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CN1304313A - 含乳酸菌的组合物、药物和食物 - Google Patents

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CN1304313A
CN1304313A CN99807015A CN99807015A CN1304313A CN 1304313 A CN1304313 A CN 1304313A CN 99807015 A CN99807015 A CN 99807015A CN 99807015 A CN99807015 A CN 99807015A CN 1304313 A CN1304313 A CN 1304313A
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acid bacteria
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lactobacillus
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CN99807015A
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石川宏
铃木信之
中谷清吾
平田晴久
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Wakamoto Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Wakamoto Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

含乳酸菌的组合物能增强由对消化道和/或泌尿生殖器官具有药理学作用的乳酸菌显示的药理作用,并抑制乳酸菌从消化道和/或泌尿生殖器官排出。即,这些组合物是含乳酸菌的组合物,含有对消化道和/或泌尿生殖器官有药理学作用的乳酸菌,乳酸菌对消化道和/或泌尿生殖器官的粘着性得到了改善,从而增强了上述药理学作用。

Description

含乳酸菌的组合物、药物和食物
技术领域
本发明涉及含乳酸菌的组合物和含有它的药物和食物。
背景技术
已长久的认为含乳酸菌的药物制剂对治疗肠道疾病是有效的，而且，经多年使用测试，被当成十分安全的药物。同时，已知在前药典双岐杆菌和前药典嗜酸性乳酸杆菌制剂中，基于乳酸菌的药物制剂的活性成分配制的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)和粪链球菌(Strptococcus faecalis)，是人肠的固有菌，这些细菌作为肠道菌在保持和促进健康方面起了非常重要的作用。
由于药理学作用的可靠性和副作用的低威胁性，如今重新有兴趣对这些乳酸菌进行了深入的研究和开发。
特别是，在抗胃炎、抗溃疡和泌尿生殖器抗感染剂领域中，预见到了乳酸菌应用的惊人进展。
作为消化性溃疡的治疗药物，目前已开发了甲腈咪胍(cimetidine)、雷尼替丁(ranitidine)、法莫替丁(famotidine)等H2-受体拮抗剂，omeprazole等质子泵抑制剂，和胃粘膜保护剂，并取得了值得称赞的治疗效应。然而，有被认为已完全治愈的溃疡重新复发和加剧，已发现这些复发事件的病因是在胃粘膜活组织切片检查标本中检测到的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)。
幽门螺杆菌是感染胃粘膜的革兰氏阴性微需氧螺杆菌。已提示由于其强大的脲酶活性，该微生物将衍生自宿主的尿素分解成氨，来中和胃酸，并从而使自身能够在胃中生长。
现在全世界都已承认，幽门螺杆菌的清除是治疗消化性溃疡的新方法，而且直到目前，已发现青霉素、羟氨苄青霉素、氨苄青霉素等β-内酰胺，红霉素、clairithromycin、氮红霉素、roxithromycin等大环内酯物，阿贝卡星、庆大霉素等氨基糖苷类，四环素抗生素，用作抗原虫剂的灭滴灵，和铋制剂对除去幽门螺杆菌是有效的，而且确实在美国和欧洲国家中被使用。
另外，最近在H2-受体拮抗剂、质子泵抑制剂等抗溃疡剂的治疗类型中，已开发了还具有针对幽门螺杆菌的抗菌作用的新化合物，而且一些已进入市场。因此，对于胃炎或胃与十二指肠溃疡的治疗及其复发的预防，已进行了许多尝试，用抗菌剂和其它对幽门螺杆菌有活性的药物来除去该生物。
然而，用常规抗菌剂治疗，不仅需要超过一般感染所需的通常剂量的大剂量，而且还需要长期用药，其可能伴有新抗性菌株的产生，而且也会有副作用的威胁。
例如，在用抗菌剂排除幽门螺杆菌的治疗领域中，一直期望用乳酸菌的生物前治疗。日本专利号2672247公开了一种嗜酸乳杆菌的菌株在从肠和胃细胞中除去幽门螺杆菌是有效的。然而，当实际将嗜酸乳杆菌施给病人时，不能获得预期效果。
日本公开出版物Hei-9-241173公开了唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)或短乳杆菌(Lactobacillus brevis)的某些菌株具有抗胃炎、抗溃疡和其它活性。这些菌株在某种程度上是有效的，但当口腔施用时，很可能乳酸菌将从胃和小肠中迅速被清除，导致幽门螺杆菌清除作用的显著减弱。
第二个期待乳酸菌应用的惊人进步的领域是其用于肠出血性大肠杆菌(EHEC)的除去。
1977年发现的EHEC是命名为“EHEC-0157”的病原性生物，因为其菌株大部分属于0157:H7血清组。
该细菌病原体的感染经常在摄入污染食物或水引起的大量食物中毒爆发中发现，而且在腹泻和腹痛等前期症状后，发生伴有腹部深度疼痛和带血粪便的出血性结肠炎。严重病人伴有作为并发症的溶血性尿毒综合征，血栓形成性血小板增多症紫癜和脑病，最坏的情况下引起死亡。该感染性疾病的病因是EHEC产生的Vero毒素(VT)。VT被分成两类，即与痢疾志贺氏菌(Shigelladysenteriae)产生的志贺毒素相同的VT1和生物活性与VT1相似，但物理化学不同，而且免疫学性质也已知与志贺类毒素相似的VT2。
VT是所有细胞毒素中最烈性的，而且由于其RNA N-糖苷酶的活性诱导的蛋白合成抑制，表现了强烈的杀死小鼠作用、细胞毒性和肠毒性。在EHEC感染中，用磷霉素、氟哌酸和卡那霉素等抗生素，但直到今日还没有足够有效的治疗形式，仍期待着新治疗方法的开发。
第三个期待乳酸菌应用的惊人进步的领域是其用于食物过敏治疗的应用。
世界上食物过敏病人的数目正稳步上升，而该趋势在发达国家中特别明显。对于食物过敏的治疗和/或预防，现在已采用了不吃引起过敏的食物和抗过敏药物的施用，但不吃食物极大加重了人体的生理和精神负担，而且也受到家庭生活或集体生活观念的许多限制。抗过敏药物的长期施用涉及副作用的高度威胁。
由于在发达国家中最近食物过敏事件的增加，已推测由于人类目前接触各种致病性微生物的机会降低了，人的体质已发生了变化，从而对这些抗原刺激过度应答。已知实验性构建的无菌动物防御机制的特征，显示对食物过敏原入侵的过度反应。
当人工喂养婴儿与母乳喂养的婴儿比较时，人工喂养婴儿显示显著高的过敏病发生率且免疫球蛋白E过多症发生率，对粪便菌落的检查揭示了双岐杆菌群在人工喂养婴儿中明显比母乳喂养的婴儿低，相反的，前者婴儿给出了较高的梭菌和假单胞菌计数或检测率[“婴儿营养和肠道菌群”，Mitsuoka,T.:“肠道菌群和营养”，p.13,Gakkai Shuppan Center,1983]。
近年来，已报道过敏的发生和Th1和Th2细胞间的平衡有关，Th1细胞比例的减少导致过敏的发生[现代医学，53,No.12,p.72-79,1998],Th1细胞由IL-12诱导[医学进展，180,p.85-89,1997]，和乳酸菌具有刺激IL-12产生的活性[日本公开出版物Hei-10-139674]。
