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CN110072533B - 选择性扩增γδT细胞群的方法及其组合物 - Google Patents

选择性扩增γδT细胞群的方法及其组合物 Download PDF

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CN110072533B CN201780042797.3A CN201780042797A CN110072533B CN 110072533 B CN110072533 B CN 110072533B CN 201780042797 A CN201780042797 A CN 201780042797A CN 110072533 B CN110072533 B CN 110072533B
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D.K.萨特派夫
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Abstract

本发明涉及用于选择性扩增γδT细胞群的方法、其组合物和掺和物，以及将它们用作治疗剂的方法。本公开的非工程改造的和工程改造的富集的γδT细胞群可用于治疗各种癌症、感染性疾病和免疫病状。

Description

选择性扩增γδT细胞群的方法及其组合物
相关申请的交叉引用
本申请根据第119条(e)款要求2016年5月12日提交的美国临时申请序列No.62/335,572的优先权和权益，该临时申请的全部公开内容据此整体以引用的方式并入本文并用于所有目的。
背景技术
T淋巴细胞的抗原识别可以通过高度多样化的异二聚体受体，即T细胞受体(TCR)实现。血液和淋巴器官中大约95％的人T细胞表达异二聚体αβTCR受体(αβT细胞谱系)。血液和淋巴器官中大约5％的人T细胞表达异二聚体γδTCR受体(γδT细胞谱系)。这些T细胞亚群可以分别称为‘αβ’和‘γδ’T细胞。αβ和γδT细胞的功能是不同的。当抗原呈递细胞(APC)在I/II类MHC的背景下呈递抗原时，则发生αβT细胞的活化。与αβT细胞相比，γδT细胞可不依赖于MHC限制而识别抗原。此外，γδT细胞组合了先天性和过继性免疫识别和应答。
γδT细胞利用一组独特的体细胞重排的可变(V)、多样性(D)、连接(J)和恒定(C)基因。γδT细胞含有的V、D和J区段少于αβT细胞。虽然生殖系Vγ和Vδ基因的数量比Vα和VβTCR基因库更有限，但是TCRγ和δ链重排期间更广泛的连接多样化过程产生了比αβTCR潜在更大的γδTCR库(Carding和Egan,Nat Rev Immunol(2002)2:336)。
人γδT细胞使用3个主要Vδ(Vδ1、Vδ2、Vδ3)和至多六个Vγ区基因来构成其TCR(Hayday AC.,Annu Rev Immunol.2000；18,975-1026)。两个主要Vδ亚群是Vδ1和Vδ2γδT细胞。具有不同Vγ的Vδ1 T细胞在粘膜γδT细胞的上皮内亚群中占优势，其中TCR在该亚群似乎识别上皮细胞上的应激分子(Beagley KW,Husband AJ.Crit Rev Immunol.1998；18(3):237-254)。通常共表达Vγ9的Vδ2 T细胞在外周血和淋巴系统中是丰富的。
γδT细胞直接识别患病细胞上的抗原的能力以及表现出杀伤肿瘤细胞的固有能力使得γδT细胞成为有吸引力的治疗工具。Vγ9Vδ2T细胞的过继性转移已经对癌症的研究性治疗产生了有限的客观临床响应(Kondo等人,Cytotherapy,10:842-856,2008；Lang等人,Cancer Immunology,Immunotherapy:CII,60:1447-1460,2011；Nagamine等人,2009；Nicol等人,British Journal of Cancer,105:778-786,2011；Wilhelm等人,Blood.2003年7月1日；102(1):200-6)，表明需要分离和临床测试新的γδT细胞群。
选择性扩增具有有效抗肿瘤活性以及改善的纯度和临床相关水平的γδT细胞亚群的能力是非常期望的。虽然抗体和细胞因子混合物已用于增殖更多不同的γδT细胞群，但是特异性γδT细胞亚群活化至足够的纯度和临床相关水平仍未实现(Dokouhaki等人,2010；Kang等人,2009；Lopez等人,2000；Kress,2006)。所以，非常需要离体扩增特异性γδT细胞亚群的临床相关方法，以及由此产生的细胞。
序列表
本申请包含以ASCII格式通过EFS-Web提交的序列表，并且全文据此以引用的方式并入。2016年3月3日创建的所述ASCII副本命名为47165-701.201-SL.txt，大小为4,366千字节。
发明内容
在一个方面，本发明提供用于产生富集的γδT细胞群的离体方法。富集的γδT细胞群可以通过一种方法从分离的混合细胞群产生，所述方法包括使混合细胞群或其纯化级分与一种或多种药剂接触，所述药剂：
i)通过结合至δ1 TCR的特异性的表位来选择性扩增δ1 T细胞，
ii)通过结合至δ2 TCR的特异性的表位来选择性扩增δ2 T细胞，
iii)通过结合至δ1 TCR和δ4 TCR的特异性的表位来选择性扩增δ1和δ4 T细胞，或
iv)通过结合至δ1 TCR、δ3 TCR、δ4 TCR和δ5 TCR的特异性的表位来选择性扩增δ1、δ3、δ4和δ5 T细胞，以提供富集的γδT细胞群。在优选的实施方案中，富集的γδT细胞群包含一定临床相关水平的γδT细胞。
在另一个方面，本发明提供用于从分离的混合细胞群产生富集的γδT细胞群的离体方法，所述方法包括使混合细胞群与一种或多种药剂直接接触，所述药剂：
i)通过结合至δ1 TCR的特异性的表位来选择性扩增δ1 T细胞，
ii)通过结合至δ2 TCR的特异性的表位来选择性扩增δ2 T细胞，
iii)通过结合至δ1 TCR和δ4 TCR的特异性的表位来选择性扩增δ1和δ4 T细胞，或
iv)通过结合至δ1 TCR、δ3 TCR、δ4 TCR和δ5 TCR的特异性的表位来选择性扩增δ1、δ3、δ4和δ5 T细胞，以提供一定临床相关水平的富集的γδT细胞群。
在某些实施方案中，临床相关水平包括大于约或至少约108个γδT细胞、109个γδT细胞、1010个γδT细胞、1011个γδT细胞或1012个γδT细胞(例如，约108至约1012)。在一个实施方案中，分离的混合细胞群来源于单个供体，并且方法提供一定临床相关水平的富集的γδT细胞群，所述富集的γδT细胞群从单个供体，例如从单个供体的单个样品或从单个供体的2个或更多个样品扩增。在其它实施方案中，分离的混合细胞群来源于一个以上或多个供体。在一些实施方案中，在本发明的第一富集步骤之后，富集的γδT细胞群包含>108个的临床相关水平的γδT细胞亚群。在其它实施方案中，在本发明的第二、第三、第四、第五等富集步骤之后，富集的γδT细胞群包含>108个的临床相关水平的γδT细胞亚群。
在某些实施方案中，选择性扩增δ1 T细胞的药剂选自与选自TS-1和TS8.2的抗体结合至相同的表位的药剂。在一些实施方案中，选择性扩增δ1 T细胞的药剂是结合与TS-1和/或TS8.2抗体所结合的表位不同的表位的药剂。在一些实施方案中，选择性扩增δ1 T细胞的药剂是结合不与TS-1或TS8.2抗体所结合的表位重叠的表位或不与TS-1或TS8.2抗体竞争的表位的药剂。在一些实施方案中，选择性扩增δ1 T细胞的药剂选自特异性结合至包含δ1可变区的表位的药剂。在其它实施方案中，药剂结合至包含图24的共有序列的氨基酸序列的δ1 TCR可变区。在另外其它实施方案中，药剂结合至包含δ1可变区的残基Arg71或Asp72，和/或J1或J2区的Lys120的表位。在一些实施方案中，药剂与包含δ1 J1或δ1 J2的K120处的突变(例如K120A、K120G、K120P、K120V、K120E、K120D或K120S)的突变型δ1 TCR多肽的结合减少。
在某些实施方案中，选择性扩增δ1 T细胞的药剂选自与抗体R9.12结合至相同的表位的药剂。在一些实施方案中，选择性扩增δ1T细胞的药剂是结合与抗体R9.12所结合的表位不同的表位的药剂。在一些实施方案中，选择性扩增δ1 T细胞的药剂是结合不与抗体R9.12所结合的表位重叠的表位或不与抗体R9.12竞争的表位的药剂。
在某些实施方案中，选择性扩增δ1 T细胞的药剂是选择性结合至和/或扩增δ1和δ4 T细胞，或δ1、δ3、δ4和δ5 T细胞的药剂。在某些实施方案中，选择性扩增δ1 T细胞的药剂是包含选自δ1-05、δ1-08、δ1-18、δ1-22、δ1-23、δ1-26、δ1-35、δ1-37、δ1-39、δ1-113、δ1-143、δ1-149、δ1-155、δ1-182、δ1-183、δ1-191、δ1-192、δ1-195、δ1-197、δ1-199、δ1-201、δ1-203、δ1-239、δ1-253、δ1-257、δ1-278、δ1-282和δ1-285的抗体的互补决定区(CDR)的药剂。在某些实施方案中，选择性扩增δ1 T细胞的药剂是包含选自δ1-05、δ1-08、δ1-18、δ1-22、δ1-23、δ1-26、δ1-35、δ1-37、δ1-39、δ1-113、δ1-143、δ1-149、δ1-155、δ1-182、δ1-183、δ1-191、δ1-192、δ1-195、δ1-197、δ1-199、δ1-201、δ1-203、δ1-239、δ1-253、δ1-257、δ1-278、δ1-282和δ1-285的抗体的可变区的药剂。在某些实施方案中，选择性扩增δ1 T细胞的药剂是结合与选自δ1-05、δ1-08、δ1-18、δ1-22、δ1-23、δ1-26、δ1-35、δ1-37、δ1-39、δ1-113、δ1-143、δ1-149、δ1-155、δ1-182、δ1-183、δ1-191、δ1-192、δ1-195、δ1-197、δ1-199、δ1-201、δ1-203、δ1-239、δ1-253、δ1-257、δ1-278、δ1-282和δ1-285的抗体相同的表位或基本上相同的表位，或与这些抗体竞争的药剂。在某些实施方案中，选择性扩增δ1T细胞的药剂是选自δ1-05、δ1-08、δ1-18、δ1-22、δ1-23、δ1-26、δ1-35、δ1-37、δ1-39、δ1-113、δ1-143、δ1-149、δ1-155、δ1-182、δ1-183、δ1-191、δ1-192、δ1-195、δ1-197、δ1-197、δ1-199、δ1-201、δ1-203、δ1-239、δ1-253、δ1-257、δ1-278、δ1-282和δ1-285的抗体。在某些实施方案中，选择性扩增δ1 T细胞的药剂是结合Bin 1 δ1表位、Bin 1b δ1表位、Bin 2 δ1表位、Bin 2b δ1表位、Bin 2c δ1表位、Bin 3 δ1表位、Bin 4 δ1表位、Bin 5 δ1表位、Bin 6 δ1表位、Bin 7 δ1表位、Bin 8 δ1表位或Bin 9 δ1表位的抗体。
在一些实施方案中，本发明的方法提供富集的γδT细胞群，所述富集的γδT细胞群包含大于60％、70％、80％或90％的来自包含T淋巴细胞的分离的混合细胞群的δ1细胞。在一些实施方案中，在对扩增的γδT细胞群进行纯化步骤之前，本发明的方法提供富集的γδT细胞群，所述富集的γδT细胞群包含大于60％、70％、80％或90％的来自包含T淋巴细胞的分离的(例如混合的)细胞群的δ1细胞，所述纯化例如通过从富集的γδT细胞群正向选择γδT细胞(例如，正向选择δ1 T细胞、δ1和δ3γδT细胞；δ1和δ4γδT细胞；或δ1、δ3、δ4和δ5T细胞(例如，指定δ-亚型的γδT细胞)；和/或正向选择δ2 T细胞)，或通过从富集的γδT细胞群剔除(depletion)非γδT细胞(例如，非δ1 T细胞，诸如αβT细胞)来进行。
在一些实施方案中，本发明的方法提供包含δ1γδT细胞和δ2γδT细胞的γδT细胞群，其中该群体为大于60％、70％、80％或90％的δ1γδT细胞。在一些实施方案中，本发明的方法提供包含δ1γδT细胞；δ2γδT细胞；δ1和δ4γδT细胞；或δ1、δ3、δ4和δ5γδT细胞的γδT细胞群，其中(i)该群体为大于60％、70％、80％或90％的δ1γδT细胞；(ii)该群体为大于60％、70％、80％或90％的δ1和δ3γδT细胞；(iii)该群体为大于60％、70％、80％或90％的δ1和δ4γδT细胞；或(iv)该群体为大于60％、70％、80％或90％的δ1、δ3、δ4和δ5γδT细胞。在一些实施方案中，本发明的方法提供包含γδT细胞(例如，δ1γδT细胞)群的组合物，所述γδT细胞群不含或含有小于约2％、1％、0.5％、0.4％、0.1％、0.05％或0.01％的αβT细胞。
在某些实施方案中，在本文所述的方法中从中扩增出γδT细胞的分离的混合细胞群包含约或小于约30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1.5％、1.2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的γδT细胞(例如，δ1、δ2、δ1和δ2、δ1和δ3或δ1和δ4γδT细胞或它们的组合)。在某些实施方案中，在本文所述的方法中从中扩增出γδT细胞的分离的混合细胞群包含约0.5％至约5％的γδT细胞(例如，δ1、δ2、δ3、δ4或δ8γδT细胞或它们的组合)。
在某些实施方案中，分离的混合细胞群来自具有大于中位数水平的循环或样品(例如，肿瘤或上皮样品)侵润性γδT细胞的一个供体或多个供体。因此，例如，在一些实施方案中，在本文所述的方法中从中扩增出γδT细胞的分离的混合细胞群包含约0.5％至约10％的γδT细胞(例如，δ1、δ2、δ3、δ4或δ8γδT细胞或它们的组合)。又如，在一些实施方案中，在本文所述的方法中从中扩增出γδT细胞的分离的混合细胞群包含约10％至约30％的γδT细胞(例如，δ1、δ2、δ3、δ4或δ8γδT细胞或它们的组合)。在一些实施方案中，在本文所述的方法中从中扩增出γδT细胞的分离的混合细胞群包含约或小于约1.5％的γδT细胞、优选地小于约1.2％的γδT细胞、更优选地小于约1％的γδT细胞、另外更优选地小于约0.5％的γδT细胞，例如约0.1％至约0.4％的γδT细胞。
在某些实施方案中，在本文所述的方法中从中扩增出γδT细胞的分离的混合细胞群包含约80％、70％、60％、50％、40％、30％或20％的T淋巴细胞和小于约30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1.5％、1.2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的γδT细胞(例如，δ1、δ2、δ1和δ2、δ1和δ3或δ1和δ4γδT细胞或它们的组合)。在某些实施方案中，在本文所述的方法中从中扩增出γδT细胞的分离的混合细胞群包含约80％、70％、60％、50％、40％、30％或20％的T淋巴细胞和约0.5％至约5％的γδT细胞(例如，δ1、δ2、δ3、δ4或δ8γδT细胞或它们的组合)。
在某些实施方案中，分离的混合细胞群来自具有大于中位数水平的循环或样品(例如，肿瘤或上皮样品)侵润性γδT细胞的一个供体或多个供体。因此，例如，在一些实施方案中，在本文所述的方法中从中扩增出γδT细胞的分离的混合细胞群包含约80％、70％、60％、50％、40％、30％或20％的T淋巴细胞和约0.5％至约10％的γδT细胞(例如，δ1、δ2、δ3、δ4或δ8γδT细胞或它们的组合)。又如，在一些实施方案中，在本文所述的方法中从中扩增出γδT细胞的分离的混合细胞群包含约80％、70％、60％、50％、40％、30％或20％的T淋巴细胞和约10％至约30％的γδT细胞(例如，δ1、δ2、δ3、δ4或δ8γδT细胞或它们的组合)。在一些实施方案中，在本文所述的方法中从中扩增出γδT细胞的分离的混合细胞群包含约80％、70％、60％、50％、40％、30％或20％的T淋巴细胞以及约或小于约1.5％的γδT细胞、优选地小于约1.2％的γδT细胞、更优选地小于约1％的γδT细胞、另外更优选地小于约0.5％的γδT细胞，例如约0.1％至约0.4％的γδT细胞。
在一些实施方案中，分离的混合细胞群选自外周血样品(例如，全血、PBMC或PBL)、白细胞单采(leukapheresis)样品、脐带血样品、肿瘤样品或组织样品(例如，上皮样品)。在一些实施方案中，分离的混合细胞群来源于单个供体。在其它实施方案中，分离的混合细胞群来源于一个以上或多个供体。在某些实施方案中，本发明的方法提供包含多克隆γδTCR多样性的富集的γδT细胞群。
在其它实施方案中，选择性扩增δ2 T细胞的药剂选自与选自B6和15D的抗体结合至相同的表位的药剂。在另外其它实施方案中，选择性扩增δ2 T细胞的药剂选自与选自B6和15D的抗体结合至不同的表位的药剂。在另外其它实施方案中，选择性扩增δ2 T细胞的药剂选自结合至不与B6或15D抗体所结合的表位重叠的表位或与B6或15D抗体竞争的药剂。在一个实施方案中，选择性扩增δ2 T细胞的药剂选自特异性结合至包含δ2可变区的表位的药剂。在一个具体实施方案中，药剂与包含δ2可变区的G35处的突变的突变型δ2TCR多肽的结合减少。
在某些实施方案中，选择性扩增δ2 T细胞的药剂是包含选自δ2-14、δ2-17、δ2-22、δ2-30、δ2-31、δ2-32、δ2-33、δ2-35、δ2-36和δ2-37(或δ2-14、δ2-17、δ2-30、δ2-31、δ2-32、δ2-33、δ2-35、δ2-36和δ2-37)的抗体的互补决定区(CDR)的药剂。在某些实施方案中，选择性扩增δ2 T细胞的药剂是包含选自δ2-14、δ2-17、δ2-22、δ2-30、δ2-31、δ2-32、δ2-33、δ2-35、δ2-36和δ2-37(或δ2-14、δ2-17、δ2-30、δ2-31、δ2-32、δ2-33、δ2-35、δ2-36和δ2-37)的抗体的可变区的药剂。
在某些实施方案中，选择性扩增δ2 T细胞的药剂是与选自δ2-14、δ2-17、δ2-22、δ2-30、δ2-31、δ2-32、δ2-33、δ2-35、δ2-36和δ2-37(或δ2-14、δ2-17、δ2-30、δ2-31、δ2-32、δ2-33、δ2-35、δ2-36和δ2-37)的抗体结合相同的或基本上相同的表位，或与这些抗体竞争的药剂。在某些实施方案中，选择性扩增δ2 T细胞的药剂是选自δ2-14、δ2-17、δ2-22、δ2-30、δ2-31、δ2-32、δ2-33、δ2-35、δ2-36和δ2-37(或δ2-14、δ2-17、δ2-30、δ2-31、δ2-32、δ2-33、δ2-35、δ2-36和δ2-37)的抗体。在某些实施方案中，选择性扩增δ2 T细胞的药剂是结合Bin 1 δ2表位、Bin 2 δ2表位、Bin 3 δ2表位或Bin 4 δ2表位的抗体。
在一些实施方案中，本发明的方法提供富集的γδT细胞群，所述富集的γδT细胞群包含大于60％、70％、80％或90％的来自包含T淋巴细胞的分离的混合细胞群的δ2细胞。在一些实施方案中，在对扩增的γδT细胞群进行纯化步骤之前，本发明的方法提供富集的γδT细胞群，所述富集的γδT细胞群包含大于60％、70％、80％或90％的来自包含T淋巴细胞的分离的(例如混合的)细胞群的δ2细胞，所述纯化例如通过从富集的γδT细胞群正向选择γδT细胞(例如，正向选择δ2 T细胞)，或通过从富集的γδT细胞群剔除非γδT细胞(例如，剔除非δ2 T细胞或剔除αβT细胞)来进行。在一些实施方案中，本发明的方法提供包含δ2γδT细胞和δ1γδT细胞的γδT细胞群，其中该群体为大于60％、70％、80％或90％的δ2γδT细胞。在一些实施方案中，本发明的方法提供包含δ2γδT细胞群的组合物，所述δ2γδT细胞群不含或含有小于约2％、1％、0.5％、0.4％、0.1％、0.05％或0.01％的αβT细胞。
在某些实施方案中，在本文所述的方法中从中扩增出γδT细胞的分离的混合细胞群包含约80％、70％、60％、50％、40％、30％或20％的T淋巴细胞和小于约60％、50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.05％或0.02％的δ2细胞。在一些实施方案中，在本文所述的方法中从中扩增出γδT细胞的分离的混合细胞群选自外周血样品(例如，PBMC或PBL)、白细胞单采样品、脐带血样品、肿瘤或组织。在某些实施方案中，本发明的方法提供包含多克隆TCR多样性的富集的γδT细胞群。
在某些实施方案中，抗原呈递细胞(APC)、人工抗原呈递细胞(aAPC)、经辐射的抗原呈递细胞群(例如，经辐射的PBMC、经辐射的永生化细胞系或经辐射的aAPC)、氨基膦酸盐、氨基磷酸盐、双膦酸盐或它们的组合不扩增，或在它们存在的情况下不扩增富集的γδT细胞群。在某些实施方案中，经辐射的PBMC不扩增或在存在经辐射的PBMC的情况下不扩增富集的γδT细胞群。在某些实施方案中，经辐射的aAPC(例如，工程改造的K562、RPMI8226、T2或JVM-3)不扩增或在存在经辐射的aAPC的情况下不扩增富集的γδT细胞群。在某些实施方案中，永生化细胞系的受辐射细胞群不扩增或在存在永生化细胞系的受辐射细胞群的情况下不扩增富集的γδT细胞群。在优选的实施方案中，选择性扩增δ1 T细胞、δ2 T细胞、δ1T细胞和δ4 T细胞或δ1、δ3、δ4和δ5 T细胞(例如，γδT细胞)的所述一种或多种药剂是抗体。
在一些实施方案中，选择性扩增δ1 T细胞、δ2 T细胞、δ1 T细胞和δ4 T细胞或δ1、δ3、δ4和δ5 T细胞(例如，指定δ-亚型的γδT细胞)的所述一种或多种药剂固定在表面上。在一些实施方案中，在第一和/或第二或后续扩增中，选择性扩增δ1 T细胞、δ2 T细胞、δ1 T细胞和δ4 T细胞或δ1、δ3、δ4和δ5 T细胞(例如，指定δ-亚型的γδT细胞)的所述一种或多种药剂固定在抗原呈递细胞(例如，aAPC)的表面上。固定在抗原呈递细胞的表面上的药剂可以例如结合至在APC的表面上表达的Fc受体或在APC的表面上表达。
在一些实施方案中，本发明的方法使用补充有IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、IL-18、IL-19、IL-21、IL-23、IL-33、IFNγ、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、凝集素(例如，PHA-E、PHA-L或ConA)或它们的两者或更多者或全部的组合的培养基进行。在一些实施方案中，本发明的方法使用未补充有IL-21的培养基进行。在一些实施方案中，本发明的方法使用补充有IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、IL-18、IL-19、IL-21、IL-23、IL-33、IFNγ、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、凝集素(例如，PHA-E、PHA-L或ConA)或它们的两者或更多者或全部的组合的培养基通过第一γδT细胞扩增进行。在一些实施方案中，本发明的方法使用未补充有IL-21的培养基通过第一γδT细胞扩增进行。在一些实施方案中，本发明的方法使用补充有IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、IL-18、IL-19、IL-21、IL-23、IL-33、IFNγ、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、凝集素(例如，PHA-E、PHA-L或ConA)或它们的两者或更多者或全部的组合的培养基通过第二γδT细胞扩增进行。在一些实施方案中，本发明的方法使用未补充有IL-21的培养基通过第二γδT细胞扩增进行。
在一些实施方案中，本发明的方法使用不含一种或多种药剂的培养基通过第一γδT细胞扩增(包括本文所述的任何γδT细胞扩增方法或组合物)，然后通过第二γδT细胞扩增进行，所述一种或多种药剂选择性扩增δ1 T细胞；δ2 T细胞；δ1 T细胞和δ3 T细胞；δ1 T细胞和δ4 T细胞；或δ1、δ3、δ4和δ5 T细胞(例如，指定δ-亚型的γδT细胞)。在一些实施方案中，本发明的方法使用培养基通过第一γδT细胞扩增(包括本文所述的任何γδT细胞扩增方法或组合物(例如，活化剂)，该方法包括使工程改造的或非工程改造的γδT细胞、工程改造的或非工程改造的γδT细胞群和/或分离的混合细胞群与选择性扩增δ1 T细胞；δ2 T细胞；δ1 T细胞和δ4 T细胞；或δ1、δ3、δ4和δ5T细胞(例如，指定δ-亚型的γδT细胞)的固定化药剂接触)，然后通过第二γδT细胞扩增进行，所述培养基：i)不含选择性扩增δ1 T细胞；δ2T细胞；δ1 T细胞和δ4 T细胞；或δ1、δ3、δ4和δ5 T细胞的一种或多种药剂；ii)含有选择性扩增δ1 T细胞；δ2 T细胞；δ1 T细胞和δ4 T细胞；或δ1、δ3、δ4和δ5 T细胞的(例如，固定化)结构上不同的药剂；iii)含有选择性扩增δ1 T细胞；δ2 T细胞；δ1 T细胞和δ4 T细胞；或δ1、δ3、δ4和δ5 T细胞的非固定(可溶性)药剂；或iv)含有扩增T细胞(例如，扩增αβ和γδT细胞)或选择性扩增γδT细胞，而非αβT细胞的药剂。
在一些情况下，扩增T细胞的药剂是结合CD3的药剂，诸如抗CD3抗体(例如，OKT3)。在一些情况下，选择性扩增γδT细胞的药剂是结合γ-链恒定区或δ-链恒定区的药剂，或结合γδTCR的药剂，诸如结合γδTCR的抗体(例如，IMMU510)。在一些情况下，在第一细胞扩增和第二细胞扩增之间，和/或在第二细胞扩增之后通过正向选择来富集γδT细胞群。在一些情况下，在第一细胞扩增和第二细胞扩增之间，和/或在第二细胞扩增之后通过剔除αβT细胞来富集γδT细胞群。
在本发明的方法的某些实施方案中，例如富集的γδT细胞群在第一、第二或后续扩增中在含有抗原呈递细胞(APC)的培养基中扩增。在一些实施方案中，培养基含有扩增T细胞、扩增γδT细胞、选择性扩增γδT细胞或选择性扩增δ1 T细胞、δ2 T细胞、δ1 T细胞和δ3T细胞或δ1 T细胞和δ4 T细胞的一种或多种药剂(例如，结合γδTCR的恒定区或可变区的抗体、结合CD3的抗体和/或氨基膦酸盐)。在某些实施方案中，富集的γδT细胞群在含有经辐射的PBMC的培养基中扩增。在某些实施方案中，富集的γδT细胞群在含有经辐射的人工APC(aAPC)的培养基中扩增。在某些实施方案中，富集的γδT细胞群在含有永生化细胞系的经辐射的细胞群(例如，K562 APC)的培养基中扩增。在一些情况下，APC不表达，或表现出HLA I类、HLA II类、HLA II类不变链和/或HLA-DM的表达减少。在一些情况下，APC表达粘附或共刺激分子，诸如细胞间粘附分子-1、CD11a、CD18、CD54、CD80、CD86、4-1BBL、OX-40L、CD70，或一种或多种锚定在膜中的γδT细胞活化剂，和/或白细胞功能相关抗原-3。在一些情况下，APC表达Fc受体，诸如对用于本文所述的γδT细胞扩增方法的活化剂的同种型具有特异性的Fc受体。在一些情况下，APC表达一种或多种选自以下的Fc受体：CD64、CD32A、CD32B、CD32C、CD16A、CD16B、FcRn、TRIM21或CD307，或它们的具有更高亲和力或改变的特异性的工程改造的变体。
在一些实施方案中，含有抗原呈递细胞(APC)、人工抗原呈递细胞(aAPC)或经辐射的抗原呈递细胞群(例如，PBMC、永生化细胞系或aAPC)的培养基还含有选择性扩增δ1 T细胞；δ2 T细胞；δ1 T细胞和δ3 T细胞；δ1 T细胞和δ4 T细胞；或δ1、δ3、δ4和δ5 T细胞的一种或多种药剂。在某些实施方案中，例如经辐射的PBMC、APC、aAPC或永生化细胞系的细胞群在细胞表面上表达选择性扩增δ1 T细胞；δ2 T细胞；δ1 T细胞和δ4 T细胞；或δ1、δ3、δ4和δ5 T细胞的一种或多种药剂。在一些优选的实施方案中，所述选择性扩增δ1 T细胞；δ2 T细胞；δ1 T细胞和δ4 T细胞；或δ1、δ3、δ4和δ5 T细胞的一种或多种药剂是抗体。在一些实施方案中，所述选择性扩增δ1 T细胞；δ2 T细胞；δ1 T细胞和δ4；或δ1、δ3、δ4和δ5 T细胞的一种或多种药剂是在APC的表面上表达的或结合至在APC的表面上表达的Fc受体(例如，Fcγ受体)的抗体。
在一些实施方案中，本发明提供用于从分离的(例如混合的)细胞群产生富集的γδT细胞群的离体方法，所述方法包括(i)在第一γδT细胞扩增中，使例如混合的细胞群与一种或多种药剂直接接触，所述一种或多种药剂(a)扩增γδT细胞(例如通过结合至γδTCR)，或(b)：
-通过结合至δ1 TCR的特异性的活化表位来选择性扩增δ1 T细胞；
-通过结合至δ2 TCR的特异性的活化表位来选择性扩增δ2 T细胞；
-通过结合至δ1 TCR和δ4 TCR的特异性的活化表位来选择性扩增δ1 T细胞和δ4 T细胞；或
-通过结合至δ1、δ3、δ4和δ5 TCR的特异性的活化表位来选择性扩增δ1、δ3、δ4和δ5T细胞，由此产生第一富集的γδT细胞群，然后(ii)在第二γδT细胞扩增中，任选地在一种或多种可溶性或固定化药剂的存在下，使第一富集的γδT细胞群的至少一部分与抗原呈递细胞(APC)直接接触，所述可溶性或固定化药剂(a)扩增T细胞，(b)扩增γδT细胞(例如，通过结合至γδTCR)，或(c)：
-通过结合至δ1 TCR的特异性的活化表位来选择性扩增δ1 T细胞；
-通过结合至δ2 TCR的特异性的活化表位来选择性扩增δ2 T细胞；
-通过结合至δ1 TCR和δ4 TCR的特异性的活化表位来选择性扩增δ1 T细胞和δ4 T细胞；或
-通过结合至δ1、δ3、δ4和δ5 TCR的特异性的活化表位来选择性扩增δ1、δ3、δ4和δ5T细胞，由此产生第二富集的γδT细胞群，其中所述第二富集的γδT细胞群包含一定临床相关数目(例如，>108个)的δ1 T细胞；δ2 T细胞；δ1 T细胞和δ4 T细胞；或δ1、δ3、δ4和δ5 T细胞。
在一些情况下，所述一定临床相关数目(例如，>108个)的γδT细胞从单个供体，例如从供体的单个样品或2个或更多个样品获得。在一些情况下，所述一定临床相关数目(例如，>108个)的γδT细胞在小于30天的扩增内，优选地小于21天的扩增，更优选地在19天的扩增内，从单个供体，例如从供体的单个样品或2个或更多个样品获得。
在一些情况下，在(i)和(ii)之间，或在(ii)之后通过正向选择来富集γδT细胞群。在一些情况下，在(i)和(ii)之间，或在(ii)之后通过剔除αβT细胞来富集γδT细胞群。在一些情况下，扩增T细胞的药剂是结合CD3的药剂，诸如抗CD3抗体。在一些情况下，选择性扩增γδT细胞的药剂是结合γ-链恒定区或δ-链恒定区的药剂，或结合γδTCR的药剂，诸如结合γδTCR的抗体(例如，IMMU510)。
在本发明的方法的某些实施方案中，富集的γδT细胞群通过以下步骤产生：(i)在第一γδT细胞扩增中，使分离的(例如混合的)细胞群与一种或多种第一药剂接触，所述第一药剂(a)扩增γδT细胞(例如，通过结合至γδTCR)或(b)：
-通过结合至δ1 TCR的特异性的活化表位来选择性扩增δ1 T细胞；
-通过结合至δ2 TCR的特异性的活化表位来选择性扩增δ2 T细胞；
-通过结合至δ1 TCR和δ4 TCR的特异性的活化表位来选择性扩增δ1 T细胞和δ4 T细胞；或
-通过结合至δ1、δ3、δ4和δ5 TCR的特异性的活化表位来选择性扩增δ1、δ3、δ4和δ5T细胞，以提供第一富集的γδT细胞群；然后(ii)在第二γδT细胞扩增中，使第一富集的γδT细胞群或其一部分与一种或多种第二药剂接触，所述第二药剂(a)扩增T细胞，(b)扩增γδT细胞(例如，通过结合至γδTCR)，或(c)：
-通过结合至δ1 TCR的特异性的活化表位来选择性扩增δ1 T细胞；
-通过结合至δ2 TCR的特异性的活化表位来选择性扩增δ2 T细胞；
-通过结合至δ1 TCR和δ4 TCR的特异性的活化表位来选择性扩增δ1 T细胞和δ4 T细胞；或
-通过结合至δ1、δ3、δ4和δ5 TCR的特异性的活化表位来选择性扩增δ1、δ3、δ4和δ5T细胞，其中所述一种或多种第二药剂与一种或多种第一药剂在结构上是不同的，据此提供第二富集的γδT细胞群。在一些情况下，所述一种或多种第二药剂与一种或多种第一药剂结合不同的γδTCR表位。
在一些情况下，在(i)和(ii)之间，或在(ii)之后通过正向选择来富集γδT细胞群。在一些情况下，在(i)和(ii)之间，或在(ii)之后通过剔除αβT细胞来富集γδT细胞群。在一些情况下，扩增T细胞的药剂是结合CD3的药剂，诸如抗CD3抗体。在一些情况下，选择性扩增γδT细胞的药剂是结合γ-链恒定区或δ-链恒定区的药剂，或结合γδTCR的药剂，诸如结合γδTCR的抗体(例如，IMMU510)。
在一些情况下，第一γδT细胞扩增在含有抗原呈递细胞(APC)的培养基中进行。在一些情况下，第二γδT细胞扩增在含有抗原呈递细胞(APC)的培养基中进行。在一些情况下，第一γδT细胞扩增在不含有抗原呈递细胞(APC)的培养基中进行。在一些情况下，第一γδT细胞扩增在不含有抗原呈递细胞(APC)的培养基中进行，并且第二γδT细胞扩增在含有抗原呈递细胞(APC)的培养基中进行。在一些情况下，第一γδT细胞扩增和第二γδT细胞扩增在含有抗原呈递细胞(APC)的培养基中进行。在一些情况下，第一γδT细胞扩增和第二γδT细胞扩增在含有氨基磷酸盐、氨基膦酸盐、双膦酸盐或它们的组合的培养基中进行。
在另一个实施方案中，本发明的富集的γδT细胞群可进一步被配制为施用于受试者。本发明的富集的γδT细胞群包含治疗有效量的γδT细胞。在某些实施方案中，γδT细胞群被工程改造为稳定表达一个或多个结构上不同的肿瘤识别部分。在某些实施方案中，如本文所述扩增和/或进一步扩增工程改造的γδT细胞。
在一些前述方面、实施方案、案例和实例中，一种或多种药剂刺激γδT细胞以在小于30小时内(例如，从大于约17小时至小于约30小时)1次细胞分裂的平均速率扩增。在一些实施方案中，所述分裂的平均速率针对连续0-4天、0-5天、0-7天γδT细胞扩增，连续0-13天γδT细胞扩增，连续0-19天γδT细胞扩增，连续0-21天γδT细胞扩增，或针对连续至少3天、4天、5天、6天、7天、10天、13天、19天或21天γδT细胞扩增。在其它实施方案中，一种或多种药剂刺激γδT细胞以在小于24小时内(例如，从大于约17小时至小于约24小时)1次细胞分裂的平均速率扩增。在其它实施方案中，一种或多种药剂刺激γδT细胞以在小于18小时或约18小时内1次细胞分裂的平均速率扩增。
应当理解，可以容易地修改一个或多个前述方面、实施方案、案例和实例，以适用于从基本上同质的细胞群进行γδT细胞扩增(例如，选择性γδT细胞扩增)，诸如在建立γδT细胞工程改造的克隆或细胞系，即含有一种或多种(例如，在结构上不同的)工程改造的γδT细胞的群体之后，或在负向选择或正向选择含有γδT细胞的细胞群的一个或多个步骤之后。因此，一种或多种前述方法或它们的组合可用于通过以下方式来扩增工程改造的γδT细胞：使工程改造的γδT细胞或其群体与本文所述的任何一种或多种活化剂接触，所述活化剂包括可溶性或固定化形式(例如，固定在APC的表面上)的本文所述的一种或多种抗体。
因此，在一些实施方案中，在本文提供的方法或组合物中，用γδT细胞工程改造的克隆或细胞系，或含有一种或多种(例如，在结构上不同的)工程改造的γδT细胞的群体替换分离的混合细胞群。
在其它方面，本发明提供选择性扩增的γδT细胞群，其中大于60％、70％、80％或90％的扩增的γδT细胞是δ1 T细胞；δ1 T细胞和δ4 T细胞；或δ1 T细胞、δ3 T细胞、δ4 T细胞和δ5 T细胞。在某个实施方案中，选择性扩增的γδT细胞群包含δ1 T细胞和δ2 T细胞，其中大于60％、70％、80％或90％的扩增的γδT细胞是δ1 T细胞、δ1 T细胞和δ4 T细胞；或δ1T细胞、δ3 T细胞、δ4 T细胞和δ5 T细胞。在某些实施方案中，选择性扩增的γδT细胞群未通过从富集的γδT细胞群正向选择γδT细胞(例如，正向选择δ1 T细胞、δ1 T细胞和δ3 T细胞或δ1 T细胞和δ4 T细胞)，或通过从富集的γδT细胞群剔除非γδT细胞(例如，剔除非δ1 T细胞，诸如αβT细胞)来纯化。
在某些实施方案中，从包含T淋巴细胞的分离的混合细胞群直接扩增选择性扩增的γδT细胞群。在某些实施方案中，在本文所述的方法中从中扩增出γδT细胞的分离的混合细胞群包含约80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％的T淋巴细胞和小于约30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1.5％、1.2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的δ1细胞。在某些实施方案中，在本文所述的方法中从中扩增出γδT细胞的分离的混合细胞群包含小于约30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1.5％、1.2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的δ1细胞。在一些实施方案中，分离的混合细胞群选自外周血样品、脐带血样品、肿瘤、上皮组织或皮肤、肝或其它组织的活检样品。在一些实施方案中，分离的混合细胞群来源于单个供体。在其它实施方案中，分离的混合细胞群来源于一个以上或多个供体。在一个实施方案中，扩增的γδT细胞群来源于肿瘤侵润性淋巴细胞，所述肿瘤侵润性淋巴细胞可以例如从结肠腺癌转移、肝癌、卵巢癌、头颈癌或肾癌分离。
在一些实施方案中，本发明的选择性扩增的γδT细胞群包含大于60％或70％的δ1T细胞；δ1 T细胞和δ4 T细胞；或δ1 T细胞、δ3 T细胞、δ4 T细胞和δ5 T细胞，这些细胞分别表达初始或中央型记忆T细胞(TCM)表型CD45RA+/CD27+和/或CD45RA-/CD27+。在一些实施方案中，扩增的γδT细胞群包含多克隆γδTCR多样性。
在其它方面，本发明提供选择性扩增的γδT细胞群，其中大于80％或90％的扩增的γδT细胞是δ2 T细胞。在某些实施方案中，选择性扩增的γδT细胞群未通过从富集的γδT细胞群正向选择γδT细胞(例如，正向选择δ2 T细胞)，或通过从富集的γδT细胞群剔除非γδT细胞(例如，剔除非δ2 T细胞，诸如剔除αβT细胞)来纯化。在某些实施方案中，从包含T淋巴细胞的分离的混合细胞群直接扩增选择性扩增的γδT细胞群。在某些实施方案中，从中扩增出γδT细胞群的分离的混合细胞群包含约80％、70％、60％、50％、40％、30％或20％的T淋巴细胞和小于约60％、50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1.5％、1.2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的δ2细胞。在某些实施方案中，在本文所述的方法中从中扩增出γδT细胞的分离的混合细胞群包含小于约30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1.5％、1.2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的δ2细胞。在一些实施方案中，分离的混合细胞群选自外周血样品、脐带血样品或肿瘤。在一个实施方案中，扩增的γδT细胞群来源于肿瘤侵润性淋巴细胞，所述肿瘤侵润性淋巴细胞可以例如从结肠腺癌转移、肝癌、卵巢癌、头颈癌或肾癌分离。
在其它方面，本发明提供选择性扩增的γδT细胞群，其中10-90％的扩增的γδT细胞是δ1 T细胞，并且90-10％的扩增的γδT细胞是δ2 T细胞。
在某些实施方案中，例如同时或在单独的接触步骤中，通过使混合细胞群与选择性扩增δ1细胞；δ1 T细胞和δ3 T细胞；δ1 T细胞和δ4 T细胞；或δ1 T细胞、δ3 T细胞、δ4 T细胞和δ5 T细胞的药剂，以及与选择性扩增δ2细胞的药剂接触来共同扩增所述群体。在其它实施方案中，所述群体是δ1和δ2 T细胞群的掺和物，该掺和物从分离的混合细胞群单独地和选择性扩增。在所有实施方案中，本发明的扩增的γδT细胞群或其掺和物可进一步被配制为施用于受试者。
在某些实施方案中，本发明的γδT细胞或γδT细胞群被工程改造为稳定表达由表达盒编码的一个或多个结构上不同的肿瘤识别部分。在一个实施方案中，γδT细胞被工程改造为稳定表达由表达盒编码的两个或多个结构上不同的肿瘤识别部分。在一些实施方案中，所述两个或多个结构上不同的肿瘤识别部分识别相同抗原的不同表位或不同抗原的不同表位。肿瘤识别部分可以选自αβTCR、γδTCR、αβTCR或γδTCR的片段、嵌合抗原受体(CAR)、完全抗体或其抗原结合片段、单链可变片段(scFv)、重链或轻链单结构域抗体(sdAb)、Fab、F(ab)2或它们的任何组合，它们结合至：(i)细胞表面肿瘤抗原或(ii)来源于在细胞表面上表达的肿瘤抗原的作为与MHC的复合物(肽-MHC复合物)的肽。在某些实施方案中，肿瘤识别部分是以非MHC限制方式识别肿瘤特异性抗原的肿瘤侵润性淋巴细胞的γδTCR。
在另一个方面，本发明提供根据本发明的方法获得的扩增的γδT细胞群。在一些实施方案中，γδT细胞群在不存在通过抗原呈递细胞或氨基膦酸盐进行的抗原刺激的情况下进行离体扩增。在某些实施方案中，γδT细胞群使用单克隆抗体、抗体片段或融合蛋白进行离体活化。本发明的γδT细胞群也可以被配制为在不与IL-2共施用的情况下施用于受试者。或者，本发明的γδT细胞群也可以被配制为在与IL-2共施用的情况下施用于受试者。
在其它方面，本发明提供用于治疗有此需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的根据本发明的扩增的γδT细胞群。在一个实施方案中，扩增的γδT细胞群关于受试者的MHC基因座是同种异体的。在某些实施方案中，扩增的γδT细胞群被工程改造为稳定表达由一个或多个表达盒编码的一个或多个，或两个或多个肿瘤识别部分。在另外的实施方案中，扩增的γδT细胞群稳定表达至少两个结构上不同的识别部分，并且每个结构上不同的识别部分识别(i)相同抗原的不同表位，或(ii)不同抗原的不同表位。肿瘤识别部分可以选自αβTCR、γδTCR、嵌合抗原受体(CAR)，包括完全抗体或其抗原结合片段、单链可变片段(scFv)、重链或轻链单结构域抗体(sdAb)、Fab、F(ab)2或它们的任何组合，它们结合至：(i)细胞表面肿瘤抗原或(ii)来源于在细胞表面上表达的肿瘤抗原的作为与MHC的复合物(肽-MHC复合物)的肽。
在另一个方面，本发明提供工程改造的γδT细胞，其中所述工程改造的γδT细胞被工程改造为表达肿瘤识别部分，其中所述肿瘤识别部分识别肿瘤抗原，和/或其中所述工程改造的γδT细胞在存在(例如，体外接触)一种或多种药剂的情况下体外扩增，所述药剂与TS-1、TS8.2、B6或15D抗体结合相同的表位。在另一个方面，本发明提供工程改造的γδT细胞，其中所述工程改造的γδT细胞被工程改造为表达肿瘤识别部分，其中所述肿瘤识别部分识别肿瘤抗原，和/或其中所述工程改造的γδT细胞在存在(例如，体外接触)一种或多种药剂的情况下体外扩增，所述药剂结合与TS-1、TS8.2、B6或15D抗体所结合的表位不同的表位，或结合不与TS-1、TS8.2、B6或15D抗体所述结合的表位重叠的表位。在一些情况下，工程改造的γδT细胞在存在(例如，体外接触)一种或多种药剂的情况下体外扩增，所述药剂不与TS-1、TS8.2、B6或15D竞争结合γδT细胞。在一个实施方案中，药剂是本文所述的任何一种或多种可溶性或固定化活化剂。在一个实施方案中，工程改造的γδT细胞是δ1、δ2、δ3或δ4工程改造的T细胞。
