正在进行当中，初步结果另人满意。建立了不同的用于检测和选择突变的hPSM构建物的体外分析方法，包括免疫化学分析和流氏细胞术分析。已经使用全长野生型hPSM稳定转染并用流氏细胞仪分选表面表达hPSM的鼠肿瘤细胞，已经得到了这样的细胞克隆。正在使用这些带有hPSM的同源鼠肿瘤细胞评价体内异源肿瘤模型。为了选择肿瘤模型的小鼠品系，已经进行了一系列的T细胞增殖实验。正在优化CTL分析方法，使用不同的免疫方法和分析条件用抗原模型已经获得了令人信服的结果。而且，目前正在建立研究通过免疫抗鼠PSM自身疫苗打破针对鼠PSM的自身免疫必需的工具。

实施例2

Her2自身疫苗的生产

通过插入一个或多个混栖的外源T细胞表位从而暴露了一系列免疫原性的Her2分子这样的修饰可以发展出Her2的自身疫苗。将测试这些修饰的蛋白诱发能与Her2分子的天然部分发生交叉反应的抗体生成的能力。随后，将在一些体外分析和体内动物模型中评价不同的构建物(可能用于DNA接种)和修饰的蛋白的效率。将分析引发的针对携带有Her2分子的肿瘤细胞特异性的CTL应答。同样，将测试所诱发的抗体通过经典途径激活补体和经由Fc受体启始ADCC的能力。最后，将在人乳腺癌的动物模型中检测不同的修饰分子的肿瘤治疗效果。

将构建在分子不同位置处带有混栖T细胞表位的免疫原性大鼠和人Her2分子。

当针对Her2分子的整个细胞外结构域接种时，所产生的抗体与其它的EGFr受体可能具有一定程度的交叉反应，因为这些受体中的一些分子的细胞外部分具有40-46％的同源性。因此，计划至少在一些修饰的蛋白中通过引入外源T细胞表位而破坏其保守区(见下面的详细讨论)。

图3中显示了在设计构建物时所要避免的可能是潜在的CTL或B细胞表位的Her2分子区域。使用这些位置的原理见下：

仅仅根据蛋白质的一级结构可将人Her2分子分为一些结构域：

细胞外(受体)部分

1-173：结构域Ⅰ(成熟多肽的N端结构区)

174-323：结构域Ⅱ(半胱氨酸富集区，24个半胱氨酸残基)

324-483：结构域Ⅲ(配体结合区，同源的EGF受体)

484-623：结构域Ⅳ(半胱氨酸富集区，20个半胱氨酸残基)

624-654：跨膜结构域(跨膜结构域氨基酸残基从654到675)

细胞内(激酶)部分

655-1010：酪氨酸激酶结构域(725-992是核心酪氨酸激酶结构域)

1011-1235:C末端结构域

已经完成了Her2分子的氨基酸序列中对将要被P2或P30人T辅助细胞表位所替换的位置的选择，考虑到以下参数(不分先后)：

1．已知的和预测的CTL表位

2．与相关受体的同源性(特别是EGFR)

3．半胱氨酸残基的保守性

4．预测的环、α螺旋和β折叠结构

5．潜在的N端糖基化位点

6．预测暴露的和隐藏的氨基酸残基

7．结构域的结构组成

CTL表位似乎簇集在结构域Ⅰ、结构域Ⅲ、跨膜结构域和激酶结构域中的2或3个“热点”中。根据本发明，这些应该大部分保存。

与其它受体具有高度同源性的区域可能是对于Her2的“总体”三级结构来说，并且因此对于抗体识别来说是结构上重要的。而具有低同源性的区域可被替换，结果是只造成结构的局部改变。

半胱氨酸残基常常涉及胞内二硫桥的形成并且因此对于总体三级结构来说很关键，应该优先保存不被改变。

预测形成α螺旋或β折叠结构的区域应优先避免作为外源表位的插入点，因为这些区域可能对蛋白质的折叠很重要。

N端糖基化位点也应该优先保存，因为蛋白质的甘露糖糖基化(如在酵母中的表达)是我们想要的，见APCs细胞表面的甘露糖受体。

预测处于分子内部的区域(根据它们的疏水特征)应优先保存，因为它们可能参与折叠。相反，亲水的暴露区域可作为插入P2和P30模型T_H表位的候选位置。

最后，也考虑到蛋白质结构域的结构组成，因为它与蛋白质结构和功能相关。

策略已经集中于保存Her2分子尽可能多的细胞外部分，因为这是蛋白质作为中和抗体的靶的相关部分。相反，癌细胞表面的膜结合Her2分子的胞内部分是不能进入人的体液免疫系统的。

所以，CTL表位的存在这一点就是疫苗包括这一部分的原因，因此显而易见的应该放置一个或多个表位在此。如果证明全长的Her2分子在大肠杆菌或酵母中不能表达，分子的细胞内部分可在第一个CTL表位“热点”(位置800处)后被截断，此后另外的CTL表位可被加到截短的分子的C末端。

跨膜区似乎是一个独立的折叠单位，并且用T_H表位如P2或P30替换它可能不会影响Her2分子的结构和折叠。此外，跨膜结构域可能会给在大肠杆菌中的表达带来许多问题，因此在任何情况下都应该替换掉。所以，在所有的构建物中，表位应优先放置在此结构域中(可能在一个构建物中此结构域仍是完整的，这是由于它含有几个CTL表位并且因为一旦与配体结合它以我们所不知道的机制参与信号传导)。

通过将P2和P30置于胞内结构域和跨膜结构域，细胞外部分基本保持完整，因此在尽可能少地干涉结构的情况下，使潜在的B细胞表位数目最大化。但是，与EGFR和Her-3和Her-4高度同源性使得与受体发生我们所(不)希望的交叉反应的危险性可能存在。此外，已经描述了一些作为受体拮抗剂(可能通过刺激异源而聚体化或配体结合)起作用并且在体内可以增加肿瘤大小的单克隆抗体。因此，在细胞外结构域中已经选出了籍此有希望降低危险性的位置。

这个选择涉及所有前述的参数并且是置于两个不同的假设之上：(1)插入到非保守(考虑到相关受体)区将会帮助维持三级结构并且可能会减少由抗体导致的我们所不希望的活化。(2)插入到高度保守的区域会导致结构改变，但也可能与此同时通过破坏大多数相关序列降低了交叉反应的危险性。这两个假设都是推理提出来的，但是由于在蛋白质的任何位置放置一个表位而造成的后果很难，因此这些位置中的一部分被包括在构建物中。

据推测完全去处两个半胱氨酸富集结构域可能是有益的。预测这将会形成亲水的暴露的环结构，并且可能形成独立折叠的可能参与二聚体形成单位(正如由许多维持对二聚体形成结构域必需的刚性结构的半胱氨酸残基所显示的)。删除这些结构可能会因此清除了被抗体活化的危险性以及减少了交叉反应抗体的数目，因为这些结构域是蛋白质细胞外部分最保守的区域。此外，对于在大肠杆菌或酵母细胞中产生这样的半胱氨酸富集结构域也是一个问题。

使用P2和P30表位的构建物的详细情况如下：P2表位基本上被置于Her2的细胞外结构域，与构成部分或全部跨膜结构域的P30表位组合。P2表位被置于根据上面讨论的标准而选择的位置上。优选的构建物具有下列结构：构建物名称     P2的位置   P30的位置   长度hHER2MA2-1A     59-73     632-652     795hHER2MA2-2A    103-117    632-652     795hHER2MA2-3A    149-463    632-652     795hHER2MA2-4A    210-224    632-652     795hHER2MA2-5A    250-264    632-652     795hHER2MA2-6A    325-339    632-652     795hHER2MA2-7A    369-383    632-652     795hHER2MA2-8A    465-479    632-652     795hHER2MA2-9A    579-593    632-652     795hHER2MA2-1B     59-73     661-675     795hHER2MA2-2B    103-117    661-675     795hHER2MA2-3B    149-163    661-675     795hHER2MA2-4B    210-224    661-675     795hHER2MA2-5B    250-264    661-675     795hHER2MA2-6B    325-339    661-675     795hHER2MA2-7B    369-383    661-675     795hHER2MA2-8B    465-479    661-675     795hHER2MA2-9B    579-593    661-675     795hHER2MA2-1Y     59-73     710-730     795hHER2MA2-2Y    103-117    710-730     795hHER2MA2-3Y    149-163    710-730     795hHER2MA2-4Y    210-224    710-730     795hHER2MA2-5Y    250-264    710-730     795hHER2MA2-6Y    325-339    710-730     795hHER2MA2-7Y    369-383    710-730     795hPER2MA2-8Y    465-479    710-730     795hHER2MA2-9Y    579-593    710-730     795hHER2MA2-Z     695-709    710-730     795hHER2MA2-C     653-667    632-652     795hHER2MA2-BX    695-709    661-675     795hHER2MA2-AX    695-709    632-652     795hHER2MA2-4E    210-224      5-25      795hHER2MA2-6E    325-339      5-25      795hHER2MA2-8E    465-479      5-25      795HER2MA5-4D     210-224    632-652^*   666hHER2MA5-6D    325-339    632-652^*   666hHER2MA5-8D    465-479    632-652^*   666hHER2MA6-C     653-667    632-652     702

表位的位置表示相对于成熟的Her2的起始点的表位的第一个和最后一个氨基酸的位置。长度是在全长构建物中氨基酸的长度。在所有的构建物中除了那些位置被标为“*”的以外，表位替换掉一段与表位相同长度的氨基酸序列。“*”表示表位被插入而不是替换Her2。因此上面所列出的所有构建物都是成熟的Her2分子的截短的部分，其中在它们的C末端去掉一部分氨基酸序列。

这些构建物中的大部分以不同形式存在，例如在pcDNA(+)载体中与天然的Her2信号肽序列融合；在pMT/BiP/V5-His-A载体中与BiP引导序列融合以便能够在果蝇属的细胞中表达，以及在pET28b载体中不带引导序列以在大肠杆菌中表达。

下面叙述了打算用于筛选和选择修饰的Her2蛋白的模型：

1．在至少3次免疫以后，将用传统的ELISA技术研究在大鼠Her2

转基因小鼠和兔子中分别诱发的抗大鼠及人Her2的抗体生成。商业

上出售的抗人和大鼠Her2的抗体将被用做阳性对照。

2．兔子的抗体将被用于在体外模型中研究推测的对过量表达Her2

的人和转基因鼠肿瘤细胞生长的抑制作用。

3．将用传统的方法研究分离自破伤风患者的外周血淋巴细胞针对

所选择的人Her2分子的T细胞增殖反应。

4．使用来自于大鼠Her2转基因小鼠的肿瘤作为靶，将研究修饰的

大鼠Her2分子在大鼠Her2转基因小鼠中诱发CTL应答的能力。

5．打算合成人Her2跨膜区包含P2和P30表位的一组选择的肽，

将在从事先已经免疫破伤风类毒素的人体内分离的外周血淋巴细胞

的增殖反应中测试这些肽以确定在Her2序列内的P2和P30是否能

够被有效处理并呈递给T细胞。

6．很有可能将测试选择的修饰的人Her2蛋白在已经被遗传改造的

只表达人VDJ基因的小鼠中产生中和抗体的能力。作为合作，这些

小鼠可以从Abgenix,Fremont,CA,U.S.A.获得。

已经叙述了4种已经完全鉴定的含有大鼠Her2癌基因的乳腺癌的转基因鼠模型。前三个转基因鼠模型表达活化的Her2癌基因而第四个转基因鼠模型则利用失活的Her2。所有的模型都利用一个MMTV启动子以驱动在乳腺中的表达。

我们已经决定使用两种转基因鼠模型：1)Muller等所描述的一个使用活化的Her2癌基因的更具侵害性的肿瘤模型(Muller等，1989)，和2)一个侵害性稍差一些的肿瘤模型，其中失活的Her2已被用于产生长潜伏期的粘着乳瘤(Guy等，1992)。上述两种转基因鼠均购自Jackson和/或Charles Rivers实验室。

在初步实验中，用修饰的大鼠Her2分子初始免疫以及加强免疫这些小鼠以使之产生抗体和CTL应答。然后用如其他人所叙述的方法(Muller等，1989；Guy等，1992；Katsumata等，1995)研究肿瘤的发病率。使用ELISA分析方法来测量抗体水平。通过产生表达大鼠Her2的靶细胞可测定CTL活性，如上所述。

另外，异源嫁接癌裸鼠模型可用于被动接种实验。给裸鼠移植入人肿瘤，并且尝试通过被动转移来自用修饰的Her2蛋白免疫的正常鼠或人源化鼠的血清来抑制肿瘤。尽管这个模型在研究抗体抑制肿瘤中的作用中非常有用，但是在此系统中不能直接测量出CTL活性。

在第二个模型中，通过移植入上面所述的转基因鼠的肿瘤细胞系也可以在小鼠体内产生肿瘤。从这些小鼠中产生的细胞系被转移进相关的小鼠品系中并且使用标准的流程使之建立在局部。

转移过量表达大鼠Her2的小鼠肿瘤细胞：在这个系统中，细胞将被大鼠基因转染并随后被转移进MHC相容的小鼠中。通过产生抗Her2应答可以获得对肿瘤生长的抑制。

在这些系统中，在佐剂中的Her2蛋白可被用做疫苗以产生抗体及CTL应答。

已经在几个系统中成功地应用DNA接种产生了有效的免疫应答。我们现在正在研究使用修饰的自身蛋白运送DNA的方法。我们试图利用DNA接种的方法来确定修饰的Her2构建物在乳腺癌转基因小鼠模型的抑瘤效果。相似的技术可能被应用于人体内治疗这些疾病。

实施例3

抗FGF8b疫苗的产生

下面将叙述抗FGF8b的人自身疫苗是如何通过插入一个或多个混栖的外源T细胞表位而暴露一系列的免疫原性分子这种修饰而发展来的。将测试这些构建物诱发可与FGF8b的天然部分发生交叉反应的抗体生成的能力，随后，将在几例体外分析和体内动物模型中评价不同构建物的效率。将测试所诱发的抗体通过经典途径激活补体的能力和通过Fc受体启始ADCC的能力。最后，将在人前列腺和乳腺癌的动物模型中测试不同的分子。

构建抗FGF8b的自身疫苗

由于已经完全鉴定了鼠和人FGF8b多肽，所有的构建物都可被用于在人和小鼠中进行的实验。

在人TNFα疫苗中成功使用的混栖的破伤风类毒素T辅助细胞表位P2和P30将被插入到FGF8b多肽中，由于FGF8b分子较小，每个分子只插入一个表位。其它混栖的T辅助细胞表位如流感血凝素表位HA(307-319)和本文中讨论的其它T细胞表位也可以考虑(O’Sullivan1991)。

已经构建了4种不同的表位沿着分子分布的免疫原性FGF8b构建物。这4种构建物是在对FGF蛋白家族进行多重和成对序列比较的基础上构建的。FGF2和FGF8b之间的序列比较被用做分析沿着FGF8b分子分布的假设的二级结构(如β折叠)的基础。在FGF2和FGF8b中保守的残基并不簇集在三维结构的任何位置，这说明在不破坏折叠能力的情况下没有特定的分子区域不可替换。FGF2氨基酸残基与FGF8b的半胱氨酸残基比较发现在三维结构上它们之间邻近，这说明在FGF8b中它们形成了一个二硫键，这个比较是正确的。也考虑到了FGF2分子N末端部分的柔韧性。

