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JP2003505428A - Ｖｇｆ選択的結合剤およびｖｇｆ関連障害の治療方法 - Google Patents

Ｖｇｆ選択的結合剤およびｖｇｆ関連障害の治療方法

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JP2003505428A
JP2003505428A JP2001511957A JP2001511957A JP2003505428A JP 2003505428 A JP2003505428 A JP 2003505428A JP 2001511957 A JP2001511957 A JP 2001511957A JP 2001511957 A JP2001511957 A JP 2001511957A JP 2003505428 A JP2003505428 A JP 2003505428A
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JP
Japan
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seq
vgf
polypeptide
selective binding
binding agent
Prior art date
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Application number
JP2001511957A
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English (en)
Inventor
ヤン，ハイ
Original Assignee
アムジエン・インコーポレーテツド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規ＶＧＦポリペプチドおよび選択的結合剤を提供する。本発明は、宿主細胞およびＶＧＦポリペプチドを製造する方法も提供する。本発明はさらに、ＶＧＦ医薬組成物およびＶＧＦポリペプチドに関連する疾患、症状および障害の診断、治療、改善および／または予防の方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、新規ＶＧＦポリペプチドおよび選択的結合剤を提供する。本発明は
、宿主細胞およびＶＧＦポリペプチドを製造する方法も提供する。本発明はさら
に、ＶＧＦ医薬組成物およびＶＧＦポリペプチドに関連する疾患、症状および障
害の診断、治療、改善および／または予防の方法を提供する。
【０００２】 （発明の背景） ＶＧＦは、ニューロンおよび内分泌細胞に見られる分泌ポリペプチドである。
Ｃａｎｕら、１９９７， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ４５：４４３−４６。ＶＦＧは
視床下部に見られ、電気活動、負傷および体内時計により脳内で調節される。視
床下部は、食物摂取およびエネルギー産出の調節に重要な役割を果たすことが示
されており、視床下部への損傷が食欲と体重の両方に影響を及ぼすことがわかっ
ている。Ｓｃｈｗａｒｔｚら、１９９５， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．，
２６９：９４９−５７。ＶＧＦは代謝においても役割を果たすことがわかって
いる。
【０００３】 ヒトおよびラットＶＦＧのヌクレオチドおよびアミノ酸配列が知られており、
相互に相同性が高い。Ｃａｎｕら、同上。ＶＧＦ遺伝子は、当初２．７ｋｂ ｃ
ＤＮＡフラグメントとして同定され、ニューロトロフィンによってインビトロで
ニューロンおよび内分泌細胞のサブポピュレーション内で転写される。
【０００４】 肥満および食欲不振は、エネルギーの摂取と消費のアンバランスから生じるエ
ネルギーホメオスタシスの崩壊である。これらの症状を効果的に治療するための
需要がある。悪液質、不妊、代謝過多症状、機能亢進、機能低下、インシュリン
生成過多、および関連症状ならびに障害の効果的に治療するための需要もある。
【０００５】 （発明の開示） 本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、
配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいず
れかで示されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドを提供する。好ま
しい単離されたポリペプチドは、配列番号２で示すアミノ酸配列を含む。
【０００６】 本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、
配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいず
れかで示されるアミノ酸配列の断片を含む、単離されたポリペプチドを提供し、
ここで断片は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５
、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のい
ずれかで示されるポリペプチドの活性を有する。好ましい単離されたポリペプチ
ドは、配列番号２のアミノ酸配列の断片を含み、ここで断片は配列番号２で示さ
れるポリペプチドの活性を有する。
【０００７】 本発明はさらに、以下よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離され
たポリペプチドを提供する： （ａ）１以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号１、配列番号２、配列番
号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番
号９、または配列番号１０のいずれかで示されるアミノ酸配列であって、ポリペ
プチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配
列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいずれ
かで示されるポリペプチドの活性を有するアミノ酸配列； （ｂ）１以上のアミノ酸挿入を有する配列番号１、配列番号２、配列番号３、
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、
または配列番号１０のいずれかで示されるアミノ酸配列であって、ポリペプチド
が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号
６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいずれかで示
されるポリペプチドの活性を有するアミノ酸配列； （ｃ）１以上のアミノ酸欠損を有する配列番号１、配列番号２、配列番号３、
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、
または配列番号１０のいずれかで示されるアミノ酸配列であって、ポリペプチド
が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号
６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいずれかで示
されるポリペプチドの活性を有するアミノ酸配列； （ｄ）Ｃ−および／またはＮ−末端切断を有する配列番号１、配列番号２、配
列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配
列番号９、または配列番号１０のいずれかで示されるアミノ酸配列であって、ポ
リペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５
、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のい
ずれかで示されるポリペプチドの活性を有するアミノ酸配列； （ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠損、カルボキシル末端切断お
よびアミノ酸末端切断より成る群から選択される１以上の修飾を有する配列番号
１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号
７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいずれかで示されるアミノ
酸配列であって、ポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列
番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、また
は配列番号１０のいずれかで示されるポリペプチドの活性を有するアミノ酸配列
。
【０００８】 非相同アミノ酸配列に融合した上述の１以上のポリペプチドを含む融合タンパ
ク質も提供される。
【０００９】 本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、
配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいず
れかで示されるアミノ酸配列を含む１以上のポリペプチドに特異的に結合可能な
、抗体などの選択的結合剤も提供する。
【００１０】 本発明はさらに、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番
号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０
、またはその天然形での変異型のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む１以上
のポリペプチドの断片に特異的に結合可能な選択的結合剤を提供する。
【００１１】 本発明の選択的結合剤は、これに限定されるわけではないが、ネズミ抗体、ヒ
ト化抗体、ヒト抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、
ＣＤＲ−グラフト抗体、抗イディオタイプ抗体、および（ＦａｂまたはＦａｂ’
断片などの）可変領域断片を含む抗体、またはその断片でもよい。本発明の選択
的結合剤は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、
配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいず
れかで示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドへの特異性を備えた１以上の相
補性決定領域を有する選択的結合剤またはその断片を含む。
【００１２】 本発明の選択的結合剤は、検出可能な標識に任意に結合できる。
【００１３】 ＶＧＦ生物活性に拮抗可能な選択的結合剤も提供される。
【００１４】 好ましい選択的結合剤またはその断片は、配列番号２で示されるアミノ酸配列
を含むポリペプチドまたはその断片を特異的に結合可能である。
【００１５】 本発明は、本発明のポリペプチドまたは選択的結合剤を含む医薬組成物も提供
し、１以上の製薬的に許容可能な調合剤も本発明に含まれる。調合剤は適切な担
体、アジュバント、可溶化剤、安定化剤または抗酸化剤でもよい。ＶＧＦポリペ
プチドまたは選択的結合剤は、ポリエチレングリコールおよびデキストランなど
の水溶性ポリマーによって共有結合的に修飾できる。本発明の医薬組成物を用い
て、治療上有効量の本発明のＶＧＦポリペプチドまたは選択的結合剤を提供する
。本発明は、ＶＧＦ関連疾患、症状または障害を治療する医薬品の製造方法も提
供する。
【００１６】 本発明はさらに、患者に本発明のＶＧＦポリペプチドまたは選択的結合剤の有
効量を投与することを含む、ＶＧＦ関連疾患、症状または障害を治療、予防また
は改善する方法を提供する。ＶＧＦ関連疾患、症状または障害には、肥満、不妊
、悪液質、摂食障害、ＡＩＤＳ関連複合体、代謝過多症状、機能亢進、機能低下
、およびインシュリン生成過多を含む。ＶＧＦ関連摂食障害は、過食症および拒
食症を含む。本発明の方法は、本発明のＶＧＦポリペプチドまたは選択的結合剤
の組合せの投与も提供することが認識されるであろう。
【００１７】 ＶＧＦポリペプチドの発現の存在または量を判定することと、ＶＧＦポリペプ
チドの発現の存在または量に基づいて、ＶＧＦ関連疾患、症状または障害、ある
いはＶＧＦ関連、症状または障害に対する感受性を診断することを含む、動物に
おけるＶＧＦ関連疾患、症状または障害、あるいはＶＧＦ関連、症状または障害
に対する感受性を診断する方法も提供される。ＶＧＦ関連疾患、症状または障害
、あるいはＶＧＦ関連、症状または障害に対する感受性を診断する好ましい方法
において、動物は哺乳類である。さらに好ましい方法では、動物はヒトである。
【００１８】 本発明は、ＶＧＦポリペプチドに結合する試験分子を確認するために、試験分
子をアッセイする方法も提供する。本方法は、ＶＧＦポリペプチドを試験分子に
接触させることと、試験分子のポリペプチドへの結合の程度を判定することを含
む。方法はさらに、そのような試験分子がＶＧＦポリペプチドのアゴニストまた
はアンタゴニストのどちらであるか判定することを含む。本発明はさらに、ＶＧ
Ｆポリペプチドの発言またはＶＧＦポリペプチドの活性に対する分子の影響を試
験する方法を含む。
【００１９】 本発明のこれらおよび他の目的は、明細書を全体として考慮すると明らかにな
るであろう。
【００２０】 （図の簡単な説明） 図１は、ＶＧＦ−１ａ（配列番号２）の投与後のＶＧＦノックアウトマウスの
体重を示す。ＶＧＦ−１ａの投与は第５日に中止した（矢印で示す）。
【００２１】 図２は、ＶＧＦ−１を注射したウサギの抗体力価レベルを示す（配列番号１）
； 図３は、ＶＧＦ−２を注射したウサギの抗体力価レベルを示す（配列番号４）
； （発明の詳細な説明） 本明細書で使用する節の見出しは、構成のためだけであり、説明する主題を限
定するものとして解釈すべきではない。本出願で引用したすべての参考文献は、
本明細書中に特に援用したものである。
【００２２】 定義 「ＶＧＦポリペプチド」という語は、表Ｉに示すアミノ酸配列のいずれかを含
むポリペプチド、および本明細書で述べる関連ポリペプチドを指す。関連ポリペ
プチドは、ＶＧＦポリペプチド断片、オルトログ、変異型、誘導体を含み、配列
番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列
番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０ので示されるいずれかの
ＶＦＧポリペプチドの１以上の特性を有する。ＶＧＦポリペプチドは本明細書で
定義するように成熟したポリペプチドでもよく、調製方法によってアミノ末端メ
チオニン残基を備えていなくてもよい。
【００２３】
【表１】
【００２４】 「ＶＧＦポリペプチド断片」という語は、配列番号１、配列番号２、配列番号
３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号
９、または配列番号１０で示されるポリペプチドのいずれかのアミノ末端での切
断および／またはカルボキシル末端での切断を含むポリペプチドを指す。「ＶＧ
Ｆポリペプチド断片」という語は、ＶＧＦポリペプチドオルトログ、変異型また
は誘導体のアミノ末端および／またはカルボキシル末端切断も指す。ＶＧＦポリ
ペプチド断片は、選択的ＲＮＡスプライシングまたはインビボプロテアーゼ活性
から生じる。そのようなＶＧＦポリペプチド断片はアミノ末端メチオニン残基を
任意に含む。そのような断片はたとえば、ＶＧＦポリペプチドに対する抗体を生
成するのに使用できる。
【００２５】 「ＶＧＦポリペプチドオルトログ」という語は、配列番号１、配列番号２、配
列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配
列番号９、または配列番号１０で示されるＶＧＦポリペプチドのいずれかに一致
する別の種からのポリペプチドを指す。たとえば、マウスおよびヒトＶＧＦポリ
ペプチドは相互のオルトログと見なされる。
【００２６】 「ＶＧＦポリペプチド変異型」という語は、配列番号１、配列番号２、配列番
号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番
号９、または配列番号１０で示されるいずれかのＶＧＦポリペプチドと比べて、
１以上のアミノ酸配列置換（保存的、非保存的、またはその組合せ）、欠損（内
部欠損および／またはＶＧＦポリペプチド断片など）、および／または付加（内
部付加および／またはＶＦＧ融合ポリペプチドなど）を有するアミノ酸配列を含
む、ＶＧＦポリペプチドを指す。変異型は天然に存在するもの（たとえばＶＧＦ
ポリペプチド対立遺伝子変異型またはＶＧＦポリペプチドオルトログ）でも、人
工的に作成してもよい。
【００２７】 「ＶＧＦポリペプチド誘導体」という語は、化学的に修飾された、配列番号１
、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７
、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０で示されるいずれかのポリペプ
チド、または本明細書で定義するようなＶＧＦポリペプチド断片、オルトログま
たは変異型を指す。化学修飾はたとえば、これに限定されるわけではないが、水
溶性ポリマー、Ｎ−結合またはＯ−結合炭水化物、糖およびリン酸塩を含む、１
以上のポリマーの共有結合的付加によってもよい。ＶＧＦポリペプチド誘導体は
、ポリペプチドに付加する分子の種類および位置のどちらかにおいて、天然のＶ
ＧＦポリペプチドとは異なる方法で修飾される。ＶＧＦポリペプチド誘導体はさ
らに、ＶＧＦポリペプチドに天然のものでは付加している１以上の化学基の欠損
を有するＶＧＦポリペプチドを含む。
【００２８】 「成熟ＶＧＦポリペプチド」という語は、リーダー配列の欠けたＶＧＦポリペ
プチドを指す。成熟ＶＧＦポリペプチドは、アミノ末端および／またはカルボキ
シル末端のタンパク質分解処理（リーダー配列あり、またはなし）、大型の前駆
体からの小型のポリペプチドの開裂、Ｎ−結合および／またはＯ−結合グリコシ
ル化などの、他の修飾を含むことがある。
【００２９】 「ＶＧＦ融合ポリペプチド」という語は、ＶＧＦポリペプチド、断片、オルト
ログ、変異型または誘導体のアミノまたはカルボキシル末端における１以上の（
非相同ペプチドまたはポリペプチドなどの）アミノ酸の融合を指す。
【００３０】 「生物活性ＶＧＦポリペプチド」という語は、配列番号１、配列番号２、配列
番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列
番号９、または配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの１以
上の活性特性を有する、ＶＧＦポリペプチドを指す。加えて、ＶＧＦポリペプチ
ドは、抗体が出現する１以上のエピトープを含む。
【００３１】 「単離されたポリペプチド」という語は、（１）源細胞からの分離時に、とも
に自然に発見された、ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物または他の物質の約５
０％以上から分離され、（２）「単離されたポリペプチド」が天然に結合してい
るポリペプチドのすべてまたは一部に（共有結合的または非共有結合的相互作用
によって）結合しておらず、（３）天然に結合していないポリペプチドに（共有
結合的または非共有結合的相互作用によって）結合しており、（４）天然に発生
しない、本発明のポリペプチドを指す。単離されたポリペプチドは、治療上、診
断上、予防上および研究上の使用を妨げる、自然環境で見られる他の汚染ポリペ
プチドまたは他の汚染物質を実質的に含まないことが好ましい。
【００３２】 「ベクター」という語は、コーディング情報を宿主細胞に伝達するのに用いる
任意の分子（たとえば核酸、プラスミドまたはウィルス）を指すのに用いる。
【００３３】 「発現ベクター」という語は、宿主細胞の形質転換に適しており、挿入された
非相同核酸配列の発現を指示および／または制御する核酸配列を含む、ベクター
を指す。発現はこれに限定されるわけではないが、転写、翻訳、およびイントロ
ンが存在する場合はＲＮＡスプライシングなどのプロセスを含む。
【００３４】 「宿主細胞」という語は、核酸配列によって形質転換された、または形質転換
され、次に興味のある選択された遺伝子を発現する能力のある細胞を指すのに用
いる。この語は、選択された細胞が存在する限り、子孫の形態または遺伝子的性
質が元の親細胞と同一であるかどうかにかかわらず、親細胞の子孫を含む。
【００３５】 「同一性」という語は当業者に公知であるように、配列の比較によって決定さ
れる、２以上のポリペプチド分子または２以上の核酸分子の配列間の関係を指す
。当業者には「同一性」は、場合に応じて、２以上のヌクレオチドまたは２以上
のアミノ酸配列間の一致によって決定される、ポリペプチドまたは核酸分子間の
配列関連性の程度も意味する。「同一性」は、２以上の配列の小さいほうと、特
定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）に
よって扱われるギャップアラインメント（ある場合）との間の同一一致のパーセ
ントを測定する。
【００３６】 「類似性」という語は、関連する概念であるが、「同一性」とは異なり「類似
性」は、同一一致および保存的置換一致の両方を含む関連性の測定値を指す。２
つのポリペプチド配列がたとえば、１０／２０の同一アミノ酸を有し、残りはす
べて非保存的置換である場合、同一性および類似性のパーセントはどちらも５０
％となる。同じ例で、保存的置換の位置がさら５あると、同一性パーセントは５
０％のままであるが、類似性パーセントは７５％となる（１５／２０）。したが
って、保存的置換がある場合、２つのポリペプチド間の類似性パーセントは、こ
れらの２つのポリペプチド間の同一性パーセントよりも高くなる。
【００３７】 「核酸配列」または「核酸分子」という語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を指す
。この語は、これに限定されるわけではないが、４−アセチルシトシン、８−ヒ
ドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニル−シトシン、シュードイソシ
トシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシ
ル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシ
ル、５−カルボキシ−メチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシ
ン、Ｎ６−イソ−ペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュー
ドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチル−グ
アニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−
メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミ
ノメチルウラシル、５−メトキシアミノ−メチル−２−チオウラシル、ベータ−
Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボニル−メチルウラシル、５−メ
トキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−
５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシ
ン、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウ
ラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラ
シル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウ
ラシル、ケオシン、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリンを含む、
既知のＤＮＡおよびＲＮＡの塩基類似体のいずれかから生成された分子を含む。
【００３８】 「天然にある」または「ネイティブの（native）」という語は、核酸分子、ポ
リペプチド、宿主細胞などの生体物質に関連して用いる場合、天然に発見され、
人間によって操作されていない物質をさす。同様に、「非ネイティブの（non-na
tive）」または「非天然型の」は本明細書で使用されるように、天然に発見され
ないか、人間によって構造的に修飾または合成された物質を指す。
【００３９】 「操作可能に結合した」という語は本明細書で使用されるように、フランキン
グ配列の配置を指し、そのように述べられるフランキング配列は、その通常の機
能を果たすように構成または構築される。したがって、コーディング配列に操作
可能に結合されたフランキング配列は、コーディング配列の複製、転写および／
または翻訳に影響を与えることができる。たとえばコーディング配列は、プロモ
ータがそのコーディング配列の転写を指示できる場合は、プロモータに操作可能
に結合されている。フランキング配列は、正しく機能する限り、コーディング配
列と近接している必要はない。それゆえたとえば、介在性の未翻訳であるが転写
された配列がプロモータ配列とコーディング配列の間に存在可能であり、プロモ
ータ配列はコーディング配列になお「操作可能に結合され」ていると見なされる
。
【００４０】 「有効量」および「治療的有効量」という語はそれぞれ、本明細書で示すＶＧ
Ｆポリペプチドの１以上の生物活性の観察可能なレベルを維持するのに用いられ
るＶＧＦポリペプチドの量を指す。
【００４１】 「製薬的に許容可能な担体」または「生理学的に許容可能な担体」という語は
本明細書で使用されるように、医薬組成物としてのＶＧＦポリペプチドまたはＶ
ＧＦ選択的結合剤の送達を実施および向上するのに適した１以上の調合物質を指
す。
【００４２】 「選択的結合剤」という語は、ＶＧＦポリペプチドに対して特異性を有する１
以上の分子を指す。本明細書で使用されるように、「特異的な」および「特異性
」という語は、選択的結合剤がＶＧＦポリペプチドに結合し、非ＶＧＦポリペプ
チドには結合しない能力を指す。しかし、選択的結合剤はＶＧＦオルトログも結
合することは認識されるであろう。
【００４３】 「形質導入」という語は、１つの細菌から別の細菌に、通常はファージによっ
て遺伝子を伝達することを指すのに用いる。「形質導入」は、真核細胞配列のレ
トロウィルスによる獲得および伝達も指す。
【００４４】 「形質移入」という語は、細胞による外部または外来性ＤＮＡの取り込みを指
すのに用い、外来性ＤＮＡが細胞膜内に導入されていると、細胞は「形質移入」
されている。多数の形質移入技術が当業界で周知であり、本明細書で開示されて
いる。たとえば、Ｇｒａｈａｍら、１９７３， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５
６； Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， １９８９）； Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ
， １９８６）； ａｎｄ Ｃｈｕら、１９８１， Ｇｅｎｅ １３：１９７を