在某些实施方案中，工程改造的γδT细胞被进一步工程改造为缺乏来自至少一个HLA基因座的基因表达。在一个实施方案中，一种或多种药剂刺激工程改造的γδT细胞以在小于30小时内(例如，从大于约17小时至小于约30小时)1次细胞分裂的平均速率扩增。在一些实施方案中，所述分裂的平均速率针对连续0-4天、0-5天、0-7天γδT细胞扩增，连续0-13天γδT细胞扩增，连续0-19天γδT细胞扩增，连续0-21天γδT细胞扩增，或针对连续至少3天、4天、5天、6天、7天、10天、13天、19天或21天γδT细胞扩增。在其它实施方案中，一种或多种药剂刺激工程改造的γδT细胞以在小于24小时内(例如，从大于约17小时至小于约24小时)1次细胞分裂的平均速率扩增。在其它实施方案中，一种或多种药剂刺激工程改造的γδT细胞以在小于18小时或约18小时内1次细胞分裂的平均速率扩增。在某些实施方案中，肿瘤识别部分来源于肿瘤侵润性淋巴细胞。
在另一个方面，本发明提供扩增的γδT细胞群，其中所述γδT细胞群包含抗肿瘤细胞毒性。在一些情况下，γδT细胞群包含与NKp30活性、NKp44活性和/或NKp46活性无关的抗肿瘤细胞毒性。在一些情况下，γδT细胞群包含抗肿瘤细胞毒性，其中所述抗肿瘤细胞毒性由与NKp30活性、NKp44活性和/或NKp46活性无关的抗肿瘤活性构成，或基本上由它们构成。在一些情况下，γδT细胞群包含抗肿瘤细胞毒性，其中至少50％、60％、75％、80％、90％或99％的抗肿瘤细胞毒性与NKp30活性、NKp44活性和/或NKp46活性无关。
在一些情况下，γδT细胞群是工程改造的γδT细胞群。在一些情况下，γδT细胞群是非工程改造的γδT细胞群。在一些情况下，γδT细胞群不包含NKp30活性依赖性抗肿瘤细胞毒性、NKp44活性依赖性抗肿瘤细胞毒性和/或NKp46活性依赖性抗肿瘤细胞毒性。在一些情况下，γδT细胞群不包含NKp30活性依赖性抗肿瘤细胞毒性。在一些情况下，γδT细胞群不包含NKp44活性依赖性抗肿瘤细胞毒性。在一些情况下，γδT细胞群是包含抗CD20嵌合抗原受体(CAR)的工程改造的γδT细胞群。在一些情况下，细胞群中小于90％、80％、75％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％的γδT细胞表达可检测水平的NKp30、NKp44和/或NKp46。
以引用方式并入
在本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请均以引用方式并入本文，其程度如同每个单独的公布、专利或专利申请被具体且单独地指明为以引用方式并入。
附图说明
本发明的新型特征在随附权利要求中具体阐述。通过参考对其中利用了本发明原理的示例性实施方案作出阐述的以下具体实施方式以及附图(本文也称为“图”和“图解”)，将更好地理解本发明的特征和优点，其中：
图1示意性地说明了工程改造的γδT细胞。图A说明了表达一个肿瘤识别部分的工程改造的γδT细胞。图B说明了表达两个结构上不同的肿瘤识别部分的工程改造的γδT细胞。
图2示意性地说明了用于治疗受试者的方法。
图3示意性地说明了用于将工程改造的γδT细胞群施用于受试者的方法。
图4描绘了说明从转移到肝的结肠腺癌(TIL 1)和肾肿瘤(TIL 2)分离的γδ1和γδ2淋巴细胞的生长的图示，并且已显示出表达CCR4和CCR7。
图5描绘了说明γδT细胞在含血清和无血清培养基中生长的图示。
图6描绘了说明使用5A6.E9、B1、TS8.2、15D、B3、B6、TS-1、γ3.20、IMMU510或11F2进行的抗γδTCR抗体封闭实验的图示。
图7描绘了说明使用5A6.E9、B1、TS8.2、15D、B3、B6、TS-1、γ3.20、IMMU510或11F2进行的抗γδTCR抗体封闭实验的图示。
图8描绘了使用抗TCR Vδ1 TS-1抗体进行的竞争实验。
图9描绘了使用抗TCR Vδ1 TS8.2抗体进行的竞争实验。
图10描绘了说明来自PBMC的δ1 T细胞的活化和扩增的图示。
图11描绘了说明来自PBMC的δ2 T细胞的活化和扩增的图示。
图12描绘了说明来自PBMC的δ1 T细胞的倍数扩增的图示。
图13描绘了说明来自PBMC的δ2 T细胞的倍数扩增的图示。
图14描绘了人Vδ1氨基酸序列。CDR1区、CDR3区和CDR3区加下划线。
图15描绘了人Vδ2氨基酸序列。CDR1区、CDR3区和CDR3区加下划线。
图16描绘了使用TS-1或TS8.2抗体活化PBMC，引起显著和特异性扩增Vδ1+ T细胞。(A)在24孔板中用山羊抗小鼠Fc(5μg/mL)(TS1Fc、TS8.2Fc、B6Fc和15DFc)直接包被(1μg/mL)MAb(TS1、TS8.2、B6和15D)或捕获(0.1μg/mL)MAb。将PBMC以106个细胞/mL接种于含有10％FBS和100IU/mL IL-2的RPMI中。在第7天，将细胞转移至无抗体的新平板并进一步扩增直到第14天。每2-3天补充培养基。数据描绘了在14天内的Vδ1+细胞扩增；(B)与A相同的培养物，示出了第14天和第0天(d0)的Vδ1+细胞的百分比；(C)如下所述，从来自不同的供体的分离的PBMC扩增Vδ1+细胞。在24孔板中用山羊抗小鼠Fc(5μg/mL)(TS1Fc、TS8.2Fc、B6Fc和15DFc)直接包被(1μg/mL)MAb(TS1、TS8.2、B6和15D)或捕获(0.1μg/mL)MAb。将PBMC f以106个细胞/mL接种于含有10％FBS和100IU/mL IL-2的RPMI中。在第7天将细胞转移至无抗体的新平板，用新鲜培养基调整至106个细胞/mL。每2-3天补充培养基并调整至106个细胞/mL。数据描绘了在14天内的Vδ1+细胞扩增。(D)将PBMC以106个细胞/mL接种于含有10％FBS和100IU/mL IL-2的RPMI中。在第7天，将细胞转移至无抗体的新平板，调整至106个细胞/mL并进一步扩增直到第23天。每2-3天补充培养基。
图17描绘了使用B6和15D抗体活化PBMC引起显著特异性活化和扩增Vδ2+ T细胞。(A)在24孔板中用山羊抗小鼠Fc(5μg/mL)(TS1Fc、TS8.2Fc、B6Fc和15DFc)直接包被(1μg/mL)MAb(TS1、TS8.2、B6和15D)或捕获(0.1μg/mL)MAb。将PBMC以106个细胞/mL接种于含有10％FBS和100IU/mL IL-2的RPMI中。在第7天，将细胞转移至无抗体的新平板并进一步扩增直到第14天。每2-3天补充培养基。数据描绘了在14天内的Vδ2+ T细胞扩增；(B)与A相同的培养物，示出了第14天和第0天(d0)的Vδ2+细胞的百分比；(C)在24孔板中直接包被(1μg/mL)MAb(15D和泛γδTCR Mab Immu510)。将来自不同供体的PBMC以106个细胞/mL接种于含有10％FBS和100IU/mL IL-2的RPMI中。在第7天将细胞转移至无抗体的新平板。每2-3天补充培养基并用新鲜培养基调整至106个细胞/mL。数据描绘了在14天内的Vδ2+ T细胞扩增；(D)与C相同的培养物，示出了第14天和第0天(d0)的Vδ2+ T细胞的百分比。(E)在24孔板中用山羊抗小鼠Fc(5μg/mL)(TS1Fc、TS8.2Fc、B6Fc和15DFc)直接包被(1μg/mL)MAb(TS1、TS8.2、B6和15D)或捕获(0.1μg/mL)MAb。将来自另一种供体的PBMC以106个细胞/mL接种于含有10％FBS和100IU/mL IL-2的RPMI中。在第7天将细胞转移至无抗体的新平板，用新鲜培养基调整至106个细胞/mL。每2-3天补充培养基并调整至106个细胞/mL。数据描绘了在14天内的Vδ2+ T细胞扩增。
图18描绘了在与γδ特异性抗体TS1、TS8.2、B6和15D培养的PBMC中αβT细胞的百分比显著降低。(A)在24孔板中用山羊抗小鼠Fc(5μg/mL)(TS1Fc、TS8.2Fc、B6Fc和15DFc)直接包被(1μg/mL)MAb(TS1、TS8.2B6和15D)或捕获(0.1μg/mL)MAb。将PBMC以106个细胞/mL接种于含有10％FBS和100IU/mL IL-2的RPMI中。在第7天，将细胞转移至无抗体的新平板并进一步扩增直到第14天。每2-3天补充培养基。数据描绘了在14天内的αβT细胞扩增；(B)与A相同的培养物，示出了第14天和第0天(d0)的αβT细胞的百分比。
图19描绘了γδTCR的活化引起γδT细胞倍增时间减少。
在24孔板中用山羊抗小鼠Fc(5μg/mL)(TS1Fc、TS8.2Fc、B6Fc和15DFc)直接包被(1μg/mL)MAb(TS1、TS8.2、B6和15D)或捕获(0.1μg/mL)MAb。将PBMC以106个细胞/mL接种于含有10％FBS和100IU/mL IL-2的RPMI中。在第7天将细胞转移至无抗体的新平板，用新鲜培养基调整至106个细胞/mL。每2-3天补充培养基并用新鲜培养基调整至106个细胞/mL。Vδ1、Vδ2和αβT细胞的倍增时间分别如(A)、(B)和(C)所示。
图20描绘了抗体TS8.2和TS1活化Vδ1引起主要初始和中央记忆表型。在24孔板中以1μg/mL直接包被抗体(TS8.2、R9.12和泛γδImmu510)。将PBMC以106/mL接种于含有10％FBS和100IU/mL IL-2的RPMI中。除第15天在新鲜培养基中1:2稀释培养物之外，每2-3天补充培养基直到第23天。使用流式细胞术分析通过CD45RA和CD27表达确定第14天和第23天的细胞表型。
图21描绘了TS8.2和MICA活化PBMC引起Vδ1 T细胞的扩增增强但αβT细胞的扩增不增强。在24孔板中用MICA-Fc(1μg/mL和5μg/mL)直接包被抗体TS8.2(1μg/mL)或TS8.2。将PBMC以106/mL接种于含有10％FBS和100IU/mL IL-2的RPMI中。每2-3天补充培养基。(A)Vδ1T细胞扩增；(B)αβT细胞扩增。
图22描绘了用δ1和δ2特异性抗体活化脐带血单核细胞引起显著和特异性扩增Vδ1+和Vδ2+ T细胞。在24孔板中以1μg/mL直接包被MAb TS8.2、R9.12、B6和15D。在含有10％FBS和100IU/mL IL-2的RPMI中以106/mL活化脐带血单核细胞。Vδ1和Vδ2 T细胞扩增分别如(A)和(B)所示。
图23描绘了与由Vδ1J1、Vδ1J2和Vδ1J3链与γ8链配对产生的可溶性TCR的结合。数据显示，TS1和TS8.2识别由Vδ1J1和Vδ1J2链产生的可溶性TCR，但不能结合Vδ1J3链，表明J1和J2基因区段对于TS1和TS8.2结合是关键的。结合至Vδ1的R9.12以及结合至δ恒定区的泛抗体(pan antibody)Immuno510不受特异性J区的影响。
图24描绘了人Vδ1J1、J2和J3区的序列比对以及Vδ1J1链在所选的位置处的突变。BE-13是指来自表达δ1γ8 TCR的T细胞白血病细胞系的δ1J区(DSMZ登录号ACC 396)。在Vδ1J1和Vδ1J2区中位置Lys120处的单个氨基酸残基被Thr或Ala置换完全消除了TS-1和TS8.2MAb的结合，表明Vδ1J1和Vδ1J2区中的该氨基酸有助于TS-1和TS8.2的结合。在Vδ1J3区中位置Thr120处的单个氨基酸残基被Lys置换获得TS-1和TS8.2 MAb的结合，进一步表明Vδ1J1和Vδ1J2区中的该氨基酸有助于TS-1和TS8.2的结合。
图25描绘了Vδ1J1中从Lys120至Thr或Ala的点突变使TS-1和TS8.2 MAb的结合丧失。
图26描绘了人Vδ1蛋白序列和基于人Vδ1和牛Vδ1氨基酸序列之间的差异的六个突变的人Vδ1序列(GenBank:AFP25162.1)。突变以粗体显示。
图27描绘了TS-1和TS8.2抗体与人Vδ1突变链的结合丧失。
图28描绘了B6 MAb与不同Vδ2/γ链配对(γ3、γ8、γ9)的结合。
图29描绘了人(IMGT人TRDV2)和恒河猴(GenBank:AY190028.1)Vδ2可变区的蛋白质序列比对以及Vδ2CDR1(G35S)、CDR2(D65G)和CDR3(C104S)中的变化。
图30描绘了15D与在CDR1处突变的Vδ2(G35S)的结合丧失。
图31描绘了使用分别抗δ1、δ2和αβ的TS8.2、B6和IP26抗体进行的高度富集的Vδ1+、Vδ2+和αβT细胞培养物的表征。使用TS-1和TS8.2的组合扩增来源于PBMC的群体，以扩增δ1细胞，或使用15D和B6来扩增δ2细胞。使用IP26 MicroBeads剔除扩增的培养物的αβT细胞。还收集正向选择的αβT细胞(富集αβ)。
图32描绘了Vδ1+、Vδ2+群体对实体瘤(BxPC3、SKMEL5)和浆细胞瘤(RPMI8226)细胞系的细胞毒性。
图33描绘了δ1特异性MAb的重链框架和互补决定区氨基酸序列。
图34描绘了图33所述的δ1特异性MAb的轻链框架和互补决定区氨基酸序列。
图35描绘了δ2特异性MAb的重链框架和互补决定区氨基酸序列。
图36描绘了δ2特异性MAb的轻链框架和互补决定区氨基酸序列。
图37描绘了通过ELISA测定的指定δ1特异性抗体与其它γδTCR的交叉反应。
图38描绘了人和海豚之间的Vδ1推导氨基酸序列的比对。
图39描绘了通过本文所述的γδT细胞扩增方法获得的增殖的Vδ1细胞(A)或Vδ2细胞(B)的百分比。
图40描绘了来自通过本文所述的γδT细胞扩增方法获得的分离的混合细胞群的Vδ1细胞(A)或Vδ2细胞(B)的倍数扩增。
图41描绘了来自通过本文所述的γδT细胞扩增方法获得的分离的混合细胞群的表型数据。使用流式细胞术分析通过CD45RA和CD27表达确定细胞表型。
图42说明了，根据本文所述的γδT细胞扩增方法来活化和扩增的δ1 T细胞可以显示出对肿瘤细胞系的强大细胞毒性。
图43说明了通过本发明的方法实现的第19天的Vδ1倍数扩增和纯度。
图44说明了通过本发明的方法实现的第19天的Vδ1倍数扩增和累积倍增时间。
图45说明了通过本发明的方法实现的第14天至第19天的Vδ1倍数扩增和累积倍增时间。
图46说明了δ1 T细胞上抗CD20嵌合抗原受体(CAR)的表达。在用CAR逆转录病毒构建体转导后第7天，用Vδ1特异性抗体(R9.12)和抗利妥昔单抗FITC缀合物对扩增的细胞染色。多达35％的Vδ1细胞是CD20 CAR+。
图47A至B描绘了δ-1特异性γδT细胞活化剂的表位结合特异性数据。
图48描绘了δ-2特异性γδT细胞活化剂的表位结合特异性数据。
具体实施方式
虽然本文已经示出和描述了本发明的各种实施方案，但是将对本领域技术人员显而易见的是，此类实施方案仅以举例的方式提供。本领域的技术人员可以想到许多变形、改变和替换而不脱离本发明。应当理解，可以采用本文所述的发明的实施方案的各种替代方案。
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本文所述的发明所属领域中普通技术人员通常所理解的相同含义。为了解释本说明书，以下定义将适用，并且在适当时，以单数使用的术语也将包括复数，反之亦然。如果阐述的任何定义与以引用的方式并入本文的任何文档发生冲突，则以下面阐述的定义为准。
如本文所用，术语“γδT细胞(gamma delta T细胞)”是指在其表面上表达由一条γ-链和一条δ-链组成的独特的T细胞受体(TCR)，即γδTCR的T细胞亚群。术语“γδT细胞”特别包括γδT细胞的所有亚群，包括但限于Vδ1和Vδ2、Vδ3γδT细胞，以及初始γδT细胞、效应记忆γδT细胞、中央记忆γδT细胞和终末分化γδT细胞。又如，术语“γδT细胞”包括Vδ4、Vδ5、Vδ7和Vδ8γδT细胞，以及Vγ2、Vγ3、Vγ5、Vγ8、Vγ9、Vγ10和Vγ11γδT细胞。
如本文所用，术语“T淋巴细胞”或“T细胞”是指表达CD3(CD3+)和T细胞受体(TCR+)的免疫细胞。T细胞在细胞介导的免疫中发挥重要作用。
如本文所用，术语“TCR”或“T细胞受体”是指形成α-β或γ-δ受体的二聚体异源性细胞表面信号传导蛋白。αβTCR识别由MHC分子呈递的抗原，而γδTCR识别与MHC呈递无关的抗原。
术语“MHC”(主要组织相容性复合物)是指编码细胞表面抗原呈递蛋白的基因的子集。在人中，这些基因称为人白细胞抗原(HLA)基因。在本文中，缩写MHC或HLA可互换使用。
如本文所用，术语“外周血淋巴细胞”或“PBL”以最广义使用，并且是指白细胞，包括一系列分化和功能阶段的T细胞和B细胞，即浆细胞、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞等。外周血中T淋巴细胞的范围为约20-80％。
如本文所用，术语“细胞群”是指通过直接从合适的来源，通常从哺乳动物分离获得的多个细胞。随后可以体外培养分离的细胞群。本领域的普通技术人员将理解，用于分离和培养细胞群的各种方法均适用于本发明，并且细胞群中的各种细胞数目均适用于本发明。细胞群可以是例如来源于外周血样品、脐带血样品、肿瘤、干细胞前体、肿瘤活检样品、组织、淋巴，或来自直接接触外部环境的受试者的上皮部位，或来源于前体干细胞的混合异质细胞群。或者，混合细胞群可以来源于从外周血样品、脐带血样品、肿瘤、干细胞前体、肿瘤活检样品、组织、淋巴建立的哺乳动物细胞的体外培养物，或来自直接接触外部环境的受试者的上皮部位，或来源于前体干细胞。
“富集的”细胞群或制剂是指来源于起始混合细胞群的细胞群，其含有特定细胞类型的百分比大于起始群体中该细胞类型的百分比。例如，起始混合细胞群可以是针对特定γδT细胞群富集的。在一个实施方案中，富集的γδT细胞群含有的δ1细胞的百分比大于起始群体中该细胞类型的百分比。又如，富集的γδT细胞群可以含有的δ1细胞的百分比和δ3细胞的百分比均大于起始群体中该细胞类型的百分比。还如，富集的γδT细胞群可以含有的δ1细胞的百分比和δ4细胞的百分比均大于起始群体中该细胞类型的百分比。还如，富集的γδT细胞群可以含有的δ1 T细胞、δ3 T细胞、δ4 T细胞和δ5 T细胞的百分比大于起始群体中该细胞类型的百分比。在另一个实施方案中，富集的γδT细胞群含有的δ2细胞的百分比大于起始群体中该细胞类型的百分比。在又一个实施方案中，富集的γδT细胞群含有的δ1细胞和δ2细胞的百分比均大于起始群体中该细胞类型的百分比。在所有实施方案中，富集的γδT细胞群含有的αβT细胞群的百分比较小。
如本文所用，所谓“扩增”意指富集制剂中期望的或目标细胞类型(例如，δ1和/或δ2 T细胞)的数量大于初始或起始细胞群中的数量。所谓“选择性扩增”意指目标细胞类型(例如，δ1或δ2 T细胞)的扩增优先于其它非目标细胞类型(例如，αβT细胞或NK细胞)。在某些实施方案中，本发明的活化剂选择性扩增例如工程改造的或非工程改造的δ1 T细胞，而不显著扩增δ2 T细胞。在其它实施方案中，本发明的活化剂选择性扩增例如工程改造的或非工程改造的δ2 T细胞，而不显著扩增δ1 T细胞。在某些实施方案中，本发明的活化剂选择性扩增例如工程改造的或非工程改造的δ1和δ3 T细胞，而不显著扩增δ2T细胞。在某些实施方案中，本发明的活化剂选择性扩增例如工程改造的或非工程改造的δ1和δ4 T细胞，而不显著扩增δ2 T细胞。在某些实施方案中，本发明的活化剂选择性扩增例如工程改造的或非工程改造的δ1、δ3、δ4和δ5 T细胞，而不显著扩增δ2 T细胞。在该语境中，术语“不显著扩增”意指优先扩增的细胞群的扩增为参考细胞群的至少10倍、优选地100倍、以及更优选地1,000倍。
如本文所用，术语“掺和物”是指来源于混合异质细胞群的两种或多种分离的富集细胞群的组合。根据某些实施方案，本发明的细胞群是分离的γδT细胞群。
适用于细胞群的术语“分离的”是指从人体或动物体分离的细胞群，它们基本上不含与所述体内或体外细胞群相关的一种或多种细胞群。
如本文所用，在细胞群的语境中的术语“接触”是指使分离的细胞群与可连接至珠粒或细胞的试剂(例如抗体、细胞因子、配体、丝裂原或共刺激分子)一起孵育。抗体或细胞因子可以是可溶性形式，或可以是固定化的。在一个实施方案中，固定化抗体或细胞因子紧密结合或共价连接至珠粒或平板。在一个实施方案中，抗体固定于Fc包被的孔上。在所期望的实施方案中，接触离体(例如，体外)或体内发生。
如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即含有特异性结合抗原(与其发生免疫反应)的抗原结合位点的分子。所谓“特异性结合”或“发生免疫反应”或“针对”意指抗体与所需抗原的一个或多个抗原决定簇反应，并且不与其它多肽反应或以非常低的亲和力(KD>10-6摩尔)结合。抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、sdAb(重链或轻链单结构域抗体)、单链、Fab、Fab’和F(ab')2片段、scFv、双体抗体、微抗体、纳米体和Fab表达文库。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体(CAR)”可以指人工T细胞受体、T抗体、单链免疫受体、嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体，例如涵盖将人工特异性移植到特定的免疫效应细胞的工程改造的受体。CAR可用于将单克隆抗体的特异性赋予T细胞，从而允许生成大量特异性T细胞，例如用于过继性细胞疗法。在特定实施方案中，例如CAR将细胞的特异性引入肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，CAR包含胞内活化结构域(允许T细胞在靶向部分与靶细胞，诸如靶肿瘤细胞接合时活化)、跨膜结构域和长度可变化的胞外结构域，并且包含疾病或病状相关的例如肿瘤-抗原结合区。在特定方面，CAR包含来源于单克隆抗体的单链可变片段(scFv)融合至CD3-ξ跨膜结构域和胞内结构域的融合物。其它CAR设计的特异性可以来源于受体(例如，肽)的配体或来源于模式识别受体，诸如Dectin。在某些情况下，可以改变抗原识别结构域的间隔以减少活化诱导的细胞死亡。在某些情况下，CAR包含另外的共刺激信号传导的结构域，诸如CD3-ξ、FcR、CD27、CD28、CD137、DAP 10/12和/或OX40、ICOS、TLR等。在一些情况下，分子可以与CAR一起共表达，包括共刺激分子、用于成像的报告基因(例如，用于正电子发射计算机断层扫描)、在添加前药、归巢受体、趋化因子、趋化因子受体、细胞因子和细胞因子受体时有条件地消融T细胞的基因产物。
已知基本抗体结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻链”(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括约100个至110个或更多个氨基酸的主要负责抗原识别的可变区。每条链的羧基末端部分限定主要负责效应功能的恒定区。一般来讲，从人获得的抗体分子涉及任何以下种类：IgG、IgM、IgA、IgE和IgD，它们彼此不同之处在于分子中存在的重链的性质。某些种类还具有子类，诸如IgG1、IgG2等等。另外，在人中，轻链可以是κ链或λ链。
术语“Fab”是指由完整L链(VL和CL)以及H链的可变区结构域(VH)和一条重链的第一恒定结构域(CH1)构成的抗体片段。完整抗体的木瓜蛋白酶消化可用于产生两个Fab片段，每个片段含有单个抗原结合位点。通常，木瓜蛋白酶消化产生的Fab的L链和H链片段通过链间二硫键连接。
术语“Fc”是指包含通过二硫键保持在一起的两条H链(CH2和CH3)的羧基末端部分和铰链区的一部分的抗体片段。抗体的效应功能由Fc区中的序列确定；该区也是由某些类型细胞上存在的Fc受体(FcR)识别的部分。一个Fc片段可以通过完整抗体的木瓜蛋白酶消化获得。
术语“F(ab')2”是指通过完整抗体的胃蛋白酶消化产生的抗体片段。F(ab')2片段含有通过二硫键保持在一起的两个Fab片段和铰链区的一部分。F(ab')2片段具有二价抗原结合活性，并且能够交联抗原。
术语Fab'是指作为F(ab')2片段的还原产物的抗体片段。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在CH1域的羧基末端具有几个另外的残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。Fab'-SH是本文对其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基携带游离硫醇基团的Fab'的称谓。
术语“Fv”是指由一个重链可变区和一个轻链可变区域紧密、非共价缔合形成的二聚体构成的抗体片段。由这两个结构域的折叠产生六个高变环(3个环各自来自H链和L链)，这六个高变环贡献用于抗原结合的氨基酸残基，并将抗原结合特异性赋予抗体。然而，即使单个可变结构域(或仅包含对抗原具有特异性的三个CDR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管通常其亲和力小于整个结合位点。
术语“单链Fv”也缩写为“sFv”或“scFv”，是指包含连接成单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。通常，scFv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，所述接头使scFv能够形成抗原结合的所需结构。关于scFv的综述，参见例如Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)；和Malmborg等人,J.Immunol.Methods 183:7-13,1995。
表述“线性抗体”用于指包含一对串联VH-CH1区段(VH-CH1-VH-CH1)的多肽，所述区段形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的，并且例如由Zapata等人,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995)描述。
术语“可变”是指以下事实，可变结构域的某些部分的序列在抗体之间广泛不同，并且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，变异性不均匀地分布于整个抗体的可变结构域。它集中在位于轻链和重链可变结构域中的三个称为高变区的区段。可变结构域的更加高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR，主要采用β-折叠构型，所述FR通过三个高变区连接，形成连接β-折叠结构并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分的环。每条链中的高变区通过FR紧密靠近在一起，并与来自另一条链的高变区一起，促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.)。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出多种效应功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
术语“抗原结合位点”或“结合部分”是指参与抗原结合的免疫球蛋白分子的一部分。抗原结合位点由重(“H”)链和轻(“L”)链的N-末端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。重链和轻链的V区内的三条高度差异链称为“高变区”，它们插入称为“框架区”或“FR”的更保守的侧接链之间。因此，术语“FR”是指天然存在于免疫球蛋白中的高变区之间并且与其邻近的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中彼此相对布置，形成抗原结合表面。抗原结合表面与结合抗原的三维表面互补，并且每条重链和轻链的三个高变区称为“互补决定区”或“CDR”。每个结构域的氨基酸分配根据KabatSequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1987和1991))，或Chothia&Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987),Chothia等人Nature 342:878-883(1989)的定义进行。
术语“高变区”、“HVR”或“HV”是指在序列上是高变的和/或形成结构限定的环的抗体可变结构域的区域。通常，抗体包含六个HVR；VH中有三个(H1、H2、H3)，并且VL中有三个(L1、L2、L3)。在天然抗体中，H3和L3显示出这六个HVR最具多样性，并且据信H3特别在赋予抗体精细特异性方面发挥了独特的作用。参见例如Xu等人,Immunity 13:37-45(2000)；Johnson和Wu,载于Methods in Molecular Biology 248:1-25(Lo编,Human Press,Totowa,N.J.,2003)。实际上，仅由重链构成的天然存在的骆驼科动物抗体在不存在轻链的情况下具有功能并且是稳定的。参见例如Hamers-Casterman等人,Nature 363:446-448(1993)；Sheriff等人,Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。
“框架区”(FR)是除CDR残基之外的那些可变结构域残基。每个可变结构域通常具有四个FR，称为FR1、FR2、FR3和FR4。如果根据Kabat定义CDR，轻链FR残基位于约残基1-23(LCFR1)、35-49(LCFR2)、57-88(LCFR3)和98-107(LCFR4)，并且重链FR残基在重链残基中位于约残基1-30(HCFR1)、36-49(HCFR2)、66-94(HCFR3)和103-113(HCFR4)。如果CDR包含来自高变环的氨基酸残基，轻链FR残基在轻链中位于约残基1-25(LCFR1)、33-49(LCFR2)、53-90(LCFR3)和97-107(LCFR4)，并且重链FR残基在重链残基中位于约残基1-25(HCFR1)、33-52(HCFR2)、56-95(HCFR3)和102-113(HCFR4)。在一些情况下，当CDR包含来自Kabat定义的CDR和高变环的那些氨基酸时，将相应地调整FR残基。例如，当CDRH1包括氨基酸H26-H35时，重链FR1残基处于位置1-25，FR2残基处于位置36-49。
“人共有区框架”是在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中代表最常见的氨基酸残基的框架。一般来讲，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的亚组。一般来讲，序列的亚组是Kabat所述的亚组。在某些情况下，对于VL，亚组是Kabat所述的亚组κI。在某些情况下，对于VH，亚组是Kabat所述的亚组III。
如本文所用，“Kd”或“Kd值”是指通过使用表面等离子共振测定而测量的解离常数，该分析例如使用BIAcore.TM.-2000或BIAcore.TM.-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,N.J.)，在25℃下，通过固定有抗原或抗体的CM5芯片以约10个反应单位(RU)进行。对于二价或其它多价抗体，通常抗体是固定化的，以避免解离常数测量伴随的亲和力诱导的干扰。关于更多细节，参见例如Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。
术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的任何蛋白决定簇、脂质或碳水化合物决定簇。表位决定簇通常由分子(诸如氨基酸、脂质或糖侧链)的活性表面基团构成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。当平衡解离常数(KD)在10-6-10-12M范围内时，抗体被认为特异性结合抗原。“活化表位”能够在结合时活化特定γδT细胞群。
当两种抗体识别相同的或空间上重叠的表位时，抗体与参考抗体结合“基本上相同的表位”。用于确定两个表位是否结合相同的或空间上重叠的表位的最广泛使用和快速的方法是竞争测定，它可以使用标记的抗原或标记的抗体以多种不同形式配置。在一些实施方案中，将抗原固定在96孔板上，并使用放射性或酶标记测量未标记的抗体阻断标记的抗体的结合的能力。或者，使用标记的和未标记的抗体的竞争研究在表达抗原的细胞上使用流式细胞术进行。
“表位作图”是鉴定抗体对其靶抗原的结合位点或表位的过程。抗体表位可以是线性表位或构象表位。线性表位由蛋白质中连续的氨基酸序列形成。构象表位由蛋白质序列中不连续，但在蛋白质折叠为其三维结构时聚集在一起的氨基酸形成。
如本文所定义，“表位鉴定(Epitope binning)”是基于抗体识别的表位对其进行分组的过程。更具体地讲，表位鉴定包括用于区分不同抗体的表位识别性质的方法和系统，连同基于抗体的表位识别性质对其进行聚类并鉴定具有不同结合特异性的抗体的计算过程。
根据本发明的“药剂”或“化合物”包括小分子、多肽、蛋白质、抗体或抗体片段。在本发明的语境中，小分子在一个实施方案中意指分子量小于1000道尔顿，特别地小于800道尔顿，更特别地小于500道尔顿的化学品。术语“治疗剂”是指具有生物学活性的药剂。术语“抗癌剂”是指具有对癌细胞的生物学活性的药剂。
如本文所用，术语“细胞培养物”是指细胞的任何体外培养物。该术语包括连续细胞系(例如，具有永生表型)、原代细胞培养物、有限细胞系(例如，非转化细胞)以及体外维持的任何其它细胞群，包括干细胞、血液细胞、胚胎脐带血细胞、肿瘤细胞、转导细胞等。
术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”是指治疗性处理和预防性或防治性措施，其中目的是预防或减缓(减轻)不期望的生理变化或病状。有益的或期望的临床结果包括但不限于可检测的或不可检测的症状的减轻、疾病程度的降低(例如，肿瘤大小、肿瘤负荷，或肿瘤分布的减少)、疾病的稳定(即，不恶化)状态、疾病进展的推迟或减缓、疾病状态的改善或缓和、以及缓解(部分或完全)。“治疗”也可意指与未接受治疗的预期存活期相比延长的存活期。需要治疗的人包括已患有病症或病状的人以及容易患上病症或病状的人或其中病症或病状将得到预防的人。
与一种或多种另外的治疗剂“组合”施用包括同时(共同)和以任何顺序连续施用。
如本文所用，术语“相同的”是指相同的两个或多个序列或子序列。此外，如本文所用，术语“基本上相同的”是指当在比较窗口上，或使用比较算法或通过手动比对和目视检查所测定的指定区域上比较和比对以获得最大对应性时具有相同的序列单元的百分比的两个或多个序列。仅举例来说，如果序列单元在指定区域上约60％相同、约65％相同、约70％相同、约75％相同、约80％相同、约85％相同、约90％相同的，或约95％相同，则两个或多个序列可以是“基本上相同的”。这种百分比描述两个或多个序列的“同一性百分比”。序列的同一性可以在长度为至少约75-100个序列单元的区域上，在长度为约50个序列单元的区域上，或在未指定的情况下，在整个序列上存在。该定义也涉及测试序列的互补序列。此外，仅举例来说，当核酸残基相同时，两个或多个多核苷酸序列是相同的，而如果核酸残基在指定区域上约60％相同、约65％相同、约70％相同、约75％相同、约80％相同、约85％相同、约90％相同或约95％相同，则两个或多个多核苷酸序列是“基本上相同的”。同一性可以存在于长度为至少约75至约100个核酸的区域上，长度为约50个核酸的区域上，或在不指定的情况下，在多核苷酸序列的整个序列上。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指不消除化合物的生物学活性或性质的物质(包括但不限于盐、载剂或稀释剂)，并且是相对无毒的，即该物质可以施用于个体而不导致不期望的生物学效应或以有害的方式与纳入其的组合物的任何组分相互作用。
如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指脊椎动物。在某些实施方案中，脊椎动物是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人、非人灵长类动物、农场动物(诸如奶牛)、运动动物和宠物(诸如猫、狗和马)。在某些实施方案中，哺乳动物是人。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指含有本发明的扩增的细胞群和/或掺和物的组合物的量，所述组合物的量施用于已患有疾病、病症或病状的受试者(例如人患者)，足以治愈或至少部分阻止，或在一定程度上缓解待治疗的疾病、病状或病症的一种或多种症状。此类组合物的有效性取决于多个条件，包括但不限于疾病、病状或病症的严重性和进程、先前疗法、患者的健康状况和对药物的响应、以及主治医生的判断。仅举例来说，治疗有效量可以通过常规实验，包括但不限于剂量递增临床试验来确定。
术语抗原呈递细胞(APC)是指野生型APC，或工程改造的或人工抗原呈递细胞(aAPC)。APC可以以经辐射的APC群体提供。APC可以从永生化细胞系(例如，K562或来源于永生化细胞系的工程改造的aAPC)或作为来自供体的细胞(例如，PBMC)的一部分提供。
如本文所用，关于蛋白质或其多肽片段或表位的术语“结构上不同的”和“结构上各异的”是指至少两种不同蛋白质、其多肽片段或表位之间的共价(即，结构)差异。例如，两种结构上不同的蛋白质(例如，抗体)可以指具有不同的一级氨基酸序列的两种蛋白质。在一些情况下，结构上不同的活化剂结合结构上不同的表位，诸如具有不同的一级氨基酸序列的表位。
如本文所用，与指定的受体活性(例如，NKp30活性、NKp44活性和/或NKp46活性)“无关”的术语“抗肿瘤细胞毒性”是指无论指定的受体或指定的受体组合是否由细胞表达或具有功能性而表现出的抗肿瘤细胞毒性。因此，表现出与NKp30活性、NKp44活性和/或NKp46活性无关的抗肿瘤细胞毒性的γδT细胞也可表现出NKp30活性依赖性抗肿瘤细胞毒性、NKp44活性依赖性抗肿瘤细胞毒性和/或NKp46活性依赖性抗肿瘤细胞毒性。
如本文所用，术语“NKp30活性依赖性抗肿瘤细胞毒性”、“NKp44活性依赖性抗肿瘤细胞毒性”和“NKp46活性依赖性抗肿瘤细胞毒性”是指需要指定受体的功能性表达的抗肿瘤细胞毒性。这种受体依赖性抗肿瘤细胞毒性的存在或不存在可以通过执行标准体外细胞毒性分析来确定，诸如在实施例48中存在或不存在指定受体的拮抗剂的情况下执行。例如，NKp30活性依赖性抗肿瘤细胞毒性的存在或不存在可以通过将在存在抗NKp30拮抗剂的情况下如实施例48所述的体外细胞毒性测定的结果与在不存在抗NKp30拮抗剂的情况下获得的结果进行比较来确定。
如本文所用，包含抗肿瘤细胞毒性的γδT细胞群(其中至少指定“％”的抗肿瘤细胞毒性与指定的受体活性(例如，NKp30活性、NKp44活性和/或NKp46活性)“无关”)是指其中阻断指定受体减少测定的抗肿瘤细胞毒性不超过一定数值％的细胞。因此，与在不存在NKp30拮抗剂的情况下相比，在存在NKp30拮抗剂的情况下包含抗肿瘤细胞毒性的γδT细胞群(其中至少50％的抗肿瘤细胞毒性与NKp30活性无关)将表现出体外抗肿瘤细胞毒性减少50％或更少。
概述
在人中，γδT细胞是提供先天性和过继性免疫应答之间的联系的T细胞亚群。这些细胞经历V-(D)-J区段重排以生成抗原特异性γδT细胞受体(γδTCR)和γδT细胞，并且可以通过γδTCR或其它单独或共同发挥作用的非TCR蛋白进行的抗原识别来直接活化，以活化γδT细胞效应功能。γδT细胞在哺乳动物中占总T细胞群的一小部分，在外周血和淋巴器官中占T细胞的大约1-5％，并且它们似乎主要存在于富含上皮细胞的区室中，如皮肤、肝、消化道、呼吸道和生殖道。与αβTCR识别结合主要组织相容性复合物分子(MHC)的抗原不同的是，γδTCR可以直接识别完整蛋白质或非肽化合物形式的细菌抗原、病毒抗原、患病细胞表达的应激抗原和肿瘤抗原。
TS-1、TS8.2、B6和15D可以活化γδT细胞。不受理论的束缚，来源于不同供体的培养物的不同水平的活化和扩增可以是由于供体γδ可变TCR库和抗体结合表位的特异性。据发现，并非每种结合特定γδT细胞亚群的药剂都能够活化特定γδT细胞，特别是活化特定γδT细胞群达到临床相关水平，即在富集的培养物中>108个目标γδT细胞。类似地，并非γδT细胞群的每个结合表位都是活化表位，即在结合时能够活化特定γδT细胞群。
本发明的发明人已鉴定与特定γδT细胞亚型的有效活化相关的特定γδ可变TCR结合区，从而能够特异性活化γδT细胞亚型，产生可施用于患者的纯度提高的临床相关水平的高度富集的γδT细胞群及其掺和物。本文还考虑和进一步描述了特异性结合能够诱导γδT细胞亚型的增强活化和扩增的活化表位的新型活化配体(包括抗体)。
在一些情况下，可以使用相对较小体积的培养基实现使用本发明的方法产生临床相关水平(即，>108)的γδT细胞。例如，在一些实施方案中，可以在大约25L；20L；10L；5L；3L；2L；1,5000mL；1,000mL；500mL；200mL；150mL；100mL或更少(例如，约10mL至约100mL、约100mL至约500mL、约500mL至约5,000mL或约5L至约25L)的最终培养物体积中从细胞群(例如，分离的混合细胞群)的扩增获得临床相关水平的γδT细胞。又如，在一些实施方案中，临床相关水平的γδT细胞可以在条件下获得，所述条件使得用于扩增从供体或多个供体获得的分离的混合细胞群的培养基的总体积小于约50L、25L、20L、10L、5L、1L或750mL(例如，约750mL至小于约50L、约100mL至约750mL、约750mL至约5L、约1L至约10L、约10L至约50L或约10L至约25L)。
本文描述了直接从分离的混合细胞群选择性活化和扩增γδT细胞亚型的方法，例如不需要预先剔除非目标细胞类型，提供临床相关水平的具有细胞毒性性质的富集的γδT细胞群。还描述了特定γδ细胞群的活化γδ可变TCR表位。本发明还提供用包含本发明的富集的γδT细胞群的组合物的治疗方法。
本文描述了产生或提供临床相关水平(>108)的工程改造的或非工程改造的γδT细胞，包括γδT细胞的一种或多种特定亚群的方法。此类方法可用于从单个供体，包括从单个供体的单个样品产生这种临床相关水平。此外，此类方法可用于产生显著大于108个工程改造的或非工程改造的γδT细胞。例如，在一些实施方案中，约或至少约109、1010、1011或1012个工程改造的或非工程改造的γδT细胞(包括γδT细胞的一种或多种特定亚群)可以在本文所述的方法中产生。在一些情况下，这种群体大小可以在仅19-30天内和/或使用总体积小于约1L的培养基实现。
γδT细胞的分离
在一些方面，本发明提供用于扩增工程改造的或非工程改造的γδT细胞的离体方法。在一些情况下，所述方法利用不包括有利于扩增特定γδT细胞群的细胞因子(诸如IL-4、IL-2或IL-15或它们的组合)的一个或多个(例如，第一和/或第二)扩增步骤。在一些实施方案中，本发明提供用于从分离的混合细胞群产生富集的γδT细胞群的离体方法，所述方法包括使混合细胞群与一种或多种药剂接触，所述一种或多种药剂通过分别结合至δ1TCR；δ1和δ4 TCR；或δ1、δ3、δ4和δ5 TCR的特异性的表位来选择性扩增δ1 T细胞；δ1 T细胞和δ3 T细胞；δ1 T细胞和δ4 T细胞；或δ1、δ3、δ4和δ5 T细胞，以提供富集的γδT细胞群。在其它方面，本发明提供用于从分离的混合细胞群产生富集的γδT细胞群的离体方法，所述方法包括使混合细胞群与一种或多种药剂接触，所述一种或多种药剂通过结合至δ2 TCR的特异性的表位来选择性扩增δ2 T细胞，以提供富集的γδT细胞群。
在其它方面，本公开内容提供用于对已从受试者分离的γδT细胞进行基因工程改造的方法。富集、活化、扩增或基因工程改造的方法可以单独或以任何顺序组合进行。在一个实施方案中，可以分离、基因工程改造，然后活化和扩增γδT细胞。在一个优选的实施方案中，可以分离、活化和扩增，然后任选地基因工程改造γδT细胞。在一些实施方案中，此类活化和扩增、然后基因工程改造的γδT细胞可以进一步活化和/或扩增。
