CN102481332A - 用于提高血小板水平的肽疗法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及T-140类似肽的新治疗用途，以及包含T-140类似肽的组合物。具体地，本发明涉及用于提高血小板水平，对血小板减少(症)的治疗和预防有用，用于控制出血以及用于诱导或调制止血的组合物和方法。

Description

用于提高血小板水平的肽疗法

技术领域

本发明涉及调节血小板水平的组合物和方法。

背景技术

血小板，也称为凝血细胞，是存在于哺乳动物血液中并介导血凝块形成和止血的无核细胞片段。另外，血小板释放生长因子在结缔组织的修复和再生中起重要作用并可以促进伤口愈合。血小板是巨核细胞(MK)的最终分化产物，巨核细胞又起源于骨髓的多能干细胞。虽然发现体液因素如血小板生成素(TPO)影响巨核细胞发育的不同细胞步骤，但以多能干细胞开始，以血小板结束的复合物突变、分化和定位过程尚未完全了解。

血小板平均寿命为约5至10天，它们的生理血液水平正常为150,000至450,000/μL。当患者的循环血小板水平下降到该生理范围以下时，接着会出现称为血小板减少(症)的病况。这种病况通常与形成的止血栓子有缺陷和出血关联，其中出血的风险与血小板计数成反比。

骨髓中血小板生成率降低，或血小板消耗、外周中血小板降解的促进，或异常血小板分配都会使血小板水平降低。例如，血小板减少(症)可能是由于抗体介导的血小板破坏或例如恶性浸润或化疗引起的骨髓衰竭造成的。

药物干预在一些情况下是可能的，例如，在诸如免疫介导的血小板减少(其中免疫系统的组分靶向和破坏血小板)的情况下，指出了可以使用免疫抑制药物。但是，对于许多患者而言，唯一批准的治疗方案是血小板输注和骨髓移植。预防性输注要谨慎使用，因为它们可能会因反复使用因为形成血小板同种异体抗体而失去其效力。血小板输注的另外潜在风险包括感染、过敏反应、和溶血反应。在产量减小引起血小板功能障碍或血小板减少时，输注是为活动性出血或严重血小板减少(例如，血小板计数＜10,000/μL)的患者保留的。在由血小板功能障碍引起血小板减少的情况下，输注是为危及生命的出血或CNS出血保留的。

因为TPO已被证明可以促进MK增殖和成熟以及血小板形成(Kaushansky等人，1994)，所以已建议使用TPO治疗血小板减少。已报道，当向正常健康志愿者和癌症患者静脉施用重组人TPO时，它导致血小板计数在施用后5天开始剂量依赖性增大并在10～14天后达到高峰。但是，早期血小板生成素类似物的临床试验已被终止，因为抗体与内源性血小板生成素交叉反应并导致继发血小板减少和出血(Junzhi等人，2001)。在某些条件下，TPO被建议作为维持疗法，而不用于诱导缓解。

其它细胞因子如IL-1、IL-3、IL-6和GM-CSF已被证明对动物巨核细胞的产生起着作用，并在临床研究中表现出血小板生成活性。但是，每个要么表现出不可接受的毒性谱，要么不能使血小板计数显著增大，这些细胞因子在治疗血小板减少中的进一步治疗应用已被终止。

因此，显然存在未满足的作为血小板输注替代物，阻止和/或治疗血小板减少的有效药物的要求。

趋化因子受体CXCR4是在各种各样的正常组织中表达的G-蛋白偶联受体，对胎儿的发育、造血干细胞的动员和幼稚淋巴细胞(naivelymphocyte)的运输起着重要作用(Rossi和Zlotnik，2000)。趋化因子CXCL12(也称为基质细胞衍生因子，或SDF-1)是CXCR4的唯一天然配体。CXCL12在包括肺、肝、骨髓和淋巴结在内的多种组织中组成性表达。

CXCL12与CXCR4的结合可活化多种调节细胞趋化、粘附、生存和增殖的细胞内信号传导通路和效应分子。例如，磷脂酰肌醇-3-激酶通路和丝裂原活化蛋白(MAP)激酶通路受CXCL12和CXCR4调节。

已证明，成熟MK功能性地表达SDF-1受体，CXCR4。还发现，SDF-1体外诱导成熟MK通过内皮细胞层迁移并增多它们的血小板生成。另外，给正常小鼠注射的腺-SDF-1，使该小鼠的血小板计数在3天后增大，而在7～10天后达到高峰，到28天时恢复正常(Lane等人，2000)。

本领域描述了包括CXCR4激动剂和拮抗剂在内的趋化因子受体调制剂的各种用途(Princen等人，2005；Tamamura等人，2005；US 7,169,750)。US 7,435,718公开了用作CXCR4拮抗剂，可用于治疗造血细胞如祖细胞或干细胞，促进细胞繁殖、自我更新、增殖或扩增的速率的某些SDF-1类似肽。US 7,435,718的公开内容揭示了，这些SDF-1类似物可以与另外的活性成分，尤其是TPO，一起配制或给药。

美国专利公开第2007/0167459号公开了具有CXCR4调节活性的杂环化合物，特别是CXCR4拮抗剂。这些化合物被建议用于预防和和治疗各种疾病，尤其是癌性疾病，包括血小板减少症。该说明书也公开了这些化合物可以与选自包括TPO在内的大范围列表的另外药物或化合物一起使用。

称为AMD3100的双环拉胺类(双螯环类，bicyclam)药物，最初作为抗HIV化合物被发现，可以拮抗方式特异性地与CXCR4相互作用。用AMD3100阻断CXCR4受体，可以动员造血祖细胞。PCT公开第WO03/011277号涉及增强受试者的祖细胞和/或干细胞群体的方法，该方法通过施用CXCR4拮抗剂如AMD3100，任选地联合施用TPO来实现。AMD3100正在经受临床试验以评价它增加可用于移植的干细胞的能力，并指明(以商品名Mozobil)可与粒细胞集落刺激因子(G-CSF)联用从而将造血干细胞(HSC)动员到外周血中，以便采集和随后进行非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤患者的自体造血干细胞移植。然而，如可以从Mozobil产品说明书中判定的，这种药物的施用可能会导致血小板水平降低和血小板减少，因此必须在Mozobil使用和血浆析离(Apheresis)期间监测血小板水平。

因而，关于各种CXCR4激动剂和拮抗剂可能参与调制血小板水平方面的证据相互矛盾。

T-140是14个残基的合成肽，其研制用作抑制HIV-1(X4-HIV-1)通过特异性结合到CXCR4上进入T细胞的特异性CXCR4拮抗剂(Tamamura等人，1998)。随后，研制了T-140的肽类似物，其用作在纳摩尔浓度水平下具有抑制活性的特异性CXCR4拮抗肽(参见Tamamura等人，2003，WO2002/020561和WO 2004/020462)。

WO 2002/020561公开了T-140的新型肽类似物和衍生物。′561公开表明了，要求保护的肽是强有力的CXCR4抑制剂，表现出高的抗HIV病毒活性和低细胞毒性。

WO 2004/020462公开了T-140的另外的新型肽类似物和衍生物，包括4F-苯甲酰基-TN 14003(SEQ ID NO：1)。′462公开进一步公开了新型预防和治疗组合物以及利用T-140类似物治疗癌症和慢性类风湿性关节炎的方法。′462说明书证明了，这些肽抑制包括乳腺癌和白血病细胞在内的癌细胞迁移的能力，和抑制体内转移形成的能力。该说明书进一步证明了对小鼠迟发型超敏反应和胶原诱导的关节炎，类风湿性关节炎动物模型的抑制作用。

WO 2004/087068涉及治疗或预防CXCR4介导的病状的方法，该方法包含向宿主施用足以抑制表达CXCR4受体或其同源物的细胞中的CXCR4信号转导的量的CXCR4肽拮抗剂，其中该CXCR4肽拮抗剂不是抗体或其片段。′068公开公开了示例性CXCR4肽拮抗剂包括T140和T140衍生物，该病状包括癌症如乳腺癌、脑癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌和非小细胞肺癌。涉及CXCR4拮抗剂在癌症治疗中的用途的其它出版物包括，例如，WO 00/09152、US 2002/0156034和WO 2004/024178。

本发明一些发明人的公开(Avniel等人，2006)公开了用T-140类似物阻断CXCR4/CXCL12轴，可以使积累在真皮中的嗜酸性粒细胞显著减少和改善上皮化，从而显著地改善烧伤之后的皮肤恢复。

随后，发现在某些条件下，T-140类似物的一些功能除了CXCR4拮抗活性之外，还可以具有CXCR4超激动特性。本发明一些发明人的WO2008/075369公开了包含具有CXCR4超激动剂活性的T-140肽类似物的组合物，及其在调节造血系统的恢复，特别是治疗与骨髓损伤关联的病况中的治疗应用。本发明一些发明人的WO 2008/075370公开了包含具有CXCR4超激动剂活性的T-140肽类似物的组合物，及其在癌症治疗中的用途。本发明一些发明人的WO 2008/075371公开了包含具有CXCR4超激动剂活性的T-140肽类似物的组合物，及其在免疫治疗和接种中的新型治疗应用。

现有技术没有公开或揭示，属于T-140类似物家族的CXCR4抑制剂肽可以特异性地促进体内血小板的产生，特别是这些肽可以增强TPO提升血小板计数的能力。长期以来需要对治疗和预防血小板缺乏有用的组合物和方法。能够迅速提高血小板计数，对控制需要它的受试者的出血有用的治疗药剂也将是有利的。

发明内容

本发明涉及用于提高血小板水平以及治疗和预防与血小板减少(症)及其症状关联的病况的组合物和方法。根据具体的实施方式，本发明可以用于控制或抑制血小板计数降低的受试者出血(症)。

本发明部分地基于这一出人意料的发现，即，已知肽4F-苯甲酰基-TN14003(4F-苯甲酰基-Arg-Arg-Nal-Cys-Tyr-Cit-Lys-DLys-Pro-Tyr-Arg-Cit-Cys-Arg-NH₂，SEQ IDNO：1)表现出相比已知血小板生成剂如血小板生成素(TPO)的模式特征在质量和数量上截然不同的增强血小板水平的模式。具体地，出人意料地发现，向人类受试者施用该肽，可以刺激血小板计数立即增大。另外，4F-苯甲酰基-TN14003在刺激健康C57B1小鼠血小板生成方面的效力与TPO一样，甚至在提高血小板水平和减轻由化疗诱导的血小板减少方面的效力比TPO更强。而且，出人意料地发现4F-苯甲酰基-TN14003可以进一步刺激血液中血小板的产生和TPO诱导的骨髓中前体集落的产生。因而，出乎意料地发现本发明肽在调节凝血细胞水平方面具有有利的双重效应：特征是血小板在施用几分钟内提升的瞬即效应，和进一步伴随着血小板生成增多的施用几天内的延长效应。

本发明在一些实施例中提供了，如本文详细描述的以提高的效率和/或安全性使用对刺激血小板生成和/或它们的血液循环水平有用的4F-苯甲酰基-TN14003及其类似物的组合物和方法。

在本发明新型组合物和方法中使用的4F-苯甲酰基-TN14003类似物(在本文也称为“本发明的肽”)是专利申请WO 2002/020561和WO2004/020462中公开的结构和功能相关的肽，也称为“T-140类似物”，如下文详细描述的。

根据第一方面，提供了提升需要它的受试者的血小板水平的方法，该方法包含向该受试者施用有效量的具有如SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列的肽或其类似物以便提升所述受试者的血小板水平。

在一种实施方式中，该方法用于提升所述受试者外周血中的血小板水平。在其它实施方式中，本发明方法可以有利地用于使血小板水平迅速增加，以便诱导血小板在几小时内提升，或者在其它实施方式中诱导血小板在施用的几分钟内提升。在一种具体实施方式中，该方法以迅速的方式诱导所述受试者外周血中血小板显著提升。在另一种具体实施方式中，所述提升发生在施用所述肽的一个小时内。

