ES2699576T3 - Péptidos con actividades antagonistas contra CXCR4 natural - Google Patents
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Abstract
Un péptido eficaz en el bloqueo de la infección del VIH-1 NL4-3 X4-trópico, con un valor IC50 menor de 50 μM que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en IVRFTKKVPQVS, 4081-419 Y411F IVRWTKKVPQVS, 4081-419 Y411W IVRYTKCVPQVS, 4081-419 K414C IVRYSKKVPQC, 4081-418 SC IVRWTKKVPQVC, 4081-419 WC01 IVRWTCKVPQVS, 4081-419 WC02 IVRWCKKVPQVS, 4081-419 WC03 IVRWSKKVPQCS, 4081-419 WSC01 IVRWSKKVPCVS, 4081-419 WSC02 IVRWSKKVCQVS, 4081-419 WSC03 IVRYTCKVCQVS, 4081-419 WSC03 IVRYTKKVPQCS, 4081-419 V418C.
Description
DESCRIPCION
Péptidos con actividades antagonistas contra CXCR4 natural
La presente invención se refiere a péptidos con actividades antagonistas contra CXCR4 natural, usos terapéuticos de los péptidos de la invención así como a un procedimiento de fabricación de los péptidos de la invención.
Antecedentes de la invención
El receptor quimiocina CXC 4 (CXCR4) es un receptor acoplado a la proteína G (GPCR) con factor-1 obtenido de células estromales (SDF-1 o CXCL12) como único ligando publicado. El CXCR4 está implicado en múltiples proce sos de desarrollo y fisiológicos que incluyen migración de células madre (Mohle y Drost, 2012) y migración de célu las inmunes (Campbell y otros, 2003). El eje CXCR4-CXCL12 juega igualmente un papel en la inmunidad innata y adaptativa, así como en varios procesos de enfermedades, tales como metástasis de células de cáncer, migración de células de leucemia, artritis reumatoide y fibrosis pulmonar (Nagasawa y otros, 1996; Zou y otros, 1998; Tachibana y otros, 1998; Furze y otros, 2008). Los antagonistas de CXCR4 artificiales son capaces de movilizar células madre hematopoyéticas (HSCs), los cuales se utilizan para reconstitución inmune después de trasplante o quimiote rapia de órganos (Ratajczak y Kim, 2012; Schroeder y DiPersio, 2012). Además, el CXCR4 es igualmente un coreceptor principal para la entrada de VIH-1 dentro de células diana (Feng y otros, 1996; Bleul y otros, 1996). La utili zación del co-receptor de CXCR4 es altamente eficaz y una alta proporción de células T CD4+ expresan este GPCR en tejidos linfáticos in vivo. Sin embargo, casi exclusivamente las variantes de VIH-1 que utilizan el receptor quimio cina C-C tipo 5 (CCR5) se transmiten y encuentran durante la infección de VIH-1 crónico (Alkhatib y otros, 1996; Deng y otros, 1996; Dragic y otros, 1996). Se ha propuesto que múltiples factores contribuyen a la ineficaz transmisión de cepas de VIH-1 CXCR4-trópico (X4) (Margolis y Shattock, 2006). No obstante, el mecanismo(s) que refuerza el control eficaz de VIH-1 X4 en individuos inmunocompetentes permanece pobremente conocido.
La investigación sobre antagonistas de CXCR4 se ha convertido recientemente en un inmenso campo de proyectos debido a múltiples indicaciones. En particular, los esfuerzos para encontrar una estrategia para intervenir con la proliferación, diferenciación y metástasis de células de cáncer no han sido aún tan satisfactorios en los estudios clínicos como se esperaba. El desarrollo de uno de los grupos de compuestos, fundamentalmente AMD3100, unos antagonistas de CXCR4
(un compuesto biciclamo: Hendrix y Flexner, 2000), ha tenido que interrumpirse para tratamientos a largo plazo debido a efectos secundarios tóxicos. Aunque el AMD está registrado para aplicaciones cortas únicas en la movilización de células madre, es, sin embargo, un desafío el encontrar antagonistas adecuados al CXCR4 diana [página 2a/2b].
Sumario de la invención
El objetivo de la presente invención es logar mediante un péptido eficaz en el bloqueo de la infección del VIH-1 NL4-3 X4-trópico, con un valor IC50 menor de 50 pM que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en
IVRFTKKVPQVS, 
IVRWTKKVPQVS, 
IVRYTKCVPQVS, 
IVRYSKKVPQC, 
IVRWTKKVPQVC, 
IVRWTCKVPQVS, 
IVRWCKKVPQVS, 
IVRWSKKVPQCS, WSC01
IVRWSKKVPCVS, 4081-419 WSC02
IVRWSKKVCQVS, 4081-419 WSC03
IVRYTCKVCQVS, 4081-419 WSC03
IVRYTKKVPQCS, 4081-419 V418C.
Los péptidos particularmente útiles de la presente invención son péptidos diméricos que consisten en dos péptidos monoméricos idénticos de acuerdo con la invención, cuyos péptidos comprenden el aminoácido cisteína, en el que los péptidos diméricos están ligados entre sí mediante un puente cisteína que está formado entre los péptidos mo noméricos. El péptido dímero de la invención está seleccionado entre el grupo de péptidos que tienen la secuencia de aminoácidos siguiente:
IVRYTKCVPQVS, 4081-419 K414C
IVRYSKKVPQC, 4081-418 SC
IVRWTKKVPQVC, 4081-419 WC01
La Patente WO 2009/004054 A2 divulga un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos: Z1-LVRYTKKVPQVSTPTL-Z2 (ALB-408) y sus fragmentos y/o variantes y/o derivados biológicamente activos, espe cialmente derivados amidados, acetilados, sulfatados, fosforilados y/o glucosilados, y péptidos obtenibles mediante síntesis múltiple, que tienen la actividad biológica de ALB408-423; en la que Z representa un número de desde 0 hasta 10 residuos de aminoácidos.
La Patente WO 2013/030320 A1 divulga proteínas cápsidas de tipo Circovirus con propiedades mejoradas. Estas proteínas, o los ácidos nucléicos de codificación, son útiles, por ejemplo, para generar anticuerpos, composiciones inmunógenas, o vacunas. La Patente WO 2013/030320 A1 se refiere igualmente a procedimientos para el tratamien to y/o prevención de enfermedades asociadas con PCV2 en mamíferos que usan dichas proteínas, ácidos nucléicos o composiciones, e igualmente se refiere a composiciones y procedimientos para la detección de PCV2 en una muestra, usando las proteínas, ácidos nucléicos o anticuerpos divulgados.