参照。このような技術を用いて、１以上の外来性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞に
導入できる。
【００４５】 「形質転換」という語は本明細書で使用されるように、細胞の遺伝的特性にお
ける変化を指し、細胞は、新しいＤＮＡを含有するよう修飾された場合に形質転
換されている。たとえば、細胞は自然な状態から遺伝子的に修飾される場合に形
質転換される。形質移入または形質導入の後、形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体
内に物理的に組込まれることにより細胞のＤＮＡと組換えるか、複製されずにエ
ピソーム因子として一時的に維持されるか、プラスミドとして独立に複製する。
ＤＮＡが細胞分裂に伴い複製される場合、細胞は安定して形質転換されたと見な
される。
【００４６】 ＶＧＦポリペプチドの関連性 ＶＧＦポリペプチドのアミノ酸配列への保存的修飾によって、ＶＧＦポリペプ
チドに似た機能的および化学的特徴を持つポリペプチドが生成する。これに対し
て、ＶＧＦポリペプチドの機能的および／または化学的特徴の実質的な修飾は、
（ａ）たとえばシートまたはらせん形態などの、置換領域の分子主鎖の構造、（
ｂ）標的部位での分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩の維持に対す
る影響が著しく異なるＶＧＦポリペプチドのアミノ酸配列中の置換を選択するこ
とによって行われる。
【００４７】 たとえば、「保存的アミノ酸置換」は、置換位置でのアミノ酸残基の極性また
は電荷にほとんど、または全く影響がないように、ネイティブのアミノ酸残基と
非ネイティブのアミノ残基との置換を含む。さらに、ポリペプチドのネイティブ
の残基は、「アラニン走査突然変異誘発」について以前述べたように、アラニン
と置換されることもある。
【００４８】 保存的アミノ酸置換は、生体系における合成ではなく、一般に化学ペプチド合
成によって含まれる非天然型アミノ酸残基も含む。これらはペプチド様アゴニス
ト、およびアミノ酸部分の他の逆転または反転形を含む。
【００４９】 天然型残基は、共通側鎖特性に基づいたクラスに分けられる： １）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ； ２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ； ３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ； ４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ； ５）鎖の方向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ； ６）芳香性：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ たとえば非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバを、他のクラスのメ
ンバと交換することを含む。このような置換残基は、他のＶＧＦポリペプチドオ
ルトログと相同性であるＶＧＦポリペプチドの領域、あるいは分子の非相同性領
域に導入してもよい。
【００５０】 このような変更を行う場合、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮する。各アミ
ノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいて疎水性親水性指標が割り当てられ
ている。疎水性親水性指標は以下のとおりである：イソロイシン（＋４．５）；
バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；
システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１
．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）
；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）
；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５
）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．
９）；アルギニン（−４．５）。
【００５１】 タンパク質に相互作用的生物機能を付与する場合、アミノ酸の疎水性親水性指
標の重要性は、当業界で一般に理解されている（Ｋｙｔｅら、１９８２， Ｊ．
Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５７：１０５−３１）。あるアミノ酸が、同様の疎
水性親水性指標またはスコアを持つ他のアミノ酸と置換されるか、なお同様の生
物活性を保持していることが知られている。疎水性親水性指標に基づいて変更す
る場合、アミノ酸の置換は、その疎水性親水性指標が±２以内であることが好ま
しく、±１以内であることが特に好ましく、±０．５以内であることがまたさら
に好ましい。
【００５２】 当業界では、特に生物機能が同等のタンパク質またはそれにより生成されるペ
プチドが、本発明の場合のように特に免疫学的実施形態に用いられる場合、同様
のアミノ酸の置換は親水性に基づいて効率的に行えることが知られている。隣接
アミノ酸の親水性によって左右されるように、タンパク質の最大の局所平均疎水
性は、その免疫原性および抗原性、すなわちタンパク質の生物特性と相関する。
【００５３】 以下の親水性値は、これらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン
（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタ
ミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グ
ルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（
−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン
（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１
．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン
（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。同様の親水性値に基づいて変更を
行う場合、親水性値が±２以内のアミノ酸の置換が好ましく、±１以内の値が特
に好ましく、±０．５以内の値がまた特に好ましい。親水性に基づいて１級アミ
ノ酸からエピトープを同定してもよい。これらの領域は、「エピトープコア領域
」とも呼ばれる。
【００５４】 望ましいアミノ酸置換（保存的または非保存的にかかわらず）は、当業者によ
って、そのような置換が望ましいときに決定することができる。たとえば、アミ
ノ酸置換を用いて、ＶＧＦポリペプチドの重要な残基を同定したり、本明細書で
述べるＶＧＦポリペプチドの親和性を増加または減少することができる。アミノ
酸置換の例は、表２に示す。
【００５５】
【表２】
【００５６】 当業者は、既知の技術を用いた適切なＶＧＦポリペプチド変異型を決定するこ
とができる。生物活性を損なわずに変更される分子の適切な領域を識別するには
、当業者は、活性にとって重要とは思われない領域を標的とする。たとえば、同
一種または他の種による、同様の活性を持つ同様のポリペプチドが既知である場
合、当業者はＶＧＦポリペプチドのアミノ酸配列をそのような同様のポリペプチ
ドと比較する。そのような比較により、同様のポリペプチド内で保存されている
分子の残基および部分を同定することができる。そのような同様のポリペプチド
に対して保存されないＶＧＦ分子の区域における変化は、ＶＧＦポリペプチドの
生物活性および／または構造に悪影響を与えにくいことが認識されるであろう。
当業者は、相対的に保存的領域においても、活性を維持しながら、化学的に同様
のアミノ酸を天然型残基と置換してもよいこともわかっている（保存的アミノ酸
残基置換）。したがって、生物活性または構造にとって重要な領域でさえ、生物
活性を損なわずに、またはポリペプチド構造に影響を与えずに、保存的アミノ酸
置換を受ける。
【００５７】 さらに当業者は、活性または構造にとって重要である、同様のポリペプチドに
おける残基を同定する構造−機能研究を検討することができる。そのような比較
を考慮して、同様のポリペプチドにおける活性または構造にとって重要なアミノ
酸残基に一致する、ＶＧＦポリペプチド中のアミノ酸残基の重要性を予測するこ
とができる。当業者は、そのように予測されたＶＧＦポリペプチドの重要なアミ
ノ酸残基化学的に同様のアミノ酸置換を選ぶことがある。
【００５８】 当業者は、３次元構造およびアミノ酸配列を、同様のポリペプチドにおけるそ
の構造に関して分析することもできる。そのような情報を考慮すると、当業者は
、３次元構造に関してＶＧＦポリペプチドのアミノ酸残基の配置を予測すること
もある。当業者は、タンパク質表面にあると予想されるアミノ酸残基に極端な変
更をしないことを選択する。なぜならそのような残基は、他の分子との重要な相
互作用に関与するからである。さらに当業者は、各アミノ酸残基にアミノ酸置換
を１個含む試験変形を作成することがある。変形は、当業者に既知の活性アッセ
イを用いてスクリーニングできる。そのような変形を用いて、適切な変形に関す
る情報を集めることができる。たとえば、特定のアミノ酸残基への変更によって
、破壊された、望ましくなく減少された、または不適切な活性が生じた場合、そ
のような変更を備えた変形は避けられる。言い換えれば、そのようなルーチン実
験から集めた情報に基づいて、当業者は、さらなる置換を単独で、または他の突
然変異と組合わせて避ける必要のあるアミノ酸をただちに決定できる。
【００５９】 多数の化学文献が、二次構造の予測に向けられている。Ｍｏｕｌｔ， １９９
６， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７：４２２−２７；
Ｃｈｏら、１９７４， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：２２２−４５；
Ｃｈｏｕら、１９７４， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１３：２１１−２２；
Ｃｈｏｕら、１９７８， Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． Ｒｅｌａｔ． Ａｒ
ｅａｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４７：４５−４８； Ｃｈｏｕら、１９７８，
Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ４７：２５１−２７６； ａｎｄ
Ｃｈｏｕら、１９７９， Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ２６：３６７−８４を参照
。さらに現在、２次構造の予測を支援するためのコンピュータプログラムが利用
できる。２次構造を予測する１つの方法は、相同モデル化に基づく。たとえば、
３０％を超える配列同一性、または４０％を超える類似性を有する２個のポリペ
プチドまたはタンパク質は、同様の構造トポロジーを持つことが多い。最近、タ
ンパク質構造データベース（ＰＤＢ）が発達したことにより、ポリペプチドまた
はタンパク質内のフォールドの考えられる数を含め、２次構造の予測可能性が向
上した。Ｈｏｌｍら、１９９９， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ２７
：２４４−４７を参照。所与のポリペプチドまたはタンパク質内には数が限定さ
れた折りたたみがあり、いったん臨界的折りたたみの構造が解決されれば、構造
予測の精度は劇的にさらに向上する（Ｂｒｅｎｎｅｒら、１９７７， Ｃｕｒｒ
． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ７：３６９−７６）。
【００６０】 ２次構造予測の別の方法として、「スレッディング」（Ｊｏｎｅｓ， １９９
７， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ７：３７７−８
７； Ｓｉｐｐｌら、１９９６， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４：１５−１９）、「
プロファイル分析」（Ｂｏｗｉｅら、１９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ：１６４−７
０；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９９０， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １
８３：１４６−５９；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８４：４３５５−５８）、および「進
化的連結」（Ｈｏｌｍら、同上およびＢｒｅｎｎｅｒら、同上を参照）が挙げら
れる。
【００６１】 好ましいＶＧＦ変異は、グリコシル化部位の数および／または種類が本発明の
ＶＧＦポリペプチドのアミノ酸配列と比べて変化したグリコシル化変形を含む。
１つの実施形態において、ＶＧＦポリペプチド変異は、本発明のＶＧＦポリペプ
チドのアミノ酸配列よりもＮ−結合グリコシル化部位の数が多いまたは少ない。
すべてのＮ−結合グリコシル化部位は、Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−
Ｔｈｒという配列を特徴とし、ここでＸで表されるアミノ酸残基は、プロリン以
外のアミノ酸残基である。この配列を作成するためにアミノ酸残基を置換すると
、Ｎ−結合炭水化物鎖を付加するための潜在的な新しい部位が設けられる。ある
いは、この配列を除去する置換によって、既存のＮ−結合炭水化物鎖が除去され
る。Ｎ−結合炭水化物鎖の再配置も行われ、ここでは１以上のＮ−結合グリコシ
ル化部位（通常は天然型の部位）が除去され、１以上の新しいＮ−結合部位が作
成される。さらに好ましいＶＧＦ変異としてシステイン変異があり、ここでは本
発明のＶＧＦポリペプチドのアミノ酸配列と比べて、１以上のシステイン残基が
除去されるか、別のアミノ酸（たとえばセリン）と置換される。システイン変形
は、不溶性封入体の分離後などに、ＶＧＦポリペプチドを生物活性形態に再度折
畳まねばならないときに有用である。システイン変異は一般に、ネイティブのタ
ンパク質よりシステイン残基が少なく、通常、不対システインから生じる相互作
用を最小限にするために偶数備えている。
【００６２】 加えて、ＶＧＦポリペプチドは相同ポリペプチドに融合してホモダイマーを作
成するか、非相同ポリペプチドに融合してヘテロダイマーを作成する。非相同ペ
プチドおよびポリペプチドは、これに限定されるわけではないが：ＶＧＦ融合ポ
リペプチドの検出および／または分離を可能にするエピトープ；細胞外領域また
は膜貫通および細胞内領域などの、膜貫通レセプタータンパク質またはその一部
；触媒的に活性である、リガンドまたはその一部；ロイシンジッパー領域などの
、オリゴマー化を促進するポリペプチドまたはペプチド；免疫グロブリン定常性
領域などの、安定性を増加させるポリペプチドまたはペプチド；本発明のＶＧＦ
ポリペプチドとは異なる治療活性を有するポリペプチドを含む。
【００６３】 融合は、ＶＧＦポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端のどちらか
で行える。融合はリンカーまたはアダプターを用いずに直接であるか、リンカー
またはアダプター分子による。リンカーまたはアダプター分子は１以上のアミノ
酸残基であり、通常は約２０〜約５０のアミノ酸残基である。リンカーまたはア
ダプター分子は、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼまたはプロテアーゼが融合部分
を分離できるように、開裂部位を用いて設計してもよい。融合タンパク質はいっ
たん作成すると、本明細書で述べる方法に従って誘導体化できることは認識され
るであろう。
【００６４】 本発明の別の実施形態では、ＶＧＦポリペプチドをヒトＩｇＧのＦｃ領域の１
以上のドメインに融合する。抗体は２つの機能的に独立した部分、抗原に結合す
る「Ｆａｂ」として知られる可変ドメインと、食細胞による補体活性および攻撃
などのエフェクター機能に関与する「Ｆｃ」として知られる不変ドメインを含む
。Ｆｃは血清半減期が長いが、Ｆａｂは短命である。Ｃａｐｏｎら、１９８９，
Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２７−３１。治療用タンパク質とともに構成される
場合、Ｆｃドメインは半減期が長くなるか、Ｆｃレセプター結合、タンパク質Ａ
結合、補体固定、場合によっては胎盤通過などの機能を含むことができる。Ｉｄ
． 表２Ｉは当業者に既知のあるＦｃ融合の使用についてまとめる。
【００６５】
【表３】
【００６６】 ある実施例において、ヒトＩｇＧヒンジのＣＨ２およびＣＨ３領域は、当業者
に既知の方法を用いて、ＶＧＦポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末
端のどちらかで融合できる。生じたＶＧＦ融合ポリペプチドは、タンパク質Ａ親
和性カラムを用いて精製してもよい。Ｆｃ領域に融合されたペプチドおよびタン
パク質は、インビボで未融合の対応物よりも実質的に長い半減期を示すことがわ
かった。また、Ｆｃ領域への融合によって、融合タンパク質のダイマー化／マル
チマー化が可能になる。Ｆｃ領域は天然型Ｆｃ領域であるか、治療的性質、循環
時間または凝集低下などの、ある性質を改良するために変更してもよい。
【００６７】 関連ポリペプチドの同一性または類似性は、既知の方法でただちに計算できる
。そのような方法としては、これに限定されるわけではないが、Ｃｏｍｐｕｔａ
ｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａ．Ｍ． Ｌｅｓｋ編、
Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９８８）；Ｂｉｏｃｏｍ
ｕｐｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃ
ｔｓ（Ｄ． Ｗ． Ｓｍｉｔｈ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９３）
；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ（
Ｐａｒｔ １， Ａ． Ｍ． Ｇｒｉｆｆｉｎ ａｎｄ Ｈ． Ｇ． Ｇｒｉｆ
ｆｉｎ編、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ １９９４）；Ｇ． ｖｏｎ Ｈｅｉｎｌｅ
， Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａ
ｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｍ． Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ａｎｄ Ｊ． Ｄｅ
ｖｅｒｅｕｘ編、Ｍ． Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ １９９１）；ａｎｄ
Ｃａｒｉｌｌｏら、１９８８， ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．
， ４８：１０７３が挙げられる。
【００６８】 同一性および／または類似性を決定する好ましい方法は、試験を行う配列間の
一致が最大となるように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、公
に入手可能なコンピュータプログラムに記載されている。２つの配列間の同一性
および類似性を決定する好ましいコンピュータプログラム法は、これに限定され
るわけではないが、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４， Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １２：３８７； Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ
Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， Ｍａｄ
ｉｓｏｎ， ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１
９９０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−１０）を含むＧＣＧ
プログラムパッケージが挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、バイオテクノ
ロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ， ＮＣＢＩ）および他の供給源（Ａ
ｌｔｓｃｈｕｌら、ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ（ＮＣＢ ＮＬＭ ＮＩＨ， Ｂ
ｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、同上）より公に入
手可能である。既知のスミス・ウォーターマンアルゴリズムも、同一性を決定す
るのに使用できる。
【００６９】 ２つのアミノ酸配列を並べるある整列方式によって、２つの配列の短い領域の
みが一致し、２つの全長配列間に重要な関係がない場合でも、この小規模な整列
領域は、非常に高い配列同一性を有する。したがって、好ましい実施形態におい
て、選択された配置方法（ＧＡＰプログラム）によって、請求されるポリペプチ
ドの５０以上の隣接アミノ酸に渡る配置が生じる。
【００７０】 たとえば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕ
ｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，
Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）、配列同一性パーセントが決定される２つのポリペプ
チドは、このそれぞれのアミノ酸の最適一致について配置される（アルゴリズム
によって決定される「一致範囲」）。ギャップオープニングペナルティ（３Ｘ平
均対角線として計算される；「平均対角線」は使用される比較マトリクスの対角
線の平均である；「対角線」は、特定の比較マトリクスによって、完全アミノ酸
一致それぞれに割り当てられたスコアまたは数である）およびギャップ伸張ペナ
ルティ（通常０．１Ｘギャップオープニングペナルティである）は、ＰＡＭ ２
５０またはＢＬＯＳＵＭ ６２などの比較マトリクスと同様に、アルゴリズムと
あわせて使用される。標準比較マトリクスは、アルゴリズム（Ｄａｙｈｏｆｆら
、５ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒ
ｕｃｔｕｒｅ（Ｓｕｐｐ． ３ １９７８）（ＰＡＭ ２５０比較マトリクス）
；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、１９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓ
ｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５−１９（ＢＬＯＳＵＭ ６２比較マトリクス
）によっても使用される。
【００７１】 ポリペプチド配列比較の好ましいパラメータは、以下を含む： アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０，
Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３−５３； 比較マトリクス：ＢＬＯＳＵＭ ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、同上）； ギャップペナルティ：１２ ギャップ長ペナルティ：４ 類似性の閾値：０
【００７２】 ＧＡＰプログラムは上のパラメータを用いると有用である。上述のパラメータ
は、ＧＡＰアルゴリズムを用いた、（エンドギャップにはペナルティのない）ポ
リペプチド比較のデフォルトパラメータである。
【００７３】 他のアルゴリズム例として、Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ、Ｗｉｓｃｏｎｓ
ｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９、１９９７年９月で述べられている
アルゴリズムを含め、ギャップオープニングペナルティ、ギャップ伸張ペナルテ
ィ、比較マトリクスおよび類似性閾値を使用できる。行うべき特定の選択は、当
業者に既知であり、タンパク質対タンパク質、タンパク質対ＤＮＡなどの、行う
べき具体的な比較によって変化する。そしてさらに、比較が（一般にＧＡＰまた
はＢｅｓｔＦｉｔが好ましい）所与の配列間であるか、または（ケースＦＡＳＴ
ＡおよびＢＬＡＳＴＡが好ましい）１個の配列と配列の大規模なデータベースと
の間であるかによって変化する。
【００７４】 核酸分子 ＶＧＦポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化する核酸は
、化学合成、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリスクリーニング、発現ライブラリ
スクリーニング、および／またはｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を、制限なく含む、さま
ざまな方法で容易に入手できる。
【００７５】 本明細書で使用する組換えＤＮＡ法は一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １
９８９）およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、編， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅ
ｒｓ Ｉｎｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ １９９４）で述べら
れている方法である。
【００７６】 ＶＧＦポリペプチドのアミノ酸配列をコード化する核酸分子は、発現タンパク
質の特性に基づく陽性クローンの検出を用いた発現クローニングによって同定さ
れる。通常、核酸ライブラリは、抗体または他の結合パートナー（たとえばレセ
プターまたはリガンド）を、宿主細胞表面で発現および表示されるクローン化タ
ンパク質に結合させることによってスクリーニングされる。抗体または結合パー
トナーは、望ましいクローンを発現する細胞を同定する検出可能な標識を用いて
修飾される。
【００７７】 以下で述べる説明に従って実施する組換え発現技術に従うと、これらのポリヌ
クレオチドが生成され、コード化ポリペプチドが発現される。たとえば、ＶＧＦ
