CN1306027C

CN1306027C - 一种体外扩增γδT淋巴细胞的方法

Info

Publication number: CN1306027C
Application number: CNB021567255A
Authority: CN
Inventors: 何维; 张素梅; 于松涛; 董小黎; 牛海涛; 陈娟; 宋卫华; 张建民; 胡愉
Original assignee: Institute of Basic Medical Sciences of CAMS and PUMC
Current assignee: Good Moral In Beijing And Cell Therapy Technology Co ltd
Priority date: 2002-12-12
Filing date: 2002-12-12
Publication date: 2007-03-21
Anticipated expiration: 2022-12-12
Also published as: CN1506456A

Abstract

本发明涉及免疫学领域。具体地，本发明涉及一种体外扩增γδT淋巴细胞的方法。

Description

一种体外扩增γδT淋巴细胞的方法

技术领域

背景技术

T淋巴细胞可根据其表面抗原受体(TCR)的不同表达分为两种T细胞：TCRαβT淋巴细胞和TCRγδT淋巴细胞。其中TCRγδT淋巴细胞数量少，识别抗原广泛且无MHC分子限制性。有研究表明，肿瘤细胞的生长可诱导TCRγδ淋巴细胞在原位的聚集，在肿瘤浸润淋巴细胞中也富含TCRγδ淋巴细胞。在IL-2的作用下，活化后的TCRγδ淋巴细胞可以大量繁殖，并在体外实验中表现出对肿瘤细胞的杀伤活性，但对正常淋巴细胞却无明显杀伤作用。因此γδT细胞作为过继免疫治疗的候选细胞引起了越来越多的国内外学者的关注。但由于γδT细胞在外周血及肿瘤组织中分布频率较低(1～10％)，从而造成分离纯化的过程十分繁琐。深入的γδT细胞功能研究及可能的应用在很大程度上取决于该细胞亚群的有效分离与纯化。

在这一领域，人们做了很多有益的尝试，由组织或外周血中分离γδT细胞通常首先分离到单个核细胞，然后对其中的γδT细胞行进一步分离。常用的方式有直接富集法及抗原选择性扩增法等。也有人结合上述两种方式，先扩增再富集。具体技术包括流式细胞术或磁性细胞分离，直接富集法往往只收集CD4、CD8双阴性T细胞，但会丢失以低比例存在但却具有生理功能的CD4⁺或CD8⁺γδT细胞。另外，该法一般需要较大的组织块或较大量的血液；抗原选择性扩增则一般采用结核分枝杆菌、淋巴瘤细胞系Daudi或其它可为γδT细胞所特异识别的磷酸化小分子。可是上述细胞或分子往往仅活化了γδT细胞中的Vγ9/Vδ2亚群，因而此种方法将面临受体库丢失的问题。还有人以抗CD₃抗体活化PBMC后，再以磁珠分选法去除αβT细胞，所获细胞群体中γδT细胞纯度可达90％，但程序复杂，费用相对昂贵。

发明内容

本发明的目的是提供一种体外应用固相抗TCRγδ抗体选择性扩增γδT细胞的方法。

为了完成本发明目的，本发明涉及一种体外扩增γδT淋巴细胞的方法，它包括：(1)分离标本以获得单个核细胞，(2)将单个核细胞加入含有浓度为0.01-5μg/ml或10μg/ml的抗TCRγδ单克隆抗体及20ng/ml的白介素IL-2的培养基中，37℃、5％CO₂饱和湿环境培养，以及(3)收获所述细胞，其特征在于所述的含有抗TCRγδ单克隆抗体的培养基中含有人AB血清。

优选地，所述的人AB血清的使用浓度为5～30％。

优选地，所述的人AB血清的使用浓度为10％。

优选地，所述的标本为血液、组织、手术切除的人实体瘤以及腹水。

优选地，所述的包被培养载体的培养基内的抗γδT单抗的浓度为0.2～2.0μg/ml。

优选地，所述的培养基含有白介素(IL)-2。

优选地，所述的白介素的使用浓度为1～200ng/ml。

优选地，所述的白介素的使用浓度为20～50ng/ml。

附图说明

图1显示六种血清培养基对γδT淋巴细胞纯度的影响。

具体实施方式

现有技术中，通常意义上的细胞培养是指从体内组织取出细胞模拟体内环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。