血小板水平在一些实施方式中可以相比启动治疗之前它们的水平提升，或者在其它实施方式中相比在缺乏治疗的情况下它们的水平(例如，它们的预测水平或在对照受试者中的水平)提升。

在一些实施方式中，本发明的组合物和方法可以用于治疗或预防与血小板计数减少或处于亚最佳状态关联的病况或症状。根据一些实施方式，本发明方法用于治疗或预防所述受试者的血小板减少(症)。

在不同的实施方式中，该方法可以用于治疗或预防可能伴随着活动性出血或活动性出血风险的急性或慢性血小板减少的症状。在一种特定实施方式中，该血小板减少的特征为血小板计数小于20,000/μL。在另一种特定实施方式中，该方法可以用于治疗特征为血小板计数小于10,000/μL的严重血小板减少。在又一种特定实施方式中，所述受试者经受临床上的显著出血。

在其它实施方式中，当拔牙、分娩、手术或其它侵入性外科手术需要快速或瞬时增大血小板计数时可以使用该方法。例如，当受试者患有血小板减少并在外科手术的24小时内(例如，手术之前的几个小时或几分钟、在外科手术期间或外科手术之后立即)开始施用所述肽时，可以使用该方法。

在不同的实施方式中，该血小板减少可以选自：与血小板破坏增加关联的血小板减少、与血小板隔绝(血小板挤伤扣留，platelet sequestration)增加关联的血小板减少、与血小板稀释(dilution)关联的血小板减少，和与血小板生成受损关联的血小板减少。

在一种特定实施方式中，所述血小板减少与免疫性血小板破坏增加关联，例如，特发性血小板减少性紫癜或自身免疫性血小板减少。在另一种特定实施方式中，所述血小板减少与丙型肝炎病毒相关性肝硬化关联。在又一种特定实施例中，所述血小板减少可以与血小板生成受损关联，例如先天性低巨核细胞(无巨核细胞，amegakaryocytic)血小板减少(症)或血小板减少(症)伴桡骨缺如(thrombocytopenia with absent radii)。在另一种实施方式中，该血小板减少(症)与骨髓缺乏或抑制无关联。在又一种实施方式中，所述受试者患有与暴露于辐射或化疗关联的血小板减少(症)或有患有该血小板减少(症)的风险。

本发明肽可以单独或者与其它治疗药剂并行或相继地联合给予受试者，所述的其它治疗药剂包括但不限于抗癌药物、细胞因子、造血药、免疫调节药物以及凝结剂或抗凝剂。可选地，将该肽与至少一种刺激血小板生成的细胞因子联合给予所述受试者，例如，该肽可以与血小板生成素或血小板生成素激动剂联合给药。根据某些实施方式，该方法可以用于增强所述受试者中血小板生成素诱导的血小板水平提升。在另一种实施方式中，该方法可以用于缩短所述受试者血小板减少的持续时间。在另一种实施方式中，所述肽可以与在别的情况下由于血小板减少或血小板减少风险而不能给予所述受试者的另外药物或物质(相继或并行联合)联合给药。

本发明的肽可以单独或以包含该肽和至少一种药学可接受载体或赋形剂的药物组合物形式给予受试者。可选地，该肽可以以进一步包含至少一种刺激血小板生成的细胞因子的药物组合物形式给药。

根据一些实施方式，本发明的肽在施用后不久提高血小板水平，因而对减轻或阻止受试者出血，特别是对易于因血小板缺乏出血的受试者出血有利。在另一个方面，提供了抑制需要它的受试者出血的方法，该方法包含向该受试者给予有效量的具有如SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列的肽或其类似物，以便抑制所述受试者出血。在一种实施方式中，该方法用于缩短所述受试者的出血持续时间。在另一种实施方式中，该方法可以用于降低所述受试者的出血强度。在另一种实施方式中，所述受试者患有血小板减少(症)。在另一种实施方式中，所述受试者患有临床上的显著出血(症)。在另一种特定实施方式中，该受试者患有血小板减少(症)，并且所述肽的给药在外科手术的24小时内开始。

在另一个方面，提供了包含有效量的具有如SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列的肽或其类似物和至少一种刺激血小板生成的细胞因子，例如血小板生成素或血小板生成素激动剂作为有效成分的药物组合物。

根据下面的描述和附图，本发明其它目的、特征和优点将变得明显。

附图说明

图1A表明4F-苯甲酰基-TN14003单独地和与血小板生成素联用使血液中的血小板水平增加。图1B表明4F-苯甲酰基-TN14003单独地和与血小板生成素联用使集落形成细胞数目增加。

图2表明一次注射的4F-苯甲酰基-TN 14003(5mg/Kg)足以增加血液中的血小板水平。

图3表明一次注射的4F-苯甲酰基-TN 14003(5mg/Kg)足以增大雄性和雌性小鼠血液中的血小板水平。

图4表明在用5FU处理之前给小鼠注射4F-苯甲酰基-TN14003(5mg/Kg)5天，其中在5FU处理之后继续用4F-苯甲酰基-TN14003处理，这种处理增强了在用5FU处理之前和之后血液中的血小板水平。

图5表明在用5FU处理之前给小鼠注射4F-苯甲酰基-TN14003(5mg/Kg)5天，其中在5FU处理之后继续用4F-苯甲酰基-TN14003处理，这种处理增大了在用5FU处理之前和之后血液中的血小板水平，而在注射5FU后1天，用G-CSF单独或与4F-苯甲酰基-TN14003联用的处理对血小板水平没有影响。

图6表明在用5FU处理之前给小鼠注射4F-苯甲酰基-TN14003(5mg/Kg)5天，其中在5FU处理之后继续用4F-苯甲酰基-TN14003(5mg/Kg)处理，这种处理增强了在用5FU处理之前和之后血液中的血小板水平，而在5FU处理之前施用TPO(0.5μg/小鼠)3天的处理不如用4F-苯甲酰基-TN14003处理。

图7表明为人类患者注射4F-苯甲酰基-TN14003(0.9mg/Kg)可以刺激该患者血液中血小板数目立即增加(图7A-患者1、图7B-患者2)。

具体实施方式

本发明涉及新型组合物和方法，其中T-140类似肽用于刺激CXCR4-介导的血小板生成和用于提升血液中的血小板水平。

本发明涉及新型T-140类似肽的治疗应用。本发明首次公开了4F-苯甲酰基-TN14003(SEQ ID NO：1)，其属于T-140肽家族的已知CXCR4抑制剂，可以立即或在相继注射之后介导刺激健康C57bl小鼠以及血小板减少小鼠和人的血小板生成和血糖水平的独特模式。另外，本发明首次公开了T-140类似物可以单独地或与血小板生成素(TPO)联用刺激血小板生成，因而适合于与刺激血小板生成素受体c-MPL的TPO或其类似物，如罗米司亭(Romiplostim)(AMG-531)和艾曲波帕(eltrombopag)(SB-497115)联合使用。

因而，根据本发明的第一方面，提供了提高有需要的受试者血小板水平的方法，该方法包括向所述受试者给予包含具有如SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列的肽或其类似物的治疗药剂。

在另一个方面，本发明提供了治疗或预防有需要的受试者血小板减少的方法，该方法包括向所述受试者给予包含具有如SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列的肽或其类似物的治疗药剂。

在另一个方面，提供了增强有需要的受试者中血小板生成素诱导的血小板水平提升的方法，该方法包括向所述受试者给予包含具有如SEQ IDNO：1中列出的氨基酸序列的肽或其类似物的治疗药剂，其中用血小板生成素或血小板生成素激动剂并行处理所述受试者。

在另一个方面，提供了抑制有需要的受试者出血的方法，该方法包括向所述受试者给予包含具有如SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列的肽或其类似物的治疗药剂。

在另一个方面，本发明提供了包含有效量的具有如SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列的肽或其类似物和至少一种刺激血小板生成的细胞因子作为活性成分的药物组合物。

根据本发明的实施方式，该肽可以以有效量施用，以便提高所述受试者的血小板水平，诱导血小板减少(症)临床症状(例如出血)的改善，或者预防、延缓血小板减少(症)或缩短其持续时间或降低其量级，或者增强联合施用的药物或物质的活性，如本文详细描述的。

肽

在本说明书和附图中，表示氨基酸等的简化代码是利用IUPAC-IUB生物化学命名委员会规定的代码或相关领域习惯上使用的代码完成的。下面给出此类代码的实例。如果存在与氨基酸有关的光学异构体，则优选代表L形式，除非另有明确说明。

Gly或G：甘氨酸；Ala或A：丙氨酸；Val或V：缬氨酸；Leu或L：亮氨酸；Ile或I：异亮氨酸；Ser或S：丝氨酸；Thr或T：苏氨酸；Cys或C：半胱氨酸；Met或M：蛋氨酸；Glu或E：谷氨酸；Asp或D：天冬氨酸；Lys或K：赖氨酸；Arg或R：精氨酸；His或H：组氨酸；Phe或F：苯丙氨酸；Tyr或Y：酪氨酸；Trp或W：色氨酸；Pro或P：脯氨酸Asn或N：天门冬酰胺；Gln或Q：谷氨酰胺；pGlu：焦谷氨酸；Nal：3-(2-萘基)丙氨酸；Cit：瓜氨酸；DLys：D-赖氨酸；DCit：D-瓜氨酸；DGlu：D-谷氨酸；Me：甲基；Et：乙基；Bu：丁基；Ph：苯基。

本说明书中经常使用的取代基、保护基和试剂用下面的代码表示。

deamino TMG-APA：下式(IV)：

R-CH2：下式(V)：

在N-末端氨基酸中，[H-]表明该末端氨基是未衍生化，而在C-末端氨基酸中，[-OH]表明该末端羧基未衍生化。

本发明的4F-苯甲酰基-TN14003类似物属于结构上紧密相关的肽家族，也称为T-140类似物，T-140是具有氨基酸序列H-Arg-Arg-Nal-Cys-Tyr-Arg-Lys-DLys-Pro-Tyr-Arg-Cit-Cys-Arg-OH(SEQID NO：69，Tamamura等人，2003)的已知合成肽，其是基于鲎(horseshoecrab)的速普肽(tachyplesin)家族多肽设计的。本发明优选肽包括专利申请WO 2002/020561和WO 2004/020462中公开的类似物和衍生物。这些肽是人工起源的合成肽。

如本文使用的SEQ ID NO：1的术语“类似物”因而涉及与SEQ ID NO：1具有至少60％同一性的肽，优选如本文定义的式(I)或(II)肽。

在一个方面，本发明涉及包含由下式(I)表示的肽或其盐作为活性成分的药物组合物的用途。

其中：

上述式(I)中的A₁表示可以在N-末端衍生化的精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、丙氨酸、谷氨酸残基(L或D形式)，或者A₁是氢原子，或者优选A₁是精氨酸、瓜氨酸、丙氨酸或D-谷氨酸残基，或者A₁是氢原子(即，这个位置上的氨基酸可以不存在)。

“N-末端衍生化的肽”或“N-α-取代的衍生物”实例包括但不限于被以下基团保护的那些：甲酰基，酰基，例如乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、C2-6烷酰基，例如己酰基、苯甲酰基、芳基羰基，例如取代的苯甲酰基(例如，2-氟苯甲酰基、3-氟苯甲酰基、4-氟苯甲酰基、2-溴苯甲酰基、3-溴苯甲酰基、4-溴苯甲酰基、2-硝基苯甲酰基、3-硝基苯甲酰基、4-硝基苯甲酰基)、琥珀酰基、戊二酰基，烟酰基，异烟酰基，烷基磺酰基(例如，甲烷磺酰基、乙烷磺酰基、丙烷磺酰基、樟脑磺酰基)，芳基磺酰基(例如，对甲苯磺酰基、4-氟苯磺酰基、均三甲苯磺酰基、4-氨基苯磺酰基、丹磺酰、4-溴苯磺酰基)等。或者该N-末端氨基酸可以不存在。