N末端带有P30表位(F30N)的FGF8b突变体是在对FGF8b蛋白和P30表位(SEQ ID NO:14)氨基酸残基进行无缺口序列比较并且记录不同位置上每个氨基酸残基的化学特征的基础上设计的。只考虑了预测的β折叠桶结构的N末端区域。在F30N中，21个氨基酸残基中有9个相似。使用这种假算法，我们希望替换只造成总体结构最小的改变。图6中显示了4中不同的构建物的序列以及替换的氨基酸的三维表现度。

在C末端带有P2表位(SEQ ID NO:12)(F2C)的FGF8b突变体是和F30N一样设计的。但是，预测在195-203位置上有一个好的Kd表位。因此，P2表位就插入到此表位的C末端。同样，只考虑了预测的β折叠桶结构的C末端区域。

通过分别用P2和P30替换FGF2结构的外部环构建了FGF8b的内部突变体(F2I和F30I)，籍此假设EGF结构β折叠桶仍保持不变。

已经在大肠杆菌中表达了免疫原性的FGF8b分子，这可以以最小的代价大规模地生产蛋白。尽管FGF8b分子含有两个潜在的N端糖基化位点(Asn31和Asn113)，大肠杆菌表达的重组FGF8b仍然显示是生物学活性的(MacArthur1995a,Blunt1997)。为了便于纯化和再折叠，产生的FGF8b带有组氨酸标记，这就使得重组分子与镍柱偶联成为可能。

分子的纯化是使用带有高正电荷的蛋白分子或组氨酸标记的蛋白分子进行的，考虑到二硫桥的形成，使用标准的流程对分子进行再折叠。

4种免疫原性分子以及野生型FGF8b cDNA已经被插入到DNA接种载体中。

筛选和选择修饰的FGF8b分子

已经在细菌中表达并随后从包涵体中纯化了4种免疫原性FGF8b分子。同样，这些构建物将被用做DNA疫苗。然后比较不同的构建物引发各种反应的能力，这些能力正是在治疗前列腺癌和乳腺癌患者中我们所期望的。这些研究将使用几种不同的体外和体内分析方法进行。最后，实验结果将作为在人体内最终选择一个或两个FGF8b候选疫苗的基础。

体外模型

在鼠系统中的分析

将使用混在完全弗氏佐剂中的不同的FGF8b构建物免疫不同单倍型的小鼠以及兔子，随后利用乳化在不完全弗氏佐剂中的相同抗原至少加强免疫两次。因此，可以比较不同构建物打破B细胞耐受的能力。使用混合在完全/不完全弗氏佐剂中的纯化的DNA肌内注射其它动物，两次注射之间间隔14天。

在免疫程序的不同时间点采集血清样品，使用传统的ELISA方法(Rochon1994)确定不同构建物诱发抗FGF8b特异性抗体产生的能力。商业上出售的抗FGF8b的多克隆抗体以及单克隆抗体(R&D)可用做阳性对照。FGF8b蛋白商业上有售(R&D)，但也可以用其它FGF8b构建物制备并随后纯化/再折叠。这些产物可用于直接ELISA中包被板子以检测用FGF8b突变体蛋白免疫的小鼠/兔子的血清。

一个研究抗FGF8b接种效果的有用的工具是FGF8b依赖的癌细胞系。本文中描述了几种FGF8b阳性的癌细胞系如MCF-7或SC-3。将使用半定量RT-PCR、细胞增殖实验和STAT-3磷酸化分析来鉴定FGF8b依赖的鼠癌细胞系。

在流氏细胞术或ELISA分析中将用FGF8b特异性的抗体来检测与细胞表面的EGF受体结合的FGF8b。针对这几种不同的FGF受体的抗体商业上有售(R&D)。

将比较这些构建物诱发能激活补体裂解携带或产生FGF8b细胞的抗体生成的能力。可用前述的表达FGF8b的鼠肿瘤细胞系之一，或者是另外使用渗透装载FGF8b的细胞来检测这一点。来自用人FGF8b构建物免疫的正常或转基因鼠(见下)的血清将与细胞系一起孵育，然后与新鲜的豚鼠补体一起孵育。通过标准程序可以检测抗体介导的补体裂解这些细胞。

通过测量由标记的表达FGF8b的细胞释放的铬51可研究所诱发的抗体介导ADCC的能力。效应细胞是来自同源小鼠的外周血单核细胞。为了建立这种分析方法，使用一个带有抗人FGF8b抗体的能够介导ADCC(Fc受体阳性)的鼠细胞系作为效应细胞会方便一些。

为了显示FGF8b候选疫苗不促进自身抗体诱发的肿瘤生长，我们也要进行一项肿瘤增殖分析。从免疫小鼠采集的血清将与表达FGF8b的肿瘤细胞一起孵育。肿瘤细胞的增殖可以通过测量它们吸收氚标记的胸腺嘧啶的能力而测定。

由于已知FGF8b可以诱导一定范围的哺乳动物细胞增殖，也很有必要检测突变体蛋白的生长促进效应。使用如Marsh1999所用的细胞增殖分析方法可以做到这一点。

FGFSb在哺乳动物细胞上的效应应被自身抗体所中和，可以通过在细胞增殖研究(和形态学改变)中使用重组的FGF8b和例如MH3T3证明这一点。加入自身抗体破坏了FGF8b的转化活性。

免疫流程

FGF8b AutoVac免疫实验所用的动物的数量必需取决于模型中疾病的外显率，并且因此，这个数量需要获得统计学上显著的信息。棉衣流程应以我们在TNFα AutoVac计划中的经验为基础。已经为特定的目的使用各种不同的免疫流程用不同的TNFα类似物免疫小鼠，但大多数实验使用下面的流程：

1．小鼠应该分别通过耳朵标记或发射机应答器标记，每笼10只小鼠。雌鼠和雄鼠应该分开评价，但无论如何，在同一笼中不能含有两种性别的小鼠。运输或标记后动物应该至少休息3天。

2．溶于PBS中的1毫克每毫升的抗原乳化在等体积的完全弗氏佐剂(CFA)(Difco或Sigma)中，通过将一滴乳化液滴在水面上看其聚集成滴还是扩散来判断其乳化情况。不断混合直至其不再扩散。

3．标准的免疫剂量是在100微升体积中有100微克抗原，然后加上100微升佐剂，因此，总免疫体积是200微升，在动物的背部施行皮下接种。

4．初始免疫2-3周后进行加强免疫，其后间隔2-3周加强一次。加强免疫抗原的制备和免疫接种和初始免疫一样，但是使用了不完全弗氏佐剂。可能3次加强会诱发最高滴度的抗体。因此，首次免疫6-9周后将会获得最高滴度。

5．初次免疫以前以及每次加强免疫后一周眼眶采血50-100微升，也可采用尾部采血，10-20微升对于测定抗体滴度来说已经足够了。

免疫计划的起始点将取决于疾病进程以及我们所要采纳的策略。首先，我们建议应该试图产生尽可能大的免疫应答，但是在小鼠年龄大约5周以前开始免疫很难达到这一点。此后，在3次初始加强以后，间隔6-8周加强免疫可维持高滴度。潜在的问题是FGF8b对于幼鼠的正常发育可能是必需的。因此，我们赞成在成年小鼠中开始免疫。

在人体系统中的评价

在选择不同的FGF8b构建物中将研究抗原呈递细胞将插入的免疫原性T细胞表位呈递给人T细胞的能力。通过同样的用于TNFα疫苗的对P2和P30呈递的体外加工分析可以做到这一点。将建立来自于接种破伤风类毒素的供体体内的对P2和P30特异的人类T细胞系。来自同一供体体内的抗原呈递细胞(PBMCs)与不同的构建物一起孵育，然后加入T细胞系。通过测量对T细胞系的刺激度可以比较对插入的T细胞表位的呈递水平。

体内动物模型

只少有3种不同的系统能被用于监测所诱发的抗FGF8b的抗体是否能够抑制FGF8b依赖的体内效应。

给小鼠移植入表达FGF8b的鼠肿瘤细胞，通过使用修饰的FGF8b蛋白或FGF8b DNA疫苗自身接种可以分析对肿瘤进程的抑制程度。理想的系统涉及使用从鼠肿瘤中分离而来的细胞。另外，我们还将使用用插入到表达载体中的FGF8b cDNA稳定转染的其它鼠细胞系(如Balb/3T3)。

异源嫁接癌鼠模型将被用于被动接种实验。裸鼠将被移植入人肿瘤，然后通过转移来自用修饰的FGF8b蛋白或FGF8b DNA疫苗免疫的正常或人源化小鼠的血清尝试抑制肿瘤。这对于研究所产生的抗体的抑瘤能力很有用。

另一个获得概念证据的方法是使用FGF8b转基因鼠。已经表明这些携带有在非常特异的小鼠乳瘤病毒(MMTV)启动子控制之下的FGF8b cDNA的小鼠自发发展为表达FGF8b的乳瘤(Coombes私人通信)。使用FGF8b突变体蛋白或FGF8b DNA疫苗对这些鼠进行自身接种，可以表明这种自身疫苗是否能够使小鼠抑制或排斥肿瘤。

获得概念证据的一种可能方法是使用wnt-1转基因鼠(MacArthur1995)。通过将MMTV病毒引入乳腺癌激活了FGF8b的表达导致多于半数的小鼠发展肿瘤。如果我们的自身疫苗能够抑制肿瘤的发病率或生长率，就可建立FGF8b依赖的肿瘤。

转基因鼠经常表现出非生理学的免疫学耐受特征这个事实很可能不影响本计划，因为FGF8b多肽对于人和小鼠来说是相同的。

当最终在小鼠模型中证明FGF8b免疫接种的有益效果并且已经选出了合适的人候选疫苗时，很可能施行有限数量的毒理学研究。随后，为了获得最终的概念证据，可在乳腺资和前列腺癌患者体内实施疫苗研究。

重要的是，如果使用体内模型的实验具有肯定的结果，根据现有的数据将会构建更多的突变体。

实施例4

制备MUC-1类似物

仅仅制备了一种MUC-1 AutoVac分子。这个分子总共包含9个粘蛋白重复，每个重复具有SEQ ID NO:33的序列。构建物从3个这样的序列开始，其后是一个P2表位，P2表位之后是3个粘蛋白序列，其后是一个P30表位，然后以3个粘蛋白序列结束。

已经制备的构建物带有和不带有一个N末端的UNI组氨酸标记(SEQ ID NO:23)。已经在大肠杆菌中表达了所有的突变体。表达蛋白的同一性已经蛋白印迹和N末端测序所证实。蛋白以可溶性形式表达，但有时以令人惊奇的二聚体出现。

通过金属亲和层析已经纯化了组氨酸标记的MUC-1分子。目前仍不知道纯蛋白的量以及纯度。

实施例5

在鼠模型系统中打破自身耐受

用由Ⅰ类和Ⅱ类表位激活的树突状细胞免疫小鼠进行的CTL实验已经表明：与仅用Ⅰ类表位相比，当用Ⅰ类分子和Ⅱ类分子肽在体外免疫和再刺激时所诱发的CTL增强了。这种情形可以与用自身疫苗免疫的情况相比，在自身疫苗中一个外源的Ⅱ类表位被插入到一个自身蛋白中。抗原呈递细胞如树突状细胞对这些分子的摄取和加工导致外源的Ⅱ类表位和一些自身的Ⅰ类表位一起被呈递。现已经知道可能引发自身反应性的CTLs细胞，但是外源Ⅱ类辅助细胞表位的存在很可能增强了这种CTL诱导作用。

现正在卵清蛋白转基因小鼠中研究本发明的诱导自身反应性CTLs细胞的可能优点。有4种不同的转基因小鼠品系，其卵清蛋白表达水平以及耐受状态各不相同，见Kurts等1997，实验药学杂志186:239-245对RIP-mOVA转基因小鼠的说明(在胰腺、肾和胸腺中表达卵清蛋白并且具有高程度的耐受)以及Kurts等1998，实验药学杂志188:409-414对RIP-OVA^low和RIP-OVA^high转基因小鼠--分别低水平和高水平表达卵清蛋白--的说明。最后一个品系，居中水平表达卵清蛋白的RIP-OVA^int已经从上述两篇参考文献的共作者William R Heath博士处获得。

在体内对不同抗原的耐受程度不同。最低耐受之一是在大量的循环抗原上发现的。这些抗原都进入胸腺，其中自身反应性T细胞被去掉。这些抗原是“中央耐受”的。另一方面，组织特异性抗原不直接进入胸腺并且通常是“外周耐受”的，由无反应性T细胞所施加。

已经产生了两种卵清蛋白AutoVac构建物。它们都与EMBL中的NO:J00845序列相关，其中来自P30(SEQ ID NO:14)的序列被插入到两个不同的位置。

在构建物“OVA 3.1”中，P30被插入到与卵清蛋白中272-292位氨基酸对应的位置上。在构建物“OVA 3.2”中，P30被插入到与卵清蛋白中321-341位氨基酸对应的位置上。这些构建物被插入到pVaxl载体中并用于DNA免疫。

每种DNA100微克皮内免疫小鼠一次。此次免疫3周后，摘取脾进行CTL分析，CTL实验的设置是使用表达卵清蛋白优势表位SIINFEKL的细胞作为靶细胞，用混杂的FILKSINE肽作为对照。在野生型C57BL/6小鼠体内，由于卵清蛋白和P30在这些小鼠中是外源的，正如我们所预料的，免疫明显地诱导出了CTL。

我们现在打算使用这些AutoVac构建物免疫4种品系的卵清蛋白转基因鼠。如上所述，RIP-OVA^low、RIP-OVAⁱⁿ和^tRIP-OVA^high转基因小鼠表达卵清蛋白的表达量依次增加并具有不同程度的耐受，RIP-mOVA转基因小鼠也具有高程度的耐受。

在这4种品系的卵清蛋白转基因鼠中，只有P30是外源的，卵清蛋白在这些小鼠中是自身抗原，并且这种情形构成了真实的诱发针对卵清蛋白CTL的自身接种。

从对卵清蛋白具有最低程度“外周耐受”的RIP-OVA^low小鼠中得到的初步结果表明插入P30的卵清蛋白和天然的卵清蛋白分子都能够诱发CTL应答--我们希望具有高程度耐受的转基因小鼠只能产生针对修饰的卵清蛋白分子而不是天然形式分子的CTL应答。

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         序列表

<110>M&E生物技术公司

     卢西拉·斯坦那

     克劳斯·格里戈里厄斯·尼尔森

     伊本·达卢姆

     杰斯珀·哈宁

     达娜·利奇

     彼得·比尔克

     索伦·莫里特森

     阿南德·高塔姆

     古尼拉·卡尔松

<120>治疗性接种的新方法

<130>22113PC1

<140>

<141>

<160>33

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>2253

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2253)