例如，非工程改造的γδT细胞群可以从受试者的复合样品扩增。复合样品可以是外周血样品(例如，PBL或PBMC)、白细胞单采样品、脐带血样品、肿瘤、干细胞前体、肿瘤活检样品、组织、淋巴，或来自直接接触外部环境的受试者的上皮部位，或来源于前体干细胞。在一些情况下，本公开内容提供用于选择性扩增Vδ1+细胞、Vδ2+细胞、Vδ1+细胞和Vδ3+细胞、Vδ1+细胞和Vδ4+细胞、Vδ1+细胞、Vδ3+细胞、Vδ4+细胞和Vδ5+细胞或它们的任何组合的方法。
外周血单核细胞可以例如使用血液成分分离机(apheresis machine)(包括Ficoll-PaqueTMPLUS(GE Healthcare)系统，或另一种合适的装置/系统)从受试者收集。γδT细胞，或所需的γδT细胞子群，可以使用例如流式细胞技术从收集样品纯化。脐带血细胞也可以在受试者出生时从脐带血获得。参见WO 2016/081518，该专利全文以引用的方式并入本文用于所有目的，包括但不限于用于PBMC分离、γδT细胞活化以及制备和使用γδT细胞活化剂的方法和组合物。
例如在第一富集步骤中，γδT细胞可以从体外培养的分离的复合样品或混合细胞群扩增，所述扩增通过使混合细胞群与一种或多种药剂接触来进行，所述一种或多种药剂通过特异性结合至γδTCR的表位来扩增γδT细胞，以提供富集的γδT细胞群。在一些实施方案中，可以活化和扩增包含在整个PBMC群体中的γδT细胞，不需要预先剔除一种或多种特定细胞群(诸如以下非γδT细胞单核细胞中的一种或多种或全部：αβT细胞、B细胞和NK细胞)，以得到富集的γδT细胞群。在一些方面，γδT细胞的活化和扩增在不存在天然或工程改造的APC的情况下进行。在一些方面，从肿瘤样本分离和扩增γδT细胞可以使用固定化γδT细胞丝裂原进行，包括对γδTCR的活化表位具有特异性的抗体，以及结合本文提供的γδTCR的活化表位的其它活化剂(包括凝集素)。
在某些实施方案中，使分离的混合细胞群与扩增γδT细胞的一种或多种药剂接触约或至少约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约17天、约19天、约21天、约25天、约29天、约30天或其中的任何范围。例如，使分离的混合细胞群与扩增γδT细胞的一种或多种药剂接触约1至约4天、约2至约4天、约2至约5天、约3至约5天、约5至约21天、约5至约19天、约5至约15天、约5至约10天或约5至约7天，以提供第一富集的γδT细胞群。又如，使分离的混合细胞群与扩增γδT细胞的一种或多种药剂接触约7至约21天、约7至约19天、约7至约23天或约7至约15天，以提供第一富集的γδT细胞群。
在一些情况下，纯化或分离步骤在第一扩增步骤和第二扩增步骤之间进行。在一些情况下，分离步骤包括除去一种或多种活化剂。在一些情况下，分离步骤包括特异性分离γδT细胞或其亚型。在一些情况下，在第一扩增步骤和第二扩增步骤之间除去一种或多种(例如，所有)活化剂(例如，不是细胞培养基的常见组分，诸如血清组分和/或IL-2的所有活化剂))，但γδT细胞不从其它细胞类型(αβT细胞)特异性分离。
在一些实施方案中，在第一富集步骤和任选地第二富集步骤中，在使用结合γδTCR的活化表位的活化剂活化和扩增γδT细胞之后，例如在第二、第三、第四、第五等富集步骤中，还可以使用本领域已知的技术富集或纯化本发明的第一富集的γδT细胞群，以获得第二或另外富集的γδT细胞群。例如，可以剔除例如第一富集的γδT细胞群的αβT细胞、B细胞和NK细胞。正向和/或负向选择在收集的γδT细胞上表达的细胞表面标志物可以用于从例如第一富集的γδT细胞群直接分离表达相似的细胞表面标志物的γδT细胞或γδT细胞群。例如，可以根据标志物(诸如CD2、CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD44、Kit、TCRα、TCRβ、TCRγ(包括一种或多种TCRγ亚型)、TCRδ(包括一种或多种TCRδ亚型)、NKG2D、CD70、CD27、CD28、CD30、CD16、OX40、CD46、CD161、CCR7、CCR4、NKp30、NKp44、NKp46、DNAM-1、CD242、JAML、以及其它合适的细胞表面标志物)的阳性或阴性表达从富集的γδT细胞群分离γδT细胞(例如，在第一扩增步骤和/或第二扩增步骤之后)。
在一些实施方案中，在第一扩增步骤之后(例如，在第一扩增步骤之后进行的分离步骤之后)，在第二扩增步骤中，任选地稀释和培养扩增的细胞。在优选的实施方案中，第二扩增步骤在其中在第二扩增步骤中约每1-2天、1-3天、1-4天、1-5天、2-5天、2-4天或2-3天补充培养基的条件下进行。在一些实施方案中，第二扩增步骤在其中细胞稀释或调整至支持γδT细胞进一步扩增1次、2次、3次、4次、5次、6次或更多次的密度的条件下进行。在一些情况下，细胞密度调整与补充培养基同时进行(即，在同一天，或在相同的时间)。例如，在第二扩增步骤中细胞密度可以每1-2天、1-3天、1-4天、1-5天、2-5天、2-4天或2-3天调整。支持γδT细胞进一步扩增的典型细胞密度包括但不限于约1x105、2x105、3x105、4x105、5x105、6x105、7x105、8x105、9x105、1x106、2x106、3x106、4x106、5x106个细胞/mL、10x106个细胞/mL、15x106个细胞/mL、20x106个细胞/mL或30x106个细胞/mL培养物。
在一些实施方案中，细胞密度调整至约0.5x106至约1x106个细胞/mL、约0.5x106至约1.5x106个细胞/mL、约0.5x106至约2x106个细胞/mL、约0.75x106至约1x106个细胞/mL、约0.75x106至约1.5x106个细胞/mL、约0.75x106至约2x106个细胞/mL、约1x106至约2x106个细胞/mL，或约1x106至约1.5x106个细胞/mL、约1x106至约2x106个细胞/mL、约1x106至约3x106个细胞/mL、约1x106至约4x106个细胞/mL、约1x106至约5x106个细胞/mL、约1x106至约10x106个细胞/mL、约1x106至约15x106个细胞/mL、约1x106至约20x106个细胞/mL或约1x106至约30x106个细胞/mL的密度。
在一些实施方案中，第二扩增步骤在其中监测细胞并维持细胞在预定的细胞密度(或密度区间)和/或维持细胞在具有预定葡萄糖含量的培养基中的条件下进行。例如，细胞可以维持在约0.5x106至约1x106个细胞/mL、约0.5x106至约1.5x106个细胞/mL、约0.5x106至约2x106个细胞/mL、约0.75x106至约1x106个细胞/mL、约0.75x106至约1.5x106个细胞/mL、约0.75x106至约2x106个细胞/mL、约1x106至约2x106个细胞/mL或约1x106至约1.5x106个细胞/mL、约1x106至约3x106个细胞/mL、约1x106至约4x106个细胞/mL、约1x106至约5x106个细胞/mL、约1x106至约10x106个细胞/mL、约1x106至约15x106个细胞/mL、约1x106至约20x106个细胞/mL、约1x106至约30x106个细胞/mL的活细胞密度下。
在一些情况下，对于扩增的至少一部分，细胞可以维持在高浓度下。例如，对于第一扩增或第二扩增的第一部分，在高细胞浓度下细胞活力可以增加。又如，对于第一扩增或第二扩增的最后部分，可以在高细胞浓度下最有效地利用培养物体积。因此，在一些实施方案中，对于第一扩增培养物或第二扩增培养物的至少一部分或全部第一扩增培养物或第二扩增培养物，细胞可以维持在约1x106个细胞/mL至约20x106个细胞/mL的活细胞密度下。
又如，细胞可以维持在具有约0.5g/L至约1g/L、约0.5g/L至约1.5g/L、约0.5g/L至约2g/L、约0.75g/L至约1g/L、约0.75g/L至约1.5g/L、约0.75g/L至约2g/L、约1g/L至约1.5g/L、约1g/L至约2g/L、1g/L至3g/L或1g/L至4g/L的葡萄糖含量的培养基中。在一些实施方案中，细胞可以维持在具有约1.25g/L的葡萄糖含量的培养基中。在一些情况下，诸如维持高细胞密度培养物时，细胞可以维持在具有约1g/L至约5g/L、约1g/L至约4g/L、约2g/L至约5g/L或约2g/L至约4g/L的葡萄糖含量的培养基中。
通常通过将新鲜含血清或无血清培养基加入培养物来维持葡萄糖含量。在一些实施方案中，例如通过监测每个参数和添加新鲜培养基，以维持参数在预定限度内，可以将细胞维持在预定的活细胞密度区间和具有预定的葡萄糖含量区间的培养基中。在一些实施方案中，通过在培养物中添加新鲜含血清或无血清培养基，同时除去灌注生物反应器中废培养基，保留细胞在里面来维持葡萄糖含量。在一些实施方案中，在γδT细胞扩增(例如，选择性γδT细胞扩增)期间或在本文所述的第一γδT细胞扩增或第二γδT细胞扩增(例如，选择性γδT细胞扩增)步骤期间监测和/或维持另外的参数(包括但限于以下一者或多者：pH、O2分压、O2饱和度、CO2分压、CO2饱和度、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸、铵、钠、钾和钙)。
例如在第一富集步骤中，可以通过使混合细胞群与一种或多种药剂接触从体外培养的分离的复合样品或混合细胞群选择性扩增γδT细胞亚型，所述一种或多种药剂：
i)通过特异性结合至δ1 TCR的表位来选择性扩增δ1 T细胞，
ii)通过特异性结合至δ2 TCR的表位来选择性扩增δ2 T细胞，
iii)通过特异性结合至δ1和δ4 TCR的表位来选择性扩增δ1和δ4T细胞；或
iv)通过特异性结合至δ1、δ3、δ4和δ5 TCR的表位来选择性扩增δ1、δ3、δ4和δ5 T细胞，
以提供富集的γδT细胞群。在一些情况下，一种或多种药剂特异性结合至δ1J1、δ1J2或δ1J3 TCR或它们中的二者或它们的全部。在一些实施方案中，可以活化和扩增整个PBMC群体中的γδ细胞，不需要预先剔除特定细胞群(诸如单核细胞、αβT细胞、B细胞和NK细胞)，得到富集的γδT细胞群。在一些方面，γδT细胞的活化和扩增在不存在天然或工程改造的APC的情况下进行。在一些方面，从肿瘤样本分离和扩增γδT细胞可以使用固定化γδT细胞丝裂原进行，包括对δ1 TCR；δ1、δ3、δ4和δ5 TCR、δ1和δ4 TCR；或δ2 TCR的特异性的活化表位特异性的抗体，以及结合本文提供的δ1 TCR；δ1、δ3、δ4和δ5 TCR；δ1和δ4 TCR；或δ2TCR的特异性的活化表位的其它活化剂(包括凝集素)。
在某些实施方案中，使分离的混合细胞群与选择性扩增δ1、δ1和δ4、δ2，或δ1和δ2T细胞的一种或多种药剂接触约5天、6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天或其中的任何范围。例如，使分离的混合细胞群与选择性扩增δ1或δ2T细胞的一种或多种药剂接触约1至约3天、约1至约4天、约1至约5天、约2至约3天、约2至约4天、约2至约5天、约3至约4天、约3至约5天、约4至约5天、约5至约15天，或约5至约7天，以提供第一富集的γδT细胞群。在一些实施方案中，在本文所述的第二扩增步骤中进一步扩增选择性扩增的δ1、δ1和δ3、δ1和δ4、δ2或δ1和δ2 T细胞。
在某些实施方案中，起始分离的混合细胞群，例如外周血样品包含在约20-80％范围内的T淋巴细胞。在某些实施方案中，在本发明的富集的γδT细胞群中残留的αβT细胞和NK细胞的百分比分别为约或小于约2.5％和1％。在某些实施方案中，在本发明的富集的γδT细胞群中残留的αβT细胞或NK细胞的百分比为约或小于约1％、0.5％、0.4％、0.2％、0.1％或0.01％。在某些实施方案中，在本发明的富集的γδT细胞群中残留的αβT细胞的百分比为约或小于约0.4％、0.2％、0.1％或0.01％(例如，在正向选择γδT细胞或其亚型的步骤之后或在剔除αβT细胞之后)。在一些实施方案中，在第一γδT细胞扩增和/或第二γδT细胞扩增之前或之后，剔除αβT细胞，但不剔除NK细胞。在某些方面，分离的混合细胞群来源于单个供体。在其它方面，分离的混合细胞群来源于多于一个供体或多个供体(例如，2个、3个、4个、5个，或2-5个、2-10个或5-10个供体，或更多个)。
因此，在一些实施方案中，本发明的方法可以从仅一个供体提供一定临床相关数目(>108个、>109个、>1010个、>1011个或>1012个或约108个至约1012个)的扩增的γδT细胞。在一些情况下，本发明的方法可以从获得供体样品时的小于19天或21天内提供一定临床相关数目(>108个、>109个、>1010个、>1011个或>1012个或约108个至约1012个)的扩增的γδT细胞。
在第一富集步骤中，使用结合至δ1、δ1和δ3 TCR、δ1和δ4 TCR或δ2 TCR的特异性的活化表位的活化剂特异性活化和扩增特定γδT细胞亚群后，在第二、第三、第四、第五等富集步骤中，还可以使用本领域已知的技术富集或纯化本发明的第一富集的γδT细胞群，以获得第二或另外富集的γδT细胞群。例如，第一富集的γδT细胞群可以剔除αβT细胞、B细胞和NK细胞。正向和/或负向选择在收集的γδT细胞上表达的细胞表面标志物可以用于从第一富集的γδT细胞群直接分离表达相似的细胞表面标志物的γδT细胞或γδT细胞群。例如，可以根据标志物(诸如CD2、CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD44、Kit、TCRα、TCRβ、TCRγ(或其一种或多种亚型)、TCRδ(或其一种或多种亚型)、NKG2D、CD70、CD27、CD28、CD30、CD16、OX40、CD46、CD161、CCR7、CCR4、DNAM-1、JAML、以及其它合适的细胞表面标志物)的阳性或阴性表达从第一富集的γδT细胞群分离γδT细胞。
在一些实施方案中，在本发明的第一γδT细胞扩增、第一富集步骤、第二γδT细胞扩增和/或第二富集步骤之后，例如在小于10mL、25mL、50mL、100mL、150mL、200mL、500mL、750mL、1L、2L、3L、4L、5L、10L、20L，或25L的培养物体积中，富集的γδT细胞群包含>108个细胞的临床相关水平的γδT细胞亚群。例如，本发明的方法可以在具有10-100mL；25-100mL；50-100mL；75-100mL；10-150mL；25-150mL；50-150mL；75-150mL；100-150mL；10-200mL；25-200mL；50-200mL；75-200mL、100-200mL；10-250mL；25-250mL；50-250mL；75-250mL、100-250mL；150-250mL；5-1,000mL；10-1,000mL或100-1,000mL；150-1,000mL；200-1,000mL；250-1,000mL、400mL至1L、1L至2L、2L至5L、2L至10L、4L至10L、4L至15L、4L至20L或4L至25L的体积的扩增培养物中提供>108个细胞的临床相关水平的γδT细胞亚群。在其它实施方案中，在本发明的第二、第三、第四、第五等富集步骤之后，富集的γδT细胞群包含>108个的临床相关水平的γδT细胞亚群。
在一些实施方案中，γδT细胞可以响应于与一种或多种抗原的接触而快速扩增。在组织培养期间，一些γδT细胞，诸如Vγ9Vδ2+γδT细胞在体外响应于与一些抗原，如焦磷酸异戊二烯酯、烷基胺和代谢物或微生物提取物的接触而快速扩增。此外，一些野生型γδT细胞，诸如Vγ2Vδ2+γδT细胞在人体中响应于某些类型的接种而在体内快速扩增。受刺激的γδT细胞可以表现出可促进从复合样品分离γδT细胞的许多抗原呈递、共刺激和粘附分子。复合样品中的γδT细胞可以使用至少一种抗原体外刺激1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、约5-15天、5-10天或5-7天或另外合适的时期，例如在扩增之前或之后，与本文所述的选择性γδT细胞扩增药剂(诸如抗体或固定化抗体)组合。使用合适的抗原刺激γδT细胞可以体外扩增γδT细胞群。
可用于刺激从复合样品体外扩增γδT细胞的抗原的非限制性实例包括焦磷酸异戊二烯酯，诸如焦磷酸异戊烯酯(IPP)、烷基胺、人微生物病原体的代谢物、共生细菌的代谢物、-甲基-3-丁烯基-1-焦磷酸(2M3B1PP)、(E)焦磷酸-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯酯(HMB-PP)、焦磷酸乙酯(EPP)、焦磷酸法尼酯(FPP)、磷酸二甲基烯丙酯(DMAP)、焦磷酸二甲基烯丙酯(DMAPP)、乙基腺苷三磷酸(EPPPA)、焦磷酸香叶酯(GPP)、焦磷酸香叶基香叶酯(GGPP)、异戊烯基腺苷三磷酸(IPPPA)、磷酸单乙酯(MEP)、焦磷酸单乙酯(MEPP)、焦磷酸3-甲酰基-1-丁酯(TUBAg 1)、X-焦磷酸(TUBAg 2)、3-甲酰基-1-丁基-尿苷三磷酸(TUBAg 3)、3-甲酰基-1-丁基-脱氧胸苷三磷酸(TUBAg 4)、单乙基烷基胺、焦磷酸烯丙酯、焦磷酸巴豆酯、二甲基烯丙基-γ-尿苷三磷酸、巴豆基-γ-尿苷三磷酸、烯丙基-γ-尿苷三磷酸、乙胺、异丁胺、仲丁胺、异戊胺和含氮双膦酸盐。
γδT细胞的活化和扩增可以使用本文所述的活化和共刺激剂触发特定γδT细胞增殖和持续群体来进行。在一些实施方案中，从不同的培养物活化和扩增γδT细胞可以实现不同的克隆或混合多克隆群体亚群。在一些实施方案中，不同的激动剂可用于鉴定提供特定γδ活化信号的药剂。在一个方面，提供特定γδ活化信号的药剂可以是针对γδTCR的不同单克隆抗体(MAb)。
在一个方面，MAb可以结合γTCR和/或δTCR的恒定区或可变区上的不同表位。在一个方面，MAb可以包括γδTCR泛MAb。在一个方面，γδTCR泛MAb可以识别γ链或δ链或它们二者(包括δ1和δ2细胞群)上不同γ和δTCR共有的结构域。在一个方面，抗体可以是5A6.E9(Thermo scientific)、B1(Biolegend)、IMMU510和/或11F2(11F2)(Beckman Coulter)。在一个方面，MAb可以针对γ链的可变区独有的特定结构域(7A5 Mab，针对如Vγ9 TCR(Thermo Scientific#TCR1720))，或Vδ1可变区上的结构域(Mab TS8.2(Thermoscientific#TCR1730；MAb TS-1(ThermoFisher#TCR 1055)、MAb R9.12(Beckman Coulter#IM1761))，或Vδ2链(MAb15D(Thermo Scientific#TCR1732或Life technologies#TCR2732)B6(Biolegend#331402)，δ1-#抗体之一描述于图33-34中，或δ2-#抗体之一描述于图35-36中。
在一些实施方案中，可以组合针对γδTCR的不同结构域的抗体(识别亚群上的特定可变区表位的泛抗体和抗体)，以评估它们增强γδT细胞的活化的能力。在一些实施方案中，γδT细胞活化剂可包括结合γδTCR的药剂，诸如MICA、NKG2D的激动剂抗体，例如MICA、ULBP1或ULBP3的Fc标签融合蛋白(R&D systems Minneapolis,MN)ULBP2或ULBP6(SinoBiological Beijing,China)。在一些实施方案中，可鉴定伴随共刺激剂，以帮助触发特定γδT细胞增殖，而不诱导细胞反应性失效和细胞凋亡。这些共刺激剂可包括在γδ细胞上表达的受体的配体，诸如以下一者或多者的配体：NKG2D、CD161、CD70、JAML、DNAX、CD81辅助分子-1(DNAM-1)ICOS、CD27、CD196、CD137、CD30、HVEM、SLAM、CD122、DAP和CD28。在一些方面，共刺激剂可以是对CD2和CD3分子上的独特表位具有特异性的抗体。当CD2和CD3在αβ或γδT细胞上表达时，它们可具有不同的构象结构，并且在一些情况下，对CD3和CD2具有特异性的抗体可引起γδT细胞的选择性活化。
γδT细胞群可以在γδT细胞的工程改造之前离体扩增。可用于促进γδT细胞群的体外扩增的试剂的非限制性实例包括抗CD3或抗CD2、抗CD27、抗CD30、抗CD70、抗OX40抗体、IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、IL-18、IL-19、IL-21、IL 23、IL-33、IFNγ、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、CD70(CD27配体)、刀豆蛋白A(ConA)、商陆(PWM)、蛋白质花生凝集素(PNA)、大豆凝集素(SBA)、小扁豆(Les Culinaris)凝集素(LCA)、豌豆(Pisum Sativum)凝集素(PSA)、罗马蜗牛(Helix pomatia)凝集素(HPA)、禾本蚕豆(Vicia graminea)凝集素(VGA)、菜豆(Phaseolus Vulgaris)红细胞凝集素(PHA-E)、菜豆白细胞凝集素(PHA-L)、西洋接骨木(Sambucus Nigra)凝集素(SNA、EBL)、朝鲜槐(Maackia Amurensis)凝集素II(MAL II)、龙爪槐(Sophora Japonica)凝集素(SJA)、二花扁豆(Dolichos Biflorus)凝集素(DBA)、小扁豆凝集素(LCA)、多花紫藤(Wisteria Floribunda)凝集素(WFA、WFL)或能够刺激T细胞增殖的其它合适的丝裂原。
γδT细胞的基因工程改造可包括将表达肿瘤识别部分(诸如αβTCR、γδTCR、编码抗体、其抗原结合片段的CAR或淋巴细胞活化结构域)的构建体稳定整合进分离的γδT细胞的基因组、细胞因子(例如，IL-15、IL-12、IL-2、IL-7、IL-21、IL-18、IL-19、IL-33、IL-4、IL-9、IL-23或IL1β)，以增强T细胞增殖、存活以及离体和体内功能。分离的γδT细胞的基因工程也可以包括使基因表达从分离的γδT细胞的基因组中的一个或多个内源性基因(诸如MHC基因座(基因座位))缺失或破坏。
γδT细胞的离体扩增
在其它方面，本公开提供用于离体扩增用于过继性转移疗法的非工程改造的和工程改造的γδT细胞群的方法。本公开的非工程改造的或工程改造的γδT细胞可以离体扩增。本公开的非工程改造的或工程改造的γδT细胞可以体外扩增，而不通过APC活化，或不与APC和/或氨基膦酸盐共培养。另外或可替代地，本公开的非工程改造的或工程改造的γδT细胞可以通过至少一个扩增步骤体外扩增，所述扩增步骤包括通过与APC和/或与一种或多种氨基膦酸盐一起共培养来活化。
在一些实施方案中，本公开的非工程改造的或工程改造的γδT细胞可以在第一γδT细胞扩增中不通过APC活化来体外扩增，然后在第二γδT细胞扩增中通过APC活化来体外扩增。在一些情况下，第一γδT细胞扩增包括使γδT细胞与一种或多种药剂接触，所述一种或多种药剂(a)扩增γδT细胞，或(b)通过分别结合至δ1 TCR；δ2 TCR；δ1和δ4 TCR；或δ1、δ3、δ4和δ5 TCR的特异性的活化表位来选择性扩增δ1 T细胞；δ2 T细胞；δ1 T细胞和δ3 T细胞；δ1 T细胞和δ4 T细胞；或δ1、δ3、δ4和δ5 T细胞。
在一些情况下，第二γδT细胞扩增在不含第一γδT细胞扩增所用的一种或多种药剂的培养基中进行。在一些情况下，第二γδT细胞扩增在含有一种或多种第二药剂的培养基中进行，所述一种或多种第二药剂(a)扩增T细胞，(b)扩增γδT细胞，或(c)通过分别结合至δ1 TCR；δ2 TCR；δ1和δ4 TCR；或δ1、δ3、δ4和δ5 TCR的特异性的活化表位来选择性扩增δ1T细胞；δ2 T细胞；δ1 T细胞和δ3 T细胞；δ1 T细胞和δ4 T细胞；或δ1、δ3、δ4和δ5 T细胞。
在一些情况下，第二药剂与用于第一γδT细胞扩增的药剂不同(例如，具有不同的一级氨基酸序列和/或结合结构上不同的γδTCR表位)。在一些情况下，第二药剂结合重叠的γδTCR表位、相同的γδTCR表位，或可以与用于第一γδT细胞扩增的药剂竞争与γδTCR的结合。在一些情况下，第二药剂在APC的细胞表面上表达。在一些情况下，第二药剂例如通过第二药剂的恒定区和APC的表面上的Fc受体之间的结合相互作用结合至APC的表面。在一些情况下，第二药剂是可溶性的。在一些情况下，第二γδT细胞扩增在含有可溶性第二药剂和APC的培养基中进行，任选地其中APC在其细胞表面上表达扩增或选择性扩增γδT细胞群的药剂或结合至其细胞表面。
在一些情况下，第一γδT细胞扩增在不存在APC的情况下进行，第二γδT细胞扩增在存在APC的情况下进行。在一些情况下，第二γδT细胞扩增使用APC和一种或多种第二药剂进行，所述一种或多种第二药剂(a)扩增T细胞，(b)扩增γδT细胞，或(c)通过分别结合至δ1 TCR；δ2 TCR；δ1和δ4 TCR；或δ1、δ3、δ4和δ5 TCR的特异性的活化表位来选择性扩增δ1 T细胞；δ2 T细胞；δ1 T细胞和δ3 T细胞；δ1 T细胞和δ4 T细胞；或δ1、δ3、δ4和δ5 T细胞。
本领域的技术人员将理解，在某些实施方案中，本文所述的第二扩增步骤的方法可以如第一扩增步骤所述进行，并且本文所述的第一步骤的方法可以如第二扩增步骤所述进行。例如，但不限于，在一些实施方案中，细胞的混合群体(例如，PBMC)可以在第一步骤中通过接触APC来扩增，然后在不存在APC的情况下，例如，通过使来自第一扩增步骤的扩增群体与固定化的药剂接触来扩增，所述固定化的药剂通过分别结合至δ1 TCR；δ2 TCR；δ1和δ4TCR；或δ1、δ3、δ4和δ5 TCR的特异性的活化表位来选择性扩增δ1 T细胞；δ2 T细胞；δ1 T细胞和δ3 T细胞；δ1 T细胞和δ4 T细胞；或δ1、δ3、δ4和δ5 T细胞。
本发明的方法可以扩增各种γδT细胞群，诸如Vγ1+、Vγ2+或Vγ3+γδT细胞群。在一些情况下，本发明的方法可以扩增Vδ1+ T细胞群；Vδ1+和Vδ3+T细胞群；Vδ1+和Vδ4+T细胞群；Vδ1+和Vδ2+T细胞群；或Vδ1+、Vδ3+、Vδ4+和Vδ5+ T细胞群。
在一些情况下，γδT细胞群可以在少于36天、少于35天、少于34天、少于33天、少于32天、少于31天、少于30天、少于29天、少于28天、少于27天、少于26天、少于25天、少于24天、少于23天、少于22天、少于21天、少于20天、少于19天、少于18天、少于17天、少于16天、少于15天、少于14天、少于13天、少于12天、少于11天、少于10天、少于9天、少于8天、少于7天、少于6天、少于5天、少于4天或少于3天内体外扩增。
在一些方面，提供了用于通过使来自混合细胞群的γδT细胞与活化剂接触来选择性扩增各种γδT细胞(包括工程改造的和非工程改造的γδT细胞)的方法。在一些情况下，活化或活化剂结合至γδT细胞的细胞表面受体上的特定表位。活化剂可以是抗体，诸如单克隆抗体。活化剂可以特异性活化一种或多种类型γδT细胞(诸如δ1、δ2、δ1和δ3或δ1和δ4细胞群)的生长。在一些实施方案中，活化剂特异性活化δ1细胞群的生长，以提供富集的δ1T细胞群。在其它情况下，活化剂特异性活化δ2细胞群的生长，以提供富集的δ2 T细胞群。
活化剂可以刺激工程改造的和非工程改造的γδT细胞以快速生长速率扩增。例如，药剂刺激以在小于30小时内1次细胞分裂、在小于29小时内1次细胞分裂、在小于28小时内1次细胞分裂、在小于27小时内1次细胞分裂、在小于26小时内1次细胞分裂、在小于25小时内1次细胞分裂、在小于24小时内1次细胞分裂、在小于23小时内1次细胞分裂、在小于22小时内1次细胞分裂、在小于21小时内1次细胞分裂、在小于20小时内1次细胞分裂、在小于19小时内1次细胞分裂、在小于18小时内1次细胞分裂、在小于17小时内1次细胞分裂、在小于16小时内1次细胞分裂、在小于15小时内1次细胞分裂、在小于14小时内1次细胞分裂、在小于13小时内1次细胞分裂、在小于12小时内1次细胞分裂、在小于11小时内1次细胞分裂、在小于10小时内1次细胞分裂、在小于9小时内1次细胞分裂、在小于8小时内1次细胞分裂、在小于7小时内1次细胞分裂、在小于6小时内1次细胞分裂、在小于5小时内1次细胞分裂、在小于4小时内1次细胞分裂、在小于3小时内1次细胞分裂、在小于2小时内1次细胞分裂的平均速率扩增γδT细胞群。
在一些情况下，活化剂可以刺激工程改造的和非工程改造的γδT细胞以每约4小时约1次分裂的平均速率、每约5小时约1次分裂的平均速率、每约6小时约1次分裂的平均速率、每约7小时约1次分裂的平均速率、每约8小时约1次分裂的平均速率、每约9小时约1次分裂的平均速率、每约10小时约1次分裂的平均速率、每约11小时约1次分裂的平均速率、每约12小时约1次分裂的平均速率、每约13小时约1次分裂的平均速率、每约14小时约1次分裂的平均速率、每约15小时约1次分裂的平均速率、每约16小时约1次分裂的平均速率、每约17小时约1次分裂的平均速率、每约18小时约1次分裂的平均速率、每约19小时约1次分裂的平均速率、每约20小时约1次分裂的平均速率、每约21小时约1次分裂的平均速率、每约22小时约1次分裂的速率、每约23小时约1次分裂的速率、每约24小时约1次分裂的平均速率、每约25小时约1次分裂的平均速率、每约26小时约1次分裂的平均速率、每约27小时约1次分裂的平均速率、每约28小时约1次分裂的速率、每约29小时约1次分裂的速率、每约30小时约1次分裂的平均速率、每约31小时约1次分裂的平均速率、每约32小时约1次分裂的平均速率、每约33小时约1次分裂的平均速率、每约34小时约1次分裂的速率、每约35小时约1次分裂的速率、每约36小时约1次分裂的平均速率扩增。
在一些情况下，活化剂可以刺激γδT细胞扩增培养物中工程改造的和/或非工程改造的γδT细胞的快速扩增，其中所述快速扩增以前述细胞分裂的平均速率中的任一者进行，并且维持在约连续1天和约连续19天之间、在约连续1天和约连续14天之间、在约连续1天和约连续7天之间、在约连续1天和约连续5天之间、在约连续2天和约连续19天之间、在约连续2天和约连续14天之间、在约连续2天和约连续7天之间、在约连续2天和约连续5天之间、在约连续4天和约连续19天之间、在约连续4天和约连续14天之间、在约连续4天和约连续7天之间或在约连续4天和约连续5天之间。
在一些情况下，活化剂可以刺激γδT细胞扩增培养物中的工程改造的和/或非工程改造的γδT细胞的扩增，所述γδT细胞扩增培养物已经以每约12小时(例如，10-12小时)约1次分裂的平均速率、每约13小时(例如，10-13小时)约1次分裂的平均速率、每约14小时(例如，10-14小时)约1次分裂的平均速率、每约15小时(例如，10-15小时)约1次分裂的平均速率、每约16小时(例如，10-16小时)约1次分裂的平均速率、每约17小时(例如，10-17小时或12-17小时)约1次分裂的平均速率、每约18小时(例如，10-18小时或12-18小时)约1次分裂的平均速率、每约19小时(例如，10-19小时或12-19小时)约1次分裂的平均速率、每约20小时(例如，12-20小时、16-20小时或18-20小时)约1次分裂的平均速率、每约21小时(例如，12-21小时、16-21小时或18-21小时)约1次分裂的平均速率、每约22小时(例如，12-22小时、16-22小时或18-22小时)约1次分裂的速率、每约23小时或更少(例如，12-23小时、16-23小时或18-23小时)约1次分裂的速率、每约24小时(例如，12-24小时、16-24小时或18-24小时)约1次分裂的平均速率维持约连续2天和约7天之间，或约连续2天和约5天之间。
在一些情况下，活化剂可以刺激γδT细胞扩增培养物中的工程改造的和/或非工程改造的γδT细胞的扩增，所述γδT细胞扩增培养物已经以每约25小时(例如，12-25小时、16-25小时、18-25小时或20-25小时)约1次分裂的平均速率、每约26小时(例如，12-26小时、16-26小时、18-26小时或20-26小时)约1次分裂的平均速率、每约27小时(例如，12-27小时、16-27小时、18-27小时或20-27小时)约1次分裂的平均速率、每约28小时(例如，12-28小时、16-28小时、18-28小时、20-28小时或22-28小时)约1次分裂的速率、每约29小时(例如，16-29小时、18-29小时、20-29小时或22-29小时)约1次分裂的速率、每约30小时(例如，16-30小时、18-30小时、20-30小时或22-30小时)约1次分裂的平均速率、每约31小时(例如，16-31小时、18-31小时、20-31小时、22-31小时或24-31小时)约1次分裂的平均速率、每约32小时(例如，18-32小时、20-32小时、22-32小时或24-32小时)约1次分裂的平均速率、每约33小时(例如，18-33小时、20-33小时、22-33小时或24-33小时)约1次分裂的平均速率、每约34小时(例如，18-34小时、20-34小时、22-34小时或24-34小时)约1次分裂的速率、每约35小时(例如，18-35小时、20-35小时、22-35小时或24-35小时)约1次分裂的速率、每约36小时(例如，18-36小时、20-36小时、22-36小时或24-36小时)约1次分裂的平均速率维持约连续2天和约7天之间或约连续2天和约5天之间。
在一些情况下，活化剂可以刺激γδT细胞扩增培养物中的工程改造的和/或非工程改造的γδT细胞的扩增，所述γδT细胞扩增培养物已经以每约12小时(例如，10-12小时)约1次分裂的平均速率、每约13小时(例如，10-13小时)约1次分裂的平均速率、每约14小时(例如，10-14小时)约1次分裂的平均速率、每约15小时(例如，10-15小时)约1次分裂的平均速率、每约16小时(例如，10-16小时)约1次分裂的平均速率、每约17小时(例如，10-17小时或12-17小时)约1次分裂的平均速率、每约18小时(例如，10-18小时或12-18小时)约1次分裂的平均速率、每约19小时(例如，10-19小时或12-19小时)约1次分裂的平均速率、每约20小时(例如，12-20小时、16-20小时或18-20小时)约1次分裂的平均速率、每约21小时(例如，12-21小时、16-21小时或18-21小时)约1次分裂的平均速率、每约22小时(例如，12-22小时、16-22小时或18-22小时)约1次分裂的速率、每约23小时或更少(例如，12-23小时、16-23小时或18-23小时)约1次分裂的速率、每约24小时(例如，12-24小时、16-24小时或18-24小时)约1次分裂的平均速率维持至少连续14天。
在一些情况下，活化剂可以刺激γδT细胞扩增培养物中的工程改造的和/或非工程改造的γδT细胞的扩增，所述γδT细胞扩增培养物已经以每约25小时(例如，12-25小时、16-25小时、18-25小时或20-25小时)约1次分裂的平均速率、每约26小时(例如，12-26小时、16-26小时、18-26小时或20-26小时)约1次分裂的平均速率、每约27小时(例如，12-27小时、16-27小时、18-27小时或20-27小时)约1次分裂的平均速率、每约28小时(例如，12-28小时、16-28小时、18-28小时、20-28小时或22-28小时)约1次分裂的速率、每约29小时(例如，16-29小时、18-29小时、20-29小时或22-29小时)约1次分裂的速率、每约30小时(例如，16-30小时、18-30小时、20-30小时或22-30小时)约1次分裂的平均速率、每约31小时(例如，16-31小时、18-31小时、20-31小时、22-31小时或24-31小时)约1次分裂的平均速率、每约32小时(例如，18-32小时、20-32小时、22-32小时或24-32小时)约1次分裂的平均速率、每约33小时(例如，18-33小时、20-33小时、22-33小时或24-33小时)约1次分裂的平均速率、每约34小时(例如，18-34小时、20-34小时、22-34小时或24-34小时)约1次分裂的速率、每约35小时(例如，18-35小时、20-35小时、22-35小时或24-35小时)约1次分裂的速率、每约36小时(例如，18-36小时、20-36小时、22-36小时或24-36小时)约1次分裂的平均速率维持至少连续14天。
在一些情况下，活化剂可以刺激γδT细胞扩增培养物中的工程改造的和/或非工程改造的γδT细胞的扩增，所述γδT细胞扩增培养物已经以每约12小时(例如，10-12小时)约1次分裂的平均速率、每约13小时(例如，10-13小时)约1次分裂的平均速率、每约14小时(例如，10-14小时)约1次分裂的平均速率、每约15小时(例如，10-15小时)约1次分裂的平均速率、每约16小时(例如，10-16小时)约1次分裂的平均速率、每约17小时(例如，10-17小时或12-17小时)约1次分裂的平均速率、每约18小时(例如，10-18小时或12-18小时)约1次分裂的平均速率、每约19小时(例如，10-19小时或12-19小时)约1次分裂的平均速率、每约20小时(例如，12-20小时、16-20小时或18-20小时)约1次分裂的平均速率、每约21小时(例如，12-21小时、16-21小时或18-21小时)约1次分裂的平均速率、每约22小时(例如，12-22小时、16-22小时或18-22小时)约1次分裂的速率、每约23小时或更少(例如，12-23小时、16-23小时或18-23小时)约1次分裂的速率、每约24小时(例如，12-24小时、16-24小时或18-24小时)约1次分裂的平均速率维持至少连续19天。
在一些情况下，活化剂可以刺激γδT细胞扩增培养物中的工程改造的和/或非工程改造的γδT细胞的扩增，所述γδT细胞扩增培养物已经以每约25小时(例如，12-25小时、16-25小时、18-25小时或20-25小时)约1次分裂的平均速率、每约26小时(例如，12-26小时、16-26小时、18-26小时或20-26小时)约1次分裂的平均速率、每约27小时(例如，12-27小时、16-27小时、18-27小时或20-27小时)约1次分裂的平均速率、每约28小时(例如，12-28小时、16-28小时、18-28小时、20-28小时或22-28小时)约1次分裂的速率、每约29小时(例如，16-29小时、18-29小时、20-29小时或22-29小时)约1次分裂的速率、每约30小时(例如，16-30小时、18-30小时、20-30小时或22-30小时)约1次分裂的平均速率、每约31小时(例如，16-31小时、18-31小时、20-31小时、22-31小时或24-31小时)约1次分裂的平均速率、每约32小时(例如，18-32小时、20-32小时、22-32小时或24-32小时)约1次分裂的平均速率、每约33小时(例如，18-33小时、20-33小时、22-33小时或24-33小时)约1次分裂的平均速率、每约34小时(例如，18-34小时、20-34小时、22-34小时或24-34小时)约1次分裂的速率、每约35小时(例如，18-35小时、20-35小时、22-35小时或24-35小时)约1次分裂的速率、每约36小时(例如，18-36小时、20-36小时、22-36小时或24-36小时)约1次分裂的平均速率维持至少连续19天。
活化剂可以刺激工程改造的或非工程改造的γδT细胞的子群以不同的生长速率扩增。例如，药剂可以刺激δ1细胞群以更快的速率生长，使得在1天至90天培养(例如，约1天至约19天、21天或23天培养)时期内，扩增产生比另一个γδT细胞群，诸如δ2或δ3群体；比扩增前γδT细胞的起始数量；比扩增前γδ1 T细胞的起始数量；或比培养物中的αβT细胞群大约10倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1,000倍、10,000倍、20,000倍、30,000倍、50,000倍、70,000倍、100,000倍或1,000,000倍的扩增。
在其它情况下，药剂可以刺激δ1和δ4群体以更快的速率生长，使得在1天至90天培养(例如，约1天至约19天、21天或23天培养)时期内，扩增产生比δ2 T细胞群；比另一个γδT细胞子群；比扩增前γδT细胞的起始数量；比扩增前γδ1 T细胞的起始数量；比扩增前γδ1和γδ3 T细胞的起始数量；或比培养物中的αβT细胞群大10倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1,000倍、10,000倍、20,000倍、30,000倍、50,000倍、70,000倍、100,000倍或1,000,000倍的扩增。
在其它情况下，药剂可以刺激δ1和δ4群体以更快的速率生长，使得在1天至90天培养(例如，约1天至约19天、21天或23天培养)时期内，扩增产生比δ2 T细胞群；比另一个γδT细胞子群；比扩增前γδT细胞的起始数量；比扩增前γδ1 T细胞的起始数量；比扩增前γδ1和γδ4 T细胞的起始数量；或比培养物中的αβT细胞群大10倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1,000倍、10,000倍、20,000倍、30,000倍、50,000倍、70,000倍、100,000倍或1,000,000倍的扩增结果。
在其它情况下，药剂可以刺激δ1、δ3、δ4和δ5群体以更快的速率生长，使得在1天至90天培养(例如，约1天至约19天、21天或23天培养)时期内，扩增产生比δ2 T细胞群；比另一个γδT细胞子群；比扩增前γδT细胞的起始数量；比扩增前γδ1 T细胞的起始数量；比扩增前γδ1和γδ3 T细胞的起始数量；比扩增前γδ1、γδ3、γδ4和γδ5 T细胞的起始数量；或比培养物中的αβT细胞群大10倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1,000倍、10,000倍、20,000倍、30,000倍、50,000倍、70,000倍、100,000倍或1,000,000倍的扩增。
在其它情况下，药剂可以刺激δ2群体以更快的速率生长，使得在1天至90天培养(例如，约1天至约19天、21天或23天培养)时期内，扩增产生比δ1 T细胞群；比δ3 T细胞群；比另一个γδT细胞子群；比扩增前γδT细胞的起始数量，比扩增前γδ2 T细胞的起始数量，或比αβT细胞大10倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1,000倍、10,000倍、20,000倍、30,000倍、50,000倍、70,000倍、100,000倍或1,000,000倍的扩增。
在一些方面，本公开提供与药剂接触的工程改造的或非工程改造的γδT细胞群，所述药剂刺激γδT细胞群快速，诸如以每30小时约1次细胞分裂或更快的速率扩增。在一些情况下，药剂选择性刺激δ1；δ2；δ1和δ4；或δ1、δ3、δ4和δ5 T细胞的增殖。γδT细胞群可包含一定量的非工程改造的γδT细胞和一定量的工程改造的γδT细胞。在一些情况下，γδT细胞群包含不同百分比的δ1、δ2、δ3和δ4 T细胞。工程改造的或非工程改造的γδT细胞群可包含例如小于90％的δ1T细胞、小于80％的δ1 T细胞、小于70％的δ1 T细胞、小于60％的δ1 T细胞、小于50％的δ1 T细胞、小于40％的δ1 T细胞、小于30％的δ1 T细胞、小于20％的δ1 T细胞、小于10％的δ1 T细胞或小于5％的δ1 T细胞。或者，工程改造的或非工程改造的γδT细胞群可包含大于5％的δ1 T细胞、大于10％的δ1 T细胞、大于20％的δ1 T细胞、大于30％的δ1 T细胞、大于40％的δ1 T细胞、大于50％的δ1 T细胞、大于60％的δ1 T细胞、大于70％的δ1 T细胞、大于80％的δ1 T细胞或大于90％的δ1 T细胞。在一些情况下，药剂是本文所述的选择性扩增剂中的一者。在一些情况下，药剂固定在表面，诸如细胞培养物表面，或APC的表面上(例如，在APC的表面上表达或结合至在APC的表面上表达的Fc受体)。