La Patente WO 2012/112188 A1 divulga composiciones de albúmina de suero humano (HSA) con propiedades me joradas sobre HSA nativas.
J. Kuil, y otros, informan en Mol. Pharmaceutics, vol. 8, (n° 6), págs. 2444-2453, (2011) sobre dendrímeros pépdidos híbridos para la obtención de imágenes de la expresión del receptor quimiocino 4 (CXCR4). El receptor quimiocino 4 (CXCR4), el cual está sobreexpresado en muchos tipos de cáncer, es una diana emergente en el campo de la ob tención de imágenes moleculares y terapéuticas. El CXCR4 de unión a varios péptidos, incluyendo el Ac-TZ14011 cíclico, ha sido ya validado. Se prepararon dendrímeros conteniendo Ac-TZ14011 mono-, di- y tetrámeros y se funcionalizaron con un marcador multimodal (híbrido), que consiste en un fluoróforo del tipo Cy5.5 y un quelato DTPA. La microscopía confocal reveló que todos los tres dendrímeros formaron membrana unida a 4°C, correspondiente a CXCR4 de unión in vitro. El dímero y el tetrámero no marcados tenían una afinidad algo más baja por el CXCR4 que el monómero no marcado. Sin embargo, cuando se marcaron con el marcador multimodal el CXCR4, la afinidad del dímero y el tetrámero fue considerablemente mayor en comparación con la del monómero marcado. Los estudios de biodistribución revelaron que los péptidos adicionales en el dímero y tetrámero redujeron la fijación de músculo no específico. La multimerización del péptido Ac-TZ19411 cíclico reduce la influencia negativa del marcador multimodal sobre la afinidad del receptor y la biodistribución.
MacDonald y otros, informan en Synlett, (n° 13), págs. 1951-1954, (2010) sobre la síntesis en fase sólida de péptidos fosfonilados, usando aminoácidos Fmoc-protegidos. Los péptidos corresponden a regiones que contienen Ser195 fosfonilado en el sitio activo de butilcolinesterasa y Tyr411 de albúmina de suero humano. Los aminoácidos Fmocprotegidos fosfonilados se usaron en la síntesis de péptidos en fase sólida para preparar los péptidos. La Fmocserina y Fmoc-tirosina con protección bencil éster se trataron con monoclorhidratos alquil metilfosfónicos para forfonilar los grupos hidroxi de la cadena lateral. Los péptidos fosfonilados se diseñaron para imitar la región de proteína después de exposición de las proteínas a agentes organofosforosos.
IVRWTCKVPQVS, 4081-419 WC02
IVRWCKKVPQVS, 4081-419 WC03
IVRWSKKVPQCS, 4081-419 WSC01
IVRWSKKVPCVS, 4081-419 WSC02
IVRWSKKVCQVS, 4081-419 WSC03
IVRYTKKVPQCS, 4081-419 V418C.
Objeto de la invención son igualmente péptidos de la invención para su uso en el tratamiento de enfermedades neurológicas, en particular apoplejía, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple; en el campo de la inmunología en particular para el tratamiento del síndrome WHIM y artritis reumatoide; en el campo de la oncología en particular para el tratamiento de cánceres, en particular cánceres que muestran el receptor CRCx tal como cáncer del hígado, páncreas, próstata o cáncer de mama; para el tratamiento de la falta de movilización, proli feración y migración de células madre, activación de célula T así como soporte de inmunoblastos tales como CTL/PD-1; en el tratamiento de heridas causadas por quemaduras; para el tratamiento de antifibrosis; tratamiento o prevención de cicatrices; para el tratamiento de trastornos cardiológicos, en particular insuficiencia cardíaca; para el tratamiento de trastornos metabólicos, en particular diabetes;
en el que el péptido es eficaz en el bloqueo de la infección con VIH-1 NL4-3 X4-trópico con un valor IC50 menor de 50 |jM.
Objeto de la invención son igualmente péptidos de la invención para su uso en el tratamiento de enfermedades neurológicas, en particular apoplejía, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple; en el campo de la inmunología en particular para el tratamiento del síndrome WHIM y artritis reumatoide; en el campo de la oncología en particular para el tratamiento de cánceres, en particular cánceres que muestran el receptor CRCx tal como cáncer del hígado, páncreas, próstata o cáncer de mama; para el tratamiento de trastornos de hematopoyesis, en particular para soporte de la movilización, proliferación y migración de células madre, activación de célula T así como soporte de inmunoblastos tales como CTL/PD-1; para el tratamiento de antifibrosis; tratamiento o prevención de cicatrices; para el tratamiento de trastornos cardiológicos, en particular insuficiencia cardíaca; para el tratamiento de trastornos metabólicos, en particular diabetes; para el tratamiento de enfermedades víricas, en particular infec ciones con VIH-1, VIH-2, Cytomegalo virus, Herpes simplex virus (tipo 1 y 2), Varicella zoster virus, Hepatitis A y Hepatitis B virus, Influenza virus, Polio virus, Rhino virus, Rubella virus, Measles virus, Rabas virus, Rous sarcoma virus, Epstein-Barr virus; y para el tratamiento de infecciones causadas por bacterias y hongos, en particular Pseudomonas, Candida, S. aureus; para el tratamiento de procesos infecciosos, procesos infecciosos anormales; trata miento de trastornos del crecimiento, tratamiento de enfermedades neuronales, trastornos de la cascada de coagu lación de la sangre y hematopoyesis, enfermedades vasculares, enfermedades del sistema inmune, y para mejorar la cicatrización de heridas y huesos.
Un objeto adicional de la presente invención es un procedimiento para la fabricación de al menso uno de los pépti dos de la invención mediante síntesis en fase sólida.
Además, el objeto de la presente invención es igualmente un procedimiento para la fabricación de al menos uno de los péptidos de la invención, en el que los péptidos monoméricos se proporcionan y acoplan bajo condiciones de reacción oxidantes que son capaces de oxidar los enlaces SH para proporcionar enlaces -S-S-.
Descripción detallada de la invención
La invención se describe adicionalmente con mayor detalle mediante el uso del péptido de SEC ID NO 16 como un representante típico del péptido de la invención. Además de la divulgación de la presente invención, se le refiere en la Patente WO 2009/004054 A2.