在医学遗传学研究中应用最广泛的是外周血淋巴细胞、皮肤或纤维细胞和各种能在体外长期生长的细胞系。外周血淋巴细胞培养具有时间短、技术简便、可重复取材等优点，它在临床染色体分析中使用最广泛。体外培养细胞株可在培养过程中发生自发的或在外界作用下的转化，成为永久细胞系，也可直接建成永久细胞系，永久细胞系能在体外无节制的传代和生长。永久细胞系通常具有非整倍体细胞和各个细胞的核型不完全相同特征。但细胞克隆的细胞系其这一特征可以不明显。

细胞培养的环境要求细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。因此，培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。

另外，细胞培养的温度是维持培养细胞旺盛生长的另一条件，培养时要求有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40℃1小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；在40-41℃1小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；41-42℃1小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；当温度在43℃以上1小时，细胞全部死亡。

气体也是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95％空气加5％二氧化碳混合气体环境中。

二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH值。大多数细胞的适宜pH为7.2-7.4，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。但细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。有资料显示，原代羊水细胞培养pH6.8时最适。

再者，细胞培养基既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖、增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。培养基的种类很多，按其物质状态分为半固体培养基和液体培养基两类；按其来源分为合成培养基和天然培养基。

(1)合成培养基：合成培养基是根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。内含碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量元素和细胞生长因子等。单独使用时细胞虽有生存但不能很好的生长增殖。

(2)天然培养基：使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及多种活性物质。与合成培养基合用，能使细胞顺利增殖生长。常见使用浓度最为5-20％。

体外培养细胞根据它们在培养器皿中是否能贴附于支持物上的生长特征，可分为贴附型生长和悬浮型生长两大类。贴附型细胞在培养时能贴附在支持物表面生长，如羊水细胞为贴附型细胞，常见的贴附型细胞是成纤维型细胞、上皮型细胞生长和游走型细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。

培养细胞形态分析

培养细胞随贴附支持物形状不同而形态各异，最常见的是贴附于平面支持物细胞。在一般光镜下生存中的细胞是均质而透明的，结构不明显。细胞在生长期常有1-2个核仁在细胞机能状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大。若胞质中时而出现颗粒和空泡等，表明细胞代谢不良。

T淋巴细胞可按照其表达的T细胞抗原受体(TCR)的不同分为两种：TCRαβ淋巴细胞和TCRγδ淋巴细胞。其中TCRγδ淋巴细胞数量少，识别抗原广泛且无MHC分子限制性，对自体、同种异体或异种肿瘤细胞均可显示明显的杀伤活性，因此γδT细胞可以用作继免疫治疗。但由于γδT细胞在外周血及肿瘤组织中分布频率较低(＜10％)，从而造成分离纯化的过程十分繁琐。深入的γδT细胞功能研究及可能的应用在很大程度上取决于该细胞亚群的有效分离与纯化。在这一领域，人们做了很多有益的尝试，其中本发明建立的固相抗TCRγδ抗体选择性扩增的方法可获得高纯度的γδT细胞，并可使TCR受体谱保持相对完整。为了将γδT细胞真正用于临床过继免疫治疗，有必要优化其培养条件，力求获得高纯度大量的γδT细胞。为此，本发明方法从取材来源、体外扩增、冻存与复苏等多种条件进行了摸索，以期获得γδT细胞体外培养的最佳条件，同时对其功能也进行了验证性的研究，希望为γδT细胞最终临床应用奠定重要的实验基础和提供理论指导。