可选地和优选地，该肽的N末端被取代的苯甲酰基衍生化。在一种特定实施方式中，该取代的苯甲酰基是4-氟苯甲酰基。在另一种特定实施方式中，该取代的苯甲酰基是2-氟苯甲酰基。

如果A₁是可在N-末端衍生化的精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、丙氨酸或谷氨酸残基(L或D形式)，则上述式(I)中的A₂表示精氨酸或谷氨酸残基(L或D形式)，或者如果A₁不存在，则A₂表示可在N-末端衍生化的精氨酸或谷氨酸残基(L或D形式)，或者优选地，如果A₁是可在N-末端衍生化的精氨酸、瓜氨酸、丙氨酸或谷氨酸残基，则A₂是精氨酸或谷氨酸残基，或者如果A₁不存在，则A₂是可在N-末端衍生化的精氨酸或谷氨酸残基。“N-末端衍生化的肽”包括，但不限于，如与A₁中提到的那些相同的肽。

上述式(I)中的A₃表示芳香族氨基酸残基(例如，苯丙氨酸、色氨酸、3-(2-萘基)丙氨酸、酪氨酸、4-氟苯丙氨酸、3-(1-萘基)丙氨酸(L或D形式)，或者优选地，A₃表示苯丙氨酸、色氨酸或3-(2-萘基)丙氨酸。

上述式(I)中的A₄表示精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、丙氨酸或谷氨酸残基(L或D形式)，或优选A₄是精氨酸、瓜氨酸、丙氨酸或者L型或D-谷氨酸残基。

上述式(I)中的A₅表示精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、丙氨酸或谷氨酸残基(L或D形式)，或者优选A₅是精氨酸、瓜氨酸、丙氨酸、赖氨酸或谷氨酸残基。

上述式(I)中的A₆表示脯氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、丙氨酸、瓜氨酸、精氨酸或谷氨酸残基(L或D形式)，或者优选A₆是D-赖氨酸、D-丙氨酸、D-瓜氨酸或D-谷氨酸残基。

上述式(I)中的A₇表示脯氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、丙氨酸、瓜氨酸或精氨酸残基(L或D形式)，或优选A₇是脯氨酸或丙氨酸残基。

上述式(I)中的A₈表示酪氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、萘丙氨酸、瓜氨酸或谷氨酸残基(L或D形式)，或者优选A₈是酪氨酸、丙氨酸或D-谷氨酸残基。

上述式(I)中的A₉表示精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、丙氨酸或谷氨酸残基(L或D形式)，或者优选A₉是精氨酸、瓜氨酸或谷氨酸残基。

上述式(I)中的A₁₀表示瓜氨酸、谷氨酸、精氨酸或赖氨酸残基(L或D形式)，或者优选A₁₀是瓜氨酸或D-谷氨酸残基。

上述式(I)中的A₁₁表示可在C末端衍生化的精氨酸、谷氨酸、赖氨酸或瓜氨酸残基(L或D形式)，或者优选A₁₁是可在C末端衍生化的精氨酸或谷氨酸残基。

“C-末端衍生化”或“C-末端羧基衍生化”包括，但不限于，酰胺化(-CONH₂、-CONHR、-CONRR′)和酯化(-COOR)。在本文中，酰胺和酯中的R和R′包括，例如，C_1-6烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基，或正丁基，C_3-8环烷基，例如环戊基、环己基，C_6-12芳基，例如苯基和α-萘基，苯基-C_1-2烷基，例如苄基、苯乙基或C_7-14芳烷基，例如C_1-2烷基，例如α-萘甲基，和另外地，一般用作口服生物可利用酯的特戊酰氧甲基(pivaloyloxymethyl)。

如果本发明的肽在除C-末端以外的侧链末端具有羧基(或羧化物)，则侧链末端具有酰胺化或酯化羧基的肽包括在本发明肽中。作为这种情况下的酰胺和酯，可以类似地使用，例如，A₁₁中列举的酰胺和酯。而且，本发明肽包括分子内氨基酸侧链上的取代基(例如，-OH、-SH、氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等)被合适的保护基(例如，C_1-6酰基、C_2-6烷酰基如甲酰基、乙酰基)保护的肽，或者复合肽，如与上述肽中的糖链结合的糖肽。

本发明肽盐包括生理可接受的酸或碱盐，特别地，生理可接受的酸加成盐是优选的。此种盐的实例有，无机酸(例如，盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸)盐，或有机酸(例如，乙酸、甲酸、丙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲烷磺酸、苯磺酸)盐。

在一种实施方式中，该组合物包含如上文定义的式(I)中列出的肽，其中A₁是谷氨酸残基或不存在(不出现)。

在另一种实施方式中，该组合物包含如上文定义的式(I)中列出的肽，其中A₄是谷氨酸残基。

在另一种实施方式中，该组合物包含如上文定义的式(I)中列出的肽，其中A₆是谷氨酸残基。

在另一种实施方式中，该组合物包含如上文定义的式(I)中列出的肽，其中A₈是谷氨酸残基。

在另一种实施方式中，该组合物包含如上文定义的式(I)中列出的肽，其中A₉是谷氨酸残基。

在另一种实施方式中，该组合物包含如上文定义的式(I)中列出的肽，其中A₅是精氨酸或谷氨酸残基。

在另一种实施方式中，该组合物包含如上文定义的式(I)中列出的肽，其中A₁₀是谷氨酸、精氨酸或赖氨酸残基。

在另一种实施方式中，该组合物包含如上文定义的式(I)中列出的肽，其中A₁₁是谷氨酸、赖氨酸或瓜氨酸残基。

在另一种实施方式中，该肽具有如本文表1中给出的SEQ ID NO：1-72中任何一个列出的氨基酸序列。

表1-T-140和当前优选的T-140类似物

在SEQ ID NO：1-72中的每个中，两个半胱氨酸残基优选以二硫键偶联。

目前优选的根据本发明的肽是具有如SEQ ID NO：1-72中任何一个中列出的氨基酸序列的肽。更优选地，先前已报道具有如表1中给出的SEQID NO：1-68和70-72中任何一个中列出的氨基酸序列的T-140衍生物相对于T-140(SEQ ID NO：69)可提高在血清中的稳定性和降低细胞毒性。然而，T-140可以适用于根据一些实施方式的本发明方法中。

在另一种优选实施方式中，用于本发明组合物和方法中的肽基本由如SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列组成。在另一种优选实施方式中，用于本发明组合物和方法中的肽具有如SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列。在另一个实施例中，该肽(类似物)与SEQ ID NO：1具有至少60％，优选至少70％，更优选至少80％的同源性。在另一种实施方式中，该肽与SEQ IDNO：1具有至少90％的同源性。在另一种实施方式中，该肽与SEQ ID NO：1具有至少95％的同源性。每种可能情况均可代表本发明的单独实施例。

人们普遍认为，两个序列之间的同源程度取决于它们的氨基酸序列的同一度以及相对于它们的长度的同一性。本发明肽同源物的长度因而通常为约8～22个氨基酸，更通常为14～20个氨基酸，或者在其它实施例中为13～15个氨基酸，在特定实施例中为约14个氨基酸。在各种其它实施例中，该肽选自SEQ ID NO：1-72，其中每种可能情况均可代表本发明的单独实施方式。

在另一种特定实施方式中，所述肽具有如SEQ ID NO：1-4、10、46、47、51-56、65、66、68、70和71的任何一个中列出的氨基酸序列。在另一个特定实施例中，所述肽具有如SEQ ID NO：4、10、46、47、68和70的任何一个中列出的氨基酸序列。在另一个特定实施例中，所述肽具有如SEQ ID NO：1、2、51、65和66的任何一个中列出的氨基酸序列。在另一种特定实施方式中，所述肽具有如SEQ ID NO：53-56的任何一个中列出的氨基酸序列。每种可能情况均可代表本发明的单独实施例。

在优选的特定实施方式中，所述肽具有如SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列。在另一种特定实施方式中，所述肽具有如SEQ ID NO：2中列出的氨基酸序列。在另一种特定实施方式中，所述肽具有如SEQ ID NO：51中列出的氨基酸序列。在另一种特定实施方式中，所述肽具有如SEQ IDNO：66中列出的氨基酸序列。每种可能情况均可代表本发明的单独实施方式。

在另一个方面，本发明涉及包含由下式(II)或其盐表示的肽的药物组合物的用途：

其中：

A₁表示精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸或丙氨酸残基或者这些氨基酸的N-α-取代衍生物，或氢原子(即可以不存在)；

A₂表示芳香族氨基酸残基；

A₃、A₄和A₆各自独立地表示精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸或丙氨酸残基；

A₅表示酪氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、萘丙氨酸或瓜氨酸残基；

A₇表示赖氨酸或精氨酸残基，其中羧基可以酰胺化或酯化；

X选自：

(i)由下式(III)表示的肽残基：

其中A₈和A₁₂各自独立地表示丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、半胱氨酸或蛋氨酸残基；

A₉表示芳香族氨基酸残基，A₁₀选自与A₃中的相同的氨基酸残基，A₁₁表示酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、半胱氨酸或蛋氨酸残基，条件是当1′-位置和6′-位置都为半胱氨酸残基时，它们可以以二硫键结合，

(ii)选自以下的肽：D-鸟氨酰基-脯氨酸、脯氨酰基-D-鸟氨酸、D-赖氨酰基-脯氨酸、脯氨酰基-D-赖氨酸、D-精氨酰基-脯氨酸、脯氨酰基-D-精氨酸、D-瓜氨酰基-脯氨酸、D-瓜氨酰基-丙氨酸、D-丙氨酰基-瓜氨酸、脯氨酰基-D-瓜氨酸、甘氨酰基-鸟氨酸、鸟氨酰基-甘氨酸、甘氨酰基-赖氨酸、赖氨酰基-甘氨酸、甘氨酰基-精氨酸、精氨酰基-甘氨酸、甘氨酰基-瓜氨酸、瓜氨酰基-甘氨酸、D-丙氨酰基-脯氨酸，和D-赖氨酰基-丙氨酸，

并且所述肽残基的组成氨基酸，D-精氨酸、L-精氨酸、D-赖氨酸、L-赖氨酸、D-鸟氨酸或L-鸟氨酸的侧链ω-氨基氢原子可以被ω-氨酰基取代，

并且(i)和(ii)的肽残基表示通过肽键结合7-位置和9-位置处氨基酸残基的肽残基；

并且4-位置和12-位置处的半胱氨酸残基可以以二硫键结合；

条件是，在上述肽或其盐中，A₁、A₃、A₄、A₅、A₆和A₇的氨基酸残基中的任何一个是丙氨酸或瓜氨酸残基；或者

(iii)含有D-瓜氨酸、D-丙氨酸、瓜氨酸，或丙氨酸残基或其盐的肽残基。

在本发明式(II)多肽中，A₁优选为精氨酸、丙氨酸或瓜氨酸残基；A₂优选为色氨酸或萘丙氨酸残基；A₃优选为精氨酸、丙氨酸或瓜氨酸残基；A₄优选为赖氨酸、丙氨酸或瓜氨酸残基；X优选为D-赖氨酰基-脯氨酸、D-丙氨酰基-脯氨酸、D-赖氨酰基-丙氨酸，或D-瓜氨酰基-脯氨酸残留；A₅优选为酪氨酸或丙氨酸残基；A₆优选为精氨酸、丙氨酸或瓜氨酸残基；A₇优选为精氨酸残基。

示例的式(II)肽是这样的肽，其中A₁、A₆和A₇是精氨酸残基，A₂是萘丙氨酸残基，A₃是瓜氨酸残基，A₄是赖氨酸残基，X是D-赖氨酰基-脯氨酸残基，且A₅是酪氨酸残基，这样的式(II)多肽，其中A₁、A₃、A₆和A₇是精氨酸残基，A₂是萘丙氨酸残基，A₄是赖氨酸残基，X是D-瓜氨酰基-脯氨酸残基，且A₅是酪氨酸残基，这样的式(II)多肽，其中A₁、A₆和A₇是精氨酸残基，A₂是萘丙氨酸残基，A₃是瓜氨酸残基，A₄是赖氨酸残基，X是D-瓜氨酰基-脯氨酸残基，A₅是酪氨酸残基，和这样的式(II)多肽，其中A₁是瓜氨酸残基，A₂是萘丙氨酸残基，A₃、A₆和A₇是精氨酸残基，A₄是赖氨酸残基，X是D-瓜氨酰基-脯氨酸残基，A₅是酪氨酸残基。