ポリペプチドのアミノ酸配列を適切なベクター内にコード化する核酸および配列
を挿入することによって、当業者は大量の望ましいヌクレオチド配列をただちに
製造できる。次に配列を用いて、検出プローブまたは増幅プライマーを作成でき
る。あるいは、ＶＧＦポリペプチドのアミノ酸配列をコード化するポリヌクレオ
チドを発現ベクター内に挿入できる。発現ベクターを適切な宿主に挿入すること
によって、コード化ポリペプチドが大量に製造される。
【００７８】 適切な核酸配列を得る別の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。
この方法では、ｃＤＮＡはポリ（Ａ）＋ＲＮＡまたはＲＮＡ全体より、酵素逆転
写酵素を用いて調製される。２個のプライマーは、一般にＶＧＦポリペプチドの
アミノ酸配列をコード化するｃＤＮＡの２個の独立領域に相補的であり、次に、
ＴａｑポリメラーゼなどのポリメラーゼとともにｃＤＮＡに添加され、ポリメラ
ーゼは２個のプライマーの間のｃＤＮＡ領域を増幅する。
【００７９】 ＶＧＦポリペプチドのアミノ酸配列をコード化する核酸分子を調製する別の方
法は、Ｅｎｇｅｌｓら、１９８９， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔｌ．
Ｅｄ． ２８：７１６−３４に記載された方法をなど、当業者に既知の方法を用
いた化学合成である。これらの方法は特に、核酸合成のためのホスホトリエステ
ル、ホスホラミダイトおよびＨ−ホスホネート法を含む。そのような化学合成に
好ましい方法は、標準ホスホラミダイト化学作用を用いたポリマー支援合成であ
る。通常、ＶＧＦポリペプチドのアミノ酸配列をコード化するＤＮＡは、長さ数
百ヌクレオチドとなる。約１００ヌクレオチドよりも大きい核酸は、これらの方
法を用いて複数の断片として合成できる。次に断片をともに連結して、ＶＧＦ遺
伝子の全長ヌクレオチド配列を作成することができる。通常、ポリペプチドのア
ミノ末端をコード化するＤＮＡフラグメントは、メチオニン残基をコード化する
ＡＴＧを有する。このメチオニンはＶＧＦポリペプチドの成熟型では、宿主細胞
内で生成されるポリペプチドがその細胞から分泌されるように設計されているか
いないかによって、存在する場合と、存在しない場合がある。当業者に既知の他
の方法も同様に使用できる。
【００８０】 ある実施形態では、核酸変異型は、所与の宿主細胞中でのＶＧＰポリペプチド
を最適に発現するよう改変されたコドンを含む。特定のコドン変化は、発現のた
めに選択されたＶＧＦポリペプチドと宿主細胞によって代われる。このような「
コドン最適化」は、たとえば所与の細胞内で高度に発現された遺伝子について好
ましいコドンを選択することにより、各種の方法で実施できる。高度に発現した
最近遺伝子のコドン優先のための「Ｅｃｏ＿ｈｉｇｈ．Ｃｏｄ」などの、コドン
頻度表を含む、コンピュータアルゴリズムを使用するか、ウィスコンシン州大学
のＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０（Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）。他の有
用なコドン頻度表としては、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ，」「Ｃｅ
ｌｅｇａｎｓ＿ｌｏｗ．ｃｏｄ，」「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ
，」「Ｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ，」「Ｍａｉｚｅ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ，」
および「Ｙｅａｓｔ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」が挙げられる。
【００８１】 場合によっては、ＶＧＦポリペプチド変異型をコード化する核酸分子を調製す
ることが望ましい。変異型をコード化する核酸分子は、プライマーが望ましい点
突然変異を有する、特定部位の突然変異誘発、ＰＣＲ増幅または他の適切な方法
を用いて作成される（突然変異誘発技術の説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら
、同上およびＡｕｓｕｂｅｌら、同上を参照）。Ｅｎｇｅｌｓら、同上による方
法を用いた化学合成も、このような変異型の調製に用いる。当業者に既知の方法
も同様に使用される。
【００８２】 ベクターおよび宿主細胞 ＶＧＦポリペプチドのアミノ酸配列をコード化する核酸分子は、標準連結技術
を用いて適切な発現ベクター内に挿入される。通常、使用する特定の宿主細胞内
で機能するベクターを選択する（すなわちベクターは、遺伝子の増幅および／ま
たは遺伝子の発現が発生するように、宿主細胞機構と適合性がある）。ＶＧＦポ
リペプチドのアミノ酸配列をコード化する核酸分子は、原核細胞、酵母、昆虫（
バキュロウイルス系）および／または真核宿主細胞内で増幅／発現される。宿主
細胞の選択は一部は、ＶＧＦポリペプチドが翻訳後に修飾されるかどうかによっ
て変わる（たとえば、グリコシル化および／またはホスホリル化）。そのような
場合、昆虫または哺乳類宿主細胞が好ましい。発現ベクターの総説については、
Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ．， ｖｏｌ．１８５（Ｄ．Ｖ． Ｇｏｅｄｄｅｌ編、Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９０）。
【００８３】 通常、何らかの宿主細胞で使用する発現ベクターは、プラスミド維持と外来性
ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含む。ある実施形態
において、総称的に「フランキング配列」と呼ばれるそのような配列は、通常、
以下のヌクレオチド配列の１以上を含む：プロモータ、１以上のエンハンサ配列
、複製源、転写終了配列、供与体および受容体部位を含む完全なイントロン配列
、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコード化する配列、リボソーム結合
部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコード化する核酸を挿入
するためのポリリンカ領域、選択可能なマーカー要素。これらの配列はそれぞれ
以下で説明する。
【００８４】 ベクターは随意に、「ｔａｇ」コード化配列、すなわちＶＧＦポリペプチドコ
ード化配列の５’および３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含むこと
がある；オリゴヌクレオチド配列はポリＨｉｓ（ｈｅｘａＨｉｓなど）、または
ＦＬＡＧ、ＨＡ（血球凝集素インフルエンザウィルス）などの別の「ｔａｇ」、
または市販の抗体が存在するｍｙｃをコード化する。このｔａｇは通常、ポリペ
プチドの発現時にポリペプチドに融合し、宿主細胞からＶＧＦポリペプチドを親
和性精製する手段として作用する。親和性精製はたとえば、親和性マトリクスと
してのｔａｇに対する抗体を用いたカラムクロマトグラフィーによって行える。
次にｔａｇは随意に、開裂のためのあるペプチダーゼを用いた各種手段によって
、精製されたＶＧＦポリペプチドから除去できる。
【００８５】 フランキング配列は相同性（すなわち宿主細胞と同じ種および／または菌株に
よる）、非相同性（すなわち宿主細胞の種または菌株以外の種による）、ハイブ
リッド（すなわち１以上の供給源によるフランキング配列の組合せ）または合成
であり、またはフランキング配列は、通常、ＶＧＦポリペプチド発現を調節する
よう機能するネイティブの配列でもよい。そのためフランキング配列源は、フラ
ンキング配列が宿主細胞機構において機能し、宿主細胞機構によって活性化可能
であれば、原核または真核生物、脊椎または無脊椎生物、または植物でもよい。
【００８６】 有用なフランキング配列は、当業者に既知の複数の方法のいずれかによって実
施される。通常、本明細書でフランキング配列−ＶＧＦ遺伝子フランキング配列
以外−は、マッピングおよび／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって以前
に同定されており、そのため、適切なエンドヌクレアーゼを用いて、適切な組織
源から分離できる。場合によっては、フランキング配列の全ヌクレオチド配列が
知られている。ここでは、フランキング配列は、核酸合成またはクローニングに
ついて本明細書で述べた方法を用いて合成されることがある。
【００８７】 フランキング配列のすべて、または一部のみが既知である場合、ＰＣＲを用い
て、および／または適切なオリゴヌクレオチドおよび／または、同一または別の
種によるフランキング配列断片を用いてゲノムライブラリをスクリーニングする
ことによって得られる。フランキング配列が未知の場合、フランキング配列を含
むＤＮＡフラグメントは、たとえばコーディング配列またはさらに別の遺伝子を
含むＤＮＡのさらに大きな一片より単離される。単離は、適切なＤＮＡフラグメ
ントを作成するための制限エンドヌクレアーゼ消化によって行われ、、次にアガ
ロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎカラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔ
ｈ， ＣＡ）を用いた分離、または当業者に既知の他の方法によって行われる。
この目的を達成するための適切な酵素を選択は、当業者にはただちに明白となる
。
【００８８】 複製源は通常、市販の原核発源ベクターの一部であり、宿主細胞中でのベクタ
ー増幅の源補助である。あるコピー数へのベクターの増幅は、場合によってはＶ
ＧＦポリペプチドの最適発現にとって重要である。ベクターをある数に増幅する
ことは、場合によってはＶＧＦポリペプチドの最適発現にとって重要である。選
択したベクターが複製部位源を含んでいない場合、既知配列に従って源複製を化
学合成し、ベクター内に連結される。たとえばプラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ビバリー、マサチューセッツ）は、大半の
グラム陰性細菌に適しており、各種の源（たとえばＳＶ４０、ポリオーマ、アデ
ノウィルス、水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）またはＨＰＶまたはＢＰＶなどの乳
頭腫ウイルス）は哺乳類細胞のクローニングベクターに有用である。一般に複製
成分源は、哺乳類発言ベクターには不要である（たとえば、ＳＶ４０源は初期プ
ロモータを含んでいるというだけで使用されることが多い）。
【００８９】 転写終了配列は通常、ポリペプチドコーディング領域末端の３’に位置し、転
写を終了させる。一般に原核細胞における転写終了配列は、Ｇ−Ｃが豊富な断片
であり、これにポリ−Ｔ配列が続く。配列はライブラリから容易に転写されたり
、ベクターの一部として購入されさえするが、本明細書で述べるような核酸合成
方法を用いて即座に合成することもできる。
【００９０】 選択可能なマーカー遺伝子要素は、選択的培地で培養される宿主細胞の生存お
よび増殖に必要なタンパク質をコード化する。代表的な選択マーカー遺伝子は、
（ａ）たとえばアンピシリン、テトラサイクリン、または原核宿主細胞へのカナ
マイシン抗生物質または他の毒素に対する耐性を付与する；（ｂ）細胞の栄養要
求性欠失を補完する；または（ｃ）複合培地から利用できない必須栄養素を供給
するタンパク質をコード化する。好ましい選択的マーカーは、カナマイシン耐性
遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。ネ
オマイシン耐性遺伝子も、原核および真核宿主細胞での選択に使用される。
【００９１】 他の選択遺伝子を用いて、発現される遺伝子を増幅することもある。増幅は、
成長のために重要なタンパク質の製造に非常に必要な遺伝子を、組換え細胞の連
続世代の染色体内で、縦に並べて反復するプロセスである。哺乳類細胞の適切な
選択的マーカーの例として、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）およびチミジン
キナーゼが挙げられる。哺乳類細胞形質転換体は、選択圧下で配置され、形質転
換体がベクター内に存在する選択遺伝子によって生存するよう独自に調整される
。選択圧は、培地中の選択剤の濃度が連続的に変化し、そのことが選択遺伝子と
ＶＧＦポリペプチドをコード化する遺伝子の両方の増幅につながる条件下で形質
転換細胞を培養することによって加えられる。結果としてＶＧＦポリペプチドが
増幅ＤＮＡから増量されて合成される。
【００９２】 リボソーム結合部位は通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、Ｓｈｉｎｅ−
Ｄａｌｇａｍｏ配列（原核生物）またはＫｏｚａｋ配列（真核生物）によって特
徴付けられる。この要素は通常、発現されるＶＧＦポリペプチドのプロモータに
対しては３’、コード化配列に対しては５’に位置する。Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇ
ａｍｏ配列は変化するが、通常はポリプリン（すなわちＡ−Ｇ含有率が高い）で
ある。多くのＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｍｏ配列が同定され、それぞれ本明細書で
述べる方法を用いて即座に合成され、原核ベクター内で使用できる。
【００９３】 リーダー配列、すなわちシグナル配列を用いて、宿主細胞外部にＶＧＦポリペ
プチドを指示することもある。通常、シグナル配列をコード化するヌクレオチド
配列は、ＶＧＦ核酸分子のコード化領域内に配置されるか、ＶＧＦポリペプチド
コード化領域の５’末端に直接配置される。多くのシグナル配列が同定されてお
り、選択された宿主細胞内で機能するシグナル配列は、ＶＧＦ核酸分子とともに
使用される。したがってシグナル配列はＶＧＦ核酸分子に対して相同性（天然型
）または非相同性である。さらにシグナル配列は、本明細書で述べる方法を用い
て化学合成される。大半の場合において、信号ペプチドが存在すると、ＶＧＦポ
リペプチドが宿主細胞から分泌され、それによって分泌されたＶＧＦポリペプチ
ドから信号ペプチドが除去される。シグナル配列はベクターの成分であるか、ベ
クター内に挿入されるＶＧＦ核酸分子の一部である。
【００９４】 ネイティブのＶＧＦポリペプチドシグナル配列をコード化する核酸配列がＶＧ
Ｆポリペプチドコーディング領域に結合されるか、非相同性シグナル配列がＶＧ
Ｆポリペプチドコード化領域に結合される。選択された非相同性シグナル配列は
、宿主細胞により、信号ペプチダーゼにより認識および処理、すなわち開裂され
る非相同性シグナル配列であることが望ましい。ネイティブのＶＧＦポリペプチ
ドシグナル配列を認識および処理しない原核宿主細胞の場合、シグナル配列は、
たとえばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼまたは熱安定性エンテロトキ
シンＩＩリーダーの群から選択された原核シグナル配列によって置換される。酵
母分泌の場合、ネイティブのＶＧＦポリペプチドシグナル配列は、酵母転化酵素
、アルファ因子または酸ホスファターゼリーダーによって置換される。哺乳類細
胞発現では、他の哺乳類シグナル配列が適している場合があるが、ネイティブの
シグナル配列で十分である。
【００９５】 真核宿主細胞発現系においてグリコシル化が望ましい一部の場合では、グリコ
シル化または収量を増加させるために、各種のプリ配列を操作してもよい。たと
えば、特定の信号ペプチドのペプチダーゼ開裂部位を変更したり、プロ配列を添
加してもよく、このこともグリコシル化に影響を与える。最終タンパク質生成物
は、（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対する）−１位置に、完全には除去さ
れなかった、発現を発生しやすい１以上の付加アミノ酸を持つことがある。たと
えば、最終タンパク質生成物は、アミノ酸末端に付加された、ペプチダーゼ開裂
部位に見られる１または２のアミノ酸残基を持つことがある。あるいは、一部の
酵素開裂部位を用いると、酵素が成熟ポリペプチド内のそのような区域で切断す
る場合、でわずかに切断された形の望ましいＶＧＦポリペプチドが生じることが
ある。
【００９６】 多くの場合、ベクター内に１以上のイントロンが存在すると、核酸分子の転写
が増加する；これは、ポリペプチドが真核宿主細胞、特に哺乳類細胞内で生成さ
れる場合に特にあてはまる。使用されるイントロンは、特に使用される遺伝子が
全長ゲノム配列またはその断片である場合、ＶＧＦ遺伝子内で天然発生すること
がある。イントロンが遺伝子内で天然発生しない場合（大半のｃＤＮＡに関して
）、イントロンは別の源から得られる。イントロンは有効となるように転写され
ねばならないため、フランキング配列およびＶＧＦ遺伝子に対するイントロンの
位置は、一般に重要である。それゆえＶＧＦ ｃＤＮＡ分子が転写される場合、
イントロンの好ましい位置は転写開始部位に対して３’、ポリ−Ａ転写終了配列
に対して５’である。好ましくは１個または複数のイントロンは、コーディング
配列を中断しないように、ｃＤＮＡの片側または反対側（すなわち５’または３
’）に配置されることが好ましい。イントロンが挿入される宿主細胞と適合性が
あれば、ウィルス、原核および真核（植物または動物）生物を含むあらゆる源に
よるあらゆるイントロンを使用できる。１以上のイントロンを随意にベクター内
に使用できる。
【００９７】 発現およびクローニングベクターは通常、宿主生物に認識され、ＶＧＦポリペ
プチドをコード化する分子に操作可能に結合されるプロモータを含む。プロモー
タは、構造遺伝子の転写を制御する、構造遺伝子（一般に約１００〜１０００ｂ
ｐ）の開始コドンの上流に（すなわち５’）位置する未転写配列である。プロモ
ータは従来、２つのクラスにグループ分けされる：誘発性プロモータと構造性プ
ロモータである。誘発性プロモータは、栄養素の有無または温度変化などの培養
条件のある変化に反応して、その制御下でＤＮＡから上昇したレベルの転写を開
始する。これに対して、構造性プロモータは連続遺伝子生成物の生成を開始する
；すなわち遺伝子発現に対してほとんどまたはまったく制御がない。潜在的な宿
主細胞によって認識される多数のプロモータが既知である。適切なプロモータは
、元のＤＮＡからプロモータを除去し、望ましいプロモータ配列をベクターに挿
入することによって、ＶＧＦポリペプチドをコード化するＤＮＡに操作可能に結
合される。ネイティブのＶＧＦプロモータ配列を用いて、ＶＧＦ核酸分子の増幅
および／または発現を指示できる。しかし、ネイティブのプロモータと比較して
発現タンパク質の転写が多く、収量が高いならば、そして、使用するために選択
された宿主細胞システムと適合性があるならば、非相同性プロモータが好ましい
。
【００９８】 原核宿主による使用に適したプロモータとしては、ベータ−ラクタマーゼおよ
びラクトースプロモータ系；アルカリホスファターゼ；トリプトファン（ｔｒｐ
）プロモータ系；およびｔａｃプロモータなどのハイブリッドプロモータが挙げ
られる。他の既知の細菌プロモータも適している。その配列は後悔されているた
め、当業者は、有用な制限部位を供給するために必要なリンカまたはアダプタを
使用して、それらを望ましいＤＮＡ配列に連結できる。
【００９９】 酵母宿主による使用に適した適切なプロモータは当業界で既知である。酵母エ
ンハンサは酵母プロモータと都合よく使用される。哺乳類宿主細胞による使用に
適したプロモータは既知であり、これに限定されるわけではないが、ポリオーマ
ウイルス、鶏痘ウィルス、アデノウィルス（アデノウィルス２など）、ウシ乳頭
腫ウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型
肝炎が含まれ、最も好ましくはサルウィルス４０（ＳＶ ４０）である。他の適
切な哺乳類プロモータとしては、たとえば熱ショックプロモータおよびアクチン
プロモータなどの、非相同性哺乳類プロモータが挙げられる。
【０１００】 ＶＧＦ遺伝子の発現で興味のある他のプロモータとしては、これに限定される
わけではないが：ＳＶ４０初期プロモータ領域、（Ｂｅｒｍｏｉｓｔ ａｎｄ
Ｃｈａｍｂｏｎ， １９８１， Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−１０）；ＣＭ
Ｖプロモータ；ラウス肉腫ウィルスの３’長末端反復に含まれるプロモータ（Ｙ
ａｍａｍｏｔｏ，ら、１９８０， Ｃｅｌｌ ２２：７８７−９７）；ヘルペス
チミジンキナーゼプロモータ（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａ
ｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７８：１４４４−４５）；メタ
ロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２， Ｎａｔｕｒ
ｅ ２９６：３９−４２）；ベータ−ラクタマーゼプロモータなどの原核発現ベ
クター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ
． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ７５：３７２７−３１）；または
ｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８０：２１−２５）が挙げられる。組
織特異性を示し、遺伝子導入動物で使用されてきた、以下の動物転写制御領域も
興味がある：膵臓腺房細胞で活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉ
ｆｔら、１９８４， Ｃｅｌｌ ３８：６３９−４６；Ｏｍｉｔｚら、１９８６
， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉ
ｏｌ． ５０：３９９−４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ， １９８７
， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５−５２５）；膵臓ベータ細胞で活性であ
るインシュリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ １９８５， Ｎａｔｕｒｅ
３１５：１１５−２２）；リンパ細胞で活性である免疫グロブリン遺伝子制御領
域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８４， Ｃｅｌｌ ３８：６４７−５８，
Ａｄａｍｅｓら、１９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３−３８；Ａｌｅｘ
ａｎｄｅｒら、１９８７， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ７：１４３
６−４４）；精巣、乳房、リンパおよびマスト細胞で活性であるマウス乳房腫瘍
ウィルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら、１９８６， Ｃｅｌｌ ４５：４８５−９５
）；肝臓で活性であるアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７
， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ． １：２６８−７６）；肝臓で活性であ
るアルファ−フェト−タンパク質遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、１９８
５， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ５：１６３９−４８；Ｈａｍｍｅ
ｒら、１９８７， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：５３−５８）；肝臓で活性である
アルファ１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら、１９８７，
Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ． １：１６１−７１）；骨髄細胞で活性であ
るベータ−グロブリン遺伝子制御領域（Ｍｏｒｇｒａｍら、１９８５， Ｎａｔ
ｕｒｅ ３１５：３３８−４０；Ｋｏｌｌｉａｓら、１９８６， Ｃｅｌｌ ４
６：８８−９４）；脳の希突起膠細胞で活性であるミエリン塩基性タンパク質遺
伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、１９８７， Ｃｅｌｌ ４８：７０３−１
２）；骨格筋で活性であるミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ， １９
８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−８６）および視床下部で活性である性
腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら、１９８６， Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２３４：１３７２−７８）。
【０１０１】 ＶＧＦポリペプチドをコード化するＤＮＡのさらに高等な真核生物における転
写を向上させるために、エンハンサ配列はベクター内に挿入される。エンハンサ
はＤＮＡのｃｉｓ−作用要素であり、通常約１０−３００ｂｐ長であり、転写を
向上させるためにプロモータに作用する。エンハンサは比較的、方向および位置
依存性である。これらは転写単位に対して５’および３’に発見されている。哺
乳類遺伝子より入手できる複数のエンハンサ配列が既知である（たとえばグロビ
ン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−フェトタンパク質およびインシュリ
ン）。しかし一般に、ウィルスによるエンハンサが使用される。ＳＶ４０エンハ
ンサ、サイトメガロウィルス初期プロモータエンハンサ、ポリオーマエンハンサ
およびアデノウィルスエンハンサは、真核プロモータの活性化のための代表的な
エンハンサ要素である。エンハンサはベクター内の、ＢＦＧ核酸分子に対して位
置５’または３’にスプライスされるが、通常、プロモータからの部位５’に配
置される。
【０１０２】 発現ベクターは、市販ベクターなどの開始ベクターから作成される。このよう
なベクターは、望ましいフランキング配列をすべて含んでいる場合と、含んでい
ない場合がある。本明細書で述べる１以上のフランキング配列がまだベクター内
に存在しない場合、それらを個々に入手して、ベクター内に連結させる。それぞ
れのフランキング配列を入手するのに用いる方法は、当業者に既知である。
【０１０３】 好ましいベクターは、細菌、昆虫および哺乳類宿主細胞と適合性のあるベクタ
ーである。そのようなベクターとしては特に、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３およびｐｃ
ＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ サンディエゴ、カリフォルニア州）、ｐ
ＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラホーヤ、カリフォルニア州）ｐＥＴ１５（