因此，希望可通过双岐细菌的吸收来预防和治疗食物过敏。
当扩大了乳酸菌的新应用范围，并将其设想得越来越重要时，基本的问题仍存在于施用的乳酸菌被迅速从消化道中清除，没有有效预防该过早清除，并保持或增强其药理学作用的方法。
同时，第四个期待乳酸菌应用的惊人进步的领域是其治疗和/或预防泌尿生殖道感染的应用。
在正常的健康妇女阴道中建立的是乳酸菌作为优势成员的良好平衡的菌群。然而，由于阴道自清洁作用的减弱、子宫内避孕装置的插入、化学或机械刺激、雌激素功能的异常和/或性交有关的感染干扰了该阴道菌群的平衡，许多其它种类的细菌替换了乳杆菌，导致细菌性阴道病或真菌性阴道病的发生。另外，猜想乳杆菌在尿道上形成一层保护性生物膜，从而防止大肠杆菌等革兰氏阴性杆菌从肛周区向上侵入，并保护尿道抵抗细菌感染。因此，该乳杆菌保护性生物膜的崩溃可导致尿道感染复发事件。
当这种细菌性阴道炎、复发性尿道感染等不及时治疗时，它们将发展成更严重的疾病，如骨盆内感染、术后感染等，而且已报道骨盆内感染和患细菌性阴道病的病人容易患HIV感染[AIDS,vol 2,p.1699-1706,1998]。
在这些泌尿生殖器感染中，已尝试用乳酸菌进行生物前治疗[日本抗生素杂志,759(No 39),p.51-12,1998；FEMS免疫学和医学微生物学，6,251-264,1993]。然而，这些泌尿生殖器官感染的特征是，即使曾经获得减轻，仍将经历复发，而完全治愈是困难的。
而由于这些情况，乳酸菌的该新应用变得更广泛，而且越来越重要了。基本的问题仍存在于，在施用后，乳酸菌从泌尿生殖器官中迅速被清除，而对预防该过早清除和保持和/或加强其药理学作用还没有有效方法。
发明简述
在本领域的上述描述中，本发明的目的是提供一种含乳酸菌的组合物，
它对增强在消化道和/或泌尿生殖器官中显示药物作用的乳酸菌的药理学作用是有益的，而且拮抗从消化道和/或泌尿生殖器官中清除乳酸菌。
因此，本发明针对含有乳酸菌的组合物，其包含在消化道和/或泌尿生殖器官中显示药理作用的乳酸菌，
其中增强了所述乳酸菌对消化道和/或泌尿生殖器官的粘着性，从而加强所述药物作用。
发明详述
本发明涉及含乳酸菌的组合物，其包含在消化道和/或泌尿生殖器官中显示药理作用的乳酸菌，其中增强了所述乳酸菌对消化道和/或泌尿生殖器官的粘着来加强所述药物作用。
本发明的发明人假定，在摄入或施用后从消化道和/或泌尿生殖器官中为了拮抗含有显示药理学作用的乳酸菌组合物的清除，从而增强其药理学作用，至关重要的是使这些细菌在消化道和/或泌尿生殖器官中保留时间延长，并为了达到该目的，提高乳酸菌对消化道和/或泌尿生殖器官的粘着。本发明由该发现完成。
上述一系列发明，即加强药理学作用，在消化道和/或泌尿生殖器官中保持时间的延长，和对消化道和/或泌尿生殖器官粘着的增强在文中显而易见，但对任何人来说，即使设想关于乳酸菌的这些想法也是很困难的，因为在本领域的描述中，乳酸菌对消化道和/或泌尿生殖器官的粘着在技术上几乎是不可能的。只有获得将在下文详细描述的具有促进粘着性的特殊物质，发明人才能实现本发明。
本说明书中所用的术语“消化道”是一般术语，指人体内掌管消化和吸收的管道，包括口、食道、胃、小肠、大肠和直肠。同样，在本说明书中使用的术语“泌尿生殖器官”也是一般术语，指涉及尿的产生和排出的器官，和涉及生殖器官，包括妇女的外阴和阴道，男性的生殖器和尿道。本说明书中使用的术语“消化道和/或泌尿生殖器官”根据上下文而定，仅指消化道，或仅指泌尿生殖器官，或同时指消化道和泌尿生殖器官。
本说明书上下文中的含乳酸菌的组合物是指含有乳酸菌的组合物。本说明书上下文中乳酸菌对消化道和/或泌尿生殖器官的粘着指乳酸菌继续存在于消化道和/或泌尿生殖器官的粘膜上皮细胞表面。乳酸菌对消化道和/或泌尿生殖器官粘着的提高指继续存在于消化道和/或泌尿生殖器官的粘膜上皮细胞表面的乳酸菌数目的增加。在本发明中，所述细菌数目(也称为粘着细菌数目)的增加至少是未治疗对照组的2倍，通常是10倍到100倍之多。
乳酸菌对消化道和/或泌尿生殖器官粘着的提高，导致乳酸菌药理学作用增强的事实已由本发明人实验性证明。因此，显而易见提高乳酸菌对消化道和/或泌尿生殖器官的粘着是增强所述药理作用的非常有效的方法。还已发现，为了增强所述药理作用的目的，要粘着在消化道和/或泌尿生殖器官上的乳酸菌优选是活有机体。
本发明含乳酸菌的组合物含有乳酸菌。上文提到的乳酸菌包括各种用于人和动物的细菌，包括：
乳酸杆菌，例如唾液乳杆菌，嗜酸乳杆菌，短乳杆菌，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)，发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)，类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)，路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)，加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)，约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)，高加索乳杆菌(Lactobacillus kefir)等；
乳球菌，例如乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)，植物乳球菌(Lactococcusplantarum)，棉子糖乳球菌(Lactococcus raffinolactis)，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，屎肠球菌(Enterococcus faecium)，唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcus thermophilus)，乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)，肠膜乳明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)等；和
双岐细菌，如动物双岐杆菌(Bifidobacterium animalis)，双岐双岐杆菌(Bifidobacterium bifidum)，短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)，婴儿双岐杆菌(Bifidobacterium infantis)，长双岐杆菌(Bifidobacterium longum)，假长双岐杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)，嗜热双岐杆菌(Bifidobacteriumthermophilum)，青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)等。
这些乳酸菌可单用，或可用两种或更多。
作为所述乳酸菌，在本发明中乳酸菌生长可用常规培养法和用离心分离过程收集。
本发明的特征是，所述乳酸菌对消化道和/或泌尿生殖器官的粘着增强，因而可用任何能尽可能长时间的增强所述乳酸菌对消化道和/或泌尿生殖器官的粘着的方法，但优选是由混合一种大分子物质组成优选碱性多聚物的方法。
不特别限于碱性多聚物，只是提供具有高分子量的碱性物质。另外，就两性多聚物而言，例如具有在碱性一侧的等电点的碱性蛋白质的多聚物(当pH比其等电点低时是带正电的)也落在“碱性多聚物”的范围内。另外，本说明书中所用术语“多聚物”，包括像具有大约808分子量的脱乙酰壳多糖四聚物等物质。