工程改造的或非工程改造的γδT细胞群可包含例如小于90％的δ2 T细胞、小于80％的δ2 T细胞、小于70％的δ2 T细胞、小于60％的δ2 T细胞、小于50％的δ2 T细胞、小于40％的δ2 T细胞、小于30％的δ2 T细胞、小于20％的δ2 T细胞、小于10％的δ2 T细胞或小于5％的δ2 T细胞。或者，工程改造的或非工程改造的γδT细胞群可包含大于5％的δ2 T细胞、大于10％的δ2 T细胞、大于20％的δ2 T细胞、大于30％的δ2 T细胞、大于40％的δ2 T细胞、大于50％的δ2 T细胞、大于60％的δ2 T细胞、大于70％的δ2 T细胞、大于80％的δ2 T细胞或大于90％的δ2 T细胞。
工程改造的或非工程改造的γδT细胞群可包含例如小于90％的δ1和δ4 T细胞、小于80％的δ1和δ4 T细胞、小于70％的δ1和δ4 T细胞、小于60％的δ1和δ4 T细胞、小于50％的δ1和δ4 T细胞、小于40％的δ1和δ4 T细胞、小于30％的δ1和δ4 T细胞、小于20％的δ1和δ4 T细胞、小于10％的δ1和δ4 T细胞或小于5％的δ1和δ4 T细胞。或者，工程改造的或非工程改造的γδT细胞群可包含大于5％的δ1和δ4 T细胞、大于10％的δ1和δ4 T细胞、大于20％的δ1和δ4 T细胞、大于30％的δ1和δ4 T细胞、大于40％的δ1和δ4 T细胞、大于50％的δ1和δ4 T细胞、大于60％的δ1和δ4 T细胞、大于70％的δ1和δ4 T细胞、大于80％的δ1和δ4 T细胞或大于90％的δ1和δ4 T细胞。
工程改造的或非工程改造的γδT细胞群可包含例如小于90％的δ4 T细胞、小于80％的δ4 T细胞、小于70％的δ4 T细胞、小于60％的δ4 T细胞、小于50％的δ4 T细胞、小于40％的δ4 T细胞、小于30％的δ4 T细胞、小于20％的δ4 T细胞、小于10％的δ4 T细胞或小于5％的δ4 T细胞。或者，工程改造的或非工程改造的γδT细胞群可包含大于5％的δ1和δ4 T细胞、大于10％的δ1和δ4 T细胞、大于20％的δ1和δ4 T细胞、大于30％的δ1和δ4 T细胞、大于40％的δ1和δ4 T细胞、大于50％的δ1和δ4 T细胞、大于60％的δ1和δ4 T细胞、大于70％的δ1和δ4 T细胞、大于80％的δ1和δ4 T细胞或大于90％的δ1和δ4 T细胞。工程改造的或非工程改造的γδT细胞群可包含例如小于90％的δ1和δ4 T细胞、小于80％的δ1和δ4 T细胞、小于70％的δ1和δ4 T细胞、小于60％的δ1和δ4 T细胞、小于50％的δ1和δ4 T细胞、小于40％的δ1和δ4 T细胞、小于30％的δ1和δ4 T细胞、小于20％的δ1和δ4 T细胞、小于10％的δ1和δ4 T细胞或小于5％的δ1和δ4 T细胞。
在某些实施方案中，本发明提供包含10-90％的δ1 T细胞和90-10％的δ2 T细胞的扩增的γδT细胞群的掺和物。在某些实施方案中，本发明提供包含10-90％的δ1和δ3 T细胞以及90-10％的δ2 T细胞的扩增的γδT细胞群的掺和物。在某些实施方案中，本发明提供包含10-90％的δ1和δ4 T细胞以及90-10％的δ2 T细胞的扩增的γδT细胞群的掺和物。在某些实施方案中，本发明提供包含10-90％的δ1、δ3、δ4和δ5 T细胞以及90-10％的δ2 T细胞的扩增的γδT细胞群的掺和物。
一种或多种活化剂可接触γδT细胞(例如活化剂γδT细胞先天受体)，其后共刺激分子可接触γδT细胞，以便提供另外的刺激和扩增γδT细胞。在一些实施方案中，活化剂和/或共刺激剂可以是植物和非植物来源的凝集素、活化γδT细胞的单克隆抗体以及其它非凝集素/非抗体药剂。在其它情况下，植物凝集素可以是刀豆蛋白A(ConA)，但可以使用诸如其它植物凝集素。凝集素的其它实例包括蛋白质花生凝集素(PNA)、大豆凝集素(SBA)、小扁豆凝集素(LCA)、豌豆凝集素(PSA)、罗马蜗牛凝集素(HPA)、禾本蚕豆凝集素(VGA)、菜豆红细胞凝集素(PHA-E)、菜豆白细胞凝集素(PHA-L)、西洋接骨木凝集素(SNA、EBL)、朝鲜槐凝集素II(MAL II)、龙爪槐凝集素(SJA)、二花扁豆凝集素(DBA)、小扁豆凝集素(LCA)、多花紫藤凝集素(WFA、WFL)。
活化剂和共刺激分子的非限制性实例包括对本文所述的δ链或γ链或其亚型具有选择性的任何一种或多种抗体，诸如5A6.E9、B1、TS8.2、15D、B6、B3、TS-1、γ3.20、7A5、IMMU510、R9.12、11F2或它们的组合的抗体。活化剂和共刺激分子的其它实例包括唑来膦酸盐、12-十四烷酰-13-乙酸佛波醇酯(TPA)、密执毒素(mezerein)、葡萄球菌肠毒素A(SEA)、链球菌蛋白A或它们的组合。
在其它情况下，活化剂和/或共刺激剂可以是αTCR、βTCR、γTCR、δTCR、CD277、CD28、CD46、CD81、CTLA4、ICOS、PD-1、CD30、NKG2D、NKG2A、HVEM、4-1 BB(CD137)、OX40(CD134)、CD70、CD80、CD86、DAP、CD122、GITR、FcεRIγ、CD1、CD16、CD161、DNAX、辅助分子-1(DNAM-1)、一种或多种NCR(例如，NKp30、NKp44、NKp46)、SLAM的抗体或配体、柯萨奇(Coxsackie)病毒和腺病毒受体或它们的组合。
工程改造的γδT细胞
工程改造的γδT细胞(参见例如图1)可以使用本领域已知的各种方法生成。工程改造的γδT细胞可以设计为稳定表达特定肿瘤识别部分。编码包含肿瘤识别部分或另一种类型的识别部分的表达盒的多核苷酸可以通过转座子/转座酶系统或基于病毒的基因转移系统(诸如慢病毒或逆转录病毒系统)，或其它合适的方法(诸如转染、电穿孔、转导、脂质转染、磷酸钙(CaPO4))、纳米工程改造物质(诸如有机改性的二氧化硅(Ormosil))、病毒递送方法(包括腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒)或其它合适的方法稳定地引入γδT细胞。可以通过将包含抗原特异性TCR的遗传密码的多核苷酸稳定插入γδT细胞的基因组来将αβ或γδ抗原特异性TCR引入工程改造的γδT细胞。可以通过将多核苷酸稳定插入γδT细胞的基因组来将编码具有肿瘤识别部分的CAR的多核苷酸引入工程改造的γδT细胞。在一些情况下，工程改造的肿瘤识别部分是工程改造的T细胞受体，并且整合进工程改造的γδT细胞的基因组的表达盒包含编码工程改造的TCRα(TCR alpha)基因、工程改造的TCRβ(TCRbeta)基因、TCRδ(TCR delta)基因，或工程改造的TCRγ(TCR gamma)基因的多核苷酸。在一些情况下，整合进工程改造的γδT细胞的基因组的表达盒包含编码抗体片段或其抗原结合部分的多核苷酸。在一些情况下，抗体片段或其抗原结合片段是编码完全抗体、抗体片段、单链可变片段(scFv)、单结构域抗体(sdAb)、Fab、F(ab)2、Fc、抗体上的轻链或重链、抗体的可变区或恒定区或它们的任何组合的多核苷酸，它们作为嵌合抗原受体(CAR)构建体，或包含CAR和T细胞受体(TCR)或抗体涉及不同抗原的CAR的双特异性构建体的一部分结合至细胞表面肿瘤抗原。在一些情况下，多核苷酸来源于人或来源于另外的物种。可以修饰来源于非人物种的抗体片段或抗原结合片段多核苷酸，以提高其与人体中天然产生的抗体变体的相似性，并且抗体片段或抗原结合片段可以是部分或完全人源化的。抗体片段或抗原结合片段多核苷酸也可以是嵌合的，例如小鼠-人抗体嵌合体。表达CAR的工程改造的γδT细胞也可以工程改造为表达由肿瘤识别部分识别的抗原的配体。
本领域已知的各种技术可用于将包含肿瘤识别部分的遗传密码的克隆的或合成工程改造的核酸引入工程改造的γδT细胞的基因组内的特定位置。分别如WO201409370、WO2003087341、WO2014134412和WO2011090804(这些专利中的每个以引用的方式整体并入本文)所述的来自微生物成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统的RNA引导的Cas9核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)和大范围核酸酶技术可用于在γδT细胞中提供有效的基因组工程改造。本文所述的技术也可用于将表达盒插入同时提供敲除一个基因并敲入另一个基因的基因组位置。例如，包含本公开的表达盒的多核苷酸可以插入编码MHC基因的基因组区域。这种工程改造可以同时提供一个或多个基因(例如表达盒中包含的基因)的敲入和另一个基因(例如MHC基因座)的敲除。
在一种情况下，将包含编码肿瘤识别部分的核酸的睡美人(Sleeping Beauty)转座子引入细胞，即工程改造的γδT细胞。与野生型睡美人转座酶相比提供增强整合的突变型睡美人转座酶，诸如US 7,985,739描述的转座酶，可用于将多核苷酸引入工程改造的γδT细胞，该专利以引用的方式整体并入本文。
在一些情况下，使用病毒方法将包含肿瘤识别部分的多核苷酸引入工程改造的γδT细胞的基因组。许多病毒方法已用于人基因疗法，诸如WO 1993020221中描述的方法，该专利整体并入本文。可用于工程改造γδT细胞的病毒方法的非限制性实例包括逆转录病毒、腺病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒或腺病毒相关的病毒方法。
含有肿瘤识别部分的遗传密码的多核苷酸可包含影响工程改造的γδT细胞的生长、增殖、活化状态的突变或其它转基因，或对肿瘤细胞具有特异性的抗原(诸如睾丸特异性癌症抗原)。本公开的γδT细胞可以被工程改造为表达包含连接至抗原识别部分(诸如TCR-CD3复合物中的分子或共刺激因子)的活化结构域的多核苷酸。工程改造的γδT细胞可表达作为T淋巴细胞活化结构域的胞内信号传导结构域。γδT细胞可以被工程改造为表达胞内活化结构域基因或胞内信号传导结构域。胞内信号传导结构域基因可以是例如CD3ζ、CD28、CD2、ICOS、JAML、CD27、CD30、OX40、NKG2D、CD4、OX40/CD134、4-1BB/CD137、FcεRIγ、IL-2RB/CD122、IL-2RG/CD132、DAP分子、CD70、细胞因子受体、CD40或它们的任何组合。在一些情况下，工程改造的γδT细胞也被工程改造为表达细胞因子、抗原、细胞受体或其它免疫调节分子。
可根据待治疗的疾病选择由工程改造的γδT细胞表达的适当肿瘤识别部分。例如，在一些情况下，肿瘤识别部分是TCR。在一些情况下，肿瘤识别部分是在癌细胞上表达的配体的受体。合适的受体的非限制性实例包括NKG2D、NKG2A、NKG2C、NKG2F、LLT1、AICL、CD26、NKRP1、CD244(2B4)、DNAM-1、NKp30、NKp44、NKp46和NKp80。在一些情况下，肿瘤识别部分可包括配体，例如IL-13配体，或肿瘤抗原的模拟物配体，诸如IL13R的模拟物IL-13。
γδT细胞可以被工程改造为表达包含来源于NKG2D、NKG2A、NKG2C、NKG2F、LLT1、AICL、CD26、NKRP1、CD244(2B4)、DNAM-1的配体结合结构域，或抗肿瘤抗体(诸如抗Her2neu或抗EGFR)以及得自CD3-ζ、Dap 10、Dap 12、CD28、41BB和CD40L的信号传导结构域的嵌合肿瘤识别部分。在一些实例中，嵌合受体结合MICA、MICB、Her2neu、EGFR、EGFRvIII、间皮素、CD38、CD20、CD19、BCMA、PSA、RON、CD30、CD22、CD37、CD38、CD56、CD33、CD138、CD123、CD79b、CD70、CD75、CA6、GD2、甲胎蛋白(AFP)、CS1、癌胚抗原(CEA)、CEACAM5、CA-125、MUC-16、5T4、NaPi2b、ROR1、ROR2、PLIF、Her2/Neu、EGFRvIII、GPMNB、LIV-1、糖脂F77、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、PSMA、STEAP-1、STEAP-2、c-Met、CSPG4、CD44v6、PVRL-4、VEGFR2、C4.4a、PSCA、叶酸结合蛋白/受体、SLC44A4、Cripto、CTAG1B、AXL、IL-13Rα2、IL-3R、EPHA3、SLTRK6、gp100、MART1、酪氨酸酶、SSX2、SSX4、NYESO-1、上皮肿瘤抗原(ETA)、MAGEA家族基因(诸如MAGEA3、MAGEA4)、KKLC1、突变ras(H、N、K)、BRaf、p53、β-连环蛋白、EGFRT790、MHC I类链相关分子A(MICA)或MHC I类链相关分子B(MICB)或者HPV、CMV或EBV中的一种或多种抗原。
在一些情况下，肿瘤识别部分靶向与肿瘤相关肽复合的MHC I类分子(HLA-A、HLA-B或HLA-C)。用于产生和使用靶向与MHC I类分子复合的肿瘤相关肽的肿瘤识别部分的方法和组合物包括Weidanz等人,Int.Rev.Immunol.30:328-40,2011；Scheinberg等人,Oncotarget.4(5):647-8,2013；Cheever等人,Clin.Cancer Res.15(17):5323-37,2009；Dohan&Reiter Expert Rev Mol Med.14:e6,2012；Dao等人,Sci Transl Med.2013年3月13日；5(176):176ra33；U.S.9,540,448；以及WO 2017/011804所述的那些。在一些实施方案中，肽MHC复合物的靶向肿瘤的相关肽是以下肽：威尔姆氏(Wilms)肿瘤蛋白1(WT1)、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、生存素、小鼠双微体2同源物(MDM2)、细胞色素P450(CYP1B)、KRAS或BRAF。
两个或多个肿瘤识别部分可以在γδT细胞中自从工程改造的γδT细胞稳定表达的遗传上不同的、基本上不同的或基本上相同的αβTCR多核苷酸，或从稳定整合进工程改造的γδT细胞的遗传上不同的αβTCR多核苷酸表达。就遗传上不同的αβTCR而言，可以利用识别与相同病症相关的不同抗原的αβTCR。在一个优选的实施方案中，γδT细胞被工程改造为表达来自一个或多个表达盒的人或小鼠来源的不同TCR，所述表达盒在不同的MHC单体型的背景下识别相同的抗原。在另一个优选的实施方案中，γδT细胞被工程改造为表达针对来自与不同的MHC单体型复合的给定抗原的相同或不同肽的一个TCR和两个或多个抗体。在一些情况下，通过工程改造的γδT细胞表达单个TCR促进了适当的TCR配对。表达不同TCR的工程改造的γδT细胞可提供通用的同种异体的工程改造γδT细胞。在第二个优选的实施方案中，γδT细胞被工程改造为表达针对肽-MHC复合物的一种或多种不同的抗体，每种抗体针对与相同的或不同的MHC单体型复合的相同的或不同的肽。在一些情况下，肿瘤识别部分可以是结合至肽-MHC复合物的抗体。
γδT细胞可以被工程改造为表达来自一个或多个表达盒的TCR，所述表达盒在不同的MHC单体型的背景下识别相同的抗原。在一些情况下，工程改造的γδT细胞被设计为表达单个TCR，或与CAR组合的TCR，以使工程改造的细胞中TCR错配的可能性最小化。由两个或多个表达盒表达的肿瘤识别部分优选地具有不同的多核苷酸序列，并且编码例如在不同的HLA单体型的背景下识别相同靶标的不同表位的肿瘤识别部分。表达这种不同TCR或CAR的工程改造的γδT细胞可提供通用的同种异体的工程改造的γδT细胞。
在一些情况下，γδT细胞被工程改造为表达一个或多个肿瘤识别部分。两个或多个肿瘤识别部分可以在γδT细胞中从遗传上相同的或基本上相同的工程改造的抗原特异性嵌合(CAR)多核苷酸表达。两个或多个肿瘤识别部分可以在γδT细胞中从遗传上不同的工程改造的CAR多核苷酸表达。遗传上不同的CAR可以被设计为识别与相同病症相关的不同抗原。
或者，γδT细胞可以是双特异性的。双特异性的工程改造的γδT细胞可以表达两个或多个肿瘤识别部分。双特异性的工程改造的γδT细胞可以表达TCR和CAR肿瘤识别部分。双特异性的工程改造的γδT细胞可以被设计为识别与相同病症相关的不同抗原。工程改造的γδT细胞可以表达识别相同的或基本上相同的抗原的两个或多个CAR/TCR双特异性多核苷酸。工程改造的γδT细胞可以表达识别不同的抗原的两个或多个CAR/TCR双特异性的构建体。在一些情况下，本公开的双特异性的构建体结合至靶细胞的活化和失活结构域，据此提供增加的靶标特异性。γδT细胞可以被工程改造为表达至少1个肿瘤识别部分、至少2个肿瘤识别部分、至少3个肿瘤识别部分、至少4个肿瘤识别部分、至少5个肿瘤识别部分、至少6个肿瘤识别部分、至少7个肿瘤识别部分、至少8个肿瘤识别部分、至少9个肿瘤识别部分、至少10个肿瘤识别部分、至少11个肿瘤识别部分、至少12个肿瘤识别部分或其它合适数量的肿瘤识别部分。
可以通过包含ITAM基序的两种功能性ζ(zeta)蛋白来增强适当的TCR功能。还可以通过αβ或γδ活化结构域(诸如CD3ζ、CD28、CD2、CTLA4、ICOS、JAML、PD-1、CD27、CD30、41-BB、OX40、NKG2D、HVEM、CD46、CD4、FcεRIγ、IL-2RB/CD122、IL-2RG/CD132、DAP分子和CD70)的表达来增强适当的TCR功能。表达的多核苷酸可以包含肿瘤识别部分、接头部分和活化结构域的遗传密码。通过工程改造的γδT细胞来翻译多核苷酸可以提供由蛋白质接头连接的肿瘤识别部分和活化结构域。通常，接头包含不阻碍肿瘤识别部分和活化结构域的折叠的氨基酸。接头分子的长度可以为至少约5个氨基酸、约6个氨基酸、约7个氨基酸、约8个氨基酸、约9个氨基酸、约10个氨基酸、约11个氨基酸、约12个氨基酸、约13个氨基酸、约14个氨基酸、约15个氨基酸、约16个氨基酸、约17个氨基酸、约18个氨基酸、约19个氨基酸或约20个氨基酸。在一些情况下，接头中至少50％、至少70％或至少90％的氨基酸为丝氨酸或甘氨酸。
在一些情况下，活化结构域可包含一个或多个突变。合适的突变可以是例如赋予活化结构域以组成型活性的突变。改变一种或多种核酸的同一性改变了翻译的氨基酸的氨基酸序列。可以进行核酸突变，以使得编码的氨基酸被修饰为极性的、非极性的、碱性或酸性氨基酸。可以进行核酸突变，以使得肿瘤识别部分被优化为识别来自肿瘤的表位。γδT细胞的工程改造的肿瘤识别部分、工程改造的活化结构域或另一工程改造的组分可以包括超过1个氨基酸突变、2个氨基酸突变、3个氨基酸突变、4个氨基酸突变、5个氨基酸突变、6个氨基酸突变、7个氨基酸突变、8个氨基酸突变、9个氨基酸突变、10个氨基酸突变、11个氨基酸突变、12个氨基酸突变、13个氨基酸突变、14个氨基酸突变、15个氨基酸突变、16个氨基酸突变、17个氨基酸突变、18个氨基酸突变、19个氨基酸突变、20个氨基酸突变、21个氨基酸突变、22个氨基酸突变、23个氨基酸突变、24个氨基酸突变、25个氨基酸突变、26个氨基酸突变、27个氨基酸突变、28个氨基酸突变、29个氨基酸突变、30个氨基酸突变、31个氨基酸突变、32个氨基酸突变、33个氨基酸突变、34个氨基酸突变、35个氨基酸突变、36个氨基酸突变、37个氨基酸突变、38个氨基酸突变、39个氨基酸突变、40个氨基酸突变、41个氨基酸突变、42个氨基酸突变、43个氨基酸突变、44个氨基酸突变、45个氨基酸突变、46个氨基酸突变、47个氨基酸突变、48个氨基酸突变、49个氨基酸突变或50个氨基酸突变。
在一些情况下，本公开的γδT细胞不表达一种或多种MHC分子。在工程改造的γδT细胞中一个或多个MHC基因座的缺失可以降低工程改造的γδT细胞被宿主免疫系统识别的可能性。人主要组织相容性复合物(MHC)基因座(称为人白细胞抗原(HLA)系统)包含在抗原呈递细胞(包括γδT细胞)中表达的大基因家族。HLA-A、HLA-B和HLA-C分子的作用是提供作为抗原呈递细胞的抗原的胞内肽。HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ和HLA-DR分子的作用是提供作为抗原呈递细胞的抗原的胞外肽。HLA基因的一些等位基因与GVHD、自体免疫疾病和癌症相关。本文所述的工程改造的γδT细胞可以进一步被工程改造为缺乏或破坏一个或多个HLA基因的基因表达。本文所述的工程改造的γδT细胞可以进一步工程改造为缺乏或破坏MHC复合物的一种或多种组分的基因表达，诸如一个或多个MHC基因的完全缺失、特定外显子的缺失或β2微球蛋白(B2m)的缺失。至少一个HLA基因的基因切除或基因断裂可以提供临床治疗性γδT细胞，所述γδT细胞可施用于具有任何HLA单体型的受试者，而不导致移植物对抗宿主疾病。本文所述的工程改造的γδT细胞可以是具有任何HLA单体型的人受试者的通用供体。
γδT细胞可以被工程改造为缺乏一个或多个HLA基因座(基因座位)。工程改造的γδT细胞可以被工程改造为缺乏HLA-A等位基因、HLA-B等位基因、HLA-C等位基因、HLA-DR等位基因、HLA-DQ等位基因或HLA-DP等位基因。在一些情况下，HLA等位基因与人疾病(诸如自体免疫疾病)相关。例如，HLA-B27等位基因与关节炎和葡萄膜炎相关，HLA-DR2等位基因与全身性红斑狼疮和多发性硬化相关，HLA-DR3等位基因与21-羟化酶缺乏相关，HLA-DR4与类风湿性关节炎和1型糖尿病相关。缺乏例如HLA-B27等位基因的工程改造的γδT细胞可施用于患有关节炎的受试者，而不容易被受试者的免疫系统识别。在一些情况下，一个或多个HLA基因座的缺失提供了工程改造的γδT细胞，它作为具有任何HLA单体型的任何受试者的通用供体。
在一些情况下，工程改造γδT细胞需要缺失γδT细胞基因组的一部分。在一些情况下，基因组的缺失部分包含MHC基因座(基因座位)的一部分。在一些情况下，工程改造的γδT细胞来源于野生型人γδT细胞，并且MHC基因座是HLA基因座。在一些情况下，基因组的缺失部分包含MHC复合物中的蛋白质对应的基因的一部分。在一些情况下，基因组的缺失部分包含β2微球蛋白基因。在一些情况下，基因组的缺失部分包含免疫检查点基因，诸如PD-1、CTLA-4、LAG3、ICOS、BTLA、KIR、TIM3、A2aR、B7-H3、B7-H4和CECAM-1。在一些情况下，工程改造的γδT细胞可以设计为表达增强T细胞活化和细胞毒性的活化结构域。可由工程改造的γδT细胞表达的活化结构域的非限制性实例包括：CD2、ICOS、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、CD27、CD70、CD80、CD86、DAP分子、CD122、GITR、FcεRIγ。
工程改造的γδT细胞的基因组的任何部分可以被缺失，以破坏内源性γδT细胞基因的表达。γδT细胞的基因组中可以缺失或破坏的基因组区域的非限制性实例包括启动子、活化子、增强子、外显子、内含子、非编码RNA、微RNA、小核RNA、可变数量串联重复序列(VNTR)、短串联重复序列(STR)、SNP图谱、高变区、小卫星序列、二核苷酸重复序列、三核苷酸重复序列、四核苷酸重复序列或简单重复序列。在一些情况下，基因组的缺失部分的范围在1个核酸至约10个核酸、1个核酸至约100个核酸、1个核酸至约1,000个核酸、1个核酸至约10,000个核酸、1个核酸至约100,000个核酸、1个核酸至约1,000,000个核酸之间或其它合适的范围。
工程改造的γδT细胞中的HLA基因表达也可以通过本领域已知的各种技术破坏。在一些情况下，大基因座基因编辑技术用于从工程改造的γδT细胞基因组切除基因，或破坏工程改造的γδT细胞中至少一个HLA基因座的基因表达。可用于编辑工程改造的γδT细胞的基因组上的所需基因座的基因编辑技术的非限制性实例包括分别如WO201409370、WO2003087341、WO2014134412和WO 2011090804(这些专利中的每个以引用的方式整体并入本文)所述的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)-Cas、锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应核酸酶(TALENs)以及大范围核酸酶技术。
γδT细胞可以从已表达肿瘤识别部分的分离的非工程改造的γδT细胞工程改造。工程改造的γδT细胞可以保持由分离的野生型γδT细胞(例如，从肿瘤样品的肿瘤侵润性淋巴细胞分离)内源性表达的肿瘤细胞识别部分。在一些情况下，工程改造的γδT细胞肿瘤细胞识别部分替代野生型γδTCR。
γδT细胞可以被工程改造为表达一种或多种归巢分子，诸如淋巴细胞归巢分子。归巢分子可以是例如淋巴细胞归巢受体或细胞粘附分子。归巢分子可以在工程改造的γδT细胞施用于受试者时帮助工程改造的γδT细胞迁移和侵润实体瘤(包括靶向实体瘤)。归巢受体的非限制性实例包括CCR家族成员，例如：CCR2、CCR4、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CLA、CD44、CD103、CD62L、E-选择素、P-选择素、L-选择素、整联蛋白(诸如VLA-4和LFA-1)。细胞粘附分子的非限制性实例包括ICAM、N-CAM、VCAM、PE-CAM、L1-CAM、粘连蛋白(PVRL1、PVRL2、PVRL3)、LFA-1、整联蛋白αXβ2、αvβ7、巨噬细胞-1抗原、CLA-4、糖蛋白IIb/IIIa。细胞粘附分子的其它实例包括钙依赖性分子(诸如T-钙粘蛋白)，以及基质金属蛋白酶(MMP)(诸如MMP9或MMP2)的抗体。
涉及T细胞成熟、活化、增殖和功能的步骤可以通过共刺激和抑制信号经由免疫检查点蛋白调控。免疫检查点是免疫系统固有的共刺激和抑制元件。免疫检查点有助于维持自身耐受性和调节生理免疫应答的持续时间和幅度，以在免疫系统对疾病状况(诸如细胞转化或感染)作出响应时防止组织损伤。用于控制来自γδ和αβT细胞的免疫应答的共刺激和抑制信号之间的平衡可由免疫检查点蛋白调控。免疫检查点蛋白(诸如PD1和CTLA4)存在于T细胞的表面上，并且可用于“开启”或“关闭”免疫应答。肿瘤可以使作为免疫耐受机制的检查点蛋白功能失调，特是对肿瘤抗原具有特异性的T细胞。本公开的工程改造的γδT细胞可以进一步被工程改造为缺乏一个或多个免疫检查点基因座(基因座位)，诸如PD-1、CTLA-4、LAG3、ICOS、BTLA、KIR、TIM3、A2aR、CEACAM1、B7-H3和B7-H4。或者，可以通过基因编辑技术破坏内源性免疫检查点基因在本公开的工程改造的γδT细胞中的表达。
免疫检查点可以是本公开的工程改造的γδT细胞中调节抑制信号传导通路的分子(例如CTLA4、PD1和LAG3)或调节刺激信号传导通路的分子(例如ICOS)。扩展免疫球蛋白超家族中的几种蛋白质可以是免疫检查点的配体。免疫检查点配体蛋白的非限制性实例包括B7-H4、ICOSL、PD-L1、PD-L2、MegaCD40L、MegaOX40L和CD137L。在一些情况下，免疫检查点配体蛋白是由肿瘤表达的抗原。在一些情况下，免疫检查点基因是CTLA-4基因。在一些情况下，免疫检查点基因是PD-1基因。
PD1是属于CD28/CTLA4家族的抑制性受体，并在活化的T淋巴细胞、B细胞、单核细胞、DC和调节T细胞上表达。已知的PD1配体有两种，即PD-L1和PD-L2，它们在T细胞、APC和恶性细胞上表达，其作用是抑制自体反应性淋巴细胞和抑制TAA特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的效应功能。因此，缺乏PD1的工程改造的γδT细胞可以保持其细胞毒性活性，无论肿瘤细胞是否表达PD-L1和PD-L2。在一些情况下，本公开的工程改造的γδT细胞缺乏PD-1基因的基因座。在一些情况下，通过基因编辑技术破坏PD-1基因在工程改造的γδT细胞中的表达。
CTLA4(细胞毒性T淋巴细胞抗原4)也称为CD152(分化簇152)。CTLA4与共刺激分子CD28共有序列同源性和配体(CD80/B7-1和CD86/B7-2)，但不同之处在于将抑制信号递送至表达作为受体的CTLA4的T细胞。CTLA4对两种配体的总亲和力更高，并且当配体密度有限时，可在与CD28的结合竞争中胜出。CTLA4通常在CD8+效应T细胞的表面上表达，并且在初始和记忆T细胞的初始活化阶段发挥功能作用。CTLA4在T细胞活化的早期通过增加对CD80和CD86的亲和力来抵消CD28的活性。CTLA4的主要功能包括下调辅助T细胞和增强调节T细胞的免疫抑制活性。在一些情况下，本公开的工程改造的γδT细胞缺乏CTLA4基因。在一些情况下，通过基因编辑技术破坏CTLA4基因在工程改造的γδT细胞中的表达。
LAG3(淋巴细胞活化基因3)在活化的抗原特异性细胞毒性T细胞上表达，并且可增强调节T细胞的功能和独立地抑制CD8+效应T细胞活性。LAG3是对MHC II类蛋白的结合具有高亲和力的CD-4样负调控蛋白，它们在一些上皮癌症中上调，引起T细胞增殖和稳态的耐受性。使用LAG-3-IG融合蛋白减少LAG-3/II类相互作用可以增强抗肿瘤免疫应答。在一些情况下，本公开的工程改造的γδT细胞缺乏LAG3基因的基因座。在一些情况下，通过基因编辑技术破坏LAG3基因在工程改造的γδT细胞中的表达。
非工程改造的和工程改造的γδT细胞的表型
工程改造的γδT细胞可以归巢至受试者身体内的特定物理位置。工程改造的γδT细胞的迁移和归巢可取决于特定趋化因子和/或粘附分子的组合表达和作用。工程改造的γδT细胞的归巢可以由趋化因子与其受体之间的相互作用控制。例如，细胞因子(包括但不限于CXCR3(其配体以IP-10/CXCL10和6Ckine/SLC/CCL21表示)、CCR4+、CXCR5+(RANTES、MIP-1α、MIP-1β的受体)、CCR6+和CCR7)可影响工程改造的γδT细胞的归巢。在一些情况下，工程改造的γδT细胞可以归巢至炎症和损伤部位和疾病细胞以执行修复功能。在一些情况下，工程改造的γδT细胞可归巢至癌症。在一些情况下，工程改造的γδT细胞可归巢至胸腺、骨髓、皮肤、喉、气管、胸膜、肺、食道、腹部、胃、小肠、大肠、肝、胰腺、肾、尿道、膀胱、睾丸、前列腺、输精管、卵巢、子宫、乳腺、甲状旁腺、脾或受试者身体的其它部位。工程改造的γδT细胞可表达一个或多个归巢部分，诸如特定的TCR等位基因和/或淋巴细胞归巢分子。
工程改造的γδT细胞可具有特定表型，并且表型可以根据细胞表面标志物表达来描述。各种类型的γδT细胞可以如本文所述进行工程改造。在优选的实施方案中，工程改造的γδT细胞来源于人，但工程改造的γδT细胞也可以来源于不同的来源，诸如哺乳动物或合成细胞。
可以使用标志物(包括但不限于CD27、CD45RA、CD45RO、CCR7和CD62L)确定扩增细胞群的免疫表型(Klebanoff等人,Immunol Rev.211:214 2006)。CD45RA在初始T淋巴细胞上表达，当抗原遇到时被CD45RO替换，但在晚期效应细胞中重新表达(Michie等人,Nature360,264-265(1992)；CD62L是充当归巢分子进入次级淋巴组织的细胞粘附分子，并且在T细胞活化后丢失，此时T细胞获得效应功能(Sallusto等人,Nature.401:708(1999)；CD27是在T细胞分化期间丢失的共刺激标志物(Appay等人,Nat Med.8:379(2002)；Klebanoff等人,Immunol Rev.211:214 2006)。
抗原
本文公开的发明提供表达抗原识别部分的工程改造的γδT细胞，其中抗原识别部分识别疾病特异性表位。抗原可以是引发免疫应答的分子。该免疫应答可涉及抗体产生、特定免疫活性细胞的活化或它们二者。抗原可以是例如肽、蛋白质、半抗原、脂质、糖、细菌、病原体或病毒。抗原可以是肿瘤抗原。肿瘤表位可以由肿瘤细胞表面上的MHC I或MHC II复合物呈递。表位可以是在细胞表面上表达并且由肿瘤识别部分识别的抗原的一部分。
工程改造的γδT细胞识别的抗原的非限制性实例包括CD19、CD20、CD30、CD22、CD37、CD38、CD56、CD33、CD138、CD123、CD79b、CD70、CD75、CA6、GD2、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、RON、CEACAM5、CA-125、MUC-16、5T4、NaPi2b、ROR1、ROR2、PLIF、Her2/Neu、EGFRvIII、GPMNB、LIV-1、糖脂F77、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、PSMA、STEAP-1、STEAP-2、间皮素、c-Met、CSPG4、PVRL-4、VEGFR2、PSCA、CLEC12a、L1CAM、GPC2、GPC3、叶酸结合蛋白/受体、SLC44A4、Cripto、CTAG1B、AXL、IL-13R、IL-3Rα2、SLTRK6、gp100、MART1、酪氨酸酶、SSX2、SSX4、NYESO-1、WT-1、PRAME、上皮肿瘤抗原(ETA)、MAGEA家族基因(诸如MAGEA3、MAGEA4)、KKLC1、突变ras、p53、MHC I类链相关分子A(MICA)或MHC I类链相关分子B(MICB)或者HPV、CMV或EBV中的一种或多种抗原。
抗原可以在细胞的胞内或胞外区室中表达，并且工程改造的γδT细胞可以识别胞内或胞外肿瘤抗原。在一些情况下，工程改造的γδT细胞中的αβTCR识别来源于胞内或胞外肿瘤抗原的肽。例如，抗原可以是由病毒感染的细胞胞内或胞外产生的蛋白质(诸如HIV、EBV、CMV或HPV蛋白)。抗原也可以是由癌细胞胞内或胞外表达的蛋白质。
抗原识别部分可以识别来自窘迫期细胞(诸如癌细胞或被病毒感染的细胞)的抗原。例如，人MHC I类链相关基因(MICA和MICB)位于染色体6的HLA I类区内。MICA和MICB蛋白被视为人上皮细胞中的“应激”标志物，并且充当表达常见自然杀伤细胞受体(NKG2D)的细胞的配体。作为应激标志物，MICA和MICB可以从癌细胞高表达。工程改造的γδT细胞可以识别MICA或MICB肿瘤表位。
肿瘤识别部分可以被工程改造为以某些亲和力识别抗原。例如，由TCR或CAR构建体编码的肿瘤识别部分可以以解离常数为至少10fM、至少100fM、至少1皮摩尔/升(pM)、至少10pM、至少20pM、至少30pM、至少40pM、至少50pM、至少60pM、至少7pM、至少80pM、至少90pM、至少100pM、至少200pM、至少300pM、至少400pM、至少500pM、至少600pM、至少700pM、至少800pM、至少900pM、至少1纳摩尔/升(nM)、至少2nM、至少3nM、至少4nM、至少5nM、至少6nM、至少7nM、至少8nM、至少9nM、至少10nM、至少20nM、至少30nM、至少40nM、至少50nm、至少60nM、至少70nM、至少80nM、至少90nM、至少100nM、至少200nM、至少300nM、至少400nM、至少500nM、至少600nM、至少700nM、至少800nM、至少900nM、至少1μM、至少2μM、至少3μM、至少4μM、至少5μM、至少6μM、至少7μM、至少8μM、至少9μM、至少10μM、至少20μM、至少30μM、至少40μM、至少50μM、至少60μM、至少70μM、至少80μM、至少90μM或至少100μM识别抗原。
在一些情况下，肿瘤识别部分可以被工程改造为以解离常数为至多10fM、至多100fM、至多1皮摩尔(pM)、至多10pM、至多20pM、至多30pM、至多40pM、至多50pM、至多60pM、至多7pM、至多80pM、至多90pM、至多100pM、至多200pM、至多300pM、至多400pM、至多500pM、至多600pM、至多700pM、至多800pM、至多900pM、至多1纳摩尔(nM)、至多2nM、至多3nM、至多4nM、至多5nM、至多6nM、至多7nM、至多8nM、至多9nM、至多10nM、至多20nM、至多30nM、至多40nM、至多50nm、至多60nM、至多70nM、至多80nM、至多90nM、至多100nM、至多200nM、至多300nM、至多400nM、至多500nM、至多600nM、至多700nM、至多800nM、至多900nM、至多1μM、至多2μM、至多3μM、至多4μM、至多5μM、至多6μM、至多7μM、至多8μM、至多9μM、至多10μM、至多20μM、至多30μM、至多40μM、至多50μM、至多60μM、至多70μM、至多80μM、至多90μM或至多100μM识别抗原。
新型活化剂
本发明的发明人鉴定了结合γδTCR的特定亚型，据此活化特定γδT细胞群的活化剂。在一个方面，本发明提供结合本文的实施例14和实施例39以及图23-30和图33-36鉴定和描述的新型活化表位的新型活化剂。活化剂包括但不限于MAb TS8.2、TS-1、15D、B6、R9.12、δ1-05、δ1-08、δ1-18、δ1-22、δ1-23、δ1-26、δ1-35、δ1-37、δ1-39、δ1-113、δ1-143、δ1-149、δ1-155、δ1-182、δ1-183、δ1-191、δ1-192、δ1-195、δ1-197、δ1-199、δ1-201、δ1-203、δ1-239、δ1-253、δ1-257、δ1-278、δ1-282、δ1-285、δ2-14、δ2-17、δ2-22、δ2-30、δ2-31、δ2-32、δ2-33、δ2-35、δ2-36和δ2-37。
这些活化剂还包括但不限于与一种或多种MAb结合相同的表位或与一种或多种MAb竞争的活化剂，所述MAb选自TS8.2、TS-1、15D、B6、R9.12、δ1-05、δ1-08、δ1-18、δ1-22、δ1-23、δ1-26、δ1-35、δ1-37、δ1-39、δ1-113、δ1-143、δ1-149、δ1-155、δ1-182、δ1-183、δ1-191、δ1-192、δ1-195、δ1-197、δ1-199、δ1-201、δ1-203、δ1-239、δ1-253、δ1-257、δ1-278、δ1-282、δ1-285、δ2-14、δ2-17、δ2-22、δ2-30、δ2-31、δ2-32、δ2-33、δ2-35、δ2-36和δ2-37。
这些活化剂还包括但不限于含有MAb的互补决定区(CDR)和/或可变区的活化剂，所述MAb选自TS8.2、TS-1、15D、B6、R9.12、δ1-05、δ1-08、δ1-18、δ1-22、δ1-23、δ1-26、δ1-35、δ1-37、δ1-39、δ1-113、δ1-143、δ1-149、δ1-155、δ1-182、δ1-183、δ1-191、δ1-192、δ1-195、δ1-197、δ1-199、δ1-201、δ1-203、δ1-239、δ1-253、δ1-257、δ1-278、δ1-282、δ1-285、δ2-14、δ2-17、δ2-22、δ2-30、δ2-31、δ2-32、δ2-33、δ2-35、δ2-36和δ2-37。
本发明还提供编码活化剂的核酸，所述活化剂：(i)含有MAb的互补决定区(CDR)和/或可变区；(ii)与MAb结合相同的表位或与MAb竞争；或者(iii)是MAb，所述MAb选自TS8.2、TS-1、15D、B6、R9.12、δ1-05、δ1-08、δ1-18、δ1-22、δ1-23、δ1-26、δ1-35、δ1-37、δ1-39、δ1-113、δ1-143、δ1-149、δ1-155、δ1-182、δ1-183、δ1-191、δ1-192、δ1-195、δ1-197、δ1-199、δ1-201、δ1-203、δ1-239、δ1-253、δ1-257、δ1-278、δ1-282、δ1-285、δ2-14、δ2-17、δ2-22、δ2-30、δ2-31、δ2-32、δ2-33、δ2-35、δ2-36和δ2-37。在一些情况下，核酸在宿主细胞(例如，异源性宿主细胞)中。在一些情况下，核酸可操作地连接至异源性启动子或可操作地连接至编码异源性多肽的核酸。如本文所用，术语“异源性”是指天然不共同存在于自然界中的两种组分。
在某些实施方案中，活化剂(例如，抗体)扩增或活化一个或个种γδT细胞群(例如，δ1 T细胞或δ2 T细胞)。在某些实施方案中，活化剂选择性活化δ1和δ3 T细胞。在某些实施方案中，活化剂选择性活化δ1和δ4 T细胞。在某些实施方案中，活化剂选择性活化δ1 T细胞。在某些实施方案中，活化剂选择性活化δ1、δ3、δ5和δ5 T细胞。在某些实施方案中，活化剂选择性活化δ2 T细胞。
本发明还提供产生一种或多种前述活化剂的方法。例如，可以培养含有编码活化剂的核酸的宿主细胞，以产生一种或多种前述活化剂。
APC
本文还描述了用于扩增工程改造的或非工程改造的γδT细胞(诸如一个或多个γδT细胞子群)的APC。在一些实施方案中，本文描述了含有编码一种或多种前述活化剂的异源性核酸的APC。在一些实施方案中，本文描述了在细胞表面上表达一种或多种前述活化剂的APC。在一些实施方案中，本文描述了在其细胞表面上表达一种或多种Fc受体的APC，其中所述Fc受体接触和/或结合一种或多种前述活化剂。
在一些情况下，APC(例如，在细胞表面上表达一种或多种前述活化剂，或结合在细胞表面上表达的Fc受体的APC)不表达HLA I类、HLA I类、不变链和/或HLA-DM，或表现出HLAI类、HLA I类、不变链和/或HLA-DM的表达减少。在一些情况下，APC表达粘附分子，诸如细胞间粘附分子-1、CD11a、CD18、CD54和/或白细胞功能相关抗原-3。在一些情况下，APC表达Fc受体，诸如对用于本文所述的γδT细胞扩增方法的活化剂的同种型具有特异性的Fc受体。在一些情况下，APC表达一种或多种选自以下的Fc受体：CD64、CD32A、CD32B、CD32C、CD16A、CD16B、FcRn、TRIM21或CD307，或它们的具有更高亲和力或改变的特异性的工程改造的变体。
本文还描述了包含一种或多种前述APC的培养物。培养物还可以含有扩增的或未扩增的、工程改造的或非工程改造的γδT细胞。培养物可以另外或可选地含有选择性或非选择性γδT细胞活化剂，包括本文所述的任何一种γδT细胞活化剂。在一些情况下，培养物不含有IL-21。在一些情况下，培养物不含有IL-4、IL-2或IL-15或它们的组合。在一些情况下，培养物不含有选择性扩增γδT细胞子群的细胞因子。
表位鉴定
本发明的发明人鉴定了γδTCR活化MAb TS8.2、TS-1、15D、B6、R9.12、δ1-05、δ1-08、δ1-18、δ1-22、δ1-23、δ1-26、δ1-35、δ1-37、δ1-39、δ1-113、δ1-143、δ1-149、δ1-155、δ1-182、δ1-183、δ1-191、δ1-192、δ1-195、δ1-197、δ1-199、δ1-201、δ1-203、δ1-239、δ1-253、δ1-257、δ1-278、δ1-282、δ1-285、δ2-14、δ2-17、δ2-22、δ2-30、δ2-31、δ2-32、δ2-33、δ2-35、δ2-36和δ2-37的表位内的结合区。示例性表位包括但不限于γδTCR活化MAb TS8.2、TS-1、15D、B6、R9.12、δ1-05、δ1-08、δ1-18、δ1-22、δ1-23、δ1-26、δ1-35、δ1-37、δ1-39、δ1-113、δ1-143、δ1-149、δ1-155、δ1-182、δ1-183、δ1-191、δ1-192、δ1-195、δ1-197、δ1-199、δ1-201、δ1-203、δ1-239、δ1-253、δ1-257、δ1-278、δ1-282、δ1-285、δ2-14、δ2-17、δ2-22、δ2-30、δ2-31、δ2-32、δ2-33、δ2-35、δ2-36和δ2-37的表位。在一些实施方案中，表位是由一种或多种γδTCR活化MAb TS8.2、TS-1、15D、B6、R9.12、δ1-05、δ1-08、δ1-22、δ1-26、δ1-35、δ1-37、δ1-39、δ1-113、δ1-143、δ1-149、δ1-155、δ1-182、δ1-183、δ1-191、δ1-192、δ1-195、δ1-197、δ1-199、δ1-201、δ1-203、δ1-253、δ1-257、δ1-278、δ1-282、δ1-285、δ2-14、δ2-17、δ2-30、δ2-31、δ2-32、δ2-33、δ2-35、δ2-36和δ2-37特异性结合的表位。