Ｎａｖａｇｅｎ、マジソン、ウィスコンシン州）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， ピスカタウェイ、ニュージャージー）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ
２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、パロアルト、カリフォルニア）、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢ
ａｃＩＩ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＳＲ−ａｌｐｈａ（ＰＣＴ公報第Ｗ
Ｏ ９０／１４３６３号）およびｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲ
Ｌ、グランドアイランド、ニューヨーク州）が挙げられる。
【０１０４】 別の適したベクターとしてはこれに限定されるわけではないが、コスミド、プ
ラスミドまたは修飾ウィルスが挙げられるが、ウィルス系は選択した宿主細胞と
適合性がなければならないことは認識されるであろう。そのようなウィルスとし
ては、これに限定されるわけではないが、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プ
ラスミド誘導体（高複写数ＣｏｌＥ１ベースファージミド、Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ラホーヤ、カリフォルニア州）、Ｔａｑ
−増幅ＰＣＲ生成物のクローニング用に設計されたＰＣＲクローニングプラスミ
ド（たとえばＴＯＰＯ（商標） ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キット、Ｐ
ＣＲ２．１（登録商標）プラスミド誘導体、Ｉｎｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド
、カリフォルニア州）および哺乳類、酵母またはバキュロウィルス発現系などの
ウィルスベクター（ｐＢａｃＰａｋプラスミド誘導体、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、パロ
アルト、カリフォルニア州）が挙げられる。
【０１０５】 ベクターを作成し、ＶＧＦポリペプチドをコード化する核酸分子がベクターの
正しい場所に挿入した後、増幅および／またはポリペプチド発現のために、完成
したベクターを適切な宿主細胞内に挿入できる。選択宿主細胞内へのＶＧＦポリ
ペプチドのために発現ベクターは、形質移入、感染、塩化カルシウム電気穿孔、
微量注入、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン法などの方法、または他
の既知の技術を含む、既知の方法で形質転換できる。選択された方法は一部は、
使用する宿主細胞の種類の関数となる。これらの方法および他の適切な方法は、
当業者に既知であり、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら、同上で述べられている。
【０１０６】 宿主細胞は、原核宿主細胞（大腸菌など）または真核宿主細胞（酵母、昆虫、
または脊椎動物細胞）でよい。宿主細胞は、適切な条件下で培養すると、ＶＧＦ
ポリペプチドが合成され、次に培地からこれを収集できる（宿主細胞が培地中に
分泌する場合）か、それを生成する宿主細胞から直接収集できる（分泌しない場
合）。適切な宿主細胞の選択は、望ましい発現レベル、（グリコシル化またはリ
ン酸化などの）活性に望ましいまたは必要なポリペプチド修飾、および生物活性
分子内への折畳みのしやすさなどの、各種の因子によって変わる。
【０１０７】 多くの適切な宿主細胞が当業者に既知であり、多くがＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙ
ｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、マナッサス、ヴァ
ージニア州から入手できる。例としては、これに限定されるわけではないが、チ
ャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＨＯ ＤＨＦＲ（−）細胞（Ｕｒ
ｌａｕｂら、１９８０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ
．Ｓ．Ａ． ９７：４２１６−２０）、ヒト胚腎臓２９３または２９３Ｔ細胞、
または３Ｔ３細胞などの哺乳類細胞が挙げられる。適切な哺乳類宿主細胞および
形質転換、培養、増幅、スクリーニング、生成物製造および精製の方法は、当業
者に既知である。他の適切な哺乳類細胞系は、サルＣＯＳ−１およびＣＯＳ−７
細胞系、およびＣＶ−１細胞系である。さらに哺乳類細胞の例としては、形質転
換細胞系を含む霊長類細胞系およびげっ歯類細胞系が挙げられる。正常な二倍体
細胞、一次組織のインビトロ培養に由来する細胞菌株も、一次組織片と同様に適
している。候補細胞も、選択遺伝子において遺伝子型的に欠陥であるか、優性に
作用する選択遺伝子を含む。他の適切な哺乳類細胞系としては、これに限定され
るわけではないが、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２
９細胞、Ｓｗｉｓｓ、Ｂａｌｂ−ｃまたはＮＩＨマウスに由来する３Ｔ３系、Ｂ
ＨＫまたはＨａｋハムスター細胞系が挙げられる。これらの細胞系はそれぞれ、
タンパク質発現の当業者によって既知であり、使用可能である。
【０１０８】 適切な宿主細胞として同様に有用なのは、細菌細胞である。たとえば、大腸菌
（たとえばＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＤＨ１０およびＭＣ１０６１）は、バイオテ
クノロジーの分野では宿主細胞として知られている。Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、他のＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅ ｓｐｐ．、などもこの方法で利用できる。
【０１０９】 当業者に既知の酵母細胞の多くの菌株も、ＶＧＦポリペプチド発現の宿主細胞
として利用できる。好ましい宿主細胞としてはたとえば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅおよびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられ
る。
【０１１０】 加えて、好ましい場合は、昆虫細胞系をＶＧＦポリペプチドの発現に使用して
もよい。このようなシステムはたとえば、Ｋｉｔｔｓら、１９９３， Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １４：８１０−１７；Ｌｕｃｋｌｏｗ， １９９３，
Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４：５６４−７２；および
Ｌｕｃｋｌｏｗら、１９９３， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６７：４５６６−７９
で述べられている。好ましい昆虫細胞はＳｆ−９およびＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ）である。
【０１１１】 遺伝子導入動物を用いて、グリコシル化ＶＧＦポリペプチドを発現させてもよ
い。たとえば、遺伝子導入ミルク生産動物（たとえば牝牛またはヤギ）を使用し
て、動物ミルク中に存在するグリコシル化ポリペプチドを得てもよい。植物を使
用してＶＧＦポリペプチドを製造してもよいが、一般に、植物で発生するグリコ
シル化は、哺乳類細胞で生成されるものとは異なり、ヒト治療用途に適さないグ
リコシル化生成物が生じる。
【０１１２】 ポリペプチド生成 ＶＧＦポリペプチド発現ベクターを含む宿主細胞は、当業者に既知の標準培地
を用いて培養できる。培地は通常、細胞の増殖および生存に必要なすべての栄養
素を含む。大腸菌細胞を培養するのに適切な培地としてはたとえば、ルリア培養
液（ＬＢ）および／またはＴｅｒｒｉｆｉｃ培養液（ＴＢ）が挙げられる。真核
細胞の培養に適した培地としては、ロズウェルパーク記念研究所培地１６４０（
ＲＰＭＩ １６４０）、最少必須培地（ＭＥＭ）および／またはダルベッコの修
正イーグル培地（ＤＭＥＭ）が挙げられ、これらはすべて培養される特定の細胞
系により必要に応じて、血清および／または成長因子を補足してもよい。昆虫培
養物に適した培地は、必要に応じてイーストレート、ラクタルブミン、加水分解
物および／またはウシ胎仔血清を補足したグレース培地である。
【０１１３】 一般に、形質移入または形質転換細胞の選択的増殖に有用な抗生物質または他
の化合物は、培地への補足物として添加する。使用される化合物は、宿主細胞が
形質転換されるプラスミド上に存在する選択可能なマーカー要素によって指示さ
れる。たとえば、選択可能マーカー要素がカナマイシン耐性である場合、培地に
添加される化合物はカナマイシンとなる。選択的成長の他の化合物は、アンピシ
リン、テトラサイクリンおよびネオマイシンである。
【０１１４】 宿主細胞によって生成されるＶＧＦポリペプチドの量は、当業者に既知の標準
方法を用いて評価できる。そのような方法としては、制限なく、ウェスタンブロ
ット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離、免疫沈澱および／またはＤＮＡ結
合ゲル移動アッセイなどの活性アッセイが挙げられる。
【０１１５】 ＶＧＦポリペプチドは宿主細胞から分泌されるように設計される場合、ポリペ
プチドの大多数は、細胞倍値に見られる。しかしＶＧＦポリペプチドが宿主から
分泌されない場合、細胞質および／または核（真核宿主細胞の場合）またはサイ
トゾル（グラム陰性細菌宿主細胞の場合）に存在する。
【０１１６】 宿主細胞の細胞質および／または核（真核宿主細胞の場合）またはサイトゾル
（グラム陰性細菌宿主細胞の場合）に位置するＶＧＦポリペプチドの場合、細胞
内物質（グラム陰性細菌の封入体を含む）は、当業者に既知の標準技術を用いて
宿主細胞から抽出できる。たとえば、宿主細胞を溶解させて、フレンチプレス、
均質化および／または超音波処理後の遠心分離などによって、周辺質／細胞質の
内容を放出させることができる。
【０１１７】 ＶＧＦポリペプチドが細胞質中に封入体を生成した場合、封入体は内部および
／または外部細胞膜に結合することが多いため、主に、遠心分離後のペレット物
質中に見られる。ペレット物質は次に、アルカリｐＨではジチオスレイトールま
たは酸性ｐＨではｔｒｉｓカルボキシエチルホスフィンなどの還元剤の存在下で
、ｐＨ極値にて、または洗剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素または尿素
誘導体などのカオトロピック剤を用いて処理され、封入体を放出、分解および溶
解する。溶解化ＶＧＦポリペプチドは次に、ゲル電気泳動、免疫沈澱などを用い
て分析できる。ＶＧＦポリペプチドを分離することが望ましい場合、分離は、本
明細書およびＭａｒｓｔｏｎら、１９９０， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ．， １８２
：２６４−７５で述べる標準方法を用いて行える。
【０１１８】 一部の場合では、ＶＧＦポリペプチドは分離に対して生物活性ではない。ポリ
ペプチドを三次構造に「再折畳み」または変換し、ジスルフィド連結を作成する
各種方法を用いて、生物活性を復元できる。そのような方法としては、溶解ポリ
ペプチドを、通常７を超えるｐＨに、特定濃度のカオトロープの存在下で曝露す
ることを含む。カオトロープの選択は、封入体溶解の選択と非常に似ているが、
通常、カオトロープはさらに低い濃度で使用され、必ずしも溶解に用いたのと同
じカオトロープではない。大半の場合、再折畳み／酸化溶液も、還元剤または特
定比の還元剤およびその酸化形を含み、ジスルフィドシャッフリングをタンパク
質のシステインブリッジ形成時に発生させる、特定の酸化還元電位を生成する。
一般に使用される酸化還元対の一部には、システイン／シスタミン、グルタチオ
ン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）
／ジチアン、ＤＴＴ、および２−２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ
−ｂ（ＭＥ）が含まれる。多くの例において、再折畳みの効率を高めるために、
共溶媒が用いられるか、必要となり、この目的に使用される一般的な試薬として
は、グリセロール、各種分子量のポリエチレングリコール、アルギニンなどが挙
げられる。
【０１１９】 封入体がＶＧＦポリペプチドの発現時に大量に生成されない場合、ポリペプチ
ドは主に、細胞ホモゲネートの遠心分離後に上澄中に見られる。ポリペプチドは
さらに、本明細書で述べるような方法を用いて、上澄から分離される。
【０１２０】 溶液からのＶＧＦポリペプチドの生成は、各種の技術を用いて行うことができ
る。ポリペプチドがカルボキシルまたはアミノ末端のどちらかに、ヘキサヒスチ
ジン（ＶＧＦポリペプチド／ｈｅｘａＨｉｓ）などのｔａｇまたはＦＬＡＧ（Ｅ
ａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．， ニューヘブン、コネチカット）またはｍ
ｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， カールスバッド、カリフォルニア州）などの他
の小さなペプチドを含む場合、カラムマトリクスがｔａｇに対する高い親和性を
有する親和性カラムに溶液を通過させて、１ステッププロセスによって精製でき
る。
【０１２１】 たとえば、ポリヒスチジンは高い親和性および特異性でニッケルに結合する。
それゆえ、ニッケルの親和性カラム（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ニッケルカラム
など）はＶＧＦポリペプチド／ポリＨｉｓの精製に使用できる。たとえばＣｕｒ
ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
１０．１１．８節（Ａｕｓｕｂｅｌら編， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ
Ｉｎｃ． ａｎｄ Ｗｉｅｌｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ １９９３）を参照。
【０１２２】 さらにＶＧＦポリペプチドは、ＶＧＦポリペプチドを特異的に認識および結合
できるモノクローナル抗体を用いて精製してもよい。
【０１２３】 部分的または実質的に汚染物質を含まないように、部分的または完全にＶＧＦ
ポリペプチドを精製することが好ましい場合、当業者に既知の標準方法を使用し
てもよい。このような方法は、制限なく、電気泳動に続く電気泳動溶出による分
離、各種のクロマトグラフィー（親和性、免疫親和性、分子ふるいおよびイオン
交換）、ＨＰＬＣおよび分取等電点焦点化法（「Ｉｓｏｐｒｉｍｅ」機械／技術
、Ｈｏｅｆｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、サンフランシスコ、カリフォルニア州
）が含まれる。場合によっては２つ以上の精製技術を組合わせて、純度を向上さ
せる。
【０１２４】 ＶＧＦポリペプチドは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、１９６３， Ｊ． Ａｍ．
Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．８５：２１４９；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、１９８５， Ｐ
ｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：５１３２；Ｓｔ
ｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ， Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． １９８４）
が述べる方法などの当業者に既知の技術を用いた、（固相ペプチド合成などの）
化学合成法を用いて調製することもある。このようなポリペプチドは、アミノ末
端上にメチオニンがあっても、なくても合成される。化学的に合成されたＶＧＦ
ポリペプチドは、これらの文献で述べる方法を用いて酸化され、ジスルフィドブ
リッジを形成する。化学的に合成されたＶＧＦポリペプチドは、組換えによって
精製された、または天然源から精製された対応するＶＧＦポリペプチドに対して
匹敵する生物活性を持つことが予想されるため、組換えまたは天然ＶＧＦポリペ
プチドによって相互に置き換えて使用してもよい。
【０１２５】 ＶＧＦポリペプチドを得る別の手段は、ＶＧＦポリペプチドが天然に見られる
供給源組織および／または液体などの生物サンプルからの精製による。そのよう
な精製は、本明細書で述べるタンパク質精製方法を用いて実施できる。精製中の
ＶＧＦポリペプチドの存在は、たとえば組換え生成されたＶＧＦポリペプチドま
たはそのペプチドフラグメントに対して調製された抗体を用いて監視してもよい
。
【０１２６】 ポリペプチドを生成する別の方法が当業界で多数知られており、ＶＧＦポリペ
プチドに対する特異性を持つポリペプチドを生成する方法を使用できる。たとえ
ば、ｍＲＮＡとそのコード化ペプチド間の融合タンパク質の生成について述べて
いる、Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９９７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９４：１２２９７−３０３を参照。Ｒｏｂｅｒｔｓ，
１９９９， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ３：２６８
−７３も参照。
【０１２７】 米国特許第５，７６３，１９２号；第５，８１４，４７６号；第５，７２３，
３２３号および第５，８１７，４８３号は、ペプチドまたはポリペプチドの生成
プロセスについて述べている。これは、確率的遺伝子またはそのフラグメントを
生成し、次にこれらの遺伝子を、確率的遺伝子によってコード化される１以上の
タンパク質を生成する宿主細胞に導入して行う。宿主細胞は次に、望ましい活性
を有するペプチドまたはポリペプチドを生成するこれらのクローンを同定するた
めに、スクリーニングされる。
【０１２８】 ペプチドまたはポリペプチドを生成する別の方法は、Ａｔｈｅｒｓｙｓ社が提
出したＰＣＴ／ＵＳ９８／２００９４（ＷＯ９９／１５６５０）で述べられてい
る。「遺伝子発見のための遺伝子発現のランダム活性化」（ＲＡＧＥ−ＧＤ）と
して知られるプロセスは、ｉｎ ｓｉｔｕ組換え方法による遺伝子の内在性遺伝
子発現または遺伝子の過剰発現の活性化を含む。たとえば、内在性遺伝子の発現
は、相同性または非正統的組換えによって、遺伝子発現を活性化できる標的細胞
内に調節配列を組込むことによって、活性化または増加される。標的ＤＮＡは最
初に放射線を受け、遺伝プロモータが挿入される。プロモータは最終的に遺伝子
の前部に裂目を配置し、遺伝子の転写を開始する。これによって、望ましいペプ
チドまたはポリペプチドの発現が行われる。
【０１２９】 これらの方法は包括的なＩＬ−１７状のタンパク質発現ライブラリを作成する
のにも使用できることが認識されるであろう。このライブラリは次に、生化学ア
ッセイ、細胞アッセイおよび全生体アッセイ（たとえば植物、マウスなど）の各
種アッセイにおいて高いスループットの表現型スクリーニングに使用できる。
【０１３０】 合成 当業者は、本明細書で述べるＶＧＦポリペプチド分子が組換えまたは他の手段
によって生成することを認識するであろう。
【０１３１】 選択的結合剤 「選択的結合剤」という語は、１以上のＶＧＦポリペプチドに対する特異性を
有する分子を指す。適切な選択的結合剤としては、これに限定されるわけではな
いが、抗体およびその誘導体、ポリペプチド、および小型分子が挙げられる。適
切な選択的結合剤は、当業者に既知の方法を用いて調製される。本発明の代表的
なＶＧＦポリペプチド選択的結合剤は、ＶＧＦポリペプチドのある部分を結合可
能であり、そのためポリペプチドがＶＧＦポリペプチド受容体に結合するのを阻
害する。
【０１３２】 「抗原」という語は、その抗原のエピトープに結合可能な抗体を生成するため
に、選択的結合剤によって結合され、さらに動物において使用できる分子または
分子の一部を指す。抗原は１以上エピトープを有する。
【０１３３】 「エピトープ」という語は、結合剤の１以上の抗原結合領域において、選択的
結合剤によって認識され、結合されることが可能な任意の分子を指す。エピトー
プは通常、特異的な電荷特性とともに、特異性な三次元構造特性を有するアミノ
酸または糖側鎖などの分子の化学活性表面グルーピングより成る。「阻害エピト
ープ」および「中和エピトープ」という語は、選択的結合剤によって結合された
場合、エピトープを含む分子の生物活性はインビボで、インビトロでまたはイン
シトゥで、さらに好ましくはインビボで失われ、ＶＧＦポリペプチドのＶＧＦポ
リペプチド受容体の結合を含む。
【０１３４】 本明細書で使用されるように、「抗原結合領域」という語は、抗原と相互作用
し、結合剤に抗原に対する特異性および親和性を結合剤上に付与する、アミノ酸
残基を含む選択的結合剤の部分を指す。好ましくは抗原−結合領域は、マウス起
源となる。別の実施形態において、抗原−結合領域は、他の動物種、特にウサギ
、リスまたはハムスターなどの特定のげっ歯類に由来することが可能である。た
とえば、本発明の選択的結合剤の抗原−結合領域は、ヒトＶＧＦポリペプチドに
特異性である非ヒト抗体に由来することが好ましい。そのような非ヒト抗体をコ
ード化するＤＮＡの好ましい供給源としては、一般にハイブリドーマとして知ら
れる、ハイブリッド細胞系などの抗体を生成する細胞系が挙げられる。
【０１３５】 ＶＧＦポリペプチドを結合する抗体および抗体断片などの選択的結合剤は、本
発明の範囲内である。抗体は、断片；変異型；またはその誘導体と同様に、モノ
特異性ポリクローナルを含むポリクローナル；モノクローナル；組換え；キメラ
；ＣＤＲグラフトなどのヒト化；ヒト；単鎖；および／または２特異性でもよい
。抗体断片は、ＶＧＦポリペプチド上のエピトープに結合する抗体の部分を含む
。そのような断片の例としては、全長抗体の酵素開裂によって精製されたＦａｂ
およびＦ（ａｂ’）断片が挙げられる。他の結合断片としては、抗体可変領域を
コード化する核酸配列を含む組換えプラスミドの発現などのように、組換えＤＮ
Ａ技術によって生成された断片が含まれる。
【０１３６】 ポリクローナル抗体は、抗原によって免疫化された動物の血清から由来する抗
体の非相同個体群である。抗原は、さらに動物にその抗原のエピトープに結合可
能な抗体を生成するよう促す抗体によって結合できる、分子または分子の一部で
ある。抗原は１以上のエピトープを持つことができる。上で述べた特性反応は、
抗原が選択性の高い方法で、その対応する抗体と反応するが、他の抗原によって
誘起される多数の他の抗体とは反応しないことを示すものである。
【０１３７】 ＶＧＦポリペプチドに向けて指示するポリクローナル抗体は一般に、ＶＧＦポ
リペプチドおよびアジュバントを複数回、皮下または腹膜内注射することによっ
て、動物（たとえばウサギまたはマウス）において生成される。ＶＧＦポリペプ
チドを、キーホールリンペットヘモシニアン、血清、アルブミン、ウシサイログ
ロブリン、または大豆トリプシン阻害剤などの、免疫化される種において免疫原
性である担体タンパク質に結合することは有用である。また、ミョウバンなどの
凝集剤を用いると、免疫反応が高まる。免疫化の後、動物から採血し、血清を抗
ＶＧＦ抗体力価についてアッセイする。
【０１３８】 モノクローナル抗体は、実質的に抗原に特異性である相同性抗原個体群を含み
、この個体群は実質的に同様のエピトープ結合部位を含む。このような抗体は、
ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＧＩＬＤを含む免疫グロブリンクラスとその
サブクラスより成る。本発明のモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマは
、インビトロ、インシトゥまたはインビボで培養できる。インビボまたはインシ
トゥで高い力価を生成するのが、生成の好ましい方法である。
【０１３９】 ＶＧＦポリペプチドに向けて指示するモノクローナル抗体は、培養物中の連続
細胞系による抗体分子の生成について提供されている任意の方法を用いて生成さ
れる。モノクローナル抗体を調製する適切な方法の例としては、Ｋｏｈｌｅｒら
、１９７５， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−９７のハイブリドーマ法、およ
びヒトＢ−細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ， １９８４， Ｊ． Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ． １３３：３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａ
ｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．
， １９８７）が挙げられる。本発明によって、ＶＧＦポリペプチドと反応する
モノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞系も提供される。
【０１４０】 好ましい抗ＶＧＦ選択的結合剤は、断片およびその領域と同様に、インビボで
ヒトＶＧＦポリペプチドまたは実質的に同じ特異性結合特性を有する抗体に結合
するのを競争的に阻害するモノクローナル抗体を含む。モノクローナル抗体の特
異性と親和性を競合阻害によって決定する好ましい方法は、Ｈａｒｌｏｗ ａｎ
ｄ Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ（Ｃｏｌｌｉｇａｎら編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｓｉｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ
． ａｎｄ Ｗｉｅｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， １９９３）；およびＭ
ｕｌｌｅｒ， １９８８， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ９２：５８９−６
０１が挙げられる。
【０１４１】 本発明のモノクローナル抗体は、治療法として使用するために修飾してもよい
。ある実施形態は、重（Ｈ）および／または軽（Ｌ）鎖は、特定の種に由来する
、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属している抗体内の相当する配列
と一致するか相同性である「キメラ抗体」であるが、鎖の残りは、別の種に由来
する、または他の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体内の相当する配列に
対して一致するか相同性である。そのような抗体の断片も、望ましい生物活性を
示す限り含まれている。米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら
、１９８５， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：６８５