上文提到的碱性多聚物包括脱乙酰壳多糖、聚赖氨酸、胆甾胺树脂和胆甾酰亚胺等抗高血脂阴离子交换树脂、鱼精蛋白、明胶、异丁烯酸氨烷酯共聚物E、异丁烯酸氨烷酯共聚物RS、乳铁蛋白和溶菌酶等。
上文提到的脱乙酰壳多糖是通过几丁质的化学处理获得的大分子多糖，该几丁质是蟹外壳、虾壳、蝗虫、蚕、蝶蛹等昆虫的表皮、香菇，enokidake等担子菌纲Basidiomycetes真菌，根霉Rhizopus等接合菌纲Zygomycetes真菌的细胞壁。已知它们具有抗肿瘤性、抗微生物性、免疫增强性和其它活性。
日本公开出版物Hei-8-165246公开了一种包含高-核酸物质和脱乙酰壳多糖的生理活性增强剂，而且日本公开出版物Hei10-191928公开了一种含有脱乙酰壳多糖和双岐细菌的健康食品。然而，还未发现脱乙酰壳多糖曾对乳酸菌与消化道和/或泌尿生殖器官的粘着性提高有利，而且鉴于本发明实现的作用，看来预测本发明也还是困难的。
用于本发明的脱乙酰壳多糖是通过碱处理天然几丁质获得的脱乙酰产物。该脱乙酰壳多糖，根据平均分子量的顺序和脱乙酰化程度，存在大范围的等级，但本发明可用的脱乙酰壳多糖包括任一和全部这些脱乙酰壳多糖的等级(包括脱乙酰壳多糖寡糖)。如熟知的，脱乙酰壳多糖是一种食料；因此，它对本发明的目的是高度安全并十分适合的。
在本发明中，脱乙酰壳多糖相对于乳酸菌的用量优选每1×109乳酸菌不少于0.00015mg，更优选的是不少于0.001mg。
本发明可用的聚赖氨酸是基本氨基酸L-赖氨酸的同聚物，通过在L-赖氨酸的ε-N末端和C-末端之间的n个酰胺键形成，而且聚合的程度(n)可以是约20到25。已知聚赖氨酸是已证实其对微生物的生长有抑制活性的化合物。
在本发明中，聚赖氨酸相对于乳酸菌的用量优选每1×109乳酸菌不少于0.00015mg，更优选的是不少于0.001mg。
本发明可用的抗高血脂阴离子交换树脂不受具体限制，但包括胆甾胺树脂和胆甾酰亚胺等。已知胆甾胺树脂是合成的强烈结合胆固醇的碱性离子交换树脂。它可以商品名Dowex；1-X2-Cl,MK-135等商业购得，也在Merck目录中被列为No.2257。上文提到的胆甾酰亚胺是已知的抗高血脂化合物，可以商品名Cholebine商业购得。
在本发明中，抗高血脂阴离子交换树脂相对于乳酸菌的用量优选每1×109乳酸菌不少于0.00015mg，更优选的是不少于0.001mg 。
本发明所用的鱼精蛋白是主要作为与鱼精细胞核中的DNA结合的核蛋白(核精蛋白)存在的强碱性蛋白质，并且是J.Antibact.Antifung.Agents Vol.23,No 10,pp 635-642(1995)中所述的已知化合物。今天，鱼精蛋白主要在食品工业中用作食品防腐剂，而且其氨基酸组成和立体结构已经被阐明。
在本发明中，鱼精蛋白相对于乳酸菌的用量优选每1×109乳酸菌不少于0.00015mg，更优选的是不少于0.001mg。
本发明中所用的明胶是能通过酸或碱处理动物骨骼、韧带或腱，并热水抽提得到的粗胶原蛋白制备的蛋白质，并且尤其是日本药典中描述的已知物质。
当在实施本发明中要用明胶时，优选用酸处理的明胶。酸处理明胶的等电点是pH7.0到9.0，而且当pH低于该等电点时，该明胶是带正电的，因此，其可作为本说明书中描述的碱性聚合物。
在本发明中，明胶相对于乳酸菌的用量优选每1×109乳酸菌不少于0.00015mg，更优选的是不少于0.001mg。
本发明中所用的异丁烯酸氨烷酯共聚物E是异丁烯酸甲酯/异丁烯酸丁酯/和异丁烯酸二甲基氨基乙酯的三聚物，而且已被用作药物学片剂和颗粒的涂层剂，因此是已知物质。例如可以商品名Eudragit E(Rhein)购得。异丁烯酸氨烷酯共聚物E可溶于有机溶剂，但在水中几乎不溶，而且由于显示碱性，该物质也属于本说明书中所称的碱性聚合物目录。
在本发明中，异丁烯酸氨烷酯共聚物E相对于乳酸菌的用量优选每1×109乳酸菌不少于0.00015mg，更优选的是不少于0.001mg。
本发明中所用的异丁烯酸氨烷酯共聚物RS是乙酰乙酯/异丁烯酸甲酯/异丁烯酸三甲基氯化铵甲酯的三聚物，是作为药物学片剂和颗粒的涂层剂的已知化合物。可以商品名Eudragit RS,Eudragit Retard S，和Eudragit RL(R)等购得。异丁烯酸氨烷酯共聚物RS在有机溶剂中可溶，而在水中几乎不溶，但由于其显示碱性，也在本说明书所称的“碱性共聚物”目录内。
在本发明中，异丁烯酸氨烷酯共聚物RS相对于乳酸菌的用量优选每1×109乳酸菌不少于0.00015mg，更优选的是不少于0.001mg。
本发明中所用的乳铁蛋白是作为多功能蛋白质存在于人和哺乳动物乳汁中的己知物质。乳铁蛋白是一种分子量大约8×104的蛋白质，已经鉴定了人乳铁蛋白和牛乳铁蛋白的氨基酸序列。由于它显示碱性，乳铁蛋白是本说明书所称的碱性聚合物之一。
在本发明中，乳铁蛋白相对于乳酸菌的用量优选每1×109乳酸菌不少于0.00015mg，更优选的是不少于0.001mg。
溶菌酶是一种作为酶的已知物质，其水解细菌的细胞壁粘肽(EC.3.2.1.17.)的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之间的β1-4键。例如，来自鸡蛋清的溶菌酶是一种由129个氨基酸残基构成，分子量14300，等电点11的单链多肽，因此是本说明书所称的碱性聚合物之一。
在本发明中，溶菌酶相对于乳酸菌的用量优选每1×109乳酸菌不少于0.00015mg，更优选的是不少于0.001mg。
在本发明中，可使用一种、或两种、或更多种上文提到的碱性聚合物。
可将含乳酸菌的组合物用于除去幽门螺杆菌的目的。当乳酸菌具有上文提到的除去幽门螺杆菌的作用时，本发明含乳酸菌的组合物(其中所述细菌对消化道和/或泌尿生殖器官的粘着性增强)比仅含有乳酸菌的组合物显示更强的除去幽门螺杆菌的效果。
可将本发明含乳酸菌的组合物用于清除肠出血性大肠杆菌的目的。当乳酸菌具有上文提到的除去出血性大肠杆菌的作用时，本发明含乳酸菌的组合物(其中所述细菌对消化道的粘着性增强)比仅含有乳酸菌的组合物显示更卓越的除去出血性大肠杆菌的效果。
可将本发明含乳酸菌的组合物用于食物过敏的治疗。当已证明乳酸菌具有上文提到的对食物过敏的治疗作用时，本发明含乳酸菌的组合物(其中所述细菌对消化道的粘着性增强)比仅含有乳酸菌的组合物显示显著提高的治疗食物过敏的效力。
可将本发明含乳酸菌的组合物用于泌尿生殖器官感染的治疗和/或预防。当已显示乳酸菌对上文提到的泌尿生殖器官感染的治疗和/或预防有效时，本发明含乳酸菌的组合物(其中所述细菌对泌尿生殖器官的粘着性增强)比仅含有乳酸菌的组合物显示卓越的对泌尿生殖器官感染的治疗和/或预防的效力。
上文提到的泌尿生殖器官感染不受具体限制，但包括细菌性阴道病、真菌性阴道病和复发尿道感染等。
可用各种方法生产本发明的含乳酸菌的组合物。例如可通过：混合所述碱性聚合物粉末与乳酸菌悬液的方法，混合所述碱性聚合物的水溶液或悬液与乳酸菌悬液的方法，或混合所述碱性聚合物与乳酸菌粉末的方法获得本发明的含乳酸菌的组合物。
另外，可用合适的稳定剂补充和通过干燥，例如冻干来粉末化组合物。至于混合变量条件，不具体限制浓度，但为了考虑乳酸菌的稳定性，温度和pH最好作明智的选择。
例如，所述乳酸菌悬液和碱性聚合物的所述水溶液或悬液的温度和pH优选分别不高于60℃和pH2到9。也可通过混合所述碱性聚合物的粉末与乳酸菌粉末来获得本发明含乳酸菌的组合物。当用脱乙酰壳多糖或异丁烯酸氨烷酯共聚物E作为碱性聚合物来制备脱乙酰壳多糖或异丁烯酸氨烷酯共聚物E的水溶液时，优选加入酸性成分，因为通常脱乙酰壳多糖和异丁烯酸氨烷酯共聚物E都会在酸性条件下膨胀并溶解。
上述酸性成分不受具体限制，但包括盐酸、硫酸、醋酸、乳酸、脂肪酸、琥珀酸、马来酸、柠檬酸和酒石酸等。
将如此获得的本发明含乳酸菌的组合物作为药物或食品施用给人或动物，或让其被人或动物摄入。包含本发明含乳酸菌组合物的药物也是本发明的一个实施例，而且包含本发明含乳酸菌的组合物的食品也是本发明的另一个实施例。
