CN1308673A - 通过同源重组修饰FSHβ基因的表达 - Google Patents

Abstract

在严格条件下与FSHβ基因编码区上游的限定的基因组区杂交、或与其具有至少80%序列同一性的分离的核酸分子,以及包含所述核酸分子作为同源重组的导向序列的DNA构成物。

Description

通过同源重组修饰FSHβ基因的表达

                      发明领域本发明涉及基因组DNA。

                       发明背景

目前用治疗蛋白治疗疾病的方法包括给予在体外生产的蛋白和基因治疗。体外生产蛋白一般包括将编码目的蛋白的外源DNA引入到培养的合适的宿主细胞中。在另一方面，基因疗法包括给予患者包含目的治疗蛋白编码序列的基因工程细胞、质粒或病毒。

也可以用基因导向技术，以所需的方式通过改变某些治疗蛋白的内源基因的表达来生产所述治疗蛋白。参阅例如美国专利第5,641,670号、5,733,761号和5,272,071号；WO 91/06666、WO 91/06667和WO 90/11354，所有这些都通过引用整体结合到本文中。

                       发明概述

本发明是基于对人促卵泡激素β(“FSHβ”)基因的编码序列的5′基因组DNA的鉴定和测序。此DNA例如可以用于DNA构成物，当将该构成物通过同源重组整合到哺乳动物细胞的基因组时，所述构成物改变(例如增加)内源FSHβ基因在该细胞中的表达。“内源FSHβ基因”意指编码FSHβ的基因的基因组(即染色体)拷贝。所述构成物包含导向序列和转录调节序列，所述导向序列包括或来自于最近公开的5′非编码序列。所述转录调节序列最好在序列上与内源FSHβ基因的转录调节序列不同。所述导向序列引导所述调节序列整合到靶基因的FSHβ编码序列之中或其上游的区中，以使该调节序列可操作地连接至所述内源编码序列。所述“可操作地连接”是指所述调节序列可以指导内源FSHβ编码序列的表达。所述构成物还可以包含易于选择已稳定整合所述构成物的细胞的选择性标记基因和/或另一个可操作地连接至启动子的编码序列。

在一个实施方案中，所述DNA构成物包括：(a)导向序列，(b)调节序列，(c)外显子，和(d)剪接供体位点。所述导向序列引导其本身和元件(b)-(d)整合到靶基因的FSHβ编码序列之中或其上游的区中。一旦整合，元件(b)则可以指导元件(c)和(d)以及所述内源基因的所有下游编码序列的转录。在所述构成物中，所述外显子通常位于所述调节序列的3′，而所述剪接供体位点位于所述外显子的3′末端。

在另一个实施方案中，所述DNA构成物包括：(a)导向序列，(b)调节序列，(c)外显子，(d)剪接供体位点，(e)内含子，和(f)剪接受体位点，其中所述导向序列引导其本身和元件(b)-(f)整合，以使元件(b)-(f)处于所述内源基因之中或其上游。然后所述调节序列指导产生转录本，所述转录本不仅包括元件(c)-(f)，而且包括所述内源FSHβ编码序列。最好使所述内含子和所述剪接受体位点位于所述剪接供体位点的下游构成物中。

所述导向序列与在要发生同源重组的基因组中预先选择的靶位点同源。它包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的至少20(例如至少30、50、100或1000)个连续的核苷酸，所述SEQ ID NO：4对应于人FSHβ基因组序列的核苷酸-7454至-1417(相对于翻译起始位点编号)，所述SEQ ID NO：5对应于人FSHβ基因组序列的核苷酸-696至-155。所谓“同源”是指所述导向序列与其基因组靶位点相同或足够相似，以使所述导向序列和靶位点可以在人细胞中进行同源重组。只要同源重组可以以有效频率发生，那么小百分率的碱基对错配可以接受。为了易于同源重组，所述导向序列最好为至少约20(例如至少50、100、250、400或1000)个碱基对(“bp”)长。所述导向序列也可以包括SEQ ID NO：4或5所包含区以外的基因组序列，只要其包括这两个区之一中的至少20个核苷酸。例如，可以由位于SEQ ID NO：4和FSHβ基因的转录起始序列之间的序列衍生另外的导向序列。

由于可能存在于FSHβ基因的基因座上的多态性，在任何给定的哺乳动物物种中任何给定的基因组靶位点的核苷酸组分都可以发生微小改变。对应于SEQ ID NO：4或5的这种多态变异体(尤其是人多态变异体)的导向序列属于本发明的范围。

在同源重组时，将所述构成物的调节序列整合到细胞染色体中FSHβ基因的编码序列上游的预先选择的区中。产生的包含得自所述构成物的调节序列的新转录单位改变了靶FSHβ基因的表达。如此产生的FSHβ蛋白在序列上与未改变的内源基因编码的FSHβ蛋白可以相同，或者由于同源重组引入的变化，与野生型FSHβ相比可以包含氨基酸残基的填加、置换或减少。

改变基因表达包括使在所获得的细胞中通常沉默(即基本不表达)的基因活化(或引起表达)，增加或减少基因的表达水平，和改变基因的调节模式，使得该模式不同于在所获得的细胞中的模式。“所获得的细胞”意指在同源重组前的细胞。

使用本发明的DNA构成物改变内源FSHβ基因在哺乳动物细胞中表达的方法也属于本发明的范围。该方法包括以下步骤：(i)将所述DNA构成物引入到哺乳动物细胞中；(ii)将所述细胞保持在允许所述构成物和与所述导向序列同源的基因组靶位点之间发生同源重组的条件下，以产生同源重组细胞；和(iii)将所述同源重组细胞保持在于得自所述构成物的调节序列控制下允许表达FSHβ编码序列的条件下。至少部分所述基因组靶位点位于内源FSHβ基因的编码序列的5′。即所述基因组靶位点可以包含编码序列以及5′非编码序列。

本发明的特征还在于转染或感染的细胞，在所述细胞中所述构成物与在内源FSHβ3基因的一个或两个等位基因中的内源ATG起始密码子上游的基因组DNA进行同源重组。这种转染或感染的细胞也称为同源重组细胞，具有改变的FSHβ表达模式。这些细胞特别适用于体外生产FSHβ和通过基因疗法输送FSHβ。产生和使用这种细胞的方法也包含在本发明中。所述细胞可以来源于脊椎动物，诸如哺乳动物(例如人、非人类的灵长类、奶牛、猪、马、山羊、绵羊、猫、狗、兔、小鼠、豚鼠、仓鼠或大鼠)。

本发明还涉及通过将上述构成物经同源重组引入到宿主细胞的基因组中体外或体内产生哺乳动物FSHβ蛋白的方法。然后将所述同源重组细胞保持在使所述FSHβ蛋白可以转录、翻译和可选地分泌的条件下。

本发明的特征还在于分离的核酸，所述核酸包含SEQ ID NO：4的至少20(例如30、50、100、200或1000)个连续核苷酸或SEQ ID NO：5的至少20(例如30、50、100或200)个连续核苷酸的序列，或包含与SEQ ID NO：4或5相同、只是具有不妨碍与所述靶序列同源重组的多态变异或其它微小变异(例如少于序列的5％)的序列的类似大小部分的序列。

在一个实施方案中，本发明的分离的核酸包括SEQ ID NO：4或5的连续100个碱基对的区段。例如所述分离的DNA可以包含SEQ IDNO：4的核苷酸1-100、101-200、201-300、301-400、401-500、501-600、601-700、701-800、801-900、901-1000、1001-1100、1101-1200、1201-1300、1301-1400、1401-1500、1501-1600、1601-1700、1701-1800、1801-1900、1901-2000、2001-2100、2101-2200、2201-2300、2301-2400、2401-2500、2501-2600、2601-2700、2701-2800、2801-2900、2901-3000、3001-3100、3101-3200、3201-3300、3301-3400、3401-3500、3501-3600、3601-3700、3701-3800、3801-3900、3901-4000、4001-4100、4101-4200、4201-4300、4301-4400、4401-4500、4501-4600、4601-4700、4701-4800、4801-4900、4901-5000、5001-5100、5101-5200、5201-5300、5301-5400、5401-5500、5501-5600、5601-5700、5701-5800、5801-5900、5901-6000或5939-6038或其互补体。或者本发明的分离的核酸可以包括SEQ IDNO：5的1-100、101-200、201-300、301-400、401-500或443-542。SEQID NO：4或5的这些区段或它们的互补体也用作本发明构成物中的导向序列。