式(II)肽在另一种实施方式中的实例为这样的式(II)肽，其中A₁、A₆和A₇是精氨酸残基，A₂是萘丙氨酸残基，A₃是丙氨酸残基，A₄是赖氨酸残基，X是D-赖氨酰基-脯氨酸残基，且A₅是酪氨酸残基，这样的式(II)肽，其中A₁是瓜氨酸残基，A₂是萘丙氨酸残基，A₃、A₆和A₇是精氨酸残基，A₄是赖氨酸残基，X是D-赖氨酰基-脯氨酸残基，且A₅是酪氨酸残基，这样的式(II)多肽，其中A₁、A₃和A₇是精氨酸残基，A₂是萘丙氨酸残基，A₄是赖氨酸残基，X是D-赖氨酰基-脯氨酸残基，A₅是酪氨酸残基，且A₆是瓜氨酸残基，这样的式(II)多肽，其中A₁和A₃是瓜氨酸残基，A₂是萘丙氨酸残基，A₄是赖氨酸残基，X是D-赖氨酰基-脯氨酸残基，A₅是酪氨酸残基，A₆和A₇是精氨酸残基，这样的式(II)多肽，其中A₁、A₃和A₇是精氨酸残基，A₂是萘丙氨酸残基，A₄是赖氨酸残基，X是D-瓜氨酰基-脯氨酸残基，A₅是酪氨酸残基，且A₆是瓜氨酸残基。

本文式II中给出的A₇氨基酸优选为这样的氨基酸，其中羧基被酰胺化以便提高该多肽在体内的稳定性，如在血清等中的稳定性。

本发明肽包括含有基本与上述任何一种肽的氨基酸序列相同的氨基酸序列的肽或其酰胺、酯或盐。这里，“基本相同的氨基酸序列”是指与该肽的活性或该肽的生物活性(例如，增强血小板水平)等在质量上相同的氨基酸序列。因此，一定程度的数量差异是可以接受的(例如，约0.01～100倍，优选0.5～20倍，或更优选0.5～2倍)。因此，上述式(I)、(II)和SEQ ID NO：1-72的任何一个中指出的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸可以有变化，只要它们具有上述任一种特性即可。也就是说，在本发明中，对于由氨基酸序列的变化，如置换、缺失或插入(添加)等产生的任何肽(变体肽)，如果此种变化没有给原始(非变体)肽的生理特性或化学特性造成任何显著变化(即，质量上不同的变化，或质量上相同但数量上显著不同的变化)，则该肽被视为与不具有此种变化的原始(非变体)肽基本相同，而且，此种变体肽的氨基酸序列被视为与原始(非变体)肽的氨基酸序列基本相同。

众所周知，一般地，肽序列中的氨基酸变化如置换、缺失或插入(添加)通常不对此种肽的生理特性或化学特性造成显著变化。例如，一般认为，某种氨基酸用具有相似化学特性的另一种氨基酸置换所形成的肽的特性与原始肽的偏差很小。

氨基酸可利用它们的特性相似性根据其中一个标准分为以下类别，例如：(i)非极性(疏水)氨基酸(实例：丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸等)；(ii)极性(中性)氨基酸(实例：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺等)；(iii)带正电荷的碱性氨基酸(实例：精氨酸、赖氨酸、组氨酸等)；(iv)带负电荷的酸性氨基酸(实例：天门冬氨酸、谷氨酸等)，因此每个类别内的氨基酸置换相对于肽的特性可以是保守的(即，产生“基本相同的”氨基酸序列的置换)。换言之，“基本上相同的氨基酸序列”可以包括：

(i)这样的氨基酸序列，其中1个或更多，或者，在其它实施例中，1～3个氨基酸被上述式(I)、(II)和SEQ ID NO：1-72中指出的氨基酸序列的其它氨基酸置换；

(ii)这样的氨基酸序列，其中在上述式(I)、(II)和SEQ ID NO：1-72中指出的氨基酸序列中消除1个或更多，或者，在其它实施例中，1～3个氨基酸；

(iii)这样的氨基酸序列，其中1个或更多，或者，在其它实施例中，1～3个氨基酸添加(插入)到上述式(I)、(II)和SEQ ID NO：1-72中指出的氨基酸序列中；或者

(iv)包括对具有上面(i)、(ii)或(iii)中指出的氨基酸序列的肽当中的氨基酸进行修饰(特别地，其侧链)的肽，或其酯、酰胺或盐。

对于本发明的肽，如果和当上面(i)～(iv)的置换、缺失、插入(添加)、修饰等有意或偶然地提供在其氨基酸序列中时，它可以变成对抗热或蛋白酶的稳定的肽或者具有更强活性的高活性肽。本发明肽也包括这些变体肽或其酰胺、其酯或其盐。

此外，本发明肽包括，由上述式(I)、(II)和SEQ ID NO：1-72的任何一个中指出的氨基酸序列组成的肽，和包含这样的氨基酸序列的肽，所述的氨基酸序列与前述氨基酸序列共有约50～99.9％(优选70～99.9％，更优选90～99.9％)同源性，具有与上述式(I)、(II)和SEQ ID NO：1-72的任何一个中指出的氨基酸序列组成的肽性质基本相同的活性，或者其酰胺、其酯或其盐。

本发明肽类似物在其它实施例中包括与SEQ ID NO：1相同的肽，或本文针对它们的氨基酸序列公开的，但具有不同衍生化基团(例如，N’衍生化或C衍生化)的其它肽，只要它们在有关血小板水平方面的活性与本文公开的肽在质量上相同即可。

具有上述SEQ ID NO：1-72的任何一个中指出的氨基酸序列的肽的酰胺、酯或盐包括与针对上述式(I)中示出的肽列举的相同的那些。优选地，具有上述SEQ ID NO：1-72的任何一个中指出的氨基酸序列的肽在C-末端氨基酸残基羧基处酰胺化。

本发明肽包括含有上述SEQ ID NO：1-72的任何一个中指出的氨基酸序列的肽，可以通过合成肽的常规已知方法制造。对于肽的合成，可以利用固相肽合成法或液相合成法。就是说，通过使能构成肽的部分肽或氨基酸与剩余部分缩合，如果产物具有保护基，则消除该保护基，可以制得期望的肽。作为已知的缩合方法和保护基的消除方法，可以列出下列实例(1)～(5)：

(1)M.Bodanszky and M.A.Ondetti，Peptide Synthesis，IntersciencePublishers，New York(1966).

(2)Schroeder and Luebke，The Peptide，Academic Press，New York(1965).

(3)N.Izumiya，等人，Peptide Synthesis，Basics and Practice，Maruzen，Tokyo(1975).

(4)H.Yajima and S.Sakakibara，Seikagaku-Jikken-Koza I，ProteinChemistry IV，Tokyo Kagakudojin，Tokyo，pp 205(1977).

(5)H.Yajima，Zoku-Iyakuhin-no-Kaihatsu，Vol.14，Peptide Synthesis，Hirokawa Publishing Co.，Tokyo(1991)。

作为合成肽的实际方法，可以列举下列实例：

一般地，可以使用市售树脂来合成肽。此类树脂包括，例如，氯甲基树脂、羟甲基树脂、二苯甲基胺树脂(benzhydroxylamine resin)、氨甲基树脂、4-羟基苄醇树脂、4-甲基二苯甲基胺树脂、PAM树脂、4-羟甲基甲基苯基乙酰氨基甲基树脂、聚丙烯酰胺树脂、4-(2′，4′-二甲氧基苯基-羟甲基)苯氧基树脂、4-2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc氨乙基苯氧基树脂等。使用此种树脂，根据常规已知的缩合方法使具有适当保护的α-氨基和侧链官能团的氨基酸在该树脂上缩合成期望多肽的序列。在该反应的最有阶段，从该树脂上清除多肽，同时脱去各种保护基，然后通过在高度稀释的溶液中执行分子内二硫键形成反应，获得期望的多肽或其酰胺。对于上述被保护氨基酸缩合，可以使用对合成多肽有用的各种活化试剂，但特别是，最好使用羧基酰亚胺。此种羧基酰亚胺包括，DCC、N，N′-二异丙基碳化二亚胺、N-乙基-N′-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺等。对于这些活化试剂的活化，将被保护的氨基酸与外消旋抑制添加剂(例如，HOBt、HOOBt)一起直接添加到树脂中，或者在将被保护的氨基酸活化成对称酸酐或HOBt酯或HOOBt酯之后，将它添加到酯树脂中。

被保护氨基酸活化和与树脂缩合所用的溶剂可以从已知对多肽缩合反应有用的溶剂中选择。例如，使用酰胺，如N，N-二甲基甲酰胺，N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、卤代烃，如二氯甲烷和氯仿，醇如三氟乙醇，亚砜，如二甲亚砜，醚，如吡啶、二噁烷和四氢呋喃，腈如乙腈和丙腈，酯，如醋酸甲酯和醋酸乙酯，或适宜的上述物质混合物。被保护氨基酸活化及其与树脂缩合所用的溶剂可以从已知对多肽缩合反应有用的溶剂中选择。将反应温度适当地设定在已知对多肽键形成反应适用的范围内，通常在-20℃～50℃。通常使用过量1.5～4倍的活化氨基酸衍生物。根据采用茚三酮反应的测试结果，如果该缩合不充分，则在不除去保护基的情况下的重复缩合反应可以使缩合充分。如果通过重复反应实现充分缩合，则可以通过使用乙酸酐或乙酰咪唑使未反应氨基酸乙酰化。

用作成分的氨基保护基包括，例如，Z、Boc、叔戊基氧羰基、异冰片基氧羰基、4-甲氧基苄基氧羰基、Cl-Z、Br-Z、金刚烷基氧羰基、三氟乙酰基、邻苯二甲酰基、甲酰基、2-硝基苯硫基、二苯基硫膦基、Fmoc等。羧基可以通过以下方法进行保护，例如烷基酯化(例如，甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、2-金刚烷基等的直链、支化或环状烷基酯化)、芳烷基酯化(例如，苄基酯、4-硝基苄基酯、4-甲氧基苄基酯、4-氯苄基酯、二苯甲基酯化)、苯酰基酯化、苄基羰基肼化(hydrazidation)、叔丁氧羰基肼化、三苯甲基肼化等。丝氨酸的羟基可以，例如，通过酯化或醚化保护。适合于这种酯化的基团包括，例如，由羧酸衍生的基团如低级烷酰基如乙酰基、芳香烃酰基(aroyl group)如苯甲酰基、苄基氧羰基、乙氧基羰基。适合于酯化的基团包括，例如，苄基、四氢吡喃基、叔丁基等。作为酪氨酸的酚OH基保护基，可以使用，例如，Bzl、C12-Bzl、2-硝基苄基、Br-Z、叔丁基等。作为组氨酸的咪唑保护基，使用例如，Tos、4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基、DNP、苄氧基甲基、Bum、Boc、Trt、Fmoc等。