在一个方面，本公开提供鉴定刺激工程改造的和非工程改造的γδT细胞以快速生长速率扩增的药剂的表位的方法。表位可包括独特空间构象中的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸。表位可由通过蛋白质的三级折叠并置的连续氨基酸或非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常可在暴露于变性溶剂时保持，而由三级折叠形成的表位通常可在用变性溶剂处理时丧失。
可进行表位作图以鉴定线性或非线性、不连续氨基酸序列，即由所关注的活化剂(诸如TS8.2、15D、B6、TS-1和R9.12抗体)(例如，特异性)识别的表位。表位作图的一般方法需要由所关注的抗体或配体以及各种片段(即，多肽序列的截短形式，通常在异源性表达系统中)识别的全长多肽序列的表达。然后可使用这些各种重组多肽序列或其片段(例如，与N-末端蛋白(例如，GFP)融合)确定所关注的抗体或配体是否能够结合多肽序列的一种或多种截短形式。
在一些实施方案中，重组多肽序列是含有两个或多个同源亲本多肽的连接片段的嵌合体，其中至少一个亲本多肽结合所关注的活化剂，而至少一个亲本多肽不结合所关注的活化剂。例如，人δ1链基因的区段可以与同源的海豚δ链基因的区段连接，并测试在重组表达系统中生成嵌合TCR的能力。然后可以测试形成TCR(例如，由细胞表面上的泛γδ-TCR抗体的检测来表示)的嵌合TCR基因与所关注的活化剂的结合。又如，人δ2链基因的区段可以与同源的猕猴δ链基因的区段连接，并测试在重组表达系统中生成嵌合TCR的能力。然后可以测试形成TCR(例如，由细胞表面上的泛γδ-TCR抗体的检测来表示)的嵌合TCR基因与所关注的活化剂的结合。
通过使用重复截短和具有重叠氨基酸区域的重组多肽序列的产生，可以鉴定由所关注的抗体识别的多肽序列的区域(参见例如，Epitope Mapping Protocols in Methodsin Molecular Biology,第66卷,Glenn E.Morris编(1996))。该方法依赖于药剂(诸如所关注的抗体)结合从表位文库(诸如来源于膜支持物上的合成肽阵列、组合噬菌体展示肽文库的表位文库)重建的序列的能力。然后，表位文库提供针对抗体筛选的一系列可能性。另外，可进行靶向表位的一个或多个残基的定点诱变或随机丙氨酸扫描以确认表位的同一性。
通过合成设计γδT细胞受体(γδTCR)的各种可能重组作为cDNA构建体，然后在合适的系统中表达，可以创建表位文库。例如，可以合成设计Jδ区不同的多个Vδ1基因区段，包括Jδ1、Jδ2和Jδ3基因区段。或者，Vδ2Jδ1和Vδ3Jδ1链也可以以合成基因排序并克隆到合适的载体。多个合成克隆的δTCR链(诸如Vδ1Jδ1、Vδ1Jδ2、Vδ1Jδ3、Vδ1Jδ4、Vδ2和Vδ3链)可以与合成克隆的γTCR链(诸如Vγ2、Vγ3、Vγ4、Vγ5、Vγ8、Vγ9和Vγ10合成设计的基因区段)一起共转染至宿主系统。在其它情况下，可以从人PBMC提取的总RNA或从人正常和恶性组织分离的γδT细胞扩增出δTCR链(诸如Vδ1Jδ1、Vδ1Jδ2、Vδ1Jδ3、Vδ1Jδ4、Vδ2和Vδ3链)。
宿主系统可以是任何合适的表达系统(诸如293细胞、昆虫细胞)或合适的体外翻译系统。转染到宿主系统中的合成设计的γδT细胞区段的多种可能的重组可以提供例如γδTCR的超过25种、30种、35种、40种、45种、50种、55种、60种、65种、70种、75种、80种、85种或90种可能的配对组合。药剂与前述文库中的一个表位结合可以通过使标记的抗体(诸如TS8.2、15D、B6、TS-1和R9.12)与文库的表位接触，并检测来自标签的信号来检测。
对于表位作图，还开发了已显示出标绘构象不连续表位的计算算法。构象表位可以使用包括例如x射线晶体学和二维核磁共振的方法确定氨基酸的空间构象来鉴定。一些表位作图方法(诸如抗原:抗体复合物晶体的x射线分析)可以提供表位的原子解析。在其它情况下，可以利用表位作图的计算组合方法基于抗体(诸如TS-1抗体或TS8.2抗体)的序列对可能的表位建模。在这种情况下，对抗体的抗原结合部分测序，并使用计算模型重建和预测抗体的可能结合位点。
在一些情况下，本公开提供确定γδT细胞受体的表位的方法，包括：(a)从γδT细胞受体制备表位的文库；(b)使表位的文库与抗体接触；以及(b)鉴定由抗体结合的表位文库中至少一个表位的氨基酸序列。在一些情况下，抗体选自TS8.2、15D、B6、TS-1和R9.12抗体。在一个实例中，抗体附接到固体支持物。表位的文库可包含对应于T细胞受体(诸如γTCR或δTCR)的连续和不连续表位的序列。在一些情况下，表位的文库包含长度在约10个氨基酸至约30个氨基酸的范围内、长度在约10个氨基酸至约20个氨基酸的范围内或长度在约5个氨基酸至约12个氨基酸的范围内的来自γδT细胞受体的片段。在一些情况下，抗体是标记的，并且标记是放射性分子、发光分子、荧光分子、酶或生物素。
δ1表位Bin
在一些实施方案中，由所关注的活化剂(例如，特异性)识别的表位是由人Vδ1的氨基酸47-70(SKEMIFLIRQ GSDEQNA)和J1(TDKLIFGKGTRVTVEP)或J2(LTAQLFFGKGTQLIVEP)组成的表位，其中所述活化剂不结合J1或J2中含有K120T突变的表位。该表位在本文中称为Bin 1 δ1表位。结合Bin 1 δ1表位的示例性活化剂包括但不限于TS-1；和δ1-18。由于(D)(J)重组，人Vδ1 J区可以变化，具有Bin 1 δ1表位的γδTCR的δ1链的示例性Vδ1 J区是SKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGTGVRGLQDTDKLIFGKGTRVTVEP；γδTCR的δ1链的另一个示例性Vδ1 J区Bin 1 δ1表位是SKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGEAPSAWGKHLTAQLFFGKGTQLIVEP。
在一些情况下，结合Bin 1 δ1表位的活化剂结合具有以下序列的γδTCR的δ1链：
AQKVTQAQSSVSMPVRKAVTLNCLYETSWWSYYIFWYKQLPSKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGTGVRGLQDTDKLIFGKGTRVTVEP；但不结合具有以下序列的γδTCR的δ1链：
结合Bin 1 δ1表位的活化剂也可以结合具有以下序列的γδTCR的δ1链：
在一些实施方案中，由所关注的活化剂(例如，特异性)识别的表位是由人Vδ1的氨基酸47-70(SKEMIFLIRQ GSDEQNA)和J1(TDKLIFGKGTRVTVEP)组成的表位，其中所述活化剂不结合J1中含有K120T突变的表位。该表位在本文中称为Bin 1b δ1表位。结合Bin 1b δ1表位的示例性活化剂包括但不限于δ1-37。具有Bin 1b δ1表位的γδTCR的δ1链的示例性Vδ1J区是SKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGTGVRGLQDTDKLIFGKGTRVTVEP。
在一些情况下，结合Bin 1b δ1表位的活化剂结合具有以下序列的γδTCR的δ1链：
AQKVTQAQSSVSMPVRKAVTLNCLYETSWWSYYIFWYKQLPSKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGTGVRGLQDTDKLIFGKGTRVTVEP；但不结合具有以下序列的γδTCR的δ1链：
结合Bin 1b δ1表位的活化剂也不结合具有以下序列的γδTCR的δ1链：
在一些实施方案中，由所关注的活化剂(例如，特异性)识别的表位是由人Vδ1的氨基酸11-21(VSMPVRKAVTL)组成的表位。该表位在本文中称为Bin 2 δ1表位。结合Bin 2 δ1表位的示例性活化剂包括但不限于和δ1-285。
在一些情况下，结合Bin 2 δ1表位的活化剂结合具有以下序列的γδTCR的δ1链：
AQKVTQAQSSVSMPVRKAVTLNCLYETSWWSYYIFWYKQLPSKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGTGVRGLQDTDKLIFGKGTRVTVEP；但不结合具有以下序列的γδTCR的δ1链：
在一些实施方案中，由所关注的活化剂(例如，特异性)识别的表位是由人Vδ1的氨基酸11-21(VSMPVRKAVTL)组成的表位，其中结合该表位的活化剂不结合Vδ1中含有R16突变(诸如R16N突变)的表位。该表位在本文中称为Bin 2b δ1表位。结合Bin 2b δ1表位的示例性活化剂包括但不限于R9.12。
在一些情况下，结合Bin 2b δ1表位的活化剂结合具有以下序列的γδTCR的δ1链：
AQKVTQAQSSVSMPVRKAVTLNCLYETSWWSYYIFWYKQLPSKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGTGVRGLQDTDKLIFGKGTRVTVEP；但不结合具有以下序列的γδTCR的δ1链：
AQKVTQAQSSVSMPVNKAVTLNCLYETSWWSYYIFWYKQLPSKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGTGVRGLQDTDKLIFGKGTRVTVEP；和/或不结合具有以下序列的γδTCR的δ1链：
在一些实施方案中，由所关注的活化剂(例如，特异性)识别的表位是由人Vδ1的氨基酸11-21(VSMPVRKAVTL)组成的表位，其中结合该表位的活化剂还与δ3、δ4和δ5γδTCR结合(交叉反应)。该表位在本文中称为Bin 2c δ1表位。结合Bin 2c δ1表位的示例性活化剂包括但不限于δ1-39。
在一些情况下，结合Bin 2c δ1表位的活化剂结合具有以下序列的γδTCR的δ1链：
AQKVTQAQSSVSMPVRKAVTLNCLYETSWWSYYIFWYKQLPSKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGTGVRGLQDTDKLIFGKGTRVTVEP；但不结合具有以下序列的γδTCR的δ1链：
在一些实施方案中，由所关注的活化剂(例如，特异性)识别的表位是由人Vδ1的氨基酸80-95(FKKAAKSVALTISALQ)或人Vδ1的氨基酸70至95(AKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQ)组成的表位。该表位在本文中称为Bin 3 δ1表位。结合Bin 3 δ1表位的示例性活化剂包括但不限于δ1-08；和δ1-23。
在一些情况下，结合Bin 3 δ1表位的活化剂结合具有以下序列的γδTCR的δ1链：
但不结合具有以下序列的γδTCR的δ1链：
在一些实施方案中，由所关注的活化剂(例如，特异性)识别的表位是由人Vδ1的氨基酸1-11(AQKVTQAQSSV)和J1或J2组成的表位。该表位在本文中称为Bin 4 δ1表位。在一些情况下，结合活化剂的Bin 4 δ1表位不结合J1或J2中含有K120T突变的表位。结合Bin 4 δ1表位的示例性活化剂包括但不限于δ1-35；和δ1-203。
在一些情况下，结合Bin 4 δ1表位的活化剂结合具有以下序列的γδTCR的δ1链：
AQKVTQAQSSVSMPVRKAVTLNCLYETSWWSYYIFWYKQLPSKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGTGVRGLQDTDKLIFGKGTRVTVEP；但不结合具有以下序列的γδTCR的δ1链：
在一些情况下，结合Bin 4 δ1表位的活化剂结合具有以下序列的γδTCR的δ1链：
在一些实施方案中，由所关注的活化剂(例如，特异性)识别的表位是由人Vδ1的氨基酸28-47(SWWSYYIFWYKQLPS)和J1组成的表位。该表位在本文中称为Bin 5 δ1表位。结合Bin 5 δ1表位的示例性活化剂包括但不限于δ1-113；δ1-155；δ1-183；δ1-191；δ1-278；和δ1-282。具有Bin 5 δ1表位的γδTCR的δ1链的示例性Vδ1 J1区是
SWWSYYIFWYKQLPSKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGTGVRGLQDTDKLIFGKGTRVTVEP。
在一些情况下，结合Bin 5 δ1表位的活化剂结合具有以下序列的γδTCR的δ1链：
AQKVTQAQSSVSMPVRKAVTLNCLYETSWWSYYIFWYKQLPSKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGTGVRGLQDTDKLIFGKGTRVTVEP；但不结合具有以下序列的γδTCR的δ1链：
在一些实施方案中，由所关注的活化剂(例如，特异性)识别的表位是由人Vδ1的氨基酸21-28(LNCLYETS)和J1组成的表位。该表位在本文中称为Bin 6 δ1表位。结合Bin 6 δ1表位的示例性活化剂包括但不限于TS 8.2和δ1-143。具有Bin 6 δ1表位的γδTCR的δ1链的示例性Vδ1 J1区是
在一些情况下，结合Bin 6 δ1表位的活化剂结合具有以下序列的γδTCR的δ1链：
AQKVTQAQSSVSMPVRKAVTLNCLYETSWWSYYIFWYKQLPSKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGTGVRGLQDTDKLIFGKGTRVTVEP；但不结合具有以下序列的γδTCR的δ1链：
在一些实施方案中，由所关注的活化剂(例如，特异性)识别的表位是由人Vδ1的氨基酸47-70(SKEMIFLIRQGSDEQNA)和J1或J2组成的表位。该表位在本文中称为Bin 7 δ1表位。结合Bin 7 δ1表位的示例性活化剂包括但不限于δ1-149；δ1-253和δ1-257。具有Bin 7δ1表位的γδTCR的δ1链的示例性Vδ1 J区是SKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGTGVRGLQDTDKLIFGKGTRVTVEP；γδTCR的δ1链的另一个示例性Vδ1 J区Bin 7δ1表位是SKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGEAPSAWGKHLTAQLFFGKGTQLIVEP。
在一些情况下，结合Bin 7 δ1表位的活化剂结合具有以下序列的γδTCR的δ1链：
AQKVTQAQSSVSMPVRKAVTLNCLYETSWWSYYIFWYKQLPSKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGTGVRGLQDTDKLIFGKGTRVTVEP；但不结合具有以下序列的γδTCR的δ1链：
在一些实施方案中，由所关注的活化剂(例如，特异性)识别的表位是由人Vδ1的氨基酸70-80(AKSGRYSVNF)和J1或J2组成的表位。该表位在本文中称为Bin 8 δ1表位。结合Bin 8 δ1表位的示例性活化剂包括但不限于δ1-192。具有Bin 8 δ1表位的γδTCR的δ1链的示例性Vδ1 J区是AKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGTGVRGLQDTDKLIFGKGTRVTVEP；γδTCR的δ1链的另一个示例性Vδ1 J区Bin 8 δ1表位是AKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGEAPSAWGKHLTAQLFFGKGTQLIVEP。
在一些情况下，结合Bin 8 δ1表位的活化剂结合具有以下序列的γδTCR的δ1链：
AQKVTQAQSSVSMPVRKAVTLNCLYETSWWSYYIFWYKQLPSKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGTGVRGLQDTDKLIFGKGTRVTVEP；但不结合具有以下序列的γδTCR的δ1链：
在一些实施方案中，由所关注的活化剂(例如，特异性)识别的表位是由人Vδ1的氨基酸80-95(FKKAAKSVALTISALQ)组成的表位。该表位在本文中称为Bin 9 δ1表位。结合Bin9 δ1表位的示例性活化剂包括但不限于δ1-201。
在一些情况下，结合Bin 9 δ1表位的活化剂结合具有以下序列的γδTCR的δ1链：
AQKVTQAQSSVSMPVRKAVTLNCLYETSWWSYYIFWYKQLPSKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGTGVRGLQDTDKLIFGKGTRVTVEP；但不结合具有以下序列的γδTCR的δ1链
相对于含有δ2的γδ-TCR，本文所述的δ1特异性抗体选择性结合含有δ1的γδ-TCR。因此，前述δ1特异性抗体不结合例如以下序列和/或包含以下序列的γδ-TCR：
δ2表位Bin
在一些实施方案中，由所关注的活化剂(例如，特异性)识别的表位是由人Vδ2的氨基酸83-94(AKNLAVLKILAP)组成的表位。该表位在本文中称为Bin 1 δ2表位。在一些情况下，结合Bin 1 δ2表位的活化剂不结合Vδ2中含有K90突变(诸如K90N突变)的表位。结合Bin1 δ2表位的示例性活化剂包括但不限于δ2-17和B6。
在一些情况下，结合Bin 1 δ2表位的活化剂结合具有以下序列的γδTCR的δ2链
AIELVPEHQTVPVSIGVPATLRCSMKGEAIGNYYINWYRKTQGNTMTFIYREKDIYGPGFKDNFQGDIDIAKNLAVLKILAPSERDEGSYYCACDPLGGPPDKLIFGKGTRVTVEP；但不结合具有以下序列的γδTCR的δ2链：
在一些实施方案中，由所关注的活化剂(例如，特异性)识别的表位是由人Vδ2的氨基酸28-38(EAIGNYY)组成的表位。该表位在本文中称为Bin 2 δ2表位。在一些情况下，结合Bin 2 δ2表位的活化剂不结合Vδ2中含有G35突变(诸如G35S突变)的表位。结合Bin 2 δ2表位的示例性活化剂包括但不限于15D。
在一些情况下，结合Bin 2 δ2表位的活化剂结合具有以下序列的γδTCR的δ2链：
AIELVPEHQTVPVSIGVPATLRCSMKGEAIGNYYINWYRKTQGNTMTFIYREKDIYGPGFK.DNFQGDIDIAKNLAVLKILAPSERDEGSYYCACDPLGGPPDKLIFGKGTRVTVEP；但不结合具有以下序列的γδTCR的δ2链：
在一些实施方案中，由所关注的活化剂(例如，特异性)识别的表位是由人Vδ2的氨基酸72-83(KDNFQGDIDIA)组成的表位。该表位在本文中称为Bin 3 δ2表位。结合Bin 3 δ2表位的示例性活化剂包括但不限于δ2-32。
在一些情况下，结合Bin 3 δ2表位的活化剂结合具有以下序列的γδTCR的δ2链：
AIELVPEHQTVPVSIGVPATLRCSMKGEAIGNYYINWYRKTQGNTMTFIYREKDIYGPGFK.DNFQGDIDIAKNLAVLKILAPSERDEGSYYCACDPLGGPPDKLIFGKGTRVTVEP；但不结合具有以下序列的γδTCR的δ2链：
在一些实施方案中，由所关注的活化剂(例如，特异性)识别的表位是由人Vδ2的氨基酸1-27(AIELVPEHQTVPVSIGVPATLRCSMKG)组成的表位。该表位在本文中称为Bin 4 δ2表位。结合Bin 4 δ2表位的示例性活化剂包括但不限于δ2-14；δ2-22；δ2-30；δ2-31；δ2-36；和δ2-37。
在一些情况下，结合Bin 4 δ2表位的活化剂结合具有以下序列的γδTCR的δ2链：
AIELVPEHQTVPVSIGVPATLRCSMKGEAIGNYYINWYRKTQGNTMTFIYREKDIYGPGFK.DNFQGDIDIAKNLAVLKILAPSERDEGSYYCACDPLGGPPDKLIFGKGTRVTVEP；但不结合具有以下序列的γδTCR的δ2链：
相对于含有δ1的γδ-TCR，本文所述的δ2特异性抗体选择性结合含有δ2的γδ-TCR。因此，前述δ2特异性抗体不结合例如以下序列和/或包含以下序列的γδ-TCR：
一般来讲，在γδ-TCR的背景下，本文所述的δ1和δ2特异性抗体识别构象表位。在一些情况下，本文所述的δ1和δ2特异性抗体分别对一对或多对γδ1或γδ2 TCR具有特异性。例如，在一些情况下，本文所述的δ1特异性抗体对γ8δ1-TCR具有特异性。在一些情况下，本文所述的δ1特异性抗体结合γ8δ1-TCR，但不结合γ9δ1-TCR。
治疗方法
可以施用含有本文所述的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物的药物组合物用于预防性和/或治疗性治疗。在治疗应用中，组合物可以足以治愈或至少部分阻止疾病或病症的症状的量施用于已患有疾病或病症的受试者。还可施用非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物以降低患上、感染或恶化病症的可能性。一群非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物用于治疗用途的有效量可根据疾病或病症的严重性和进程、先前疗法、受试者的健康状况、体重和/或对药物的反应和/或主治医生的判断而变化。
本公开的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可用于治疗需要进行病症治疗的受试者。病症的实例包括癌症、感染性疾病、自体免疫疾病和败血症。受试者可以是人、非人灵长类动物，诸如黑猩猩以及其它猿类和猴类物种；农场动物，诸如牛、马、绵羊、山羊、猪；家畜，诸如兔、狗和猫；实验动物，包括啮齿动物，诸如大鼠、小鼠和豚鼠等等。受试者可以是任何年龄的。受试者可以是例如老年人、成人、青少年、青春前期少年、儿童、幼儿、婴儿。
使用本发明的富集的γδT细胞群治疗受试者的病症(例如，疾病)的方法可包括将治疗有效量的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物施用于受试者。本公开的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可以以多种方案(例如，时间安排、浓度、剂量、治疗间间隔和/或制剂)施用。受试者也可以在接受本公开的富集的γδT细胞群和/或其掺和物之前使用例如化学疗法、放射疗法或它们二者的组合预处理。作为治疗的一部分，非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可以以第一方案施用于受试者，并且可以监测受试者以确定第一方案治疗是否达到给定的治疗功效水平。在一些情况下，工程改造的γδT细胞或另一种工程改造的γδT细胞可以以第二方案施用于受试者。图2示意性地展示了用于治疗受试者的方法。在第一操作201中，将至少一种工程改造的γδT细胞施用于患有或怀疑患有给定病症(例如，癌症)的受试者。工程改造的γδT细胞可以以第一方案施用。在第二操作202中，可以例如由保健提供者(例如，主治医生或护士)监测受试者。在一些实例中，监测受试者以确定或测量工程改造的γδT细胞在治疗受试者病症中的功效。在一些情况下，还可以监测受试者以确定受试者中γδT细胞群的体内扩增。接下来，在第三操作203中，将至少一种另外的工程改造的γδT细胞以第二方案施用于受试者。第二方案可以与第一方案相同或与第一方案不同。在一些情况下，不进行第三操作203，例如如果发现第一操作201中工程改造的γδT细胞的施用有效(例如，单轮施用足以治疗病症)。由于工程改造的γδT细胞群的同种异体和通用供体特征，它们可以以不同的MHC单体型施用于多名受试者。工程改造的γδT细胞可以在施用于受试者之前冷冻或超低温保存。
富集的γδT细胞群(即，工程改造的或非工程改造的)和/或其掺和物也可以在施用于受试者之前冷冻或超低温保存。在某些实施方案中，工程改造的富集的γδT细胞群可以包含两种或多种表达相同的肿瘤识别部分、不同的肿瘤识别部分或相同的肿瘤识别部分和不同的肿瘤识别部分的组合的细胞。例如，工程改造的富集的γδT细胞群可以包含设计为识别不同的抗原或相同抗原的不同表位的几种不同的工程改造的γδT细胞。例如，人黑素瘤细胞可表达NY-ESO-1癌基因。人体内的感染细胞可以将NY-ESO-1癌蛋白加工为小片段，并提供用于抗原识别的NY-ESO-1蛋白的多个部分。工程改造的富集的γδT细胞群可以包含多种表达不同的肿瘤识别部分的工程改造的γδT细胞，所述肿瘤识别部分设计为识别NY-ESO-1蛋白的不同部分。图3示意性地展示了使用识别黑素瘤抗原NY-ESO-1的不同表位的工程改造的γδT细胞群来治疗受试者的方法。在第一操作301中，选择识别相同抗原的不同表位的工程改造的γδT细胞群。例如，工程改造的γδT细胞群可包含两种或多种表达不同的肿瘤识别部分的细胞，所述肿瘤识别部分识别NY-ESO-1蛋白的不同部分。在第二操作302中，工程改造的γδT细胞群可以以第一方案施用。在第二操作303中，可以例如由保健提供者(例如，主治医生或护士)监测受试者。
本公开的富集的γδT细胞群(即，非工程改造的或工程改造的)和/或其掺和物可用于治疗各种病症。在一些情况下，本公开的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可用于治疗癌症(包括实体瘤和血液恶性肿瘤)。癌症的非限制性实例包括：急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、神经母细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑肿瘤(诸如小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤)、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视路和下丘脑神经胶质瘤、乳腺癌、支气管腺瘤、伯基特(Burkitt)淋巴瘤、原发部位不明癌症、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、宫颈癌、儿童期癌症、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓增生性疾病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤文氏(Ewing)肉瘤、生殖细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道基质肿瘤、神经胶质瘤、多毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞(肝)癌、霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤、下咽癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、卡波西氏(Kaposi)肉瘤、肾癌、喉癌、唇和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌(诸如非小细胞和小细胞肺癌)、淋巴瘤、白血病、巨球蛋白血症、骨/骨肉瘤的恶性纤维性组织细胞瘤、髓母细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、转移性原发不明颈部鳞状细胞癌、口腔癌、多发性内分泌腺肿瘤综合征、骨髓增生异常综合征、骨髓性白血病、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、上皮性卵巢癌、卵巢生殖细胞肿瘤、胰腺癌、胰腺癌胰岛细胞、鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、口咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、垂体腺瘤、胸膜肺母细胞瘤、浆细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、皮肤癌默克(merkel)细胞、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、T细胞淋巴瘤、咽喉癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、滋养叶肿瘤(妊娠)、原发灶不明的癌症、尿道癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、华氏巨球蛋白血症和威廉姆氏(Wilms)肿瘤。
在一些情况下，本公开的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可用于治疗感染性疾病。感染性疾病可以例如由病原性细菌或由病毒引起。多种病原性蛋白质、核酸、脂质或其片段可由病变细胞表达。抗原呈递细胞可以例如通过吞噬作用或通过受体介导的胞吞作用内化此类病原性分子，并且展示出结合至适当的MHC分子的抗原片段。例如，APC可以展示出病原性蛋白的多种9聚物片段。本公开的工程改造的富集的γδT细胞群可设计为识别病原性细菌或病毒的多种抗原和抗原片段。病原性细菌的非限制性实例可见于：a)博德特氏菌属(Bordetella)，诸如百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)种；b)疏螺旋体属(Borrelia)，诸如伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)种；c)布鲁氏菌属(Brucelia)，诸如流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、犬布鲁氏菌(Brucella canis)、马尔他布鲁氏菌(Brucela meliterisis)和/或猪布鲁氏菌(Brucella suis)种；d)弯曲杆菌属(Campylobacter)，诸如空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)种；e)衣原体属(Chlamydia)和亲衣原体属(Chlamydophila)，诸如肺炎衣原体(Chlamydia pneumonia)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)和/或鹦鹉热衣原体(Chlamydophila psittaci)种；f)梭菌属(Clostridium)，诸如肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)种；g)棒状杆菌属(Corynebacterium)，诸如白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)种；h)肠球菌属(Enterococcus)，诸如粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和/或屎肠球菌(Enterococcus faecium)种；i)埃希氏菌属(Escherichia)，诸如大肠杆菌(Escherichia coli)种；j)弗朗西斯氏菌属(Francisella)，诸如土拉热弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)种；k)嗜血杆菌属(Haemophilus)，诸如流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)种；l)螺杆菌属(Helicobacter)，诸如幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)种；m)军团菌属(Legionella)，诸如嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)种；n)钩端螺旋体属(Leptospira)，诸如问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)种；o)李斯特菌属(Listeria)，诸如单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)种；p)分枝杆菌属(Mycobacterium)，诸如麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)和/或溃疡分枝杆菌(mycobacterium ulcerans)种；q)支原体属(Mycoplasma)，诸如肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia)种；r)奈瑟氏菌属(Neisseria)，诸如淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)和/或脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidia)种；s)假单胞菌属(Pseudomonas)，诸如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)种；t)立克次氏体属(Rickettsia)，诸如立氏立克次氏体(Rickettsia rickettsii)种；u)沙门氏菌属(Salmonella)，诸如伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)和/或鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)种；v)志贺氏菌属(Shigella)，诸如宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)种；w)葡萄球菌属(Staphylococcus)，诸如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和/或腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)种；x)链球菌属(Streptpcoccus)，诸如无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)和/或酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)种；y)密螺旋体属(Treponema)，诸如梅毒密螺旋体(Treponema pallidum)种；z)弧菌属(Vibrio)，诸如霍乱弧菌(Vibrio cholera)；和/或aa)耶尔森氏菌属(Yersinia)，诸如鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)种。
在一些情况下，本公开的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可用于治疗感染性疾病，感染性疾病可由病毒导致。病毒的非限制性实例可见于以下病毒科，并用示例性种说明：a)腺病毒科(Adenoviridae)，诸如腺病毒种；b)疱疹病毒科(Herpesviridae)，诸如单纯疱疹1型、单纯疱疹2型、水痘-带状疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔(Epstein-barr)病毒、人巨细胞病毒、人疱疹病毒8型种；c)乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)，诸如人乳头瘤病毒种；d)多瘤病毒科(Polyomaviridae)，诸如BK病毒、JC病毒种；e)痘病毒科(Poxviridae)，诸如天花种；f)肝病毒科(Hepadnaviridae)，诸如乙肝病毒种；g)细小病毒科(Parvoviridae)，诸如人博卡病毒、细小病毒B19种；h)星状病毒科(Astroviridae)，诸如人星状病毒种；i)杯状病毒科(Caliciviridae)，诸如诺沃克病毒种；j)黄病毒科(Flaviviridae)，诸如丙肝病毒(HCV)、黄热病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒种；k)披膜病毒科(Togaviridae)，诸如风疹病毒种；l)肝炎病毒科(Hepeviridae)，诸如戊肝病毒种；m)逆转录病毒科(Retroviridae)，诸如人免疫缺陷病毒(HIV)种；n)正黏液病毒科(Orthomyxoviridaw)，诸如流感病毒种；o)沙状病毒科(Arenaviridae)，诸如瓜纳瑞托(Guanarito)病毒、胡宁(Junin)病毒、拉沙(Lassa)病毒、马秋波(Machupo)病毒和/或萨比亚(Sabiá)病毒种；p)本雅病毒科(Bunyaviridae)，诸如克里米亚-刚果(Crimean-Congo)出血热病毒种；q)丝状病毒科(Filoviridae)，诸如埃博拉(Ebola)病毒和/或马尔堡(Marburg)病毒种；副黏液病毒科(Paramyxoviridae)，诸如麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、亨德拉(Hendra)病毒和/或尼帕(Nipah)病毒种；r)弹状病毒属(Rhabdoviridae)，诸如狂犬病毒种；s)呼肠孤病毒科(Reoviridae)，诸如轮状病毒、环状病毒、科罗拉多壁虱热病毒和/或版纳(Banna)病毒种。在一些实例中，病毒未分配至病毒科，诸如丁型肝炎。
在一些情况下，本公开的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可用于治疗免疫疾病，诸如自体免疫疾病。炎性疾病(包括自体免疫疾病)也是B细胞疾病相关的疾病类别。免疫疾病或病症(包括自体免疫病症)的实例包括：类风湿性关节炎、风湿热、多发性硬化、实验性自体免疫脑脊髓炎、牛皮癣、葡萄膜炎、糖尿病、全身性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎、湿疹、硬皮病、多发性肌炎/硬皮病、多发性肌炎/皮肌炎、溃疡性结肠炎、严重联合免疫缺陷症(SCID)、迪乔治(DiGeorge)综合征、共济失调性毛细血管扩张症、季节性过敏、常年性过敏、食物过敏、过敏反应、肥大细胞增生症、过敏性鼻炎、异位性皮肤炎、帕金森氏症(Parkinson)、阿尔茨海默氏症(Alzheimer)、脾功能亢进、白细胞粘附缺陷、X-连锁淋巴细胞增生性疾病、X-连锁无丙种球蛋白血症、选择性免疫球蛋白A缺乏、高IgM综合征、HIV、自体免疫淋巴细胞增生性综合征、维斯科特-奥尔德里(Wiskott-Aldrich)综合征、慢性肉芽肿病、常见变异型免疫缺陷病(CVID)、高免疫球蛋白E综合征、桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎、急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、辛登南氏(Sydenham)舞蹈症、重症肌无力、多腺体综合征、大疱性类天疱疮、过敏性紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、多形性红斑、gA肾病、高安氏(Takayasu)动脉炎、爱迪生氏(Addison)病、结节病、溃疡性结肠炎、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、古巴斯捷氏(Goodpasture)综合征、闭塞性血栓血管炎、修格连氏(Sjogren)综合征、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎、甲状腺毒症、慢性活动性肝炎、多软骨炎、寻常型天疱疮、韦格纳(Wegener)肉芽肿、膜性肾病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、骨髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎、银屑病、纤维化肺泡炎和癌症。
使用本公开的γδT细胞群和/或其掺和物治疗可以在病症的临床发作之前、期间和之后提供给受试者。治疗可以在疾病的临床发作之后1天、1周、6个月、12个月或2年后提供给受试者。治疗可以在疾病的临床发作之后提供给受试者持续超过1天、1周、1个月、6个月、12个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或更长时间。治疗可以在疾病的临床发作之后提供给受试者持续少于1天、1周、1个月、6个月、12个月或2年。治疗还可以包括在临床试验中治疗人。治疗可以包括将包含本公开的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物的药物组合物施用于受试者。
在一些情况下，本公开的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物施用于受试者调节了受试者体内的内源性淋巴细胞的活性。在一些情况下，非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物施用于受试者提供了内源性T细胞的抗原，并且可加强免疫应答。在一些情况下，记忆T细胞是CD4+ T细胞。在一些情况下，记忆T细胞是CD8+ T细胞。在一些情况下，非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物施用于受试者活化了另一种免疫细胞的细胞毒性。在一些情况下，另一种免疫细胞是CD8+ T细胞。在一些情况下，另一种免疫细胞是自然杀伤T细胞。在一些情况下，非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物施用于受试者抑制了调节T细胞。在一些情况下，调节T细胞是Fox3+Treg细胞。在一些情况下，调节T细胞是Fox3-Treg细胞。活性可由本公开的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物调节的细胞的非限制性实例包括：造血干细胞；B细胞；CD4；CD8；红细胞；白细胞；树突状细胞，包括树突状抗原呈递细胞；白血球；巨噬细胞；记忆B细胞；记忆T细胞；单核细胞；自然杀伤细胞；嗜中性粒细胞；辅助T细胞；和杀伤T细胞。
在大多数骨髓移植期间，环磷酰胺与全身辐射的组合通常用于防止受试者的免疫系统对移植物中的造血干细胞(HSC)产生排斥反应。在一些情况下，进行供体骨髓与白介素-2(IL-2)的离体孵育，以增强供体骨髓中杀伤淋巴细胞的产生。白介素-2(IL-2)是野生型淋巴细胞的生长、增殖和分化必需的细胞因子。目前关于γδT细胞过继性转移到人体中的研究需要γδT细胞和白介素-2的共施用。然而，低剂量和高剂量的IL-2均可具有剧毒副作用。IL-2毒性可在多个器官/系统中表现出来，最显著的是心脏、肺、肾和中枢神经系统。在一些情况下，本公开提供了在不与细胞因子(诸如IL-2、IL-15、IL-12或IL-21)共施用的情况下，将非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物施用于受试者的方法。在一些情况下，非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可以在不与IL-2共施用的情况下施用于受试者。在一些情况下，非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物在手术(诸如在不与IL-2共施用的情况下的骨髓移植)期间施用于受试者。