１−５５を参照。
【０１４２】 キメラ抗体およびその生成方法は当業者に既知である。Ｃａｂｉｌｌｙら、１
９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８
１：３２７３−７７；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ
． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８１：６８５１−５５；Ｂｏｕｌｉ
ａｎｎｅら、１９８４， Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３−４６；Ｎｅｕｂｅｒ
ｇｅｒら、１９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８−７０；Ｌｉｕら、１９
８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８４
：３４３９−４３；およびＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， 同上を参照。
【０１４３】 本明細書で使用されるように、「キメラ抗体」という語は、１価、２価または
多価免疫グロブリンを含む。１価キメラ抗体は、ジスルフィドブリッジを通じて
キメラＬ鎖に結合したキメラＨ鎖によって形成されるダイマー（ＨＬ）である。
２価キメラ抗体は、１以上のジスルフィドブリッジを通じて結合した２個のＨＬ
ダイマーによって形成されるテトラマー（Ｈ２Ｌ２）である。多価キメラ抗体も
たとえば、（たとえばＩｇＭ Ｈ鎖またはμ鎖から）凝集するＣＨ領域を用いて
生成可能である。
【０１４４】 本発明のキメラ抗体は、それぞれＨおよび／またはＬ免疫グロブリンを含む。
好ましいキメラＨ鎖は、ＣＨ１またはＣＨ２などの、ヒトＨ鎖Ｃ領域（ＣＨ）の
少なくとも一部に連結したＶＧＦポリペプチドに特異性の非ヒト抗体のＨ鎖に由
来する抗体−結合領域を含む。好ましいキメラＬ鎖は、ヒトＨ鎖Ｌ領域（ＣＬ）
の少なくとも一部に連結したＶＧＦポリペプチドに特異性の非ヒト抗体のＬ鎖に
由来する抗体−結合領域を含む。
【０１４５】 同一または異なる可変領域結合特異性のキメラＨ鎖およびＬ鎖を有する選択的
結合剤は、個々のポリペプチド鎖を適切に結合することによっても調製できる。
たとえばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎ
ｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ １９９４）およびＨａｒｌｏｗ
ら、同上を参照。この手法を用いると、キメラＨ鎖（またはその誘導体）を発現
する宿主細胞は、キメラＬ鎖（またはその誘導体）を発現する宿主細胞から個別
に培養され、免疫グロブリン鎖は個別に回収され、次いで結合される。あるいは
、宿主細胞は共培養可能であり、鎖は培地中で自発的に結合し、次に集まった免
疫グロブリンが回収される。
【０１４６】 本発明は、抗体、断片、領域またはその誘導体などの、選択的結合剤の「誘導
体」も提供し、この語は、機能的に免疫グロブリン断片に似た分子種を生成する
切断または修飾遺伝子によってコード化される、タンパク質を含む。修飾として
は、これに限定されるわけではないが、植物および細菌毒素などの細胞毒性タン
パク質をコード化する遺伝子配列の添加が挙げられる。断片および誘導体は、本
発明のどの宿主細胞からも生成できる。あるいは、ＶＧＦポリペプチド受容体を
持つ細胞を選択的に殺す細胞毒性抗ＶＧＦ抗体を提供するために、抗体、断片お
よびその領域などの抗ＶＧＦ選択的結合剤は、細胞毒性タンパク質または化合物
にインビトロで結合させることができる。
【０１４７】 適切な断片としてはたとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ
が挙げられる。これらの断片は、無傷の抗体のＦｃフラグメントを欠失しており
、循環からさらに迅速に消滅し、無傷の抗体よりも低い非特異性組織結合を持つ
ことができる。Ｗａｈｌら、１９８３， Ｊ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ２４：
３１６−２５を参照。これらの断片は、たとえばパパイン（Ｆａｂ断片を生成す
るため）またペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を生成するため）などの酵素を用い
たタンパク質分解開裂によって、当業者に既知の方法を用いて無傷の抗体から生
成される。本発明のモノクローナル抗体によって認識されるこのような抗原−結
合領域および／またはエピトープの同定は、本出願の実施形態に匹敵する、同様
の結合特性および治療または診断有用性を備えた別のモノクローナル抗体を生成
するのに必要な情報を提供する。
【０１４８】 別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は「ヒト化」抗体である
。非ヒト抗体をヒト化する方法は当業界で既知である。米国特許第５，５８５，
０８９号および第５，６９３７６２号を参照。一般にヒト化抗体は、ヒト以外の
供給源から導入された１以上のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、たとえば、当
業界で述べられる方法を用いて（Ｊｏｎｅｓら、１９８６， Ｎａｔｕｒｅ ３
２１：５２２−２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８， Ｎａｔｕｒｅ ３３
２：３２３−２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３
９：１５３４−３６）、ヒト抗体の対応する領域をげっ歯類相補性決定領域（Ｃ
ＤＲ）の少なくとも一部で置換することによって実施できる。
【０１４９】 モノクローナル抗体の生成をバイパスする、抗体分子の抗体−結合領域（すな
わちＦａｂまたは可変領域断片）の組換えＤＮＡバージョンを作成する技術は、
本発明の範囲に含まれる。この技術では、抗体特異性メッセンジャーＲＮＡ分子
は、免疫化動物から採取された免疫系細胞から抽出され、、ｃＤＮＡ内に転写さ
れる。ｃＤＮＡは次に細菌発現系内にクローン化される。本発明の実施に適した
そのような技術の１例は、発現Ｆａｂタンパク質が周辺質空間（細菌細胞膜と細
胞壁の間）に移動させるか、分泌させるリーダー配列を有する、バクテリオファ
ージラムダベクター系を使用する。抗原を結合するこれらに対して、多数の機能
Ｆａｂ断片を迅速に生成およびスクリーニングできる。このようなＶＧＦ結合分
子（ＶＧＦポリペプチドに対する特異性を持つＦａｂ断片）は特に、本明細書で
使用する「抗体」という語の範囲に含まれる。
【０１５０】 適切な抗体特異性のマウス抗体分子による遺伝子を、適切な生物活性（ヒトの
補体を活性化し、ＡＤＣＣを伝達する能力など）ヒト抗体分子による遺伝子とス
プライシングすることによるキメラ抗体の生成のために開発された技術も本発明
の範囲内である。Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８１：６８５１−５５；Ｎｅｕｂｅｒｇ
ｅｒら、１９８４， Ｎａｔｕｒｅ， ３１２：６０４−０８。この技術によっ
て生成された抗体などの選択的結合剤は、本発明の範囲内である。
【０１５１】 本発明はマウスまたはラットのモノクローナル抗体に限定されないことは認識
されるであろう；実際に、ヒト抗体も使用できる。このような抗体は、ヒトハイ
ブリドーマを用いて得ることができる。Ｃｏｔｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， ７７（１９８
５）を参照。したがって、ＶＧＦポリペプチドを結合するヒト抗体も十分に本発
明の範囲内である。そのような抗体は、内在性免疫グロブリン生成が行われない
場合にヒト抗体のレパートリーを生成可能なＶＧＦ抗原（随意に担体に結合され
る）遺伝子導入動物（たとえばマウス）で免疫化させることによって生成される
。たとえばＪａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａ
ｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０：２５５１−５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉ
ｔｓら、１９９３， Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−５８；Ｂｒｕｇｇｅｍａ
ｎｎら、１９９３， Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ． ７：３３−４０を参照
。
【０１５２】 抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体は、抗体の抗原結合部位と一般に結合する独
自の決定基を認識する抗体である。抗Ｉｄ抗体は、モノクローナル抗体源として
同じ種および遺伝子型の動物（たとえばマウス菌株）を抗Ｉｄを調製するモノク
ローナル抗体によって免疫化して調製できる。免疫化動物は、免疫化抗体のイデ
ィオタイプ決定基を認識し、これらのイディオタイプ決定基に対する抗体（抗Ｉ
ｄ抗体）を生成して、それに反応する。たとえば米国特許第４，６９９，８８０
号を参照。抗Ｉｄ抗体は、また別の動物において免疫反応を誘起し、いわゆる抗
抗Ｉｄ抗体を生成する「免疫原」としても使用できる。それゆえ、モノクローナ
ル抗体のイディオタイプ決定基を抗体を使用することによって、同一特異性の抗
体を発現する他のクローンを同定できる。
【０１５３】 本発明では、ＶＧＦポリペプチドを結合するヒト抗体も含まれる。内在性免疫
グロブリン生成が行われない場合にヒト抗体のレパートリーを生成可能な遺伝子
導入動物（たとえばマウス）を使用して、随意に担体に結合された、ＶＧＦポリ
ペプチド抗原（すなわち６以上の連続アミノ酸を持つ）を用いて免疫化すること
によって、そのような抗体が生成される。たとえばＪａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１
９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９
０：２５５１−５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３， Ｎａｔｕｒｅ ３
６２：２５５−５８；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、１９９３， Ｙｅａｒ ｉｎ
Ｉｍｍｕｎｏ． ７：３３を参照。１つの方法において、そのような遺伝子導入
動物は、免疫グロブリン重および軽鎖をコード化する内在性遺伝座を無能力にし
、ヒト重および軽鎖タンパク質をそのゲノムに挿入することで生成される。そし
て部分的に修飾された動物、すなわち修飾が全補足よりも少ない動物は、望まし
い免疫系修飾すべてを有する動物を得るために交雑される。免疫源を投与した場
合、これらの遺伝子導入動物は、これらの高原に対して免疫特異性である可変領
域を含む、ヒト（たとえばネズミ以外）のアミノ酸配列を持つ抗体を生成する。
ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８およびＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９２６
を参照。米国特許第５，５４５，８０７、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／２４５
およびＰＣＴ／ＧＢ８９／０１２０７、およびＥＰ出願第５４６０７３Ｂ１号お
よび第５４６０７３Ａ１号にも別の方法が述べられている。ヒト抗体も、宿主細
胞の組換えＤＮＡの発現によって、または本明細書で述べる、ハイブリドーマ細
胞中での発現によって生成できる。
【０１５４】 別の実施形態では、ヒト抗体はファージ表示ライブラリから生成することもで
きる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９１， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２
２７：３８１；Ｍａｒｋｅら、１９９１， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２
２：５８１）。これらは、糸状バクテリオファージ表面の抗体レパートリーの表
示によって模倣免疫選択を処理し、次に選択する抗体への結合により、ファージ
の選択を処理する。そのような技術は、そのような手法を用いた、ＭＰＬ−およ
びｍｓｋ−受容体のための高親和性および機能的アゴニスト抗体の分離について
述べた、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／１７３６４で述べられている。
【０１５５】 キメラ、ＣＤＲグラフトおよびヒト化抗体は通常、組換え法によって生成され
る。抗体をコード化する核酸は、宿主細胞内に導入され、本明細書で述べられ、
当業者に既知の材料および手順を用いて発現される。好ましい実施形態では、抗
体はＣＨＯ細胞のような哺乳類宿主細胞内で生成される。モノクローナル（たと
えばヒト）抗体は、宿主細胞内での組換えＤＮＡの発現によって、または本明細
書で述べるハイブリドーマ中での発現によって生成される。
【０１５６】 本発明の抗ＶＧＦ抗体は、ＶＧＦポリペプチドの検出および定量化のために、
結合タンパク競合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、免疫沈澱ア
ッセイなどの既知のアッセイ方法で使用できる（Ｓｏｌａ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎ
ａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
１４７−１５８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， １９８７）。抗体はＶＧ
Ｆポリペプチドを、使用するアッセイ法に適した親和性で結合する。
【０１５７】 ある実施形態において、診断用途のために抗ＶＧＦ抗体を検出可能部分で標識
してもよい。検出可能部分は、検出可能信号を直接または間接に生成できるいず
れの部分でもよい。たとえば検出可能部分は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、 １２５ Ｉ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎまたは６７Ｇａなどのラジオアイソトープ；フ
ルオレセインイソチオシアネート、ローダミンまたはルシフェリンなどの蛍光ま
たは化学発光化合物；またはアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼま
たはホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素でもよい（Ｂａｙｅｒ，ら
、１９９０， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ． １８４：１３８−６３）。
【０１５８】 結合タンパク競合アッセイは、限定量の抗ＶＧＦ抗体と結合するための、試験
サンプル分析物（ＶＧＦポリペプチド）と競合する標識標準（たとえばＶＧＦポ
リペプチド、またはその免疫学的反応性部分）の能力に依存する。試験サンプル
中のＶＧＦポリペプチドの量は、抗体と結合するようになる標準の量と反比例す
る。結合するようになる標準の量を決定しやすくするために、抗体に結合した標
準および分析物が未結合のままの標準および分析物から都合よく分離するように
、抗体は通常、競合前後に不溶化される。
【０１５９】 サンドイッチアッセイは通常、検出および／または定量されるタンパク質の各
種の免疫原性部分、すなわちエピトープにそれぞれ結合可能な、２種類の抗体を
使用する。サンドイッチアッセイでは、試験サンプル分析物は通常、固体担体上
に固定された第１の抗体に結合され、その後、第２の抗体が分析物に結合し、そ
れゆえ不溶性の３成分複合体が生成される。たとえば米国特許第４，３７６，１
１０号を参照。第２の抗体自体は、検出可能部分によって標識される（直接サン
ドイッチアッセイ）か、検出可能部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を用い
て測定される（間接サンドイッチアッセイ）。たとえば、ある種のサンドイッチ
アッセイは酵素免疫抗体法（ＥＬＩＳＡ）であり、この場合、検出可能部分は酵
素である。
【０１６０】 抗ＶＧＦ抗体を含む選択的結合剤は、インビボ画像診断でも有用である。検出
可能部分で標識される抗体は動物に、好ましくは血流ないに投与され、宿主内の
標識抗体の存在および位置が分析される。抗体は、当業者に既知の核磁気共鳴、
放射線医学、または他の検出手段のいずれかにかかわらず、動物内で検出可能な
どの部分によっても標識される。
【０１６１】 本発明の選択的結合剤は、抗体を含め、治療学として使用できる。これらの治
療剤は一般に、ＶＧＦポリペプチドの１以上の生物活性をそれぞれ向上または低
下させるという点で、作用薬またはアンタゴニストである。ある実施形態におい
て、本発明のアンタゴニスト抗体は、インビボまたはインビトロでＶＧＦポリペ
プチドの機能活性を抑制または除去できる抗体またはその結合フラグメントであ
る。好ましい実施形態において、選択的結合剤、たとえばアンタゴニスト抗体は
、約５０％以上の、好ましくは約８０％以上のＶＧＦポリペプチド機能活性を抑
制する。別の実施形態において、選択的結合剤は、ＶＧＦポリペプチド結合パー
トナー（リガンドまたは受容体）と相互作用し、そのためＶＧＦポリペプチド活
性をインビトロまたはインビボで抑制また除去可能な抗ＶＧＦポリペプチド抗体
でもよい。選択的結合剤は、アゴニストおよびアンタゴニスト抗ＶＧＦポリペプ
チド抗体を含め、当業者に既知のスクリーニングアッセイによって同定される。
【０１６２】 本発明は、ＶＧＦ選択的結合剤（抗体など）および生体サンプル中のＶＧＦポ
リペプチドレベルの検出に有用な他の試薬を含むキットにも関する。このような
試薬は、検出可能な標識、ブロッキング血清、陽性および陰性制御サンプルおよ
び検出試薬を含むことがある。
【０１６３】 化学誘導体 ＶＧＦポリペプチドの化学修飾誘導体は、本明細書で述べる開示を考慮すると
、当業者によって調製できる。ＶＧＦポリペプチド誘導体は、ポリペプチドに天
然結合する分子の種類および位置のいずれかが異なる方法で修飾される。誘導体
は、１以上の天然結合化学基をを除去して生成される分子を含むことがある。Ｖ
ＧＦポリペプチドは、１以上のポリマーの共有結合によって修飾される。たとえ
ば、選択されたポリマーは通常水溶性であるため、結合されるタンパク質は生理
学的環境などの水性環境では沈殿しない。ポリマー混合物は、適切なポリマーの
範囲に含まれる。最終生成物調製物を治療に使用するには、ポリマーが製薬的に
許容可能であることが好ましい。
【０１６４】 ポリマーはそれぞれどんな分子量でもよく、分岐でも直鎖でもよい。ポリマー
のそれぞれの平均分子量は通常、約２ｋＤａから約１００ｋＤａである（「約」
という語は、水溶性ポリマーの調製物において、ある分子の分子量が、表示され
た分子量よりも多いか、やや少ないことを示す）。各ポリマーの平均分子量は好
ましくは約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａであり、さらに好ましくは約１２ｋＤａ〜約
４０ｋＤａであり、最も好ましくは約２０ｋＤａ〜約３５ｋＤａである。
【０１６５】 適切な水溶性ポリマーまたはその混合物としては、これに限定されるわけでは
ないが、Ｎ−連結またはＯ−連結炭水化物、糖、リン酸塩、ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）（モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）、アルコキシ−またはアリロキシ−ま
たはアリロキシ−ポリエチレングリコールを含む、タンパク質の誘導体化に使用
されたＰＥＧの形を含む）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキスト
ラン（たとえば約空６ｋＤの低分子量デキストランなど）、セルロース、または
他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレン
グリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エ
チレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（たとえばグリセロー
ル）およびポリビニルアルコールが挙げられる。本発明は、共有結合したＶＧＦ
ポリペプチドマルチマーを調製するのに用いる二機能性架橋分子も含む。
【０１６６】 一般に化学誘導化は、タンパク質と活性化ポリマー分子との反応に用いる適切
などの条件下でも実施できる。ポリペプチドの化学誘導体の調製方法は一般に次
のステップを含む：（ａ）ＶＧＦポリペプチドが１以上のポリマー分子に結合す
るようになる条件下で、ポリペプチドを活性化ポリマー分子（ポリマー分子の反
応性エステルまたはアルデヒド誘導体など）と反応させるステップと（ｂ）反応
生成物を得るステップである。最適反応条件は、既知のパラメータと望ましい結
果に基づいて決定される。たとえば、ポリマー分子のタンパク質に対するポリマ
ー分子の比が大きくなると、結合するポリマー分子のパーセンテージが大きくな
る。ある実施形態において、ＶＧＦポリペプチド誘導体は、アミノ末端に単一ポ
リマー分子部分を有する。たとえば、米国特許第５，２３４，７８４号を参照。
【０１６７】 ポリペプチドのペギル化は、当業者に既知のどのペギル化反応を用いても特異
的に実施できる。このような反応は、たとえば以下の文献で述べられている：Ｆ
ｒａｎｃｉｓら、１９９２， Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ
ｓ ３：４−１０；ＥＰ公報第１５４３１６号および第４０１３８４号；米国特
許第４，１７９，３３７号。たとえばペギル化は、本明細書で述べる反応性ポリ
エチレングリコール分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）を用いたアクリ
ル化反応またはアルキル化反応によって実施できる。アクリル化反応の場合、選
択したポリマーは反応性エステル基１個を有する必要がある。還元性アルキル化
の場合、選択したポリマーは反応性アルデヒド基１個を有する必要がある。反応
性アルデヒドはたとえば、水安定性のポリエチレングリコールプロピオンアルデ
ヒドであるか、そのモノＣ１−Ｃ１０アルコキシまたはアリロキシ誘導体である
（米国特許第５，２５２，７１４号を参照）。
【０１６８】 別の実施形態において、ＶＧＦポリペプチドはビオチンに化学結合される。ビ
オチン／ＶＧＦポリペプチド分子は次にアビジンに結合され、４価アビジン／ビ
オチン／ＶＧＦポリペプチド分子が生じる。ＶＧＦポリペプチドも、ジニトロフ
ェノール（ＤＮＰ）またはニトロフェノールに結合され、生じた結合体は抗ＤＮ
Ｐまたは抗ＴＮＰ−ＩｇＭと沈殿して、１０価の十量体結合体を生成する。
【０１６９】 一般に、本発明のＶＧＦポリペプチド誘導体の投与によって軽減または調節さ
れる症状には、ＶＧＦポリペプチドについて本明細書で述べる症状が含まれる。
しかし、本明細書で開示されたＶＧＦポリペプチド誘導体は、非誘導体化分子と
比べて、別の活性、向上または低下した生物活性、またはたとえば延長または短
縮した半減期などの他の特性を有することがある。
【０１７０】 ＶＧＦポリペプチド活性の他のモジュレータのアッセイ ある状況では、ＶＧＦポリペプチドの活性のモジュレータ、すなわちアゴニス
トまたはアンタゴニストである分子を同定することが望ましい。ＶＧＦポリペプ
チドを調節する天然または合成分子は、本明細書で述べるような、１以上のスク
リーニングアッセイを用いて同定される。そのような分子はインビトロ方法、ま
たは注射による、あるいは経口投与、埋め込み器具などによるインビボ方法のど
ちらで投与してもよい。
【０１７１】 「試験分子」とは、ＶＧＦポリペプチドの活性を調節（すなわち上昇または低
下）する能力を評価されている分子を指す。最も一般的には、試験分子はＶＧＦ
ポリペプチドと相互作用する。しかし試験分子が、ＶＧＦ遺伝子発現に影響を与
えることによって、またはＶＧＦポリペプチド結合パートナー（たとえば受容体
またはリガンド）に結合することによって、ＶＧＦポリペプチド活性を間接的に
も調節することも考えられる。ある実施形態において、試験分子は約１０−６Ｍ
、好ましくは約１０−８Ｍ、さらに好ましくは約１０−９Ｍ、またさらに好まし
くは約１０−１０Ｍの親和性定数を持つＶＧＦポリペプチドに結合する。
【０１７２】 ＶＧＦポリペプチドアゴニストまたはアンタゴニストは、タンパク質、ペプチ
ド、炭水化物、脂質、またはＶＧＦポリペプチドと相互作用してその活性を調節
する低分子量分子でもよい。ＶＧＦポリペプチド発現を調節する分子としては、
ＶＧＦポリペプチドをコード化する核酸に対して相補性の核酸、またはＶＧＦポ
リペプチドの発現を指示または制御する核酸配列に対して相補性の核酸、発現の
アンチセンスレギュレータとして作用する核酸が挙げられる。
【０１７３】 いったん試験分子がＶＧＦポリペプチドと相互作用することが確認されると、
分子はさらに、ＶＧＦポリペプチド活性を上昇または低下させる能力について評
価される。試験分子のＶＧＦポリペプチドとの相互作用の測定は、細胞ベースの
結合アッセイ、膜結合アッセイ、溶液相アッセイ、イムノアッセイを含む、複数
の形式で実施できる。一般に、試験分子はＶＧＦポリペプチドによって規定時間
だけインキュベートされ、ＶＧＦポリペプチド活性は、生物活性を測定する１種
類以上のアッセイによって決定される。
【０１７４】 試験分子とＶＧＦポリペプチドとの相互作用も、イムノアッセイにおいてポリ
クローナルまたはモノクローナル抗体を用いて直接分析される。あるいは、本明
細書で述べるエピトープタグを含むＶＧＦポリペプチドの修飾形も溶液およびイ
ムノアッセイで使用してもよい。
【０１７５】 ＶＧＦポリペプチドが結合パートナー（たとえば受容体またはリガンド）との
相互作用によって生物活性を示す場合、各種のインビトロアッセイを用いて、Ｖ
ＧＦポリペプチドの対応するパートナー（選択的結合剤、受容体またはリガンド
など）との結合を測定するのに用いる。これらのアッセイを用いて、試験分子が
ＶＧＦポリペプチドをその結合パートナーに結合する速度および／または程度を
上昇または低下させる能力について、試験分子をスクリーニングできる。あるア
ッセイにおいて、ＶＧＦポリペプチドはマイクロタイタープレートのウェルに固
定化する。次に放射線標識ＶＧＦポリペプチド結合パートナー（たとえばヨウ化
ＶＧＦポリペプチド結合パートナー）および試験分子を、（どちらかの順番で）
一度に１つずつ、または同時にウェルに加えることができる。インキュベーショ
ン後、ウェルを洗浄し、シンチレーションカウンタを用いて放射能をカウントし
て、結合パートナーがＶＧＦポリペプチドに結合する程度を決定する。通常、分
子は濃度範囲にわたって試験され、試験アッセイの１以上の要素が欠けた一連の
対照ウェルは、結果評価での精度に用いることができる。この方法の代わりの方
法は、タンパク質の「位置」の逆転、すなわちＶＧＦポリペプチド結合パートナ
ーをマイクロタイタープレートウェルへの固定化、試験分子および放射線標識Ｖ
ＧＦポリペプチドを用いたインキュベーション、ＶＧＦポリペプチド結合の決定