在所述分离的DNA中，所述连续核苷酸的序列没有连接至编码全长FSHβ的序列，或至少没有以和在任何天然基因组中的构型相同的构型(即分离自相同的序列)连接。因此本文使用的术语“分离的DNA”不表示染色体DNA或大段的基因组DNA(这可能掺入到粘粒或酵母人工染色体中)，染色体DNA或大段的基因组DNA不仅包括部分或全部SEQ ID NO：4或5，而且包括完整的FSHβ编码序列和所有的位于FSHβ编码序列和存在于细胞基因组中对应于SEQ ID NO：4或5的序列之间的序列。它确实包括但不限于，(i)掺入到质粒或病毒中的DNA；或(ii)作为独立于其它序列的单独分子存在的DNA，例如通过聚合酶链式反应(“PCR”)或限制性内切核酸酶处理产生的片段。所述分离的DNA最好不包含编码完整FSHβ前体(即与其内源分泌信号肽互补的FSHβ)的序列。

本发明还包括包含分离的DNA，其包含的一条链包含至少100(例如至少200、400或1000)个核苷酸长并在或高度严格或中等严格条件下与SEQ ID NO：4或5或SEQ ID NO：4或5的互补体杂交的序列。该序列没有连接至FSHβ编码序列，或至少没有以和在任何天然基因组中出现的构型相同的构型连接。所谓中等严格条件意指在Church缓冲液(7％SDS、0.5％NaHPO₄、1M EDTA、1％牛血清白蛋白)中于50℃杂交并于50℃在2×SSC中清洗。高度严格条件定义为在50％甲酰胺存在下于42℃杂交；用包含1％SDS的2×SSC于65℃第一次清洗；接着用0.1×SSC于65℃第二次清洗。

本发明还包括包含链的分离的DNA，所述链包含(1)至少100(例如至少200、400或1000)个核苷酸长并(2)与SEQ ID NO：4或5或它们的互补体的等长区段具有至少80％(例如至少85％、90％、95％或98％)序列同一性的序列。该序列没有连接至FSHβ编码序列，或至少没有以和在任何天然基因组中出现的构型相同的构型连接。

在特定多肽或核酸分子被认为与参比多肽或核酸分子具有明确百分率的同一性或保守性的情况下，通过Myers和Miller，CABIOS(1989)的算法确定同一性或保守性的百分率，所述算法收录于ALIGN程序(2.0版)或其等同程序中，在需要时使用12的隙宽补偿参数和4的缺口补偿参数。其它所有参数都设定为它们的默认状态。ALIGN的使用权很容易获得。参见例如国际互联网http：//www2.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi。

本发明的特征还在于通过提供其内源FSHβ基因已如本文所述活化的细胞，并将该细胞植入动物(例如诸如人的哺乳动物、非人类的灵长类、母牛、猪、马、山羊、绵羊、猫、狗、兔、小鼠、豚鼠、仓鼠或大鼠)中，所述细胞在所述动物中分泌FSHβ，从而将FSHβ输送给所述动物的方法。本发明还包括通过提供其内源FSHβ基因已如本文所述活化的细胞，并在允许该细胞表达和分泌FSHβ的条件下体外培养该细胞，从而产生FSHβ的方法。

本发明的分离的DNA例如可以用作用于(当与合适的下游引物共同使用时)获得内源FSHβ基因的调节区和/或编码区的上游PCR引物源，或用作指示在人染色体制备物中染色体11存在的杂交探针。它也可以如下所述用于改变内源FSHβ基因在脊椎动物细胞中表达的方法。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科技术语都具有和本发明所属领域的一般技术人员的通常理解相同的含义。以下描述了试验方法和材料，尽管与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料也可以用来实施和检验本发明。本文提及的所有的出版物、专利申请、专利和其它参考文献都通过引用整体结合到本文中。在有冲突的情况下，以本说明书包括定义为准。所述材料、方法和实施例仅起说明作用，并无限制意图。

由以下的详述和权利要求将明显看出本发明的其它特征和优势。

                   附图简述

图1是一幅示意图，显示人FSHβ基因的基因组结构。

图2是一幅示意图，显示包括在质粒pHFB2的插入片段(下部)中的人FSHβ基因的基因组区(上部)。在中间的三个条块表示其序列已公开的所述基因的基因组。

图3表示人FSHβ基因的部分序列(SEQ ID NO：1)，包括ATG起始密码子的5′序列的7,454个核苷酸。也显示了由所述编码序列编码的部分多肽序列(SEQ ID NO：2)。公开的序列具有下划线。“SD”和“SA”分别表示剪接供体位点和剪接受体位点。“成熟”表示成熟FSHβ多肽的起点。

图4是一幅显示本发明构成物的示意图。该构成物包含第一个导向序列(1)；可扩增的标记基因(AM)；选择性标记基因(SM)；调节序列；加帽位点；与人FSHβ基因的第一个非编码外显子相同的序列；未配对的剪接供体位点(SD)；和第二个导向序列(2)。黑框表示编码DNA，而线框表示非翻译序列。

图5-7是说明本发明的三个构成物的示意图。所述构成物在插入到所述质粒中的醛缩酶5′UTS的大小上不同。这些构成物包括连接至巨细胞病毒(“CMV”)启动子的编码糖蛋白α-亚基(即FSHα)的序列。图中的缩写为：“UTS”表示非翻译序列；“amp”表示氨苄青霉素；“Ori”表示复制起点；“SD”剪接供体位点；“HSV TK”单纯疱疹病毒胸苷激酶基因；“DHFR”表示二氢叶酸还原酶；“HBV”表示乙型肝炎病毒；以及“hGH”表示人生长激素。

图8是由用pGA308(图5)转染并选择在各种浓度的氨甲蝶呤存在下生长的HT-1080细胞产生的FSH的条形图。

图9表示人FSHβ转录起始位点上游的序列SEQ ID NO：4。

图10表示人FSHβ转录起始位点上游的序列SEQ ID NO：5。

图11表示用于本发明构成物的第一个导向序列(SEQ ID NO：6)。

图12表示用于本发明构成物的第二个导向序列(SEQ ID NO：5)。

                   发明详述

本发明基于对人FSHβ基因的编码序列的上游序列的核苷酸组成的研究。

FSH是在正常生殖生理学中对卵母细胞和精子维持和发育起主要作用的促性腺激素。FSH具有两个亚基α和β，后者是负责FSH生物特异性。

人FSHβ基因编码包含16个氨基酸的信号肽的129个氨基酸的前体蛋白。所述基因包含三个外显子和两个内含子，第一个外显子是非编码外显子。人FSHβ基因的基因组图谱示于图1。该图谱是基于对应于三个单独基因组区段(图1)的公开序列(HUMFSHBQ1，GenBank登录号M54912、M38644、M21219和M18536)而构建。第一个区段为720bp长并包含非转录上游序列的530bp、外显子1(63bp；非编码)和内含子1的127bp。第二个区段始于位置-152并终止于位置+367(除非另有说明，否则本文指出的所有位置均为相对于转录起始位点)。此区段包括内含子1的146bp、外显子2(165bp)和内含子2的208bp。第三个区段包含内含子2的102bp和外显子3，并延伸1,480bp通过翻译终止密码子。FSHβ编码序列的5′特异性序列以及它们在改变内源FSHβ基因表达 中的用途

为获得包含FSHβ基因上游序列的基因组DNA，用40 bp的寡核苷酸探针β2筛选在λEMBL3(Clontech目录#HL1006d)中的人淋巴细胞基因组文库。此探针由外显子1的23bp和内含子1的17bp衍生，并具有以下序列：5′TTGGCATCTACCGTTTTCAAGTGGTGACAGCTACTTTTGA 3′

               (SEQ ID NO：3)

用放射性标记的β2探针筛选大约一百万个重组噬菌体。分离一个噬菌斑，命名为克隆8-1-1-1。将来自噬菌体8-1-1-1的7.6kb的HindIII-KpnI片段亚克隆到pBluescript II SK+(Stratagene，La Jolla，CA)中，以产生包含约6.6kb的上游序列、外显子1、内含子1、外显子2和内含子2的9bp的质粒(图2)。该质粒命名为pHFB2。

利用Sanger法对pHFB2质粒测序。对序列数据组进行序列对比，以获得完整噬菌体8-1-1-1插入片段的全序列。此核苷酸序列(SEQ IDNO：1)示于图3。

所述插入片段显示包含在位置-7,454开始的FSHβ基因的7,622bp的区(图3)。包含位置-7,454至-1,417的序列(所述上游序列的6,038bp；SEQ ID NO：4)和包含位置-696至-155的序列(内含子1的542bp；SEQ ID NO：5)以前未报导过。