施用方法
本发明的一种或多种非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可以任何顺序或同时施用于受试者。如果同时施用，则本发明的多种非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可以单一、统一形式提供(诸如静脉内注射)，或以多种形式提供(例如以多种静脉内输注、皮下注射或丸剂提供)。本发明的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可以一起或分开包装于单个包装中或多个包装中。本发明的一种或全部非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可以多个剂量给予。如果不同时施用，多个剂量之间的时间安排可以变化至大约一周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或约一年。在一些情况下，在施用于受试者之后，本发明的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可以在受试者的身体内体内扩增。可以冷冻非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物，以提供用于使用相同的细胞制剂进行的多次治疗的细胞。本公开的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物，以及包含它们的药物组合物可以包装为试剂盒。试剂盒可包括非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物，以及包含它们的组合物的使用说明(例如，书面说明)。
在一些情况下，治疗癌症的方法包括将治疗有效量的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物施用于受试者，其中所述施用治疗癌症。在一些实施方案中，施用治疗有效量的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物持续至少约10秒、30秒、1分钟、10分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或1年。在一些实施方案中，施用治疗有效量的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物持续至少一周。在一些实施方案中，施用治疗有效量的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物持续至少两周。
本文所述的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可以在疾病或病症发生之前、期间或之后施用，并且施用含有非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物的药物组合物的时间安排可以变化。例如，非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可以用作预防性用途，并且可以根据病症或疾病偏好连续施用于受试者，以降低疾病或病症发生的可能性。非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可在症状的发作期间或之后尽快施用于受试者。非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物的施用可以在症状发作时立即、在症状发作的前3小时内、在症状发作的前6小时内、在症状发作的前24小时内、在症状发作的前48小时内或在症状发作的任何时期开始。初始施用可以通过任何实用途径进行，诸如使用本文所述的任何制剂通过本文所述的任何途径进行。在一些实例中，本公开的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物的施用是静脉内施用。一个或多个剂量的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可以在癌症、感染性疾病、免疫疾病、败血症发作或骨髓移植之后尽快施用持续治疗免疫疾病所需的时间长度，例如约24小时至约48小时、约48小时至约1周、约1周至约2周、约2周至约1个月、约1个月至约3个月。对于癌症的治疗，一个或多个剂量的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可以在癌症发作之后以及在其它治疗之前或之后几年施用。在一些实例中，非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可以施用持续至少约10分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、24小时、至少48小时、至少72小时、至少96小时、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少1年、至少2年、至少3年、至少4年或至少5年。每位受试者的治疗长度可以变化。
剂量
本文公开的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可以配制为适于精确剂量的单次施用的单位剂型。在一些情况下，单位剂型包含另外的淋巴细胞。在单位剂型中，制剂被分成含有适量的一种或多种化合物的单位剂量。单位剂量可以是含有不连续量的制剂的包装的形式。非限制性实例为包装片剂或胶囊剂以及小瓶或安瓿瓶中的粉剂。水性混悬剂组合物可以包装在单剂量不可重复开启式容器中。多剂量可重复开启式容器可以例如与防腐剂或不与防腐剂组合使用。在一些实例中，药物组合物不包含防腐剂。用于肠胃外注射的制剂可以以单位剂型存在于例如安瓿瓶或含防腐剂的多剂量容器中。
本文所述的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可以以至少5个细胞、至少10个细胞、至少20个细胞、至少30个细胞、至少40个细胞、至少50个细胞、至少60个细胞、至少70个细胞、至少80个细胞、至少90个细胞、至少100个细胞、至少200个细胞、至少300个细胞、至少400个细胞、至少500个细胞、至少600个细胞、至少700个细胞、至少800个细胞、至少900个细胞、至少1x103个细胞、至少2x103个细胞、至少3x103个细胞、至少4x103个细胞、至少5x103个细胞、至少6x103个细胞、至少7x103个细胞、至少8x103个细胞、至少9x103个细胞、至少1x104个细胞、至少2x104个细胞、至少3x104个细胞、至少4x104个细胞、至少5x104个细胞、至少6x104个细胞、至少7x104个细胞、至少8x104个细胞、至少9x104个细胞、至少1x105个细胞、至少2x105个细胞、至少3x105个细胞、至少4x105个细胞、至少5x105个细胞、至少6x105个细胞、至少7x105个细胞、至少8x105个细胞、至少9x105个细胞、至少1x106个细胞、至少2x106个细胞、至少3x106个细胞、至少4x106个细胞、至少5x106个细胞、至少6x106个细胞、至少7x106个细胞、至少8x106个细胞、至少9x106个细胞、至少1x107个细胞、至少2x107个细胞、至少3x107个细胞、至少4x107个细胞、至少5x107个细胞、至少6x107个细胞、至少7x107个细胞、至少8x107个细胞、至少9x107个细胞、至少1x108个细胞、至少2x108个细胞、至少3x108个细胞、至少4x108个细胞、至少5x108个细胞、至少6x108个细胞、至少7x108个细胞、至少8x108个细胞、至少9x108个细胞、至少1x109细胞或更多的量存在于组合物中。
本发明的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物的治疗有效剂量可以是约1个细胞至约10个细胞、约1个细胞至约100个细胞、约1个细胞至约10个细胞、约1个细胞至约20个细胞、约1个细胞至约30个细胞、约1个细胞至约40个细胞、约1个细胞至约50个细胞、约1个细胞至约60个细胞、约1个细胞至约70个细胞、约1个细胞至约80个细胞、约1个细胞至约90个细胞、约1个细胞至约100个细胞、约1个细胞至约1x103个细胞、约1个细胞至约2x103个细胞、约1个细胞至约3x103个细胞、约1个细胞至约4x103个细胞、约1个细胞至约5x103个细胞、约1个细胞至约6x103个细胞、约1个细胞至约7x103个细胞、约1个细胞至约8x103个细胞、约1个细胞至约9x103个细胞、约1个细胞至约1x104个细胞、约1个细胞至约2x104个细胞、约1个细胞至约3x104个细胞、约1个细胞至约4x104个细胞、约1个细胞至约5x104个细胞、约1个细胞至约6x104个细胞、约1个细胞至约7x104个细胞、约1个细胞至约8x104个细胞、约1个细胞至约9x104个细胞、约1个细胞至约1x105个细胞、约1个细胞至约2x105个细胞、约1个细胞至约3x105个细胞、约1个细胞至约4x105个细胞、约1个细胞至约5x105个细胞、约1个细胞至约6x105个细胞、约1个细胞至约7x105个细胞、约1个细胞至约8x105个细胞、约1个细胞至约9x105个细胞、约1个细胞至约1x106个细胞、约1个细胞至约2x106个细胞、约1个细胞至约3x106个细胞、约1个细胞至约4x106个细胞、约1个细胞至约5x106个细胞、约1个细胞至约6x106个细胞、约1个细胞至约7x106个细胞、约1个细胞至约8x106个细胞、约1个细胞至约9x106个细胞、约1个细胞至约1x107个细胞、约1个细胞至约2x107个细胞、约1个细胞至约3x107个细胞、约1个细胞至约4x107个细胞、约1个细胞至约5x107个细胞、约1个细胞至约6x107个细胞、约1个细胞至约7x107个细胞、约1个细胞至约8x107个细胞、约1个细胞至约9x107个细胞、约1个细胞至约1x108个细胞、约1个细胞至约2x108个细胞、约1个细胞至约3x108个细胞、约1个细胞至约4x108个细胞、约1个细胞至约5x108个细胞、约1个细胞至约6x108个细胞、约1个细胞至约7x108个细胞、约1个细胞至约8x108个细胞、约1个细胞至约9x108个细胞或约1个细胞至约1x109个细胞。
在一些情况下，本发明的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物的治疗有效剂量可以是约1x103个细胞至约2x103个细胞、约1x103个细胞至约3x103个细胞、约1x103个细胞至约4x103个细胞、约1x103个细胞至约5x103个细胞、约1x103个细胞至约6x103个细胞、约1x103个细胞至约7x103个细胞、约1x103个细胞至约8x103个细胞、约1x103个细胞至约9x103个细胞、约1x103个细胞至约1x104个细胞、约1x103个细胞至约2x104个细胞、约1x103个细胞至约3x104个细胞、约1x103个细胞至约4x104个细胞、约1x103个细胞至约5x104个细胞、约1x103个细胞至约6x104个细胞、约1x103个细胞至约7x104个细胞、约1x103个细胞至约8x104个细胞、约1x103个细胞至约9x104个细胞、约1x103个细胞至约1x105个细胞、约1x103个细胞至约2x105个细胞、约1x103个细胞至约3x105个细胞、约1x103个细胞至约4x105个细胞、约1x103个细胞至约5x105个细胞、约1x103个细胞至约6x105个细胞、约1x103个细胞至约7x105个细胞、约1x103个细胞至约8x105个细胞、约1x103个细胞至约9x105个细胞、约1x103个细胞至约1x106个细胞、约1x103个细胞至约2x106个细胞、约1x103个细胞至约3x106个细胞、约1x103个细胞至约4x106个细胞、约1x103个细胞至约5x106个细胞、约1x103个细胞至约6x106个细胞、约1x103个细胞至约7x106个细胞、约1x103个细胞至约8x106个细胞、约1x103个细胞至约9x106个细胞、约1x103个细胞至约1x107个细胞、约1x103个细胞至约2x107个细胞、约1x103个细胞至约3x107个细胞、约1x103个细胞至约4x107个细胞、约1x103个细胞至约5x107个细胞、约1x103个细胞至约6x107个细胞、约1x103个细胞至约7x107个细胞、约1x103个细胞至约8x107个细胞、约1x103个细胞至约9x107个细胞、约1x103个细胞至约1x108个细胞、约1x103个细胞至约2x108个细胞、约1x103个细胞至约3x108个细胞、约1x103个细胞至约4x108个细胞、约1x103个细胞至约5x108个细胞、约1x103个细胞至约6x108个细胞、约1x103个细胞至约7x108个细胞、约1x103个细胞至约8x108个细胞、约1x103个细胞至约9x108个细胞或约1x103个细胞至约1x109个细胞。
在一些情况下，本发明的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物的治疗有效剂量可以是约1x106个细胞至约2x106个细胞、约1x106个细胞至约3x106个细胞、约1x106个细胞至约4x106个细胞、约1x106个细胞至约5x106个细胞、约1x106个细胞至约6x106个细胞、约1x106个细胞至约7x106个细胞、约1x106个细胞至约8x106个细胞、约1x106个细胞至约9x106个细胞、约1x106个细胞至约1x107个细胞、约1x106个细胞至约2x107个细胞、约1x106个细胞至约3x107个细胞、约1x106个细胞至约4x107个细胞、约1x106个细胞至约5x107个细胞、约1x106个细胞至约6x107个细胞、约1x106个细胞至约7x107个细胞、约1x106个细胞至约8x107个细胞、约1x106个细胞至约9x107个细胞、约1x106个细胞至约1x108个细胞、约1x106个细胞至约2x108个细胞、约1x106个细胞至约3x108个细胞、约1x106个细胞至约4x108个细胞、约1x106个细胞至约5x108个细胞、约1x106个细胞至约6x108个细胞、约1x106个细胞至约7x108个细胞、约1x106个细胞至约8x108个细胞、约1x106个细胞至约9x108个细胞、约1x106个细胞至约1x109个细胞、约1x106个细胞至约2x109个细胞、约1x106个细胞至约3x109个细胞、约1x106个细胞至约4x109个细胞、约1x106个细胞至约5x109个细胞、约1x106个细胞至约6x109个细胞、约1x106个细胞至约7x109个细胞、约1x106个细胞至约8x109个细胞、约1x106个细胞至约9x109个细胞、约1x107个细胞至约1x109个细胞、约1x107个细胞至约2x109个细胞、约1x107个细胞至约3x109个细胞、约1x107个细胞至约4x109个细胞、约1x107个细胞至约5x109个细胞、约1x107个细胞至约6x109个细胞、约1x107个细胞至约7x109个细胞、约1x107个细胞至约8x109个细胞、约1x107个细胞至约9x109个细胞、约1x108个细胞至约1x109个细胞、约1x108个细胞至约2x109个细胞、约1x108个细胞至约3x109个细胞、约1x108个细胞至约4x109个细胞、约1x108个细胞至约5x109个细胞、约1x108个细胞至约6x109个细胞、约1x108个细胞至约7x109个细胞、约1x108个细胞至约8x109个细胞、约1x108个细胞至约9x109个细胞或约1x109个细胞至约1x1010个细胞。
保存
在一些实施方案中，富集的γδT细胞群和/或其掺和物可以在冷冻培养基中配制，并置于低温储存单元(诸如液氮冷冻剂(-195C)或超低温冷冻剂(-65C、-80C或-120C))中长期储存至少约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年、2年、3年或至少5年。冷冻培养基可含有二甲亚砜(DMSO)和/或氯化钠(NaCl)和/或葡萄糖和/或硫酸葡聚糖和/或羟乙基淀粉(HES)，以及将pH维持在约6.0至约6.5之间、约6.5至约7.0之间、约7.0至约7.5之间、约7.5至约8.0之间或约6.5至约7.5之间的生理pH缓冲剂。可以使超低温保存的γδT细胞解冻，并如本文所述通过使用抗体、蛋白质、肽和/或细胞因子刺激来进一步加工。可以使超低温保存的γδT细胞解冻，并如本文所述通过病毒载体(包括逆转录病毒和慢病毒载体)或非病毒工具(包括RNA、DNA和蛋白质)进行基因修饰。或者，非工程改造的γδT细胞可以通过本文所述的方法扩增、进行基因修饰和超低温保存。
因此，基因工程的和/或非工程改造的γδT细胞可以进一步超低温保存，以得到冷冻培养基中浓度为约至少101、102、103、104、105、106、107、108、109或至少约1010个细胞/mL，数量为至少约1、5、10、100、150、200、500瓶的细胞库。超低温保存的细胞库可以保持其功能，并且可以解冻，以及进一步刺激和扩增。在一些方面，可以刺激解冻的细胞，并在合适的封闭容器(诸如细胞培养物袋和/或生物反应器)中扩增，得到作为同种异体细胞产物的大量细胞。超低温保存的γδT细胞可以在低温储存条件下维持其生物学功能持续至少约6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、15个月、18个月、20个月、24个月、30个月、36个月、40个月、50个月或至少约60个月。在一些方面，制剂中不使用防腐剂。可以使超低温保存的γδT细胞解冻，并作为同种异体的现成细胞产品给多名患者输注。
本文提及的所有出版物和专利均以引用的方式整体并入本文用于描述和公开目的，例如这些出版物中描述的构建体和方法可以结合本文所述的发明使用。本文讨论的出版物单独提供，因为它们在本专利申请的提交日期之前公开。本文不应理解为根据前述发明或出于任何其它原因，允许本文所述的发明人提前了解此类公开内容。
通过以下非限制性实施例更详细地解释本发明。
实施例
实施例1.原代细胞分离、消化和培养物
使用血液成分分离机从健康供体收集原代人外周血单核细胞(PBMC)。使用Ficolll-PaqueTMPLUS(GE Healthcare Bio-Sciences AB,Uppsala,Sweden)系统或相似的系统纯化PBMC。然后将细胞重悬于适当的生长培养基中。
或者，从外周血、脐带血、骨髓、健康组织或患病组织(诸如癌性组织)收集原代人细胞。
来自健康供体的组织
从协作人体组织网络(The Cooperative Human Tissue Network,CHTN)接收来自健康供体的新鲜组织并在RPMI-1640培养基中运输到实验室。用解剖刀将组织切成1-3mm3碎片。以2-5片/孔置于24孔板(Costar)的补充有GlutaMAX、25mM HEPES pH7.2、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素和10％人AB血清和100IU/ml rhIL-2的2mL RPMI-1640中，或如下文所述消化。在潮湿培育箱中37℃下5％CO2的空气中孵育平板。每隔一天检查培养物以监测淋巴细胞的增殖。在培养开始后每7天更换所有孔的一半培养基。当密集的淋巴细胞毯(carpet)覆盖周围的碎片或来源于消化组织的淋巴细胞群，达到适当的浓度时，收集淋巴细胞，如下文所述。
组织酶促消化
从协作人体组织网络(CHTN)接收来自健康供体的新鲜组织样品并在RPMI-1640培养基中运输到实验室。使用两种酶混合物LiberaseTMDL研究级(Sigma Aldrich Co.,St.Louis,MO)，或LiberaseTMTM研究级(Sigma Aldrich Co.,St.Louis,MO)或Miltenyi肿瘤解离试剂盒(130-095-929)以及gentleMACS分离器通过酶促消化分离淋巴细胞。
将组织切成2-3mm3碎片，在37℃和5％CO2下消化1小时。使消化细胞悬浮液通过40微米过滤器，离心并用RPMI-1640培养基洗涤。对细胞进行计数并重悬于补充有10％人AB血清(Corning)和100IU/ml rhIL-2的RPMI培养基(GIBCO BRL)中。将收集的细胞群以0.5至1x106个细胞/ml接种于24孔组织培养板中。当细胞的浓度超过1.5x106个细胞/ml时，将细胞分瓶至含IL2的RPMI培养基中。
肿瘤样本的培养
从协作人体组织网络(CHTN)接收来自原发性和转移性癌症患者的新鲜肿瘤样本(包括结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、头颈癌、口腔癌、胰腺癌和肝癌的样本)，并在RPMI培养基中运输到实验室。用解剖刀将肿瘤样本切成1-3mm3碎片。以2-5片/孔置于24孔板(Costar)的补充有GlutaMAX、25mM HEPES pH7.2、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素和10％人AB血清和100IU/ml rhIL-2的2ml RPMI-1640中。在潮湿培育箱中37℃下5％CO2的空气中孵育平板。每隔一天检查培养物以监测淋巴细胞的增殖。在培养开始后每7天更换所有孔的一半培养基。当密集的淋巴细胞毯覆盖周围的碎片时收集淋巴细胞。
新鲜肿瘤样本酶促消化
从协作人体组织网络(CHTN)接收来自原发性和转移性癌症患者的新鲜肿瘤样本(包括结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、头颈癌、口腔癌、胰腺癌和肝癌的样本)，并在RPMI培养基中运输到实验室。使用酶混合物LiberaseTMDL研究级(Sigma Aldrich Co.,St.Louis,MO)、LiberaseTMTM研究级(Sigma Aldrich Co.,St.Louis,MO)或Miltenyi肿瘤解离试剂盒(130-095-929)以及gentleMACS分离器通过酶促消化分离淋巴细胞。将组织切成2-3mm3碎片，在37℃和5％CO2的空气中消化1小时。使消化细胞悬浮液通过40微米过滤器，离心并用RPMI-1640培养基洗涤。对细胞进行计数并重悬于补充有10％人AB血清(Corning)和100IU/ml rhIL-2的RPMI培养基(GIBCO BRL)中。将收集的细胞群以0.5至1x106个细胞/ml接种于24孔组织培养板中。当细胞的浓度超过1.5x106个细胞/ml时，将细胞分瓶至含IL2的RPMI培养基中。
在示例性血清补充培养基中培养原代细胞
使用Ficoll-PaqueTMPLUS(GE Healthcare Bio-Sciences PA,USA)通过从来源于健康供体的血沉棕黄层分离产生PBMC群体。在24孔组织培养板的补充有10％胎牛血清(Gibco)、2mmol/L L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和100IU rhIL-2/ml的RPMI-1640(Corning CellGro)中以1x106个细胞/mL培养PBMC。
类似的培养条件可用于生长从外周血、脐带血、骨髓、健康组织或患病组织(诸如前述癌性组织)收集的原代人细胞。
在示例性无血清培养基中培养原代细胞
使用Ficoll-PaqueTMPLUS(GE Healthcare Bio-Sciences PA,USA)通过从来源于健康供体的血沉棕黄层分离产生PBMC群体。在24孔组织培养板的含有CTS-OpTmizer补充剂的CTS无血清培养基中以1x106个细胞/mL培养PBMC。
类似的培养条件可用于生长从外周血、脐带血、骨髓、健康组织或患病组织(诸如前述癌性组织)收集的原代人细胞。
实施例2：贴壁单核细胞和巨噬细胞以及CD4+和CD8+αβT细胞的剔除
使用前述血液成分分离方法收集PMBC，并通过低渗处理或使用Ficoll梯度离心的密度分离除去红细胞。在大规模组织培养容器(诸如10层或40层Cell Factory(Nunc)转瓶(Nunc))中孵育无红细胞PBMC。包含巨噬细胞和单核细胞的贴壁群体通常保持与细胞培养容器的表面结合。在悬浮群体中生长的细胞群是γδT细胞富集的。将大约108、109或1010个PBMC与抗人CD4和抗人CD8包被的含铁微珠(例如Miltenyi Biotech Microbeads)一起孵育。使孵育的细胞群流经磁场，其中CD4+和CD8+ T细胞得以保持。“流经”的细胞群是γδT细胞富集的。
实施例3：单核细胞和巨噬细胞的剔除
使用前述血液成分分离方法收集PMBC，并通过低渗处理或使用Ficoll梯度离心的密度分离除去红细胞。在大规模组织培养容器(诸如10层或40层Cell Factory(Nunc)转瓶(Nunc))中孵育无红细胞PBMC。使除去红细胞的PBMC流经填充的玻璃棉柱来除去单核细胞和巨噬细胞。“流经”的细胞群是γδT细胞富集的，用于进一步加工。
实施例4：γδT细胞的富集
使用前述血液成分分离方法收集PMBC，并通过低渗处理或使用Ficoll梯度离心的密度分离除去红细胞。在大规模组织培养容器(诸如10层或40层Cell Factory(Nunc)转瓶(Nunc))中孵育无红细胞PBMC。通过实施例2或实施例3所述的方法剔除单核细胞和巨噬细胞。将大约108、109或1010个PBMC与CD4和CD8包被的含铁微珠(例如Miltenyi BiotechMicrobeads)一起孵育。使孵育的细胞群流经磁场，其中抗人CD4+和抗人CD8+ T细胞得以保持。“流经”的细胞群是γδT细胞富集的。使用针对不需要的细胞类型的抗体混合物，通过免疫磁珠分离(例如Miltenyi Biotech AutoMACS系统)除去不需要的细胞(诸如NK、γδT细胞、B细胞、单核细胞和巨噬细胞)。
或者，通过使用小鼠抗人αβTCR(IP26、BW242/412)抗体，针对NK、αβT细胞、B细胞、单核细胞或巨噬细胞上的表面受体和附接到抗小鼠IgG MicroBeads(Miltenyi 130-048-401)的一种或多种其它抗体，或针对NK、αβT细胞、B细胞、单核细胞或巨噬细胞或它们的组合上的表面受体的一种或多种四聚体抗体复合物或双特异性抗体除去不需要的细胞类型。
使用抗体从原代细胞分离γδT细胞
在一个实例中，根据细胞表面标志物的阳性(即，γδTCR)或阴性(即，αβTCR、CD4、CD8、CD56)表达，使用流式细胞术分选从原代培养物分离天然的γδT细胞。
实施例5.从原发性肿瘤分离γδT细胞
根据实施例1中详述的方法分离γδT细胞。简而言之，从NCI协作人体组织网络(CHTN)获得新鲜收集的肿瘤样本。在RPMI-1640培养基中运输转移到肝的结肠腺癌(TIL 1)和肾肿瘤(TIL 2)。如上所述，使用扁平刀片将肿瘤组织切成尺寸为2mm3的小块，然后用2mL于RPMI中的释放酶混合物(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)和3000个单位的DNA酶消化。在消化后，通过消毒纱布40微米尼龙网过滤肿瘤，并在RPMI-1640中洗涤两次。对细胞进行计数，并以1x106/ml接种于24孔板的含有10％人AB血清、补充有L-谷氨酰胺和100U/mLrhIL-2的RPMI-1640中。在培养6天后收集肿瘤侵润性淋巴细胞。通过流式细胞术抗δ1 TCR(FITC缀合的抗Vδ1TS8.2,(Thermo Fisher)和抗Vδ2 B6(Biolegend)分析γδT淋巴细胞的存在。使用FlowJo软件分析数据。
图4描绘了展示从转移到肝的结肠腺癌(TIL 1)和肾肿瘤(TIL 2)分离的γδ1和γδ2淋巴细胞的生长的图示。这些淋巴细胞显示出表达CCR4和CCR7(数据未示出)。如图4所述，Vδ1亚群是从两种类型肿瘤分离的优势群体。
实施例6.γδT细胞的刺激和扩增
在含有细胞因子(IL-2、IL-4、IL-7、IL-15、IL-12、IL-21、IL-23或IL-33)、生长因子(胰岛素和转铁蛋白、胰岛素样生长因子)、白蛋白、脂质(胆固醇、脂质溶液、脂质前体)、维生素、铜、铁、硒、蛋白质水解产物、必需氨基酸、非必需氨基酸和剪切保护剂(PluronicF-68)的无血清培养基(诸如Ex-Vivo 10(Lonza 04-380Q)、Ex-Vivo 15(Lonza 04-744Q)、Ex-Vivo 20(Lonza 04-448Q)、AIMV培养基(ThermoFisher Scientific12055091)、Optimizer CTS(ThermoFisher Scientific A1048501))中刺激和扩增γδT细胞。
本文的实施例中描述的无血清培养基也可以补充有添加剂，所述添加剂支持105至2x107个细胞/mL之间的高细胞密度γδT细胞在悬浮培养物中生长(例如WAVE生物反应器)，同时维持γδT细胞的生物学功能。
提供γδT细胞的稳健生长的另外添加剂包括例如氯化钙、无水硝酸钙、硫酸铜五水合物、柠檬酸铁、硝酸铁、硫酸亚铁、硫酸锌和/或腐胺。
痕量金属提供于无血清培养基中，以提供低水平的替代血清的元素组分，包括仲钼酸铵、钒、锰、镍、亚硒酸钠、偏硅酸钠九水合物、氯化亚锡、氯化铝、乙酸钡、氯化镉、氯化铬、钴、二氧化锗、溴化钾、碘化钾、氯化铷、硝酸银、氟化钠和/或氯氧化锆。
添加至支持γδT细胞的稳健生长的细胞培养基的其它组分为例如腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、甜菜碱、牛磺酸、亚叶酸、乙醇胺、亚油酸、油酸氢化可的松、丙酮酸、植物水解产物、酵母水解产物和/或β-巯基乙醇。
添加以促进γδT细胞稳健生长的维生素包括：生物素(B7)、D-泛酸钙(B5)、氯化胆碱、氰钴胺素(B12)、叶酸(B9)、i-肌醇(肌-肌醇)、烟酰胺(B3)、吡哆醛单盐酸盐、吡哆醇单盐酸盐(B6)、核黄素(B2)、硫胺素和/或单盐酸盐(B1)。
实施例7：扩增的γδT细胞的表征：免疫表型
扩增的T细胞群可以例如通过区分不同群体的细胞表面标志物的FACS染色来表征。在含有2％胎牛血清的HEPES缓冲盐水溶液(HBSS)中洗涤细胞一次，与适量的MAb在4℃下孵育30分钟，并在HBSS中重新洗涤。简而言之，在100μl体积的FACS染色介质(FSM；含2％胎牛血清的HBSS)中对1x106个细胞染色，所述FACS染色介质含有氟异硫氰酸酯(FITC)或藻红蛋白(PE)缀合的针对CD2、CD3(BioLegend，克隆OKT3)、CD4(BioLegend，克隆OKT4)、CD7、CD8(BioLegend，克隆RPAT8)、CD11a、CD16、CD18、CD19、CD27、CD28、CD38、CD45RA、CD56、CD57、CD69、CD71、CD95、CD107、ICAM-1、MICA/B、NKG2D DR5、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5CCR6、CCR7、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR5、CXCR5、CXCR6、CXCR7、IL-2R、IL-7R、Ki67、L-选择素、VLA-4、JAML、PD1、PDL1、CTLA-4、Ox40、TCR Vδ1(ThermoFisher Scientific，克隆TS8.2)或TCR Vδ2(BioLegend，克隆B6)的MAb。
除表面标志物之外，细胞因子分泌、胞内细胞因子和/或膜相关细胞因子(包括例如TNF-α、IFN-γ、GM-CSF、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-17或IL-21)可以根据本领域已知的方法表征。
在本文的某些实施例中，通过zombie violet(BioLegend)胺染料的缺乏或低掺入来确定活细胞。荧光减一(Fluorescence Minus One,FMO)对照用于限定每种抗原的表面表达的正门和负门边界。在Sony SH800细胞计数器上收集染色的细胞，并使用FlowJo v10.1分析数据。流式细胞数据以点图显示。
实施例8.在含血清和无血清培养基中进行δ2 T细胞扩增
在含血清培养基(R2:RPMI+10％FBS)和无血清培养基(AIMV+牛白蛋白；CTS无血清补充剂)中评估不同δ2 T细胞的生长和扩增速率。图5描绘了展示δ2 T细胞的生长的图示。当前实验中使用的所有培养基均含有100IU/mL IL-2、2mM谷氨酰胺和1x青霉素/链霉素。此外，在第0天使用1、5和20μM唑来膦酸刺激细胞。每2-3天补充培养基，但不再添加唑来膦酸。从106个PBMC扩增的δ2 T细胞的总数和13天的时间段后每次处理的倍数扩增如图5所示。这些结果表明，δ2 T细胞可在无血清培养基中扩增。
实施例9.抗γδTCR抗体封闭和竞争测定
图6和图7描绘了展示抗γδTCR抗体封闭实验的图示，图8和图9描绘了抗体竞争测定。图6和图7展示了封闭实验的结果，其中PBMC与各种抗体，即5A6.E9、B1、TS8.2、15D、B3、B6、TS-1、γ3.20、IMMU510或11F2预孵育。随后洗涤细胞，并用TS8.2-FITC(δ1特异性)或B6-PE(δ2特异性)二抗染色。通过流式细胞术分析PBMC样品。几何平均荧光强度(gMFI)降低用于评估封闭的程度。展示了针对TS8.2-FITC(图6)和针对B6-PE(图7)的抑制水平。
MAb TS-1和TS8.2与抗体5A6.E9、B1、IMMU510、R9.12-2或11F2之间结合表达γδ1TCR的细胞系BE13的竞争研究通过以下方式进行：使1x105个细胞与1、2或10μg未标记的竞争抗体(IgG1、5A6.E9、B1、TS8.2、TS-1、R9.12、IMMU510或11F2)和0.2μg FITC缀合的抗Vδ1TCR克隆TS8.2(图8)或抗Vδ1 TCR克隆TS-1(图9)同时在冰上孵育30分钟。％竞争通过几何平均荧光的变化除以几何平均荧光的最大变化来计算。如图9所示，TS-1抗体与TS8.2竞争细胞结合的效力相当于TS8.2抗体本身。其它测试抗体都不能与TS8.2竞争结合。TS8.2抗体与TS-1竞争细胞结合，但效力不如TS-1本身。还观察到一些水平的11F2抗体与TS-1的结合竞争。这些结果表明TS-1和TS8.2抗体均与γδ1结合，但可能不结合相同的表位。
实施例10.肿瘤样本的酶促消化以及使用γδ表位特异性抗体进行的γδT细胞扩 增
用0.5-1μg抗γδTCR抗体包被24孔板。如实施例4所述，对从消化的肿瘤组织分离的细胞进行计数，并以0.5-1x106个细胞/ml接种于抗体包被孔的补充有10％人AB血清和rhIL-2(100IU/mL)的RPMI1640培养基中。在37℃、5％CO2下孵育培养物7-21天。
实施例11.肿瘤样本的酶促消化以及使用γδ表位特异性抗体进行的γδT细胞扩 增
如实施例1的“新鲜肿瘤样本酶促消化”部分所述，对从消化的肿瘤组织分离的细胞进行计数，并以0.5-1x106个细胞/ml接种于3D细胞培养板(超低吸附多孔板)的抗体包被孔的补充有10％人AB血清和rhIL-2(100IU/mL)的RPMI 1640培养基中。在37℃、5％CO2下孵育培养物7-21天。
实施例12.从PBMC活化和扩增γδT细胞
活化剂作为可溶性药剂或固定在培养孔上的药剂测试。将可溶性抗原和抗体以0.1-5μg/ml的最终浓度加入以1x106个细胞/ml的细胞密度在24孔板中培养的人PBMC中。或者，通过包被24孔培养板的孔来固定相同的抗γδTCR抗体。以0.1-10μg/ml的浓度添加抗γδTCR抗体。用PBS洗涤孔两次，然后将PBMC转移至平板，并如上文所述在RPMI-1640、AIM-V或CTS-OpTmizer培养基中培养。培养基补充有100IU/mL的rhIL-2。
在具体实例中，在第0天使用以0.5、1和2μg/孔固定在24孔板中的各种抗体刺激来自供体B3的一百万个PBMC/ml。测试的抗体为小鼠IgG1同种型对照克隆MG1-45(BioLegend)、UCHT-1、5A6.E9、B1、TS8.2、15D、B6、B3、TS-1、γ3.20、7A5和唑来膦酸。图10和图11描绘了展示分别从PBMC活化和扩增δ1和δ2 T细胞的图示。在含有RPMI和10％FBS、100IU/mLrhIL-2、谷氨酰胺和1x青霉素链霉素的培养基中活化和扩增细胞。在初始刺激后第7天，将细胞在新鲜培养基中传代，并置于用相同抗体以相同浓度新包被的24孔板中。每2-3天补充再刺激培养物中的培养基直到第13天，并通过流式细胞术分析。
图12展示了δ1 T细胞的总数，图13展示了生长和扩增13天后δ2 T细胞的总数。通过将δ1和δ2 T细胞百分比(分别使用TS8.2-FITC和B6-PE通过流式细胞术确定)乘以活细胞总数，然后从非特异性小鼠IgG MG1-45(BioLegend 401403)活化的δ1和δ2 T细胞减去阴性对照值来计算γδT细胞的总数。
仅当抗体固定在培养板上时获得用于细胞扩增的活化，当这些抗体以可溶性形式(包括整个PBMC细胞群形式)添加至培养物时未检测到扩增(数据未示出)。泛γδTCR MAb5A6.E9和B1并活化δ1和δ2细胞群的生长。MAb15D和B6诱导δ2细胞群的选择性生长。MAbTS8.2和TS-1诱导δ1细胞群的选择性生长。令人感兴趣的是，虽然MAb TS-1和TS8.2彼此竞争细胞表面TCR的结合，但TS-1诱导的增殖高3倍。类似地，检测抗体B1、5A6.E9、15D、B6和B3之间不同程度的δ2细胞群增殖诱导。该数据表明，独特表位是触发γδ细胞群的特异性和稳健扩增必需的。
实施例13：从PBMC活化和扩增特定γδT细胞群从PBMC活化和扩增Vδ1 T细胞
活化抗体(TS1、TS8.2、R9.12、B6和15D)以0.25或1μg/mL(示出0.25μg/mL的数据)直接固定至塑料24孔板，或在24孔板中由结合平板的山羊抗小鼠IgGFc(5μg/mL)以0.05或0.1mg/mL(示出0.05μg/mL的数据)捕获。在含有RPMI和10％FBS、100IU/mL rhIL-2的培养基中以1x106个细胞/ml活化人PBMC。每2-3天补充培养物中的培养基。在第-7天，将细胞转移至无活化抗体的新平板，并通过每2-3天补充新鲜培养基总共14或23天来进一步扩增。在第0、7、14和23天进行细胞计数和流式细胞术分析，以确定Vδ1和Vδ2 T细胞的百分比和数量。倍数扩增定义为γδT细胞的数量除以每个孔中接种的起始PBMC中相同γδT细胞类型的数量。图16描绘了展示从来自不同供体的PBMC活化和扩增Vδ1 T细胞的图示。MAb TS-1.R9.12和TS8.2诱导Vδ1 T细胞群的显著选择性生长和富集。Vδ1 T细胞在14天内扩增400至14,500倍(图16A、C)，并从1.2％至87.0％的T淋巴细胞群(占总细胞群的约95％)富集(图16B)。Vδ1T细胞在23天内扩增26,330倍(图16D)。
从PBMC活化和扩增Vδ2 T细胞
活化抗体(TS1、TS8.2、R9.12、B6和15D)以0.25或1μg/mL(示出0.25μg/mL的数据)直接固定至塑料24孔板或由结合平板的山羊抗小鼠IgGFc(5μg/mL)以0.05或0.1μg/mL捕获(示出0.05μg/mL的数据)。在含有RPMI和10％FBS、100IU/mL rhIL-2的培养基中以1x106个细胞/ml活化人PBMC。每2-3天补充培养物中的培养基。在第-7天，将细胞转移至无活化抗体的新平板，并通过每2-3天补充新鲜培养基进一步扩增总共14天。图17展示了14天后来自不同供体的Vδ2 T细胞的倍数扩增和百分比。MAb B6和15D诱导Vδ2 T细胞群在14天内选择性扩增70倍至4,740倍(图17A、17C和17E)，并富集δ2群体至最多80％的T淋巴细胞群(占约95％的总细胞群)(图17B和17D)。
在γδTCR活化的PBMC中减少αβ T细胞的百分比
在细胞培养孔中测试固定活化剂。在24孔板中用山羊抗小鼠Fc(5μg/mL)直接包被(1μg/mL)或捕获(0.1μg/mL)MAb(TS1、TS8.2、B6和15D)。在含有RPMI和10％FBS、100IU/mLrhIL-2的培养基中以1x106个细胞/ml活化人PBMC。每2-3天补充培养物中的培养基。在第-7天，将细胞转移至无抗体的新平板，并通过每2-3天补充培养基进一步扩增直到第14天并通过流式细胞术分析。图18展示了14天后αβT细胞的倍数扩增和百分比。与MAb TS1、TS8.2、B6和15D培养PBMC使αβT细胞在14天培养期内从92％显著减少至9％。
通过δ1和δ2特异性抗体活化减少了δ1和δ2 T细胞的群体倍增时间
在24孔板中用山羊抗小鼠Fc(5μg/mL)直接包被(1μg/mL)或捕获(0.1μg/mL)MAb。将PBMC以106个细胞/mL接种于含有10％FBS和100IU/mL IL-2的RPMI中。在第7天将细胞转移至无抗体的新平板，用新鲜培养基调整至106个细胞/mL。在第7天，将培养物转移至无抗体的新平板，并调整至106个细胞/mL，每2-3天补充新鲜培养基。结果如图19所示。Vδ1 T细胞群倍增时间从在不存在活化抗体的情况下的37小时减少至在存在固定化TS1抗体的情况下的24小时。Vδ2 T细胞群倍增时间从在不存在活化抗体的情况下的125小时减少至用固定化15D抗体活化时的27.5小时。αβT细胞群倍增时间不受γδTCR抗体活化的显著影响。
使用TS8.2和TS1抗体活化产生优势的初始和中央记忆表型
抗体TS8、R9.12和Immuno510以1.0μg/mL的浓度直接固定至塑料孔。以1x106个细胞/ml活化人PBMC，并在含有RPMI和10％FBS、100IU/mL rhIL-2的培养基中培养。每2-3天补充培养物中的培养基直到第23天，并在第0、14和23天通过流式细胞术分析。图20描绘了通过流式细胞术分析的由CD45RA和CD27表达所确定的第14和23天Vδ1 T细胞的表型。γδ细胞的表型定义为初始(CD45RA+/CD27+)、中央记忆(TCM、CD45RA-/CD27+)、效应记忆(TEM、CD45RA-/CD27-)和效应记忆表达(TEMRA、CD45RA+/CD27-)。在43％至63％初始群体和23％至27％的中央记忆群体的23天扩增期内，用TS8.2和R9.12活化维持Vδ1 T细胞表型。相比之下，用泛γδ抗体Immuno510的活化使初始Vδ1-T细胞从47％减少至8％和33％之间。
通过MICA-Fc进行Vδ1 T细胞群的特异性增强扩增
通过结合平板的TS8.2抗体(1μg/mL)或结合平板的TS8.2和MICA-Fc融合蛋白(分别为1和5μg/mL)活化人PBMC。在含有10％FBS、100IU/mL rhIL-2的RPMI培养基中扩增培养物。图21描绘了10天后的细胞扩增。与仅TS8.2对照相比，TS8.2与MICA-Fc组合使Vδ1 T细胞群的扩增增强2倍(A)，而不对αβT细胞群产生影响(B)。
来自脐带血的δ1和δ2 T细胞的特异性和显著活化
使用Ficol通过密度梯度离心分离来自人脐带血的单核细胞，并在含有RPMI、10％FBS、100IU/mL rhIL-2的培养基中使用抗体TS8.2、R9.12、B6和15D活化。图22显示，使用δ1特异性抗体扩增Vδ1 T细胞最多152倍，并在7天内使用δ2特异性抗体扩增Vδ2 T细胞最多93倍。
实施例14.活化γδTCR MAb的表位作图
确定γδTCR活化抗体的表位结合结构域。在ELISA结合测定中，使用野生型和突变型γδTCR配对链的不同组合确定γδTCRδ1特异性活化MAb TS8.2、TS1以及δ2特异性活化MAb 15D和B6的结合表位。TS1、TS8.2和R9.12是通过流式细胞术检测的结合表达δ1 TCR的人T白血病细胞系BE13的表面的δ1特异性MAb(数据未示出)。克隆BE13 TCR链δ1J1和γ8J2并用于δ1特异性MAb的表位作图。