<220>

<221>mjsc-特征

<222>(58)..(2253)

<223>Human PSM′

<220>

<221>misc-特征

<222>(4)..(6)

<223>ggt or tgg encoding Gly and Trp,respectively

<400>1

atg ggt aat ctc ctt cac gaa acc gac tcg gct gtg gcc acc gcg cgc  48

Met Gly Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg

1                 5                  10                  15

cgc ccg cgc tgg ctg tgc gct ggg gcg ctg gtg ctg gcg ggt ggc ttc  96

Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe

             20                  25                  30ttt ctc ctc ggc ttc ctc ttc ggg tgg ttt ata aaa tcc tcc aat gaa    144Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ser Asn Glu

     35                  40                  45gct act aac att act cca aag cat aat atg aaa gca ttt ttg gat gaa    192Ala Thr Asn Ile Thr Pro Lys His Asn Met Lys Ala Phe Leu Asp Glu

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             85                  90                  95caa tcc cag tgg aaa gaa ttt ggc ctg gat tct gtt gag cta gca cat    336Gln Ser Gln Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp Ser Val Glu Leu Ala His

        100                 105                 110tat gat gtc ctg ttg tcc tac cca aat aag act cat ccc aac tac atc    384Tyr Asp Val Leu Leu Set Tyr Pro Asn Lys Thr His Pro Asn Tyr Ile

    115                 120                 125tca ata att aat gaa gat gga aat gag att ttc aac aca tca tta ttt    432Ser Ile Ile Asn Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe Asn Thr Set Leu Phe

130                 135                 140gaa cca cct cct cca gga tat gaa aat gtt tcg gat att gta cca cct    480Glu Pro Pro Pro Pro Gly Tyr Glu Asn Val Ser Asp Ile Val Pro Pro145                 150                 155                 160ttc agt gct ttc tct cct caa gga atg cca gag ggc gat cta gtg tat    528Phe Ser Ala Phe Ser Pro Gln Gly Met Pro Glu Gly Asp Leu Val Tyr

            165                 170                 175gtt aac tat gca cga act gaa gac ttc ttt aaa ttg gaa cgg gac atg    576Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys Leu Glu Arg Asp Met

        180                 185                 190aaa atc aat tgc tct ggg aaa att gta att gcc aga tat ggg aaa gtt    624Lys Ile Asn Cys Ser Gly Lys Ile Val Ile Ala Arg Tyr Gly Lys Val

    195                 200                 205ttc aga gga aat aag gtt aaa aat gcc cag ctg gca ggg gcc aaa gga    672Phe Arg Gly Asn Lys Val Lys Asn Ala Gln Leu Ala Gly Ala Lys Gly

210                 215                 220gtc att ctc tac tcc gac cct gct gac tac ttt gct cct ggg gtg aag    720Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly Val Lys225                 230                 235                 240tcc tat cca gat ggt tgg aat ctt cct gga ggt ggt gtc cag cgt gga    768Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly Val Gln Arg Gly

            245                 250                 255aat atc cta aat ctg aat ggt gca gga gac cct ctc aca cca ggt tac    816Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr

        260                 265                 270cca gca aat gaa tat gct tat agg cgt gga att gca gag gct gtt ggt    864Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Ala Glu Ala Val Gly

    275                 280                 285ctt cca agt att cct gtt cat cca att gga tac tat gat gca cag aag    912Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Gly Tyr Tyr Asp Ala Gln Lys

290                 295                 300ctc cta gaa aaa atg ggt ggc tca gca cca cca gat agc agc tgg aga    960Leu Leu Glu Lys Met Gly Gly Ser Ala Pro Pro Asp Ser Ser Trp Arg305                 310                 315                 320gga agt ctc aaa gtg ccc tac aat gtt gga cct ggc ttt act gga aac   1008Gly Ser Leu Lys Val Pro Tyr Asn Val Gly Pro Gly Phe Thr Gly Asn

            325                 330                 335ttt tct aca caa aaa gtc aag atg cac atc cac tct acc aat gaa gtg   1056Phe Ser Thr Gln Lys Val Lys Met His Ile His Ser Thr Asn Glu Val

        340                 345                 350aca aga att tac aat gtg ata ggt act ctc aga gga gca gtg gaa cca   1104Thr Arg Ile Tyr Asn Val Ile Gly Thr Leu Arg Gly Ala Val Glu Pro

    355                 360                 365gac aga tat gtc att ctg gga ggt cac cgg gac tca tgg gtg ttt ggt   1152Asp Arg Tyr Val Ile Leu Gly Gly His Arg Asp Ser Trp Val Phe Gly

370                 375                 380ggt att gac cct cag agt gga gca gct gtt gtt cat gaa att gtg agg   1200Gly Ile Asp Pro Gln Ser Gly Ala Ala Val Val His Glu Ile Val Arg385                 390                 395                 400agc ttt gga aca ctg aaa aag gaa ggg tgg aga cct aga aga aca att   1248Ser Phe Gly Thr Leu Lys Lys Glu Gly Trp Arg Pro Arg Arg Thr Ile

            405                 410                 415ttg ttt gca agc tgg gat gca gaa gaa ttt ggt ctt ctt ggt tct act   1296Leu Phe Ala Ser Trp Asp Ala Glu Glu Phe Gly Leu Leu Gly Ser Thr

        420                 425                 430gag tgg gca gag gag aat tca aga ctc ctt caa gag cgt ggc gtg gct   1344Glu Trp Ala Glu Glu Asn Ser Arg Leu Leu Gln Glu Arg Gly Val Ala

    435                 440                 445tat att aat gct gac tca tct ata gaa gga aac tac act ctg aga gtt    1392Tyr Ile Asn Ala Asp Ser Ser Ile Glu Gly Asn Tyr Thr Leu Arg Val

450                 455                 460gat tgt aca ccg ctg atg tac agc ttg gta cac aac cta aca aaa gag    1440Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr Ser Leu Val His Asn Leu Thr Lys Glu465                 470                 475                 480ctg aaa agc cct gat gaa ggc ttt gaa ggc aaa tct ctt tat gaa agt    1488Leu Lys Ser Pro Asp Glu Gly Phe Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Glu Ser

            485                 490                 495tgg act aaa aaa agt cct tcc cca gag ttc agt ggc atg ccc agg ata    1536Trp Thr Lys Lys Ser Pro Ser Pro Glu Phe Ser Gly Met Pro Arg Ile

        500                 505                 510agc aaa ttg gga tct gga aat gat ttt gag gtg ttc ttc caa cga ctt    1584Ser Lys Leu Gly Ser Gly Asn Asp Phe Glu Val Phe Phe Gln Arg Leu

    515                 520                 525gga att gct tca ggc aga gca cgg tat act aaa aat tgg gaa aca aac    1632Gly Ile Ala Ser Gly Arg Ala Arg Tyr Thr Lys Asn Trp Glu Thr Asn

530                 535                 540aaa ttc agc ggc tat cca ctg tat cac agt gtc tat gaa aca tat gag    1680Lys Phe Ser Gly Tyr Pro Leu Tyr His Ser Val Tyr Glu Thr Tyr Glu545                 550                 555                 560ttg gtg gaa aag ttt tat gat cea atg ttt aaa tat GaG ctc act gtg    1728Leu Val Glu Lys Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys Tyr His Leu Thr Val

            565                 570                 575gcc cag gtt cga gga ggg atg gtg ttt gag cta gcc aat tcc ata gtg    1776Ala Gln Val Arg Gly Gly Met Val Phe Glu Leu Ala Asn Ser Ile Val

        580                 585                 590ctc cct ttt gat tgt cga gat tat gct gta gtt tta aga aag tat gct    1824Leu Pro Phe Asp Cys Arg Asp Tyr Ala Val Val Leu Arg Lys Tyr Ala

    595                 600                 605gac aaa atc tac agt att tct atg aaa cat cca cag gaa atg aag aca    1872Asp Lys Ile Tyr Ser Ile Ser Met Lys His Pro Gln Glu Met Lys Thr

610                 615                 620tac agt gta tca ttt gat tca ctt ttt tct gca gta aag aat ttt aca    1920Tyr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu Phe Ser Ala Val Lys Asn Phe Thr625                 630                 635                 640gaa att gct tcc aag ttc agt gag aga ctc cag gac ttt gac aaa agc    1968Glu Ile Ala Ser Lys Phe Ser Glu Arg Leu Gln Asp Phe Asp Lys Ser

            645                 650                 655aac cca ata gta tta aga atg atg aat gat caa ctc atg ttt ctg gaa   2016Asn Pro Ile Val Leu Arg Met Met Asn Asp Gln Leu Met Phe Leu Glu

        660                 665                 670aga gca ttt att gat cca tra ggg tta cca gac agg cct ttt tat agg   2064Arg Ala Phe Ile Asp Pro Leu Gly Leu Pro Asp Arg Pro Phe Tyr Arg

    675                 680                 685cat gtc atc tar gct cca agc agc cac aac aag tat gca ggg gag tca   2112His Val Ile Tyr Ala Pro Ser Ser His Ash Lys Tyr Ala Gly Glu Ser

690                 695                 700ttc cca gga att tat gat gct ctg ttt gat att gaa agc aaa gtg gac   2160Phe Pro Gly Ile Tyr Asp Ala Leu Phe Asp Ile Glu Ser Lys Val Asp705                 710                 715                 720cct tcc aag gcc tgg gga gaa gtg aag aga cag att tat gtt gca gcc   2208Pro Ser Lys Ala Trp Gly Glu Val Lys Arg Gln Ile Tyr Val Ala Ala

            725                 730                 735ttc aca gtg cag gca gct gca gag act ttg agt gaa gta gcc taa       2253Phe Thr Val Gln Ala Ala Ala Glu Thr Leu Ser Glu Val Ala

        740                 745                 750<210>2<211>750<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Gly Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg1               5                  10                  15Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe

         20                  25                  30Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ser Asn Glu

     35                  40                  45Ala Thr Ash Ile Thr Pro Lys His Asn Met Lys Ala Phe Leu Asp Glu

 50                  55                  60Leu Lys Ala Glu Asn Ile Lys Lys Phe Leu Tyr Asn Phe Thr Gln Ile65                  70                  75                  80Pro His Leu Ala Gly Thr Glu Gln Asn Phe Gln Leu Ala Lys Gln Ile

             85                  90                  95Gln Ser Gln Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp Ser Val Glu Leu Ala His

        100                 105                 110Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Lys Thr His Pro Asn Tyr Ile

    115                 120                 125Ser Ile Ile Asn Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe Asn Thr Ser Leu Phe

130                 135                 140Glu Pro Pro Pro Pro Gly Tyr Glu Asn Val Ser Asp Ile Val Pro Pro145                 150                 155                 160Phe Ser Ala Phe Ser Pro Gln Gly Met Pro Glu Gly Asp Leu Val Tyr

            165                 170                 175Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys Leu Glu Arg Asp Met

        180                 185                 190Lys Ile Asn Cys Ser Gly Lys Ile Val Ile Ala Arg Tyr Gly Lys Val

    195                 200                 205Phe Arg Gly Asn Lys Val Lys Asn Ala Gln Leu Ala Gly Ala Lys Gly

210                 215                 220Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly Val Lys225                 230                 235                 240Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly Val Gln Arg Gly

            245                 250                 255Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr

        260                 265                 270Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Ala Glu Ala Val Gly

    275                 280                 285Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Gly Tyr Tyr Asp Ala Gln Lys

290                 295                 300Leu Leu Glu Lys Met Gly Gly Ser Ala Pro Pro Asp Ser Ser Trp Arg305                 310                 315                 320Gly Ser Leu Lys Val Pro Tyr Asn Val Gly Pro Gly Phe Thr Gly Asn

            325                 330                 335Phe Ser Thr Gln Lys Val Lys Met His Ile His Ser Thr Asn Glu Val

        340                 345                 350Thr Arg Ile Tyr Asn Val Ile Gly Thr Leu Arg Gly Ala Val Glu Pro

    355                 360                 365Asp Arg Tyr Val Ile Leu Gly Gly His Arg Asp Ser Trp Val Phe Gly

370                 375                 380Gly Ile Asp Pro Gln Ser Gly Ala Ala Val Val His Glu Ile Val Arg385                 390                 395                 400Ser Phe Gly Thr Leu Lys Lys Glu Gly Trp Arg Pro Arg Arg Thr Ile

            405                 410                 415Leu Phe Ala Ser Trp Asp Ala Glu Glu Phe Gly Leu Leu Gly Ser Thr

        420                 425                 430Glu Trp Ala Glu Glu Asn Ser Arg Leu Leu Gln Glu Arg Gly Val Ala

    435                 440                 445Tyr Ile Asn Ala Asp Ser Ser Ile Glu Gly Asn Tyr Thr Leu Arg Val

450                 455                 460Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr Ser Leu Val His Asn Leu Thr Lys Glu465                470                  475                 480Leu Lys Ser Pro Asp Glu Gly Phe Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Glu Ser

            485                 490                 495Trp Thr Lys Lys Ser Pro Ser Pro Glu Phe Ser Gly Met Pro Arg Ile

        500                 505                 510Ser Lys Leu Gly Ser Gly Asn Asp Phe Glu Val Phe Phe Gln Arg Leu

    515                 520                 525Gly Ile Ala Ser Gly Arg Ala Arg Tyr Thr Lys Asn Trp Glu Thr Asn

530                 535                 540Lys Phe Ser Gly Tyr Pro Leu Tyr His Ser Val Tyr Glu Thr Tyr Glu545                 550                 555                 560Leu Val Glu Lys Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys Tyr His Leu Thr Val

            565                 570                 575Ala Gln Val Arg Gly Gly Met Val Phe Glu Leu Ala Asn Ser Ile Val

        580                 585                 590Leu Pro Phe Asp Cys Arg Asp Tyr Ala Val Val Leu Arg Lys Tyr Ala

    595                 600                 605Asp Lys Ile Tyr Ser Ile Ser Met Lys His Pro Gln Glu Met Lys Thr

610                 615                 620Tyr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu Phe Ser Ala Val Lys Asn Phe Thr625                 630                 635                 640Glu Ile Ala Ser Lys Phe Ser Glu Arg Leu Gln Asp Phe Asp Lys Ser

            645                 650                 655Asn Pro Ile Val Leu Arg Met Met Asn Asp Gln Leu Met Phe Leu Glu

        660                 665                 670Arg Ala Phe Ile Asp Pro Leu Gly Leu Pro Asp Arg Pro Phe Tyr Arg

    675                 680                 685His Val Ile Tyr Ala Pro Ser Ser His Asn Lys Tyr Ala Gly Glu Ser

690                 695                 700Phe Pro Gly Ile Tyr Asp Ala Leu Phe Asp Ile Glu Ser Lys Val Asp705                 710                 715                 720Pro Ser Lys Ala Trp Gly Glu Val Lys Arg Gln Ile Tyr Val Ala Ala

            725                 730                 735Phe Thr Val Gln Ala Ala Ala Glu Thr Leu Ser Glu Val Ala

        740                 745                 750<210>3<211>3768<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(1)..(3768)<400>3atg gag ctg gcg gcc ttg tgc cgc tgg ggg ctc ctc ctc gcc ctc ttg    48Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu

        -20                 -15                 -10ccc ccc gga gcc gcg agc acc caa gtg tgc acc ggc aca gac atg aag    96Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys

     -5              -1   1               5ctg cgg ctc cct gcc agt ccc gag acc cac ctg gac atg ctc cgc cac   144Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His10                  15                  20                  25ctc tac cag ggc tgc cag gtg gtg cag gga aac ctg gaa ctc acc tac   192Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr

             30                  35                  40ctg ccc acc aat gcc agc ctg tcc ttc ctg cag gat atc cag gag gtg   240Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val

         45                  50                  55cag ggc tac gtg ctc atc gct cac aac caa gtg agg cag gtc cca ctg   288Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu

     60                  65                  70cag agg ctg cgg att gtg cga ggc acc cag ctc ttt gag gac aac tat   336Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr

 75                  80                  85gcc ctg gcc gtg cta gac aat gga gac ccg ctg aac aat acc acc cct    384Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro90                  95                 100                 105gtc aca ggg gcc tcc cca gga ggc ctg cgg gag ctg cag ctt cga agc    432Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser

            110                 115                 120ctc aca gag atc ttg aaa gga ggg gtc ttg atc cag cgg aac ccc cag    480Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln

        125                 130                 135ctc tgc tac cag gac acg att ttg tgg aag gac atc ttc cac aag aac    528Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn

    140                 145                 150aac cag ctg gct ctc aca ctg ata gac acc aac cgc tct cgg gcc tgc    576Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys

155                 160                 165cac ccc tgt tct ccg atg tgt aag ggc tcc cgc tgc tgg gga gag agt    624His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser170                 175                 180                 185tct gag gat tgt cag agc ctg acg cgc act gtc tgt gcc ggt ggc tgt    672Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys

            190                 195                 200gcc cgc tgc aag ggg cea ctg ccc act gac tgc tgc cat gag cag tgt    720Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys

        205                 210                 215gct gcc ggc tgc acg ggc ccc aag cac tct gac tgc ctg gcc tgc ctc    768Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu

    220                 225                 230cac ttc aac cac agt ggc atc tgt gag ctg cac tgc cca gcc ctg gtc    816His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val

235                 240                 245acc tac aac aca gac acg ttt gag tcc atg ccc aat ccc gag ggc cgg    864Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg250                 255                 260                 265tat aca ttc ggc gcc agc tgt gtg act gcc tgt ccc tac aac tac ctt    912Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu

            270                 275                 280tct acg gac gtg gga tcc tgc acc ctc gtc tgc ccc ctg cac aac caa    960Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln

        285                 290                 295gag gtg aca gca gag gat gga aca cag cgg tgt gag aag tgc agc aag    1008Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys

    300                 305                 310ccc tgt gcc cga gtg tgc tat ggt ctg ggc atg gag cac ttg cga gag    1056Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu

315                 320                 325gtg agg gca gtt acc agt gcc aat atc cag gag ttt gct ggc tgc aag    1104Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys330                 335                 340                 345aag atc ttt ggg agc ctg gca ttt ctg ccg gag agc ttt gat ggg gac    1152Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp

            350                 355                 360cca gcc tcc aac act gcc ccg ctc cag cca gag cag ctc caa gtg ttt    1200Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe

        365                 370                 375gag act ctg gaa gag atc aca ggt tac cta tac atc tca gca tgg ccg    1248Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro

    380                 385                 390gac agc ctg cct gac ctc agc gtc ttc cag aac ctg caa gta atc cgg    1296Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg

395                 400                 405gga cga att ctg cac aat ggc gcc tac tcg ctg acc ctg caa ggg ctg    1344Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu410                 415                 420                 425ggc atc agc tgg ctg ggg ctg cgc tca ctg agg gaa ctg ggc agt gga    1392Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly

            430                 435                 440ctg gcc ctc atc cac cat aac acc cac ctc tgc ttc gtg cac acg gtg    1440Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val

        445                 450                 455ccc tgg gac cag ctc ttt cgg aac ccg cac caa gct ctg ctc cac act    1488Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr

    460                 465                 470gcc aac cgg cca gag gac gag tgt gtg ggc gag ggc ctg gcc tgc cac    1536Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His

475                 480                 485cag ctg tgc gcc cga ggg cac tgc tgg ggt cca ggg ccc acc cag tgt    1584Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys490                 495                 500                 505gtc aac tgc agc cag ttc ctt cgg ggc cag gag tgc gtg gag gaa tgc    1632Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys

            510                 515                 520cga gta ctg cag ggg ctc ccc agg gag tat gtg aat gcc agg cac tgt    1680Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys

        525                 530                 535ttg ccg tgc cac cct gag tgt cag ccc cag aat ggc tca gtg acc tgt    1728Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys

    540                 545                 550ttt gga ccg gag gct gac cag tgt gtg gcc tgt gcc cac tat aag gac    1776Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp

555                 560                 565cct ccc tte tgc gtg gcc cgc tgc ccc agc ggt gtg aaa cct gac ctc    1824Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu570                 575                 580                 585tcc tac atg ccc atc tgg aag ttt cca gat gag gag ggc gca tgc cag    1872Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln

            590                 595                 600cct tgc ccc atc aac tgc acc cac tcc tgt gtg gac ctg gat gac aag    1920Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys

        605                 610                 615ggc tgc ccc gcc gag cag aga gcc agc cct ctg acg tcc atc gtc tct    1968Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Val Ser

    620                 625                 630gcg gtg gtt ggc att ctg ctg gtc gtg gtc ttg ggg gtg gtc ttt ggg    2016Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly

635                 640                 645atc ctc atc aag cga cgg cag cag aag atc egg aag tac acg atg cgg    2064Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg650                 655                 660                 665aga ctg ctg cag gaa acg gag ctg gtg gag ccg ctg aca cct agc gga    2112Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly

            670                 675                 680gcg atg ccc aac cag gcg cag atg cgg atc ctg aaa gag acg gag ctg    2160Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu

        685                 690                 695agg aag gtg aag gtg ctt gga tct ggc gct ttt ggc aca gtc tac aag    2208Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys

    700                 705                 710ggc atc tgg atc cct gat ggg gag aat gtg aaa att cca gtg gcc atc    2256Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile

715                 720                 725aaa gtg ttg agg gaa aac aca tcc ccc aaa gcc aac aaa gaa atc tta    2304Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu730                 735                 740                 745gac gaa gca tac gtg atg gct ggt gtg ggc tcc cca tat gtc tcc cgc    2352Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg

            750                 755                 760ctt ctg ggc atc tgc ctg aca tcc acg gtg cag ctg gtg aca cag ctt    2400Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu

        765                 770                 775atg ccc tat ggc tgc ctc tta gac cat gtc cgg gaa aac cgc gga cgc    2448Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg

    780                 785                 790ctg ggc tcc cag gac ctg ctg aac tgg tgt atg cag att gcc aag ggg    2496Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly

795                 800                 805atg agc tac ctg gag gat gtg cgg ctc gta cac agg gac ttg gcc gct    2544Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala810                 815                 820                 825cgg aac gtg ctg gtc aag agt ccc aac cat gtc aaa att aca gac ttc    2592Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe

            830                 835                 840ggg ctg gct cgg ctg ctg gac att gac gag aca gag tac cat gca gat    2640Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp

        845                 850                 855ggg ggc aag gtg ccc atc aag tgg atg gcg ctg gag tcc att ctc cgc    2688Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg

    860                 865                 870cgg cgg ttc acc cac cag agt gat gtg tgg agt tat ggt gtg act gtg    2736Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr val

875                 880                 885tgg gag ctg atg act ttt ggg gcc aaa cct tac gat ggg atc cca gcc    2784Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala890                 895                 900                 905cgg gag atc cct gac ctg ctg gaa aag ggg gag cgg ctg ccc cag ccc    2832Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro

            910                 915                 920ccc atc tgc acc att gat gtc tac atg atc atg gtc aaa tgt tgg atg    2880Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met

        925                 930                 935att gac tct gaa tgt cgg cca aga ttc cgg gag ttg gtg tct gaa ttc    2928Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe

    940                 945                 950tcc cgc atg gcc agg gac ccc cag cgc ttt gtg gtc atc cag aat gag    2976Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu

955                 960                 965gac ttg ggc cca gcc agt ccc ttg gac agc acc ttc tac cgc tca ctg    3024Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu970                 975                 980                 985ctg gag gac gat gac atg ggg gac ctg gtg gat gct gag gag tat ctg    3072Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr Leu

            990                 995                1000gta ccc cag cag ggc ttc ttc tgt cca gac cct gcc ccg ggc gct ggg    3120Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly Ala Gly

       1005                1010                1015ggc atg gtc cac cac agg cac cgc agc tca tct acc agg agt ggc ggt    3168Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg Ser Gly Gly

   1020                1025                1030ggg gac ctg aca cta ggg ctg gag ccc tct gaa gag gag gcc ccc agg    3216Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu Glu Ala Pro Arg1035                1040                1045tct cca ctg gca ccc tcc gaa ggg gct ggc tcc gat gta ttt gat ggt    3264Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser Asp Val Phe Asp Gly1050               1055                1060                1065gac ctg gga atg ggg gca gcc aag ggg ctg caa agc ctc ccc aca cat    3312Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu Gln Ser Leu Pro Thr His

           1070                1075                1080gac ccc agc cct cta cag cgg tac agt gag gac ccc aca gta ccc ctg    3360Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu

       1085                1090                1095ccc tct gag act gat ggc tac gtt gcc ccc ctg acc tgc agc ccc cag    3408Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln

   1100                1105                1110cct gaa tat gtg aac cag cca gat gtt cgg ccc cag ccc cct tcg ccc    3456Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro1115                1120                1125cga gag ggc cct ctg cct gct gcc cga cct gct ggt gcc act ctg gaa    3504Arg Glu Gly Pro Leu Pro Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu1130               1135                1140                1145agg gcc aag act ctc tcc cca ggg aag aat ggg gtc gtc aaa gac gtt    3552Arg Ala Lys Thr Leu Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val

           1150                1155                1160ttt gcc ttt ggg ggt gcc gtg gag aac ccc gag tac ttg aca ccc cag    3600Phe Ala Phe Gly Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln

       1165                1170                1175gga gga gct gcc cct cag ccc cac cct cct cct gcc ttc agc cca gcc    3648Gly Gly Ala Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala

   1180                1185                1190ttc gac aac ctc tat tac tgg gac cag gac cca cca gag cgg ggg gct    3696Phe Asp Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala1195                1200                1205cca ccc agc acc ttc aaa ggg aca cct acg gca gag aac cca gag tac    3744Pro Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr1210               1215                1220                1225ctg ggt ctg gac gtg cca gtg tga                                    3768Leu Gly Leu Asp Val Pro Val

           1230<210>4<211>1255<212>PRT<213>Homo sapiens<400>4Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu1               5                  10                  15Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys

         20                  25                  30Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His

     35                  40                  45Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr

 50                  55                  60Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val65                  70                  75                  80Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu

             85                  90                  95Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr

        100                 105                 110Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro

    115                 120                 125Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser

130                 135                 140Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln145                 150                 155                 160Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn

            165                 170                 175Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys

        180                 185                 190His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser

    195                 200                 205Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys

210                 215                 220Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys225                 230                 235                 240Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu

            245                 250                 255His Phe Asn His Ser Gly lle Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val

        260                 265                 270Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg

    275                 280                 285Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu

290                 295                 300Ser Thr Asp val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln305                 310                 315                 320Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys

            325                 330                 335Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu

        340                 345                 350Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys

    355                 360                 365Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp

370                 375                 380Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe385                 390                 395                 400Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro

            405                 410                 415Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg

        420                 425                 430Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu

    435                 440                 445Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly

450                 455                 460Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val465                 470                 475                 480Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr

            485                 490                 495Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His

        500                 505                 510Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys

    515                 520                 525Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys

530                 535                 540Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys545                 550                 555                 560Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys

            565                 570                 575Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp

        580                 585                 590Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu

    595                 600                 605Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln

610                 615                 620Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys625                 630                 635                 640Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Val Ser

            645                 650                 655Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly

        660                 665                 670Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg

    675                 680                 685Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly

690                 695                 700Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu705                 710                 715                 720Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys

            725                 730                 735Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile

        740                 745                 750Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu

    755                 760                 765Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg

770                 775                 780Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu785                 790                 795                 800Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg

            805                 810                 815Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Ash Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly

        820                 825                 830Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala

    835                 840                 845Arg Ash Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe

850                 855                 860Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp865                 870                 875                 880Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg

            885                 890                 895Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val

        900                 905                 910Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala

    915                 920                 925Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro

930                 935                 940Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met val Lys Cys Trp Met945                 950                 955                 960Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe

            965                 970                 975Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu

        980                 985                 990Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu

    995                1000                1005Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr Leu1010                1015                1020Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly Ala Gly025                1030                1035                1040Gly Met Val Mis His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg Ser Gly Gly

           1045                1050                1055Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu Glu Ala Pro Arg

       1060                1065                1070Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser Asp Val Phe Asp Gly

   1075                1080                1085Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu Gln Ser Leu Pro Thr His1090                1095                1100Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu105                1110                1115                1120Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln

           1125                1130                1135Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro

       1140                1145                1150Arg Glu Gly Pro Leu Pro Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu

   1155                1160                1165Arg Ala Lys Thr Leu Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val1170                1175                1180Phe Ala Phe Gly Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln185                1190                1195                1200Gly Gly Ala Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala

           1205                1210                1215Phe Asp Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala

       1220                1225                1230Pro Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr

   1235                1240                1245Leu Gly Leu Asp Val Pro Val1250                1255<210>5<211>648<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(1)..(648)<400>5atg ggc agc ccc cgc tcc gcg ctg agc tgc ctg ctg ttg cac ttg ctg    48Met Gly Ser Pro Arg Ser Ala Leu Ser Cys Leu Leu Leu His Leu Leu1               5                  10                  15gtt ctc tgc ctc caa gcc cag gta act gtt cag tcc tca cct aat ttt    96Val Leu Cys Leu Gln Ala Gln Val Thr Val Gln Ser Ser Pro Asn Phe

         20                  25                  30aca cag cat gtg agg gag cag agc ctg gtg acg gat cag ctc agc cgc   144Thr Gln His Val Arg Glu Gln Ser Leu Val Thr Asp Gln Leu Ser Arg

     35                  40                  45cgc ctc atc egg acc tac cag ctc tac agc cgc acc agc ggg aag cac   192Arg Leu Ile Arg Thr Tyr Gln Leu Tyr Ser Arg Thr Ser Gly Lys His

 50                  55                  60gtg cag gtc ctg gcc aac aag cgc atc aac gcc atg gca gaa gac gga   240Val Gln Val Leu Ala Asn Lys Arg Ile Asn Ala Met Ala Glu Asp Gly65                  70                  75                  80gac ccc ttc gcg aag ctc att gtg gag acc gat act ttt gga agc aga   288Asp Pro Phe Ala Lys Leu Ile Val Glu Thr Asp Thr Phe Gly Ser Arg

             85                  90                  95gtc cga gtt cgc ggc gca gag aca ggt ctc tac atc tgc atg aac aag   336Val Arg Val Arg Gly Ala Glu Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Met Asn Lys