为改变内源FSHβ基因的表达，使用示于图4的一般方法。将SEQID NO：4的核苷酸3860至5784用作第一个(5′)导向序列，而SEQ IDNO：5用作第二个(3′)导向序列。然后将包含这些序列的DNA片段亚克隆到质粒中，以产生分别在图5-7中图示说明的导向构成物pGA308、pGA301和pGA307。这些质粒每个都包含约3.2Kb的5′导向序列和约0.5Kb的3′导向序列。

分别用每种所述质粒转染HT-1080细胞，并将其置于G418选择之下培养。大约14天后，对6孔培养平板中的G418抗性菌落计数。此外，利用ELISA对在每孔中的条件培养基进行GA-FSH表达的筛选。对产生GA-FSH的细胞进行胰蛋白酶消化并计数。然后将所述细胞稀释，并置于96孔平板中培养以产生克隆。培养大约2周后，经ELISA对克隆细胞群进行GA-FSH产生的筛选。将发现产生GA-FSH的菌落扩大培养并贮藏或进一步分析。表1概述了内源基因活化的频率和对上述克隆步骤的其它观察。

更详细研究了用pGA308转染的细胞。图8显示了在具有各种浓度氨甲蝶呤的培养基中培养的pGA308转染的HT1080细胞产生FSH的范围。标记“0.2(克隆的)”的条块表示通过有限稀释抗0.2μM氨甲蝶呤的细胞而克隆的细胞系的FSH产生。在图8中图示的结果清楚显示，较高浓度的氨甲蝶呤可以获得一天至少产生50μg/10⁶细胞的细胞系。

                                        表1

转染的质粒	G418抗性菌落的总数	FSHβ基因活化事件的总数	活化频率	分离的克隆细胞系的总数	FSHβ平均产量(ng/106细胞·24小时)
						pGA301	38012	3	1/12671	11	465
pGA307	31068	3	1/10356	20	450
						pGA308	27474	4	1/6869	16	521

一般方法学改变内源FSHβ表达

使用上述FSHβ上游序列，采用如在美国专利第5,641,670号中一般描述的方法，可以改变内源人FSHβ基因的表达。在图4中显示了一个策略。在此策略中，设计的导向构成物包括与所述基因上游的第一个靶位点同源的第一个导向序列、可扩增的标记基因、选择性标记基因、调节区、加帽位点、外显子、未配对的剪接供体位点和对应于所述第一个靶位点下游的第二个靶位点并终止于FSHβ编码序列之中或上游的第二个导向序列。在此策略中，在同源重组之前所述第一个和第二个靶位点在所述染色体中紧接，但这种构型不是必需的(也参见下文)。同源重组细胞将产生mRNA前体，其对应于外源外显子和剪接供体位点以及在所述剪接供体位点和FSHβ基因的转录终止序列之间的任何序列，包括FSHβ内含子、外显子和3′非翻译区(图4)。剪接此信息产生其中外源外显子与内源FSHβ基因的外显子2融合的mRNA。翻译mRNA产生前体FSHβ。

也可以使用其它的方法。例如，所述第一个和/或第二个靶位点可以位于FSHβ基因的第一个内含子中。在另一方面，设计的所述DNA构成物由5′至3′可以包括第一个导向序列、可扩增的标记基因、选择性标记基因、调节区、加帽位点、外显子、剪接供体位点、内含子、剪接受体位点和第二个导向序列。对于此策略，为了避免不需要的ATG起始密码子，所述第二个靶位点的5′末端最好小于正常FSHβ转录起始位点上游的40 bp。由同源重组基因座产生的mRNA前体包括外源外显子、外源剪接供体位点、外源内含子、外源剪接受体位点和在外源剪接受体位点和内源FSHβ基因的转录终止位点之间的任何序列。剪接此转录本将产生可以翻译其产生人FSHβ前体的mRNA，它或者具有正常FSHβ分泌信号序列，或者具有基因工程分泌信号序列。外源内含子的大小和由此外源调节区相对于所述内源基因编码区的位置可以改变，以使所述调节区的功能最佳。

在任何活化策略中，所述第一个和第二个靶位点互相之间不需要紧接或甚至相近。当它们互相之间不紧接时，FSHβ基因的正常上游区的一部分和/或所述编码区的一部分在同源重组时应缺失。

如果需要，可以在表达人糖蛋白α-亚基(FSHα)基因的细胞类型中生产活化的FSHβ基因的产物，FSHα基因的产物和FSHβ基因的产物形成异源二聚体。这可能是天然产生的细胞株或细胞系。另一方面，所述人糖蛋白α-亚基基因(Genbank序列HUMGLYCA1)可以和FSHβ基因的产物共表达，这种共表达通过在合适的启动子控制下表达所述人糖蛋白α-亚基基因或cDNA完成，或通过本文描述的方法活化所述人糖蛋白α-亚基基因完成。

作为实施例，编码糖蛋白α-亚基的序列可以包括在所述DNA构成物中。此编码序列置于调节序列的转录控制之下，所述调节序列与将指导内源FSHβ基因表达的调节序列具有相同或不同的核苷酸组成。图5-7图示说明了这些构成物的实施例。DNA构成物

本发明的DNA构成物至少包括导向序列和调节序列。它还可以包括外显子；或外显子和未配对的剪接供体位点；或外显子、剪接供体位点、内含子和剪接受体位点。如果所述外显子存在，则位于所述调节序列的3′，而所述未配对的剪接供体位点位于所述外显子的3′末端。如果存在所述内含子和所述剪接受体位点，则它们位于所述剪接供体位点的3′。另外，在位于所述未配对的剪接供体位点侧翼的所述外显子之前(即其5′)可以有多个外显子和内含子(以及合适的剪接供体和受体位点)。在所述构成物中的DNA被认为是外源，因为该DNA不是宿主细胞基因组的原始部分。外源DNA可以具有与在通过病毒载体转染或感染之前的细胞中存在的部分内源基因组DNA相同或不同的序列。本文使用的“转染”是指通过化学或物理方法，诸如磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染、电穿孔、微注射、微粒轰击或biolistic介导的摄取，将质粒引入到细胞中。本文使用的“感染”是指通过病毒感染将病毒核酸引入到细胞中。在下文详细描述了包括于本发明的DNA构成物中的各种元件。

所述DNA构成物还可以包括顺式作用或反式作用病毒序列(例如包装信号)，从而能够将所述构成物经病毒载体感染输送到细胞的核中。必要时，所述DNA构成物可以由病毒生活周期的各步(诸如在逆转录病毒中整合酶介导的整合或附加体维持)中脱离出来。通过病毒序列的合适的缺失或突变，诸如在逆转录病毒载体中整合酶编码区的缺失，可以实现脱离。关于所述构建的其它细节和病毒载体的用法见于Robbins等人，Pharmacol.Ther.80：35-47，1998；和Gunzburg等人，Mol.Med.Today 1：410-417，1995，通过引用结合到本文中。导向序列

导向序列使得目的序列可以同源重组到在宿主基因组中选择的位点。导向序列与其在宿主基因组中相应的靶位点同源(即能够与其同源重组)。

环状DNA构成物可以使用一个单一的导向序列，或两个或两个以上单独的导向序列。线性DNA构成物可以包含两个或两个以上单独的导向序列。与已知的导向序列同源的靶位点可以位于FSHβ基因的外显子和/或内含子之中、位于FSHβ编码区的上游并与其紧接或位于FSHβ编码区的上游并与其有一段距离。

在所述构成物中的两个导向序列的第一个(或者如果在该构成物中只有一个导向序列，则是整个导向序列)至少部分得自新近公开的FSHβ编码序列的上游基因组区。此导向序列包含SEQ ID NO：1的一部分，例如对应于位置-7,454至-1,417(SEQ ID NO：4)或位置-696至-155(SEQ ID NO：5)的序列的至少20个连续的核苷酸。在所述构成物中的两个导向序列的第二个可以导向所述编码序列的上游基因组区(例如也包含SEQ ID NO：4或5的一部分)或导向所述基因的外显子或内含子。

所述导向序列另外可以包括得自先前已知的FSHβ基因区的序列，所述FSH基因区包括本文描述的那些区，以及在结构上未特征鉴定但本领域技术人员可以作出图谱的上游更远的区。

可以利用基因组片段与包含全部或部分SEQ ID NO：4或5的探针杂交的能力，鉴定用作导向序列的所述基因组片段。所述探针可使用得自SEQ ID NO：1的引物经PCR产生。调节序列