El péptido de la invención es eficaz en el bloqueo de la infección con VIH-1 NL4-3 X4-trópico con un valor IC50 me nor de 50 j M. Dichos péptidos se consideran que tienen el efecto inhibidor suficiente como para suprimir o inhibir las respuestas fisiológicas mediadas por el CXCR4 activo. Los péptidos de la invención comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en
IVRFTKKVPQVS, 4081-419 Y411F
IVRWTKKVPQVS, 4081-419 Y411W
Otra realización aún de la invención comprende el péptido de la invención que tiene al menos una de las secuencias de aminoácidos siguientes:
IVRYTKCVPQVS, 4081-419 K414C
IVRYSKKVPQC, 4081-418 SC
IVRWTKKVPQVC, 4081-419 WC01
IVRWTCKVPQVS, 4081-419 WC02
IVRWCKKVPQVS, 4081-419 WC03
IVRWSKKVPQCS, 4081-419 WSC01
IVRWSKKVPCVS, 4081-419 WSC02
IVRWSKKVCQVS, 4081-419 WSC03
IVRYTKKVPQCS, 4081-419 V418C.
Estos aminoácidos se usaron para la preparación de dímeros los cuales están ligados mediante sus cisteínas. Am bos homo- y heterodímeros pueden sintetizarse combinando dichos péptidos.
Los péptidos particularmente útiles de la presente invención son péptidos diméricos que consisten en dos péptidos monoméricos idénticos de acuerdo con la invención, cuyos péptidos comprenden el aminoácido cisteína, en el que los péptidos diméricos están ligados entre sí mediante un puente cisteína que está formado entre los péptidos monómeros. En particular, el péptido dímero de la invención está seleccionado entre el grupo de péptidos que tiene la secuencia de aminoácidos siguiente:
IVRYTKCVPQVS, 
IVRYSKKVPQC, 
IVRWTKKVPQVC, 
IVRWTCKVPQVS, 
IVRWCKKVPQVS, 
IVRWSKKVPQCS, 
IVRWSKKVPCVS, 
IVRWSKKVCQVS, 
IVRYTKKVPQCS, 
Igualmente, los péptidos retro-inversos de los péptidos de la inversión entran dentro del alcance de la presente in vención, así como otros derivados que estabilizan el enlace péptido frente a peptidasas.
El término derivado define todos los fragmentos de longitudes que incluyen truncamientos en la terminación N y C, el péptido de la invención que contiene substituciones de restos de aminoácidos incluyendo restos D-aminoácidos y restos de aminoácidos modificados, así como péptidos que contienen enlaces disulfuro y extensiones en la termina ción N y C.
Objeto de la presente invención son igualmente péptidos de la invención para su uso en el tratamiento de enferme dades neurológicas, en particular apoplejía, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, esclerosis múlti ple; en el campo de la inmunología en particular para el tratamiento del síndrome WHIM y artritis reumatoide; en el campo de la oncología en particular para el tratamiento de cánceres, en particular cánceres que muestran el recep tor CRCX tal como cáncer del hígado, páncreas, próstata o cáncer de mama; para el tratamiento de trastornos de hematopoyesis, en particular para soporte de la movilización, proliferación y migración de células madre, activación de célula T así como soporte de inmunoblastos tales como CTL/PD-1; para el tratamiento de antifibrosis; tratamiento o prevención de cicatrices; para el tratamiento de trastornos cardiológicos, en particular insuficiencia cardíaca; para el tratamiento de trastornos metabólicos, en particular diabetes; para el tratamiento de enfermedades víricas, en particular infecciones con VIH-1, VIH-2, Cytomegalo virus, Herpes simplex virus (tipo 1 y 2), Varicella zoster virus, Hepatitis A y Hepatitis B virus, Influenza virus, Polio virus, Rhino virus, Rubella virus, Measles virus, Rabas virus, Rous sarcoma virus, Epstein-Barr virus; y para el tratamiento de infecciones causadas por bacterias y hongos, en particular Pseudomonas, Candida, S. aureus; para el tratamiento de procesos infecciosos, procesos infecciosos anormales; tratamiento de trastornos del crecimiento, tratamiento de enfermedades neuronales, trastornos de la cascada de coagulación de la sangre y hematopoyesis, enfermedades vasculares, enfermedades del sistema inmu ne, y para mejorar la cicatrización de heridas y huesos.
El péptido de la invención puede formularse como médicamente con vehículos aceptables farmacéuticamente ade cuados.
El péptido de acuerdo con la invención puede administrarse en un modo usual para péptidos en una vía parenteral, intravenosa, intramuscular, intranasal, local-tópica, subcutánea o bucal. La cantidad de péptido a administrar es desde 1 |jg hasta 1 g por dosis unitaria por día.
Un objeto adicional de la presente invención es un procedimiento para la fabricación de al menos uno de los pépti dos de la invención mediante síntesis en fase sólida. La síntesis química del péptido de la invención puede llevarse a cabo por medios de síntesis en fase sólida convencionales, por ejemplo sobre un sintetizador de péptido 9050 (Ap plied Biosystems) usando la química Fmoc conocida.
Además, el objeto de la presente invención es igualmente un procedimiento para la fabricación de al menos uno de los péptidos de la invención, en el que los péptidos monoméricos se proporcionan y acoplan bajo condiciones de reacción oxidante que son capaces de oxidar los enlaces SH para proporcionar enlaces -S-S-.
El cribado antivírico se llevó a cabo usando el clon molecular VIH-1-NL4-3 X4. Para determinar si la actividad antiví rica dependió del tropismo del co-receptor vírico y para excluir la posibilidad de que un agente contaminante fuera el responsable de los efectos observados, los autores de la presente invención ensayaron a cotinuación el efecto del péptido químicamente sintetizado de la SEC ID NO 16 sobre una variedad de cepas VIH-1. El péptido sintético inhi bió de manera general la infección por cepas VIH-1 X4 con una concentración inhibidora media del 50% (IC50) de 15,8 jg/ml (correspondiente a 8,6 jM). La replicación de VIH-1 NL4-3 de tipo salvaje (ts) en PBMCs se suprimió marcadamente a concentraciones >4 jg/ml. De manera notable, justamente ~1% del precursor HSA altamente abundante necesita convertirse al péptido del péptido de la SEC ID NO 16 para lograr ~10 jg/ml. El péptido del péptido de la SEC ID NO 16 no muestra efectos citotóxicos incluso a concentraciones excesivamente altas. Experi mentos adicionales confirmaron que el péptido inhibe también la infección por cepas VIH-2 X4 y SIV, aunque los efectos fueron relativamente modestos ya que estos virus usan co-receptores múltiples. Los autores de la presente invención han encontrado que el pretratamiento con células diana víricas, pero no de viriones, dieron como resultado una reducción efectiva de infección por VIH, lo cual sugiere que el péptido de la SEC ID NO 16 tiene una diana celu lar. Además, la potencia de inhibición disminuyó gradualmente cuando el péptido de la SEC ID NO 16 se agregó después de exposición de las células a los viriones, y el precursor HSA no tuvo efecto antiretrovírico. Así, los datos demostraron que un fragmento de la proteína la más abundante en el plasma humano, es un inhibidor que se produ ce de manera natural y específico de cepas de VIH-1 X4 que identifica una etapa temprana del ciclo de vida vírico. Se ha encontrado que el péptido de la SEC ID NO 16 compite con la unión de CXCL12 a CXCR4 de una manera que depende de la dosis. La constante de disociación (DC50) se igualó a 8±3 jM , lo que corresponde a un valor de K1 de 3±1 jM. Así, el valor DC50 del péptido de la SEC ID NO 16 es similar a los valores IC50 obtenidos en ensayos de inhibición de VIH-1. No obstante, tal como se ha indicado anteriormente, estas concentraciones pueden lograrse fácilmente mediante la escisión proteolítica de una pequeña fracción del abundante precursor HSA.