可通过常规技术以各种形式提供上述的药物或食物。关于胃肠道应用的剂形，可通过口服途径安全施用粉末、细粒、颗粒、胶囊、片剂、锭剂、糖浆等。关于泌尿生殖器官应用的剂量形式，可示范性使用栓剂、片剂、胶囊、霜、凝胶、油膏、洗剂、洗液和灌洗液。
可通过配制含乳酸菌的组合物和各种在药物学和食品加工过程中常规使用的各种添加剂，如赋形剂、粘合剂、崩解剂、涂层剂、润滑剂等以已知方式来生产这些药物学制备物。
人的剂量依赖于靶疾病和疾病的严重程度，但就成人病人而言，可根据需要每日一次或一日内分几剂施用不少于1×106活细胞，优选1×108到1×1012活细胞。
赋形剂包括蔗糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖等糖和玉米淀粉、马铃薯淀粉、稻淀粉、部分糊精化淀粉等淀粉。
粘合剂包括糊精、藻酸钠、角叉菜胶、瓜耳树胶、阿拉伯树胶、琼脂等多糖，黄蓍胶、明胶、面筋等天然存在的大分子物质，羟丙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基乙基纤维素、羧基甲基纤维素钠等纤维素衍生物，和聚乙烯吡咯酮、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚乙二醇、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸和乙酸乙烯酯树脂等合成聚合物。
崩解剂包括羧基甲基纤维素、羧基甲基纤维素钙、低-饱和度羟丙基纤维素等纤维素衍生物，和羧基甲基淀粉钠、羟丙基淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉、稻淀粉和部分糊精化的淀粉等淀粉。
润滑剂包括滑石、硬脂酸、硬脂酸钙、硬脂酸镁、硅胶、水化二氧化硅、各种石蜡和氢化油等。
涂层剂包括二甲基氨基乙基异丁烯酸酯-异丁烯酸共聚物、聚乙烯缩乙醛二乙基氨基乙酸酯，乙酸乙酯-异丁烯酸共聚物、乙酸乙酯-异丁烯酸甲酯-氯化三甲基铵甲基异丁烯酸酯共聚物、乙基纤维素等水不溶性聚合物，异丁烯酸-乙酸乙酯共聚物，邻二苯甲酸羟丙基甲基纤维素酯、醋酸羟丙基甲基纤维素酯琥珀酸酯等肠聚合物，和甲基纤维素。羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯酮、聚乙二醇等水溶性聚合物。
可将本发明含乳酸菌的组合物加到食品中。食品种类不受具体限制，但包括酸奶和其它发酵的乳制品。
实施本发明的最佳模式
下列工作、试验和配方实施例意图更详细的说明本发明，而不是要限制本发明的范围。
在评估本发明的各种效果时，用人胃癌细胞系MKN45(JCRB 0254,Yamaguchi,H.等：日本传染病协会杂志，72,487,1998)作为常规使用的胃细胞模型；用人结肠癌细胞系Caco 2(ATCC HTB-37,Coconnie M.H.等：FEMS微生物学通信，110,299,1993)作为常规使用的肠道细胞模型；用在乳酸菌存在下分泌IL-2的单核细胞白血病细胞系THP-1(Infect.Immun.,64.1906,1996)作为食品过敏模型细胞；和用人子宫癌细胞系HeLa(RCB007,Gey GO等：癌症研究，12,264,1952)作为常规使用的泌尿生殖器官细胞模型。这些将有利于体外评估。
实施例1
乳酸菌接种于MRS Broth(Difco),37℃液体培养16小时。在培养完成后，3000rpm离心培养液5分钟，收集细胞浓缩液。在该浓缩液中加入预先用1N盐酸调节到pH5的磷酸缓冲盐水(在本文后面称为PBS(pH5),NissuiPharmaceutical)，提供每毫升2×109或3×109乳酸菌的悬液。
将脱乙酰壳多糖(Chitosan 10,≥80％脱乙酰，0.5％粘度=5到20cps.,WakoPure Chemical Ind.)悬浮于30毫升蒸馏水中，加入1N盐酸使之溶解。然后用0.1N氢氧化钠/H2O将溶液调节到pH5，并用水补充到100毫升，得到脱乙酰壳多糖的水溶液。然后将10毫升乳酸菌悬液和10毫升该脱乙酰壳多糖的水溶液混合，提供含乳酸菌的组合物。
以下评估了本发明的效果。将胃癌细胞系MKN45悬浮于最终浓度为每毫升5×104细胞的10％胎牛血清-RPMI 1640培养液中，以每孔100微升分到96孔微量滴定板的各孔中去。在37℃培养3日后，用PBS洗涤粘着在微量滴定板上的MKN45胃癌细胞三次，制备MKN45单层。另一组试验将结肠癌细胞系Caco2悬浮在补充了20％血清，最终浓度为每毫升5×104细胞的Eagle’s MEM中，以每孔100微升分到96孔微量滴定板上。在37℃培养3日后，用PBS洗涤微量滴定板三次，制备单层Caco2结肠癌细胞。分别用PBS(pH5)2倍稀释含乳酸菌的组合物和乳酸菌悬液，并将各0.1ml稀释液加到单层MKN4胃癌细胞或单层Caco2结肠癌细胞上，然后37℃培养10分钟。用PBS洗涤细胞后，革兰氏染色乳酸菌，在光学显微镜下计数粘着在细胞上的乳酸菌。结果发现本发明含乳酸菌的组合物高度粘着于MKN45胃癌细胞和Caco2结肠癌细胞(表1和2)。
表1对胃癌细胞系MKN45的粘着(n=4)
    乳酸菌 存活数(细胞/毫升) 脱乙酰壳多糖浓度(mg/ml)   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
唾液乳杆菌WB1004(FREM P-15360)     1×109     0     45±10
    1.25     491±78**
唾液乳杆菌WB1004(FREM P-15360)     1×109     0     45±10
    0.15     368±39**
短乳杆菌WB1005(FREM P-15361)     1.5×109     0     0
    0.075     458±43**
鼠李糖乳杆菌(JCM1136)     1.5×109     0     3±3
    0.6     514±226**
类干酪乳杆菌类干酪亚种(CIP103918)     1.5×109     0     0
    0.075     140±28**
干酪乳杆菌(CIP103137)     1.5×109     0     0
    0.075     77±21**
植物乳杆菌(JCM1149)     1.5×109     0     0
    0.075     181±56**
唾液乳杆菌唾液亚种(CIP103140)     1.5×109     0     39±9
    1.25     353±73**
唾液乳杆菌水杨苷亚种(Lactobacillussalivarius subsp.salicinius)(JCM1150)     1.5×109     0     9±2
    1.25     213±25**
瑞士乳杆菌(JCM1120)     1.5×109     0     7±2
    0.3     632±136**
发酵乳杆菌(JCM1173)     1.5×109     0     12±3
    0.3     831±248**
德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgarius)(JCM1002)     1.5×109     0     9±4
    0.6     351±72**
德氏乳杆菌乳亚种(Lactobacillusdelbrueckii subsp.lactis)  (JCM1248)     1.5×109     0     6±3
    1.25     509±126**