首先，利用固相抗TCRγδ抗体选择性扩增方法在体外建立若干正常人及化疗前后卵巢上皮癌病人的TCRγδ淋巴细胞系。并比较了不同来源标本的γδT细胞的扩增特点。对同一标本，我们采取了不同浓度抗体包被及不同种类的血清培养，以期获得γδT细胞体外培养的最佳条件。其次，我们研究了γδT细胞对同种异体及自体肿瘤细胞，自体PBMC的细胞毒功能进行。并比较了细胞因子孵育前后及冻存-复苏前后的γδT细胞的细胞毒活性。

固相抗体法可以有效地扩增γδT细胞，纯度可达80％以上。化疗明显削弱了γδT细胞对抗体及IL-2的反应能力，因此采血宜在病人开始化疗前。此外，我们还摸索了一种较为简便有效的γδT细胞培养方法-25cm²塑料培养瓶固化抗体培养法，其γδT细胞的扩增效率与我们先前的24孔培养板固化抗体培养法相同。该方法由于操作简便，可能会在今后的临床实践有更大的使用价值。同时我们发现，γδT细胞对同种异体及自体肿瘤细胞具有相同水平的细胞毒活性，但对自体PBMC并无显著的杀伤效应。另外以IL-2为代表的细胞因子孵育会显著增强γδT细胞的细胞毒活性，而冻存-复苏前后的γδT细胞的细胞毒活性则处于同一水平。

以下将结合实施例详细描述本发明。但是实施例并非限制本发明的实质，仅仅是对本发明的技术方案进行说明，以便于本领域技术人员进一步理解本发明。本发明保护范围由所附的权利要求限定。

术语说明

术语“单个核细胞”是指以淋巴细胞为主的细胞群体，其中含有少量的单核细胞。

术语“TCR”是指淋巴细胞表面的抗原识别受体。

术语“γδT淋巴细胞”是指TCR由γ和δ链构成的淋巴细胞。

术语“单克隆抗体”是指由同一B淋巴细胞克隆产生的针对单一抗原决定族的抗体。

术语“抗TCRγδ单克隆抗体”是指针对于T淋巴细胞表面TCR的γ或δ链的单克隆抗体。

细胞培养容器的抗体包被

实施例1

(1)细胞培养板的抗体包被

于24孔塑料培养板中每孔加入500μl内含1μg/ml抗TCRγδ单抗的RPMI-1640培养基，置37℃CO₂饱和湿环境，孵育2小时，用前以RPMI1640培养基洗涤3次，此为固相抗体包被的培养板，4℃存放备用。

实施例2

(2)细胞培养瓶的抗体包被

于25cm²塑料培养瓶内加入2.5ml内含1.0μg/ml抗TCRγδ单克隆抗体的RPMI1640培养基进行包被。37℃孵育2小时，用前以RPMI1640培养基洗涤3次。

实施例3

外周血单个核细胞(PBMC)分离

无菌采血5ml，以RPMI1640培养基1∶1稀释外周血标本，加入含有淋巴细胞分离液的离心管(稀释静脉血与淋巴细胞分离液体积比2∶1)，500×g离心20分钟。吸取淋巴细胞分离液界面乳白色单个核细胞层，以RPMI1640培养基洗涤2次，离心同上。以完全培养基(含10％胎牛血清的RPMI1640培养基)调整细胞浓度至10⁶细胞/ml备用。

实施例4

肿瘤浸润淋巴细胞(γδTIL)的分离

实体瘤标本无菌手术切除，约10g左右，于PBS(含青霉素、链霉素1000U/ml)中浸洗5分钟，去除坏死组织、周围血管及正常组织；用PBS(含青霉素、链霉素100u/ml，庆大霉素50u/ml)彻底冲洗后剪碎，再洗涤3次；离心沉淀肿瘤组织，500×g离心10分钟；重悬组织于完全培养基备用。

实施例5

腹水单个核细胞(γδTAL)的分离

无菌取卵巢上皮癌患者腹水100ml，500×g离心10分钟；弃上清，重悬细胞于10ml RPMI-1640培养基，加入到含5ml淋巴细胞分离液的离心管，500×g离心15分钟；吸取淋巴细胞分离液界面的白色单个核细胞层，RPMI-1640培养基洗涤3次，500×g离心5分钟；重悬细胞于完全培养基，调细胞浓度为5×10⁵个细胞/ml。