Se examinó si el péptido de la SEC ID NO 16 afecta la migración celular mediada por CXCR4/CXCL12, que juega un papel clave en la homeostasis, respuestas inmunes y la metástasis de varios cánceres. Se ha encontrado que el péptido de la SEC ID NO 16 suprimió la migración inducida por CXCL12 de células T Jurkat, así como de células madre humanas CD34+. De manera similar, el péptido de la SEC ID NO 16 previno la invasión de células tumorales in vitro. Así, este péptido puede ejercer efectos anti-inflamatorios así como anti-invasivos y anti-metástasis.
El eje CXCL12-CXCR4 está implicado en la retención de médula ósea de células madre hematopoyéticas (HSCs), las cuales son comúnmente usadas para la reconstitución de la hematopoyesis en pacientes trasplantados (Mohty y otros, 2011). Las CXCR4 humanas y de ratón están altamente conservadas y los estudios piloto en ratones revela ron que una única administración i.p. del péptido de la SEC ID NO 16 dio como resultado una significativa moviliza ción de células progenitoras y neutrófilos en la periferia. El trasplante de células obtenidas del péptido de la SEC ID NO 16 tratado con ratones dio como resultado unos índices de injertos incrementados, lo que confirma adicional mente la exitosa movilización de células madre mediante este péptido que se produce de manera natural.
Una administración i.p. del péptido de la SEC ID NO 16 redujo de manera significativa la infiltración dependiente de CXCR4 de neutrófilos, linfocitos y eosinófilos dentro las vías respiratorias de ratones tras exposición a alérgenos con OVA. Este tratamiento redujo igualmente de manera marcada la infiltración de macrófagos. Por el contrario, el ALB409-423, el cual no interactúa con CXCR4, no tuvo efectos significantes. Así, el péptido de la SEC ID NO 16 es un antagonista eficaz de CXCR4 in vivo que moviliza las células madre y ejerce efectos anti-inflamatorios en mode los de ratones.
Se ha encontrado que el péptido de la SEC ID NO 16 inhibió la Pseudomonas aeroginosa, un patógeno oportunista gram-negativo, de una manera dependiente de la dosis y que fue eficaz al 80% en concentraciones de >5 jM . En comparación, únicamente se observaron efectos modestos contra el Staphylococus aureus, un patógeno bacteriano gram-positivo, o contra Candida albicans, un hongo diploide y agente causal de infecciones oportunistas orales y genitales. Así, el péptido de la SEC ID NO 16 no solamente inhibe cepas de VIH-1 X4, sino que también ejerce efec tos antibacterianos específicos.
La interacción del péptido de la SEC ID NO 16 con CXCR4 es altamente específica ya que la actividad de un gran número de otros GPCRs no fue afectada y que este péptido interactúa con la segunda hélice extracelular de CXCR4. El proceso exacto de unión del péptido de la SEC ID NO 16 a CXCR4 permanece sin determinar. Se ha informado que el CXCL12 interactúa inicialmente con la N-terminación de CXCR4 para inducir cambios de conformación que posteriormente permiten la interacción del ligando con la segunda y tercera hélices extracelulares del GPCR (Brelot y otros, 2000; Zhou y otros, 2001; Huang y otros, 2003).
Continuación
Ejemplos
Péptidos
El péptido de la SEC ID NO 16 y varios derivados del mismo se sintetizaron mediante síntesis en fase sólida con vencional sobre un sintetizador de péptidos 9050 (Applied Biosystems) usando química Fmoc. El péptido se purificó mediante cromatografía RP, y su identidad y pureza se establecieron mediante RP-HPLC análitica y MALDI-MS. Virus madre
Los clones moleculares de VIH-1, VIH-2 y SIV que difieren en el tropismo del co-receptor se generaron mediante transfección transitoria de células 293T con ADN pro-vírico mediante el procedimiento del fosfato cálcico (CalPhos™ Mammalian Transfection Kit, Clontech). Después de incubación durante una noche, la mezcla de transfección se reemplazó mediante medio DMEM suplementado con FCS al 10%, y los virus madre se recolectaron 48 horas posttransfección. A continuación, el sobrenadante del cultivo se centrifugó durante 5 minutos a 3000 rpm para separar los residuos de las células. Los virus madre resultantes se cuantificaron mediante ELISA con antígeno p24 (VIH) o p27 (SIV).Los virus madre o bien se usaron inmediatamente o bien se almacenaron en partes alícuotas a -80°C. Ensayo de infección de TZM-bl
Las células informadoras TZM-bl que contenían el gen informador LacZ bajo el control del promotor de HIV-1 se sembraron en placas de microvaloración de fondo en F de 96 pocillos (Greiner Bio-One). Al día siguiente, la células se pre-incubaron con varias diluciones del péptido de la SEC ID NO 16 o sus derivados durante 1 hora y, posterior mente, se infectaron con VIH-1, VIH-2 y SIV. Los índices de infección se determinaron después de 2 días usando el kit Tropix Gal-Screen de una etapa, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Ensayo de infección de PBMC
Las células mononucleares de sangre periférica se aislaron a partir de capas leucocitarias obtenidas de DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg-Hesse usando centrifugación de densidad Ficoll. Se estimularon 1x106 PBMC por ml con 1 pg/ml de fitohemaglutinina (PHA, Oxoid, #3085280) y 10 ng/ml de Interleucina 2 (IL-2, Strathmann, #9511192) durante tres días. Después de esto, la células se granularon y resuspendieron en medio conteniendo IL-2. Se sembraron 2x105 PBMC en placas de microvaloración de fondo en F de 96 pocillos, se agregaron los péptidos y las células se infectaron con 10-100 pg de antígeno p24 de virus X4 o R5 trópico. Los sobrenadantes conteniendo la progenie de los virus se extrajeron cada 2-3 días post-infección. La producción de virus se midió mediante ELISA de antígeno p24 (programa de reactivo de SIDA NIH). Los valores medios de antígeno p24 se obtuvieron a partir de infecciones por triplicado ±desviación estándar.