嗜酸乳杆菌(CIP76.13)     1.5×109     0     0
    0.3     56±19**
路氏乳杆菌(JCM1112)     1×109     0     333±61
    0.3     1604±177**
加氏乳杆菌(JCM1131)     1.5×109     0     37±12
    1.25     312±96**
约氏乳杆菌(CNCM I-1225)     1.5×109     0     13±4
    0.16     691±68**
嗜酸乳杆菌WB2001     1.5×109     0     26±18
    0.15     2141±189**
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
表2对结肠癌细胞系Caco2的粘着(n=4)
    乳酸菌 存活数(细胞/毫升) 脱乙酰壳多糖浓度(mg/ml)   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
唾液乳杆菌WB1004(FREM P-15360)     1×109     0     104±36
    1.25     475±62**
短乳杆菌WB1005(FREM P-15361)     1.5×109     0     3±2
    0.075     177±75**
干酪乳杆菌(CIP103137)     1.5×109     0     3±1
    0.075     71±34*
植物乳杆菌(JCM1149)     1.5×109     0     2±2
    0.075     324±169**
嗜酸乳杆菌(CIP76.13)     1.5×109     0     11±4
    0.3     134±58*
路氏乳杆菌(JCM1112)     1×109     0     65±8
    0.6     1127±431**
student’s t-试验*：显著差异，p＜0.01
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.05
实施例2
将乳酸菌以1％的量接种到含1％葡萄糖的GAM Bouillon(NissuiPharmaceutical)，进行37℃液体培养24小时。培养完成后，3000rpm离心培养液5分钟，得到细胞浓缩液。在该浓缩液中加入PBS(pH5)，从而得到每毫升含有2×109个乳酸菌的悬液。
然后，将10毫升获得的乳酸菌悬液与10毫升如实施例1的相同方式制备的脱乙酰壳多糖水溶液，给予含乳酸菌的组合物。
如实施例1中的相同程序评估本发明的效果。结果发现本发明含乳酸菌的组合物高度粘着于MKN45胃癌细胞和Caco2结肠癌细胞(表3和4)。
表3对胃癌细胞系MKN45的粘着(n=4)
乳酸菌 存活数(细胞/毫升) 脱乙酰壳多糖浓度(mg/ml) 粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
粪肠球菌(ATCC29212) 1×109     0     0
    0.15     582±114**
屎肠球菌(JCM5803) 1×109     0     0
    0.075     312±21**
屎肠球菌(JCM5804) 1×109     0     0
    0.15     338±73**
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
表4对结肠癌细胞系Caco2的粘着(n=4)
 乳酸菌 存活数(细胞/毫升) 脱乙酰壳多糖浓度(mg/ml) 粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
屎肠球菌(JCM5804) 1×109     0     0
    0.15     314±38**
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
实施例3
通过将如实施例1制备的10毫升乳酸菌悬液和10毫升如实施例1制备的脱乙酰壳多糖水溶液混合来制备含乳酸菌的组合物。
通过如实施例1中的相同程序来评估本发明的效果。结果发现本发明含乳酸菌的组合物高度粘着于MKN45胃癌细胞和Caco2结肠癌细胞(表5和6)。
表5对胃癌细胞系MKN45的粘着(n=4)
    乳酸菌 存活数(细胞/毫升) 脱乙酰壳多糖浓度(mg/ml) 粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
乳酸乳球菌(ATCC11454) 1×109  0  8±4
 0.15  882±233**
肠膜乳明串珠菌(JCM6124) 1×109  0  108±30
 0.3  844±28**
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
表6对结肠癌细胞系Caco2的粘着(n=4)
    乳酸菌 存活数(细胞/毫升) 脱乙酰壳多糖浓度(mg/ml) 粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
肠膜乳明串珠菌(JCM6124) 1×109     0     5±1
    0.3     2939±563**
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
实施例4
通过混合10毫升如实施例2中制备的乳酸菌悬液与10毫升如实施例1中制备的脱乙酰壳多糖水溶液制备了含乳酸菌的组合物。
如实施例1中的相同程序评估了本发明的作用。结果发现本发明含乳酸菌的组合物高度粘着于Caco2结肠癌细胞(表7)。
表7对结肠癌细胞系Caco2的粘着(n=4)
    乳酸菌 存活数(细胞/毫升)   脱乙酰壳多糖浓度(mg/ml) 粘着细胞数±标准偏细胞/10000μm2)
双岐双岐杆菌WB1003(FREM P-12612) 1×109  0  110±10
 0.6  194±35**
短双岐杆菌(JCM1192) 1×109  0  11±16
 0.6  499±34**
婴儿双岐杆菌(JCM1222) 1×109  0  0
 0.15  403±61**
长双岐杆菌WB1001(FREM P-12610) 1×109  0  0
 0.3  362±50**
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
实施例5
分别用无菌PBS稀释指定健康食品“MEIJI Bulgaria Yogurt”(Meiji MilkProducts)和“Onaka-e-GG！”(Takanashi Milk Products)，并接种在BL琼脂培养基上，每皿0.1毫升。在37℃厌氧培养3日后，出现的菌落被分离出来。通过革兰氏染色和API 50CL(Japan Biomellieu Biotech)鉴定如此分离的细菌染色。从“MEIJI Bulgaria Yogurt”中分离到德氏乳杆菌保加利亚亚种和唾液链球菌嗜热亚种。从“Onaka-e-GG！”中，分离到鼠李糖乳杆菌。将如此分离和鉴定的乳酸菌在如实施例1的培养液中培养，得到每毫升各含3×109个乳酸菌的悬液。
然后，将各10毫升乳酸菌悬液与如实施例1中的相同方式制备的脱乙酰壳多糖的水溶液混合，得到含乳酸菌的组合物。
用如实施例1中的相同程序评估本发明的效果。结果发现本发明含乳酸菌的组合物高度粘着于MKN45胃癌细胞和Caco2结肠癌细胞(表8和9)。
表8对胃癌细胞系MKN45的粘着(n=4)