固相抗体活化、扩增与γδT细胞的纯度鉴定

将实施例2、3、6中分离的细胞用完全培养基制备成细胞悬液加入洗涤好并包被有抗体的24孔培养板(每孔1ml)或25cm²塑料培养瓶(每瓶5ml)。IL-2终浓度20ng/ml。37℃、5％CO₂饱和湿环境培养。

对在24孔培养板中生长的细胞，需根据细胞生长状态每1～3天换液或分孔。换液用完全培养基同上。

对在25cm²塑料培养瓶中生长的细胞，在细胞活化前，每天向瓶中加入1ml完全培养基，细胞活化后，转入已内含10ml完全培养基的75cm²塑料培养瓶中，以后根据细胞生长状态每2～3天换液一次。换液用完全培养基同上。待细胞铺满瓶底时分瓶。

于培养第7、10、14和21天分别收集待分析细胞约10⁶个，500×g离心2分钟，弃上清，用PBS洗3次，离心同上；按抗体使用说明书加入相应荧光标记抗体：抗TCRγδ-FITC和抗TCRαβ-PE进行免疫荧光双染色，另设同种型抗体平行染色作对照，4℃孵育30分钟后，以PBS洗液离心洗涤三次；以500μl PBS固定液固定，然后流式细胞仪分析所获细胞群体纯度。

不同组织来源的各培养体系中，一周内均可见淋巴细胞活化，1～2周内开始扩增，3～4周达到对数生长，γδT细胞比例随时间逐渐上升，最高可达到95％，约四周后增殖速度下降，如下表所示。根据来源不同，γδT细胞扩增到一定纯度的时间有所差别，以扩增纯度达到70％为观察点，所需时间为：外周血γδT细胞约14天左右，γδTAL约21天左右，γδTIL约28天左右。

实施例6

不同血清对外周血TCRγδ细胞扩增的比较

对13例化疗前的卵巢癌病人外周血分别以含15％及10％进口胎牛血清、10％国产胎牛血清、20％及10％人脐血清、10％人AB血清的完全培养基进行培养。结果在同样的培养条件下，十四天时，10％人AB血清培养者所获TCRγδ细胞的纯度最高(图1)。

表1.抗TCRγδ抗体体外扩增的γδT细胞系的纯度分析

培养时间(天)	外周血		TAL		TIL
	外周血		TAL		TIL		γδTcells(％)	αβTcells(％)	γδTcells(％)	αβTcells(％)	γδTcells(％)	αβTcells(％)
	1014212428	50±1171±390±5NDND	25±412±65±3NDND	27±655±872±477±386±6	33±197±613±93±34±1	NDND52±864±383±9	γδTcells(％)	αβTcells(％)	γδTcells(％)	αβTcells(％)	γδTcells(％)	αβTcells(％)	NDND25±819±78±9

注：ND，未检测。

实施例7

抗体包被浓度的优化实验

为了获得固相抗体法体外扩增TCRγδ细胞的最佳条件，对5例健康人外周血标本同时采用0.01μg/ml、0.1μg/ml、1.0μg/ml、5μg/ml及10μg/ml浓度抗体包被培养板。在同样培养条件下，以各浓度抗体包被培养板所获得的TCRγδ细胞纯度无显著性差异(P＞0.05)。

实施例8

健康人与化疗前、化疗后卵巢癌病人外周血体外扩增TCRγδ细胞的比较

在健康人及化疗前卵巢癌病人的PBMC培养体系中，3～4天后可见淋巴细胞活化，5～7天可见明显增殖，一周后为快速增殖期，此期内细胞接近指数生长。十四天左右时细胞总量可达(4～5)×10⁸。约于第3周内增殖速度下降。超过4周后状态较差。实验中10例正常人外周血均以固相抗体法扩增得到了TCRγδ细胞系，13例化疗前病人中亦有11例成功得到了TCRγδ细胞系(85％)。