所述DNA构成物的调节序列可以包含一个或多个启动子(例如组成型启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子)、增强子、支架构成物相关区或基质附着部位、负调节元件、转录因子结合位点，或这些元件的组合。

所述调节序列可以得自真核生物(例如哺乳动物)或病毒基因组。有用的调节序列包括但不限于调节SV40早期或晚期基因、巨细胞病毒基因和腺病毒主要晚期基因表达的那些调节序列。它们还包括得自编码小鼠金属硫蛋白-I、延伸因子-1α、胶原蛋白(例如胶原蛋白Iα1、胶原蛋白Iα2和胶原蛋白IV)、肌动蛋白(例如γ-肌动蛋白)、免疫球蛋白、HGM-CoA还原酶、甘油醛磷酸脱氢酶、3-磷酸甘油酸激酶、胶原酶、溶基质素、纤连蛋白、波形蛋白、纤溶酶原激活物抑制剂I、胸腺素β4、组织金属蛋白酶抑制剂、核糖体蛋白、主要组织相溶性复合体分子和人白细胞抗原的基因的调节区。

所述调节序列最好包含转录因子结合位点，诸如TATA框、CCAAT框、AP1、Sp1或NF-κB结合位点。标记基因

如果需要，所述构成物可以包括编码目的多肽、可操作地连接至其自身启动子的序列。其实例应为选择性标记基因，它可用来易化对导向事件的鉴别。可扩增的标记基因也可以用来易化对具有共扩增的侧翼DNA序列的细胞的选择。可以通过在选择可扩增基因表达的介质存在下培养，鉴别包含可扩增标记基因的扩增拷贝的细胞。活化的内源基因通常将同扩增的选择性标记基因一起扩增。包含多拷贝的活化内源基因的细胞可以产生很高水平的FSHβ，并因此可用于体外产生蛋白和基因治疗。

选择性标记基因和可扩增的标记基因互相之间不必处于紧接状态。可扩增的标记基因和选择性标记基因可以是相同的基因。一个或两个所述标记基因可以位于所述DNA构成物的内含子中。在美国专利第5,641,670中描述了合适的可扩增的标记基因和选择性标记基因。外源外显子

DNA构成物可以进一步包含外显子，即拷贝到RNA中并存在于成熟mRNA分子中的DNA序列。在所述构成物中的外显子在本文中称为外源或由所述构成物产生的外显子。所述外源外显子可以同人FSHβ基因的第一个外显子一样是非编码的，实际上在序列中它可以和后一个外显子可选地相同。在另一方面，所述外源外显子编码一个或多个氨基酸残基，或部分编码氨基酸残基(即包含密码子的一个或两个核苷酸)。当所述外显子包含编码序列时，设计的所述DNA构成物应在转录和剪接时使得产生的mRNA的读框与靶FSHβ基因的编码区的读框符合。即将所述外源外显子以不改变产生自内源外显子的mRNA部分的合适读框的方式剪接至内源外显子。

在所述DNA构成物中包含编码外显子使得可产生包含内源FSHβ蛋白序列和外源蛋白序列的融和蛋白。这种杂合蛋白可以将两种或两种以上蛋白的构成物、酶或配体结合或受体结合特性组合到一种多肽中。例如所述外源外显子可以编码细胞膜锚着点、改善细胞分泌的信号肽、前导序列、酶区、辅因子结合区或易于纯化由重组基因的基因座产生的FSHβ杂合蛋白的附加表位。剪接供体位点

剪接供体位点位于所述外源外显子的3′末端侧翼。剪接供体位点是一个序列，它控制将RNA转录本的一个外显子剪接至该RNA转录本的另一个外显子的剪接受体位点。通常，第一个外显子位于第二个外显子的5′，而位于第一个外显子的3′末端的所述剪接供体位点与位于第二个外显子5′一侧的剪接受体位点匹配。剪接供体位点具有特征性的表示为(A/C)AGGURAGU(其中R表示嘌呤)的共有序列，GU必须在第4和第5位(Jackson，Nucleic Acids Research19：3715-3798，1991)。所述剪接供体共有序列的前三个碱基是所述外显子的最后三个碱基：即它们未被剪除。剪接供体位点的功能定义为其对在mRNA剪接途径中合适反应的影响能力。

作为实施例，当一个或多个间插核苷酸的存在对于使所述外源外显子符合靶基因的第二个外显子读框不是必需时，所述剪接供体位点与ATG密码子紧接排列并位于其3′。当所述外源外显子编码一个或多个符合靶基因的编码序列读框的氨基酸时，所述剪接供体位点最好可与所述外源编码序列在其3′一侧紧接排列。

位于所述外源外显子侧翼的剪接供体位点在所述构成物中是未配对的，即在所述构成物自身中剪接供体位点的下游没有伴随的可以被剪接至剪接供体位点的剪接受体位点。在同源重组到FSHβ编码序列的上游靶位点后，所述构成物的未配对的剪接供体位点以功能方式和FSHβ的内源外显子的内源剪接受体位点配对。加工由同源重组的FSHβ基因产生的转录本导致将所述外源外显子剪接至内源外显子的剪接受体位点。

本发明的构成物也可以包括剪接受体位点。此位点与剪接供体位点一起，控制将一个外显子剪接至另一个外显子。剪接受体位点具有特征性的表示为(Y)₁₀NYAG(SEQ ID NO：7)的序列，其中Y表示任何嘧啶，而N表示任何核苷酸(Jackson，Nucleic Acids Research19：3715-3798，1991)。内含子

DNA构成物可以可选地包含内含子。内含子是位于剪接供体位点和剪接受体位点之间的一个或多个核苷酸的序列，在形成成熟mRNA分子时通过剪接将其由前体RNA分子中去除。加帽位点

所述DNA构成物可以可选地包含加帽位点。加帽位点是与所述调节区有关并由其使用的特异性转录起始位点。此加帽位点在所述构成物中位于对应于所述调节序列的位置，以便同源重组后，所述调节序列指导在所述加帽位点开始合成转录本。或者，在所述构成物中不包括加帽位点，转录装置将由于在靶基因中缺乏用作加帽位点的合适位点而定位。另外的DNA元件

所述构成物可以另外包含影响通过同源重组产生的RNA或蛋白的构成物或稳定性的序列。所述DNA构成物可选地可以包括细菌复制起点和细菌抗生素抗性标记或其它的选择性标记，它们便于在细菌或任何其它合适的克隆/宿主系统中大规模繁殖质粒。

所述DNA构成物的所有上述元件互相之间都可操作地连接或以功能方式排列。即在所述构成物和靶基因组DNA之间同源重组时，所述调节序列可以指导初级RNA转录本的产生，所述初级RNA转录本起始于加帽位点(可选地包括在所述构成物中)，并包括(i)对应于所述构成物的外显子和剪接供体位点(如果它们存在)的序列，和(ii)位于所述剪接供体位点和内源基因的转录终止位点之间的序列。后一序列可以包括FSHβ基因的内源调节区以及邻近该区的通常不被转录的序列。在可操作地连接的构型中，所述导向构成物的剪接供体位点指导剪接至所述内源FSHβ基因的一个外显子侧翼的剪接受体位点的剪接事件，使得可以由完全剪接的成熟转录本产生目的蛋白。所述剪接受体位点可以是内源的，使得将剪接事件导向内源外显子。在另一个所述剪接受体位点包括于所述导向构成物的实施方案中，所述剪接事件去除了由所述导向构成物引入的外源内含子。

在所述DNA构成物中元件的顺序可以改变。当所述构成物是环状质粒或病毒载体时，在产生的构成物中元件的相对顺序例如可以是：导向序列、质粒DNA(包含在微生物和其它适合的宿主中用于选择和/或复制导向质粒的序列)、选择性标记、调节序列、外显子和未配对的剪接供体位点。

当所述构成物为线性时，该顺序例如可以是：第一个导向序列、选择性标记基因、调节序列、外显子、剪接供体位点和第二个导向序列；或为另一种顺序：第一个导向序列、调节序列、外显子、剪接供体位点、选择性标记基因和第二个导向序列。所述元件的顺序还可以是：第一个导向序列、选择性标记、调节序列、外显子、剪接供体位点、内含子、剪接受体位点、可选地内部核糖体进入位点和第二个导向序列。