を含む。たとえば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ａｌｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１８章（Ａｕｓｕｂｅｌら編， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕ
ｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ １９９
５）を参照。
【０１７６】 放射線標識の代わりとして、ＶＧＦポリペプチドまたはその結合パートナーを
ビオチンに結合し、次に、比色定量によって、またはストレプトアビジンの蛍光
標識付によって検出可能な、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）ま
たはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）などの酵素に結合したストレプトアビジン
を用いて、ビオチン化タンパク質の存在を検出できる。ＶＧＦポリペプチドまた
はＶＧＦポリペプチド結合パートナーに指示された抗体は、ビオチンに結合され
ており、複合体のインキュベーション後に、ＡＰまたはＨＲＰに結合した酵素結
合ストレプトアビジンを用いる検出に使用してもよい。
【０１７７】 ＶＧＦポリペプチドまたはＶＧＦポリペプチド結合パートナーは、アガロース
ビード、アクリルビードまたは他の種類のそのような不活性固体相基質への結合
により固定化することもできる。基質−タンパク質複合体は、相補性タンパク質
および試験化合物を含む溶液中に配置される。インキュベーション後、ビードは
遠心分離によって沈殿させることができ、ＶＧＦポリペプチドとその結合パート
ナーとの間の結合の量は、本明細書で述べる方法を用いて評価できる。あるいは
基質−タンパク質複合体は、カラム内に固定化でき、試験分子および相補性タン
パク質がカラムを通過する。次のＶＧＦポリペプチドとその結合パートナーとの
複合体の形成は、本明細書で述べるどの技術（たとえば放射線標識または抗体結
合）を使用しても評価できる。
【０１７８】 ＶＧＦポリペプチド結合タンパク質とＶＧＦポリペプチド結合パートナーとの
複合体形成を増加または減少させる試験分子を同定するのに有用な別のインビト
ロアッセイは、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， ピス
カタウェイ、ニュージャージー）などの表面プラズモン共鳴検出システムである
。ＢＩＡｃｏｒｅシステムは、製造者によって指定されたとおりに利用する。こ
のアッセイは実質的に、ＶＧＦポリペプチドまたはＶＧＦポリペプチド結合パー
トナーのどちらかと、検出器内に位置するデキストラン被覆センサチップの共有
結合を含む。次に試験化合物および他の相補性タンパク質は、同時に、または連
続的にセンサチップを含むチャンバに注射できる。結合する相補性タンパク質の
量は、センサチップのデキストラン被覆側に物理的に結合している分子質量の変
化に基づいて評価可能であり、分子質量は検出器システムによって測定される。
【０１７９】 場合によっては、ＶＧＦポリペプチドおよびＶＧＦポリペプチド結合パートナ
ーの複合体の形成を増加または減少させる能力について、２以上の試験化合物を
ともに評価することが望ましい。このような場合、本明細書で述べるアッセイは
、そのような追加の試験化合物を同時に、あるいは第１の試験化合物に続いて加
えることによって、即座に改良できる。アッセイの残りのステップは本明細書で
述べるとおりである。
【０１８０】 本明細書で述べるようなインビトロアッセイを使用すると、多数の試験化合物
をＶＧＦポリペプチドおよびＶＧＦポリペプチド結合パートナーの複合体の形成
に対する効果について都合よくスクリーニングできる。アッセイを自動化して、
ファージ表示で生成する化合物、合成ペプチドおよび化学合成ライブラリをスク
リーニングできる。
【０１８１】 ＶＧＦポリペプチドおよびＶＧＦポリペプチド結合パートナーの複合体の形成
を増加または減少させる化合物も、細胞およびＶＧＦポリペプチドまたはＶＧＦ
ポリペプチド結合パートナーのどちらかを発現する細胞系を用いた細胞培養でス
クリーニングできる。細胞および細胞系は、任意の哺乳動物から得られるが、ヒ
トまたは他の霊長類、イヌまたはげっ歯類の供給源によることが好ましい。ＶＧ
Ｆポリペプチドの、ＶＧＦポリペプチド結合パートナーを発現する細胞の表面へ
の結合は、試験分子の不在時に評価され、結合の程度はたとえば、ＶＧＦポリペ
プチド結合パートナーにビオチン化抗体を用いるフローサイトメトリーによって
決定される。細胞培養アッセイを都合よく使用して、本明細書で述べるタンパク
質結合アッセイで陽性となる化合物をさらに評価することができる。
【０１８２】 薬剤候補の影響をスクリーニングするために、細胞培養物も用いることができ
る。たとえば、薬剤候補はＶＧＦ遺伝子の発現を増加または減少させる。ある実
施形態において、生成されるＶＧＦポリペプチドまたはＶＧＦポリペプチド断片
の量は、細胞培養物を薬剤候補に曝露した後に測定する。ある実施形態において
、薬剤候補の細胞培養物への実際の影響を検出する。たとえば、特定の遺伝子の
過剰発現は、細胞培養物に特定の影響を持つ。そのような場合、薬剤候補が遺伝
子の発現を増加または減少させる能力、または細胞培養物に対する特定の影響を
防止または抑制する能力を試験する。他の実施例において、ポリペプチドの断片
などの特定の代謝生成物は、疾患または疾病症状を生じるか、それらに関連する
。そのような場合、薬剤候補が細胞培養物においてそのような代謝生成物の生成
を減少させる能力を試験する。
【０１８３】 インターナライズタンパク質 （ＨＩＶによる）ｔａｔタンパク質配列を用いて、タンパク質を細胞内にイン
ターナライズできる。たとえばＦａｌｗｅｌｌら、１９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎ
ａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９１：６６４−６８を参照。
たとえばＨＩＶ ｔａｔタンパク質（「タンパク質形質導入ドメイン」またはＴ
ＡＴ ＰＤＴと呼ばれる）の１１のアミノ酸配列（Ｙ−Ｇ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｒ
−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ；配列番号１１）は、細胞の細胞質膜および核膜に渡る仲介送
達として説明されている。Ｓｃｈｗａｒｚｅら、１９８８， Ｎａｔ． Ｍｅｄ
． ４：１４４９−５２を参照。これらの手順では、腹膜内投与後に組織に浸透
するＦＩＴＣ作成物（ＦＩＴＣ標識Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−
Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ；配列番号１２）が調製され、そのような作成物の細胞への
結合は、蛍光発色セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析によって検出される。ｔａ
ｔ−β−ｇａｌ融合タンパク質によって処理された細胞は、β−ｇａｌ活性を示
す。注射後、そのような作成物の発現は、肝臓、腎臓、肺、心臓、脳組織を含む
、多くの組織で検出できる。そのような作成物は、細胞内に入るためにある程度
の変性を受けると考えられるため、細胞へ入った後に再折畳みが必要となること
がある。
【０１８４】 それゆえ、ｔａｔタンパク質配列を用いて望ましいポリペプチドを細胞内にイ
ンターナライズすることは認識されるであろう。たとえば、ＶＧＦ分子の活性を
抑制するために、ｔａｔタンパク質配列を用いて、ＶＧＦアンタゴニスト（抗Ｖ
ＧＦ選択性結合剤、小型分子、溶解性受容体、アンチセンスオリゴヌクレオチド
など）を細胞内に投与できる。本明細書で使用されるように、「ＶＧＦ分子」と
いう語は、本明細書で定義されるＶＧＦ核酸分子とＶＧＦポリペプチドの両方を
指す。望ましい場合、ＶＧＦタンパク質自体もこれらの手順を用いて、細胞内に
内部的に投与される。Ｓｔｒａｕｓ， １９９９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：
１４６６−６７も参照。
【０１８５】 治療用途 本発明のＶＧＦポリペプチドおよび選択的結合剤を用いて、本明細書で再引用
されたものを含め、多数の急性および慢性疾患または症状を治療、診断、改善、
または防止することができる。
【０１８６】 ＶＧＦ関連疾患、症状および障害としては、肥満、不妊、悪液質、摂食障害、
ＡＩＤＳ関連複合体、代謝過剰症状、機能亢進、機能低下および過剰インシュリ
ン生成が挙げられる。
【０１８７】 望ましくないレベルのＶＧＦポリペプチドによって誘起または仲介される他の
疾患は、本発明の範囲に含まれる。望ましくないレベルには、過剰レベルのＶＧ
Ｆポリペプチドおよび半正常レベルのＶＧＦポリペプチドが含まれる。
【０１８８】 ＶＧＦポリペプチド組成物および投与 治療用組成物は、本発明の範囲内にある。こうしたＶＧＦポリペプチド医薬品
組成物は、投与方法に適するように選択される製薬上または生理学上許容され得
る配合剤との混合物の形態で治療上有効な量のＶＧＦポリペプチドを含むことが
できる。医薬品組成物は、投与方法に適するように選択される製薬上または生理
学上許容され得る配合剤との混合物の形態で治療上有効な量の一つ以上のＶＧＦ
ポリペプチド選択性結合剤を含むことができる。
【０１８９】 好ましくは、許容され得る配合材料は、用いられる投薬量および濃度で受容者
に対して非毒性である。
【０１９０】 医薬品組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透性、粘度、透明度、色、等張性
、におい、不稔性、安定性、溶解または放出速度、吸収、または浸透を変え、持
続または保存するための配合材料を含有することができる。適する配合材料には
、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシンな
ど）、抗菌薬、酸化防止剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸
水素ナトリウムなど）、緩衝剤（ホウ酸塩、重炭酸塩、トリス−ＨＣｌ、クエン
酸塩、リン酸塩、またはその他の有機酸など）、充填剤（マンニトールまたはグ
リシンなど）、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）、錯化
剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン、またはヒド
ロキシプロピル−β−シクロデキストリンなど）、増量剤、単糖類、２糖類、お
よびその他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンなど）、
たんぱく質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど）、着色、
着香および希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、低
分子量ポリペプチド、塩形成性対イオン（ナトリウムなど）、保存薬（塩化ベン
ズアルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール
、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロヘキシジン、ソルビン酸、または
過酸化水素など）、溶媒（グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチ
レングリコールなど）、糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）
、懸濁化剤、界面活性剤または湿潤剤（プルロニック；ＰＥＧ；ソルビタンエス
テル；ポリソルベート２０またはポリソルベート８０などのポリソルベート；ト
リトン；トロメタミン；レシチン、コレステロールまたはチロキサパールなど）
、安定性向上剤（スクロースまたはソルビトールなど）、強壮増強剤（アルカリ
金属ハロゲン化物−好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム−またはマン
ニトールソルビトールなど）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または製
薬助剤が含まれるが、それらに限定されない。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒ
ｏ編集、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０）を参照
のこと。
【０１９１】 最適な医薬品組成物は、例えば、意図する投与経路、送達フォーマット、およ
び望ましい投薬量に依存して、熟練した医師によって決定されるであろう。例え
ば、上記のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅｓを参照のこと。こうした組成物は、ＶＧＦ分子の物理的状態、安定性、
インビボでの放出速度およびインビボでのクリアランス率に影響を及ぼし得る。
【０１９２】 医薬品組成物における主たるビヒクルまたは担体は、本来、水性であってもよ
いし、または非水系であってもよい。例えば、注射に適するビヒクルまたは担体
は、水、生理食塩水、または人工脳脊髄液であり、非経口投与用組成物に一般的
なその他の材料を追加してもよい。さらに例となるビヒクルには、中性緩衝食塩
水または血清アルブミンと混合した食塩水がある。例となるその他の医薬品組成
物は、約ｐＨ７．０〜８．５のトリス緩衝液、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢
酸塩緩衝液が含まれ、これらは、さらにソルビトールまたは適する代用品を含む
ことができる。本発明の一つの実施形態において、ＶＧＦポリペプチド組成物は
、保存用に、所望の純度を有する選択された組成物を任意の配合剤（上記のＲｅ
ｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）と混
合することによって、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で調製することができ
る。さらに、ＶＧＦポリペプチド生成物は、スクロースなどの適する賦形剤を用
いて凍結乾燥物として処方することができる。
【０１９３】 ＶＧＦポリペプチド医薬品組成物は、非経口送達用に選択することができる。
あるいは、この組成物は、吸入用、または経口などの消化管を通した送達用に選
択することができる。こうした医薬品として許容され得る組成物の調製は、当該
技術の範囲内にある。
【０１９４】 配合成分は、投与部位に許容され得る濃度で存在する。例えば、緩衝剤を用い
て、組成物を生理学的ｐＨまたはわずかに低いｐＨ、典型的には約５〜約８のｐ
Ｈ範囲内に維持する。
【０１９５】 非経口投与を考慮する場合、本発明に用いるための治療用組成物は、製剤上許
容され得るビヒクル中に所望のＶＧＦ分子を含む発熱物質を含まない非経口条件
に適う水溶液の形態である。注射剤用に製剤上適するビヒクルは、無菌希釈水で
あり、ＶＧＦ分子は、その中に適切に保存された無菌等張液として処方される。
さらにもう一つの調製法は、生成物の制御放出または持続放出のために供給し、
その後、蓄積注射によって送達することができる注射可能マイクロスフェア、生
体分解性粒子、高分子化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸など）、ビーズ
、またはリポソームなどの薬剤と所望の分子とを配合することを含むことができ
る。ヒアルロン酸を用いることもでき、これは、循環における持続時間を増進す
る効果を及ぼすことができる。所望の分子を導入するために適するその他の手段
には、移植可能な薬物送達装置が挙げられる。
【０１９６】 一つの実施形態において、医薬品組成物は、吸入用に処方することができる。
例えば、ＶＧＦポリペプチドは、吸入用乾燥粉剤として処方することができる。
ＶＧＦポリペプチドまたは核酸分子吸入溶液は、噴射剤を用いてエアゾール送達
用に処方することもできる。さらにもう一つの実施形態において、溶液を霧状に
することができる。肺投与は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２００６９にさらに記
載されており、この特許は、化学的に変性したたんぱく質の肺送達を記載してい
る。
【０１９７】 一定の製剤は、経口投与することができることも考慮した。本発明の一つの実
施形態において、このように投与されるＶＧＦポリペプチドは、習慣的に用いら
れているような担体を用いて、または用いずに、タブレットおよびカプセルなど
の対応する固体剤形に処方することができる。例えば、カプセルは、バイオアベ
イラビリティが最大であり、前全身性分解が最小である時、胃腸管内にある時点
で製剤の活性部分を放出するように設計することができる。ＶＧＦポリペプチド
の吸収を助長するために追加の薬剤を含むことができる。希釈剤、着香剤、低融
点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁化剤、タブレット崩壊剤、および結合剤を用
いてもよい。
【０１９８】 もう一つの医薬品組成物は、タブレットの製造に適する非毒性賦形剤との混合
物での有効量のＶＧＦポリペプチドを含むことができる。無菌水、または別の適
するビヒクル、溶液にタブレットを溶解することによって、単位剤形に調製する
ことができる。適する賦形剤には、炭酸カルシウム、炭酸または重炭酸ナトリウ
ム、ラクトース、またはリン酸カルシウムなどの不活性希釈剤；あるいはデンプ
ン、ゼラチン、またはアラビアゴムなどの結合剤；あるいはステアリン酸マグネ
シウム、ステアリン酸、またはタルクなどの潤滑剤が挙げられるが、それらに限
定されない。
【０１９９】 持続または制御放出性製剤中にＶＧＦポリペプチドを含む製剤を含むその他の
ＶＧＦポリペプチド医薬品組成物は、当業者には明らかであろう。リポソーム担
体、生体分解性微粒子または多孔質ビーズおよび蓄積注射などの多様なその他の
持続または制御放出手段を策定する技術も当業者には知られている。医薬品組成
物の送達のための多孔質高分子微粒子の制御放出を記載するＰＣＴ／ＵＳ９３／
００８２９を参照のこと。
【０２００】 持続性放出製剤のさらなる例には、成形品、例えば、フィルムまたはマクロカ
プセルの形態での半透性ポリマー材料が挙げられる。持続性放出材料には、ポリ
エステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号および
欧州特許公報０５８４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメ
ートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２
：５４７−５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇ
ｅｒら、１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２
７７およびＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５
）、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら．、上記文献）またはポリ−Ｄ
（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州公報１３３９８８号）を挙げることができる
。持続性放出組成物は、リポソームも含むことができ、これは、当該技術分野に
おいて知られている幾つかの方法のうちのいずれかによって調製することができ
る。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら、１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８−９２；および欧州公報０３６６７６号、０８
８０４６号および１４３９４９号を参照のこと。
【０２０１】 インビボで投与に用いることができるＶＧＦ医薬品組成物は、典型的に、無菌
でなければならない。これは、無菌濾過膜を通す濾過によって達成することがで
きる。組成物を凍結乾燥する時、この方法を用いる滅菌は、凍結乾燥および解凍
の前に行ってもよいし、または後に行ってもよい。非経口投与用の組成物は、凍
結乾燥形態または溶液状態で保管することができる。さらに、非経口組成物は、
一般に、無菌進入口を有する容器、例えば、皮下注射針によって貫通され得るス
トッパーを有する静脈液バッグまたはバイアル内に入れられる。
【０２０２】 一旦、医薬品組成物を処方すると、溶液、懸濁液、ゲル、乳濁液、固体として
、または無水または凍結乾燥粉剤として無菌バイアル内で保管することができる
。こうした製剤は、すぐに用いることができる形態で保管することもできるし、
または投与前に解凍を要する形態（例えば、凍結乾燥状態）で保管することもで
きる。
【０２０３】 特定の実施形態において、本発明は、１回量の投与単位を製造するためのキッ
トに割り当てられる。このキットは、各々、乾燥たんぱく質を有する第一容器と
水性製剤を有する第二容器の両方を具備することができる。単一および複数のチ
ャンバーを有する予備充填された注射器（例えば、液体注射器および離液型注射
器）を具備するキットも本発明の範囲内に含まれる。
【０２０４】 治療に用いるべきＶＧＦ医薬品組成物の有効量は、例えば、治療状況および目
的に依存するであろう。従って、当業者には、治療に適する投薬レベルが、送達
される分子、用いられているＶＧＦ分子についての指示、投薬経路、および患者
のサイズ（体重、体表または器官のサイズ）および状態（年齢および全身の健康
）に一部依存して変化するであろうことはご理解いただけよう。従って、臨床医
は、投薬量をタイターし、投薬経路を改良して、最適な治療効果を得ることがで
きる。典型的な投薬量は、上述の因子に依存して約０．１μｇ／ｋｇから約１０
０ｍｇ／ｋｇ以上までの範囲にわたり得る。他の実施形態では、投薬量は、０．
１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ；または１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／
ｋｇまで；または５μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲にわたり得る
。
【０２０５】 投薬頻度は、用いられる製剤中のＶＧＦ分子の薬物動態因子に依存するであろ
う。典型的に、臨床医は、所望の効果を達成する投与量に達するまで組成物を投
与するであろう。従って、組成物は、１回量として、ある期間にわたって２回以
上の量（同じ量の所望分子を含有してもよいし、含有しなくてもよい）として、
または移植装置またはカテーテルによる持続注入として投与することができる。
適切な投薬量のさらなる改善は、通常の当業者によって日常的に行われており、
彼らが日常的に行う仕事の領域に入る。適切な投薬量は、適切な用量応答データ
を用いることによって把握することができる。
【０２０６】 医薬品組成物の投薬経路は、例えば、経口的に；静脈内経路、腹膜内経路、大
脳内経路（実質組織内経路）、脳室内経路、筋肉内経路、眼内経路、動脈内経路
、門脈内経路または病巣内経路による注射を通して；持続性放出システムによっ
て；または移植装置によって行われる既知の方法に従う。所望される場合、組成
物は、大量注射によって、または点滴によって持続的に、または体内移植装置に
よって投与することができる。
【０２０７】 あるいは、またはさらに、所望の分子を吸収まはた被包する膜、スポンジ、ま
たはその他の適する材料を移植することによって、組成物を局所的に投与するこ
とができる。移植装置を用いる場合、この装置は、あらゆる適する組織または器
官に移植することができ、拡散投与、時効性大量投与、または持続性投与によっ
て所望の分子を送達することができる。
【０２０８】 場合によっては、エクスビボ方式でＶＧＦポリペプチド医薬品組成物を用いる
ことが望ましい。こうした例では、患者から除去した細胞、組織または器官をＶ
ＧＦポリペプチド医薬品組成物に暴露し、その後、それらの細胞、組織または器
官を患者に移植して戻す。
【０２０９】 他の場合、ＶＧＦポリペプチドは、本明細書中に記載するものなどの方法を用
いてＶＧＦポリペプチドを発現および分泌するように遺伝子設計した一定の細胞
を移植することによって送達することができる。こうした細胞は、動物細胞であ
ってもよいし、またはヒトの細胞であってもよく、また、オートロガスであって
もよいし、ヘテロロガスであってもよいし、またはキセノジェニックであっても
よい。任意に、細胞を不死化してもよい。免疫応答の機会を減少させるために、
細胞を被包して、周囲組織の侵入を回避してもよい。被包材料は、典型的に、た
んぱく質生成物（複数を含む）を放出するが、患者の免疫系によるまたは周囲組
織からのその他の有害な因子による細胞の崩壊を防止することができる生物学的
適合性の半透性高分子エンクロージャーまたは膜である。
【０２１０】 本明細書中で論じるように、単離細胞集団（基幹細胞、リンパ球、赤血球、軟
骨細胞、ニュートロンなど）を一つ以上のＶＧＦポリペプチドで処理することが
望ましい場合がある。これは、単離細胞が細胞膜への透過が可能な形態である場
合、単離細胞を直接ポリペプチドに暴露することによって達成することができる
。
【０２１１】 本発明のさらなる実施形態は、治療用ポリペプチドのインビトロでの生成と遺
伝子療法または細胞治療による治療用ポリペプチドの生成および送達との両方の
ための細胞および方法（例えば、相同的組換えおよび／またはその他の組換え生
成法）に関する。相同的組換え法およびその他の組換え法を用いて、通常転写沈
黙ＶＧＦ遺伝子または不完全発現遺伝子を含む細胞を修飾することによって、治
療上効能のある量のＶＧＦポリペプチドを発現する細胞を生じることができる。
【０２１２】 相同的組換えは、標的遺伝子が転写活性遺伝子における変異を誘導または修正
するために本来開発された技術である。Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，１９８９，
Ｐｒｏｇ．ｉｎ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．＆ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６：
３０１。基礎技術は、特定の変異を哺乳動物ゲノムの特定領域に導入するための
方法（Ｔｈｏｍａｓら、１９８６，Ｃｅｌｌ ４４：４１９−２８；Ｔｈｏｍａ
ｓ ａｎｄ Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９８７，Ｃｅｌｌ ５１：５０３−１２；Ｄ
ｏｅｔｓｃｈａｍａｎら、１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８５８３−８７）、または欠陥遺伝子内の特定の変異を修正
するための方法（Ｄｏｅｔｓｃｈａｍａｎら、１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３３０
：５７６−７８）として開発された。相同的組換え技術の例は、米国特許第５，
２７２，０７１号；欧州特許公報９１９３０５１号および５０５５００号；ＰＣ