        100                 105                 110aag ggg aag cta att gcc aag agc aac ggc aaa ggc aag gac tgc gta   384Lys Gly Lys Leu Ile Ala Lys Ser Asn Gly Lys Gly Lys Asp Cys Val

    115                 120                 125ttc aca gag atc gtg ctg gag aac aac tac acg gcg ctg cag aac gcc   432Phe Thr Glu Ile Val Leu Glu Ash Asn Tyr Thr Ala Leu Gln Asn Ala

130                 135                 140aag tac gag ggc tgg tac atg gcc ttt acc cgc aag ggc cgg ccc cgc   480Lys Tyr Glu Gly Trp Tyr Met Ala Phe Thr Arg Lys Gly Arg Pro Arg145                 150                 155                 160aag ggc tcc aag acg cgc cag cat cag cgc gag gtg cac ttc atg aag   528Lys Gly Ser Lys Thr Arg Gln His Gln Arg Glu Val His Phe Met Lys

            165                 170                 175cgc ctg ccg cgg ggc cac cac acc acc gag cag agc ctg cgc ttc gag   576Arg Leu Pro Arg Gly His His Thr Thr Glu Gln Ser Leu Arg Phe Glu

        180                 185                 190ttc ctc aac tac ccg ccc ttc acg cgc agc ctg cgc ggc agc cag agg   624Phe Leu Asn Tyr Pro Pro Phe Thr Arg Ser Leu Arg Gly Ser Gln Arg

    195                 200                 205act tgg gcc ccg gag ccc cga tag                                   648Thr Trp Ala Pro Glu Pro Arg

210                215<210>6<211>215<212>PRT<213>Homo sapiens<400>6Met Gly Ser Pro Arg Ser Ala Leu Ser Cys Leu Leu Leu His Leu Leu1               5                  10                  15Val Leu Cys Leu Gln Ala Gln Val Thr Val Gln Ser Ser Pro Asn Phe

         20                  25                  30Thr Gln His Val Arg Glu Gln Ser Leu Val Thr Asp Gln Leu Ser Arg

     35                  40                  45Arg Leu Ile Arg Thr Tyr Gln Leu Tyr Ser Arg Thr Ser Gly Lys His

 50                  55                  60Val Gln Val Leu Ala Asn Lys Arg Ile Asn Ala Met Ala Glu Asp Gly65                  70                  75                  80Asp Pro Phe Ala Lys Leu Ile Val Glu Thr Asp Thr Phe Gly Ser Arg

             85                  90                  95Val Arg Val Arg Gly Ala Glu Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Met Asn Lys

        100                 105                 110Lys Gly Lys Leu Ile Ala Lys Ser Asn Gly Lys Gly Lys Asp Cys Val

    115                 120                 125Phe Thr Glu Ile Val Leu Glu Asn Asn Tyr Thr Ala Leu Gln Asn Ala

130                 135                 140Lys Tyr Glu Gly Trp Tyr Met Ala Phe Thr Arg Lys Gly Arg Pro Arg145                 150                 155                 160Lys Gly Ser Lys Thr Arg Gln His Gln Arg Glu Val His Phe Met Lys

            165                 170                 175Arg Leu Pro Arg Gly His His Thr Thr Glu Gln Ser Leu Arg Phe Glu

        180                 185                 190Phe Leu Asn Tyr Pro Pro Phe Thr Arg Ser Leu Arg Gly Ser Gln Arg

    195                 200                 205Thr Trp Ala Pro Glu Pro Arg

210                 215<210>7<211>2256<212>DNA<213>Mus musculus<220><221>CDS<222>(1)..(2256)<400>7atg tgg aac gca ctg cag gac aga gac tcc gcg gag gtc ctg gga cac    48Met Trp ASh Ala Leu Gln Asp Arg Asp Ser Ala Glu Val Leu Gly His1               5                  10                  15cgc cag cgc tgg ctc cgt gtt ggg aca ctg gtg ctg gct tta acc gga    96Arg Gln Arg Trp Leu Arg Val Gly Thr Leu Val Leu Ala Leu Thr Gly

         20                  25                  30acc ttc ctc att ggc ttc ctc ttt ggg tgg ttt ata aaa cct tcc aat   144Thr Phe Leu Ile Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys Pro Ser Asn

     35                  40                  45gaa gct act ggt aat gtt tcc cat tct ggc atg aag aag gag ttt ttg   192Glu Ala Thr Gly Asn Val Ser His Ser Gly Met Lys Lys Glu Phe Leu

 50                  55                  60cat gaa ttg aag gct gag aac atc aaa aaa ttt tta tac aat ttc aca   240His Glu Leu Lys Ala Glu Asn Ile Lys Lys Phe Leu Tyr Asn Phe Thr65                  70                  75                  80cgg aca cca cac ttg gca gga aca caa aat aat ttt gag ctt gca aag   288Arg Thr Pro His Leu Ala Gly Thr Gln Asn Asn Phe Glu Leu Ala Lys

             85                  90                  95caa att cat gac cag tgg aaa gaa ttt ggc ctg gat ttg gtt gag tta    336Gln Ile His Asp Gln Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp Leu Val Glu Leu

        100                 105                 110tcc cat tac gat gtc ttg ctg tcc tat cca aat aaa act cat cct aac    384Ser His Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Lys Thr His Pro Asn

    115                 120                 125tat atc tca ata att aat gaa gat gga aat gag att ttc aaa aca tca    432Tyr Ile Ser Ile Ile Asn Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe Lys Thr Ser

130                 135                 140tta tct gaa cag cca ccc cca gga tat gag aat ata tca gat gta gtg    480Leu Ser Glu Gln Pro Pro Pro Gly Tyr Glu Asn Ile Ser Asp Val Val145                 150                 155                 160cca cca tac agt gcc ttc tct cca caa ggg aca cca gag ggt gat cta    528Pro Pro Tyr Ser Ala Phe Ser Pro Gln Gly Thr Pro Glu Gly Asp Leu

            165                 170                 175gtg tat gtc aac tat gca cga act gaa gac ttc ttt aaa ctg gaa cgg    576Val Tyr Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys Leu Glu Arg

        180                 185                 190gaa atg aag atc agt tgt tct ggg aag att gtg att gcc aga tat ggg    624Glu Met Lys Ile Ser Cys Ser Gly Lys Ile Val Ile Ala Arg Tyr Gly

    195                 200                 205aaa gtg ttc aga gga aat atg gtt aaa aat gct caa ctg gca ggg gca    672Lys Val Phe Arg Gly Asn Met Val Lys Asn Ala Gln Leu Ala Gly Ala

210                 215                 220aaa gga atg att ctg tac tca gac cct gct gac tac ttt gtt cct gcg    720Lys Gly Met Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Val Pro Ala225                 230                 235                 240gtg aag tcc tat cca gat ggc tgg aac ctc cct gga ggt ggt gtc caa    768Val Lys Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly Val Gln

            245                 250                 255cgt gga aat gtc tta aat ctt aat ggt gca ggt gac ccg ctc aca cca    816Arg Gly Asn Val Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro

        260                 265                 270ggt tac cca gca aat gaa cat gct tat agg cat gag ttg aca aac gct    864Gly Tyr Pro Ala Asn Glu His Ala Tyr Arg His Glu Leu Thr Asn Ala

    275                 280                 285gtt ggc ctt cca agt att cct gtc cat cct att gga tat gat gat gca    912Val Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Gly Tyr Asp Asp Ala

290                 295                 300cag aaa ctc tta gaa cac atg ggt ggt cca gca ccc cct gac agt agc     960Gln Lys Leu Leu Glu His Met Gly Gly Pro Ala Pro Pro Asp Ser Ser305                 310                 315                 320tgg aag gga gga tta aaa gtg cct tac aac gtg gga cct ggc ttt gct    1008Trp Lys Gly Sly Leu Lys Val Pro Tyr Asn Val Gly Pro Gly Phe Ala

            325                 330                 335gga aac ttt tca aca caa aag gtc aag atg cat att cac tct tac act    1056Gly Asn Phe Ser Thr Gln Lys Val Lys Met His Ile His Ser Tyr Thr

        340                 345                 350aaa gtg aca aga atc tat aat gtc att ggc acc ctc aaa gga gct ctg    1104Lys Val Thr Arg Ile Tyr Asn Val Ile Gly Thr Leu Lys Gly Ala Leu

    355                 360                 365gaa cca gac aga tat gtt att ctt gga ggt cac cga gac gct tgg gta    1152Glu Pro Asp Arg Tyr Val Ile Leu Gly Gly His Arg Asp Ala Trp Val

370                 375                 380ttt ggt ggc att gac cct cag agt gga gca gct gtt gtt cat gaa att    1200Phe Gly Gly Ile Asp Pro Gln Ser Gly Ala Ala Val Val His Glu Ile385                 390                 395                 400gtg cgg agc ttt gga acc ctg aag aag aaa gga cgg agg cct aga agg    1248Val Arg Ser Phe Gly Thr Leu Lys Lys Lys Gly Arg Arg Pro Arg Arg

            405                 410                 415aca att ttg ttt gca agc tgg gat gca gaa gaa ttt ggc ctt ctt ggt    1296Thr Ile Leu Phe Ala Ser Trp Asp Ala Glu Glu Phe Gly Leu Leu Gly

        420                 425                 430tct act gag tgg gca gag gaa cat tca aga ctc cta caa gag cga ggt    1344Ser Thr Glu Trp Ala Glu Glu His Ser Arg Leu Leu Gln Glu Arg Gly

    435                 440                 445gtg gct tat att aat gct gat tct tcc ata gaa gga aat tac act cta    1392Val Ala Tyr Ile Asn Ala Asp Ser Ser Ile Glu Gly Asn Tyr Thr Leu

450                 455                 460aga gtt gat tgc aca cca ctg atg tac agc tta gtg tac aac cta aca    1440Arg Val Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr Ser Leu Val Tyr Asn Leu Thr465                470                 475                 480aaa gag ctg caa agc cca gat gaa ggt ttt gaa gga aaa tct ctt tat    1488Lys Glu Leu Gln Ser Pro Asp Glu Gly Phe Glu Gly Lys Ser Leu Tyr

            485                 490                 495gac agc tgg aaa gaa aag agt cct tca cct gag ttc att gga atg ccc    1536Asp Ser Trp Lys Glu Lys Ser Pro Ser Pro Glu Phe Ile Gly Met Pro

        500                 505                 510aga att agc aag ctg ggg tct ggc aat gat ttt gaa gtg ttc ttc caa    1584Arg Ile Ser Lys Leu Gly Ser Gly Asn Asp Phe Glu Val Phe Phe Gln

    515                 520                 525aga ctt gga att gct tca ggc aga gcc cga tat act aaa aat tgg aaa    1632Arg Leu Gly Ile Ala Ser Gly Arg Ala Arg Tyr Thr Lys Asn Trp Lys

530                 535                 540act aac aaa gtc agc agc tat cct ctc tat cac agt gtc tat gaa aca    1680Thr Asn Lys Val Ser Ser Tyr Pro Leu Tyr His Ser Val Tyr Glu Thr545                 550                 555                 560tat gag ctg gta gta aaa ttt tat gac cca aca ttt aaa tac cac ctc    1728Tyr Glu Leu Val Val Lys Phe Tyr Asp Pro Thr Phe Lys Tyr His Leu

            565                 570                 575act gtg gcc cag gtt cga gga gcg atg gta ttt gaa ctt gcc aat tct    1776Thr Val Ala Gln Val Arg Gly Ala Met Val Phe Glu Leu Ala Asn Ser

        580                 585                 590ata gtg ctt ccc ttt gac tgc caa agt tat gct gta gct ctg aag aag    1824Ile Val Leu Pro Phe Asp Cys Gln Ser Tyr Ala Val Ala Leu Lys Lys

    595                 600                 605tat gct gac act atc tac aat att tca atg aaa cat cca caa gaa atg    1872Tyr Ala Asp Thr Ile Tyr Asn Ile Ser Met Lys His Pro Gln Glu Met

610                 615                 620aag gct tac atg ata tca ttt gat tca ctg ttt tct gca gtc aat aat    1920Lys Ala Tyr Met Ile Ser Phe Asp Ser Leu Phe Ser Ala Val Asn Asn625                 630                 635                 640ttt aca gat gtt gca tct aag ttc aat cag aga ctg caa gag tta gac    1968Phe Thr Asp Val Ala Ser Lys Phe Asn Gln Arg Leu Gln Glu Leu Asp

            645                 650                 655aaa agc aac ccc ata tta ctg aga att atg aat gac cag ctg atg tat    2016Lys Ser Asn Pro Ile Leu Leu Arg Ile Met Asn Asp Gln Leu Met Tyr

        660                 665                 670ctg gaa cgt gca ttc att gat cct tta ggc tta cca gga agg cct ttc    2064Leu Glu Arg Ala Phe Ile Asp Pro Leu Gly Leu Pro Gly Arg Pro Phe

    675                 680                 685tac agg cat acc atc tat gct cca agc agc cac aac aag tat gca gga    2112Tyr Arg His Thr Ile Tyr Ala Pro Ser Ser His Asn Lys Tyr Ala Gly

690                 695                 700gaa tca ttc cct ggg att tat gat gcc ctt ttt gat ata agt agc aaa    2160Glu Ser Phe Pro Gly Ile Tyr Asp Ala Leu Phe Asp Ile Ser Ser Lys705                 710                 715                 720gtc aat gct tct aag gcc tgg aac gaa gtg aag aga cag att tct att    2208Val Asn Ala Ser Lys Ala Trp Asn Glu Val Lys Arg Gln Ile Ser Ile

            725                 730                 735gca acc ttt aca gtg caa gct gca gca gag act ctg agg gaa gta gct    2256Ala Thr Phe Thr Val Gln Ala Ala Ala Glu Thr Leu Arg Glu Val Ala

        740                 745                 750<210>8<211>752<212>PRT<213>Mus musculus<400>8Met Trp Asn Ala Leu Gln Asp Arg Asp Ser Ala Glu Val Leu Gly His1               5                  10                  15Arg Gln Arg Trp Leu Arg Val Gly Thr Leu Val Leu Ala Leu Thr Gly

         20                  25                  30Thr Phe Leu Ile Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys Pro Ser Asn

     35                  40                  45Glu Ala Thr Gly Asn Val Ser His Ser Gly Met Lys Lys Glu Phe Leu

 50                  55                  60His Glu Leu Lys Ala Glu Asn Ile Lys Lys Phe Leu Tyr Asn Phe Thr65                  70                  75                  80Arg Thr Pro His Leu Ala Gly Thr Gln Asn Asn Phe Glu Leu Ala Lys

             85                  90                  95Gln Ile His Asp Gln Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp Leu Val Glu Leu

       100                  105                 110Ser His Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Lys Thr His Pro Asn

    115                 120                 125Tyr Ile Ser Ile Ile Asn Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe Lys Thr Ser

130                 135                 140Leu Ser Glu Gln Pro Pro Pro Gly Tyr Glu Asn Ile Ser Asp Val Val145                 150                 155                 160Pro Pro Tyr Ser Ala Phe Ser Pro Gln Gly Thr Pro Glu Gly Asp Leu