Viabilidad de las células
Con el fin de comprobar los efectos citotóxicos se incubaron células TZM-bl o PBMCs pre-estimuladas con concen traciones crecientes de péptidos. La viabilidad de las células se determinó usando el ensayo de viabilidad de células luminiscentes CellTiter-Glo (PROMEGA, G7571) según recomendaciones del fabricante. Los valores se obtuvieron a partir de mediciones por triplicado. Los índices de vitalidad se calcularon con relación a índices de ATP en células que contenían PBS (no péptido) (100%). Los datos se registraron usando un luminómetro 10 minutos después de la adición del reactivo.
El péptido del péptido de SEC ID NO 16 bloquea una etapa temprana en la infección
Monitorizacion mediante fluorescencia en tiempo real de interacciones ligando-receptor
Se adquirieron anticuerpos monoclonales (mAbs) CXCR4 (clon 12G5, IgG2a) anti-humano o CXCR7 (clon 9C4) anti humano de R&D Systems (Minneapolis, MN). La unión de mAbs anti-CXCR7 y anti-CXCR4 no-conjugados se reveló usando F(ab')2 Ab anti-ratón de cabra PE-conjugado (Dako, Glostrup, Dinamarca) y se analizó en un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences) con el software CellQuest. Las quimiocinas humanas CXCL12 y CXCL12-TexasRed se sintetizaron tal como ha sido descrita (Valenzuela-Fernandez, y otros 2001).La quimiocina humana CXCL12 se adquirió de Clinisciences SAS (Francia).
Los experimentos se realizaron usando células que expresan de manera estable EGFP-CXCR4, suspendidas en tampón de albúmina de suero bovino-HEPES (He PeS 10 mM, NaCl 137,5 mM, MgCh 1,25 mM, CaCl21,25 mM, KCl 6 mM, glucosa 10 mM, NaH2PO40,4 mM, albúmina de suero bovino al 0,1% (p/v), pH 7,4) (típicamente a 106 células/ml). Los registros en función del tiempo de la fluorescencia emitida a 510 nm (excitación a 470 nm) se realizaron a 21°C usando un espectrofluorímetro y con tomas de muestras cada 0,3 segundos. Las mediciones de unión de fluorescencia se iniciaron mediante la adición a los 30 segundos de 100 mM de CXCL12-TR a la suspensión de 1 ml de célula. Para los experimentos de competencia, las células que expresan EGFP-CXCR4 se pre-incubaron durante 10 minutos en la ausencia o la presencia de varias concentraciones de fármacos no marcados. A continuación, se agregó el CXCL12-Tr (100 nM) y se registró la fluorescencia hasta que se alcanzó el equilibrio (300 segundos). Los datos se analizaron usando el software Kaleidagraph 3.08 (Synergy Software, Reading, PA, USA).
Internalización de EGFP-CXCR4 o EGFP-CXCR7
El ADNc de CXCR7 se clonó en fusión con ADNc de EGFP dentro de un vector pIRES Hyg 3 modificado (Clonetech). Las células HEK 293T que expresan de manera estable EGFP-CXCR7 se generaron mediante el procedi miento de co-precipitación de fosfato cálcido-ADN y la unión del mAb 9C4 se confirmó en la ausencia o presencia de 100 nM de CXCL12. La internalización de receptores se registró tal como se describe en la referencia (Hachet-Haas y otros, 2008) usando el marcado de superficies de células de EGFP con un anti-GFP de ratón monoclonal (Roche Molecular Biochemicals; dilución 1/100) como anticuerpo primario y un fragmento AffiniPure F(ab')2 R-PE-conjugado de IgG anti-ratón de cabra (Immunotech; 1/100) como anticuerpo secundario. La tinción de CXCR4 o de CXCR7 se cuantificó mediante análisis citométrico de flujo (10.000 células por muestra) sobre un citómetro (FCScalibur, Becton-Dickinson). La media de la intensidad de fluorescencia de CXCR4 o de CXCR7 se calculó usando el software CELLQuest (Bencton-Dickinson).
Citometría de flujo
El sitio de unión del péptido de la SEC ID NO 16 sobre CXCR4 se comprobó mediante análisis de citometría de flujo (FACSCalibur; Becton-Dickinson) usando el mAb CXCR4 (BD Pahrmingen, clon: 12G5; o 1D9) y mAb CCR5 (BD Parmingen, clon: CD195) anti-humano comercial. Se incubaron 2x105 células T Jurkat con péptidos a 4°C durante 30 minutos en medio libre de suero. Después de la incubación, las células se lavaron con tampón FACS (PBS FCS al 1%) mediante centrifugación y, a continuación, se tiñeron secuencialmente o bien con mAb CXCR4 o bien con mAb CCR5 anti-humano marcados con PE, a 4°C. Después de lavarlas, las células se fijaron con paraformaldehido al 4% en tampón FACS durante 5 minutos a temperatura ambiente y, a continuación, se analizaron sobre un citómetro de flujo. Los datos se procesaron mediante el uso de CELLQUEST (Becton Dickson). Para analizar la preferencia del péptido de la SEC ID NO 16, las células fantasma (parenteral, X4, Hi) se recolectaron usando la solución de disocia ción de células (Non-enzymatic 1x; Sigma; C5914) y se prepararon para análisis FACS tal como se ha descrito ante riormente.
Ensayo de unión de [35S]GTP[S]
Producción de baculovirus recombinantes. La producción de baculovirus que codifican CXCR4 humano, subunidad a-i2 de proteína G de rata, y tanto la subunidad p1 de proteína G humana como la subunidad Y3 de proteína G bovina ha sido ya descrita (Moepps y otros, 1997). La [35S]Gt P[S] se obtuvo de Perkin-Elmer (Waltham, USA). La CXCR4 se obtuvo de PeproTech (Rocky Hill, USA).