另一方面，所述顺序可以是：第一个导向序列、第一个选择性标记基因、调节序列、外显子、剪接供体位点、第二个导向序列和第二个选择性标记基因；或为：第一个导向序列、调节序列、外显子、剪接供体位点、第一个选择性标记基因、第二个导向序列和第二个选择性标记基因。在位于所述第一个选择性标记侧翼的导向序列和在宿主基因组中的同源序列之间的重组导致所述第一个选择性标记的定向整合，而所述第二个选择性标记未被整合。目的转染或感染的细胞是那些用第一个选择性标记而不是第二个选择性标记稳定转染或感染的细胞。可以通过在包含选择第一个标记表达的介质和选择抗第二个标记的另一种介质的培养基中生长，选择这类细胞。预计已通过非同源重组机制不正确整合导向构成物的转染或感染的细胞应表达所述第二个标记基因，从而在所述培养基中被杀死。

有时在所述构成物中包括正选择性标记，以便于选择包含该标记的扩增拷贝的细胞。在此实施方案中，构成物元件的顺序例如可以是：第一个导向序列、可扩增的正选择性标记、第二个选择性标记(可选的)、调节序列、外显子、剪接供体位点和第二个导向DNA序列。

所述构成物的各种元件可以由天然来源(例如基因组DNA)获得，或者可以使用基因工程技术或合成方法产生。所述构成物的调节区、加帽位点、外显子、剪接供体位点以及可选的内含子和剪接受体位点可以作为完整单元由例如人延伸因子-1α(GenBank序列HUMEF1A)基因或巨细胞病毒(GenBank序列HEHCMVP1)立即早期区中分离。这些元件还可以由单独基因分离。转染或感染和同源重组

可以将本发明的DNA构成物作为单一的DNA构成物或作为加入到转染或感染细胞的染色体或核DNA中的分开的DNA序列，引入到诸如原代细胞、继代细胞或无限增殖化细胞的细胞中。所述DNA可以作为线性、双链(在一个或两个末端具有或不具有单链区)、单链或环状分子引入。所述DNA构成物及其RNA相应物还可以作为病毒核酸引入。

当将所述构成物以两个独立的DNA片段引入到宿主细胞中时，所述两个片段在一个片段的3′末端和在另一个片段的5′末端具有DNA序列同源性(重叠)，同时一个片段具有第一个导向序列，而另一个片段具有第二个导向序列。当引入到细胞中时，所述两个片段可以进行同源重组，以形成在原来两个片段之间的重叠区侧翼具有第一个和第二个导向序列的单个分子。于是产物分子的形式适于和细胞靶位点同源重组。可以使用多于两个的片段，设计它们中的每一个，以使它们互相之间进行同源重组，以最终形成适于同如上所述的细胞靶位点同源重组的产物。

本发明的DNA构成物如果自身不含有选择性标记，则其可与包含这种标记的另一个构成物共转染或共感染。可以用限制酶在一个或多个位点切割导向质粒，以在转染或感染前产生线性或有缺口的分子。产生的游离DNA末端增加了目的同源重组事件的发生频率。此外，可以用外切核酸酶处理所述游离的DNA末端，以产生突出的5′或3′单链DNA末端(例如至少30个核苷酸长，最好100-1000个核苷酸长)，增加目的同源重组事件的发生频率。在此实施方案中，在所述导向序列和基因组靶之间的同源重组将产生两个拷贝的所述导向序列，位于包含在引入的质粒中的元件侧翼。

可以通过各种物理或化学方法，包括电穿孔、微注射、微粒轰击、磷酸钙沉淀、脂质体输送或Polybrene或DEAE葡聚糖介导的转染，(最好在体外)将所述DNA构成物转染到细胞中。

如本领域所述，将转染或感染的细胞保持在允许同源重组的条件下(参阅例如Capecchi，Science 24：1288-1292，1989)。所述“转染细胞”是指通过非使用病毒载体的方法将DNA分子引入到其中(或其祖先中)的细胞。所述“感染细胞”是指使用病毒载体将DNA或RNA分子引入到其中(或其祖先中)的细胞。已知可用作载体的病毒包括腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、慢病毒、逆转录病毒、新培斯病毒和诸如金丝雀痘病毒的痘菌病毒。当将所述同源重组细胞保持在足以允许所述DNA转录的条件下时，由所述DNA构成物引入的调节区将改变FSHβ基因的转录。

可以通过表型筛选或通过用针对FSHβ的酶联免疫吸附测定(ELISA)分析培养上清液，鉴定同源重组细胞(即已进行目的同源重组的细胞)。可由Accurate Chemical and Scientfic(Westbury，NY)获得检测FSHβ的市售ELISA试剂盒。还可以通过DNA和RNA分析或通过聚合酶链式反应(PCR)筛选，鉴定同源重组细胞。

本文使用的术语“原代细胞”包括(i)存在于分离自脊椎动物组织源的细胞悬浮液中的细胞(在它们平板培养之前，即使它们附着到诸如皿或烧瓶的组织培养基体中之前)，(ii)存在于得自组织的外植块中的细胞，(iii)第一次平板培养的细胞，和(iv)由这些平板培养细胞产生细胞悬浮液。原代细胞也可以是在人或动物中天然产生的细胞。

继代细胞是在随后的所有培养步骤的细胞。即第一次由培养基体中取出平板培养的原代细胞并再次平板培养(传代细胞)，本文将它们称为继代细胞，它们是在随后传代中的所有细胞。继代细胞株包括已经传代一次或几次的继代细胞。通常继代细胞表现出在培养中平均群体倍增次数有限，并具有接触抑制、贴壁依赖性生长的特性(贴壁依赖性不适用于在悬浮培养中繁殖的细胞)。原代和继代细胞不是无限增殖化的。

无限增殖化细胞是在培养中表现出生活期限明显无限的细胞系(与细胞株相反，定义“株”专供原代和继代细胞之用)。

选择用于转染或感染的细胞可以分为四种类型或四类：(i)获得的产生或包含不超过痕量的FSHβ蛋白的细胞，(ii)产生或包含蛋白的细胞，但蛋白量不是所需的量(诸如其量低于所获得的细胞类型生理正常的水平)，(iii)在所获得的细胞类型生理正常的水平上产生蛋白的细胞，但其含量或产量将增大或增强，和(iv)需要改变其中的编码所述蛋白的基因的调节或诱导模式的细胞。

通过本发明方法转染或感染的原代、继代和无限增殖化细胞可以由各种组织获得并包括可以在培养中保持的所有合适的细胞类型。例如，合适的原代和继代细胞包括成纤维细胞、角质形成细胞、上皮细胞(例如乳房上皮细胞、肠上皮细胞)、内皮细胞、神经胶质细胞、神经细胞、血液的组成组分(例如淋巴细胞、骨髓细胞)、肌细胞和这些体细胞类型的前体。当要在基因治疗中使用所述同源重组细胞时，最好由要给予转染或感染的原代或继代细胞的个体获得原代细胞。然而，可以由相同物种的供体(即不是受体的个体)获得原代细胞。

可用于蛋白生产或基因治疗的无限增殖化细胞系的实例包括但不限于，2780AD卵巢癌细胞(Van der Blick等，Cancer Res.，48：5927-5932，1988)、A549(美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)CCL 185)、BeWo(ATCC CCL 98)、Bowes黑素瘤细胞(ATCC CRL 9607)、CCRF-CEM(ATCC CCL 119)、CCRF-HSB-2(ATCC CCL 120.1)、COLO201(ATCC CCL 224)、COLO205(ATCC CCL 222)、COLO320DM(ATCC CCL 220)、COLO 320HSR(ATCC CCL 220.1)、Daudi细胞(ATCC CCL 213)、Detroit 562 (ATCC CCL 138)、HeLa细胞及HeLa细胞衍生物(ATCC CCL 2、2.1和2.2)、HCT116(ATCC CCL247)、HL-60细胞(ATCC CCL 240)、HT1080细胞(ATCC CCL 121)、IMR-32(ATCC CCL 127)、Jurkat细胞(ATCC TIB 152)、K-562白血病细胞(ATCC CCL 243)、KB癌细胞(ATCC CCL 17)、KG-1(ATCCCCL 246)、KG-1a(ATCC CCL 246.1)、LS123(ATCC CCL 255)、LS174T(ATCC CCL CL-188)、LS1 80(ATCC CCL CL-187)、MCF7乳癌细胞(ATCC BTH 22)、MOLT-4细胞(ATCC CRL 1582)、Namalwa细胞(ATCC CRL 1432)、NCI-H498(ATCC CCL 254)、NCI-H508(ATCC CCL 253)、NCI-H548(ATCC CCL 249)、NCI-H716(ATCC CCL251)、NCI-H747(ATCC CCL 252)、NCI-H1688 (ATCC CCL 257)、NCI-H2126(ATCC CCL 256)、Raji细胞(ATCC CCL 86)、RD(ATCCCCL 136)、RPMI2650(ATCC CCL 30)、RPMI8226细胞(ATCC CCL155)、SNU-C2A(ATCC CCL 250.1)、SNU-C2B(ATCC CCL 250)、SW-13(ATCC CCL 105)、SW48(ATCC CCL 231)、SW403 (ATCC CCL230)、SW480(ATCC CCL 227)、SW620(ATCC CCL 227)、SW837(ATCC CCL 235)、SW948(ATCC CCL 237)、SW1116(ATCC CCL233)、SW1417(ATCC CCL 238)、SW1463(ATCC CCL 234)、T84(ATCC CCL 248)、U-937细胞(ATCC CRL 1593)、WiDr(ATCC CCL218)和WI-38VA13亚系2R4细胞(ATCC CCL 75.1)以及通过融合人细胞和其它物种的细胞产生的异种杂交瘤细胞。可以使用次级人成纤维细胞株，诸如WI-38(ATCC CCL 75)和MRC-5(ATCC CCL171)。此外，原代、继代或无限增殖化人细胞，以及来自其它物种的原代、继代或无限增殖化细胞，可以用于体外生产蛋白或基因治疗。表达FSHβ的细胞