            165                 170                 175Val Tyr Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys Leu Glu Arg

        180                 185                 190Glu Met Lys Ile Ser Cys Ser Gly Lys Ile Val Ile Ala Arg Tyr Gly

    195                 200                 205Lys Val Phe Arg Gly Asn Met Val Lys Asn Ala Gln Leu Ala Gly Ala

210                 215                 220Lys Gly Met Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Val Pro Ala225                 230                 235                 240Val Lys Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly Val Gln

            245                 250                 255Arg Gly Asn Val Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro

        260                 265                 270Gly Tyr Pro Ala Asn Glu His Ala Tyr Arg His Glu Leu Thr Asn Ala

    275                 280                 285Val Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Gly Tyr Asp Asp Ala

290                 295                 300Gln Lys Leu Leu Glu His Met Gly Gly Pro Ala Pro Pro Asp Ser Ser305                 310                 315                 320Trp Lys Gly Gly Leu Lys Val Pro Tyr Asn Val Gly Pro Gly Phe Ala

            325                 330                 335Gly Asn Phe Ser Thr Gln Lys Val Lys Met His Ile His Ser Tyr Thr

        340                 345                 350Lys Val Thr Arg Ile Tyr Asn Val Ile Gly Thr Leu Lys Gly Ala Leu

    355                 360                 365Glu Pro Asp Arg Tyr Val Ile Leu Gly Gly His Arg Asp Ala Trp Val

370                 375                 380Phe Gly Gly Ile Asp Pro Gln Ser Gly Ala Ala Val Val His Glu Ile385                 390                 395                 400Val Arg Ser Phe Gly Thr Leu Lys Lys Lys Gly Arg Arg Pro Arg Arg

            405                 410                 415Thr Ile Leu Phe Ala Ser Trp Asp Ala Glu Glu Phe Gly Leu Leu Gly

        420                 425                 430Ser Thr Glu Trp Ala Glu Glu His Ser Arg Leu Leu Gln Glu Arg Gly

    435                 440                 445Val Ala Tyr Ile Asn Ala Asp Ser Ser Ile Glu Gly Asn Tyr Thr Leu

450                 455                 460Arg Val Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr Ser Leu Val Tyr Asn Leu Thr465                 470                 475                 480Lys Glu Leu Gln Ser Pro Asp Glu Gly Phe Glu Gly Lys Ser Leu Tyr

            485                 490                 495Asp Ser Trp Lys Glu Lys Ser Pro Ser Pro Glu Phe Ile Gly Met Pro

        500                 505                 510Arg Ile Ser Lys Leu Gly Ser Gly Asn Asp Phe Glu Val Phe Phe Gln

    515                 520                 525Arg Leu Gly Ile Ala Ser Gly Arg Ala Arg Tyr Thr Lys Asn Trp Lys

530                 535                 540Thr Asn Lys Val Ser Ser Tyr Pro Leu Tyr His Ser Val Tyr Glu Thr545                 550                 555                 560Tyr Glu Leu Val Val Lys Phe Tyr Asp Pro Thr Phe Lys Tyr His Leu

            565                 570                 575Thr Val Ala Gln Val Arg Gly Ala Met Val Phe Glu Leu Ala Asn Ser

        580                 585                 590Ile Val Leu Pro Phe Asp Cys Gln Ser Tyr Ala Val Ala Leu Lys Lys

    595                 600                 605Tyr Ala Asp Thr Ile Tyr Asn Ile Ser Met Lys His Pro Gln Glu Met

610                 615                 620Lys Ala Tyr Met Ile Ser Phe Asp Ser Leu Phe Ser Ala Val Asn Asn625                 630                 635                 640Phe Thr Asp Val Ala Ser Lys Phe Asn Gln Arg Leu Gln Glu Leu Asp

            645                 650                 655Lys Ser Asn Pro Ile Leu Leu Arg Ile Met Asn Asp Gln Leu Met Tyr

        660                 665                 670Leu Glu Arg Ala Phe Ile Asp Pro Leu Gly Leu Pro Gly Arg Pro Phe

    675                 680                 685Tyr Arg His Thr Ile Tyr Ala Pro Ser Ser His Asn Lys Tyr Ala Gly

690                 695                 700Glu Ser Phe Pro Gly Ile Tyr Asp Ala Leu Phe Asp Ile Ser Ser Lys705                 710                 715                 720Val Asn Ala Ser Lys Ala Trp Asn Glu Val Lys Arg Gln Ile Ser Ile

            725                 730                 735Ala Thr Phe Thr Val Gln Ala Ala Ala Glu Thr Leu Arg Glu Val Ala

        740                 745                 750<210>9<211>2082<212>DNA<213>Mus musculus<220><221>CDS<222>(1)..(2082)<400>9atg aag aag gag ttt ttg cat gaa ttg aag gct gag aac atc aaa aaa    48Met Lys Lys Glu Phe Leu His Glu Leu Lys Ala Glu Asn Ile Lys Lys1               5                  10                  15ttt tta tac aat ttc aca cgg aca cca cac ttg gca gga aca caa aat    96Phe Leu Tyr Asn Phe Thr Arg Thr Pro His Leu Ala Gly Thr Gln Asn

         20                  25                  30aat ttt gag ctt gca aag caa att cat gac cag tgg aaa gaa ttt ggc   144Asn Phe Glu Leu Ala Lys Gln Ile His Asp Gln Trp Lys Glu Phe Gly

     35                  40                  45ctg gat ttg gtt gag tta tcc cat tac gat gtc ttg ctg tcc tat cca   192Leu Asp Leu Val Glu Leu Ser His Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro

 50                  55                  60aat aaa act cat cct aac tat atc tca ata att aat gaa gat gga aat   240Asn Lys Thr His Pro Asn Tyr Ile Ser Ile Ile Ash Glu Asp Gly Asn65                  70                  75                  80gag att ttc aaa aca tca tta tct gaa cag cca ccc cca gga tat gag   288Glu Ile Phe Lys Thr Ser Leu Ser Glu Gln Pro Pro Pro Gly Tyr Glu

             85                  90                  95aat ata tca gat gta gtg cca cca tac agt gcc ttc tct cca caa ggg   336Asn Ile Ser Asp Val Val Pro Pro Tyr Ser Ala Phe Ser Pro Gln Gly

        100                 105                 110aca cca gag ggt gat cta gtg tat gtc aac tat gca cga act gaa gac   384Thr Pro Glu Gly Asp Leu Val Tyr Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp

    115                 120                 125ttc ttt aaa ctg gaa cgg gaa atg aag atc agt tgt tct ggg aag att   432Phe Phe Lys Leu Glu Arg Glu Met Lys Ile Ser Cys Ser Gly Lys Ile

130                 135                 140gtg att gcc aga tat ggg aaa gtg ttc aga gga aat atg gtt aaa aat   480Val Ile Ala Arg Tyr Gly Lys Val Phe Arg Gly Asn Met Val Lys Asn145                 150                 155                 160gct caa ctg gca ggg gca aaa gga atg att ctg tac tca gac cct gct   528Ala Gln Leu Ala Gly Ala Lys Gly Met Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala

            165                 170                 175gac tac ttt gtt cct gcg gtg aag tcc ta5 cca gat ggc tgg aac ctc    576Asp Tyr Phe Val Pro Ala Val Lys Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu

        180                 185                 190cct gga ggt ggt gtc caa cgt gga aat gtc tta aat ctt aat ggt gca    624Pro Gly Gly Gly Val Gln Arg Gly Asn Val Leu Asn Leu Asn Gly Ala

    195                 200                 205ggt gac ccg ctc aca cca ggt tac cca gca aat gaa cat gct tat agg    672Gly Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr Pro Ala Asn Glu His Ala Tyr Arg

210                 215                 220cat gag ttg aca aac gct gtt ggc ctt cca agt att cct gtc cat cct    720His Glu Leu Thr Asn Ala Val Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro225                 230                 235                 240att gga tat gat gat gca cag aaa ctc tta gaa cac atg ggt ggt cca    768Ile Gly Tyr Asp Asp Ala Gln Lys Leu Leu Glu His Met Gly Gly Pro

            245                 250                 255gca ccc cct gac agt agc tgg aag gga gga tta aaa gtg cct tac aac    816Ala Pro Pro Asp Ser Ser Trp Lys Gly Gly Leu Lys Val Pro Tyr Asn

        260                 265                 270gtg gga cct ggc ttt gct gga aac ttt tca aca caa aag gtc aag atg    864Val Gly Pro Gly Phe Ala Gly Asn Phe Ser Thr Gln Lys Val Lys Met

    275                 280                 285cat att cac tct tac act aaa gtg aca aga ate tat aat gtc att ggc    912His Ile His Ser Tyr Thr Lys Val Thr Arg Ile Tyr Asn Val Ile Gly

290                 295                 300acc ctc aaa gga gct ctg gaa cca gac aga tat gtt att ctt gga ggt    960Thr Leu Lys Gly Ala Leu Glu Pro Asp Arg Tyr Val Ile Leu Gly Gly305                 310                 315                 320cac cga gac gct tgg gta ttt ggt ggc att gac cct cag agt gga gca   1008His Arg Asp Ala Trp Val Phe Gly Gly Ile Asp Pro Gln Ser Gly Ala

            325                 330                 335gct gtt gtt cat gaa att gtg cgg agc ttr gga acc ctg aag aag aaa   1056Ala Val Val His Glu Ile Val Arg Ser Phe Gly Thr Leu Lys Lys Lys

        340                 345                 350gga cgg agg cct aga agg aca att ttg ttt gca agc tgg gat gca gaa   1104Gly Arg Arg Pro Arg Arg Thr Ile Leu Phe Ala Ser Trp Asp Ala Glu

    355                 360                 365gaa ttt ggc ctt ctt ggt tct act gag tgg gca gag gaa cat tca aga   1152Glu Phe Gly Leu Leu Gly Ser Thr Glu Trp Ala Glu Glu His Ser Arg

370                 375                 380ctc cta caa gag cga ggt gtg gct tat att aat gct gat tct tcc ata   1200Leu Leu Gln Glu Arg Gly Val Ala Tyr Ile Asn Ala Asp Ser Ser Ile385                 390                 395                 400gaa gga aat tac act cta aga gtt gat tgc aca cca ctg atg tac agc   1248Glu Gly Asn Tyr Thr Leu Arg Val Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr Ser

            405                 410                 415tta gtg tac aac cta aca aaa gag ctg caa agc cca gat gaa ggt ttt   1296Leu Val Tyr Asn Leu Thr Lys Glu Leu Gln Ser Pro Asp Glu Gly Phe

        420                 425                 430gaa gga aaa tct ctt tat gac agc tgg aaa gaa aag agt cct tca cct   1344Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Asp Ser Trp Lys Glu Lys Ser Pro Ser Pro

    435                 440                 445gag ttc att gga atg ccc aga att agc aag ctg ggg tct ggc aat gat   1392Glu Phe Ile Gly Met Pro Arg Ile Ser Lys Leu Gly Ser Gly Asn Asp

450                 455                 460ttt gaa gtg ttc ttc caa aga ctt gga att gct tca ggc aga gcc cga   1440Phe Glu Val Phe Phe Gln Arg Leu Gly Ile Ala Ser Gly Arg Ala Arg465                 470                 475                 480tat act aaa aat tgg aaa act aac aaa gtc agc agc tat cct ctc tat   1488Tyr Thr Lys Asn Trp Lys Thr Asn Lys Val Ser Ser Tyr Pro Leu Tyr

            485                 490                 495cac agt gtc tat gaa aca tat gag ctg gta gta aaa ttt tat gac cca   1536His Ser Val Tyr Glu Thr Tyr Glu Leu Val Val Lys Phe Tyr Asp Pro

        500                 505                 510aca ttt aaa tac cac ctc act gtg gcc cag gtt cga gga gcg atg gta   1584Thr Phe Lys Tyr His Leu Thr Val Ala Gln Val Arg Gly Ala Met Val

    515                 520                 525ttt gaa ctt gcc aat tct ata gtg ctt ccc ttt gac tgc caa agt tat   1632Phe Glu Leu Ala Asn Ser Ile Val Leu Pro Phe Asp Cys Gln Ser Tyr

530                 535                 540gct gta gct ctg aag aag tat gct gac act atc tac aat att tca atg   1680Ala Val Ala Leu Lys Lys Tyr Ala Asp Thr Ile Tyr Asn Ile Ser Met545                 550                 555                 560aaa cat cca caa gaa atg aag gct tac atg ata tca ttt gat tca ctg   1728Lys His Pro Gln Glu Met Lys Ala Tyr Met Ile Ser Phe Asp Ser Leu

            565                 570                 575ttt tct gca gtc aat aat ttt aca gat gtt gca tct aag ttc aat cag   1776Phe Ser Ala Val Asn Asn Phe Thr Asp Val Ala Ser Lys Phe Asn Gln

        580                 585                 590aga ctg caa gag tta gac aaa agc aac ccc ata tta ctg aga att atg   1824Arg Leu Gln Glu Leu Asp Lys Ser Asn Pro Ile Leu Leu Arg Ile Met

    595                 600                 605aat gac cag ctg atg tat ctg gaa cgt gca ttc att gat cct tta ggc   1872Asn Asp Gln Leu Met Tyr Leu Glu Arg Ala Phe Ile Asp Pro Leu Gly

610                 615                 620tta cca gga agg cct ttc tac agg cat acc atc tat gct cca agc agc   1920Leu Pro Gly Arg Pro Phe Tyr Arg His Thr Ile Tyr Ala Pro Ser Ser625                 630                 635                 640cac aac aag tat gca gga gaa tca ttc cct ggg att tat gat gcc ctt   1968His Asn Lys Tyr Ala Gly Glu Ser Phe Pro Gly Ile Tyr Asp Ala Leu

            645                 650                 655ttt gat ata agt agc aaa gtc aat gct tct aag gcc tgg aac gaa gtg   2016Phe Asp Ile Ser Ser Lys Val Asn Ala Ser Lys Ala Trp Asn Glu Val

        660                 665                 670aag aga cag att tct att gca acc ttt aca gtg caa gct gca gca gag   2064Lys Arg Gln Ile Ser Ile Ala Thr Phe Thr Val Gln Ala Ala Ala Glu

    675                 680                 685act ctg agg gaa gta gct                                           2082Thr Leu Arg Glu Val Ala

690<210>10<211>694<212>PRT<213>Mus musculus<400>10Met Lys Lys Glu Phe Leu His Glu Leu Lys Ala Glu Asn Ile Lys Lys1               5                  10                  15Phe Leu Tyr Asn Phe Thr Arg Thr Pro His Leu Ala Gly Thr Gln Asn

         20                  25                  30Asn Phe Glu Leu Ala Lys Gln Ile His Asp Gln Trp Lys Glu Phe Gly

     35                  40                  45Leu Asp Leu Val Glu Leu Ser His Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro

 50                  55                  60Asn Lys Thr His Pro Asn Tyr Ile Ser Ile Ile Asn Glu Asp Gly Asn65                  70                  75                  80Glu Ile Phe Lys Thr Ser Leu Ser Glu Gln Pro Pro Pro Gly Tyr Glu