克隆含有δ和γ链的胞外V结构域、多样性(D)结构域、连接(J)结构域和C区结构域的可溶性TCR构建体，并融合至通过293细胞的瞬时转染表达的人IgG1重链融合γδTCR-FC蛋白的铰链区、CH2和CH3结构域。
对于δ1特异性MAb的作图，表达包括Vδ1J1、Vδ1J2和Vδ1J3的不同δ1链。产生在V区和J区突变的另外Vδ1J1链。所有不同的δ1链均与从BE13细胞系克隆出的γ8 TCR链配对，δ1特异性MAb的结合不受与γ链配对的影响。
将不同的γδTCR共转染至293细胞，并且能够正确组装和形成正确配对的受体链分泌的二硫键连接的异源二聚体。通过ELISA结合测定使用抗TCR泛γδ抗体(包括识别所有γδT细胞受体的B1.1(Biolegend#331202)、5E6.E9(ThermoFisher Scientific#TCR1061)、11F2(Beckman Coulter#340884)和IMMU510(Beckman Coulter#IM1349)抗体)确认TCRγδ-FC异源二聚体的正确折叠。
在所有情况下，所有γδTCR MAb的结合限于γδTCR异源二聚体，表明δ1和δ2链与γ链的配对对于正确结合结构是必需的。
293细胞的瞬时转染和嵌合蛋白的产生。239细胞在补充有10％胎牛血清的达尔伯克改良的伊格尔培养基(Dulbecco's modified Eagle medium,DMEM)中生长。在转染前一天将贴壁293细胞接以1X105个细胞/孔种于24孔板上，并在37℃(5％CO2)下孵育过夜。将1μg每种TCRγ-Fc和TCRδ-FC质粒组合。在无血清Opti-MEM培养基中稀释质粒DNA和fectin293转染试剂(ThermoFisher Scientific#12347019)5分钟，然后在室温下复合20-30分钟。将全部体积的转染混合物逐滴加入所制备的细胞。在37℃(5％CO2)下孵育转染的293细胞48-72小时。在转染后48小时收集细胞上清液，并通过ELISA测定测试选择的抗人γδTCR单克隆抗体的结合。
夹心ELISA测定。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来测试细胞培养上清液。在4℃下将测定板(Greiner Bio-One高结合微板)与100μl1μg/ml山羊抗人IgG、Fcγ片段特异性抗体(Jackson ImmunoResearch#109-005-008)孵育过夜。在室温下用200μl/孔封闭缓冲液(含3％BSA的PBS)封闭平板1h。将含有可溶性γδTCR的上清液加入PBS-Tween(以0.5ml/L溶于PBS的Tween)中，并在室温下孵育1h，然后用选择的小鼠抗人γδTCR特异性mab洗涤和孵育。使用HRP缀合的山羊抗小鼠FC特异性(Jackson ImmunoResearch Laboratories；Peroxidase-AffiniPure山羊抗小鼠IgG，Fcγ片段特异性#115-035-008)(在封闭缓冲液中1:10,000稀释一小时)检测γδTCR mAb与可溶性TCR组的结合。然后洗涤平板并用TMB试剂显色。在Victor X3读板器(Perkin Elmer)上以450nm波长测量平板上的变色。
如图23所示，当δ1链包括Vδ1J1和Vδ1J2序列而非Vδ1J3链时，检测TS1和TS8.2与可溶性TCR的结合，表明TS1和TS8.2的结合涉及δJ3中缺失的δJ1和δJ2区中的关键残基。数据表明，TS1和TS8.2结合δ1J1和δ1J2 TCR，并且R9.12结合δ1J1、δ1J2和δ1J3 TCR，并且J1和J2区段含有TS1和TS8.2结合关键的序列。
为了鉴定TS8.2和TS1结合必需的J1/J2区中的关键氨基酸，人δJ区的序列比对指向J1和J2之间共有的但在J3序列中不同的4个可能的残基9J1/J2残基Leu116、Lys120和Thr122。根据所选位置的J3序列修改δJ1序列；Leu116被改为Met，Lys120被改为Thr和Ala，Thr122被Ile置换。Lys120改为Thr消除了TS8.2和TS1二者的结合，而非R9.12的结合。如图24和25所示，在δJ1和δJ2中位置120的赖氨酸残基是TS-1和TS8.2抗体结合关键的。
为了进一步鉴定TS8.2和TS1结合重要的Vδ1序列，制备另外的突变Vδ1 TCR构建体。如图26所示，构建六条突变的Vδ1链。根据高度同源的牛Vδ1S1和人Vδ1之间的氨基酸序列差异(68％同一性)设计突变。使用合成基因(整合DNA技术)产生突变的Vδ1链。可溶性TCR以Vδ1链与人γ8 TCR Fc链的配对表示。
如图27所示，TS-1和TS8.2抗体不能结合两条突变的Vδ1链，即Vδ1Mut1和Vδ1Mut6。Vδ1Mut1在人δ1链的可变区的Gly57至Ala88的区域之间的残基段中显示出9个残基变化，并且Vδ1Mut6在位置71和72(编号如图14所示)处显示出两个残基的变化。Vδ1 MAb R9.12和泛δ链恒定MAb Immuno510的结合不受Vδ1的任何变化的影响。所以，位置Arg71和Asp72的Vδ1残基与J1/J2区的Lys120一起对Ts-1和TS8.2 MAb二者的结合是关键的。
总之，数据表明，TS-1和TS8.2二者的关键结合和活化表位位于δ1链的V和J1/J2区内。
Vδ2特异性活化MAb 15D和B6的表位作图
通过流式细胞术检测Mab B6和15D与唑来膦酸活化的δ2 T细胞群的特异性结合，同时未检测到与表达δ1TCR的BE13细胞系的结合(数据未示出)。竞争结合测定数据还显示，B6和15D不彼此竞争且识别不同的表位。
γδTCR链组合。为了鉴定15D和B6 MAb的结合表位，产生了不同的γδ2 TCR构建体。Vδ2链与γ3、γ4、γ8、γ9J1和γ9JP FC融合链共转染。使用抗TCR泛γδ抗体IMMU510(Backman Coulter#IM1349)和γ9特异性MAb 7A5(ThermoFisher Scientific#TCR1720)通过ELISA结合测定确认分泌的δ2 TCR异源二聚体的正确折叠。
B6的结合受到被选为与δ2链配对的γ链的影响。当δ2链与γ9链配对时，检测到B6的结合，而不论γ9J序列如何。γ3δ2 TCR对的结合大大减少，并且未检测到与γ8配对的δ2链的结合。如图28所示，B6 MAb的最稳定结合是与δ2γ9 TCR的结合。γ3和γ8二者均属于γ家族1并且彼此共有高度序列同源性(75％)，γ2家族成员γ9与γ3和γ8共有低序列同源性(约20％)。B6的高结合亲和力涉及δ2链和γ9链二者上的残基。阳性对照MAb是结合δ链的恒定区的泛γδTCR，即IMMU510，并且识别所有γδTCR，以及γ9特异性MAb，即7A5 MAb。检测B6 MAb与δ2γ9 TCR的结合。B3是Vγ9抗体。
最近，据显示人和恒河猴γδ2 T细胞显示出高度的TCR基因区段的生殖系序列同源性和CDR3区的多样性(Daubenberger CA等人,J Immunol 2001；167:6421-30)。为了鉴定15D结合所需的关键序列，将特定点突变引入人Vδ2链的CDR结构域，并且在位置Gly35(Vδ2CDR1)、Asp65(Vδ2 CDR2)和Cys104(Vδ2 CDR3)通过定点诱变被恒河猴序列替换。图29示出了人(IMGT人TRDV2)和恒河猴(GenBank:AY190028.1)Vδ2可变区的蛋白质序列比对。在CDR1(G35S)、CDR2(D65G)和CDR3 C104S(编号如图15所示)中进行改变。在人Vδ2的CDR1处的Gly至Ser的单个残基置换使15D的结合活性完全丧失。如图30所示，Gly35被鉴定为15D结合的关键残基。Vδ2的CDR1、CDR2和CDR3的变化不影响B6、γδTCR泛MAb(即IMMU510)和γ9特异性Mab(即7A5)的结合。
实施例15.γδT细胞活化和扩增的新型调节剂的表位作图
CD2表位：
CD2分子由两个胞外免疫球蛋白超家族结构域，即Ig样V型结构域和Ig样C型结构域构成，它们上面的三个主要免疫原区已有所描述(Davis等人,Immunol Today 1996；17:177-187)。区域1和区域2位于第一结构域内，区域3位于第二结构域内。识别区域1的MAb结合静息和活化T细胞，并且可以强烈抑制CD58与CD2的结合。识别区域2的单克隆抗体具有相似的结合性质，但不能有效阻断CD58结合。识别区域3的单克隆抗体仅识别活化T细胞上的CD2，且不阻断CD58结合。
CD2激动剂MAb的结合表位作图通过针对CD58(CD2的天然配体)的竞争测定和活化测定来进行。此外，测试关键CD2结合残基的定点诱变(导致CD58的结合丧失)的MAb结合。突变的实例包括CD2序列的位置67(K至R)、70(Q至K)、110(Y至D)和位置111(D至H)的诱变。为了设计用于CD2的结合表位作图的构建体，使用VectorNTI(Thermo Fisher)进行人和小鼠CD2的序列比对。比对显示人和小鼠CD2之间具有50％序列同源性。预期结合人CD2的胞外结构域的MAb不与小鼠CD2发生交叉反应。为了鉴定结合表位，我们制备了小鼠/人嵌合CD2构建体的结构域交换。在此类构建体中，在表达CD2的胞外结构域的表达载体中，人N-末端Ig样V型结构域(残基25-128)被小鼠残基(23-121)替换。将嵌合cDNA种类瞬时转染至CHO或293细胞中。人野生型CD2和人小鼠嵌合构建体在CHO细胞的表面上表达。通过FACScanto分析嵌合CD2细胞表面表达。通过流式细胞术检测并通过活化测定验证嵌合分子的结合或结合丧失。
NKG2D表位：
通过抗hNKG2D抗体减少或阻断NKG2D与一种或多种其配体(MICA/MICB)的相互作用的能力，或通过与已知阻断hNKG2D配体相互作用的抗体的竞争来测试针对NKG2D的活化MAb的表位作图。通过减少NKG2D介导的NK细胞或T细胞活化的能力来鉴定激动剂MAb。这可以通过典型细胞毒性测定、配体阻断抗体的添加，或通过剂量依赖性方式阻断γδT细胞介导的表达MICA的肿瘤细胞杀伤来评估。
CD27表位：
通过功能测定或阻断人CD27与其天然配体人CD70之间的相互作用能力来进行针对CD27的激动剂抗体的表位作图。将表达CD27的细胞与5μg MAb一起在4℃下孵育30min，其后将1μg生物素酰化CD70加入管中。再在4℃下孵育混合物15min，然后洗涤。接下来，将细胞与链亲和素-PE的混合物(用于检测CD70配体结合)一起孵育30min，然后进行几个洗涤步骤并使用FACS进行分析。CD70结合的阻断表明MAb和CD70共有相同的表位。
实施例16：扩增的γδT细胞群的TCR Vδ谱系的表征
通过聚合酶链式反应(PCR)评估来自单个供体的扩增γδT细胞的克隆多样性。将从健康供体新鲜分离的PBMC的克隆多样性与用本文所述的不同活化剂(包括抗TCR特异性抗体、配体和凝集素)刺激7天和13天的培养物的克隆多样性进行比较。
提取前述γδT细胞的RNA，逆转录为cDNA，并使用Vδ1、Vδ2和Vδ3特异性引物对通过PCR扩增。将Vδ1正向引物(5’ATGCTGTTCTCCAGCCTGCTGTGTGTATTT 3’；SEQ ID NO:1)、Vδ2正向引物(5’ATGCAGAGGATCTCCTCCCTCATCCATCT 3’；SEQ ID NO:2)和Vδ3正向引物(5’ATGATTCTTACTGTGGGCTTTAGCTTTTTG 3’；SEQ ID NO:3)与A Cδ反向引物(5’CTTGGGGTAGAATTCCTTCACCAGACAAGC3’；SEQ ID NO:4)组合用于扩增500bp DNA片段。
使用Vγ特异性引物以单独的RT-PCR反应扩增γ链，以扩增Vγ2、Vγ3、Vγ4和Vγ5(5’GGTGCTTCTAGCTTTCCTGTCTCCTGC3’(SEQ ID NO:10))、Vγ8(5’ATGCTGTTGGCTCTAGCTCTGCTTCTA3’(SEQ ID NO:11))和Vγ9(5’ATGCTGTCACTGCTCCACACATCAACG3’(SEQ ID NO:12)。Vγ引物与Cγ反向引物(5’GGAAGAAAAATAGTGGGCTTGGGGGAA3’(SEQ ID NO:13))配对。γ反向引物基于Cγ1和Cγ2的共有序列。克隆PCR片段并获得80个独立的Vγ插入序列的核苷酸序列。分析Vδ、Dδ和Jδ连接序列，并进行CDR3序列比对。
实施例17：用于γδT细胞的工程改造的MAb和相关的靶向构建体
从cDNA克隆获得人CD20基因(Origene Technologies,Inc.,6 Taft Court,Suite100,Rockville,Md.20850)。使用正向引物(5'ATGACAACACCCAGAAATTCAGTAAATGG3'(SEQ IDNO:14))和反向引物(5'TCAAGGAGAGCTGTCATTTTCTATTGGTG3'(SEQ ID NO:15))扩增CD20基因，将扩增的CD20 cDNA整合进哺乳动物细胞高表达载体pCDNA3.4(Thermo FisherScientific)，并转染进CHO细胞宿主细胞。通过FACS分析来鉴定在细胞表面上高水平表达CD20分子的重组CHO细胞(CD20/CHO细胞)。
使用CD20/CHO细胞免疫工程改造为产生完全人抗体的BALB/C小鼠或转基因小鼠，如Jakobovits和Bornstein(Jakobovits Curr.Opin.Biotechnol.19956:561-6；Bornstein等人,Invest New Drugs.201028:561-74.)所述。通过FACS测定来筛选对人CD20具有高亲和力和特异性的抗体。通过CDR移植使小鼠抗体人源化(Kim和Hong Methods MolBiol.2012；907:237-45。还从小鼠或大鼠(工程改造为产生人重链单结构域抗体)产生人单结构域CD20抗体(Janssens等人,PNAS 2006,第103卷:15130)。
将编码上述高亲和力/特异性CD20抗体的基因克隆到MSGV1逆转录病毒载体骨架或pCAG慢病毒载体。从表达选择的MAb的小鼠杂交瘤或从人源化抗体链克隆VH和VL结构域。使用本文所述的CD20 MAb工程改造γδT细胞。
实施例18：用于γδT细胞的工程改造的TCR构建体
从表达NY-ESO-1-MHC特异性肽复合物的T淋巴细胞分离表达包含高反应性αβTCR链的序列的TCR的构建体。NY-ESO-1-MHC特异性肽复合物诱导针对各种表达NYESO-1的肿瘤的有效体外和体内抗肿瘤活性。
从黑素瘤、肉瘤患者或从具有来源于人黑素瘤或肉瘤肿瘤的患者来源异种移植物的小鼠分离高反应性αβTCR链。或者，TCR来源于已改变为具有表达NY-ESO-1肽或NYESO-1肽复合物的人源化免疫系统的小鼠(参见Gonzales等人,Immunol Res.201357:326-334；Boucherma等人,J Immuno.2013.191；583-593；Liang-PingL.等人,Nature Med.2010,16:1029-1035)。鉴定在显性I类等位基因HLA-A*02(例如，肽SLLMWITQC残基157-167(SEQ IDNO:16))和显性HLA-A*01相关肽的背景下识别NY-ESO-1的表位的T细胞。
使用一步RT-PCR试剂盒(Qiagen Hilden Germany)根据制造商的建议通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)产生TCRα和TCRβ转录物的序列。从由反应性T细胞分离的RNA产生第一链cDNA。使用TRIzol总RNA分离试剂(Invitrogen Life Technologies)从CTL克隆提取总RNA。TCRα和β链的扩增通过可结合至以氨基酸位置34和35(Kabat编号)处的色氨酸-酪氨酸残基为中心的TCRα和β链V区的高度保守区的一组简并引物来进行，该引物与α和β恒定区反向引物组合使用(Moonka和Loh Journal of Immunological Methods 169(1994)41-51)。凝胶纯化扩增的PCR片段并直接测序。序列信息用于设计适用于克隆单个全长cDNA的PCR引物。
克隆TCR基因并插入基于MSGV的逆转录病毒载体和从选择的T细胞扩增的全长cDNA。使用MSGV1骨架构建编码野生型NY-ESO-1反应性人TCR的α和β链的逆转录病毒载体。TCRα和TCRβ链的连接通过一个构建体中的内部核糖体进入位点(IRES)元件，或通过使用可切割的小RNA病毒肽序列分离来进行。
逆转录病毒上清液通过使用上文所述的Lipofectamine 2000(Invitrogen)用每种MSGV1 TCR载体和编码内源性病毒逆转录病毒包膜蛋白的载体一起共转染稳定表达MMLVgag和pol蛋白的293细胞，或通过使用Nucleofector(Lonza)的电穿孔来产生。在转染后第2天和第3天收集上清液，并用含10％FCS的新鲜DMEM 1:1稀释。工程改造的γδT细胞能够适当表达编码TCRα和β链的基因，而不需要任何另外操作。
实施例19.使用αβTCR构建体来工程改造γδT细胞
使用标准技术从选择的对所需抗原具有特异性的T细胞克隆包含αβTCR(肿瘤识别部分)的多核苷酸。使用前述实施例所述的方法使分离的内源性野生型γδT细胞生长至至少6×106个细胞，然后使用包含编码肿瘤识别部分的表达盒的逆转录病毒或慢病毒感染。病毒感染的标准方案可用于将载体系统引入野生型γδT细胞。选择标志物的表达用于选择已成功转染的细胞。
可以通过流式细胞术和/或通过定量QRT-PCR以及通过使用细胞毒性和细胞因子分泌的靶细胞进行的功能测定来评估工程改造的αβTCR的表达。还可通过流式细胞术和/或通过定量qRT-PCR来评估工程改造的活化结构域的表达。通过流式细胞术来确定表达所关注的细胞表面标志物的工程改造的γδT细胞的数量。使用本文所述的合适方法(诸如CRISPR-Cas、talen、大范围核酸酶、锌指或睡美人转座子技术)使工程改造的γδT细胞进一步工程改造，以使与HLA基因或β2M基因相关的外显子缺失。
实施例20：使用CAR和TCR构建体来工程改造γδT细胞
使用基于逆转录病毒或慢病毒的载体转导γδT细胞，以表达可引导工程改造的γδT细胞特异性识别肿瘤细胞并活化以杀伤肿瘤细胞的靶向部分。转导的靶向部分包括针对肿瘤特异性表面蛋白或肿瘤特异性胞内肽的MAb。还使用涉及肽-MHC复合物的高亲和力TCR来工程改造γδT细胞。
或者，可以通过使用非病毒载体转导来工程改造细胞。
实施例21：使用靶向部分来工程改造分离的γδT细胞
CAR构建体设计由不同的主要功能结构域、识别肿瘤细胞上展示的所关注的蛋白质或MHC相关肽的靶标部分、将胞外受体靶向元件连接至跨膜结构域的短间隔序列(它跨越细胞膜并连接至胞内活化信号传导结构域)构成。
在γδT细胞的表面上表达的靶标部分受体将被设计为特异性结合在癌细胞上表达的靶蛋白。肿瘤识别部分将针对靶标设计，所述靶标包括CD19、CD20、CD22、CD37、CD38、CD56、CD33、CD30、CD138、CD123、CD79b、CD70、CD75、CA6、GD2、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、CEACAM5、CA-125、MUC-16、5T4、NaPi2b、ROR1、ROR2、5T4、PLIF、Her2/Neu、EGFRvIII、GPMNB、LIV-1、糖脂F77、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、PSMA、STEAP-1、STEAP-2、间皮素、c-Met、CSPG4、PVRL-4、VEGFR2、PSCA、叶酸结合蛋白/受体、SLC44A4、Cripto、CTAG1B、AXL、IL-13Rα2、IL-3R和SLTRK6。
靶标部分受体可来源于对在肿瘤细胞的表面上表达的肿瘤糖蛋白具有特异性的抗体的一部分，或者工程改造的受体可以来源于具有已知特异性的TCR受体，或识别来源于MHC复合物相关的表面上呈递的胞内肿瘤特异性抗原的特定肽序列的抗体，所述胞内肿瘤特异性抗原包括gp100、MART1、酪氨酸酶、SSX2、SSX4、NYESO-1、上皮肿瘤抗原(ETA)、MAGEA家族基因(诸如MAGEA3、MAGEA4)、KKLC1、突变的N和K和H ras、BRaf、p53、MHC I类链相关分子A(MICA)、MHC I类链相关分子B(MICB)或者HPV、EBV或CMV中的一种或多种抗原。这种高亲和力T细胞受体(如肿瘤识别部分)将识别具有高度特异性的肽-MHC复合物。
实施例22：使用间隔序列和跨膜结构域来靶向部分构建体
不同的间隔序列将被工程改造为肿瘤识别部分构建体，以优化工程改造的T细胞对癌细胞的效力。每个间隔序列的大小将根据靶蛋白的大小、受体识别的表位、工程改造的肿瘤识别部分的大小以及受体的亲和力而变化。可以调节构象变化的间隔序列包括人IgG、CD8a和CD4铰链区的序列。
测试的间隔序列由以不同长度(19至9个残基)使用的Gly、Ser和Thr氨基酸构成，以提供具有改善的结合亲和力性质的嵌合受体。每个构建体的铰链和跨膜部分来源于CD8a序列(人CD8a的残基117至178)或者具有CD28跨膜结构域的人IgG1铰链-Fc cDNA(残基153-179)。
实施例23：具有共刺激结构域的靶向部分构建体
不同的共刺激结构域将被工程改造为包含肿瘤识别部分的构建体。包含CD28、4-1BB、CD2、CD27、NKG2D、DAP10、DAP12、CD161、CD30、JAML、TLR、CD244或CD100共刺激信号传导结构域的共刺激结构域被工程改造进入γδT细胞，以模拟通过嵌合受体放大活化的“第二信号”，产生繁殖和杀伤癌细胞的更强大信号。
胞质区来源于αβ和/或γδT细胞共刺激分子的内部结构域，包括：CD28(残基180-220)、CD137(残基214-255)、ICOS(残基165-199)、CD27(残基213-260)、NKG2D(残基1-51)、JAML(残基297-394)、CD2(残基236-351)、CD30(残基408-595)、OX40(残基1-23)、HVEM(残基224-283)或CD46分子。根据用于诱导细胞毒性的工程改造的γδT细胞群的活化程度，并且根据体外和体内的细胞因子分泌程度来选择最佳构建体。
实施例24：包含CD3ζ活化结构域的靶向部分
克隆含有三个ITAM结构域(ITAM1:APAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKR,(SEQ IDNO:5)；ITAM 2:PQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGM,(SEQ ID NO:6)；和ITAM3:ERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQ,(SEQ ID NO:7)的胞内CD3ζ(残基52-164)。
使用引物5’AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCA-3’(SEQ ID NO:8)和反向引物5’CTCGAGTGGCTGTTAGCCAGA-3’(SEQ ID NO:9)来扩增TCRζ的胞内结构域。
通过多步骤重叠延伸PCR来产生CAR构建体。使用重叠延伸聚合酶链式反应方案，在Platinum Taq DNA聚合酶高保真试剂盒(Invitrogen)加尾的引物驱动的单个PCR反应中融合产物。将编码全长构建体的DNA连接至MSGV1逆转录病毒载体。构建体提供包含CD3ζ活化结构域的CAR靶向部分。
实施例25：使用多于一个识别部分工程改造γδT细胞
使用包含肿瘤识别部分(包括涉及相同胞内肿瘤特异性蛋白的TCR和MAb)的多于一种构建体转导γδT细胞。在不同的MHC单体型(诸如A2和A1)、涉及在相同的肿瘤细胞上表达的不同靶标的抗体或涉及相同靶标上的不同表位的抗体的背景下，选择每个构建体以识别特定肽。
实施例26.工程改造的γδT细胞的体外扩增
使用适当的组织培养基(诸如上述实施例所述的组织培养基)来生长和扩增工程改造的γδT细胞。工程改造的γδT细胞在5％CO2培育箱中37℃下，使用或不使用外部抗原刺激，且不与APC或氨基磷酸盐共培养的情况下指数生长至约1x106。
实施例27：由活化的工程改造的和非工程改造的γδT细胞释放的细胞因子的功能 表征
使用商业化酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒测量IFN-γ、TNF-α(R&D Systems)、IL-1β、IL-2(Biosource International)、IL-12(Diaclone Research)、IL-6和IL-18的表达。根据制造商的说明进行酶联免疫吸附测定。在包被有抗人细胞因子的单克隆小鼠IgG1的聚苯乙烯96孔板(Maxisorb,Nunc)中，以于0.05M碳酸氢钠缓冲液中1μg/ml的浓度在4℃下孵育过夜，在不同的时间点(24至72小时)测定细胞因子的量。在用含有0.05％Tween 20的PBS洗涤后，用3％于PBST中的牛血清白蛋白(BSA，重量/体积，Sigma)在37℃下封闭平板1h。加入来自γδ培养物样品的标准品(R&D的重组人细胞因子)和上清液，在室温下孵育平板2h。使用与重组人细胞因子标准品相关的匹配抗体对进行检测。
实施例28.鉴定共刺激剂
通过将共刺激剂加入整个PBMC或富集的工程改造的和非工程改造的γδT细胞群来测试不同的共刺激剂支持工程改造的和非工程改造的γδT细胞的活化、扩增和存活的能力。将可溶性或固定化形式的共刺激剂加入不同的活化剂(包括抗γδTCR特异性MAb)中。在存在或不存在CD2、CD27、CD28、CD30、CD137、ICOS、CD161、CD122、CD244和NKG2D的可溶性或固定化激动抗体，或刺激配体(包括CD70-FC(CD27的配体)、MICA、MICB和ULBP(NKG2D的配体)、4-1BB(CD137的配体)和Pilar 9(CD161的配体))的情况下，将如上述实施例所述从健康供体的血沉棕黄层纯化的人PBMC或从组织分离的淋巴细胞以2x106接种于含有2-10μg抗γδTCR抗体的24孔平底组织培养板的1mL补充有100IU/mL rhIl-2的完全RPMI-1640培养基中。
实施例29.细胞因子支持活化
通过将细胞因子加入整个PBMC或富集的工程改造的和非工程改造的γδT细胞群来测试不同的细胞因子支持工程改造的和非工程改造的γδT细胞的活化、扩增和存活的能力。为了测试细胞因子活化支持，将各种细胞因子每3天以100IU/mL分别加入单独的细胞培养物。所测试的细胞因子包括IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-33、IL-21、IL-18、IL-19、IL-4、IL-9、IL-23、IFN-γ和IL1β。在选择的时期结束后，收集细胞样品，并通过流式细胞术确定细胞群的组成，即γδT细胞、αβT细胞、B细胞和NK细胞的百分比。
将细胞保持在培养物中，并且在第14天和第21天测试所选择的群体的扩增。
实施例30：活化来源的Vδ1+、Vδ2+ T细胞群对肿瘤细胞具有细胞毒性
为了确定本发明的选择性活化的、富集的δ1和δ2 T细胞群的细胞毒性，使用Ficoll paque PLUS(GE Healthcare#17-1440-02)密度梯度离心从由正常供体获得的血沉棕黄层分离PBMC，并以1×106个细胞/mL接种于24孔板的R2培养基(在补充有青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺和100IU/mL人重组IL2的RPMI1640中含10％胎牛血清)中。
在第0天，将细胞接种于包被有1μg/mlδ1特异性MAb(TS1、TS8.2)或δ2特异性MAb(15D、B6)的孔中，以活化PBMC群体内的γδ细胞。在第3天和第5天进行50％培养基交换。在第7天，将活化的细胞移至无任何MAb包被的6孔培养皿，扩增并以约1×106个细胞/mL维持直到第14天。为了进一步进行Vδ1+和Vδ2+活化的T细胞培养，使用结合至抗小鼠IgGMicroBeads(Miltenyi#130-048-401)的IP26单克隆抗体(Biolegend#306702)正向选择αβT细胞并将其从δ1和δ2活化的培养物剔除。如图31所示，这产生高度富集的Vδ1+和Vδ2+ T细胞群。还收集正向选择的αβT细胞(富集αβ)。这些富集的Vδ1+、Vδ2+和αβT细胞培养物维持在R2培养基中直到第22天。
在第22天，通过流式细胞术确定富集培养物的γδ和αβT细胞组成，使用分别抗δ1、δ2和αβ的TS8.2、B6和IP26抗体进行表面TCR染色。高度富集的培养物分别含有92％、98％和99％的Vδ1+(TS8.2+)、Vδ2+(B6+)和αβ(IP26+)T细胞。
使用Vδ1+、Vδ2+和αβT细胞群进行体外细胞毒性分析
为了评估Vδ1+、Vδ2+和αβT细胞培养物的细胞毒性，将效应细胞以10:1比例与靶细胞系一起孵育6小时。在该分测定中测试的靶细胞系包括实体瘤细胞系BxPc3(CRL-1687TM)胰腺癌和SK-MEL-5(HTB-70TM)人黑素瘤以及血液B肿瘤细胞系RPMI8226(CCL-155TM)。使用CytoTox Glo试剂(Promega目录号)测定细胞死亡。使用以下公式计算特异性裂解％：
测试高度富集的Vδ1+、Vδ2+和αβT细胞培养物杀伤BxPC3、SKMEL5和RPMI8226细胞系的能力。如图32所示，Vδ1+ T细胞显示出杀伤上皮肿瘤细胞系BxPC3和SKMEL5以及浆细胞瘤细胞系RPMI8226的能力。(图32A)而Vδ2+ T细胞显示出主要针对RPMI8226的效力，并且对实体瘤细胞系的效力较低。αβT细胞不显示出任何细胞毒性活性。
实施例31：体外扩增的γδT细胞的抗肿瘤活性
以1:1至40:1之间的效应细胞与靶细胞比测试针对各种肿瘤细胞系和原发性肿瘤细胞的细胞毒性活性。通过检测胞内酶(即，乳酸脱氢酶)的释放来测量肿瘤细胞系和原发性肿瘤细胞的裂解。通过流式细胞术、ELISA和/或ELISPOT测定来测量培养物中表达工程改造的肿瘤识别部分的γδT细胞的百分比。
实施例32：体内抗肿瘤活性
给用人肿瘤异种移植物移植的免疫缺陷小鼠或huPBMC-NOG(Taconic)小鼠或具有上文所述的人源化免疫系统的小鼠的群组皮下或原位注射来源于患者来源的肿瘤或肿瘤细胞系(包括结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、头颈癌、前列腺癌、膀胱癌、口腔癌、胰腺癌和肝癌)的细胞，并允许达到50-100mm3的平均大小。将初始的或工程改造的、富集的或分离的γδ-T细胞以一定剂量范围静脉内注射至小鼠或直接注射至肿瘤。肿瘤消退定义为与未治疗和特定适应症的护理标准相比，γδ-T细胞给药后肿瘤体积的减小。在一些实验中，用GFP或荧光素酶标记初始的或工程改造的γδT细胞，并注射至具有肿瘤的小鼠，以跟踪它们的持续和归巢。在研究结束时，收集肿瘤并通过流式细胞术和免疫组织化学来分析GFP阳性细胞。
实施例33.来源于抗体特异性活化的Vδ1和Vδ2群体的多克隆TCR多样性
从TS8.2和B6活化群体扩增和克隆TCR链。在δ1特异性活化mAb TS8.2和δ2特异性MAb B6特异性活化14天之后收集PBMC培养物。在350μl RLT缓冲液(Qiagen)中裂解PBMC培养物，使用Qiagen RNeasy微型试剂盒(Qiagen，目录号74106)根据制造商的说明从5X105个细胞纯化总RNA。简而言之，将350μl 70％乙醇加入细胞裂解物，以提供理想的结合条件。然后将裂解物加入RNeasy二氧化硅膜离心柱。洗掉污染物。在50μl水中洗脱浓缩的RNA。
一步RT PCR：使用5′δ1(5’GCCCAGAAGGTTACTCAAGCCCAGTC3’)和5’δ2(5’GCCATTGAGTTGGTGCCTGAACACC 3’)引物与3′人Cδ(5’TTACAAGAAAAATAACTTGGCAGTCAAGAGAAA3’)引物组合扩增全长δ链。将全长δ链的800bp PCR片段克隆至pCI表达载体(Promega目录号E1841)。类似地，使用5’引物γ2、γ3、γ4(5’TCTTCCAACTTGGAAGGGAGAACGAAGTC 3’)、γ5(5’TCTTCCAACTTGGAAGGGGGAACGA 3’)、γ8(5’TCTTCCAACTTGGAAGGGAGAACAAAGTC 3’)、γ9(5’GCAGGTCACCTAGAGCAACCTCAAATTTCC 3’)与单个3’Cγ引物(5’GGAAGAAAAATAGTGGGCTTGGGGGAA 3’)组合扩增全长γ链。
使用逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)从100ng总RNA扩增δ和γ转录物。对于TS8.2 MAb活化的每个样品运行总共五个RT-PCR反应(δ1、γ2-γ4、γ5、γ8和γ9)，并且对于B6 MAb活化的每个样品运行两个RT-PCR反应(δ2和γ9)。使用QIAGEN一步RT-PCR试剂盒进行扩增(Qiagen,Inc.)。该试剂盒提供了Sensiscript和Omniscript逆转录酶、HotStarTaq DNA聚合酶、dNTP混合物、缓冲剂和Q-溶液(允许有效扩增“难以扩增的”(例如，富含GC)模板的新型添加剂)的混合物。制备包含5μl RNA、0.5 100μMδ或γ链引物(通过IDT合成定制)、5μl 5×RT-PCR缓冲剂、1μl dNTP、1μl含有逆转录酶和DNA聚合酶的酶混合物以及0.4μl核糖核酸酶抑制剂RNasin(1个单位)的反应混合物。反应混合物含有逆转录和PCR所需的所有试剂。热循环仪程序为RT步骤50℃30分钟，95℃15分钟，然后是30个循环的(95℃30秒，48℃30秒，72℃1.0分钟)。然后是最终孵育72℃10分钟。将提取的PCR产物直接克隆到pCI表达载体。使用IMGT分析核苷酸序列，以鉴定具有最高序列同源性的生殖系V、D和J基因成员。
TS8.2 CDR3活化的Vδ1链的序列的实例(连接多样性以粗体文本指示)：
TS8.2活化的克隆1 Vδ1、J1
TS8.2活化的克隆2 Vδ1、D3、J1
TS8.82活化的克隆3 Vδ1、D2+D3、J1
TS8.2活化的克隆4 Vδ1、D3、J1
TS8.2活化的克隆5 Vδ1 D1+D3、J1
TS8.2活化的克隆6 Vδ1 D1+D3、J1
TS8.2活化的克隆7 Vδ1、D2和D3、J1
TS8.2活化的克隆8 Vδ1、D2和D3、J1
TS8.2活化的克隆9 Vδ1、D2和D3、J1
TS8.2 Mab活化的γ链的实例：
B8 TS8.82活化的克隆-1 γ4、J1/J2
B8 TS8.82活化的克隆-2 γ9、JP1
TS8.2活化的克隆-3 γ4、J1
TS8.2活化的克隆-4 γ9、J1/J2
TS8.2活化的克隆5 γ2、J1
TS8.2活化的克隆6 γ3、JP2
TS8.2活化的克隆7 γ2、JP1
TS8.2活化的克隆8 γ4、J1/J2
TS8.2活化的克隆9 γ9、JP1
TS8.2活化的克隆10 γ3、J1
TS8.2活化的克隆11 γ3、JP2
TS8.2活化的克隆12 γ4、J2
TS8.2活化的克隆13 γ2、JP1
TS8.2活化的克隆14 γ4、J1/J2
TS8.2活化的克隆15 γ9、J1
TS8.2活化的克隆16 γ2、J1
TS8.2活化的克隆17 γ4、JP1
B8(血沉棕黄层8)-B6活化的克隆：
B6活化的克隆 δ2、D3、J1
B6活化的克隆 δ2、D3、J1
B6活化的克隆 δ2、D2+D3、J1
B6活化的克隆 δ2、D3、J1
B6活化的克隆 δ2、D3、J1
B6活化的克隆 δ2、D3、J1
B6活化的克隆 δ2、D2+D3、J1
B6活化的克隆 δ2、D3、J3
B6活化的克隆 δ2、D2+D3、J1
B6活化的克隆 δ2、D1+D3、J1
B6活化的γ链：
B6活化的克隆γ9、JP1
B6活化的克隆γ9、JP1
B6活化的克隆γ9、JP1
B6活化的克隆γ9、JP1
B6活化的克隆γ9、JP1
B6活化的克隆γ9、
B6活化的克隆γ9、
B6活化的克隆γ9、
B6活化的克隆γ9、
B6活化的克隆γ9、JP1
实施例34.在冷冻培养基中超低温保存γδT细胞，以得到用于进一步加工的细胞 库
在冷冻培养基中配制未修饰的γδT细胞，并置于低温储存单元(诸如液氮冷冻剂(-195℃)或超低温冷冻剂(-65℃、-80℃或-120℃)中长期储存。冷冻培养基含有二甲亚砜(DMSO)、氯化钠(NaCl)、葡萄糖、硫酸葡聚糖或羟乙基淀粉(HES)以及在6.5和7.5之间的生理pH缓冲液。
使超低温保存的γδT细胞解冻，并通过使用抗体、蛋白质、肽和细胞因子刺激来进一步加工。使超低温保存的γδT细胞解冻，并如本专利申请上文所述进基因修饰。将工程改造的γδT细胞进一步超低温保存，以得到冷冻培养基中浓度为106至108个细胞/mL，量为10、100、200瓶的细胞库。将非工程改造的和/或工程改造的γδT细胞进一步超低温保存，以得到冷冻培养基中浓度为106至108个细胞/mL，量为10、100、200、500和1,000瓶或袋的细胞库。
实施例35.在冷冻培养基中超低温保存γδT细胞，以得到用于进一步加工的细胞 库的替代方案
将其它超低温保存剂添加至上述实施例所述的超低温保存支持物，以在冷冻和解冻过程期间提供营养支持和生物物理学细胞保护，从而防止裂解。这些超低温保存剂包括D-葡萄糖、甘露糖醇、蔗糖、腺嘌呤、鸟苷、重组人白蛋白、柠檬酸、抗凝剂、Benzonase、DNA酶、丙二醇、乙二醇、2-甲基-2,4-戊二醇。被设计为为高细胞密度冷冻产物提供缓冲能力的另外添加剂包括无机磷酸盐、碳酸氢钠和HEPES。
实施例36.在冷冻培养基中超低温保存γδT细胞，以得到用于进一步加工的细胞 库
在设计为实现-0.1℃至-5℃/分钟之间的冷冻速率的温度控制跃升中，使用受控速率冷冻机(例如CryoMed受控速率冷冻机)或具有适当绝热的支架系统(以提供所需的冷冻速率)的机械-70℃冷冻机进行γδT细胞的初始冷冻。将冷冻的细胞置于-70℃冷冻剂中短期储存最多30至60天。将冷冻的细胞置于液N2储存罐中长期储存最多12、24、36和48个月，同时维持γδT细胞数和细胞功能，而不发生恶化，如前面部分所述的方法所测定。
使本实施例所述的超低温保存的细胞解冻，并在合适的封闭容器(诸如细胞培养袋和/或生物反应器)中进一步刺激和扩增，得到可施用于受试者的适量工程改造的γδT细胞。
实施例37.用于直接输注给患者的γδT细胞制剂
通过离心和/或膜渗滤将工程改造的γδT细胞浓缩至含有防冻赋形剂的生理缓冲液中5x106个细胞/mL和108个细胞/mL之间，并置于低温储存单元(诸如液氮或超低温冷冻剂)中长期储存。
实施例38.患癌人受试者的治疗
使新鲜的或冷冻的工程改造的和/或非工程改造的γδT细胞在床边解冻，并给人受试者静脉内输注。在30-60分钟的时间段内将约1个细胞/千克至约1x1010个细胞/千克工程改造的和/或非工程改造的γδT细胞输注至人受试者。在或不在共刺激细胞因子IL-2或其它细胞因子的帮助下施用工程改造的γδT细胞。任选地，重复该程序。通过流式细胞术测定γδT细胞在受试者体内的扩增。
实施例39.特定γδT细胞活化剂的产生
通过重组可溶性人γδTCR的免疫来产生鼠科动物抗体形式的γδT细胞活化剂。通过使用γ8δ1-TCR-FC免疫来产生δ1特异性活化剂，并且通过使用γ9δ2-TCR-FC免疫来产生δ2特异性活化剂，这两种构建体均包含融合至人IgG1FC的γδTCR链的成熟ECD。用人重组γδTCR接种三个小鼠品系(Balb/c、CD-1和FVB)，以提供分泌高亲和力鼠科动物单克隆抗体活化剂的杂交瘤。
通过PCR扩增产生hγδTCR-Fc融合构建体。从由BE13(DSMZ#ACC 396)(表达γ8δ1TCR的T细胞白血病细胞系)分离的RNA扩增γ8δ1 TCR链。从由唑来膦酸活化的人PBMC分离的RNA扩增γ9δ2TCR链。从瞬时转染的HEK 293细胞的上清液纯化可溶性δ1TCR-FC和δ2TCR-FC。用等体积的Gold(Sigma Aldrich)或Imject Alum佐剂(Thermo Fisher)乳化10μg可溶性TCR，并用于免疫每只小鼠。然后通过足垫途径将所得的乳液注入六只小鼠(每种品系2只：Balb/c、CD-1和FVB)。
使用固相ELISA测定筛选小鼠血清的对人γδTCR具有特异性的小鼠IgG抗体。简而言之，用1μg/ml于ELISA包被缓冲液中的重组γδTCR包被96孔板(VWR International,目录号610744)过夜。在用含有0.02％(v/v)Tween 20的PBS洗涤后，用溶于PBS的3％(w/v)BSA封闭孔，200μL/孔在室温下(RT)放置1小时。滴定(1:100、1:200、1:400和1:800)小鼠血清，并以50μL/孔加入γδTCR包被的板，并在室温下孵育1小时。洗涤平板，然后与50μL/孔HRP标记的山羊抗小鼠IgG(在3％BSA-PBS或溶于PBS的2％FCS中1:10,000稀释)在室温下孵育1小时。再次洗涤平板，在室温下加入40μL/孔TMB底物溶液(Thermo Scientific 34028)15分钟。在显色后，加入等体积的2N H2SO4以停止底物显色，并且通过分光光度计在OD 450下分析平板。
处死血清阳性免疫小鼠并切下引流淋巴结(膝后窝和腹股沟)，并用作产生抗体的细胞的来源。使B细胞的单细胞悬浮液(766×106个细胞)与非分泌型P3x63Ag8.653骨髓瘤细胞(ATCC#CRL-1580)通过电融合以1:1的比率融合。使用BTX HybrimmuneTM系统(BTXHarvard Apparatus)根据制造商的说明进行电融合。在融合后，将细胞重悬于补充有重氮丝氨酸(Sigma#A9666)的杂交瘤选择培养基、含有15％胎儿克隆I血清(Hyclone)、10％BMCondimed(Roche Applied Sciences)、4mM L-谷氨酰胺、100IU青霉素-链霉素和50μM 2-巯基乙醇的含丙酮酸钠的高葡萄糖DMEM培养基(Cellgro目录号15-017-CM)中，然后接种于三个T150烧瓶中，每个烧瓶50mL选择培养基。然后将烧瓶置于含有5％CO2和95％空气的潮湿的37℃培育箱中持续6-7天。
在生长六天后，使用Aria II细胞分选仪将包含在T150烧瓶中大批生长的细胞的文库以1个细胞/孔接种于Falcon 384孔平底板中。然后使选择的杂交瘤在90μL含有15％胎儿克隆I血清(Hyclone)、10％BM-Condimed(Roche Applied Sciences)、1mM丙酮酸钠、4mML-谷氨酰胺、100IU青霉素-链霉素、50μM 2-巯基乙醇和100μM次黄嘌呤的培养基中生长。冷冻任何其余未使用的杂交瘤文库细胞，用于将来文库测试。在生长十天后，通过ELISA和FACS测定来测定每孔接种细胞的上清液对δ1TCR的抗体反应性。
对于通过FACS-杂交瘤筛选，使用基于流式细胞术的测定来筛选分泌鼠科动物免疫球蛋白的孔的人δ1/TCR特异性。将表达δ1γ8TCR的BE13细胞或表达δ2γ9TCR的唑来膦酸处理的人PBMC在冰上与25μL杂交瘤上清液一起孵育60分钟。用PBS、2％FCS洗涤细胞两次，然后与50μL缀合至PE的山羊抗小鼠IgG Fc片段特异性二抗(在PBS/2％FCS中1:300稀释)孵育。在孵育15分钟后，用PBS/2％FCS洗涤细胞两次，重悬于含DAPI的PBS/2％FCS中，并使用FACS Canto根据制造商的说明通过流式细胞术进行分析。对含有优先结合BE13细胞的免疫球蛋白的孔进行扩增，并通过ELISA测定进一步测试δ1特异性。对含有优先结合唑来膦酸活化的PBMC细胞的免疫球蛋白的孔进行扩增，并通过ELISA测定进一步测试δ2特异性。
使用通过配对以下γδTCR链产生的可溶性γδTCR蛋白质包被高结合的ELISA 96孔板：γ8δ1、γ8δ2、γ9δ1和γ9δ2。稀释可溶性TCR并在碳酸钠缓冲液中以1μg/ml在4℃下使用过夜。使用于PBS/Tween中的3％BSA在37℃下洗涤和封闭平板一小时。立即使用或保存在4℃下。在室温下平板上孵育未稀释的杂交瘤上清液一小时。洗涤平板并使用HRP标记的山羊抗小鼠IgG(在3％BSA-PBS中1:10,000稀释)在室温下探测一小时。然后如上文所述使用底物溶液孵育平板，并在OD 450下读数。转移和扩增含有优先结合人δ1 TCR链(通过背景之上信号确定)的免疫球蛋白的孔。