已经过数次化疗的卵巢癌病人(此时血常规已恢复正常水平)的PBMC培养体系则与前二者有明显不同。14例化疗后病人中只有5例以固相抗体法扩增得到了TCRγδ细胞系(36％)，而且活化与增殖速度慢，细胞纯度也低。一般一周左右方可见细胞活化，两周后为快速增殖期，但也于第3周内增殖速度下降。其第一次传代时间平均为12.4天，明显长于健康人及化疗前卵巢癌病人PBMC培养体系的6.4及7.8天的平均第一次传代时间(P＜0.05)。

实施例9

不同浓度人AB血清对外周血γδT细胞扩增的比较对10例化疗前的卵巢癌病人外周血分别以含5％、10％、15％、20％、25％、30％人AB血清的完全培养基进行培养。结果在同样的培养条件下，十四天时，各组扩增γδT细胞的纯度无明显差异。

试验例1

体外扩增卵巢肿瘤患者外周血、腹水和肿瘤细胞中γδT细胞的细胞毒活性测定

(1)传代培养的靶细胞(新建同种异体/自体卵巢上皮癌细胞系、长期建系的同种异体卵巢上皮癌细胞系SKOV3细胞和淋巴瘤细胞系Daudi细胞)，用RPMI-1640培养基洗细胞2次后，重悬于RPMI-1640完全培养基中，调整细胞浓度为4×10⁵/ml，加入96孔板，使每孔细胞为4×10⁴/100ul，置37℃5％CO₂培养。

(2)抗体封闭：热休克后的靶细胞用抗HSP60或抗HSP70抗体(用RPMI-1640培养基1∶500倍稀释)悬起，4℃孵育120分钟后，再同上述处理。

(3)实施例5中获得的传代培养的生长状态良好的相应γδT细胞，洗涤后重悬于完全培养基，按效靶比10∶1、20∶1和40∶1调细胞浓度分别为2×10⁶个细胞/ml，4×10⁶个细胞/ml，8×10⁶个细胞/ml，加入靶细胞孔中，100μl/孔，此时每孔总体积为200μl。

混合后的反应体系置于37℃，5％CO₂饱和湿环境培养4小时；每孔弃100μl上清，同时加入MTT(5mg/ml)15μl/孔，37℃，5％CO₂饱和湿环境孵育4小时；加入SDS溶解液100μl/孔，置于CO₂孵箱，8小时后于全自动酶标仪上测定光密度值(OD值)。测定波长为570nm，参考波长630nm。

计算公式如下：

(4)体外扩增巢癌患者外周血、腹水和肿瘤细胞中γδT细胞的细胞毒活性测定结果

1)SKOV3细胞的细胞毒作用

在同一效靶比，所测试的效应细胞对SKOV3细胞的杀伤作用基本处于同一水平；

2)对新建系同种异体卵巢上皮癌细胞的细胞毒作用在同一效靶比，所有效应细胞杀伤活性处于同一水平；

3)对新建系自体卵巢上皮癌细胞的细胞毒作用在同一效靶比，所有效应细胞对自体卵巢上皮癌细胞的杀伤活性处于同一水平；

4)对Daudi细胞的细胞毒作用在同一效靶比，γδTAL与αβTAL对Daudi细胞的杀伤活性处于同一水平；

试验例2

肠癌患者肿瘤浸润γδT淋巴细胞细胞毒活性

(1)靶细胞为：Daudi、EL-4和HR8348(0.25％胰酶消化)肿瘤细胞。

比较了同一标本来源的γδTIL和αβTIL对三种肿瘤细胞系的杀伤能力。γδTIL对异种小鼠胸腺瘤EL-4细胞的杀伤活性明显高于αβTIL(在效靶比范围为1∶1～1∶5之间时，P＜0.05)；对于同种异体肿瘤细胞HR8348，αβTIL杀伤活性强于γδTIL(P＜0.05)；而对于Daudi细胞，两者无明显差异(P＞0.05)。γδTIL的肿瘤杀伤强度由高到低依次为：Daudi，EL-4和HR8348.