Ｔ／ＵＳ９０／０７６４２、およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０９９５５に記載
されている。
【０２１３】 相同的組換えを通して、ゲノムに挿入すべきＤＮＡ配列は、標的ＤＮＡに取付
けることによって対象となる遺伝子の特定領域に割り当てることができる。標的
ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡの領域に対して相補的（相同適）であるヌクレオチド配
列である。ゲノムの特定領域に対して相補的である標的ＤＮＡの小片をＤＮＡ複
製プロセス中に親鎖と接触させる。ハイブリッド形成することによって、共有相
同領域を通して内在性ＤＮＡのその他の断片と組換えることが、細胞に挿入され
たＤＮＡの一般的性質である。変異もしくは異なる配列または別のヌクレオチド
を含むオリゴヌクレオチドにこの相補鎖が取付けられると、これは、組換えの結
果として新しく合成された鎖にも組み込まれる。このプルーフリーディング機能
の結果として、ＤＮＡの新しい配列は、テンプレートとして働くことができる。
このようにして、転移ＤＮＡは、ゲノムに組み込まれる。
【０２１４】 ＶＧＦポリペプチドの発現と相互作用、またはこれを制御することができるＤ
ＮＡの領域、例えば、隣接配列を標的ＤＮＡのこれらの断片に取付ける。例えば
、プロモータ／エンハンサ要素、サプレッサ、または外在性転写変調要素を、意
図する宿主細胞のゲノムに、所望のＶＧＦポリペプチドをコードするＤＮＡの転
写に影響を及ぼすために十分な近接および向き付けで挿入する。制御要素は、宿
主細胞ゲノム中に存在するＤＮＡの一部を制御する。従って、所望のＶＧＦポリ
ペプチドの発現は、ＶＧＦ遺伝子それ自体をコードするＤＮＡの転写によってで
はなく、むしろＶＧＦ遺伝子を転写するための認識可能な信号を有する外在性遺
伝子配列を供給するＤＮＡ調節セグメントと結合した標的ＤＮＡ（対象となる外
在性遺伝子との相同領域を含む）を用いることによって達成することができる。
【０２１５】 例となる方法では、細胞内の所望の標的とする遺伝子（すなわち、所望の外在
性細胞遺伝子）の発現は、少なくとも調節配列、エクソン、およびスプライスド
ナー部位を含むＤＮＡの導入により、予め選択された部位での細胞遺伝子への相
同的組換えによって変更される。これらの成分は、結果として（ＤＮＡ構成体中
に存在する調節配列、エクソンおよびスプライスドナー部位が外在性遺伝子に作
動的に結合する）新しい転写単位が実質的に生成されるような方法で、染色体（
ゲノム）ＤＮＡに導入される。これらの成分の染色体ＤＮＡへの導入の結果とし
て、所望の外在性遺伝子の発現が修飾される。
【０２１６】 本明細書中に記載するような修飾された遺伝子発現は、得られるような細胞内
では通常沈黙している（発現しない）遺伝子を活性化すること（すなわち、発現
させること）、ならびに得られるような細胞内では生理学上有意なレベルでは発
現しない遺伝子の発現を増加させることを含む。この実施形態は、さらに、得ら
れるような細胞内で発生する調節または導入のパターンとは異なるように調節ま
たは導入パターンを変化させること、および得られるような細胞内で発現する遺
伝子の発現を減少させること（排除することを含む）を含む。
【０２１７】 相同的組換えを用いて細胞の外在性ＶＧＦ遺伝子からのＶＧＦポリペプチドの
生産を増加させる、すなわちそれをさせることができる一つの方法は、最初に相
同的組換えを用いて、部位特定組換えシステム（例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ、Ｆ
ＬＰ／ＦＲＴ）（Ｓａｕｅｒ，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ．，５：５２１−２７；Ｓａｕｅｒ，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｓ
ｙｍｏｌ．，２２５：８９０−９００）から組換え配列を、細胞の外在性ゲノム
ＶＧＦポリペプチドコード領域の上流（すなわち、それに対して５’）に配置す
ることを含む。ゲノムＶＧＦポリペプチドコード領域の直ぐ上流に配置された部
位に対して相同な組換え部位を含むプラスミドを適切な組換え酵素とともに修飾
細胞系統に導入する。この組換え酵素によって、細胞系統内のゲノムＶＧＦポリ
ペプチドコード領域の直ぐ上流に配置された組換え部位にプラスミドの組換え部
位を媒介としてプラスミドが組み込まれることとなる（Ｂａｕｂｏｎｉｓ ａｎ
ｄ Ｓａｕｅｒ，１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２０
２５−２９；Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５
１−５５）。転写を増加させることが知られている一切の隣接配列（例えば、エ
ンハンサ／プロモータ、イントロン、翻訳エンハンサ）は、このプラスミド内に
適切に配置される場合、細胞の内在性ＶＧＦ遺伝子からの新規または増加ＶＧＦ
ポリペプチドの生産をもたらす新しいまたは修飾された転写単位を創り出すよう
に組み込まれる。
【０２１８】 部位特異的組換え配列が細胞の内在性ゲノムＶＧＦポリペプチドコード領域の
直ぐ上流に配置された細胞系統を用いるさらなる方法は、相同的組換えを用いて
、細胞系統のゲノム内のほかの場所に第二組換え部位を導入することである。そ
の後、適切な組換え酵素をこの二組換え部位細胞系統に導入して、組換え現象（
欠失、逆位、および転座）を生じ（Ｓａｕｅｒ，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ
．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５：５２１−２７；Ｓａｕｅｒ，１９９３，Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２２５：８９０−９００）、これによって、細胞
の内在性ＶＧＦ遺伝子からの新規または増加ＶＧＦポリペプチドの生産をもたら
す新しいまたは修飾された転写単位が創り出されることとなる。
【０２１９】 細胞の内在性ＶＧＦ遺伝子からのＶＧＦポリペプチドの発現を増加させるかま
たは引き起こすためのさらなるアプローチは、細胞の内在性ＶＧＦ遺伝子からの
新規または増加ＶＧＦポリペプチドの生産をもたらす方法で遺伝子（一つまたは
複数）（例えば、転写因子）の発現を増加させるかまたは引き起こすことおよび
／または遺伝子（一つまたは複数）（例えば、転写リプレッサー）の発現を減少
させることを含む。この方法は、細胞の内在性ＶＧＦ遺伝子からの新規または増
加ＶＧＦポリペプチドの生産をもたらすような、細胞への非自然発生ポリペプチ
ド（例えば、転写因子ドメインに接合した部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを含む
ポリペプチド）の導入を含む。
【０２２０】 ＶＧＦポリペプチド細胞治療、例えば、ＶＧＦポリペプチドを生産する細胞の
移植も考慮する。この実施形態は、生物活性形態のＶＧＦポリペプチドを合成す
ることおよび分泌することができる細胞を移植することを含む。こうしたＶＧＦ
ポリペプチド生産細胞は、ＶＧＦポリペプチドの自然生産者である細胞であるこ
とができ、あるいは所望のＶＧＦポリペプチドをコードする遺伝子でまたはＶＧ
Ｆポリペプチドの発現を促進する遺伝子で形質転換することによって、ＶＧＦポ
リペプチドを生産する能力を強化した組換え細胞であってもよい。こうした修飾
は、遺伝子を伝達すること、ならびにその発現および分泌を促進することに適す
るベクターによって達成することができる。異種のポリペプチドの投与によって
発生し得るようなＶＧＦポリペプチドを投与した患者における潜在的免疫反応を
最小化するために、ＶＧＦポリペプチドを生産する天然細胞がヒト由来であり、
ヒトＶＧＦポリペプチドを生産することが好ましい。同様に、ＶＧＦポリペプチ
ドを生産する組換え細胞は、ヒトＶＧＦポリペプチドをコードする遺伝子を含有
する発現ベクターで形質転換されることが好ましい。
【０２２１】 移植細胞を被包して、周囲組織の侵入を回避することができる。ヒトまたはヒ
ト以外の動物細胞は、ＶＧＦポリペプチドを放出することができるが、患者の免
疫系によるまたは周囲組織からのその他の有害な因子による細胞の崩壊を防止す
る生物学的適合性の半透性高分子エンクロージャーまたは膜に入れて患者に移植
することができる。あるいは、エクスビボでＶＧＦポリペプチドを生産するよう
に形質転換された患者自身の細胞をこうした被包を施さず患者に直接移植するこ
とができる。
【０２２２】 生体細胞を被包する技術は、当業者に既知であり、被包細胞の調製および患者
への移植は日常的に達成することができる。例えば、Ｂａｅｔｇｅら．（ＰＣＴ
公開番号ＷＯ９５／０５４５２およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２９９）は、生物
活性分子を有効に送達するための遺伝子設計細胞を収容する膜カプセルを記載し
ている。このカプセルは、生物学的適合性であり、容易に修復することができる
。このカプセルは、哺乳動物宿主に移植するとインビボでのダウンレギュレーシ
ョンを受けないプロモータに作動的に結合する生物活性分子についてのＤＮＡ配
列コーディングを含む組換えＤＮＡ分子でトランスフェクションされた細胞を被
包する。この装置は、生体細胞から受容者内の特定部位に分子を送達するために
供給される。さらに、米国特許第４，８９２，５３８号、第５，０１１，４７２
号、および第５，１０６，６２７号を参照のこと。生体細胞を被包するためのシ
ステムは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１０４２５（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら．）に
記載されている。ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１０４７０（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら
．）；Ｗｉｎｎら、１９９１，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１３：３２２−２
９；Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、１９９１，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１１：２
９６−７５；およびＴｒｅｓｃｏら、１９９２，ＡＳＡＩＯ ３８：１７−２３
も参照のこと。
【０２２３】 インビボおよびインビトロでの遺伝子治療用ＶＧＦポリペプチド送達も構想す
る。遺伝子治療技術の一つの例は、構成または誘導性プロモータに作動的に結合
して、「遺伝子治療用ＤＮＡ構成体」を形成することができるＶＧＦポリペプチ
ドをコードする核酸（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および／または合成ＤＮＡのい
ずれか）を用いることである。このプロモータは、構成体が挿入される細胞また
は組織タイプ内で活性であることを条件として、内在性ＶＧＦポリペプチドに対
して相同的であってもよいし、または非相同的であってもよい。遺伝子治療用Ｄ
ＮＡ構成体のその他の成分は、任意に、部位特異的組込みのために設計されたＤ
ＮＡ分子（例えば、相同的組換えに有用な内在性配列）、組織特異的プロモータ
、エンハンサまたはサイレンサー、親細胞上に選択的利点をもたらすことができ
るＤＮＡ分子、形質転換細胞を特定するラベルとして有用なＤＮＡ分子、負の選
択システム、細胞特異的結合剤（例えば、細胞標的用など）、細胞特異的内在化
因子、ベクターからの発現を強化する転写因子、およびベクター生産を可能にす
る因子が挙げられる。
【０２２４】 次に、ウイルスまたは非ウイルスベクターを用いて、遺伝子治療用ＤＮＡ構成
体を（エクスビボまたはインビボのいずれかで）細胞内に導入することができる
。遺伝子治療用ＤＮＡ構成体を誘導するための一つの手段は、本明細書中に記載
するようなウイルスベクターによるものである。レトロウイルスベクターなどの
一定のベクターは、ＤＮＡ構成体を細胞の染色体ＤＮＡに伝達し、遺伝子を染色
体ＤＮＡに組み込むことができる。その他のベクターは、エピソマーとして機能
し、遺伝子治療用ＤＮＡ構成体は、細胞質中に残るであろう。
【０２２５】 さらにその他の実施形態において、標的細胞内でＶＦＧ遺伝子を制御発現させ
るために、調節エレメントを含むことができる。こうした要素は、適切なエフェ
クターに応答して活動を始める。このようにして、治療用ポリペプチドを所望時
に発現することができる。一つの通常の制御手段は、小分子ダイマライザー、ま
たはＤＮＡ結合たんぱく質または転写活性たんぱく質などの小分子結合ドメイン
と生物学的プロセスを開始させることができるドメインとを含むキメラたんぱく
質を二量化するためのラパログ（ｒａｐａｌｏｇ）の使用を含む（ＰＣＴ公開番
号ＷＯ９６／４１８６５、ＷＯ９７／３１８９８、およびＷＯ９７／３１８９９
を参照のこと）。たんぱく質の二量化を用いてトランスジーンの転写を開始させ
ることができる。
【０２２６】 別の調節技術は、凝集体またはクラスターとしての細胞内部の対象となる遺伝
子から発現されるたんぱく質を貯蔵する方法を用いる。対象となる遺伝子は、条
件凝集ドメインを含む融合たんぱく質として発現され、その結果、その小胞体内
に凝集たんぱく質を保持することとなる。貯蔵たんぱく質は、細胞内部で安定で
あり、不活性である。しかし、条件凝集ドメインを除去し、その結果、凝集体ま
たはクラスターを特異的にばらばらに分解して、たんぱく質を細胞から分泌する
ことができる薬物（例えば、小分子リガンド）を投与することによって、このた
んぱく質を放出することができる。Ａｒｉｄｏｒら、２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２８７：８１６−１７およびＲｉｖｅｒａら、２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
８７：８２６−３０を参照のこと。
【０２２７】 その他の適する制御手段または遺伝子スイッチには、本明細書中に記載する系
が挙げられるが、それらに限定されない。ミフェプリストーン（Ｍｉｆｅｐｒｉ
ｓｔｏｎｅ）（ＲＵ４８６）をプロゲステロン拮抗薬として用いる。修飾プロゲ
ステロン受容体リガンド結合ドメインのプロゲステロン拮抗薬への結合は、後に
核酸に入ってＤＮＡに結合する二つの転写因子の二量体を形成することによって
転写を活性化する。リガンド結合ドメインを修飾して、受容体が天然リガンドに
結合する能力を排除する。修飾ステロイドホルモン受容体系は、米国特許第５，
３６４，７９１号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４０９１１およびＷＯ９７／
１０３３７にさらに記載されている。
【０２２８】 さらにもう一つの制御システムは、エクジソン受容体（細胞質受容体）に結合
し、これを活性化するエクジソン（ショウジョウバエステロイドホルモン）を用
いる。次に、この受容体を細胞核に転座させて、特異的ＤＮＡ応答要素（エクジ
ソン応答遺伝子からのプロモータ）に結合させる。エクジソン受容体は、転写を
開始させるために、トランスアクティベーションドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン
、およびリガンド結合ドメインを含む。エクジソン系は、米国特許第５，５１４
，５７８号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／３８１１７、ＷＯ９６／３７６０９、お
よびＷＯ９３／０３１６２にさらに記載されている。
【０２２９】 もう一つの制御手段は、正のテトラサイクリン制御性トランス活性化因子を用
いる。このシステムは、転写を活性化するポリペプチドに結合した突然変異ｔｅ
ｔリプレッサーたんぱく質ＤＮＡ結合ドメイン（逆テトラサイクリン調節性トラ
ンス活性化因子たんぱく質を生じる突然変異ｔｅｔＲ−４アミノ酸変化、すなわ
ち、それらがテトラサイクリンの存在のもとでｔｅｔオペレーターに結合する）
を含む。こうしたシステムは、米国特許第５，４６４，７５８号、第５，６５０
，２９８号、および第５，６５４，１６８号に記載されている。
【０２３０】 さらなる発現制御システムおよび核酸構成体は、Ｉｎｎｏｖｉｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．の米国特許第５，７４１，６７９号および第５，８３
４，１８６号に記載されている。
【０２３１】 インビボでの遺伝子治療は、ＶＧＦポリペプチドをコードする核酸分子を局部
注射によって、またはその他の適切なウイルスもしくは非ウイルス伝達ベクター
によって、細胞に導入することにより達成することができる。Ｈｅｆｔｉ，１９
９４，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２５：１４１８−３５。例えば、ＶＧＦポリ
ペプチドをコードする核酸分子は、標的とする細胞への伝達のためにアデノ随伴
ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに収容することができる（例えば、Ｊｏｈｏｎｓｏ
ｎ，ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／３４６７０；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／
０７１７８を参照のこと）。組換えＡＡＶゲノムは、典型的に、機能性プロモー
タおよびポリアデニル化配列と作動的に結合するＶＧＦポリペプチドをコードす
るＤＮＡ配列に隣接するＡＡＶ逆向き末端反復配列を含む。
【０２３２】 別の適するウイルスベクターには、レトロウイルスベクター、アデノウイルス
ベクター、単純ヘルペスウイスルベクター、レンチウイルスベクター、肝炎ウイ
ルスベクター、パルボウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ポックスウ
イルスベクター、アルファウイルスベクター、コロナウイルスベクター、ラブド
ウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、および乳頭腫ウイルスベクタ
ーが挙げられるが、それらに限定されない。米国特許第５，６７２，３４４号は
、組換え神経栄養性ＨＳＶ−１ベクターを含むインビボイルス媒介遺伝子伝達シ
ステムを記載している。米国特許第５，３９９，３４６号は、治療用たんぱく質
をコードするＤＮＡセグメントを挿入するようにインビトロで処理したヒトの細
胞を伝達することによる、患者に治療用たんぱく質を供給するプロセスの例を提
供している。遺伝子治療技術を実践するためのその他の方法および材料は、米国
特許第５，６３１，２３６号（アデノウイルスベクターを含む）、第５，６７２
，５１０号（レトロウイルスを含む）、第５，６３５，３９９号（サイトカイン
を発現するレトロウイルスベクターを含む）に記載されている。
【０２３３】 非ウイルス型伝達法には、リポソーム媒介伝達、裸ＤＮＡ伝達（直接注射）、
受容体媒介伝達（リガンドＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーション、リン酸カ
ルシウム沈降、および微粒子衝撃（例えば、遺伝子銃）が挙げられるが、それら
に限定されない。遺伝子治療材料および方法は、ベクターによる発現およびベク
ター製造方法を強化するために、誘導性プロモータ、組織特異的エンハンサ／プ
ロモータ、部位特異的組込みのために設計されたＤＮＡ配列、親細胞上に選択的
利点をもたらすことができるＤＮＡ配列、形質転換細胞を特定するためのラベル
、負の選択システムおよび発現制御システム（安全手段）、細胞特異的結合剤（
細胞標的用）、細胞特異的内在化因子、および転写因子も含むことができる。遺
伝子治療技術を実践するためのこうした追加の方法および材料は、米国特許第４
，９７０，１５４号（エレクトロポレーション技術を含む）、第５，６７９，５
５９号（遺伝子伝達のためのリポたんぱく質含有システムを記載している）、第
５，６７６，９５４号（リポソーム担体を含む）、第５，５９３，８７５号（リ
ン酸カルシウムトランスフェクションのための方法を記載している）、および第
４，９４５，０５０号（生物活性粒子を細胞に対して一定速度で噴射することに
よって、粒子が細胞の表面を貫通して、細胞の内部に組み込まれる方法を記載し
ている）、およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４０９５８（核リガンドを含む）に
記載されている。
【０２３４】 ＶＦＧ遺伝子治療または細胞治療が、同じまたは異なる細胞（複数を含む）に
おける一つ以上の追加のポリペプチド（複数を含む）の伝達をさらに含むことが
できることも考慮される。こうした細胞は、親細胞に別々に導入してもよいし、
または細胞を上記被包膜などの単一の移植可能装置に収容してもよいし、または
細胞をウイルスベクターによって別々に修飾してもよい。
【０２３５】 遺伝子治療によって細胞内の内在性ＶＧＦポリペプチド発現を増加させるため
の手段は、一つ以上のエンハンサ要素をＶＧＦポリペプチドプロモータに挿入す
ることであり、エンハンサ要素は、そこでＶＧＦ遺伝子の転写活性を増大させる
ために働くことができる。用いられるエンハンサ要素は、遺伝子を活性化するこ
とを望む組織を基に選択されるであろう−その組織においてプロモータの活性化
をもたらすことが知られているエンハンサ要素が選択されるであろう。例えば、
ＶＧＦポリペプチドをコードする遺伝子が、Ｔ細胞において「活動を始める」こ
とができる場合には、ｌｃｋプロモータエンハンサ要素を用いることができる。
ここで、追加すべき転写要素の機能部分は、標準クローニング技術を用いて、Ｖ
ＧＦポリペプチドプロモータを含むＤＮＡの断片に挿入すること（および任意に
、ベクターおよび／または５’および／または３’隣接配列に挿入すること）が
できる。「相同的組換え構成体」として知られるこの構成体は、その後、エクス
ビボまたはインビボのいずれかで、所望の細胞に導入することができる。
【０２３６】 遺伝子治療を用いて、内在性プロモータのヌクレオチド配列を修飾することに
よってＶＧＦポリペプチドの発現を減少させることができる。こうした修飾は、
典型的に、相同的組換え法によって達成される。例えば、不活性化のために選択
されるＶＧＦ遺伝子のプロモータのすべてまたは一部を含有するＤＮＡ分子は、
転写を調節するプロモータの断片を除去および／または置換するように設計する
ことができる。例えば、ＴＡＴＡボックスおよび／またはプロモータの転写活性
化因子の結合部位は、標準的な分子生物学技術を用いて欠失させることができる
。こうした欠失はプロモータの活性を抑制し、その結果、対応するＶＧＦ遺伝子
の転写を抑制することができる。ＴＡＴＡボックスまたはプロモータにおける転
写活性化因子結合部位の欠失は、置換、欠失および／または一つ以上のヌクレオ
チドの挿入によって、一つ以上のＴＡＴＡボックスおよび／または転写活性化因
子結合部位ヌクレオチドを変異させるＶＧＦポリペプチドプロモータのすべてま
たは関連部分を含むＤＮＡ構成体を（調節されるＶＧＦ遺伝子と同じまたは関連
種から）生成することによって達成することができる。結果として、ＴＡＴＡボ
ックスおよび／または活性化因子結合部位は、活性が低下してしまい、完全に不
活性になる。修飾されたプロモータセグメントに隣接する天然（内在性）５’お
よび３’ＤＮＡ配列に対応する少なくとも約５００個のＤＮＡ塩基を典型的に含
有するこの構成体は、直接に、または本明細書中に記載するようなウイルスベク
ターによって、（エクスビボまたはインビボのいずれかで）適切な細胞に導入す
ることができる。典型的に、細胞のゲノムＤＮＡへの構成体の組込みは、相同的
組換えによるであろう。この場合、プロモータ構成体における５’および３’Ｄ
ＮＡ配列は、内在性染色体ＤＮＡへのハイブリダイゼーションによる修飾プロモ
ータ領域の組込みを助長するために働くことができる。
【０２３７】 ＶＧＦポリペプチドの使用 ＶＧＦポリペプチドは、治療する状態に適するように、一つ以上のサイトカイ
ン、成長因子、抗生物質、抗炎症物質、および／または化学療法薬と併用（同時
にまたは逐次的に）することができる。
【０２３８】 一つ以上のＶＧＦポリペプチドの活性を抑制することが望ましい場合には、そ
の他の方法を用いることもできる。こうした抑制は、発現制御配列（三重らせん
形成）またはＶＧＦｍＲＮＡに相補的であり、ハイブリダイズする核酸分子によ
って行われる。例えば、少なくともＶＧＦ遺伝子の一部に相補的である配列を有
するアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ分子を細胞に導入することができる。アン
チセンスプローブは、本明細書中で開示するＶＧＦ遺伝子の配列を用いて利用で
きる技術によって設計することができる。典型的に、こうしたアンチセンス分子
各々は、選択ＶＧＦ遺伝子各々の出発部位（５’末端）に相補的であろう。アン
チセンス分子を、その後、対応するＶＧＦｍＲＮＡにハイブリダイズする時、こ
のｍＲＮＡの翻訳は、妨げられるか低下させられる。アンチセンス抑制因子は、
細胞または器官におけるＶＧＦポリペプチドの減少または不在に関わる情報を提
供する。
【０２３９】 あるいは、遺伝子治療を用いて、一つ以上のＶＧＦポリペプチドの優性陰性抑
制因子を生じることができる。この状況において、選択された各ＶＧＦポリペプ
チドの突然変異ポリペプチドをコードするＤＮＡを調製し、本明細書中に記載す
るようなウイルス法または非ウイルス法のいずれかを用いて患者の細胞に導入す
ることができる。典型的には、こうした突然変異体各々が、その生物学的役割に
おいて内在性ポリペプチドに匹敵するように設計される。
【０２４０】 さらに、生物学的に活性であるかまたは活性でないＶＧＦポリペプチドは、イ
ムノゲンとして用いることができる。すなわち、ポリペプチドは、抗体を発生す
ることができる少なくとも一つのエピトープを含有する。（本明細書中に記載す
るような）ＶＧＦポリペプチドに結合する選択的結合剤は、インビボおよびイン
ビトロでの診断のために用いることができ、これには、標識された形態で用いて
、体液または細胞サンプル中のＶＧＦポリペプチドの存在を検出することが挙げ
られるが、それに限定されない。この抗体を用いて、本明細書中で列挙するもの
を含む多数の疾病および障害を予防、治療、または診断することもできる。抗体
をＶＧＦポリペプチドに結合させて、ＶＧＦポリペプチドの少なくとも一つの活
性特性を低下させるかまたは阻害してもよいし、またはポリペプチドに結合させ
て、ＶＧＦポリペプチドの少なくとも一つの活性特性を増大させてもよい（ＶＧ
Ｆポリペプチドの薬物動態を増大させることによるものを含む）。
【０２４１】 本発明のＶＧＦポリペプチドは、発現クローニング手段を用いてＶＧＦポリペ
プチド受容体のクローンを作るために用いることができる。放射線ラベル（１２
５−ヨウ素）ＶＧＦポリペプチドまたは親和性／活性標識ＶＧＦポリペプチド（
Ｆｃ融合またはアルカリ性リン酸分解酵素融合など）は、ＶＧＦポリペプチド受
容体を発現する細胞タイプまたは細胞系統または組織を特定するための結合分析
に用いることができる。こうした細胞または組織から単離したＲＮＡをｃＤＮＡ
に転化させて、哺乳動物発現ベクターにクローニングし、哺乳動物細胞（ＣＯＳ
または２９３細胞など）にトランスフェクションして、発現ライブラリを作るこ
とができる。放射線ラベルまたは標識ＶＧＦポリペプチドは、その後、それらの
表面にＶＧＦポリペプチド受容体を発現する細胞のサブセットをこのライブラリ
から特定し、単離するための親和性リガンドとして用いることができる。その後