将所得的δ1和δ2 TCR特异性克隆杂交瘤在CS-10冷冻培养基(BiolifeSolutions)中超低温保存并储存在液氮中。
实施例40.δ1和δ2特异性活化剂的测序
选择示例性的特异性结合、活化和扩增δ1 T细胞的不同单克隆抗体进行测序和进一步分析。如下表所示，实施例39中产生的选择的δ1-γδTCR特异性单克隆抗体的重链可变区(图33)和轻链可变区(图34)的序列分析确认了新互补决定区，并显示出新VDJ排列。图33-34所示的互补决定区由Kabat定义。单独选择示例性的特异性结合、活化和扩增δ2 T细胞的不同单克隆抗体进行测序和进一步分析。如下表所示，实施例39中产生的选择的δ2-γδTCR特异性单克隆抗体的重链可变区(图35)和轻链可变区(图36)的序列分析确认了新互补决定区，并显示出新VDJ排列。图35-36所示的互补决定区由Kabat定义。
使用RNeasy分离试剂盒(RNeasy微型试剂盒Qiagen#74106)从选择的杂交瘤细胞提取总RNA。在350μl RLT缓冲液中裂解104个杂交瘤细胞，加入等体积的70％乙醇，并将样品上样至RNeasy微型离心柱。洗涤柱两次，并通过将100μl无RNA酶水直接上样至离心柱膜来洗脱RNA。通过在1％琼脂糖凝胶中取出3μL来确定RNA制剂的量，然后储存在-80℃下直到使用。
使用包含三十二个小鼠特异性前导序列引物(设计为靶向完全小鼠VH库)的5′引物混合物与对所有小鼠Ig同种型具有特异性的3′小鼠Cγ引物组合来扩增每个杂交瘤的Ig重链的可变区。使用相同的PCR引物从两个末端对VH的400bp PCR片段测序。类似地，使用三十二个5′Vκ前导序列引物(设计为扩增每个Vκ小鼠家族)的混合物与对小鼠κ恒定区具有特异性的单个反向引物组合对κ轻链扩增和测序。使用逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)从100ng总RNA扩增VH和VL转录物。
对每种杂交瘤运行总共八个RT-PCR反应：Vκ轻链四个，Vγ重链四个。使用一步法OneStep Ahead RT-PCR试剂盒进行扩增(Qiagen#220213)。制备包含5μL RNA、0.5 100μM重链或κ轻链引物(通过IDT合成定制)、12.5μL DNA聚合酶、缓冲剂、dNTP的主混合物、1μL含有逆转录酶和DNA聚合酶的酶混合物以及0.4μL核糖核酸酶抑制剂RNasin(1个单位)的反应混合物。反应混合物含有逆转录和PCR所需的所有试剂。热循环仪程序设置为RT步骤50℃10分钟，95℃5分钟，然后是30个循环PCR(95℃30秒，58℃30秒，72℃一分钟)。然后是在72℃下最终孵育10分钟。
使用QIAquickTMPCR纯化试剂盒(Qiagen)根据制造商的方案制备用于直接DNA测序的PCR产物。使用50μL无菌水从离心柱洗脱DNA，然后使用特异性V区引物从两条链直接测序。使用VBase2分析核苷酸序列，以鉴定具有最高序列同源性的生殖系V、D和J基因成员。
图33描绘了来自δ1特异性抗体的重链可变区的连续氨基酸序列。图34描绘了轻链可变区的对应连续氨基酸序列。总之，图33-34提供了所鉴定的可操作抗δ1 TCR抗体的注释序列。
图35描绘了来自δ2特异性抗体的重链可变区的连续氨基酸序列。图36描绘了轻链可变区的对应连续氨基酸序列。总之，图35-36提供了所鉴定的可操作抗δ2 TCR抗体的注释序列。
实施例41.δ1特异性活化剂的交叉反应
第三γδ群体是Vδ3 T细胞，它占约0.2％的循环T细胞。
Vδ3 T细胞在血液中很少见，但在肝和白血病和一些慢性病毒感染患者中很丰富。其它次要亚群包括Vδ4、Vδ5、Vδ6、Vδ7和Vδ8γδT细胞，由分别剪接成编码不同的TCRα和δ蛋白的Cδ的VJα基因组成。
通过结合测定测试δ1特异性活化剂与其它γδT细胞群发生交叉反应的交叉反应性和能力，以检测δ1特异性特异性活化剂与由8个不同的δ链(Vδ1、Vδ2、Vδ3、Vδ4、Vδ5、Vδ6、Vδ7和Vδ8)组成的可溶性TCR的结合。全部八个δ链克隆为C-末端Fc融合物，并与γ-FC链一起共转染至293细胞，可溶性TCR-FC分泌至培养基中。
在转染前一天，将293贴壁细胞以1x105个细胞/孔接种于12孔板中。
在转染当天，使用293fectinTM转染试剂(Thermo Fisher#12347019)在无血清培养基中共转染0.5μg每种质粒(δ+γ链)。
在转染后3天收集分泌的TCR用于ELISA测定中的结合分析。
ELISA结合分析。
将可溶性TCR-FC蛋白被捕获至包被有1μg/mL山羊抗人FC(山羊抗人IgG、Fcγ片段特异性-Jackson ImmunoResearch#109-005-098)的ELISA平板的表面。在4℃下进行结合过夜。通过使用HRP缀合的二抗：山羊抗小鼠FC特异性(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.Peroxidase-AffiniPure山羊抗小鼠IgG，Fcγ片段特异性#115-035-008)(在封闭缓冲液中1:10,000稀释)检测来测试δ1特异性特异性活化剂与捕获在平板上的可溶性γδTCR的结合，然后向每个孔添加TMB底物。结果如图37所示。
除δ1 T细胞之外，与其它γδT细胞亚群交叉反应和使其活化的能力可以是重要的，因为克隆扩增的TRDV4和TRDV8 T细胞显示出有助于针对AML的免疫应答，而寡克隆TRDV5和TRDV6可能出现在经历复发的患者中。(Jin等人Journal of Hematology&Oncology(2016)9:126)。
实施例42.活化和增殖测定
测试δ1和δ2 TCR特异性抗体诱导γδT细胞的活化和增殖的能力。简而言之，用于50mM NaHCO3或PBS中5μg/mL的山羊抗小鼠Fc-γ多克隆抗体包被48孔板(Corning)过夜。用PBS洗涤孔，并用于PBS中的1％BSA在37C下进一步封闭1小时，并且γδ-TCR特异性抗体以于于0.1％BSA中1μg/mL添加2小时。对于细胞标记，在置于完全培养基中过夜后，洗涤新鲜的或冷冻的人PBMC，并在5μM CFSE(PBS)中复原，在室温下避光孵育5min。用含有FBS的培养基洗涤细胞，并在含有10％FBS、2mM谷氨酰胺、25mM HEPES和200IU/mL rhIL-2的RPMI-1640培养基中以106个/mL复原。将CFSE标记的PBMC以0.5x106个/孔接种并培养5天。
在5天后，收集细胞并用泛γδ、Vδ1、Vδ2和αβTCR特异性表面标志物染色，并通过CFSE荧光的逐渐变化评估细胞增殖。由于活化而在5天中分裂的细胞的百分比如图39所示，并用于对抗体的活化效力进行排序。
实施例43.使用特定MAb从人PBMC一步扩增Vδ1和Vδ2 T细胞
如上文实施例2所述，通过24孔板中预包被的山羊抗小鼠Fcγ抗体将选择的活化δ1-TCR和δ2-TCR抗体(D1-08、D1-35、D1-39、D2-14、D2-17、D2-22、D2-30、D2-32、D2-33、D2-33、D2-35、D2-36、D2-37)和OKT3以1μg/mL捕获于2％FBS(PBS)中。将来自初始δ1群体在总细胞的0.2-0.28％之间并且Vδ2群体在总细胞的约0.2-4％之间的几个供体的人PBMC以106/mL/孔接种于含有10％FBS、2mM谷氨酰胺、100IU/mL rhIL-2的RPMI-1640培养基中。每2-3天通过培养基补充来饲养培养物中的细胞。在第7天收集细胞，并以106个/mL重新接种于无活化抗体的新平板中，并通过连续进料和在第14天重新接种进一步扩增至106个/mL的细胞密度。在第21天进行细胞分析(计数和流式细胞术)，以确定δ1和δ2细胞的纯度和倍数扩增。图40示出了PBMC培养物中δ1(A)和δ2(B)细胞的倍数扩增。Vδ1和Vδ2 MAb在21天内诱导δ1和δ2T细胞扩增最多约12000倍(对于Vδ1 T细胞)和最多6700倍(对于Vδ2 T细胞)。
在第21天通过CD27表面标志物表达评估扩增的δ1细胞的表型。图41示出，在第21天MAb活化的Vδ1 T细胞的表型主要是(>50％)CD27+CD45RA+(初始)和CD27+CD45RA-(中央记忆)。
实施例44.来自脐带血的δ1-T细胞的一步扩增
如实施例43所述，通过Ficoll密度梯度从含有0.4％的Vδ1细胞的人脐带血分离单核细胞，并用捕获的δ1 TCR特异性抗体活化。如下表所示，在用δ1特异性MAb活化后Vδ1 T细胞在21天内扩增最多1503倍。
D1抗体 倍数扩增，第21天
TS8.2 1062
δ1-08 1104
δ1-22 1503
δ1-26 557
δ1-35 918
δ1-37 1017
D1-39 1039
Immuno510 460
实施例45.使用饲养细胞进行Vδ1 T细胞的两步扩增
在本实施例中，根据实施例4所述的方案活化人PBMC，并扩增δ1细胞14天。简而言之，在24孔板中通过包被的山羊抗小鼠Fcγ多克隆抗体来捕获Vδ1抗体TS-1、D1-08、D1-37、D1-39，并且如本文所述活化和扩增细胞。在第14天收集细胞培养物并通过使用生物素酰化抗TCRαβ抗体和磁性微珠(Miltenyi Biotec)剔除αβT细胞来富集δ1 T细胞。使用经辐射的PBMC饲养细胞对富集的Vδ1细胞进行第二步活化/扩增。简而言之，在存在经辐射的人同种异体PBMC的情况下，在20mL含有10％FBS、2mM谷氨酰胺、100IU/mL IL-2和30ng/mL D1-35MAb的RPMI-1640培养基中以200:1的比例培养总共130,000个富集的细胞。培养物垂直放置于T25烧瓶中。在第18天，通过更换70％的培养基来饲养细胞。从那时开始，每2-3天通过更换50％的培养基，并将活细胞密度调整为1x106个/mL来饲养细胞，并在第28天收集细胞。如下表所示，在2步扩增程序中扩增δ1细胞最多约28,000倍。
实施例46.在不剔除αβT细胞的情况下，使用饲养细胞进行Vδ1 T细胞的两步扩增
在本实施例中，根据实施例6所述的方案使用0.2％的起始Vδ1群体活化人PBMC，并扩增δ1细胞7天。简而言之，在24孔板中通过包被的山羊抗小鼠Fcγ多克隆抗体来捕获Vδ1抗体TS-1、D1-08、D1-37、D1-39，并且如本文所述活化和扩增细胞。在第7天收集细胞培养物，使用经辐射的饲养细胞对扩增的细胞进行第二步活化/扩增。简而言之，在存在经辐射的人同种异体PBMC的情况下，在20mL含有10％FBS、2mM谷氨酰胺、100IU IL-2和30ng/mLD1-35 MAb的RPMI1640培养基中以200:1的比例培养总共130,000个细胞。培养物垂直放置于T25烧瓶中。在第12天，通过更换70％的培养基来饲养细胞。从那时开始，每2-3天通过更换50％的培养基，并将活细胞密度调整为106个/mL来饲养细胞，直到第21天收集。如下表所示，在2步扩增程序中扩增δ1细胞最多约114,000倍。
第1步活化，MAb 第2步活化/MAb Vδ1倍数扩增
TS-1 iPBMC/D1-35 82298
D1-37 iPBMC/D1-35 113764
D1-08 iPBMC/D1-35 55348
D1-39 iPBMC/D1-35 81391
实施例47.在剔除αβT细胞的情况下，使用饲养细胞进行Vδ1 T细胞的两步扩增
在本实施例中，根据实施例4所述的方案使用0.36％的起始Vδ1群体活化人PBMC，并扩增Vδ1细胞14天。在第14天收集细胞培养物并通过使用生物素酰化抗TCRαβ抗体和磁性微珠(Miltenyi Biotec)剔除αβT细胞来富集δ1 T细胞。使用经辐射的饲养细胞对富集的Vδ1细胞进行第二步活化/扩增。简而言之，在存在经辐射的K562细胞的情况下，在20mL含有10％FBS、2mM谷氨酰胺、100IU/mL IL-2和30ng/mL D1-35 MAb的RPMI-1640培养基中以49:1、9:1和2:1的比例培养富集的细胞。将指定比例的培养物(各自25x106个总活细胞)置于6孔G-Rex烧瓶(Wilson Wolf)中。在第18天，通过更换75％的培养基来饲养细胞，并在第21天收集。如下表所示，在2步扩增程序中扩增δ1细胞最多约31,000倍。
第1步活化，MAb 第2步活化/MAb Vδ1倍数扩增，
D1-35 iK562/D1-35，49:1 31121
D1-35 iK562/D1-35，9:1 18142
D1-35 iK562/D1-35，2:1 6346
实施例48.使用Vδ1 MAb活化和扩增的δ1 T细胞显示出强大的针对肿瘤细胞系的 细胞毒性
使用固定化的D1-08 MAb活化人PBMC 7天，每2天通过在静止条件下进料来扩增培养物。在扩增结束时，通过使用抗TCRαβ抗体和磁性微珠(Miltenyi)剔除αβT细胞来富集δ1T细胞。纯化的δ1细胞用于针对Jurkat(leukemia)和Colo205(结肠癌)细胞系的细胞毒性测定。简而言之，将扩增的δ1 T细胞与CFSE标记的靶细胞以10:1、5:1、2:1、1:1和1:5的效应细胞:靶细胞比在96孔圆底平板(悬浮液)的含有100IU/mL IL-2的完全培养基中孵育4小时。在孵育结束时，使用膜联蛋白-V-APC缀合物和Zombie Violet活力染料对细胞悬浮液进行染色并通过流式细胞术分析，以检测死亡/垂死细胞。如图42所示，Vδ1细胞在4小时测定中显示出高达45％的针对各种比例的两种肿瘤细胞系的细胞毒性。
实施例49.通过包括第二步振荡的2步程序来活化和扩增δ1 T细胞
外周血单核细胞的分离
用无Ca2+和Mg2+的PBS 1:3稀释从血液成分分离机收集的新鲜血液制品。然后使用Ficoll-PaqueTMPLUS(GE Healthcare)系统利用Sepmate(STEMCELL)来纯化稀释的血液制品。然后富集洗涤所富集的淋巴细胞层两次，首先使用无Ca2+和Mg2+的PBS，然后使用无Ca2+和Mg2+的于PBS中的0.25％人血清白蛋白。最后，将纯化的血液制品以1x107个细胞/mL在超低吸附24孔板、6孔板和T-75烧瓶上在含胎牛血清和无血清培养基中放置过夜。
T细胞活化
在T细胞活化前一天，用抗Fc抗体包被适当的细胞培养容器，包括组织培养物处理的24孔板、6孔板、T75烧瓶或透气袋。在初始包被后，将容器在2-8℃的黑暗中储存过夜。在初始抗Fc包被后，用于无Ca2+和Mg2+的PBS中的5％胎牛血清封闭容器，并在37℃CO2培育箱中孵育1小时。在1小时孵育后，用无Ca2+和Mg2+的PBS洗涤容器一次，然后使用Vδ1特异性单克隆抗体捕获容器。然后在振荡和不振荡的情况下，在室温下孵育容器最多4小时。在捕获结束时，用无Ca2+和Mg2+的PBS洗涤容器两次，并准备进行T细胞活化。
使用含胎牛血清和无血清培养基将过夜放置的PBMC稀释为0.5x106至2x106个细胞/cm2。然后将稀释的PBMC加入Vδ1特异性单克隆抗体固定的容器。静态维持PBMC 3至7天。从第3天开始每天添加新鲜细胞培养基，以维持足够的营养水平，诸如葡萄糖和谷氨酰胺，并稀释有毒副产物(诸如乳酸和铵)的积累。在初始活化结束时，通过机械或化学方法收集细胞。然后将细胞转移至新烧瓶中，用于后续扩增。
T细胞扩增
在初始T细胞活化后，将细胞培养物维持在37℃CO2培育箱中最多21天。最初，将活化的细胞培养物在含胎牛血清和无血清培养基中稀释至1e6个细胞/mL。T细胞可培养在具有超低吸附或组织培养物处理的表面的静态T-烧瓶(包括T-25、T-75、T-150和T-225烧瓶)中或标准无挡板或挡板振荡烧瓶(包括125mL、250mL、500mL、1000mL、2000mL和3000mL的总容器体积)中。在静态T-烧瓶中，工作体积与表面积之比维持在0.5mL/cm2或更小，以确保充分的培养物氧合。在振荡烧瓶中，工作体积与总容器体积之比在轨道振荡平台上维持在1至2或更小，以确保充分混合和通气。
每天采集活细胞培养密度(VCD)、代谢物、pH和气体测量值。采集葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸、铵、钠离子、钾离子和钙离子的代谢物测量值。还采集pH和气体测量值，包括氧分压、CO2分压和pH。通过温度补偿采集氧、CO2和pH测量值。基于VCD或代谢物的进料均可用于维持细胞培养。对于基于VCD的进料策略，如果VCD增加至1.5x106个细胞/mL或更大，则使用新鲜培养基将培养物稀释至1x106个细胞/mL。对于基于代谢物的进料策略，当葡萄糖水平从小于1g/L增加至1.5g/L时添加新鲜培养基。
细胞收集和保藏
在19天或21天扩增结束时总是观察到大于90％的细胞活力。在细胞扩增后，洗涤细胞培养物并重悬于细胞保藏培养基中，然后以超过20x106个细胞/mL的细胞密度等分细胞。使用受控速率冷冻机或冷冻容器，通过控制冷冻进行液氮的气相中的超低温保存。
实施例49a
在本实施例中，通过Ficoll纯化供体A新鲜血液制品(具有0.4％的起始Vδ1组成)，并在超低吸附T75烧瓶中放置过夜。在第0天至第5天用固定化的δ1特异性单克隆抗体δ1-35和δ1-08活化后，将培养物转移至振荡烧瓶。从第5天至第19天，每天对培养物取样，使用新鲜血清培养基通过基于VCD的进料策略维持营养物和废物浓度。图43示出了δ1-35和δ1-08活化的培养物的Vδ1倍数扩增和纯度。
实施例49b
在本实施例中，通过Ficoll纯化供体B新鲜血液制品(具有0.1％的起始Vδ1组成)，并在超低吸附T75烧瓶中放置过夜。在第0天至第5天用固定化的δ1特异性单克隆抗体δ1-08活化后，将培养物转移至振荡烧瓶。从第5天至第19天，每天对培养物取样，使用新鲜含血清培养基或新鲜无血清培养基通过基于VCD的进料策略维持营养物和废物浓度。图44示出了含血清和无血清培养基扩增的培养物中Vδ1倍数扩增和倍增时间(DT)(从第0天至第19天累积)。
实施例49c
在本实施例中，通过Ficoll纯化供体C新鲜血液制品(具有0.5％的起始Vδ1组成)，并在超低吸附T75烧瓶中放置过夜。在第0天至第7天(49c.1)和第0天至第5天用固定化的δ1特异性单克隆抗体δ1-08活化后，将培养物转移至振荡烧瓶。从第7天至第19天，每天对培养物取样，并使用新鲜血清培养基通过基于葡萄糖的进料策略维持营养物和废物浓度。对于另外两种培养物，从第7天至第19天，每天对培养物取样，并使用新鲜血清培养基通过基于VCD的进料或基于葡萄糖的进料策略维持营养物和废物浓度。图45示出了Vδ1倍数扩增和倍增时间(DT)(从第14天至第19天累积)。
图45的49c.1部分展示了7天活化、然后使用基于葡萄糖的进料策略从第7天至第19天维持的培养物的Vδ1倍数扩增和DT(从第14天至第19天累积)。图45的49c.2部分展示了5天活化、然后使用基于VCD的进料策略从第7天至第19天维持的培养物的Vδ1倍数扩增和DT(从第14天至第19天累积)。图45的49c.3部分展示了5天活化、然后使用基于VCD的进料策略从第7天至第19天维持的培养物的Vδ1倍数扩增和DT(从第14天至第19天累积)。
实施例50.使用逆转录病毒嵌合抗原受体构建体转导Vδ1 T细胞
如实施例49a所述，用固定化的抗Vδ1特异性单克隆抗体(δ1-08)刺激来自健康供体的外周血单核细胞，并在补充有rhIL-2的培养基中培养19天。简而言之，在24孔板中使用通过预包被的山羊抗小鼠Fcγ抗体捕获的D1-08 Vδ1 MAb活化分离的PBMC。在含有10％FBS、25mM HEPES、2mM谷氨酰胺和100IU/mL IL-2的RPMI1640培养基中以1e6个/mL/孔接种细胞。在五天后，将细胞转移至振荡烧瓶，并如实施例49a所述扩增。在第19天收集细胞，用PHA(2μg/mL)洗涤和再刺激2天，然后用编码抗CD20(利妥昔单抗)来源的嵌合抗原受体(连接至CD28-CD3ζ的scFv)的逆转录病毒载体转导。简而言之，用retronectin(TaKaRa Bio)预包被24孔板的孔，并将含逆转录病毒的上清液(1mL)在32C下孵育4小时，以允许病毒颗粒粘附，其后除去上清液(retronectin平板)。洗涤扩增的δ1 T细胞，以0.5x106个细胞/mL重悬于1mL补充有100IU/mL IL-2的病毒上清液中，并接种于retronectin平板中。以1800rpm离心平板10min，并置于37C培育箱中。每2天再使用进料培养细胞7天，然后使用荧光大鼠抗利妥昔单抗独特型抗体(FITC缀合物)(识别T细胞表面上表达的CD20特异性CAR)通过流式细胞术分析转导百分比。如图46所示，超过34％的活Vδ1+细胞表达CAR构建体。
实施例51.γδT细胞TCR的抗体的表位作图
目的是标绘δ1特异性活化剂的表位特异性。所有δ1特异性活化剂都针对γδTCR的δ1链。通过使用人和海豚δ1 TCR链的重组嵌合分子进行作图。尽管人和海豚δ1链之间具有高氨基酸同一性，但是δ1特异性活化剂不结合海豚δ1链。所以，我们利用人Vδ1和海豚Vδ1之间序列和构象的相似性(65％序列相似性)来构建重组嵌合分子，其中我们将人残基的不同的区段更换为来自海豚δ1 TCR链的它们的同源对应物。
通过流式细胞术分析确认所有mAb均特异性结合γδTCR的δ1链的可变区。δ1γ8TCR以正确折叠构象的可溶性FC融合蛋白表达，如所有抗δ1小鼠单克隆抗体(mAb)组的结合所确定。这些mAb显示出靶向γδTCR的构象依赖性表位。
为了表达人δ1 TCR的离散表位，克隆一组7个重组嵌合δ1链，以得到人/海豚δ1-FCTCR链。根据T细胞受体可变结构域的IMGT独特编号，海豚残基分别包含氨基酸1-11、1-21、1-28、1-47、1-70、1-80和1-95(Lefranc等人,Developmental and ComparativeImmunology 27(2003)55-77)，如图38所示。
通过ELISA结合测定以及结合丧失的检测来鉴定这些δ1特异性结合结构域，而不需要关于潜在接触残基的先前知识。通过覆盖影响所选的δ1活化剂的结合的关键海豚残基，我们鉴定了δ1 TCR链的V区和J区内的8种可能的结合bin。
该研究中所用的表达载体是pCI-Neo哺乳动物表达载体(Promega#E1841)，可溶性TCR的表达来源于CMV启动子。小鼠IgH信号肽用于将可溶性TCR蛋白输出到培养基，然后是用于将可溶性TCR捕获至ELISA平板的人FC结构域。
从γδ1BE-13 T细胞系扩增人δ1链的ECD。根据所公开的序列，海豚Vδ1序列以合成基因订购(宽吻海豚(Tursiops truncatus)T细胞受体δ链(TRD基因)的mRNA，分离体5R1D80)(GenBank:LN610748.1)。使用这些cDNA为模板，将新嵌合分子从合成片段(IDTDNA)克隆至信号肽的5’AgeI位点和δ恒定区的3’E.coRI。克隆由海豚/人δ1链构成的六个构建体，并使用γ8-FC链共转染，以在293细胞中表达可溶性δ1γ8 TCR蛋白。
在90-mm细胞培养板的含有10％胎牛血清(HycloneTMFetalCloneTMI血清(U.S.)-GE Healthcare Life Sciences)的DMEM培养基(Thermo Fisher Scientific)中培养HEK-293细胞。对于每个构建体，使用293Fectin作为转染试剂，用10μg质粒转染1×106个HEK-293细胞。在转染后72小时收集上清液。
δ1特异性活化剂-单克隆抗体的不同之处在于它们对嵌合体的结合模式，并且可以鉴定每种单克隆抗体的不同的结合模式，如ELISA测定所测试。
在室温下用1μg/孔于ELISA包被缓冲液(50mm Na2CO3、0·05％NaH3、pH 9·6)中的山羊抗人FC特异性抗体(Jackson ImmunoResearch#109-005-098)包被聚苯乙烯微量滴定板(Greiner bio-one#655061)过夜。用洗涤缓冲液(PBS 0·05％(v/v)Tween 20)洗涤平板三次，然后在室温(RT)下用100μl/孔的ELISA封闭缓冲液(溶于PBST的3％BSA)封闭1h。通过添加100ml每种上清液并在室温下孵育1小时来进行可溶性TCR与封闭平板的结合。在ELISA封闭缓冲液中将每种抗体稀释至1μg/ml，并测试与每种γδTCR嵌合分子的结合。
通过添加100μl/孔HRP缀合的二抗：山羊抗小鼠FC特异性(Jackson ImmunoResearchLaboratories,Inc.Peroxidase-AffiniPure山羊抗小鼠IgG，Fcγ片段特异性#115-035-008)(在封闭缓冲液中1:10,000稀释)来进行结合的检测。通过使用TMB底物(ThermoFisher#34029)来检测结合的抗体的量，10分钟后通过分光光度法在450nm下测定显色。所有测定均一式两份进行。
所有构建体的序列
δ1-D3-J1FC-完全人TCR
海豚TRD分离体5R1D8
克隆海豚/人嵌合体-可溶性TCR组-人序列以蓝色表示
海豚/人1-11
海豚/人1-21
海豚/人1-28
海豚/人1-47
海豚/人1-70
海豚/人1-80
海豚/人1-95
结果
通过遗传重组来组装来自单独的V、D和J区区段的功能性TCR基因。当组装TCRδ链基因时，D基因区段与J区段并置，然后V区段重排为所组装的下游DJ区段。TCR链的免疫球蛋白样折叠使每条链的三个环或互补决定区(CDR)彼此接近定位，产生接触抗原的结合面。这些CDR环中的两个(即1和2)由V基因区段编码，并且仅具有由Vδ1区基因区段提供的多样性。由于每个V区段能够重排为任何(D)J区段，加上编码序列的连接不精确的事实，第三CDR环由V(D)J区段的并置产生，并且提供更多的多样性。在这些链接的每个之处可以添加或缺失核苷酸。表位结合特异性如ELISA所示(图47A-B)。
我们鉴定了结合γδTCR分子的δ1链的框架区上的不同表位的活化剂。一组单克隆抗体对TCR的δ链的δ1可变区具有反应性。具体地讲，本发明提供结合δ1链可变区的单克隆抗体(诸如d1-08、d1-39、d1-192、d1-201、d1-285)，而不论连接多样性(所有γδTCR组成(D)J1、V(D)J2和V(D)J3的并置)如何。这些单克隆抗体对δTCR的“可变区”具有反应性，所以是对V区的表位具有反应性的单克隆抗体。
其它δ1活化剂特异性识别δ1链可变区，以及由V(D)J1区段的限制性并置产生的CDR3环。这些单克隆抗体对V-D或V-D-J区的组合表位中TCR的“可变区”具有反应性：d1-37、d1-113、d1-155、d1-182、d1-183、d1-191、d1-278和d1-282。
其它δ1活化剂特异性识别δ1链可变区，以及由V(D)J1和V(D)J1而非V(D)J3区段的并置产生的CDR3环：d1-35、d1-143、d1-149、d1-203。
对δ1具有特异性的抗体分为以下表位Bin：
Bin1：VDJ连接-JH1/JH2：TS-1；和δ1-18
Bin1b：VDJ连接-J1，非J3，K120T/A突变体的结合丧失：δ1-37
Bin2：(aa 11-21)：δ1-285
Bin2b：(aa 11-21)，R16N突变体的结合丧失：R9.12
Bin2c：(aa 11-21)，与δ3、δ4和δ5γδTCR发生交叉反应：δ1-39
Bin3：(aa 80-95或70-95)：δ1-08；δ1-23
Bin4：(aa 1-11)，K120T/A突变体的结合丧失：δ1-35；δ1-203；
Bin5：(aa 28-47+J1区)：δ1-113；δ1-155；δ1-183；δ1-191；δ1-278；δ1-282
Bin6：(aa 21-28+J1区)：TS8.2；δ1-143
Bin7：(aa 47-70+J1/J2区)：δ1-149；δ1-253和δ1-257
Bin8：(aa 70-80)+J1/J2：δ1-192
Bin9：(aa 80-95)：δ1-201。
与d1表位作图相似：根据Linguiti G.等人,2016。宽吻海豚T细胞受体γ(TRG)和α/δ(TRA/TRD)基因座的基因组和表达分析揭示了相似的基本公开内容；海豚和人中的库。BMC基因组。克隆一组5个重组嵌合δ2链，以得到人/海豚δ2-FC TCR链。根据T细胞受体可变结构域的IMGT独特编号，海豚残基分别包含氨基酸28-94、44-94、72-94和82-94(Lefranc等人,Developmental and Comparative Immunology 27(2003)55-77)，如图15所示。
δ2/γ9-FC构建体的转染
人TRGV9-JP-FC
人Vδ21J1-FC
海豚Vδ2J1-FC
人/海豚Vδ2J1-FC(28-94)
人/海豚Vδ2J1-FC(44-94)
人/海豚Vδ2J1-FC(72-94)
人海豚Vδ2J1-FC(82-94)
人Vδ21J1-FC(CDR1-S)
人Vδ21J1-FC(CDR2-G)
人Vδ21J1-FC(CDR3-S)
ELISA结果如图48所示，鉴定以下表位bin：
Bin 1 2 3 4
残基 83-94 28-38 72-83 1-27
mAb δ2-17 15D δ2-32 δ2-14
B6 δ2-22
δ2-30
δ2-31
δ2-36
δ2-37
。
***
虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但是将对本领域技术人员显而易见的是，此类实施方案仅以举例的方式提供。本领域的技术人员可以对其做出许多变形、改变和替换而不脱离本发明。应当理解，本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案可在本发明的实践中采用。以下权利要求旨在限定本发明的范围并且从而涵盖在这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构。

Claims (48)

1.一种用于从包含T淋巴细胞的分离的混合细胞群产生富集的δ1γδT的细胞群的离体方法，所述方法包括使所述混合细胞群与一种或多种药剂直接接触，所述一种或多种药剂通过结合至δ1TCR的特异性的活化表位来在第一次γδT细胞扩增中选择性扩增δ1T细胞，以提供临床相关水平的富集的γδT细胞群，其中所述一种或多种选择性扩增δ1γδT细胞的药剂选自抗体，
所述抗体包含选自下述的重链可变区/轻链可变区(HCVR/LCVR)序列对：SEQ ID NO:153/180,154/181,155/182,156/183,157/184,158/185,159/186,160/187,161/188,162/189,163/190,164/191,166/193,167/194,168/195,172/199,173/200,175/202,176/203,177/204,178/205,和179/206,或者
包含HCVR/LCVR序列对的六个互补决定区(CDR)，该序列对选自：SEQ ID NO:153/180,154/181,155/182,156/183,157/184,158/185,159/186,160/187,161/188,162/189,163/190,164/191,166/193,167/194,168/195,172/199,173/200,175/202,176/203,177/204,178/205,和179/206。
2.权利要求1的方法，其中所述一种或多种药剂是抗体，所述抗体包含选自下述的HCVR/LCVR序列对：SEQ ID NO：154/181、和158/185；或者
包含HCVR/LCVR序列对的六个CDR，该序列对选自：SEQ ID NO:154/181、和158/185。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中：
所述一种或多种药剂通过与δ1TCR、δ3TCR、δ4TCR和δ5TCR特异性的活化表位结合来选择性地扩增δ1T细胞、δ3T细胞、δ4T细胞和δ5T细胞；或者
所述一种或多种药剂通过结合δ1TCR和δ4TCR特异性的活化表位选择性地扩增δ1T细胞和δ4T细胞。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中：
(i)富集的γδT细胞群不由抗原呈递细胞或氨基磷酸盐扩增；
(ii)将选择性扩增δ1T细胞的一种或多种药剂固定在表面上；
(iii)所述分离的混合细胞群选自外周血样品、脐带血样品或肿瘤；
(iv)所述富集的γδT细胞群包含多克隆TCR多样性；
(v)所述富集的γδT细胞群被配制以施用于受试者；
(vi)所述富集的γδT细胞群包括治疗有效量的γδT细胞；和/或
(vii)γδT细胞群被工程化以稳定表达一个或多个抗原识别部分以产生工程化γδT细胞。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其进一步包括将至少一部分富集的γδT细胞群与一种或多种药剂直接接触，所述药剂(a)在第二次γδT细胞扩增中扩增γδT细胞，和/或(b)消耗αβT-细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述第二次γδT细胞扩增包括使所述富集的γδT细胞群的至少一部分与抗原呈递细胞(APC)直接接触。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述第二次γδT细胞扩增包括使至少一部分富集的γδT细胞群与一种或多种药剂直接接触，所述药剂选择性扩增δ1T细胞；δlT细胞、δ3T细胞、δ4T细胞和δ5T细胞；或δ1T细胞和δ4T细胞。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种药剂选自包含HCVR/LCVR序列对的抗体，所述序列对选自SEQ ID NO：154/181、158/185、160/187、172/199和175/202；或者
是包含选自SEQ ID NO：154/181、158/185、160/187、172/199和175/202的HCVR/LCVR序列对的六个CDR的抗体。
9.根据权利要求3所述的方法，其中所述一种或多种药剂是包含由SEQ ID NO：158/185组成的HCVR/LCVR序列对的六个CDR的抗体；或者
是包含由SEQ ID NO：158/185组成的HCVR/LCVR序列对的抗体。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述富集的γδT细胞群中δ1T细胞的百分比大于60％。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述方法包括无血清培养条件和/或悬浮细胞培养条件。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述方法自以下在小于90天内实现从所述分离的混合细胞群扩增至少108个γδT细胞：
-开始所述第一次扩增，
-提供供体样品的步骤，或
-使所述混合细胞群与一种或多种药剂直接接触的第一步骤。
13.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述方法自以下在小于60天内实现从所述分离的混合细胞群扩增至少108个γδT细胞：
-开始所述第一次扩增，
-提供供体样品的步骤，或
-使所述混合细胞群与一种或多种药剂直接接触的第一步骤。
14.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述方法自以下在小于30天内实现从所述分离的混合细胞群扩增至少108个γδT细胞：
-开始所述第一次扩增，
-提供供体样品的步骤，或
-使所述混合细胞群与一种或多种药剂直接接触的第一步骤。
15.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述方法自以下在小于21天内实现从所述分离的混合细胞群扩增至少108个γδT细胞：
-开始所述第一次扩增，
-提供供体样品的步骤，或
-使所述混合细胞群与一种或多种药剂直接接触的第一步骤。
16.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述方法自以下在小于19天内实现从所述分离的混合细胞群扩增至少108个γδT细胞：
-开始所述第一次扩增，
-提供供体样品的步骤，或
-使所述混合细胞群与一种或多种药剂直接接触的第一步骤。
17.根据权利要求4所述的方法，其中所述γδT细胞群被工程化以表达两个或更多个抗原识别部分。
18.根据权利要求4所述的方法，其中所述抗原识别部分识别肿瘤抗原、与自身免疫疾病相关的抗原或致病抗原。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述抗原识别部分选自TCR、αβTCR、γδTCR、嵌合抗原受体(CAR)、完整抗体或其抗原结合片段、单-链可变片段(scFv)、重链或轻链单域抗体(sdAb)、Fab、F(ab)2或其任何组合，其结合至：(i)细胞表面肿瘤抗原，(ii)来源于在所述细胞表面上表达的肿瘤抗原的作为与MHC的复合物(肽-MHC复合物)的肽，(iii)与自身免疫性疾病或病原体相关的细胞表面抗原，或(iv)肽，其来源于在细胞表面表达的与自身免疫性疾病或病原体相关的抗原作为与MHC的复合物(肽-MHC复合物)。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述病原体相关的抗原是细菌抗原或病毒抗原。
21.根据权利要求4所述的方法，其中所述工程化的γδT细胞被工程化以缺乏来自至少一个HLA基因座的基因表达。
22.根据权利要求4所述的方法，其中所述工程化的γδT细胞是通用供体细胞。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述分离的混合细胞群包括之前没有耗竭去除单核细胞的完整的PBMC群、αβT细胞、B细胞和NK细胞。
24.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，还包括：
在选择性扩增δ1γδT细胞之前去除一种或多种红细胞、NK细胞、αβT细胞、B细胞、单核细胞和巨噬细胞。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中使所述混合细胞群与选择性扩增δ1T细胞的至少一种抗体接触进一步包括包含选自IL-2、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23和IL-33的细胞因子的培养条件。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述细胞因子选自IL-2、IL-7和IL-15。
27.根据权利要求17的方法，其中所述两个或更多个抗原识别部分是不同的，并且其中每个不同的抗原识别部分被工程化以识别相同抗原的不同表位或识别不同抗原的不同表位。
28.根据权利要求25-26中任一项的方法，其中培养条件不包含IL-4，和其中所述混合细胞群在扩增之前没有暴露于外源性IL-4。
29.抗体：
(i)包含重链可变区/轻链可变区(HCVR/LCVR)的序列对，该序列对选自SEQ ID NO：153/180、154/181、155/182、156/183、157/184，158/185、159/186、160/187、161/188、162/189、163/190、164/191、166/193、167/194、168/195、172/199、173/200、175/202、176/203、177/204、178/205和179/206；或者
(ii)包含HCVR/LCVR序列对的六个互补决定区(CDR)，该序列对选自SEQ ID NO:153/180、154/181、155/182、156/183、157/184、158/185、159/186、160/187、161/188、162/189、163/190、164/191、166/193、167/194、168/195、172/199、173/200、175/202、176/203、177/204、178/205和179/206。
30.根据权利要求29所述的抗体，其包含选自SEQ ID NO：154/181、158/185、160/187、172/199和175/202的HCVR/LCVR序列对；或者
包含选自SEQ ID NO：154/181、158/185、160/187、172/199和175/202的HCVR/LCVR序列对的六个CDR。
31.根据权利要求30所述的抗体，其包含选自下述的HCVR/LCVR序列对：SEQ ID NO：154/181和SEQ ID NO：158/185；或者
包含选自下述的HCVR/LCVR序列对的六个CDR：SEQ ID NO：154/181和SEQ ID NO：158/185。
32.根据权利要求31所述的抗体，其包含由SEQ ID NO：158/185组成的HCVR/LCVR序列对；或者包含由SEQ ID NO：158/185组成的HCVR/LCVR序列对的六个CDR。
33.编码根据权利要求29-32中任一项所述的抗体的核酸，其中所述核酸与异源启动子可操作地连接。
34.宿主细胞，其包含权利要求33的核酸和/或权利要求29-32中任一项的抗体。
35.根据权利要求34所述的宿主细胞，其中所述核酸进一步编码与所述抗体融合的膜锚定蛋白或跨膜结构域，其中所述抗体呈递在所述宿主细胞的细胞外表面上。
36.组合物，其包含扩增的γδT细胞群和根据权利要求29-32中任一项所述的抗体，其中所述抗体结合δ1TCR可变区的氨基酸序列和选择性扩增δ1γδT细胞。
37.根据权利要求36所述的组合物，其中所述扩增的γδT细胞群包含大于60％百分比的δ1T细胞。
38.根据权利要求36所述的组合物，其中所述抗体固定在表面上。
39.根据权利要求36所述的组合物，其中所述扩增的γδT细胞群衍生自从受试者的复合样本分离的γδT细胞。
40.根据权利要求39所述的组合物，其中所述复合样本选自由血液样本、脐带血样本、肿瘤、干细胞前体、肿瘤活检、组织、淋巴，和/或直接接触所述外部环境的受试者的上皮部位组成的组。
41.根据权利要求36所述的组合物，其进一步包含选自IL-2、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和IL-33的细胞因子。
42.根据权利要求41所述的组合物，其中所述细胞因子选自IL-2,IL-7,和IL-15。
43.根据权利要求41所述的组合物，其中所述组合物不包含IL-4。
44.根据权利要求36所述的组合物，其中所述扩增的γδT细胞群经工程改造以表达一个或多个肿瘤识别部分。
45.根据权利要求36所述的组合物，其中所述扩增的γδT细胞群经工程改造以表达一个或多个抗原识别部分，所述抗原识别部分识别一个或多个与自身免疫性疾病相关的抗原或一个或多个致病性抗原。
46.根据权利要求36-45中任一项所述的组合物，其中所述扩增的γδT细胞群包含至少1x108δ1γδT细胞。
47.权利要求36-46中任一项的组合物在制备用于治疗有需要的受试者的癌症、自身免疫病或传染病的药物中的用途，其中所述γδT细胞经工程改造以表达抗原识别部分，并且抗原识别部分分别识别肿瘤抗原、与自身免疫性疾病相关的抗原或致病性抗原。
48.根据权利要求47所述的用途，其中所述抗原识别部分选自TCR、αβTCR、γδTCR、嵌合抗原受体(CAR)、完整抗体或其抗原结合片段、单链可变片段(scFv)、重链或轻链单域抗体(sdAb)、Fab、F(ab)2或其任何组合，其结合至：(i)细胞表面肿瘤抗原，(ii)来源于在所述细胞表面上表达的肿瘤抗原的作为与MHC的复合物(肽-MHC复合物)的肽，(iii)与自身免疫性疾病或病原体相关的细胞表面抗原，或(iv)肽，其来源于在细胞表面表达的与自身免疫性疾病或病原体相关的抗原作为与MHC的复合物(肽-MHC复合物)。
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GR01 Patent grant
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