             85                  90                  95Asn Ile Ser Asp Val Val Pro Pro Tyr Ser Ala Phe Ser Pro Gln Gly

        100                 105                 110Thr Pro Glu Gly Asp Leu Val Tyr Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp

    115                 120                 125Phe Phe Lys Leu Glu Arg Glu Met Lys Ile Ser Cys Ser Gly Lys Ile

130                 135                 140Val Ile Ala Arg Tyr Gly Lys Val Phe Arg Gly Asn Met Val Lys Asn145                 150                 155                 160Ala Gln Leu Ala Gly Ala Lys Gly Met Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala

            165                 170                 175Asp Tyr Phe Val Pro Ala Val Lys Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu

        180                 185                 190Pro Gly Gly Gly Val Gln Arg Gly Asn Val Leu Asn Leu Asn Gly Ala

    195                 200                 205Gly Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr Pro Ala Asn Glu His Ala Tyr Arg

210                 215                 220His Glu Leu Thr Asn Ala Val Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro225                 230                 235                 240Ile Gly Tyr Asp Asp Ala Gln Lys Leu Leu Glu His Met Gly Gly Pro

            245                 250                 255Ala Pro Pro Asp Ser Ser Trp Lys Gly Gly Leu Lys Val Pro Tyr Asn

        260                 265                 270Val Gly Pro Gly Phe Ala Gly Ash Phe Ser Thr Gln Lys Val Lys Met

    275                 280                 285Mis Ile His Ser Tyr Thr Lys Val Thr Arg Ile Tyr Asn Val Ile Gly

290                 295                 300Thr Leu Lys Gly Ala Leu Glu Pro Asp Arg Tyr Val Ile Leu Gly Gly305                 310                 315                 320His Arg Asp Ala Trp Val Phe Gly Gly Ile Asp Pro Gln Ser Gly Ala

            325                 330                 335Ala Val Val His Glu Ile Val Arg Ser Phe Gly Thr Leu Lys Lys Lys

        340                 345                 350Gly Arg Arg Pro Arg Arg Thr Ile Leu Phe Ala Ser Trp Asp Ala Glu

    355                 360                 365Glu Phe Gly Leu Leu Gly Ser Thr Glu Trp Ala Glu Glu His Ser Arg

370                 375                 380Leu Leu Gln Glu Arg Gly Val Ala Tyr Ile Asn Ala Asp Ser Ser Ile385                 390                 395                 400Glu Gly Asn Tyr Thr Leu Arg Val Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr Ser

            405                 410                 415Leu Val Tyr Asn Leu Thr Lys Glu Leu Gln Ser Pro Asp Glu Gly Phe

        420                 425                 430Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Asp Ser Trp Lys Glu Lys Ser Pro Ser Pro

    435                 440                 445Glu Phe Ile Gly Met Pro Arg Ile Ser Lys Leu Gly Ser Gly Asn Asp450                  455                 460Phe Glu Val Phe Phe Gln Arg Leu Gly Ile Ala Ser Gly Arg Ala Arg465                 470                 475                 480Tyr Thr Lys Asn Trp Lys Thr Asn Lys Val Ser Ser Tyr Pro Leu Tyr

            485                 490                 495His Ser Val Tyr Glu Thr Tyr Glu Leu Val Val Lys Phe Tyr Asp Pro

        500                 505                 510Thr Phe Lys Tyr His Leu Thr Val Ala Gln Val Arg Gly Ala Met Val

    515                 520                 525Phe Glu Leu Ala Asn Ser Ile Val Leu Pro Phe Asp Cys Gln Ser Tyr

530                 535                 540Ala Val Ala Leu Lys Lys Tyr Ala Asp Thr Ile Tyr Asn Ile Ser Met545                 550                 555                 560Lys His Pro Gln Glu Met Lys Ala Tyr Met Ile Ser Phe Asp Ser Leu

            565                 570                 575Phe Ser Ala Val Asn Asn Phe Thr Asp Val Ala Ser Lys Phe Asn Gln

        580                 585                 590Arg Leu Gln Glu Leu Asp Lys Ser Asn Pro Ile Leu Leu Arg Ile Met

    595                 600                 605Ash Asp Gln Leu Met Tyr Leu Glu Arg Ala Phe Ile Asp Pro Leu Gln

610                 615                 620Leu Pro Gly Arg Pro Phe Tyr Arg His Thr Ile Tyr Ala Pro Ser Ser625                 630                 635                 640His Asn Lys Tyr Ala Gly Glu Ser Phe Pro Gly Ile Tyr Asp Ala Leu

            645                 650                 655Phe Asp Ile Ser Ser Lys Val Asn Ala Ser Lys Ala Trp Asn Glu Val

        660                 665                 670Lys Arg Gln Ile Ser Ile Ala Thr Phe Thr Val Gln Ala Ala Ala Glu

    675                 680                 685Thr Leu Arg Glu Val Ala

690<210>11<211>45<212>DNA<213>Clostridium tetani<220><221>CDS<222>(1)..(45)<400>11cag tac atc aaa gct aac tcc aaa ttc atc ggt atc acc gag ctg        45Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu1               5                  10                  15<210>12<211>15<212>PRT<213>Clostridium tetani<400>12Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu1               5                  10                  15<210>13<211>63<212>DNA<213>Clostridium tetani<220><221>CDS<222>(1)..(63)<400>13ttc aac aac ttc acc gta agc ttc tgg ctg cgt gtt ccg aaa gtt agc    48Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser1               5                  10                  15gct agc cac ctg gaa                                                63Ala Ser His Leu Glu

         20<210>14<211>2l<212>PRT<213>Clostridium tetani<400>14Phe Asn Asn Phe Thr Val SerPhe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser1               5                 10                  15Ala Ser His Leu Glu

         20<210>15<211>25<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述：破伤风类毒素表位和PSM的融合体<400>15Gln Glu Arg Gly Val Gln Tyr lle Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly1               5                  10                  15Ile Thr Glu Leu Arg Val Asp Cys Thr

         20                  25<210>16<211>25<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述：破伤风类毒素表位和PSM的融合体<400>16Ala Val Val Leu Arg Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly1               5                  10                  15Ile Thr Glu Leu Glu Met Lys Thr Tyr

         20                  25<210>17<211>25<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述：破伤风类毒素表位和PSM的融合体<400>17Met Phe Leu Glu Arg Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly1               5                  10                  15Lle Thr Glu Leu His Val Ile Tyr Ala

         20                  25<210>18<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述：破伤风类毒素表位和PSM的融合体<400>18Asn Ser Arg Leu Leu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg1               5                  10                  15Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Val Asp Cys Thr Pro

         20                  25                  30<210>19<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述：破伤风类毒素表位和PSM的融合体<400>19Val Val Leu Arg Lys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg1               5                  10                  15Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Ser Phe Asp Ser Leu

         20                  25                  30<210>20<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述：破伤风类毒素表位和PSM的融合体<400>20Leu Met Phe Leu Glu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg1               5                  10                  15Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Pro Ser Ser His Asn

         20                  25                  30<210>21<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工His标记<220><221>CDS<222>(1)..(18)<400>21cat cat cat cat cat cat                                      16His His His His His His1               5<210>22<211>6<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列的描述：人工His标记<400>22His His His His His His1               5<210>23<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工His标记<220><221>CDS<222>(1)..(42)<400>23atg aaa cac caa cac caa cat caa cat caa cat caa cat caa            42Met Lys His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln1               5                  10<210>24<211>14<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列的描述：人工His标记<400>24Met Lys His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln1               5                  10<210>25<211>69<212>DNA<213>Mus musculus<220><221>CDS<222>(1)..(69)<400>25atg gat gca atg aag aga ggg ctc tgc tgt gtg ctg ctg ctg tgt gga    43Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly1               5              10                      15gca gtc ttc gtt tcg ccc agc                                        69Ala Val Phe Val Ser Pro Ser

         20<210>26<211>23<212>PRT<213>Mus musculus<400>26Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly1               5                  10                  15Ala Val Phe Val Ser Pro Ser

         20<210>27<211>33<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(1)..(33)<400>27gaa caa aaa ctc atc tca gaa gag gat ctg aat                       33Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn1               5                  10<210>28<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>28Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn1               5                  10<210>29<211>75<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(1)..(75)<400>29atg aag gat tcc tgc atc act gtg atg gcc atg gcg ctg ctg tct ggg   48Met Lys Asp Ser Cys Ile Thr Val Met Ala Met Ala Leu Leu Ser Gly1               5                  10                  15ttc ttt ttc ttc gcg ccg gcc tcg agc                               75Phe Phe Phe Phe Ala Pro Ala Ser Ser

         20                  25<210>30<211>25<212>PRT<213>Homo sapiens<400>30Met Lys Asp Ser Cys Ile Thr Val Met Ala Met Ala Leu Leu Ser Gly1               5                  10                  15Phe Phe Phe Phe Ala Pro Ala Ser Ser

         20                  25<210>31<211>60<212>DNA<213>Mus musculus<220><221>CDS<222>(1)..(60)<400>31atg aga agg atg ctt ctg cac ttg agt gtt ctg act ctc agc tgt gtc   48Met Arg Arg Met Leu Leu Mis Leu Ser Val Leu Thr Leu Ser Cys Val1               5                  10                  15tgg gCC act gcc                                                   60Trp Ala Thr Ala

         20<210>32<211>20<212>PRT<213>Mus musculus<400>32Met Arg Arg Met Leu Leu His Leu Ser Val Leu Thr Leu Ser Cys Val1               5                  10                  15Trp Ala Thr Ala

         20<210>33<211>20<212>PRT<213>Homo sapiens<400>33Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala1               5                  10                  15Pro Asp Thr Arg

         20

Claims (83)

1．一种在动物包括人体内诱导抗多肽抗原免疫应答的方法，所述的多肽抗原在所述动物体内是弱免疫原性或无免疫原性的，这种方法包括实现由动物的免疫系统的抗原呈递细胞(APC)同时呈递免疫原性有效量的以下物质：

1)至少一个来自多肽抗原的CTL表位和/或至少一个来自细胞相关多肽抗原的B细胞表位，和

2)至少一个对动物来说是外源的第一T辅助细胞表位(T_H表位)。

2．一种在动物包括人体内通过诱导特异的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答而下调细胞相关多肽抗原的方法，所述的多肽抗原在所述动物体内是弱免疫原性或无免疫原性的，所述CTL应答是针对表面携带有所述细胞相关多肽抗原或在其细胞内区室携带有所述细胞相关多肽抗原的细胞，这种方法包括在动物体内实现由合适的抗原呈递细胞(APC)同时呈递以下物质：

1)至少一个来自细胞相关多肽抗原的CTL表位，和

2)至少一个对动物来说是外源的第一T辅助淋巴细胞(T_H)表位。

3．如权利要求1或2的方法，其中所述的至少一个CTL表位当被呈递时与APC细胞表面的MHCⅠ类分子相结合，和/或其中所述的至少一个第一外源T_H表位当被呈递时与APC细胞表面的MHCⅡ类分子结合。

4．如前述任一项权利要求的方法，其中抗原呈递细胞是树突状细胞或巨噬细胞。

5．如前述任一项权利要求的方法，其中多肽抗原选自肿瘤相关多肽抗原、自身蛋白、病毒多肽抗原和来自细胞内寄生虫或细菌的多肽抗原。

6．如前述任一项权利要求的方法，其中APC细胞对CTL表位以及第一外源T_H表位的呈递是通过向动物的免疫系统呈递多肽抗原的至少一种第一类似物而实现的，所述的第一类似物包含多肽抗原氨基酸序列的一个变异，所述的变异至少含有所述CTL表位和第一外源T_H表位。

7．如权利要求6的方法，其中至少第一类似物含有细胞相关多肽抗原的大部分已知的和推测的CTL表位。

8．如权利要求7的方法，其中类似物氨基酸序列中大部分已知的和推测的CTL表位被至少90％的能够识别相关多肽抗原所有已知的和推测的CTL表位的MHCⅠ单倍型所识别。

9．如权利要求6到8任一项的方法，其中细胞相关多肽抗原的几乎所有已知的CTL表位存在于类似物中，和/或其中细胞相关多肽抗原的几乎所有推测的CTL表位存在于至少第一类似物中。

10．如权利要求6到9任一项的方法，其中至少一个第一类似物另外包含由细胞相关多肽抗原结构的修饰所组成的部分，所述的修饰具有以下效果：用第一类似物免疫动物可在动物体内诱导抗细胞相关多肽抗原的抗体产生。

11．如前述任一项权利要求的方法，其包括以免疫原性有效量向动物的免疫系统呈递至少一个多肽抗原的第二类似物，所述的第二类似物包含多肽抗原结构的一个修饰，所述的修饰具有以下效果：用第二类似物免疫动物可在动物体内诱导抗细胞相关多肽抗原的抗体产生。

12．如权利要求11的方法，其中所述修饰包括在第二类似物中包含至少一个外源T_H表位。

13．如权利要求6到12任一项的方法，其中第一和/或第二类似物包含细胞相关多肽抗原的大部分的B细胞表位。

14．如权利要求6到13任一项的方法，其中所述变异和/或修饰涉及氨基酸取代和/或缺失和/或插入和/或添加。

15．如权利要求6到14任一项的方法，其中所述变异和/或修饰包括

------至少一个第一部分被包含在第一和/或第二类似物中，所述的第一部分将类似物导向至抗原呈递细胞，和/或

------至少一个第二部分被包含在第一和/或第二类似物中，所述的第二部分刺激免疫系统，和/或

------至少一个第三部分被包含在第一和/或第二类似物中，所述的第三部分优化类似物向免疫系统的呈递。

16．如权利要求6到15任一项的方法，其中所述变异和/或修饰包括细胞相关多肽抗原的至少一个B细胞表位或至少一个CTL表位的重复。

17．如权利要求6到16任一项的方法，其中所述变异和/或修饰包括引入半抗原。

18．如前述任一项权利要求的方法，其中第一和/或第二外源T_H表位是免疫优势的。

19．如前述任一项权利要求的方法，其中第一和/或第二外源T_H表位是混栖的。

20．如权利要求12到19任一项的方法，其中第一和/或第二外源T_H表位选自天然的T_H表位和人工MHCⅡ结合肽序列。

21．如权利要求20的方法，其中天然的T_H表位选自破伤风类毒素表位如P2和P30表位、白喉类毒素表位、流感病毒血凝素表位和恶性疟原虫CS表位。

22．如权利要求12到21任一项的方法，其中第一和/或第二T_H表位和/或第一和/或第二和/或第三部分以下列形式存在

------与细胞相关多肽抗原氨基酸序列或其亚序列中合适的化学基团共价或非共价连接的侧基团，和/或

------细胞相关多肽抗原氨基酸序列的融合配偶体。

23．如权利要求22的方法，其中第一部分是APC特异性表面抗原的基本上特异性的结合配偶体，如在APC上有受体存在的碳水化合物如甘露聚糖或甘露糖。

24．如权利要求15到23任一项的方法，其中第二部分选自细胞因子如γ干扰素(IFN-γ)，Flt3配体(Flt3L)，白细胞介素1(IL-1)，白细胞介素2(IL-2)，白细胞介素4(IL-4)，白细胞介素6(IL-6)，白细胞介素12(IL-12)，白细胞介素13(IL-13)，白细胞介素15(IL-15)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或其有效部分；热休克蛋白，选自HSP70,HSP90,HSC70,GRP94和钙网蛋白(CRT)或其有效部分；或激素。