带有活化羧基的成分包括，例如，相应的酸酐、叠氮化物、活性酯[醇(例如，五氯苯酚、2，4，5-三氯苯酚、2，4-二硝基苯酚、氰基甲醇、对硝基苯酚、HONB、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基邻苯二甲酰亚胺、HOBt)的酯]。带有活化氨基的成分包括，例如，相应的磷酰胺。作为脱去(除去)保护基的方法，例如，使用在诸如钯黑或钯碳的催化剂的存在下在氢气流下进行的催化还原、通过无水氟化氢、甲烷磺酸、三氟甲烷磺酸、三氟乙酸或其混合物等进行的酸处理、通过二异丙基乙胺、三乙胺、哌啶、哌嗪等进行的碱处理，和通过钠在液氨中进行的还原。通过上述酸处理进行的消除反应一般在约-20℃～40℃的温度下完成，但在酸处理中，添加阳离子捕捉剂如苯甲醚、苯酚、苯硫基甲烷、间甲酚、对甲酚、二甲硫醚、1，4-丁烷二巯醇、1，2-乙烷二巯醇有用。用作组氨酸咪唑保护基的2，4-二硝基苯基通过用苯硫酚处理除去。用作色氨酸吲哚保护基的甲酰基通过在1，2-乙烷二硫醇、1，4-丁烷二硫醇等存在下的上述酸处理除去，也可以通过用氢氧化钠稀释液、氨稀释液等的碱处理脱去。

不参与成分的反应的官能团保护和保护基，以及此种保护基的除去，和参与该反应的官能团活化可以从常规已知的基团或常规已知的方法中加以选择。作为获取多肽酰胺的替换方法，存在例如这样的方法：在酰胺化和保护羧基末端氨基酸的α-羧基以及然后在氨基侧扩展肽链至期望链长之后，制备除去此种肽链N-末端的α-氨基保护基的多肽，和除去C-末端羧基保护基的多肽，然后使该两种多肽在上述混合溶剂中缩合。缩合反应的细节如上所述。在纯化通过缩合获得的被保护多肽之后，可以通过用上述方法除去所有保护基获得期望的粗多肽。使用各种已知纯化方法纯化这种粗多肽之后，如果冻干主要馏分，则可以获得酰胺型的期望多肽。为了获得酯型的多肽，例如，通过使羧基末端氨基酸的α-羧基与期望醇缩合制备氨基酸酯，然后可以以与酰胺型多肽相同的方式获取酯型的期望多肽。

反应之后，可以通过将常用的纯化方法如溶剂萃取、蒸馏、柱色谱、液相色谱、重结晶等相结合，纯化和分离本发明肽。如果通过上述方法获得的肽是无盐型，则可以通过已知方法将它转化成合适的盐，或者如果此种肽是盐，则可以通过已知方法将它转化成无盐型。

药物组合物和试剂盒

如本文使用的“药物组合物”是指本文所述的活性成分中的一种或多种与其它化学组分如生理适合的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的在于使化合物容易给予有机体。

下文，短语“生理合适的载体”和“生理可接受载体”可以互换使用，是指不对有机体造成显著刺激，不破坏所施用化合物的生物活性和特性的载体或稀释剂。

在本文，术语“赋形剂”是指为了进一步使活性成分容易施用而添加到药物组合物中的惰性物质。赋形剂的实例包括但不局限于，碳酸钙、磷酸钙、各种糖和淀粉类、纤维素衍生物、明胶、植物油，和聚乙二醇。

调配和施用药物的技术可以在最新版“Remington′s PharmaceuticalSciences”Mack Publishing Co.，Easton，PA中找到，其通过引用完整地合并在此(Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Gennaro，A.，Lippincott，Williams & Wilkins，Philadelphia，Pa.，20^th ed，2000)。

本发明药物组合物可以通过本领域熟知的工艺制造，如通过常规的混合、溶解、造粒、包糖衣、研粉、乳化、作成胶囊、包埋(entrapping)或冷冻干燥工艺。

根据本发明实施例使用的药物组合物因而可用常规方法利用一种或多种使活性成分容易加工成可以药用的制剂，包含赋形剂和辅助物的生理可接受载体调配。合适的剂型取决于所选的施用途径。

本发明药物组合物适合于全身或局部施用，例如，通过将药物组合物直接注射到患者组织区域(例如，病灶内注射)中。

对于注射，该药物组合物的活性成分可以调配在水溶液中，优选在生理相容性缓冲液如Hank’s溶液、Ringer’s溶液，或生理盐缓冲液中。

用于潜在施用的药物组合物包括水溶性形式的活性制剂水溶液。另外，可将该活性成分的悬浮液配制成适当的油性或基于水的注射悬浮液。合适的亲脂溶剂或媒介物包括脂肪油如芝麻油，或合成的脂肪酸酯如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。水性注射悬浮液可包含增大悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇，或葡聚糖。可选地，该悬浮液还可包含合适的稳定剂或增大活性成分的溶解度从而允许制备高度浓缩的溶液的试剂。

替换地，该活性成分可以是粉末形式，在使用前用合适的媒介物如无菌的基于无热源水的溶液进行配制。

对于口服施用，该药物组合物可以容易地通过将活性化合物与本领域熟知的药学可接受载体相结合而调配。此类载体使该药物组合物能够调配成供患者口服摄取的片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、浆液、混悬剂等。口服使用的药物制剂可利用固体赋形剂制造，任选地研磨所得混合物，需要时可加入合适的辅助物并在此后对颗粒混合物进行加工，从而获得片剂或糖衣核。合适的赋形剂为，特别是，填充剂如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇，纤维素制品如，玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍树胶、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素和羧甲基纤维素钠，和/或生理上可接受的聚合物如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可加入崩解剂，如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂，或海藻酸或其盐如海藻酸钠。

糖衣核具有合适的包衣。为此目的，可使用浓缩的糖溶液，其可以任选地包含阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或色素加入到片剂或糖衣丸包衣中，以便鉴定或表征不同的活性化合物剂量组合。

可口服使用的药物组合物，包括明胶制成的推入配合胶囊，以及由明胶和增塑剂如甘油或山梨醇制成的密封软胶囊。推入配合胶囊可包含与填充剂如乳糖、粘合剂如淀粉、润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁，和任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性成分溶解于或悬浮于合适的液体中，如脂肪油、液体石蜡，或液体聚乙二醇。另外，可加入稳定剂。所有用于口服施用的制剂剂量应适合所选的施用途径。

对于颊部施用，该组合物可采用用常规方法调配的片剂或锭剂的形式。

适用于本发明上下文的药物组合物包括含有对实现期望目的有效的量的活性成分的组合物。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是阅读本文提供的详细公开内容之后。示例的人用剂量在一些实施例中可以为0.03-10mg/kg、0.1-10mg/kg、0.1-2mg/kg、0.1-1mg/kg，0.3-10mg/kg、0.3-2mg/kg、0.3-1mg/kg或0.3-0.9mg/kg。例如，发现皮下施用的0.3mg/kg或更多剂量对提升接受化疗的人患者血小板水平有效。

可选地，本发明的肽可以与一种或多种另外的活性剂结合调配或施用(并行或相继)。在某些实施方式中，该组合物除了包含本发明肽之外，还可以进一步包含一种或多种其它可诱导或增加血小板生成的药剂，例如TPO和TPO激动剂。如本文使用的TPO激动剂(或TPO受体激动剂)是指具有TPO的和基本类似于TPO的药物活性特征的分子。例如，此种分子可以是TPO类似物或模拟物，或以拮抗方式结合到c-mpl(TpoR)受体，血小板生成素生理靶上的其它分子(如蛋白质、肽、抗体和小分子)。常见的TPO激动剂具有，例如增加巨核细胞增殖和分化的血小板生成活性。在各种具体实施例中，本发明肽可以以协同或相叠加(additive)方式增加血小板生成的各个方面或血小板水平。

可诱导或增加血小板生成，包括市售TPO激动剂在内的药剂的具体实例为，由Amgen研制作为血小板生成素受体结合肽体的罗米司亭(Romiplostim)(AMG-531，以商品名Nplate销售)、由GlaxoSmithKline以商品名Promacta作为TPO受体激动剂销售的艾曲波帕(Eltrombopag)(rINN，SB-497115)、由AkaRx研制作为小分子血小板生成素受体激动剂的AKR-501、由Ligand Pharmaceuticals研制作为口服血小板生成素模拟物的LGD-4665、Adherex Technologies公司建议作为预防某些化疗方案引起的骨髓抑制的化学保护药的N-乙酰基半胱氨酸、由Johnson & Johnson研制作为聚乙二醇化肽血小板生成素受体激动剂的peg-TPOmp，以及由GlaxoSmithKline and Ligand Pharmaceuticals研制作为口服非肽小分子血小板生成素受体激动剂的SB-559448。其它可以促进血小板生成的细胞因子包括，例如IL-1、IL-3、IL-6和GM-CSF。

这样的联合施用药物，例如TPO激动剂的合适的剂量和施用方案是可以获得的，技术人员可以根据需要对它进行修改。例如，Nplate(罗米司亭)是血小板生成素受体激动剂，适合于治疗已对皮质类固醇、免疫球蛋白或脾切除术的反应不充分的慢性免疫(特发性)血小板减少性紫癜(ITP)患者的血小板减少。Nplate的当前指示剂量为10mcg/kg的每周最大剂量。

可选地，另外的活性药剂也可以包括其它细胞因子或细胞因子受体调制剂。例如，本文证明了，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)不干扰肽抑制血小板减少的能力，因而在一些实施例中本发明肽可以与G-CSF或其类似物或激动剂(具有如技术人员可以理解的G-CSF生物活性，例如，非格司亭、来格司亭(lenograstim)和那托司亭(nartograstim)联合施用。本发明肽能够单独地或者当与G-CSF一起施用时能够迅速或缓慢地(几分钟或几天内)提升体内血小板计数。

在其它实施方式中，该肽可以与抗癌治疗剂联合使用，例如，与一种或多种化疗药物联合。例如，因此证明了本发明肽可以与5-氟脲嘧啶(5-FU)一起安全地施用从而抑制化疗诱导的血小板减少。5-FU是用作癌症治疗使用的嘧啶类似物的示例抗代谢物化疗药物。在一些实施例中，本发明肽与化疗药物的联合施用可以降低血小板减少的风险，因而使化疗能够持续延长的持续时间和/或以增大的剂量进行，否则所述增大的剂量将由于不良反应而被禁用。在其它实施例中，该化疗药物和本发明肽可以具有抑制癌症形成，和并行地降低出血风险的协同效应。在另一种实施方式中，本发明的组合物和方法增强了患有癌症的受试者的化疗安全性。在另一种实施方式中，本发明组合物和方法增强了患有癌症的受试者的化疗有效性。在各种实施方式中，联合治疗迅速和缓慢地提高了经受化疗的癌症患者的血小板水平。在一些情况下，对于血小板减少患者，此种抗癌药物和其它药物或治疗方案的使用可能被排除或受限制。例如，对于因丙肝引起肝硬化的血小板减少患者，低血小板计数可能会妨碍干扰素治疗。在一些实施例中，本发明肽可以与另外的药物或物质(例如，化疗药物)联合施用(或共调配从而形成药物组合物)从而利于患者使用该药物或物质，否则所述患者将由于血小板减少或血小板减少风险而不能接受该药物。

化疗药物包括但不限于，烷化剂(如环磷酰胺、异环磷酰胺、马法兰、苯丁酸氮芥、BCNU、CCNU、氨烯咪胺、甲基苄肼、马利兰和噻替派)，抗代谢物(如甲氨蝶呤、5-氟脲嘧啶、阿糖胞苷、吉西他滨、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、氟达拉滨和克拉屈滨)，蒽环类药物(如柔红霉素、多柔比星、去甲氧基柔红霉素、表柔霉素和米托蒽醌)，喜树碱(如伊立替康和托泊替康)，紫杉烷类(如紫杉醇和多西他赛)和铂类(如顺铂、卡铂和奥沙利铂)。

在某些其它实施例中，本发明肽可以与其它血小板调制剂和凝结调制剂联合施用或共调配。

在又一些其它示例实施方式中，该肽可以与用于治疗血小板减少的本领域已知的其它药剂联合施用或共调配。例如，在某些情况下适合于治疗血小板减少的免疫调制药物，例如，皮质类固醇或免疫抑制剂可以根据标准方案使用。