本发明的同源重组细胞以所需的水平表达FSHβ，并可用于体外生产FSHβ和基因治疗。生产蛋白

按照本发明的同源重组细胞可以用于体外生产FSHβ。所述细胞保持在本领域描述的导致表达蛋白的条件下。可以由细胞裂解物或细胞上清液中纯化所述FSHβ蛋白。可以通过本领域已知的常规药物途径(例如口服、静脉内、肌内、肠内、肺、经粘膜、皮内、经皮、直肠、鞘内、皮下、腹膜内或病灶内途径)，将包含所述FSHβ蛋白的药用组合物输送给人或动物。口服可能需要采取保护蛋白免受胃肠道降解的措施：例如通过在高分子微囊中包胶囊。基因治疗

本发明的同源重组细胞可用作同源重组细胞系群、同源重组原代或继代细胞群、同源重组克隆细胞株或细胞系、同源重组异源细胞株或细胞系以及细胞混合物，在该混合物中至少存在一种代表前述四类同源重组细胞之一的细胞。这些细胞可在输送体系中用于治疗不育、增强人或动物的生育力或治疗任何其它可用FSHβ治疗的病症。

将同源重组原代细胞、克隆细胞株或异源细胞株以足够的量通过合适的途径，给予要治疗或预防不正常或不良症状的个体，以表达或产生生理学相关水平的蛋白或外源DNA。生理学相关水平是接近体内通常产生所述产物的水平或导致不正常或不良症状改善的水平。如果所述细胞与具有免疫能力的受体同源，则所述细胞可以静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、网膜内、肾被膜下(subrenal capsularly)、鞘内、颅内或肌内给予或植入。

如果所述细胞不同源而所述受体具有免疫能力，则可以将要给予的所述同源重组细胞放入一个或多个半透性屏障装置中。所述装置的透性特性使得在将所述细胞植入到受试者中时防止其离开所述装置，但治疗性蛋白可以自由透过，并可以离开所述屏障装置进入植入体附近的局部区域或进入系统循环。参见例如美国专利第5,641,670、5,470,731、5,620,883、5,487,737号和1999年4月16日提交的定名为“治疗性蛋白的输送”的共有美国专利申请(发明人：Justin C，Lamsa和Douglas A.Treco)，所有这些都通过引用结合到本文中。所述屏障装置可以在任何合适的位置植入：例如腹膜内、鞘内、皮下、肌内、肾被膜内或网膜内。

屏障装置特别有用，使得可植入同源重组无限增殖化细胞、来自其它物种的同源重组细胞(同源重组异种细胞)或来自非组织相容性匹配供体的细胞(同源重组同种异体细胞)以治疗受试者。所述装置将细胞保留在体内的固定位置，同时保护所述细胞免受宿主免疫系统的攻击。当治疗方法由于任一原因要停止时，屏障装置还通过使所述细胞立即去除，提供方便的短期(即过渡)治疗。在没有用于短期基因治疗的屏障装置的情况下，也可以使用转染或感染的异种细胞和同种异体细胞。在此情况下，将在体内输送由所述细胞产生的FSHβ，直至宿主的免疫系统排斥所述细胞为止。

为此目的可以使用许多合成、半合成或天然的过滤膜，包括但不限于，纤维素、乙酸纤维素、硝化纤维、聚砜、聚偏二氟乙烯、聚氯乙烯聚合物和聚氯乙烯衍生物的聚合物。可以使用屏障装置，以使得来自其它物种的原代、继代或无限增殖化细胞可用于人类的基因治疗。

可用于本发明的基因治疗的另一类装置是其中包埋所述细胞的可植入的胶原基质。在WO 97/15195中描述了这种可以包含将所述细胞附着于其上的微珠的装置，该文献通过引用结合到本文中。

给予剂量或植入需要的细胞的数量取决于几种因素，包括所述蛋白的表达水平、宿主动物的大小和病症以及与植入方法相关的限制。通常在成年人或其它类似大小的动物中植入的细胞的数量在1×10⁴至5×10¹⁰的范围内，最好为1×10⁸至1×10⁹。如果需要，它们可以在患者的多个部位同时或者在几个月或几年的时间内植入。所述给予可以根据需要重复。