(2)靶细胞为：CA2、803、HR8348和Hep2肿瘤细胞。

检测了γδTILs、CD3TILs以及本发明正常人外周血扩增γδT细胞系对4种肿瘤细胞系的细胞毒活性。结果表明三者均表现出对传代异体肿瘤细胞的细胞裂解活性。γδTILs对Hep2细胞的细胞毒作用显著低于其对另外三种靶细胞的细胞毒作用。γδTILs对四种靶细胞的细胞毒活性由高到低依次为：CA2、803、HR8348和Hep2。

三种细胞系对四种肿瘤细胞的细胞毒作用

细胞	Hep2	HR8348	CA2	803
细胞	Hep2	HR8348	CA2	803	γδTILsCD3TILsγδPBMC	16.7±0.313.9±0.516.9±2.0	47.0±2.834.8±2.3未检测	58.6±15.941.4±5.732.4±4.8	51.2±12.439.3±7.846.6±8.5

试验例3

裸鼠体内抑瘤实验

(1)采用裸鼠皮下接种卵巢上皮癌细胞系SKOV3细胞，探讨γδTAL细胞卵巢上皮癌的体内治疗作用，同时比较其与αβTAL细胞在体内治疗的效果。

采用4周龄雌性Balb/c裸鼠，随机分成3组：γδTAL治疗组、αβTAL治疗组和对照组，每组8只。取传代生长良好的人卵巢上皮癌细胞系SKOV3细胞，以RPMI-1640培养基洗涤2次，重悬于无血清RPMI-1640培养基，调细胞浓度为5×10⁶个细胞/ml，裸鼠皮下接种，100μl/只(荷瘤细胞数量为5×10⁵个细胞/只)。接种肿瘤细胞3天后，取生长状态良好的γδTAL和αβTAL，以RPMI-1640培养基洗涤2次，重悬于无血清RPMI-1640培养基，调细胞浓度为2.5×10⁷个细胞/ml；在治疗组裸鼠腹腔内分别接种，100μl/只(TIL数量为2.5×10⁶个细胞/只)，对照组用同体积的RPMI-1640培养基注射；在上述接种同时于同部位注射rIL-21×10⁵U/只，每周一次，共注射3次。肿瘤长出后(接种肿瘤细胞后，7天左右开始有肿瘤结节形成)，观察肿瘤结节生长情况，每2～3天用游标卡尺测量肿瘤瘤体直径并记录。待出瘤裸鼠数及肿瘤个数不再增加时，确定30天为一观察时段，每3天测量瘤体直径，共测量10次，结果以各组肿瘤瘤体体积大小来评价。

瘤体体积计算公式：瘤体体积(mm³)＝a×b²×0.4

a：瘤体长径(mm)，b：瘤体短径(mm)

肿瘤细胞接种后第7～20天，各组裸鼠开始有肿瘤结节生成。50天观察期结束时，γδTAL治疗组的出瘤率为62.5％，αβTAL治疗组的出瘤率为75％，对照组的出瘤率为82.5％，经χ2检验，各组间出瘤率未见显著性差异。以30天内10次瘤体体积测量结果为观察值，进行对照组、αβTAL治疗组、γδTAL治疗组的瘤体体积大小比较，统计学分析表明瘤体体积大小有显著性差异，γδTAL治疗组的瘤体体积明显小于αβTAL治疗组和对照组(P＜0.05)，表明γδTAL在裸鼠体内有抑制肿瘤生长作用，其作用强于αβTAL治疗组及对照组。

(2)采用裸鼠皮下接种Burkitt’s淋巴瘤细胞株Daudi细胞，探讨γδTIL对人类肿瘤的体内治疗作用，同时比较αβTIL组及不加TIL的对照组的体内治疗效果。