Cultivo de células de insecto y preparación de membrana: Se desarrollaron células Sf9 a 27°C en discos de cultivo de 59 cm2 en medio TNM-FH (Sigma, T 1032) suplementado con suero bovino fetal al 10% y 0,5 mg/ml de gentamicina. Para la producción de receptores recombinantes y G12 heterotrímeros, se desarrollaron células a una densidad de aproximadamente 60%, se incubaron durante 1 hora a 27°C en 2 ml por disco de medio conteniendo el baculovirus(es) recombinante(s). A continuación, las células se suplementaron con 9 ml por disco de medio recién preparado y se mantuvieron en este medio durante 48 horas a 27°C. Para la preparación de una fracción de membrana bruta, las células se granularon mediante centrifugación, y se resuspendieron en 600 pl por disco de tampón de lisis enfria do en hielo conteniendo Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, GDP 3 pM, 2 pg/ml de inhibidor de tripsina de soja, pepstatina 1pM, leupeptina 1 pM, PMSF 100 pM, y 1 pg/ml de aprotinina. Las células se homogeneizaron forzando a pasar la suspensión 6 veces a través de una aguja de 0,5 mm x 23 mm unida a una jeringuilla desechable. Después de 30 minutos en hielo, el lisato se centrifugó a 2.450 x g durante 45 segundos para separar las células y los núcleos sin romper. A partir del sobrenadante resultante se aisló una fracción de membrana bruta mediante centrifugación a
26.000 x g durante 30 minutos a 4°C. El gránulo se lavó con 300 |jl de tampón de lisis, se resuspendió en 300 |jl de tampón de lisis recién preparado, se congeló por congelación instantánea en nitrógeno líquido, y se almacenó a -80°C.
La unión de [35S]GTP[S] a membranas de células de insectos infectadas con baculovirus se ensayó tal como se ha descrito (Mopps y otros, 1997). En resumen, se incubaron membranas (10 jg de proteína/muestra) durante 60 minu tos a 30°C en una mezcla (l00 jl) conteniendo trietanolamina/HCl 50 mM, pH 7,4, EDTA 1,0 mM, MgCh 5,0 mM, GDP 10 jM, y [35S]GTP[S] 1,05 nM (1250 Ci/mmol). La incubación se terminó mediante filtración rápida a través de membranas de nitrocelulosa de 0,45 jm de tamaño de poro (Advanced Microdevices, Ambala Cantonment, India). Las membranas se lavaron, secaron, y la radioactividad retenida se determinó mediante recuento de centelleo líquido. La unión no específica se definió como la unión no competente para GTP[S] no marcado 100 jM.
Rastreo de antagonista GPCR del péptido de la SEC ID NO 16
Efecto del péptido de la SEC ID NO 16 y derivados sobre la migración de células
La migración de células Jurkat (ATCC) se analizó usando cámaras de 6,5 mm de diámetro con filtros de 5 jm de poro (Transwell, cultivo de células de 24 pocillos, Coster, Boston, MA). Se suspendieron 2 x 105 células Jurkat en 200 j l de Optimizer T-Cell Expansion SFM, y la suspensión de células se agregó a la cámara superior. A continua ción, se agregaron a la cámara inferior CXCL12 10 nM (R&D System) y/o varias concentraciones del péptido de la SEC ID NO 16 o sus derivados en 600 j l de T-Cell Expansion SFM a la cámara inferior. Las cámaras de cultivo de células se incubaron durante 150 minutos en una incubadora de cultivo de células a 37°C. Después de la incubación, las cámaras se retiraron, se tomaron 100 j l de los sobrenadantes y las células que migraron dentro del compartimento inferior se contaron o bien directamente usando un hemocitómetro o bien se analizaron usando un ensayo de viabilidad de células luminiscentes CellTiter-Glo, tal como se ha descrito anteriormente. Todos los valores represen tan la media de los números de células que migraron con relación a células tratadas únicamente con CXCL12 pro cedentes de un experimento por triplicado ± SD.
Las células madre hematopoyéticas periféricas (PHS) aisladas mediante aféresis de individuos tratados con el factor estimulante de colonias de granulocitos (GCSF) se obtuvieron del Institute of Transfusion Medicine, University Hospi tal Ulm. Las células congeladas se descongelaron cuidadosamente en tampón ACD-A al 10% diluido 1/10 (suminis trado por el Institute of Transfusión Medicine) en PBS. Se colocaron 1 x 105/200 j l de células PHS dentro de la cámara superior de placas trans-pocillo. A continuación, en cada pocillo se colocaron CXCL12 10 nM y/p varias concentraciones del péptido de la SEC ID NO 16 o sus derivados en 600 j l de medio de cultivo. Después de 3 horas, se midió la quimiotaxis usando el ensayo de viabilidad de células luminiscentes CellTiter-Glo, tal como se ha descrito anteriormente. Todos los valores representan la media de números de células que migraron con relación a células tratadas únicamente con CXCL12 procedentes de un experimento por triplicado ± SD.
Ensayo de invasión de células de cáncer
La invasión de células de células de cáncer se ensayó usando una cámara de invasión Biocoat Matrigel (BD Bio-CoatTM Matrigel™ Invasion Chamber) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se suspendieron 5 x 104 célu las DU145 (ATCC) en 300 j l deRpMI libre de suero (Gibco) conteniendo BSA al 0,1% (Kp L) y, a continuación, se agregaron a la cámara superior. A cada cámara inferior se agregaron 700 j l de medio libre de suero con o sin CXCL12 100 nM y varias concentraciones del páptido de la SEC ID NO 16. Las cámaras se incubaron durante 24 horas a 37°C en una atmósfera húmeda de 5% de CO2/95% de aire. Las células no invasoras se separaron de la superficie superior de la membrana mediante restregado. Las células invadidas frente a las del fondo de la membra na se cuantificaron usando el kit de ensayo de viabilidad de células luminiscentes CellTiter-Glo®, tal como se ha descrito anteriormente.
Efecto de antagonistas de CXCL12 y CXCR4 sobre el citoesqueleto de actina
Se estimularon células Jurkat preincubadas o bien con medio, con derivados ALB o bien con AMD3100 (todos ellos 545 jM ) con CXCL12 (10 jg/ml) a 37°C durante el tiempo indicado, se fijaron en formaldehido al 5% (Carl Roth GmBH, Karlsruhe, Alemania) y se permeabilizaron con saponina al 0,1% (Carl Roth). Se tiñó F-actina con faloidina conjugada con AlexaFluor568 (Molecular Probes, Eugene, OR) seguido de análisis citométrico de flujo de intensidad de teñido relativo.