                   其它实施方案

应当理解，虽然已经描述了本发明及其详述，但先前的描述意在说明，并不限制由所附权利要求书的范围确立的本发明的范围。

其它方面、优势和修改在以下权利要求书的范围内。

                                        序列表<110>  Transkaryotic Therapies Inc.<120>  生产和输送蛋白的基因组序列<130>  07236/016WO1<150>  US 60/084,665<151>  1998年5月7日<160>  7<170>  FastSEQ for Windows，版本3.0<210>  1<211>  7622<212>  DNA<213>  Homo sapiens<400>    1ggatccgaga acatagaagg agcaggtaat ttatcaaggc atgaacacgg gtgcttaatt       60tcctattttg aggccaggca tggtggctca cacctgtaat cccaacactt taggaagcca      120aggtgggtgg attgcttgag tctaggattt tgagaccagc ctggccaaca tggcgaaatc      180ctgtctctac taaaaatact aaaattaacc agtcatggtg gtggtgtgcc tttagtccca      240gctactctgg tggctgaggc acaagaatca cttgaacctg ggaggcagag gttgcagtga      300gctgagactg tgccacttca ctccagcctg ggtgacagag taagattctg tctcaaaaaa      360tatgtatata tacacacata taatagatac ataaacatat atacatatat aatatataaa      420tatatatatt atatataata tataaacata tataaatata tatatatata tatatatata      480tatataaacc aaacataaag gaataatttt gggggaaaat cttcataaat gaaagaacaa      540cataggctgt tgagtatatg cacagaaatt caagagatct tccagcaatt gaagacattg      600gtttaccaga attcacaaaa gaagtcagct gtgcatttaa agtagaatgt gatgagtgtt      660accactgagg taggaactgg gaactaagga agcgtaagac agaaagtgct gaactgagag      720ttgggcattg gaggctgtgt aaggcagggt aagtgaatgt ctcctagaag ctacctttaa      780atggagtttt gaagtacttg taggagtagc ttaggtgaaa agaagaggag aaacatgtat      840caggcagagg gactagaacc ttattacctt caaagaagaa gcaaaaagaa tacatgtgac      900tttgaggtgg tgggaggtgc tttaagccaa tataggtgaa tttgacatag gacttcccta      960aataatgttc ggtcatttgt taaatattga gtgatatatc actgtattaa agcccaagag     1020ttgcttttat atagaaagaa gaaaaaagcc caagagagtt ttatttctag agggaatatt     1080ttctagaaat aaaggaaggt gtatcagcca gtttctagtc aggaaaacag aaatcacacc     1140tgatatgcaa aatagaggaa aatcagggaa ttcattaatc cagagatttg gttgctcaag     1200tattagattg ctgaaaagcc agacagggaa tatgaggcaa tcagagataa gtattagtga     1260caagctccat ttatgtgcag gattggaggg acataggtgg ggttcccaga agccagaagg     1320tgagaccacc tagcagaagc tcaaaccaca gctggggttt cctcacaaaa gctgggacca     1380ccaggaggag ctgtccaatg ggatctggag ccagggagat catgcagtca ctaccaggaa     1440gggaagcaga atgtaaaagg tagagagaaa tactccaact gcttccttgc attcactttc     1500caatctccat tcacaaaggc aaaaacctgc taatacagca gagtgggaaa agcagcctgc     1560caaggtcctt tctcccacaa aacagagcac aaaaccaagc aaaaacaagg aatgcatttg     1620atagcaaaca ggctatggac caacccaaca taaaagaaat gatgagtgat ttcttttttc     1680atttggttca agaaaagtat ttcagtaact attatgtaac agaaattcta tttattttgg     1740ggaattcaaa ggtgaataaa aaagaactct aaatttttat caataaaata tttcaaaaac     1800ctcaatgaga gtaatggcat taactagcaa atatgctaat gagatgagct agccataaga     1860ggcttagaat tgagagaaag gtctgggggc ctcttgacag gccaaattca gagctgtttg     1920tgggaatctc tgacctaact gcaggtggaa atataaatat gggcatttag aatagtggcc     1980caaactttgg atgatttctg tcttggggtc tctccaatta atgggattga tgagaactgt     2040agaccactga ggtcaccatg gctcaatgaa tagtcccctg gctttggagt caaactgacc     2100tgaatatgaa ccccagcttt gctacttaca ggttgcattt atcctcagtt ttctcatctt     2160tcaaagaaga acagtaactt ctttaaaagg ttattgtagg ctgggtgcag tggctcacgc     2220ctgtaatcgc agcactttgg gaggcggagg ctagtggatc acttgaggcc aggagttgga     2280aactagcctg gccaacatgg tgaaactctg tctctacaaa aagaaattta aaaaattttg     2340ctgggtgtgg tggcacacac ctggaattcc agctacctgg gaggccgagg catgagcatc     2400acttgagtct ggaaagcaga gggttgcagt gagccaagat tgtaccactg tactcaagcc     2460tgggtgacac agtgagacct tgtctaaaaa aaaaaaaggt tattgtgtta ttgtaaatat     2520tgtatatgaa cttctattta acatgtttag ttaaatgcct gtgtaattgt ccaatgtgct     2580cttctagctc actgcacaga caaaactgat tcactgaaat catggaattg cagcaaagaa     2640caaatctaat taatgtaggt caaacgggag gactggagtt attattcaaa tcagtctccc     2700tgaaaactca gaggctaggg ttttatggat aatttggtgg gcaggggact agggaatggg     2760tgctgctgat tggttgggga atgaaatagt aagattgtgg aaaactgtcc tccttcattg     2820agtctgcttc cgggtgtagg ccacacgacc agttgagtca tgaagcatgc gtccaagtgg     2880agtcagtttg ttgccagaat gcaaaagcct gaaaaatgtc tcaaatgatc aactgtaggc     2940tccacaataa tgatattatc tataggagca attggggaag taacaaatct tgtgacctct     3000ggacacataa ctcctgaact agtaagggat tataaaaacc atgcctatat cttatcagaa     3060ttcaggtccc cccataatcc taatctcaca gcatttcatt tgtttagaaa ggccattttc     3120agtccctgag caaggagggg gttagtttta ggataggact attatccttg cttcgttaaa     3180ctataaacta aattcctccc atggttagct tggcctacac ctaagaatga gtgagaacag     3240ccagcctgtg aggctagagg caagatggag tcagccatgc tagatttatc tcactgtcat     3300aacctttgca aaggcagttt cacctgggac ataggaggta ctcaatgaaa aagaagctat     3360taatattaaa attttaaaaa tgaatttaag gaactaatac tatgtacata ttagtcatta     3420aaacaaagtg gttcatttac attcacacaa ataaatcttg tgattataca taggtaatat     3480gaaaaacttt gttttctttc ataatacaag gtattagcaa tagatatagt aatgttagca     3540ttcctttgga aaaaatgaaa agatttataa ttttccaaga atcattagta tttttattta     3600atatacataa tataaaattt attcattcta taacttggaa atatgcttgc ttaccaatta     3660ctgacagatt tcaaaatatt tctatactca caatattcat ttacataaat attgatttgg     3720tacttacaat gtgtactgct atgctaagtt ttgtctttgt caaacatatt ttataaaatc     3780ataatcctag atgaatccaa cttttggtaa cccacgtgcc tgaacccctg ctgttaacag     3840gcaaagtgtg gt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         20                  25                  30Glu Glu Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly

     35                  40                  45Tyr Cys Tyr Thr Arg

 50<210>  3<211>  40<212>  DNA<213>  Homo sapiens<400>  3ttggcatcta ccgttttcaa gtggtgacag ctacttttga                             40<210>  4<211>  6038<212>  DNA<213>  Homo sapiens<400>  4ggatccgaga acatagaagg agcaggtaat ttatcaaggc atgaacacgg gtgcttaatt       60tcctattttg aggccaggca tggtggctca cacctgtaat cccaacactt taggaagcca      120aggtgggtgg attgcttgag tctaggattt tgagaccagc ctggccaaca tggcgaaatc      180ctgtctctac taaaaatact aaaattaacc agtcatggtg gtggtgtgcc tttagtccca      240gctactctgg tggctgaggc acaagaatca cttgaacctg ggaggcagag gttgcagtga      300gctgagactg tgccacttca ctccagcctg ggtgacagag taagattctg tctcaaaaaa      360tatgtatata tacacacata taatagatac ataaacatat atacatatat aatatataaa      420tatatatatt atatataata tataaacata tataaatata tatatatata tatatatata      480tatataaacc aaacataaag gaataatttt gggggaaaat cttcataaat gaaagaacaa      540cataggctgt tgagtatatg cacagaaatt caagagatct tccagcaatt gaagacattg      600gtttaccaga attcacaaaa gaagtcagct gtgcatttaa agtagaatgt gatgagtgtt      660accactgagg taggaactgg gaactaagga agcgtaagac agaaagtgct gaactgagag      720ttgggcattg gaggctgtgt aaggcagggt aagtgaatgt ctcctagaag ctacctttaa      780atggagtttt gaagtacttg taggagtagc ttaggtgaaa agaagaggag aaacatgtat      840caggcagagg gactagaacc ttattacctt caaagaagaa gcaaaaagaa tacatgtgac      900tttgaggtgg tgggaggtgc tttaagccaa tataggtgaa tttgacatag gacttcccta      960aataatgttc ggtcatttgt taaatattga gtgatatatc actgtattaa agcccaagag     1020ttgcttttat atagaaagaa gaaaaaagcc caagagagtt ttatttctag agggaatatt     1080ttctagaaat aaaggaaggt gtatcagcca gtttctagtc aggaaaacag aaatcacacc     1140tgatatgcaa aatagaggaa aatcagggaa ttcattaatc cagagatttg gttgctcaag     1200tattagattg ctgaaaagcc agacagggaa tatgaggcaa tcagagataa gtattagtga     1260caagctccat ttatgtgcag gattggaggg acataggtgg ggttcccaga agccagaagg     1320tgagaccacc tagcagaagc tcaaaccaca gctggggttt cctcacaaaa gctgggacca     1380ccaggaggag ctgtccaatg ggatctggag ccagggagat catgcagtca ctaccaggaa     1440gggaagcaga atgtaaaagg tagagagaaa tactccaact gcttccttgc attcactttc     1500caatctccat tcacaaaggc aaaaacctgc taatacagca gagtgggaaa agcagcctgc     1560caaggtcctt tctcccacaa aacagagcac aaaaccaagc aaaaacaagg aatgcatttg     1620atagcaaaca ggctatggac caacccaaca taaaagaaat gatgagtgat ttcttttttc     1680atttggttca agaaaagtat ttcagtaact attatgtaac agaaattcta tttattttgg     1740ggaattcaaa ggtgaataaa aaagaactct aaatttttat caataaaata tttcaaaaac     1800ctcaatgaga gtaatggcat taactagcaa atatgctaat gagatgagct agccataaga     1860ggcttagaat tgagagaaag gtctgggggc ctcttgacag gccaaattca gagctgtttg     1920tgggaatctc tgacctaact gcaggtggaa atataaatat gggcatttag aatagtggcc     1980caaactttgg atgatttctg tcttggggtc tctccaatta atgggattga tgagaactgt     2040agaccactga ggtcaccatg gctcaatgaa tagtcccctg gctttggagt caaactgacc     2100tgaatatgaa ccccagcttt gctacttaca ggttgcattt atcctcagtt ttctcatctt     2160tcaaagaaga acagtaactt ctttaaaagg ttattgtagg ctgggtgcag tggctcacgc     2220ctgtaatcgc agcactttgg gaggcggagg ctagtggatc acttgaggcc aggagttgga     2280aactagcctg gccaacatgg tgaaactctg tctctacaaa aagaaattta aaaaattttg     2340ctgggtgtgg tggcacacac ctggaattcc agctacctgg gaggccgagg catgagcatc     2400acttgagtct ggaaagcaga gggttgcagt gagccaagat tgtaccactg tactcaagcc     2460tgggtgacac agtgagacct tgtctaaaaa aaaaaaaggt tattgtgtta ttgtaaatat     2520tgtatatgaa cttctattta acatgtttag ttaaatgcct gtgtaattgt ccaatgtgct     2580cttctagctc actgcacaga caaaactgat tcactgaaat catggaattg cagcaaagaa     2640caaatctaat taatgtaggt caaacgggag gactggagtt attattcaaa tcagtctccc     2700tgaaaactca gaggctaggg ttttatggat aatttggtgg gcaggggact agggaatggg     2760tgctgctgat tggttgggga atgaaatagt aagattgtgg aaaactgtcc tccttcattg     2820agtctgcttc cgggtgtagg ccacacgacc agttgagtca tgaagcatgc gtccaagtgg     2880agtcagtttg ttgccagaat gcaaaagcct gaaaaatgtc tcaaatgatc aactgtaggc     2940tccacaataa tgatattatc tataggagca attggggaag taacaaatct tgtgacctct     3000ggacacataa ctcctgaact agtaagggat tataaaaacc atgcctatat cttatcagaa     3060ttcaggtccc cccataatcc taatctcaca gcatttcatt tgtttagaaa ggccattttc     3120agtccctgag caaggagggg gttagtttta ggataggact attatccttg cttcgttaaa     3180ctataaacta aattcctccc atggttagct tggcctacac ctaagaatga gtgagaacag     3240ccagcctgtg aggctagagg caagatggag tcagccatgc tagatttatc tcactgtcat     3300aacctttgca aaggcagttt cacctgggac ataggaggta ctcaatgaaa aagaagctat     3360taatattaaa attttaaaaa tgaatttaag gaactaatac tatgtacata ttagtcatta     3420aaacaaagtg gttcatttac attcacacaa ataaatcttg tgattataca taggtaatat     3480gaaaaacttt gttttctttc ataatacaag gtattagcaa tagatatagt aatgttagca     3540ttcctttgga aaaaatgaaa agatttataa ttttccaaga atcattagta tttttattta     3600atatacataa tataaaattt attcattcta taacttggaa atatgcttgc ttaccaatta     3660ctgacagatt tcaaaatatt tctatactca caatattcat ttacataaat attgatttgg     3720tacttacaat gtgtactgct atgctaagtt ttgtctttgt caaacatatt ttataaaatc     3780ataatcctag atgaatccaa cttttggtaa cccacgtgcc tgaacccctg ctgttaacag     3840gcaaagtgtg gtaggtacag atctatacct accaccttcc tctacccacc agcatctgca     3900ccc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Claims (38)