采用4周龄BALB/c裸鼠，雌雄各半，随机分为3组：αβTIL治疗组、γδTIL治疗组和对照组，每组8只。传代生长良好的Burkitt’s淋巴瘤细胞株Daudi，以RPMI-1640培养基洗2次，重悬于无血清RPMI-1640培养基，调整细胞浓度至2×10⁶个细胞/ml，行裸鼠腹内注射，每只0.1ml，荷肿瘤细胞数量2×10⁵个细胞/只。接种肿瘤第3天，取生长状态良好的相应淋巴细胞，RPMI-1640培养基洗2次，重悬于无血清RPMI-1640培养基，调整细胞浓度至1×10⁷个细胞/ml，裸鼠腹内原位注射，每只0.1ml，淋巴细胞数量1×10⁶个细胞/只，对照组注射同体积RPMI-1640培养基。同时注射IL-2(1×10⁴u/只)，以后每周追加注射一次，共三次。观察并计数裸鼠死亡情况，裸鼠死亡时取其肿瘤部位及效应器官作病理观察。

本发明采用裸鼠腹内接种的方法探讨了γδTIL对人类肿瘤治疗效果。γδTIL治疗组动物存活时间比对照组及αβTIL治疗组延长，存活率提高。其中γδTIL治疗组动物有一半以上未生长肿瘤。精确的卡方检验表明，在IL-2作用下，γδTIL治疗组动物的存活率明显高于对照组(P＜0.05)，而αβTIL治疗组动物存活率与对照组相比无显著性差异。

(3)采用裸鼠皮下接种Burkitt’s淋巴瘤细胞株Daudi细胞，探讨γδTIL对人类肿瘤的体内治疗作用，比较CD3TIL以及培养自正常组织的γδT细胞系与γδTIL在体内过继中的治疗效果。

采用4周龄BAL/c裸鼠，雌性，随机分为4组，每组8只，传代生长良好的Burkitt’s淋巴瘤细胞株Daudi，以RPMI1640洗2次，重悬于无血清RPMI1640，调整细胞浓度至1×10⁶/ml，裸鼠腹内注射，每只0.1ml，荷肿瘤细胞数量1×10⁵/只。接种肿瘤第3天，取生长状态良好的相应淋巴细胞，RPMI1640洗2次，重悬于无血清RPMI1640，调整细胞浓度至1×10⁷/ml，裸鼠腹内注射，每只0.1ml，淋巴细胞数量1×10⁶/只。观察并计数裸鼠死亡情况。

肿瘤接种后3个月时γδTIL治疗组小鼠存活率为75％，对照组为62.5％，而CD3TIL和正常组织γδT细胞系接种组小鼠存活率分别为25％和50％。γδTIL治疗组小鼠的死亡时间与对照组相比，明显延迟。χ2分析显示，γδTIL治疗组的动物存活率明显高于CD3TIL组(P＜0.05)，其它组间未见显著差异。

Claims

1.一种体外扩增γδT淋巴细胞的方法，它包括：(1)分离标本以获得单个核细胞，(2)将单个核细胞加入含有浓度为0.01-5μg/ml的抗TCRγδ单克隆抗体及20ng/ml的白介素IL-2的培养基中，37℃、5％CO₂饱和湿环境培养，以及(3)收获所述细胞，其特征在于所述的含有抗TCRγδ单克隆抗体的培养基中含有浓度为5-30％的人AB血清。

2.一种体外扩增γδT淋巴细胞的方法，它包括：(1)分离标本以获得单个核细胞，(2)将单个核细胞加入含有浓度为10μg/ml的抗TCRγδ单克隆抗体及20ng/ml的白介素IL-2的培养基中，37℃、5％CO₂饱和湿环境培养，以及(3)收获所述细胞，其特征在于所述的含有抗TCRγδ单克隆抗体的培养基中含有浓度为5-30％的人AB血清。

3.根据权利要求1或2所述的扩增γδT淋巴细胞的方法，其特征在于所述的标本为来源于血液、组织、手术切除的人实体瘤以及腹水。

4.根据权利要求3所述的扩增γδT淋巴细胞的方法，其特征在于所述的实体瘤为卵巢癌。