Movilización de células progenitoras en ratones
Se alojaron ratones CS7BI/6J (Janvier, Le Genest St. Isle, Francia) en el vivario convencional del Goethe-University Medical Centre, Frankfurt, con alimento y agua sin limitación. Los ratones recibieron inyecciones i.p. de 200 j l de agua o de solución salina normal conteniendo 10 mg/ml del péptido de la SEC ID NO 16. Se extrajo sangre a los tiempos indicados después de inyección de la bolsa del carrillo después de desinfección cuidadosa de la piel. Des pués de lisis hipotónica, los leucocitos se incubaron por duplicado en medio semi-sólido comercialmente disponible repleto con citocina (3434, Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) bajo condiciones estándar. Las CFU-C se valo raron el día 7, tal como se ha descrito (Bonig y otros, 2006). Las CFU-C se normalizaron al volumen de de sangre
incubada. Todos los estudios de animales se realizaron con permiso de la IACUC local, de acuerdo con las directri ces de la AAALAC.
Trasplante de células movilizadas
Se inyectaron animales C57BL/8 con el péptido de la SEC ID NO 16 (2 mg i.p. en solución salina) o con controles de solución salina. La sangre periférica se recolectó individualmente 1 hora post-inyección, se contó, combinó y tras plantó de manera competitiva (660 pl de sangre equivalente) junto a 4x105 células C57BL/6 CD45.1 BM dentro de receptores C57BL/6 Cd45.1.
Modelo de ratón con asma
Se sensibilizaron ratones mediante inyección intraperitoneal (i.p.) los días 0, 1 y 2 de 50 pg de ovoalbúmina (OVA, Sigma-Aldrich, A5503) adsorbida sobre 2 mg de hidróxido de aluminio (Sigma-Aldrich, 23918-6) en solución salina. Los ratones se expusieron mediante instilación intranasal (i.n.) de 10 pg de OVA en 25 pl de solución salina (12,5 pl/nare) o de solución salina solamente para el ratón de control los días 5, 6 y 7 bajo anestesia (50 mg/kg de ketamina y 3,3 mg/kg de xilacina, i.p.). Dos horas antes de cada exposición a OVA se administraron el péptido de la SEC ID No 16 o ALB409-423 en solución salina i.p. (16 pmol/kg). El lavado broncoalveolar (BAL) y el recuento de células diferenciales se llevó a cabo 24 horas después de la última exposición a OVA, tal como ha sido ya informado (Rebver y otros, 2012).
Espectroscopia de RMN
Para la captación de espectros de RMN, se preparó una solución 1 mM del péptido de la SEC ID NO 16 en fosfato sódico 10 mM en H2O/D2O 10:1, ajustado a un pH final de 7,0 con HCl. Los espectros RMN-1H TOCSY y NOESY se registraron a 800 MHz, 600 MHz y 500MHz sobre espectrómetros Bruker. Los espectros captados en el equipo a 800 MHz se usaron debido a su mejor calidad. Los espectros se referenciaron a TSP externo, y se registraron usan do el procedimiento States-TPPI que incorpora la secuencia de pulsos 3-9-19 de compuerta para la supresión de agua (Jeener y otros, 1979). En general, se captaron 256 valores t1 de evolución en el tiempo igualmente espacia dos, promediándose 16 transitorios de 2048 puntos. Las matrices de datos de dominio en función del tiempo fueron todas rellenadas con ceros a 4K en ambas dimensiones, proporcionando, de esta forma, una resolución digital de 3,41 Hz/pt. Antes de la transformación de Fourier, se aplicó una ventana Lorentz-Gauss con diferentes parámetros tanto para las dimensiones t1 como t2 para todos los experimentos. Los espectros NOESY (Griesinger y otros, 1988) se obtuvieron con tiempos de mezclado (0,3 segundos) y los experimentos TOCSY (Braunschweiler y otros, 1983; Rucker y otros, 1989) se registraron usando pulsos de mezclado DIPSI2 de 0,060 segundos (Bartles y otros, 1995). Tanto los experimentos NOESY como TOCSY se realizaron a 298 K.
Asignación de picos de cruce NOESY y cálculo de estructura
La dispersión de desplazamiento químico de 1H en espectros de RMN permitió una asignación no ambigua correcta de todas las resonancias NH- y CH-alfa, así como la vasta mayoría de protones de cadenas secundarias (97,7%), usando metodología estándar, combinando espectroscopía TOCSY y NOESY. Las conexiones de la cadena princi pal secuencial se establecieron siguiendo la NOEs CHi-NHi+1 y la NHi-NHi+1.
La lista de picos para los espectros NOESY registrados con un tiempo de mezclado de 0,30 segundos se generaron mediante selección del pico interactivo usando el software XEASY (Schafer, N, 1996). Los volúmenes de picos cru zados se determinaron mediante la rutina de integración de pico automatizada, peakint (Engh, 1991) implementada en XEASY. Para el cálculo de la estructura, se sometieron un conjunto de 407 picos cruzados NOESY a cálculos CYANA (Herrmann y otros, 2002; Guntert y otros, 2003; Guntert y otros, 2004). De este conjunto de señales, 400 (98,2%) fueron asignaron como no ambiguas por el programa CYANA. Las 20 seleccionadas como mejor conforma das mostraron bajos valores de función diana CYANA (con función diana media: 0,056). La estructura tridimensional del péptido de la SEC ID NO 16 se determinó usando el protocolo estándar de asignación combinada de NOE auto mática y el cálculo de estructura del programa CYANA (versión 2.1) (Herrmann y otros, 2002; Guntert y otros, 2003; Guntert y otros, 2004). Se siguieron siete ciclos de asignación combinada de NOESY automática y cálculos de es tructura para un cálculo de la estructura final. El cálculo de la estructura comenzó en cada ciclo a partir de 100 con formadores aleatorios y se usó el programa de reasociación simulada estándar. Los 20 conformadores con los valo res de función diana CYANA final más bajos se retuvieron para análisis y pasaron al ciclo siguiente. Se aplicó la combinación restringida en el primero de los dos ciclos a todas las restricciones de distancia NOE, abarcando al menos tres restos, con el fin de minimizar la distorsión estructural por restricciones de distancia erróneas. Se usaron los parámetros covalentes de Engh y Huber. Las restricciones que implicaron grupos degenerados de protones (es decir, metilos), accidentalmente degenerados a metilenos, y protones de anillos aromáticos equivalentes, se expan dieron dentro de restricciones de distancia ambiguas entre todos los pares correspondientes de átomos de hidró geno. Los pares diastereotópicos no degenerados se permutaron periódicamente por valores de funciones diana mínimos durante la reasociación simulada en los ciclos 1-7. Se aplicaron temporalmente escasas restricciones sobre pares de ángulos de torsión y sobre ángulos de torsión de cadenas secundarias entre átomos de carbono tetrahédricos durante las fases de alta temperatura y enfriamiento del programa de reasociación simulado con el fin de favore cer las regiones permitidas de la gráfica de Ramachandram y las posiciones rotámeras aleatoriamente distribuidas,
respectivamente. La lista de enlaces de distancia superior para el cálculo estructural final está exclusivamente for mada por enlaces de distancia superior asignadas de manera no ambigua y no requiere la posible permutación de pares diastereotópicos.