    乳酸菌 存活数(细胞/毫升) 脱乙酰壳多糖浓度(mg/ml)   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
德氏乳杆菌保加利亚亚种(Meiji MilkProducts) 1.5×109  0  6±1
 0.6  164±10**
唾液链球菌嗜热亚种(Meiji MilkProducts) 1.5×109  0  44±26
 0.3  1356±102**
鼠李糖乳杆菌(Takanashi MilkProducts) 1.5×109  0  8±3
 0.3  366±43**
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
表9对结肠癌细胞系Caco2的粘着(n=4)
    乳酸菌 存活数(细胞/毫升) 脱乙酰壳多糖浓度(mg/ml) 粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
德氏乳杆菌保加利亚亚种(Meiji MilkProducts) 1.5×109  0  7±3
 0.15  1210±637**
唾液链球菌嗜热亚种(Meiji MilkProducts) 1.5×109  0  37±26
 0.15  1159±305**
鼠李糖乳杆菌(Takanashi MilkProducts) 1.5×109  0  10±3
 0.15  1797±239**
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
实施例6
分别冻干唾液乳杆菌WB 1004悬液和如实施例1中获得的含唾液乳杆菌WB1004的组合物悬液，制备含唾液乳杆菌WB 1004细胞的粉末和粉化的含唾液乳杆菌WB 1004细胞的组合物。
使用各悬浮在N0.1溶液J.P.(pH12)中的含唾液乳杆菌WB 1004细胞的粉末和粉化的含唾液乳杆菌WB 1004细胞的组合物，用如实施例1中的相同程序评估了本发明的效果。结果发现本发明含乳酸菌的组合物高度粘着于MKN45胃癌细胞(表10)。
表10对胃癌细胞系MKN45的粘着(n=4)
    样品   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
粉化乳酸菌 51±9
粉化含乳酸菌的组合物 230±12**
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
实施例7
将如实施例1中的相同方式制备的唾液乳杆菌WB 1004悬液(5毫升)3000rpm离心5分钟，以获得唾液乳杆菌WB 1004的细胞浓缩液。
分别将各种梯度的脱乙酰壳多糖(包括脱乙酰壳多糖寡糖)悬浮于30毫升蒸馏水中，并加入1N盐酸使其溶解。在用0.1N氢氧化钠调节pH后，将各溶液用水补充到100毫升，得到脱乙酰壳多糖的水溶液。然后，将10毫升脱乙酰壳多糖的水溶液加到乳酸菌的细胞浓缩液中，得到含乳酸菌的组合物。用如实施例1中的相同程序评估本发明的效果。结果发现本发明含乳酸菌的组合物高度粘着于MKN45胃癌细胞和Caco2结肠癌细胞(表11和12)。表11对胃癌细胞系MKN45的粘着(n=4)
    脱乙酰壳多糖 脱乙酰壳多糖溶液(pH) 脱乙酰壳多糖浓度(mg/ml) 粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
脱乙酰壳多糖100，脱乙酰化≥80％,0.5％粘度：50到150cps WakoPure Chemical Ind.     5     0     36±17
    0.25     205±23**
脱乙酰壳多糖100，脱乙酰化≥80％,0.5％粘度：300到700cps WakoPure Chemical Ind.     5     0     36±17
    0.3     200±17**
脱乙酰壳多糖1000，脱乙酰化：75到90％,0.5％粘度：800到1300cpsWako Pure Chemical Ind.     5     0     36±17
    0.25     190±20**
Koyo脱乙酰壳多糖，脱乙酰化46.1％,0.5％粘度：35cps KoyoChemical     2     0     36±17
  0.00015     103±21**
脱乙酰壳多糖，脱乙酰化7％,0.5％粘度：430cps Yaidzu SuisanChemical     5     0     36±17
    0.75     648±163**
Kimitsu脱乙酰壳多糖，脱乙酰化75到85％,0.5％粘度：5到20cpsKimitsu Chemical     4.5     0     36±17
    10     140±37**
Kimitsu脱乙酰壳多糖，脱乙酰化≥95％,0.5％粘度：5到20cpsKimitsu Chemical     6.5     0     36±17
    2.5     173±40**
水溶脱乙酰壳多糖，分子量3000到30000 Wako Pure Chemical Ind.     4     0     30±6
    0.63     717±92**
脱乙酰壳多糖寡糖，70％二-己糖：分子量20000/30％乳酸YaidzuSuisan Chemical     4     0     30±6
    0.75     927±166**
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
表12对结肠癌细胞系Caco2的粘着(n=4)
    脱乙酰壳多糖 脱乙酰壳多糖溶液(pH) 脱乙酰壳多糖浓度(mg/ml) 粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
脱乙酰壳多糖寡糖，70％二-己糖：分子量20000/30％乳酸YaidzuSuisan Chemical     4     0     24±7
    0.1     76±21**
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
实施例8
将如实施例1中的相同程序制备的唾液乳杆菌WB 1004悬液(5毫升)以3000rpm离心5分钟，得到唾液乳杆菌WB 1004的细胞浓缩液。
将脱乙酰壳多糖(脱乙酰壳多糖10,≥80％乙酰化，0.5％粘度=5到20cps,Wako Pure Chemical Ind.，或脱乙酰壳多糖LL,≥80％脱乙酰化，0.5％粘度=≥20cps,Yaidzu Suisan Chemical)悬浮在30毫升蒸馏水中，并用不同的酸使其溶解。在用0.1N氢氧化钠调节到pH3到5后，将各溶液用水补充到100毫升，得到脱乙酰壳多糖的水溶液。然后，将10毫升脱乙酰壳多糖溶液加到乳酸菌的细胞浓缩液中，得到含乳酸菌的组合物。
用如实施例1中的相同程序评估了本发明的效果。结果发现本发明含乳酸菌的组合物高度粘着于MKN45胃癌细胞和Caco2结肠癌细胞(表13)。
表13对胃癌细胞系MKN45的粘着(n=4)
溶解脱乙酰壳多糖的酸 脱乙酰壳多糖 脱乙酰壳多糖溶液(pH) 脱乙酰壳多糖浓度(mg/ml)   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
醋酸 脱乙酰壳多糖10     3     0     36±17
    0.075     229±31**
乳酸 脱乙酰壳多糖10     3     0     36±17
    0.075     295±70**
柠檬酸 脱乙酰壳多糖10     3     0     36±17
    0.15     367±26**