25．如权利要求15到24任一项的方法，其中第三部分是一种脂类如棕榈酰基、肉豆蔻基、法呢基、香叶基-香叶基、GPI锚和N-酯酰甘油二酯基。

26．如权利要求6到25任一项的方法，其中第一和/或第二类似物具有细胞相关多肽抗原几乎全部三级结构。

27．如权利要求6到26任一项的方法，其中APC呈递是通过给予动物免疫原性有效量的至少一个第一类似物而实现的。

28．如权利要求27的方法，其中也给予免疫原性有效量的至少一个第二类似物。

29．如权利要求27或28的方法，其中所述的至少一个第一和/或第二类似物与药物学和免疫学可接受的载体和/或运送工具和任选的佐剂配制在一起。

30．如权利要求29的方法，其中所述的佐剂促进APCs细胞如树突状细胞对至少第一和/或第二类似物的摄入。

31．如权利要求30的方法，其中佐剂选自免疫定向佐剂；免疫调节佐剂如毒素、细胞因子和分枝杆菌衍生物；油剂；聚合物；胶囊形成佐剂；皂苷；免疫刺激复合物基质(ISCOM基质)；颗粒；DDA；铝佐剂；DNA佐剂；γ-菊粉和胶囊化佐剂。

32．如权利要求31的方法，其中细胞因子是如权利要求24所定义的细胞因子或其有效部分，其中毒素选自李斯特氏菌毒素(LLO)、脂质体A(MPL,L180.5/RalLPS)和热稳定的内毒素，其中分枝杆菌衍生物选自胞壁酰二肽、完全弗氏佐剂、RIBI和海藻糖二酯如TDM和TDE，其中免疫定向佐剂选自CD40配体、CD40抗体或其特异性结合片段、甘露糖、Fab片段和CTLA-4；其中油剂选自角鲨烯或不完全弗氏佐剂，其中聚合物选自碳水化合物如右旋糖苷、PEG、淀粉、甘露聚糖和甘露糖；塑料聚合物如；和乳胶如乳胶珠；其中皂甙选自皂树皂甙、Quil A和QS21，其中颗粒包含乳胶和右旋糖苷。

33．如权利要求27到32任一项的方法，其中给予途径选自经口途径和肠胃外途径如真皮内、真皮下、皮内或皮下；腹膜内、经颊、舌下、硬膜内、脊柱、肛内和颅内途径。

34．如权利要求27到33任一项的方法，其包括每年至少给药1次，如每年至少给药2、3、4、5、6和12次。

35．如权利要求1到5任一项的方法，其中呈递是通过给予动物携带有编码和表达至少一种CTL表位和至少一种T_H表位的核酸片段的非致病性微生物或病毒实现的。

36．如权利要求6到14任一项的方法，其中呈递是通过给予动物携带至少一个编码和表达至少第一类似物的核酸片段的非致病性微生物或病毒实现的。

37．如权利要求15到26任一项的方法，其中T_H表位和/或第一和/或第二和/或第三部分是以来自细胞相关多肽抗原氨基酸序列的融合配偶体的形式存在的，且其中呈递是通过给予动物携带至少一个编码和表达至少第一和/或第二类似物的核酸片段的非致病性微生物或病毒实现的。

38．如权利要求11到14任一项或权利要求36的方法，其中呈递是通过给予动物携带至少一个编码和表达至少第二类似物的核酸片段的非致病性微生物或病毒实现的。

39．如权利要求38的方法，其中向动物给予一次非致病性微生物或病毒。

40．如权利要求1到5任一项的方法，其中呈递是通过在体内向APC细胞内引入至少一个编码和表达至少一个CTL表位和/或至少一个B细胞表位，和至少一个第一外源T_H表位的核酸片段实现的。

41．如权利要求6到14任一项的方法，其中呈递是通过在体内向APC细胞内引入至少一个编码和表达第一类似物的核酸片段实现的。

42．如权利要求15到26任一项的方法，其中T_H表位和/或第一和/或第二和/或第三部分是以来自细胞相关多肽抗原氨基酸序列的融合配偶体的形式存在的，且其中呈递是通过在体内向APC细胞内引入至少一个编码和表达第一和/或第二类似物的核酸片段实现的。

43．如权利要求11到14任一项或权利要求41的方法，其中进一步包括在体内向APC细胞内引入至少一个编码和表达第二类似物的核酸片段。

44．如权利要求1到5任一项的方法，其中呈递是通过在体内向APC细胞内共同引入至少两个核酸片段实现的，其中一个核酸片段编码和表达至少一个CTL表位，且其中另一个核酸片段编码和表达权利要求1、2和21到24任一项中所定义的至少一个第一外源T_H表位。

45．如权利要求40到44任一项的方法，其中引入的核酸选自裸DNA、与带电荷的或不带电荷的脂类配制在一起的DNA、配制在脂质体中的DNA、被包含在病毒载体上的DNA、与促进转染的蛋白或多肽配制在一起的DNA、与寻靶定向蛋白或多肽配制在一起的DNA、与寻靶定向碳水化合物配制在一起的DNA、与钙沉淀试剂配制在一起的DNA、与惰性载体分子结合在一起的DNA和与佐剂配制在一起的DNA。

46．如权利要求45的方法，其中佐剂选自权利要求30到32任一项中定义的佐剂。

47．如权利要求40到46任一项的方法，其中采用权利要求33或34中定义的给药方式。

48．一种选择在动物体内是弱免疫原性或无免疫原性的细胞相关多肽抗原的免疫原性类似物的方法，所述的免疫原性类似物能够在动物体内诱导产生CTL应答，所述CTL应答针对展示与来自细胞相关多肽抗原的一个表位结合的MHCⅠ类分子的细胞，所述方法包含以下步骤

a)鉴别细胞相关多肽抗原氨基酸序列的至少一个亚序列，所述的亚序列不含有已知的或推测的CTL表位，

b)通过向细胞相关多肽抗原氨基酸序列中在步骤a)所鉴别的至少一个亚序列中的一个位置，引入至少一个对动物来说是外源的T_H表位来制备细胞相关多肽抗原的至少一个推定的免疫原性类似物，和

c)选择在步骤b)中所制备的证实能够在动物体内诱导产生CTL应答的那个/那些类似物。

49．如权利要求48的方法，其中

1)在步骤a)中所鉴别的亚序列不含有半胱氨酸残基，或者，在步骤b)中引入的T_H表位不明显改变半胱氨酸残基的模式，和/或

2)在步骤a)中所鉴别的亚序列不含有已知的或推测的糖基化位点，或者，在步骤b)中引入的T_H表位不明显改变糖基化位点的模式，和/或

3)在步骤a)中所鉴别的亚序列明显负责由细胞相关多肽抗原所造成的病理生理学后果，并且在步骤b)中引入的外源T_H表位可以减少或除去所述的病理生理学后果，和/或

4)在步骤a)中所鉴别的亚序列与动物体内另外的蛋白抗原的氨基酸序列是同源的，并且在步骤b)中引入的T_H表位基本上去除了这种同源性，和/或

5)在步骤b)中引入的外源T_H表位导致细胞相关多肽抗原的大部分B细胞表位被保存下来。

50．如权利要求49的方法，在第5)项中，类似物具有细胞相关多肽抗原的总体三级结构。

51．一种制备能够产生细胞相关多肽抗原的类似物的细胞的方法，这种方法包括将编码根据权利要求48到50任一种方法选择出的类似物的核酸序列引入到载体中，并用此载体转化合适的宿主细胞。

52．一种制备细胞相关多肽抗原的类似物的方法，这种方法包括在能够促进编码细胞相关多肽抗原的核酸序列表达的条件下培养权利要求51的细胞，并从培养物的上清液中提取类似物。

53．如权利要求52的方法，其中进一步包括纯化所提取的类似物和，任选地对纯化产物进行人工翻译后修饰如再折叠、用酶处理、化学修饰和缀合。

54．如前述任一项权利要求的方法，其中弱的细胞相关多肽抗原选自5-α还原酶、α-胎蛋白、AM-1、APC、APRIL、BAGE、β-连环蛋白、Bcl2、bcr-abl(b3a2)、CA-125、CASP-8/FLICE、组织蛋白酶、CD19、CD20、CD21、CD23、CD22、CD33、CD35、CD44、CD45、CD46、CD5、CD52、CD55(791Tgp72)、CD59、CDC27、CDK4、CEA、c-myc、Cox-2、DCC、DcR3、E6/E7、EGFR、EMBP、Ena78、Farsyl转移酶、FGF8b或FGF8a、FLK-1/KDR、叶酸受体、G250、GAGE家族、胃泌素17、胃泌素释放激素(铃蟾肽)、GD2/GD3/GM3、GnRH、GnTV、GP1、gp100/Pmel17、gp-100-in4、gp15、gp75/TRP-1、hCG、肝素酶、Her2/neu、HMTV、Hsp70、hTERT(端粒酶)、IGFR1、IL-13R、iNOS、Ki67、KIAA0205、K-ras,H-ras,N-ras、KSA(CO17-1A)、LDLR-FUT、MAGE家族(MAGE-1,MAGE-2,MAGE-3等)、Mammaglobin、MAP17、Melan-A/MART-1、mesothelin、MIC A/B、MT-MMPs,Mox1、异常糖基化的粘蛋白如MUC-1、MUC-2、MUC-3和MUC-4、MUM-1、NY-ESO-1、骨粘连蛋白、p15、p170/MDR1、p53、p97/促黑素转移素、PAI-1、PDGF、血纤维蛋白溶酶原(uPA)、PRAME、Probasin、Progenipoietin、PSA、RAGE-1、Rb、RCAS1、SART-1、SSX基因家族、STAT3、STn(粘蛋白相关)、TAG-72、TGF-α、TGF-β、胸腺素β15、TNF-α、TPA、TPI、TRP-2、酪氨酸酶、VEGF、ZAG、p16INK4、谷胱甘肽-S-转移酶。

55．如权利要求54的方法，其中细胞相关多肽抗原是人PSM。

56．如权利要求55的方法，其中外源T_H细胞表位被引入到由SEQID NO:2的下述位置所定义的部分PSM氨基酸序列中：16-52和/或87-108和/或210-230和/或269-289和/或298-324和/或442-465和/或488-514和/或598-630和/或643-662和/或672-699位氨基酸位置。

57．如权利要求55或56的方法在治疗或缓解前列腺癌中的应用。

58．如权利要求54的方法，其中细胞相关多肽抗原是成纤维细胞生长因子8b(FGF8b)。

59．如权利要求58的方法，其中外源T细胞表位被引入到由SEQID NO:6的下述位置所定义的FGF8b部分氨基酸序列中：1-54和/或178-215和/或55-58和/或63-68和/或72-76和/或85-91和/或95-102和/或106-111和/或115-120和/或128-134和/或138-144和/或149-154和/或158-162和/或173-177位氨基酸位置，并且其中优选不引入到26-45和186-215位氨基酸位置。

60．如权利要求58或59的方法在治疗或缓解癌症如前列腺癌和乳腺癌中的应用。

61．如权利要求54的方法，其中细胞相关多肽抗原是Her2。

62．如权利要求61的方法，其中外源T细胞表位被引入到由SEQ IDNO:3的下述位置所定义的Her2部分氨基酸序列中：5-25和/或59-73和/或103-117和/或149-163和/或210-224和/或250-264和/或325-339和/或369-383和/或465-479和/或579-593和/或632-652和/或653-667和/或661-675和/或695-709和/或710-730氨基酸位置，72-86和/或146-160和/或221-235和/或257-271和/或387-401位氨基酸位置。

63．如权利要求61或62的方法在治疗或缓解乳腺癌中的应用。

64．在人体内具有免疫原性的人PSM类似物，所述的类似物包含PSM几乎所有已知的和推测的CTL和B细胞表位并且包括至少一个如权利要求18到21任一项中定义的外源T_H表位。

65．如权利要求64的类似物，其中至少一个外源T_H表位以PSM氨基酸序列中的插入或PSM氨基酸序列一部分的取代形式存在或是缺失一部分PSM氨基酸序列的结果。

66．如权利要求65的类似物，其中外源T_H表位被引入到权利要求56中定义的位置。

67．在人体内具有免疫原性的人Her2类似物，所述的类似物包含Her2几乎所有已知的和推测的CTL和B细胞表位并且包括至少一个如权利要求18到21任一项中定义的外源T_H表位。

68．如权利要求67的类似物，其中至少一个外源T_H表位以Her2氨基酸序列中的插入或Her2氨基酸序列一部分的取代形式存在或是缺失一部分Her2氨基酸序列的结果。

69．如权利要求68的类似物，其中外源T_H表位被引入到权利要求62中定义的位置。

70．在人体内具有免疫原性的人/鼠FGF8b类似物，所述的类似物包含FGFSb几乎所有已知的和推测的CTL和B细胞表位并且包括至少一个如权利要求18到21任一项中定义的外源T_H表位。

71．如权利要求70的类似物，其中至少一个外源T_H表位以FGF8b氨基酸序列中的插入或FGF8b氨基酸序列一部分的取代形式存在或是缺失一部分FGF8b氨基酸序列的结果。

72．如权利要求71的类似物，其中外源T_H表位被引入到权利要求59中定义的位置。

73．一种免疫原性组合物，其包含作为有效的免疫原性作用剂的权利要求64到72任一项的类似物以及药物学和免疫学可接受的载体或运送工具，和任选的佐剂。

74．一种编码权利要求64到72任一项的类似物的核酸片段。

75．一种携带权利要求74的核酸片段的载体。

76．如权利要求75的载体，其能自主复制。

77．如权利要求75或76的载体，其选自质粒、噬菌体、粘粒、微型染色体和病毒。

78．如权利要求75到77任一项的载体，其在5’-3’方向以可操作的连接方式包含驱动权利要求74的核酸片段表达的启动子，任选的一编码可使多肽片段分泌或结合在膜上的前导肽的核酸序列，权利要求74的核酸片段，和任选的编码终止子的核酸序列。

79．如权利要求75到78任一项的载体，当被引入宿主细胞时，此载体可与或不与宿主细胞染色体整合。

80．一种携带如权利要求75到79任一项的载体的转化的细胞。

81．一种诱导抗PSM,Her2或FGF8b抗体产生的组合物，此组合物包含

1)权利要求74的核酸片段或权利要求75到79任一项的载体，和

2)药物学和免疫学可接受的稀释剂和/或运送工具和/或佐剂。

82．一种稳定的细胞系，其携带权利要求75到79任一项的载体并且表达权利要求74的核酸片段，且任选地分泌或在其表面结合权利要求64到72任一项的类似物。

83．一种制备权利要求80的细胞的方法，此方法包括用权利要求74的核酸片段或权利要求75到79任一项的载体转化宿主细胞。

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