在又一种实施方式中，该组合物由作为唯一活性成分的本发明肽组成。

在另一种实施方式中，根据本发明的制品以试剂盒形式提供，该试剂盒包含一种或多种活性成分(本发明肽和/或如本文指定的另外的活性成分)和在本发明方法中联合施用活性成分的说明书。例如，在另一种实施方式中，提供了试剂盒，该试剂盒包含i)至少一种刺激血小板生成的细胞因子，优选TPO或TPO激动剂，和ii)具有如SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列的肽或其类似物。在另一种实施方式中，提供了包含供一个单一哺乳动物用的一疗程治疗剂的药物包装，其包含具有单位剂量形式的本发明T-140类似物的单元的容器，和具有TPO单元的容器。

治疗用途

在各种实施方式中，本发明的肽对治疗血小板障碍有用。一般而言，血小板障碍包括与血小板异常增多(血小板增多症、骨髓增生性障碍)，血小板减少(血小板减少症)，或血小板功能障碍关联的障碍。这些病况中的任何一种都可以导致止血栓子的形成和出血。根据本发明实施例，本发明方法和组合物对提升以血小板水平减小或处于亚最佳状态为特征的病况的血小板计数以及治疗和预防血小板减少(症)特别有用。

血小板减少(症)的原因可以根据机制分类，包括血小板生成失败、血小板存活正常的脾隔离增加、血小板破坏或消耗增多(免疫学原因和非免疫学原因)、血小板稀释，以及这些原因的组合。特定病况的诊断通过利用外周血液涂片，必要时和骨髓抽吸执行；脾隔离增大由脾肿大暗示。

血小板减少(症)可能是由于骨髓中巨核细胞减少或没有巨核细胞引起的，例如再生障碍性贫血或白血病患者、接受骨髓移植药物(例如，化疗)的患者，和一些阵发性睡眠性血红蛋白尿患者。血小板减少(症)也可能是由血小板生成减少引起的，尽管骨髓中存在巨核细胞，例如，酒精诱导的血小板减少(症)、HIV关联的血小板减少(症)、骨髓发育不良综合征和维生素B12或叶酸盐(叶酸)缺乏。

例如，先天性低(无)巨核细胞血小板减少(CAMT)是罕见的遗传学障碍，其表现为血小板减少和巨核细胞减少(Megakaryocytopenia)(血小板和巨核细胞数目低)。骨髓中没有巨核细胞的这种情况不与身体异常关联。这种疾病的原因似乎是TPO受体，c-mpl引起的基因突变，尽管血清中TPO水平很高。CAMT的主要治疗方法是骨髓移植。为了确保血小板计数不会下降到危险水平，需要频繁输注血小板。

TAR综合征(血小板减少(症)伴桡骨缺如)是罕见的遗传学障碍，其特征是前臂中没有桡骨以及血小板计数急剧减少。血小板减少(症)的症状导致瘀伤和潜在威胁生命的出血。血小板异常反映了血小板生成不足，这可能是由于异常或受抑制的巨核细胞生成引起，可能与缺乏对血小板生成素的反应关联。

TAR患者的主要治疗方法是血小板输注，其中造血干细胞移植(HSCT)是血小板输注后仍然出现血小板减少伴出血的患者的治疗方案。另外，脾切除术可能对成人患者有效。虽然血小板减少患者已对用红细胞生成素和白介素-6进行的细胞因子处理作出反应，但所确立的治疗方案还未被临床批准。

脾隔离引起的血小板减少(症)可以发生在导致脾肿大的各种障碍中，例如，肝硬化伴充血性脾肿大、高歇氏病(Gaucher′s disease)和骨髓纤维化伴骨髓化生。隔离对于晚期肝硬化引起的充血性脾肿大的患者是期望的。血小板计数通常＞30,000/uL，除非导致脾肿大的障碍也损害血小板生成(例如，骨髓纤维化伴骨髓化生)。血小板是由脾通过肾上腺素释放的，因而可以在应激时获得。所以，仅由脾隔离引起的血小板减少通常不会导致出血。脾切除可以纠正血小板减少，但不适用，除非存在由同时发生的骨髓衰竭引起严重的血小板减少。

免疫性血小板破坏发生在如结缔组织障碍、药物诱导的血小板减少、HIV关联的血小板减少、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、淋巴增生性障碍、新生儿同种免疫血小板减少、输血后紫癜和怀孕(妊娠血小板减少(症))中。非免疫性血小板破坏的特征是，例如弥漫性血管内凝血、败血症、某些全身性感染(如肝炎、埃-巴二氏病毒、巨细胞病毒)、急性呼吸窘迫综合征和血栓性血小板减少性紫癜-溶血性尿毒症综合征中的血小板减少。表现为瘀点、紫癜和粘膜出血。

特发性(免疫性)血小板减少性紫癜是血小板减少引起的出血性障碍，与全身疾病无关联。通常，它在成人中是慢性的，但在儿童中通常是急性自限性的。特发性血小板减少性紫癜(ITP)通常由针对结构性血小板抗原的自身抗体的形成引起。在儿童ITP中，该自身抗体可被病毒抗原与巨核细胞的结合触发。症状和体征为瘀点，紫癜和粘膜出血。总胃肠道出血和血尿不常见。脾是正常大小，除非被共存的儿童病毒性感染扩大。

ITP的治疗包括皮质类固醇、脾切除，和免疫抑制剂。对于危及生命的出血，需要血小板输注、IV皮质类固醇，和IV免疫球蛋白。对于血小板计数＜10,000至20,000/μL并出现活动性出血的患者，可以使用血小板生成素模拟药物，如罗米司亭和艾曲波帕。但这些药物被用于维持治疗，而不是诱导缓解，需要不断施用以便维持血小板计数＞50,000/μL。在ITP和危及生命的出血的儿童或成人中，通过给予IV免疫球蛋白1g/kg，一次/天，持续1～天，试图进行迅速的吞噬阻断。这种处理通常会导致血小板计数在2～4天内升高，但升高的血小板计数仅保持2～4周。也给予ITP和危及生命的出血患者血小板输注。血小板输注不能预防性地使用。

输血后紫癜导致免疫性血小板破坏，表现类似于ITP，在之前的7～10天有输血病史。患者，通常是妇女，大多数缺乏血小板抗原(PLA-1)。输注PLA-1-阳性血小板可以刺激抗-PLA-1抗体的形成，它可以与患者的PLA-1-阴性血小板反应。导致严重的血小板减少，需要2至6周消退。

结缔组织(如系统性红斑狼疮，SLE)或淋巴增生性障碍可以导致免疫性血小板减少。皮质类固醇和脾切除治疗可能有效。

药物诱导的血小板减少通常通过引起免疫反应发生，其中结合到血小板上的药物产生“新”和“外来”抗原。在有药物摄入史的患者中，表现类似于ITP。当药物停止时，血小板计数通常开始在1～2天内增加，7天之内恢复到正常。偶尔诱导血小板减少的常用药物症包括奎宁、甲氧苄啶(Trimethoprim)/磺胺甲噁唑、糖蛋白IIb/IIIa抑制剂(阿昔单抗，替罗非班)、氢氯噻嗪、卡马西平、醋氨酚、氯磺丙脲、甲胺呋硫、利福平和万古霉素。

自身免疫性血小板减少性紫癜(AITP)是免疫介导的障碍，其中血小板由自身抗体调理并被网状内皮系统中的吞噬细胞过早地破坏。AITP中看到的血小板减少主要是由脾和肝脏清除的血小板增多引起的。虽然AITP中的体液异常已明确界定，但T细胞对AITP发病起着重要作用已日益显现。该疾病的急性和慢性形式的区别在于急性AITP发生之前常发生感染性疾病，一般在初始出现的几周内自发地消退。定义为血小板减少持续多于六个月的该障碍慢性形式，一般发生在成人中，并归入主要由IgG自身抗体介导的器官特异性自身免疫性疾病类。

接受普通肝素的多达5％患者会患有血小板减少，这甚至在肝素剂量非常低的情况(例如用于冲洗中从而保持IV或动脉管路通畅)下也可能发生。该机制通常是免疫性的。可能会发生出血，但更常见的是，血小板聚集过多，造成血管阻塞，导致反常性动脉和静脉血栓形成，这可能危及生命(如肢体动脉栓塞、中风、急性MI)。

HIV感染可能会导致表现类似于ITP的血小板减少。血小板计数可能随着糖皮质激素增加，这往往被抑制，除非血小板计数下降到＜20,000/μL，因为这些药物可能会进一步抑制免疫功能。在用抗病毒药物治疗后血小板计数通常也会增加。其它感染，如全身病毒感染(如埃-巴二氏病毒、巨细胞病毒)、立克次氏体感染(例如，落基山斑疹热)，和细菌性败血症通常与血小板减少关联。

轻度血小板减少，通常无症状，发生在约5％的正常怀孕妇女的妊娠后期(妊娠血小板减少)；它通常是轻度的(血小板计数＜70,000/μL是罕见的)，不需要治疗，分娩后消退。然而，先兆子痫和HELLP综合征(溶血、肝功能试验升高，和低血小板)的怀孕妇女可能会患有严重的血小板减少，此类妇女通常需要立即分娩，如果血小板计数＜20,000/μL(或者如果要进行剖腹产，则＜50,000/μL)，那么考虑血小板输注。

败血症往往导致非免疫性血小板减少，其与该感染的严重程度相似。该血小板减少有多种原因：弥漫性血管内凝血、可能与血小板关联的免疫复合物的形成、补体的活化，以及受损内皮表面上的血小板沉积。

急性呼吸窘迫综合征患者可能会患有非免疫性血小板减少，可能继发于肺毛细血管床血小板沉积。血小板减少也是慢性肝病常见的并发症，被认为是疾病晚期的指标。低血小板计数部分由于门脉高压和脾功能亢进、血小板生成素产生的减少，以及病毒诱导的骨髓抑制的影响造成。

血小板减少是丙型肝炎病毒(HCV)感染患者中常见的慢性肝病并发症，被认为是疾病晚期的指标。与HCV相关性肝硬化关联的血小板减少(症)的低血小板计数被认为部分由于门脉高压和脾功能亢进、血小板生成素产生的减少，以及病毒诱导的骨髓抑制的影响造成。

另外，血小板减少可能是由于稀释，例如，大量的血液置换或换血(由于储血中血小板活力的丧失)引起的稀释。

如本文使用的“血小板减少(症)”是受感染个体血小板水平下降到该个体血小板数目正常范围以下的障碍，例如，由于产生、分布和/或破坏受到扰乱引起。通常，正常血小板计数在150,000～450,000/μL。75,000～150,000/μL的血小板计数被定义为1级血小板减少，50,000～75,000/μL的血小板计数被定义为2级血小板减少，25,000～50,000/μL的血小板计数被定义为3级血小板减少，而25,000/μL以下的血小板计数被定义为4级血小板减少。

出血的风险与血小板计数成反比。血小板计数低于50,000/μL时，容易出现轻微出血，且大出血的风险增大，而血小板计数为20,000～50,000/μL时，易于因创伤而出血，甚至轻微的创伤。血小板计数小于20,000/μL时，可能会发生自发性出血，而血小板计数低于5000/μL时，严重自发性出血的可能性更大，严重血小板减少(症)通常称为危及生命的血小板减少。

在其他实施例中，血小板减少也称为个体血小板数目与在某一参考点在该个体中测得的血小板数目相比的减少。个体血小板数目的减少可以是与该参考点的值相比减少大于20％、30％、40％、60％、80％、90％、95％或甚至更多。与某一参考点测得的血小板数目相比的血小板数目减少在某些个体中可能伴有出血的变化，而在其它个体中相当的减少不伴有出血变化。所述参考点可以是，例如治疗如放射或化疗的开始阶段。

在某些实施例中，本发明肽用于治疗血小板减少。在其它实施例中，本发明肽用于预防血小板减少。在其它实施例中，本发明肽用于延缓血小板减少的发病。在其它实施例中，本发明肽用于缩短血小板减少的持续时间。在其它实施例中，本发明肽用于治疗、预防血小板减少，缩短其持续时间，或延缓其症状。在其它实施例中，本发明肽用于减轻血小板减少(例如，缩短其持续时间或降低其强度，或延缓该疾病的发病或其症状)。