抗坏血酸 脱乙酰壳多糖10     3     0     36±17
    0.075     364±85**
琥珀酸 脱乙酰壳多糖10     3     0     36±17
    0.075     662±144**
酒石酸 脱乙酰壳多糖10     3     0     36±17
    0.075     346±38**
苹果酸 脱乙酰壳多糖10     3     0     36±17
    1.25     353±92**
天冬氨酸 脱乙酰壳多糖LL     5     0     29±7
    0.15     1802±162**
谷氨酸 脱乙酰壳多糖LL     5     0     32±2
    0.15     1811±196**
脂肪酸 脱乙酰壳多糖LL     5     0     105±25
    0.15     1802±358**
马来酸 脱乙酰壳多糖LL     5     0     105±25
    0.15     1931±134**
烟碱酸 脱乙酰壳多糖LL     5     0     105±25
    0.15     1706±93**
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
实施例9
将阿莫西林(Amoxicillin)(Sigma)和万古霉素(ShionogiPharmaceutical)分别以最终浓度为每毫升200微克和每毫升10微克加到饮用水中，使ICR小鼠(雄性，5周龄)饮用该饮用水5日，来除去胃中的细菌。然后，将饮用水换成无菌水，并在1夜禁食后，以0.5ml(8×109个细胞)口腔施用如实施例1、实施例17或实施例19中制备的含唾液乳杆菌WB 1004的组合物悬液或唾液乳杆菌WB 1004细胞悬液的2倍PBS稀释液。30分钟后，杀死小鼠，分离胃，除去肠内容物。用PBS洗涤胃并用玻璃匀浆器将9倍重量于胃的0.5M NaCl与胃-起匀浆。适当用0.5M NaCl稀释如此获得的匀浆物，并将其涂在含有改良LBS琼脂培养基(Mitsuoka,T.,：肠道细菌的世界，Sobun-sha)的培养皿上。培养皿在37℃厌氧培养24小时，从长出的菌落数来测定粘着在胃上的细菌细胞数。用API 50 CH(Japan Biomillieu Biotech)分析数个菌落，并鉴定出它们是唾液乳杆菌WB 1004。结果发现本发明含乳酸菌的组合物高度粘着于小鼠胃(表14)。
表14对小鼠胃的粘着(n=4～5)
聚合物(浓度) 样品 粘着细胞数±标准偏差(Log10CFU/胃)
脱乙酰壳多糖10(0.25％) 含乳酸菌的组合物 7.1±0.8*
乳酸菌 5.7±0.2
 Eudragit RL(0.5％) 含乳酸菌的组合物 6.8±0.4**
乳酸菌 3.6±0.8
 Eudragit E100(2％) 含乳酸菌的组合物 7.3±0.6**
乳酸菌 4.2±1.0
student’s t-试验*：显著差异，p＜0.05
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
实施例10
将MKN45胃癌细胞以终浓度为每毫升5×104个细胞悬浮在10％FCS-RPMI1640培养液中，并以0.1ml/孔分到96孔微量滴定板的孔中。37℃培养3日后，用PBS洗涤粘着在微量滴定板上的MKN45胃癌细胞三次，以制备单层MKN45胃癌细胞。
将如实施例1中获得的唾液乳杆菌WB 1004的悬液或含唾液乳杆菌WB 1004组合物的悬液加到上述的MKN45单层上，并在培育30分钟后，用PBS洗涤MNK45胃癌细胞三次。然后，加入0.1ml PBS，用超声波仪(7250型，SeikoElectronics)以20kHz超声粉碎5秒，来溶解MNK45胃癌细胞，并分离粘着在细胞上的唾液乳杆菌WB 1004。然后，用PBS稀释该超声液，并涂在MRS琼脂板上，测定唾液乳杆菌WB 1004的活菌数。结果，当使用唾液乳杆菌WB 1004细胞悬液时，粘着在MKN45胃癌细胞上的乳酸菌活菌数是104.8±0.1，而当使用本发明含唾液乳杆菌WB 1004的组合物悬液时，活菌数是106.3±0.1，大约高30倍。
实施例11
将聚赖氨酸(50％聚赖氨酸，Asama Kasei)溶于100毫升PBS中。然后将10毫升该聚赖氨酸溶液和10毫升如实施例1或2中的相同方式制备的乳酸菌悬液(pH7.2,2×109/ml)混合，得到含乳酸菌的组合物。用如实施例1中的相同方法评估了本发明的效果。然而，在pH7时进行对Caco2结肠癌细胞的粘着试验。结果发现本发明含乳酸菌的组合物高度粘着于MKN45胃癌细胞和Caco2结肠癌细胞(表15和16)。
表15对胃癌细胞系MKN45的粘着(n=4)
    乳酸菌 聚合物浓度(mg/ml)   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
唾液乳杆菌WB1004(FREM P-15360)  0  19±8
 12.5  237±83**
短乳杆菌WB1005(FREM P-15361)  0  20±4
 6.3  183±16**
干酪乳杆菌(CIP103137)  0  2±1
 1.6  29±7**
植物乳杆菌(JCM1149)  0  16±1
 1.6  78±19**
屎肠球菌(JCM5804)  0  10±5
 3.1  393±57**
乳酸乳球菌(ATCC11454)  0  10±4
 1.6  188±51**
双岐双岐杆菌WB 1003(FREM P-12612)  0  15±7
 3.1  93±24**
婴儿双岐杆菌(JCM1222)  0  8±2
 1.6  64±16**
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
表16对结肠癌细胞系Caco2的粘着(n=4)
    乳酸菌 聚合物浓度(mg/ml)   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
唾液乳杆菌WB1004(FREM P-15360) 0  9±2
 1.3  112±12**
短乳杆菌WB1005(FREM P-15361)  0  6±1
 2.5  75±7**
嗜酸乳杆菌WB2001  0  4±3
 1.3  160±11**
屎肠球菌(JCM5804)  0  12±1
 2.5  176±18**
双岐双岐杆菌WB 1003(FREM P-12612)  0  5±2
 0.6  625±32**
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
实施例12
将胆甾胺树脂(Sigma)悬浮在100毫升PBS中。然后，将10毫升该胆甾胺树脂悬液与10毫升如实施例1或2中的相同方式制备的乳酸菌悬液(pH7,2×109/ml)混合，得到含乳酸菌的组合物。用如实施例1中的相同方式评估了本发明的效果。然而，在pH7下进行对Caco2结肠癌细胞粘着的试验30分钟。结果发现本发明含乳酸菌的组合物高度粘着于MKN45胃癌细胞和Caco2结肠癌细胞(表17和18)。
表17对胃癌细胞系MKN45的粘着(n=4)
    乳酸菌 聚合物浓度(mg/ml)   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
唾液乳杆菌WB1004(FREM P-15360)  0  172±44
 1.3  644±306**
短乳杆菌WB1005(FREM P-15361)  0  57±30
 0.078  624±77**
干酪乳杆菌(CIP103137)  0  5±1
 0.31  264±28**