1.DNA构成物，所述构成物当通过同源重组整合到哺乳动物细胞基因组中时，在该细胞中改变内源FSHβ基因的表达，该构成物包含含有SEQ ID NO：4或5的至少20个连续核苷酸的导向序列和转录调节序列。

2.权利要求1的DNA构成物，其中所述构成物还包含外显子和剪接供体位点。

3.权利要求2的DNA构成物，其中所述构成物还包含所述剪接供体位点下游的内含子和剪接受体位点。

4.权利要求1的DNA构成物，其中所述构成物还包含选择性标记基因。

5.权利要求1的DNA构成物，其中所述导向序列包含SEQ IDNO：4或5的至少50个连续核苷酸。

6.包含SEQ ID NO：4或其互补体的至少20个连续核苷酸的分离的核酸。

7.权利要求6的分离的核酸，其中所述分离的核酸包含SEQ IDNO：4或其互补体的至少50个连续的核苷酸。

8.权利要求6的分离的核酸，其中所述分离的核酸包含SEQ IDNO：4或其互补体的至少100个连续的核苷酸。

9.权利要求6的分离的核酸，其中所述分离的核酸包含SEQ IDNO：4或其互补体的至少200个连续的核苷酸。

10.权利要求6的分离的核酸，其中所述分离的核酸包含SEQ IDNO：4或其互补体的至少500个连续的核苷酸。

11.权利要求6的分离的核酸，其中所述分离的核酸包含SEQ IDNO：4或其互补体的至少1000个连续的核苷酸。

12.权利要求6的分离的核酸，其中所述分离的核酸包含SEQ IDNO：4或其互补体。

13.包含SEQ ID NO：5或其互补体的至少20个连续核苷酸的分离的核酸。

14.权利要求13的分离的核酸，其中所述分离的核酸包含SEQID NO：5或其互补体的至少50个连续的核苷酸。

15.权利要求13的分离的核酸，其中所述分离的核酸包含SEQID NO：5或其互补体的至少100个连续的核苷酸。

16.权利要求13的分离的核酸，其中所述分离的核酸包含SEQID NO：5或其互补体的至少200个连续的核苷酸。

17.权利要求13的分离的核酸，其中所述分离的核酸包含SEQID NO：5或其互补体。

18.分离的DNA，其包含的一条链所包含的核苷酸序列(i)为至少100个核苷酸长并(ii)在高度严格条件下与SEQ ID NO：4或5或者SEQ ID NO：4或5的互补体杂交。

19.权利要求18的分离的DNA，其中所述核苷酸序列为至少200个核苷酸长。

20.权利要求18的分离的核酸，其中所述核苷酸序列为至少400个核苷酸长。

21.权利要求18的分离的核酸，其中所述核苷酸序列为至少1000个核苷酸长。

22.分离的DNA，其包含的一条链所包含的核苷酸序列(i)为至少100个核苷酸长并(ii)和长度与其相同的SEQ ID NO：4或5的片段的核苷酸序列具有至少80％的序列同一性。

23.权利要求22的分离的DNA，其中所述核苷酸序列为至少200个核苷酸长。

24.权利要求22的分离的DNA，其中所述核苷酸序列为至少400个核苷酸长。

25.权利要求22的分离的DNA，其中所述核苷酸序列为至少1000个核苷酸长。

26.用权利要求1的DNA构成物稳定转染的同源重组细胞，所述DNA构成物与内源FSHβ编码序列的ATG起始密码子上游的基因组DNA进行了同源重组。

27.用权利要求2的DNA构成物稳定转染的同源重组细胞，所述DNA构成物与内源FSHβ编码序列的ATG起始密码子上游的基因组DNA进行了同源重组。

28.用权利要求3的DNA构成物稳定转染的同源重组细胞，所述DNA构成物与内源FSHβ编码序列的ATG起始密码子上游的基因组DNA进行了同源重组。

29.用权利要求4的DNA构成物稳定转染的同源重组细胞，所述DNA构成物与内源FSHβ编码序列的ATG起始密码子上游的基因组DNA进行了同源重组。

30.改变内源FSHβ基因在哺乳动物细胞中表达的方法，该方法包括

将权利要求1的DNA构成物引入到所述细胞中；

将所述细胞保持在允许所述构成物和与所述导向序列同源的基因组靶位点之间发生同源重组的条件下，以产生同源重组细胞；并

将所述同源重组细胞保持在允许于所述转录调节序列控制下表达所述FSHβ编码序列的条件下。

31.给动物输送FSHβ的方法，包括

提供权利要求26的细胞，并

将该细胞植入到所述动物中，其中所述细胞分泌FSHβ。

32.给动物输送FSHβ的方法，包括

提供权利要求27的细胞，并

将该细胞植入到所述动物中，其中所述细胞分泌FSHβ。

33.给动物输送FSHβ的方法，包括

提供权利要求28的细胞，并

将该细胞植入到所述动物中，其中所述细胞分泌FSHβ。

34.给动物输送FSHβ的方法，包括提供权利要求29的细胞，并将该细胞植入到所述动物中，其中所述细胞分泌FSHβ。

35.生产FSHβ的方法，包括提供权利要求26的细胞，并在使所述细胞表达和分泌FSHβ的条件下体外培养所述细胞。

36.生产FSHβ的方法，包括提供权利要求27的细胞，并在使所述细胞表达和分泌FSHβ的条件下体外培养所述细胞。

37.生产FSHβ的方法，包括提供权利要求28的细胞，并在使所述细胞表达和分泌FSHβ的条件下体外培养所述细胞。

38.生产FSHβ的方法，包括提供权利要求29的细胞，并在使所述细胞表达和分泌FSHβ的条件下体外培养所述细胞。

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