在一些实施例中，血小板减少(症)与血小板破坏增加关联。在一些特定实施方式中，该破坏是免疫性的。在一些特定实施方式中，该破坏是非免疫性的。在其它特定实施方式中，该破坏是药物诱导的。在其它实施方式中，血小板减少(症)与血小板隔绝增加关联。在其它实施方式中，血小板减少与血小板稀释关联。在其它实施方式中，血小板减少(症)与血小板生成受损关联。

在其它实施例中，血小板减少(症)与血小板破坏增加、血小板隔绝增加、血小板稀释，和血小板生成受损中的至少一种关联。在其它实施例中，血小板减少仅与上述状况之一关联(例如，血小板破坏增加、血小板隔绝增加、血小板稀释，或血小板生成受损)。不期望受任何理论或作用机制束缚，在一些实施例中，本发明方法可以促进血小板释放或减轻或抵消血小板破坏。

在某些实施例中，该受试者在别的情况下不能用造血药剂或用于治疗骨髓受损的药剂治疗(或在其它实施例中，不能遵从于该治疗)。在其它实施例中，血小板减少与中性粒细胞减少无关联。在其它实施例中，血小板减少与贫血无关联。在其它实施例中，血小板减少与巨核细胞减少无关联。在其它实施例中，血小板减少与骨髓缺陷或抑制无关联。在另外的实施例中，该受试者没有患有其它血小板障碍，例如与血小板功能受损或异常关联或者与凝块或凝结缺陷或异常(例如，凝血因子障碍)关联的障碍。

在其它实施例中，血小板减少是严重的血小板减少。在特定实施例中，血小板减少是4级血小板减少。在其它实施例中，血小板减少是急性血小板减少。在其它实施例中，血小板减少是慢性血小板减少。在其它实施例中，血小板减少的特征是血小板计数少于50,000/μL。在其它实施例中，血小板减少的特征是血小板计数在20,000和50,000/μL之间。在其它实施例中，血小板减少的特征是血小板计数少于20,000/μL。在其它实施例中，血小板减少的特征是血小板计数少于10,000/μL。在其它实施例中，血小板减少的特征是血小板计数少于5000/μL。在其它实施例中，血小板减少的特征是急性出血。在特定实施例中，血小板计数少于10,000～20,000/μL并存在急性出血。在其它实施例中，血小板减少的特征是危及生命的出血。在其它实施例中，血小板减少的特征是因组织损伤出血。在其它实施例中，血小板减少是有症状的。例如，该症状可以包括以下的一种或多种：溢血、瘀点、紫癜、粘膜出血、总胃肠道出血、血尿、脾肿大或在其它实施例中的血栓形成。在其它实施例中，血小板减少是无症状的。

在另一个实施例中，提供了提升受试者血小板水平的方法，该方法包含向该受试者施用有效量的本发明肽。在某些实施例中，该肽可用于提升其中此类细胞，例如由于骨髓移植或化疗，或癌症患者的辐射而衰竭的状况下的血小板。因而，降低了这些患者因血小板减少而死亡和患并发症的风险。在其它实施例中，该肽可用于提升未患有辐射或化疗诱导的血小板减少的患者的血小板水平。例如，但不限于，本发明方法在一些实施例中用于治疗特发性血小板减少性紫癜患者。在其它实施例中，该肽可用于提升特发性血小板减少性紫癜患者的血小板水平。在其它实施例中，该肽可用于提升先天性低巨核细胞血小板减少患者的血小板水平。在其它实施例中，该肽可用于治疗先天性低巨核细胞血小板减少。在其它实施例中，该肽可用于提升血小板减少伴桡骨缺如患者的血小板水平。在其它实施例中，该肽可用于治疗血小板减少伴桡骨缺如。在其它实施例中，该肽可用于提升自身免疫性血小板减少的血小板水平。在其它实施例中，该肽可用于治疗自身免疫性血小板减少。在其它实施例中，该肽可用于提升与HCV相关性肝硬化关联的血小板减少患者的血小板水平。在其它实施例中，该肽可用于治疗与HCV相关性肝硬化关联的血小板减少。在其它实施例中，该肽可用于治疗原发性血小板增多。

在其它实施例中，该方法可以用于提升如在所述受试者外周血中测得的血小板水平。

在各种实施例中，该治疗可以诱导血小板减少的缓解。在一些实施例中，该血小板水平可以恢复到正常水平或那些特征不太严重的血小板减少级别(例如，从4级至3、2或1级，或者从3级至2或1级等)。在特定实施例中，该治疗与将受试者血小板水平诱导或维持在大于50,000/μL关联。在其它实施例中，该治疗与将受试者血小板水平诱导或维持在20,000和50,000/μL之间关联。在其它实施例中，该治疗与将受试者血小板水平诱导或维持在大于20,000/μL关联。在其它实施例中，该治疗导致受试者血小板水平与参考点(例如，治疗开始或未经本发明肽治疗的对照受试者的水平)的值相比增大20％、30％、40％、60％、80％、90％、95％或甚至更大。

在其它实施例中，该治疗可迅速和/或缓慢地诱导所述受试者外周血中的血小板显著提升。如本文使用的显著提升在一些实施例中是指统计学上显著的提升、临床上显著的提升(即，导致受试者病况的改善、症状表现等的改善)，和/或如技术人员识别的显著改善。例如，在预定持续时间之后，血小板水平(例如，血液水平)可以增大约10％、20％、30％、40％、60％、80％、90％、95％或更大。迅速提升是指在施用小于24小时之后以及在施用的几小时或几分钟内发生的显著增大，例如在10、20、30、40、50或60分钟内或1～24小时内，例如1、2、3、4或8小时内发生的增大。缓慢提升是指在施用的几天或周内(例如，在3、4、5、6、7、8、9或10天内)发生的或可以观察到的增大。

在另一个实施例中，本发明可以用于治疗患有血小板减少的受试者，其中所述肽的施用在外科手术的24小时内(例如，在手术前的1、2、3、4或8小时，或者10、20、30、40或50分钟，或者在其它实施例中在手术期间或在手术后的1、2、3、4或8小时，或10、20、30、40或50分钟内)开始。

在另一个实施例中，该方法可以减轻血小板减少(症)的临床症状(例如，缩短其持续时间或降低其强度或延缓其发病)。在一个实施例中，该症状是出血。

世界卫生组织提出标准化分级尺度来衡量出血的严重程度。0级-无出血，等级1-点状出血，2级-轻度失血(临床上显著)，3级-大失血，需要输血(严重)，4级-失血衰弱，与死亡有关的视网膜或脑失血。在各种实施例中，方法可用于降低、抑制、治疗或预防2、3或4级出血(临床显著出血、严重出血或出血衰弱)，其中每种可能情况均代表本发明的单独实施例。在另一个实施例中，该肽用于提升出血发作期间血小板水平。在另一个实施例中，该方法用于抑制某个部位发生的过度出血。

已出于意料地发现本发明肽可以增强血小板生成素的体内活性，从而提高血小板生成活性，且副作用降低。因而，在另一个实施例中，提供了增强需要它的受试者中血小板生成素诱导的血小板水平提升的方法，该方法包含将血小板生成素与具有如SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列的肽或其类似物或衍生物联合(并行或相继)给予所述受试者。在另一个实施例中，提供了缩短需要它的受试者的血小板减少持续时间的方法，该方法包含将有效量的TPO与具有如SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列的肽或其类似物或衍生物并行或相继联合给予该受试者。在另一个实施例中，本发明肽可以与TPO联合用于治疗如本文详述的血小板减少。

该施用途径和剂量可以根据患者状况进行调节，技术人员(例如，治疗医师)根据本公开和实例将会明了各种方案。在一些实施例中，该肽可以迅速地施用，例如，作为单剂量施用或者短期施用，例如当需要迅速或瞬时提升血小板(例如，在外科手术之前)时。例如，如实例3证明的，单次皮下注射4F-苯甲酰基-TN14003(0.9mg/kg)可诱导计划用于干细胞收获，在施用后的几分钟或几小时测量的人血小板减少患者的血小板水平提升。在其它实施例中，该肽可以缓慢地施用，例如以重复施用或长期施用方式施用。例如，实例1和2证明，持续数日每日一次的4F-苯甲酰基-TN 14003皮下注射可以诱导提升血小板水平的延长效应。在一些实施例中，该肽是全身施用的。在其它实施例中，该肽是局部施用的。在特定实施例中，该肽是肠胃外施用的。例如，该肽可以皮下、静脉内或真皮内施用。

在其它实施例中，本发明涉及具有如SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列的肽或其类似物，在制备用于提升需要它的受试者血小板水平的药品中的用途。

在其它实施例中，本发明涉及具有如SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列的肽或其类似物在制备用于治疗或预防需要它的受试者血小板减少的药品中的用途。

在进一步实施例中，本发明公开了具有如SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列的肽或其类似物，在制备用于增强需要它的受试者中血小板生成素诱导的血小板水平提升的药品中的用途，其中所述受试者并行地用血小板生成素或血小板生成素激动剂治疗。

根据其它实施例，本发明提供了具有如SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列的肽或其类似物在制备用于抑制需要它的受试者出血的药品中的用途。

在其它实施例中，本发明涉及包含具有如SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列的肽或其类似物的组合物，该组合物用于提升血小板水平，用于治疗或预防血小板减少，用于增强血小板生成素诱导的血小板水平提升，或用于抑制需要它的受试者出血，如本文详述的。

实例

材料和方法

试剂

血小板生成素购自PROSPEC cat# CYT-346。4F-苯甲酰基-TNI4003(SEQ ID NO：1)由Novotide有限公司合成。

小鼠和实验方案

雌性C57BL/6小鼠(7-8周龄)购自Harlan Israel，并在HebrewUniversity Animal Facility(以色列耶路撒冷)保存在无特定病原体的条件下。

将4F-苯甲酰基-TN 14003和血小板生成素在PBS中重构成各种浓度。给小鼠皮下注射200μL的总体积。注射4F-苯甲酰基-TN 14003(100μg/小鼠，5mg/Kg)5天，每天一次，第5天采集血液并测试血小板计数，并测试骨髓中的造血集落。注射3次血小板生成素，按(0.5μg/小鼠)的量每天1次，第5天采集血液并测试血小板计数，并测试骨髓中的造血集落。在另一个组中，注射4F-苯甲酰基-TN 14003(100μg/小鼠)5天，每天一次，并在第3、4和5天进一步给小鼠注射血小板生成素(即，注射3次，按0.5μg/小鼠的量每日1次)。第5天采集血液并测试血小板计数和骨髓中的造血集落。给对照小鼠注射适当体积的PBS，第5天采集血液并测试血小板计数和骨髓中的造血集落。

在化疗实验中，将5-氟尿嘧啶(5-FU)按150mg/kg溶解在盐水中并进行腹膜内注射(第0天)。用4F-苯甲酰基-TN14003(5mg/Kg)处理该小鼠5天，或者用TPO(0.5μg/小鼠)处理3天，之后用5-FU处理。在用5-FU施用后1天，经4F-苯甲酰基-TN14003处理的小鼠进一步每日用4F-苯甲酰基-TN14003(5mg/Kg)处理，该处理一直持续到实验结束。在4F-苯甲酰基-TN14003施用或对照(PBS)注射之后1小时收集血液样品；由以色列American Medical Laboratories测试总血细胞计数。在一些实验中，在施用5-FU后1天，每日皮下注射最终浓度为5μg/小鼠，总体积为0.2ml的G-CSF，直至实验结束。

造血祖细胞(HPC)分析

为了评价骨髓中的祖细胞数，处理之后利用集落形成细胞试验制取造血集落。通过将该细胞置于伊思考夫改良杜尔贝可培养基(IMDM)中分析集落，该培养基含有1％甲基纤维素、15％FBS、1％牛血清白蛋白(BSA)、3U/mL rh EPO、10⁴M 2-巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、50ng/mL rmSCF、10ng/mL rmIL-3、10μg/mL rh胰岛素、10ng/mL rh IL-6，和200μg/mL人转铁蛋白(Methocult GF M3434；StemCell Technologies有限公司)。将该培养物在含有5％CO₂的加湿气氛中在37℃下温育。7天后，利用光学显微镜根据形态学标准对典型集落进行视觉打分。