、ＤＮＡをこれらの細胞から単離し、哺乳動物細胞にトランスフェクションして
、ＶＧＦポリペプチド受容体を発現する細胞のフラクションが、元のライブラリ
におけるものより何倍も高い第二発現ライブラリを作ることができる。この濃縮
プロセスは、ＶＧＦポリペプチド受容体を含有する単一組換えクローンが単離さ
れるまで、反復して繰り返すことができる。ＶＧＦポリペプチド受容体の単離は
、ＶＧＦポリペプチドの通信経路の新規作用物質および拮抗物質を特定または開
発するために有用である。こうした作用物質および拮抗物質には、溶解性ＶＧＦ
ポリペプチド受容体、抗ＶＧＦポリペプチド受容体抗体、小分子、またはアンチ
センスオリゴヌクレオチドが挙げられ、これらは、本明細書中に記載する一つ以
上の疾病または障害を治療、予防または診断するために用いることができる。
【０２４２】 以下の実施例は、説明のみを目的とするものであり、いかなる点においても本
発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきものではない。
【０２４３】 実施例１：抗ＶＧＦポリペプチド抗体の生成 標準ペプチド合成プロトコルを用いてＡｍｇｅｎ Ｂｏｕｌｄｅｒ Ｐｅｐｔ
ｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙグループによって合成されたＶＧＦポリペプチド
をウサギに注射することによって、ＶＧＦポリペプチドに対する抗体を生成した
。ペプチド合成後、異なるバッチからＶＧＦポリペプチドをプールし、凍結乾燥
した。各ＶＧＦポリペプチドについてのペプチド含量をＨＣｌでの加水分解によ
って決定した。
【０２４４】 システイン残基を欠くＶＧＦポリペプチド（ＶＧＦ−１；配列番号１、または
ＶＧＦ−２；配列番号４；表Ｉ）からポリクローナル抗ＶＧＦポリペプチド抗体
を調製するために、５ｍｇのＶＧＦポリペプチドおよび０．５ｍＬのＩｍｊｅｃ
ｔ（登録商標）ＥＤＣ結合緩衝剤（イリノイ州、ロックフォードのＰｉｅｒｃｅ
）を２ｍＬのバイアルに移し、この混合物を渦巻攪拌した。２０ｍｇバイアルの
Ｉｍｊｅｃｔ（登録商標）キーホールリンペットヘモシアニン（Ｐｉｅｒｃｅ）
を２ｍＬの滅菌水中で希釈し、この溶液の０．５ｍＬをＶＧＦポリペプチド溶液
に添加した。キーホールリンペットヘモシアニンの添加後、０．１ｍＬのＥＤＣ
（１ｍＬの滅菌水中１０ｍｇのＥＤＣ（Ｐｉｅｒｃｅ））をＶＧＦポリペプチド
に添加し、この溶液を室温で、少なくとも２時間インキュベーションした。
【０２４５】 インキュベーション後、結合ＶＧＦポリペプチドを１０００の分子量をカット
オフするＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ６透析管（カルフォルニア州、ランチョドミン
ゲスのＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に移し、２ＬのＰＢＳ中
で一晩、４℃で透析して、サンプルから既知の抗凝固物質であるＥＴＤＡを除去
した。透析した結合ＶＧＦポリペプチド溶液を１５ｍＬの円錐型試験管に移し、
ＰＢＳを添加して、溶液の量を４ｍＬにした。各々１ｍＬのアリコートを２ｍＬ
のネジ付き試験管に移して、各アリコートを２ｍＬのガラス製注射器に注入し、
その後、１ｍＬのＴｉｔｅｒｍａｘ（登録商標）リサーチアジュバント（ジョー
ジア州、ノルクロスのＣｙｔＲｘ）を注入した。
【０２４６】 注射器に１８ゲージ混合針を取付け、溶液を混合して乳化させた。次に、ウサ
ギに筋肉内注射するために、この混合物を２本の１ｍＬ注射器に移した。ウサギ
には、０．１ｍＬのＶＧＦポリペプチド／アジュバント溶液を二つの注射部位に
注射し、その後、４週間および６週間後にウサギにブーストした。第二ブースト
後にウサギから試験採血（約５ｍＬ採血）し、その後２週間後に再び試験採血し
た。生成物のブリードが許容可能と考えられる場合には、ウサギに再びブースト
して、このブーストから２週間後、６週間、週に１回採血した（約４０ｍＬの採
血）。図１および２は、ＶＧＦ−１またはＶＧＦ−２のいずれかを注射したウサ
ギの抗体力価レベルを示す。
【０２４７】 システイン残基を有するＶＧＦポリペプチドからポリクローナル抗ＶＧＦポリ
ペプチド抗体を調製するために、５ｍｇのＶＧＦポリペプチドおよび０．５ｍＬ
のＩｍｊｅｃｔ（登録商標）マレイミド結合緩衝剤（Ｐｉｅｒｃｅ）を２ｍＬの
バイアルに移し、その混合物を渦巻攪拌した。２０ｍｇバイアルのＩｍｊｅｃｔ
（登録商標）キーホールリンペットヘモシアニン（Ｐｉｅｒｃｅ）を２ｍＬの滅
菌水中で希釈し、０．５ｍＬのこの溶液をＶＧＦポリペプチド溶液に添加した。
キーホールリンペットヘモシアニンの添加後、ＶＧＦポリペプチド溶液を室温で
少なくとも２時間インキュベーションした。
【０２４８】 インキュベーション後、結合ＶＧＦポリペプチドをＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ６
透析管に移し、２ＬのＰＢＳ中で一晩、４℃で透析して、サンプルからＥＴＤＡ
を除去した。透析した結合ＶＧＦポリペプチド溶液を１５ｍＬの円錐型試験管に
移し、ＰＢＳを添加して、溶液の量を４ｍＬにした。各々１ｍＬのアリコートを
２ｍＬのネジ付き試験管に移して、各アリコートを２ｍＬのガラス製注射器に注
入、その後、１ｍＬのＴｉｔｅｒｍａｘ（登録商標）リサーチアジュバント（Ｃ
ｙｔＲｘ）を注入した。
【０２４９】 注射器に１８ゲージ混合針を取付け、溶液を混合して乳化させた。次に、ウサ
ギに筋肉内注射するために、この混合物を２本の１ｍＬ注射器に移した。ウサギ
には、０．１ｍＬのＶＧＦポリペプチド／アジュバント溶液を二つの注射部位に
注射し、その後、４週間および６週間後にウサギにブーストした。第二ブースト
後にウサギから試験採血（約５ｍＬ採血）し、その後２週間後に再び試験採血し
た。生成物のブリードが許容可能と考えられる場合には、ウサギに再びブースト
して、このブーストから２週間後、６週間、週に１回採血した（約４０ｍＬの採
血）。
【０２５０】 実施例２：ノックアウトマウスにおけるＶＧＦポリペプチドの生物活性 標準ペプチド合成プロトコルを用いて、Ａｍｇｅｎ Ｂｏｕｌｄｅｒ Ｐｅｐ
ｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙグループによって合成されたＶＧＦポリペプチ
ド用いて、ノックアウトマウスにおけるＶＧＦポリペプチドの生物活性を分析し
た。ペプチド合成後、異なるバッチからＶＧＦポリペプチドをプールし、凍結乾
燥した。各ＶＧＦポリペプチドについてのペプチド含量をＨＣｌでの加水分解に
よって決定した。
【０２５１】 ＶＧＦ遺伝子のノックアウトマウスは、ニューヨーク州、ニューヨークのＭｔ
．Ｓｉｎａｉ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＳｔｅｖｅ Ｓａｌｔ
ｏｎから入手した。ＶＧＦポリペプチドの投与に先立ち、ノックアウトマウスを
ＬＤ １２：１２条件（すなわち、昼１２時間、夜１２時間）で収容した。ＶＧ
Ｆポリペプチドを注射する２４時間前、ノックアウトマウスを個別におりに入れ
て、一時的住居に移し、その場所で、マウスを残りの実験のために、１２：１２
条件のもとで飼った。
【０２５２】 ２ｍｇのＶＧＦ−１ａ（配列番号２；表１）の腹膜内注射によって、ＶＧＦポ
リペプチドを１日２回（午前９：００および午後６：００に）ノックアウトマウ
スに投与した。注射前、ＶＧＦ−１ａポリペプチドは、ＣＳＦ溶液緩衝剤（１２
６．６ｍＭのＮａＣｌ、２．６ｍＭのＫＣｌ、２．０ｍＭのＭｇＣｌ２および１
．４ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ７．４）中１６％に希釈し
た。ノックアウトマウスに５日間ＶＧＦ−１ａポリペプチドを投与して、各マウ
スの体重を毎日測定した。処理マウスの体重は、ＶＧＦ−１ａポリペプチドの投
与停止後３日間、毎日測定した。
【０２５３】 図１は、ＶＧＦ−１ａの投与後のＶＧＦノックアウトマウスの体重を示す。４
匹の処理マウスのうち３匹は、体重が１０〜１５％増加した。この実験から体重
の増加が食物または水の摂取増加の結果であるか否かの判定を下すことは不可能
であった。
【０２５４】 実施例３：ＶＧＦポリペプチド−Ｆｃ融合たんぱく質 ＶＧＦポリペプチドは、それらのカルボキシル−またはアミノ末端におけるヒ
ト免疫グロブリンＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域との融合たんぱく質として発現される。適
切なＰＣＲプライマーおよび標準ＰＣＲ増幅手順を用い、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領
域に関するＤＮＡ配列コーディングをＶＧＦ−１（配列番号１）ポリペプチド、
ＶＧＦ−１ｂ（配列番号３）ポリペプチド、またはＶＧＦ−２（配列番号４）ポ
リペプチドをコードするものとフレーム内で融合させることによって、ＶＧＦポ
リペプチド−Ｆｃ融合構成体を調製する。
【０２５５】 ＰＣＲによって発生させたＶＧＦポリペプチド−Ｆｃ融合生成物を制限エンド
ヌクレアーゼＮｄｅ ＩおよびＢａｍ ＨＩで消化して、ベクターｐＡＭＧ２１
にライゲーションした後、標準技術を用いてコンピテント大腸菌株２５９６細胞
に形質転換させる。組換えたんぱく質生成物を生産する能力および正確なヌクレ
オチド配列を有する遺伝子融合体を有する能力についてクローンをスクリーニン
グする。
【０２５６】 大腸菌株ＧＭ２２１におけるＦｃ融合構成体を含む細菌培養物を、５０ｍｇ／
ｍＬのカナマイシンを含有するＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ培地中、３７℃で増殖さ
せる。ｌｕｘＰＲプロモータからの遺伝子生成物の発現の誘導は、合成自己誘導
物質Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−ＤＬ−ホモセリンラクトンを培地に添加
して、最終濃度２０ｎｇ／ｍＬにした後、遂行する。培養物を３７℃でさらに３
時間インキュベーションする。このインキュベーション後、細菌培養は、封入体
の存在について顕微鏡による試験を行い、その後、遠心分離によって回収する。
１０％のβ−メルカプトエタノールを含有するＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液に
再懸濁させることによって、細胞ペレットを直接溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
って分析する。
【０２５７】 ＶＧＦポリペプチド−Ｆｃ融合たんぱく質は、高圧均質化（すなわち、１４，
０００ＰＳＩで２回パス）を用いて、最初に細胞を水中で破砕することによって
精製する。封入体は、１時間、Ｊ−６Ｂにおいて４２００ＲＰＭで遠心分離する
ことによって回収し、その封入体を６Ｍのグアニジン、５０ｍＭのトリス、８ｍ
ＭのＤＴＴ、ｐＨ８．７に１時間、１：１０の比率で溶解する。その後、溶解混
合物は、２Ｍの尿素、５０ｍＭのトリス、１６０ｍＭのアルギニン、３ｍＭのシ
ステイン、ｐＨ８．５に２０倍に希釈する。この混合物を一晩、冷間で攪拌して
、限外濾過によって約１０倍に濃縮し、その後、１０ｍＭのトリス、１．５Ｍの
尿素、ｐＨ９で３倍に希釈する。その後、この混合物のｐＨを酢酸でｐＨ５に調
整する。遠心分離によって沈殿物を除去し、２０ｍＭのＮａＡｃ、１００ｍＭの
ＮａＣｌ、ｐＨ５中で平衡させたＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏ
ｗカラム（１０ｍｇ／ｍＬたんぱく質充填；室温）にこの上澄を充填する。１０
０ｍＭのＮａＣｌ〜５００ｍＭのＮａＣｌの範囲の同じ緩衝液中の２０カラム量
の成分を用いてたんぱく質をカラムから溶離する。カラムからのプールを３倍に
希釈し、２０ｍＭのＮａＡｃ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５中のＳＰ−Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム（１０ｍｇ／ｍＬたんぱく質充填；室温）に充填する
。１５０ｍＭのＮａＣｌ〜４００ｍＭのＮａＣｌの範囲の同じ緩衝液中の２０カ
ラム量の成分を用いてたんぱく質をカラムから溶離する。ピークをプールして、
濾過する。
【０２５８】 本明細書中に記載する方法または通常の当業者に知られた方法を用いて、ＶＧ
Ｆポリペプチド−Ｆｃ融合たんぱく質の活性を評価する。
【０２５９】 実施例４：トランスジェニックマウスにおけるマウスＶＧＦポリペプチドの発
現 ＶＧＦポリペプチドの生物活性を評価するために、標準プロトコルを用いて、
シナプシンプロモータの制御下にあるマウスＶＧＦポリペプチドをコードする構
成体を調製した。この構成体の伝達によって、ＶＧＦポリペプチドの機能に関す
る情報を与える病理学的変化を生じることが予想される。同様に、標準プロトコ
ルを用いて、β−アクチンプロモータの制御下にあるＶＧＦポリペプチド全長を
含有する構成体を調製した。この構成体の伝達によって、偏在発現が生じること
が予想される。
【０２６０】 これらの構成体を発生させるために、ＰＣＲを用い、所望の配列の５’および
３’末端に対応すると共に制限酵素部位を組み込こんで増幅生成物の発現ベクタ
ーへの挿入を可能にするプライマーを用いて、マウスＶＧＦポリペプチドをコー
ドするテンプレートＤＮＡ配列を増幅させた。増幅後、ＰＣＲ生成物をゲル精製
し、適する制限酵素で消化して、標準組換えＤＮＡ技術を用いて発現ベクトルに
ライゲーションさせた。Ｇｒａｈａｍら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１
７：２７２−７４、およびＲａｙら、１９９１，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：２２
６５−７３を参照のこと。
【０２６１】 ライゲーション後、反応混合物を用いて、エレクトロポレーションにより大腸
菌宿主株を形質転換させ、形質転換株を薬物耐性のために選択した。選択された
コロニーからのプラスミドＤＮＡを単離して、ＤＮＡ配列に従わせて、適切な挿
入の存在および突然変異の不在を確認した。ＶＧＦポリペプチド発現ベクターは
、ＣｓＣｌ密度勾配遠心分離を２回繰り返すことによって精製して、適する制限
酵素を用いて切断し、マウスＶＧＦポリペプチドトランスジーンを含む線状化フ
ラグメントは、ゲル電気泳動法によって精製した。２μｇ／ｍＬの濃度で、精製
フラグメントを５ｍＭのトリス、ｐＨ７．４および０．２ｍＭのＥＤＴＡに再懸
濁させた。
【０２６２】 ＢＤＦ１×ＢＤＦ１ 交配マウスからの単個細胞胚を記載（ＰＣＴ公開番号Ｗ
Ｏ９７／２３６１４）のように注射した。肺をＣＯ２インキュベーター内で一晩
培養し、１５〜２０の二細胞胚を偽妊娠ＣＤ１メスマウスの卵管に移植した。顕
微注射した胚の移植によって得られた子孫を次のようにゲノムＤＮＡサンプルに
おける組込みトランスジーンのＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。耳断片
を２０μＬの耳緩衝液（２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１０ｍＭのＥＤＴＡ、
ＳＤＳ０．５％、および５００ｍｇ／ｍＬのプロティナーゼＫ）中、５５℃で一
晩消化した。その後、サンプルを２００μＬのＴＥで希釈し、適切なプライマー
を用いてＰＣＲ反応に用いた。
【０２６３】 トランスジェニックファウンダー動物を特定し、これらを用いてＦ１マウスを
発生させた。これを行うために、Ｆ１マウスから脾臓、肝臓および全脳部分を除
去して、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）
を用いて全細胞ＲＮＡを脾臓から単離し、ＲＴ−ＰＣＲによってトランスジーン
の発現を決定した。秘蔵から回収したＲＮＡを次のようにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐ
ｔ（商標）Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ−Ｂ
ＲＬ）を用いてｃＤＮＡに変換した。発現ベクター内のＶＧＦポリペプチドトラ
ンスジーンに対して３’に配置した適するプライマーを用いて、トランスジーン
転写体からのｃＤＮＡの合成を起動する。トランスジェニックファウンダーの肝
臓、脳および脾臓組織から調製した１０ｍｇの全ＲＮＡおよび対照を１ｍＭのプ
ライマーとともに１０分間７０℃でインキュベーションして、氷上に置いた。そ
の後、この反応物に１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭのＫＣｌ
、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．１ｍＭのＤＴＴ、およ
び２００ＵのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素を補給した。５０分間４
２℃でインキュベーションした後、１５分間７２℃で加熱することによって反応
を停止し、２ＵのＲＮａｓｅ Ｈを用いて２０分間３７℃で消化した。その後、
マウスＶＧＦポリペプチドに対して特異的なプライマーを用いるＰＣＲによって
サンプルを増幅した。
【０２６４】 トランスジェニック陽性Ｆ１マウスからの同腹子を交雑してＦ２同型接合マウ
スを発生させる。Ｆ２マウスにおけるＶＧＦｍＲＮＡの発現レベルは、本明細書
中に記載したとおりに決定する。
【０２６５】 実施例５：Ｆ２トランスジェニックマウスにおけるマウスＶＧＦポリペプチド
の生物活性 安楽死させる前に実施例４で得られたＦ２トランスジェニック動物の体重を測
定し、イソフルオランによって麻酔して、心臓穿刺によって血液を取る。サンプ
ルを血液学および血清化学分析にかける。終末全採血後、Ｘ線撮影を行う。肉眼
解剖し次第、主要内臓を重量分析にかける。
【０２６６】 肉眼解剖後、組織（すなわち、肝臓、脾臓、膵臓、胃、全胃腸管、腎臓、生殖
器官、皮膚および乳腺、骨、脳、心臓、肺、胸腺、気管、食道、甲状腺、副腎、
膀胱、リンパ腺および骨格筋）を除去し、組織学試験のために１０％緩衝Ｚｎ−
ホルマリン中に固定する。固定後、組織を処理してパラフィンブロックにし、３
ｍｍの切片標本を得る。すべての切片標本をヘマトキシリンおよびエクソシンで
染色し、その後、組織学分析にかける。
【０２６７】 トランスジェニックマウスおよび対照マウス両方の脾臓、リンパ腺およびバイ
エル板を、次にように、Ｂ細胞およびＴ細胞特異的抗体を用いて免疫組織学分析
にかける。ホルマリン固定パラフィン埋没切片を脱パラフィン化し、脱イオン水
中で水和する。切片標本を３％の過酸化水素で急冷し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏ
ｃｋ（ペンシルバニア州、ピッツバーグのＬｉｐｓｈａｗ）を用いてブロックし
て、ネズミモノクローナル抗マウスＢ２２０およびＣＤ３（インディアナ州、イ
ンディアナポリスのＨａｒｌａｎ）中でインキュベーションする。発色原として
ＤＡＢ（カルフォルニア州、サンタバーバラのＢｉｏＴｅｋ）を伴うビオチニル
化ウサギ抗ネズミ免疫グロブリンおよびペルオキシダーゼ結合ストレプタビジン
（カルフォルア州、サンラモンのＢｉｏＧｅｎｅｘ）によって抗体結合を検出す
る。切片標本をヘマトキシンで対比染色する。
【０２６８】 剖検後、トランスジェニック動物および対照同腹子からＭＬＮおよび脾臓と胸
腺の切片を除去する。１００ｍｍのナイロン製細胞染色器（ニュージャージー州
、フランクリンレイクのＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の底に対して注射
器の平坦な端で組織を穏やかに摩砕することによって、単個細胞懸濁液を調製す
る。細胞を２回洗浄し、カウントしてた後、各組織からの約１×１０６の細胞を
１０分間、体積２０μＬの０．５μｇＣＤ１６／３２（ＦｃγＩＩＩ／ＩＩ）と
ともにインキュベーションする。その後、０．５μｇのＦＩＴＣの抗体またはＣ
Ｄ９０．２（Ｔｈｙ−１．２）、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）、ＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ
−１）、Ｇｒ−１、ＣＤ４、またはＣＤ８に対するＰＥ結合モノクローナル抗体
（カルフォルニア州、サンディエゴのＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を伴う体積１００
μＬのＰＢＳ（Ｃａ＋およびＭｇ＋を含まない）、０．１％のウシ血清アルブミ
ンおよび０．０１％のアジ化ナトリウム中で、３０分間、２〜８℃でサンプルを
染色する。抗体結合後、細胞を洗浄し、その後、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてフローサイトメトリーにより分析する。
【０２６９】 本発明を好ましい実施形態の面から説明してきたが、当業者が変型および改造
を思い浮かべるであろうことが考えられる。従って、特許請求する本発明の範囲
内に入るこうした同意義の変型のすべてを添付のクレームによってカバーするつ
もりである。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＶＧＦ−１ａ（配列番号２）の投与後のＶＧＦノックアウトマウスの体重を示
す。ＶＧＦ−１ａの投与は第５日に中止した（矢印で示す）。
【図２】 ＶＧＦ−１を注射したウサギの抗体力価レベルを示す（配列番号１）。
【図３】 ＶＧＦ−２を注射したウサギの抗体力価レベルを示す（配列番号４）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/00 Ａ６１Ｐ 3/00 ４Ｈ０４５ 3/04 3/04 7/00 7/00 15/08 15/08 31/18 31/18 43/00 43/00 Ｃ０７Ｋ 16/46 Ｃ０７Ｋ 16/46 Ｃ１２Ｎ 5/10 14/47 // Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ ＺＮＡ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA44 BA80 CA04 CA07 DA06 EA04 GA01 GA14 HA12 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA01 4B065 AA26X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C084 AA17 ZA51 ZA69 ZA70 ZA81 ZC21 ZC42 ZC55 4C085 AA13 AA14 BB31 CC21 EE01 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA41 CA40 DA76 DA86 EA27 FA72

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 選択的結合剤またはその断片であって： （ａ）配列番号１
    、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７
    、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいずれかで表されるアミノ酸
    配列と； （ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号
    ５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０の
    いずれかで表されるアミノ酸配列の断片； またはその天然の変異型より成る群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプ
    チドに特異的に結合する選択的結合剤またはその断片。
  2. 【請求項２】 配列番号２またはその断片で表されるアミノ酸配列を含むポ
    リペプチドを特異的に結合する選択的結合剤またはその断片。
  3. 【請求項３】 抗体またはその断片である、請求項１または２に記載の選択
    的結合剤。
  4. 【請求項４】 ヒト化抗体である、請求項１または２に記載の選択的結合剤
    。
  5. 【請求項５】 ヒト抗体またはその断片である、請求項１または２に記載の
    選択的結合剤。
  6. 【請求項６】 ポリクローナル抗体またはその断片である、請求項１または
    ２に記載の選択的結合剤。
  7. 【請求項７】 モノクローナル抗体またはその断片である、請求項１または
    ２に記載の選択的結合剤。
  8. 【請求項８】 キメラ抗体またはその断片である、請求項１または２に記載
    の選択的結合剤。
  9. 【請求項９】 ＣＤＲ−グラフト抗体またはその断片である、請求項１また
    は２に記載の選択的結合剤。
  10. 【請求項１０】 抗イディオタイプ抗体またはその断片である、請求項１ま
    たは２に記載の選択的結合剤。
  11. 【請求項１１】 可変領域断片である、請求項１または２に記載の選択的結
    合剤。
  12. 【請求項１２】 ＦａｂまたはＦａｂ’断片である、請求項１０に記載の可
    変領域断片。
  13. 【請求項１３】 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列
    番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１
    ０のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する特異性を備
    えた１以上の相補性決定領域を含む、選択的結合剤またはその断片。
  14. 【請求項１４】 検出可能標識に結合される、請求項１または２に記載の選
    択的結合剤。
  15. 【請求項１５】 ＶＧＦポリペプチド生物活性を拮抗する、請求項１または
    ２に記載の選択的結合剤。
  16. 【請求項１６】 患者に請求項１または２に記載の選択的結合剤の有効量を
    投与することからなる、ＶＧＦポリペプチド関連疾患、障害または症状を治療、
    防止または改善する方法。
  17. 【請求項１７】 ＶＧＦポリペプチド関連疾患、障害または症状が肥満であ
    る、請求項１５に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 ＶＧＦポリペプチド関連疾患、障害または症状が不妊、悪
    液質、摂食障害、ＡＩＤＳ関連複合体、代謝過剰症状、機能亢進、機能低下およ
    び過剰インシュリン生成より成る群から選択される、請求項１５に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 摂食障害が過食症および拒食症である、請求項１７に記載
    の方法。
  20. 【請求項２０】 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列
    番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１
    ０のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを用いて動物を免疫化
    することによって生成される選択的結合剤。
  21. 【請求項２１】 請求項１または２に記載のポリペプチドを結合できる選択
    的結合剤を生成するハイブリドーマ。
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