Estabilidad al suero del péptido de la SEC ID NO16
Se inoculó suero humano con 1mM del péptido de la SEC ID NO 16 o derivados mejorados y se incubó a 37°C. Se tomaron muestras cada dos horas e inmediatamente se almacenaron a -20°C. Para comprobar la actividad antivírica del péptido incubado en suero, se agregaron 10 pl de las muestras a 5 x 104 /100 pl de células TZM-bl. A continua ción, las células se infectaron con 90 pl VIH-1 NL4-3, lo que dio como resultado una dilución de 20 veces de las mezclas de péptido y suero. La infectividad se midió a los 2 días después de la infección usando el kit Tropix Gal-Screen de una etapa. Para comprobar el efecto de los inhibidores de proteasa sobre la degradación del péptido de la SEC ID NO 16, el suero se suplementó primeramente con un cóctel de inhibidor de proteasa (1X Complete mini (Roche) y 1 mM de PMSF (Roche)) antes de agregar 1 mM del péptido de SEC ID NO l6.
ELISA indirecto para la detección y cuantificación del péptido de la SEC ID NO 16
Se generó un antisuero policlonal contra el péptido de la SEC ID NO 16 mediante inmunización de gallinas con el péptido de la SEC ID NO 16 (Davids Technologie GmBH, Regensburg), y se generó un anticuerpo monoclonal me diante inmunización de ratones (ViroPharmaceuticals GmBH & CoKG, Hannover) tal como se ha descrito en otra parte (Referencias). Para caracterizar la reactividad y especificidad de los anticuerpos policlonales y monoclonales, 100 pl del péptido de la SEC ID NO 16, de derivados del mismo (20 pM), o de HSA (Sigma) diluidos seriadamente se recubrieron sobre placas ELISA (Corning costar) durante una noche a 4°C. Al día siguiente, las placas se lavaron dos veces con 200 pl de tampón de lavado ELISA (KPL) y se trataron con 150 pl de albúmina de suero bovino al 1% (BSA) en PBS para bloquear las superficies no recubiertas. Después de lavados adicionales, se agregaron 100 pl de anticuerpos mono- o policlonales diluidos de seriadamente y se incubaron durante 1 hora. A continuación, las placas se lavaron y se agregaron 100 pl de Abs (anti-pollo o anti-ratón) secundarios conjugados con peroxidase de rábano picante (h Rp ) durante otra 1 hora. Después de esto, las placas se lavaron 5 veces y se agregaron 100 pl de Sure-Blue TMB 1-Component Microwell Peroxidase Substrate (KPL). El revelado del color se interrumpió mediante la adición de 100 pl de HCl 1 N a cada pocillo y las densidades ópticas se registraron usando un lector de placas de microvaloración (Molecular Devices; VMax Kinetic Microplate Reader) a 450 nm, con 650 nm como una referencia. Referencias
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Claims (6)
1. Un péptido eficaz en el bloqueo de la infección del VIH-1 NL4-3 X4-trópico, con un valor IC50 menor de 50 pM que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en
IVRFTKKVPQVS, 
IVRWTKKVPQVS, 
IVRYTKCVPQVS, 
IVRYSKKVPQC, 
IVRWTKKVPQVC, 
IVRWTCKVPQVS, 
IVRWCKKVPQVS, 
IVRWSKKVPQCS, 
IVRWSKKVPCVS, 
IVRWSKKVCQVS, 
IVRYTCKVCQVS, 
IVRYTKKVPQCS, 
2. Un péptido dímero que consiste en dos péptidos monoméricos idénticos de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los péptidos diméricos están ligados entre sí mediante un puente cisteína que está formado entre los péptidos monoméricos.
3. Un péptido de la reivindicación 1 ó 2, para su uso en el tratamiento de enfermedades neurológicas, en particular apoplejía, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple, el tratamiento del síndrome WHIM y artritis reumatoide; para el tratamiento de cánceres, en particular cánceres que muestran el receptor CRCX tal como cáncer del hígado, páncreas, próstata o cáncer de mama; para el tratamiento de la falta de mo vilización, proliferación y migración de células madre, activación de la célula T así como soporte de inmunoblastos tal como CTL/PD-1; para el tratamiento de antifibrosis; tratamiento o prevención de cicatrices; para el trata miento de trastornos cardiológicos, en particular insuficiencia cardíaca; para el tratamiento de trastornos metabólicos, en particular diabetes.
4. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, para su uso en el tratamiento de trastornos de hematopoyesis, en particular para soporte de la movilización, proliferación y migración de células madre; en el tratamiento de heridas, en particular heridas causadas por quemaduras; para el tratamiento de enfermedades víricas, en parti cular infecciones con VIH-1, VIH-2, Cytomegalo virus, Herpes simplex virus (tipo 1 y 2), Varicella zoster virus, Hepatitis A y Hepatitis B virus, Influenza virus, Polio virus, Rhino virus, Rubella virus, Measles virus, Rabas vi rus, Rous sarcoma virus, Epstein-Barr virus; y para el tratamiento de infecciones causadas por bacterias y hon gos, en particular Pseudomonas, Candida, S. aureus; para el tratamiento de procesos infecciosos, procesos in fecciosos anormales, tratamiento de trastornos del crecimiento, tratamiento de enfermedades neuronales, tras tornos de la cascada de coagulación de la sangre y hematopoyesis, enfermedades vasculares, enfermedades del sistema inmune, y para mejorar la cicatrización de heridas y huesos.
5. Un procedimiento para la fabricación de al menos uno de los péptidos de acuerdo con la reivindicación1 ó 2 mediante síntesis de fase sólida.
6. Un procedimiento de fabricación de al menos uno de los péptidos de acuerdo con la reivindicación1 ó 2, en el que los péptidos monoméricos se proporcionan y acoplan bajo condiciones de reacción oxidantes, las cuales son capaces de oxidar los enlaces SH para proporcionar enlaces -S-S-.
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