统计学分析

结果表示为平均值±SD。统计学差异通过双尾学生t测验分析确定统计学差异。p＜0.05的值被视为统计学上显著的。

临床方案

对接受用于诱导骨髓中的祖干细胞动员到外周血中的G-CSF的多发性骨髓瘤(MM)患者，进行4F-苯甲酰基-TN14003的阶段I/IIa、非随机、开放、单剂量、剂量递增、安全性研究。

所有符合条件的患者都根据已接受的MM实践在门诊接受环磷酰胺(Cytoxan、Neosar的通用名称)4gr/m²作为它们的计划治疗的一部分。G-CSF(neupogen)在5天后启动，一直持续到干细胞收集结束时，每天在18:00之后以5μg/kg/天的量施用SC。在7和10天后，监测WBC和血小板，直至干细胞收集为止。根据WBC方案对1,000个细胞进行干细胞收集。

10天后按照30、100、300或900μg/Kg单剂量注射4F-苯甲酰基-TN14003。注射后的后续工作包括在30min、1hr、2hr、4hr、8hr、24hr时间点对WBC和血小板水平进行计数。

附图各处出现的标记“4FB-TN140”用于指4F-苯甲酰基-TN14003(SEQ ID NO：1)。“PLAT”表示血小板水平。

实施例1：制取集落和血小板

如从图1以及表2和3中可以看出，4F-苯甲酰基-TN 14003和血小板生成素可诱导血液中产生血小板((图1A，表2))和骨髓中产生集落形成细胞(造血祖细胞，“HPC”)(图1B，表3)。还发现，这些药剂共同配合从而进一步刺激血液中的血小板数和骨髓中祖细胞的产生。因而，4F-苯甲酰基-TN 14003加强了TPO增强体内血小板水平的活性。

在图1中，“CTRL”表示磷酸盐缓冲盐水(PBS)-处理的小鼠，“PLAT”表示血小板水平，“集落数”表示骨髓中集落形成细胞(造血干细胞)数目，“TPO”表示血小板处理的小鼠。

表2-4F-苯甲酰基-TN 14003和TPO对血小板计数的影响

处理	血小板(×103)	SD	％增大	P值
					对照	1172	123
4F-苯甲酰基-TN 14003	1551	263	32	0.00509
					TPO	1556	133	32	0.000589
TPO+4F-苯甲酰基-TN 14003	1912	43	63	0.008486

表3-4F-苯甲酰基-TN 14003和TPO对HPC计数的影响

处理	集落数	SD	P值
				对照	128.2	6.9
4F-苯甲酰基-TN 14003	148.2	5.5	0.1
				TPO	150.2	15.5	0.2
TPO+4F-苯甲酰基-TN 14003	215.2	19	0.01

在图2所述的实验中，按5mg/kg的剂量给小鼠皮下注射4F-苯甲酰基-TN14003，以每日一次的注射方式施用或者分成两个剂量施用的一日两次方式施用。1、2或3天后测量血小板水平。如从图2可以看出，单次注射的肽足以诱导血小板水平的显著提升。

如从图3可以看出，在雄性和雌性小鼠中都观察到这种作用，因为该肽增强了在雄性和雌性动物中施用3天后测得的血小板水平。在图3中，“雄性对照”和“雌性对照”分别表示PBS-处理的雄性和雌性小鼠；“雄性+4FB-T140”和“雌性+4FB-T140”表示用4F-苯甲酰基-TN14003(5mg/kg)处理的雄性或雌性小鼠。

实施例2.化疗诱导的血小板减少的预防

然后在化疗诱导的血小板减少小鼠模型中检查血小板调制作用。在这些实验中，向所有小鼠(在第0天)腹膜内注射以150mg/kg溶解在盐水中的5-氟尿嘧啶(“5FU”)。进一步用4F-苯甲酰基-TN14003(5mg/Kg，每日皮下注射1次)处理一些小鼠，持续5天，之后用5-FU处理，在5-FU之后1天每日用4F-苯甲酰基-TN 14003(5mg/Kg)进一步处理小鼠，该处理一直持续到实验结束。在4F-苯甲酰基-TN 14003或对照(PBS)注射施用之后的1hr收集血液样品。如图4可以看出，4F-苯甲酰基-TN14003的施用可以增强在用5FU处理之前和之后血液中的血小板水平。在图4中，菱形表示对照(PBS处理的)小鼠，敞开正方形表示4F-苯甲酰基-TN14003处理的小鼠。

接着，检查该肽对5-FU与或不与G-CSF一起处理的小鼠的影响。在5-FU处理后1天开始施用G-CSF(如每日皮下注射，5μg/小鼠)，持续到该实验接触为止。5-FU和4F-苯甲酰基-TN14003施用以及血液样品收集如同上面针对图4明确说明的。如图5所示，4F-苯甲酰基-TN14003在单独施用或与G-CSF联合施用时增强了用5-FU处理之前和之后血液中的血小板水平。G-CSF的处理对血小板水平没有影响，并且不改变4F-苯甲酰基-TN14003对血小板水平的提升作用。在图5中，菱形表示对照(PBS处理的)小鼠，敞开正方形表示4F-苯甲酰基-TN14003处理的小鼠，三角形表示G-CSF处理的小鼠，十字形表示用G-CSF和4F-苯甲酰基-TN14003处理的小鼠。

然后将该肽在化疗诱导的血小板减少模型中的活性与TPO的活性进行比较。在TPO组中，在用5-FU处理之前用单剂量TPO(0.5μg/小鼠)处理小鼠3天。5-FU和4F-苯甲酰基-TN 14003施用以及血液样品收集如同上面针对图4明确说明的。如从图6可以看出，TPO和4F-苯甲酰基-TN14003都提升了在5-FU施用之前和之后的血小板水平。在施用10天后，4F-苯甲酰基-TN14003处理的小鼠的血小板水平高于TPO处理的小鼠或对照小鼠的。在图6中，菱形表示对照(PBS处理的)小鼠，敞开正方形表示4F-苯甲酰基-TN 14003处理的小鼠，三角形表示TPO处理的小鼠。

实施例3.血小板减少患者血小板水平的迅速提升

根据临床方案，让经受环磷酰胺化疗的MM患者接受G-CSF，以便诱导HPC动员用于随后收获和移植。环磷酰胺和G-CSF处理后10天，让患者接受按0.9mg/kg注射的4F-苯甲酰基-TN14003。如从图7可以看出，4F-苯甲酰基-TN 14003刺激血液中的血小板数立即增大，这可以在施用后30分钟检测到，并且在几个小时后(在1、2、4或8小时之后)仍然可以观察到。在图7中，“0分钟”时间点表示在注射4F-苯甲酰基-TN14003时的血小板水平。

参考文献

Avniel，S.et al.，J.Invest.Dermatol.2006，126(2)：468-76.

Junzhi Li，Chun Yang，Yuping Xia，Amy Bertino，John Glaspy，MichaelRoberts and David J.Kuter.Thrombocytopenia caused by the development ofantibodies to thrombopoietin.Blood.2001，98：3241-3248.

Kaushansky K，Lok S，Holly RD，et al.Promotion of megakaryocyteprogenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin.Nature.199A；369：568-571.

Princen，K.and Schols，D.，Cytokine Grow.Fac.Rev.2005，16(6)：659-677.

Rossi，D.and Zlotnik，A.，Ann.Rev.Immun.2000，18：217-242.

Tamamura，H.and Fujii，N.，Expert Opin.Ther.Targets，2005，9(6)：1267-1282.

Tamamura，H.et al.，Org.Biomol.Chem.2003，1：3663-3669.

Tamamura，H.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.1998，253(3)：877-882.

William J.Lane，Sergio Dias，Koichi Hattori，Beate Heissig，Margaret Choy，Sina Y.Rabbany，Jeanette Wood，Malcolm A.S.Moore and Shahin Rafii.Stromal-derived factor 1-induced megakaryocyte migration and plateletproduction is dependent on matrix metalloproteinases.Blood，15 December2000，Vol.96，No.13，pp.4152-4159.

具体实施例的前述描述如此充分地揭示了本发明的一般性质，以至于人们通过应用当前知识，容易变更和/或修改此种特定实施例的各种应用，无需不适当的实验且不偏离一般概念，因而此种修改和变更应当且倾向于包括在所公开实施例等效形式的含义和范围内。应理解，本文采用的短语或术语是为了描述，而不是限制。实施各种所公开功能的方式、材料和步骤可以采取多种形式，而不偏离本发明。

Claims (30)

1.一种提升有需要的受试者的血小板水平的方法，所述方法包含向所述受试者给予有效量的SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列的肽或其类似物以便提升所述受试者的血小板水平。

2.根据权利要求1所述的方法，其用于提升所述受试者外周血中的血小板水平。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述方法以迅速的方式诱导所述受试者外周血中的血小板显著提升。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述提升在给予所述肽的1小时内发生。

5.根据权利要求1所述的方法，其用于治疗或预防所述受试者的血小板减少。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述血小板减少的特征是血小板计数少于20,000/μL。

7.根据权利要求5所述的方法，其用于治疗特征为血小板计数少于10,000/μL的严重血小板减少。

8.根据权利要求5所述的方法，其中，所述受试者患有临床上显著的出血。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述受试者患有血小板减少，并且所述肽的给予在外科手术程序的24小时内开始。

10.根据权利要求5所述的方法，其中，所述血小板减少选自由以下组成的组中：与血小板破坏增加关联的血小板减少、与血小板隔离增加关联的血小板减少、与血小板稀释关联的血小板减少和与血小板生成受损关联的血小板减少。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述血小板减少与免疫性血小板破坏增加关联。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述血小板减少选自特发性血小板减少性紫癜和自身免疫性血小板减少。

13.根据权利要求10所述的方法，其中，所述血小板减少与丙型肝炎病毒相关性肝硬化关联。

14.根据权利要求10所述的方法，其中，所述血小板减少与血小板生成受损关联，并选自由先天性低巨核细胞血小板减少和血小板减少伴桡骨缺如组成的组。

15.根据权利要求5所述的方法，其中，所述血小板减少与骨髓缺乏或抑制无关联。

16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述受试者患有与暴露于辐射或化疗关联的血小板减少或有具有与暴露于辐射或化疗关联的血小板减少的风险。

17.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述肽与至少一种刺激血小板生成的细胞因子联合给予所述受试者。

18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述肽与血小板生成素或血小板生成素激动剂联用。

19.根据权利要求18所述的方法，其用于增强所述受试者中血小板生成素诱导的血小板水平提升。

20.根据权利要求18所述的方法，其用于缩短所述受试者血小板减少的持续时间。

21.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肽以进一步包含至少一种刺激血小板生成的细胞因子的药物组合物的形式给予。

22.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肽与在别的情况下由于血小板减少或血小板减少风险而不能给予所述受试者的另外的药物或物质联用。

23.一种抑制有需要的受试者出血的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列的肽或其类似物，以便抑制所述受试者出血。

24.根据权利要求23所述的方法，其用于缩短所述受试者的出血持续时间。

25.根据权利要求23所述的方法，其用于降低所述受试者的出血强度。

26.根据权利要求23所述的方法，其中，所述受试者患有血小板减少。

27.根据权利要求23所述的方法，其中，所述受试者患有临床上显著的出血。

28.根据权利要求23所述的方法，其中，所述肽的给予在外科手术程序的24小时内开始。

29.一种药物组合物，包含作为有效成分的有效量的SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列的肽或其类似物和至少一种刺激血小板生成的细胞因子。

30.根据权利要求29所述的组合物，其中，所述细胞因子是血小板生成素或血小板生成素激动剂。

Images