嗜酸乳杆菌(CIP76.13)  0  21±5
 1.3  1859±280**
屎肠球菌(JCM5804)  0  95±18
 0.078  394±103**
乳酸乳球菌(ATCC11454)  0  40±7
 1.3  1619±454**
短双岐杆菌(JCM1192)  0  14±4
 0.078  53±6**
婴儿双岐杆菌(JCM1222)  0  42±3
 0.078  627±94**
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
表18对结肠癌细胞系Caco2的粘着(n=4)
    乳酸菌 聚合物浓度(mg/ml)   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
唾液乳杆菌WB1004(FREM P-15360)  0  9±2
 1.3  359±18**
短乳杆菌WB1005(FREM P-15361)  0  6±1
 2.5  317±17**
嗜酸乳杆菌(CIP76.13)  0  1±1
 2.5  197±21**
约氏乳杆菌(CNCM I-1225)  0  1±1
 5.0  69±13**
嗜酸乳杆菌WB2001  0  4±3
 1.3  324±16**
屎肠球菌(JCM5804)  0  12±1
 2.5  139±14**
乳酸乳球菌(ATCC11454)  0  1±1
 5.0  141±11**
双岐双岐杆菌WB1003(FREM P-12612)  0  5±2
 0.6  659±29**
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
实施例13
将鱼精蛋白(Asama Kasei)溶于60毫升水，然后加入并溶解0.9克氯化钠。用1N盐酸将溶液调节到pH4，再用水稀释到100毫升，从而获得浓度为2.5％或0.15％的鱼精蛋白水溶液。然后，将10毫升该鱼精蛋白水溶液与10毫升如实施例1中的相同方式制备的唾液乳杆菌WB1004(pH4,3×109/ml)悬液混合，得到含乳酸菌的组合物。用如实施例1中的相同程序评估了本发明的效用。结果发现本发明含乳酸菌的组合物高度粘着于MKN45胃癌细胞和Caco2结肠癌细胞(表19和20)。
表19对胃癌细胞系MKN45的粘着(n=4)
    乳酸菌 聚合物浓度(mg/ml)   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
唾液乳杆菌WB1004(FREM P-15360)  0  57±13
 12.5  128±28**
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
表20对结肠癌细胞系Caco2的粘着(n=4)
    乳酸菌 聚合物浓度(mg/ml)   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
唾液乳杆菌WB1004(FREM P-15360)  0  18±5
 0.75  105±33**
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
实施例14
将硫酸鱼精蛋白(来自鲑鱼；Wako Pure Chemical Ind.)溶解在60毫升水中，然后加入并溶解0.9克氯化钠。用1N氢氧化钠将溶液调节到pH7，并用水稀释到100毫升，从而得到浓度为0.06到0.5％的鱼精蛋白水溶液。然后，将每种浓度的鱼精蛋白溶液10毫升与如实施例1或2中制备的乳酸菌悬液(pH7,3×109/ml)混合，得到含乳酸菌的组合物。用如实施例1中的相同程序评估了本发明的效用。然而，在pH7下进行对Caco2结肠癌细胞的30分钟粘着试验。结果发现本发明含乳酸菌的组合物高度粘着于Caco2结肠癌细胞(表21)。
表21对结肠癌细胞系Caco2的粘着(n=4)
    乳酸菌 聚合物浓度(mg/ml)   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
唾液乳杆菌WB1004(FREMP-15360)  0  9±2
 0.3  161±22**
短乳杆菌WB1005(FREM P-15361)  0  6±1
 0.6  412±46**
植物乳杆菌(JCM1149)  0  0
 1.3  122±17**
嗜酸乳杆菌(CIP76.13)  0  1±1
 0.6  44±8**
约氏乳杆菌(CNCM I-1225)  0  1±1
 2.5  22±7**
嗜酸乳杆菌WB2001  0  4±3
 0.6  290±41**
屎肠球菌(JCM5804)  0  12±1
 2.5  173±24**
双岐双岐杆菌WB1003(FREM P-12612)  0  5±2
 0.6  601±81**
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
实施例15
将如实施例1或实施例5中的相同方法制备的乳酸菌悬液(3×109/ml)(10ml)3000rpm离心10分钟，得到乳酸菌的细胞浓缩液。
将明胶(AP-100型，Nitta Gelatin)悬浮在80毫升水中，50℃温热溶解，然后自然降温。接着，加入并溶解0.9克氯化钠，并用1N盐酸调节到pH3，然后用水进一步稀释到100毫升，从而得到明胶水溶液。然后，将20毫升明胶溶液加到上述乳酸菌细胞浓缩液中，得到含乳酸菌的组合物。
用如实施例1中的相同程序评估了本发明的效果。然而，进行30分钟粘着试验。结果发现本发明含乳酸菌的组合物高度粘着于MKN45胃癌细胞和Caco2结肠癌细胞(表22和23)。
表22对胃癌细胞系MKN45的粘着(n=4)
    乳酸菌 聚合物浓度(mg/ml)   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
唾液乳杆菌WB1004(FREM P-15360)  0  19±5
 10  94±21**
加氏乳杆菌(JCM1131)  0  28±3
 6.4  427±138**
鼠李糖乳杆菌(TakanashiMilk Product)  0  5±3
 6.4  66±21**
约氏乳杆菌(CNCM I-1225)  0  7±4
 2.5  25±10*
嗜酸乳杆菌WB2001  0  33±8
 40  612±90**
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
student’s t-试验*：显著差异，p＜0.05
表23对结肠癌细胞系Caco2的粘着(n=4)
    乳酸菌 聚合物浓度(mg/ml)   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
屎肠球菌(JCM5804)  0  157±81
 2.5  1400±633**
双岐双岐杆菌WB1003(FREM P-12612)  0  7±5
 0.6  55±19**
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
实施例16
将低分子量明胶(Miyagi Kagaku Kogyo)(10克)溶于80毫升水，然后加入并溶解0.9克氯化钠。用1N盐酸将该溶液调节到pH3，并用水稀释到100毫升，从而获得低分子量明胶的水溶液。然后，将10毫升该10％低分子量明胶水溶液与10毫升唾液乳杆菌WB1004的悬液(pH3,3×109细胞/ml)混合，得到含乳酸菌的组合物。用如实施例1中的相同程序评估了本发明的效果。然而，进行30分钟的粘着试验。结果发现本发明含乳酸菌的组合物高度粘着于MKN45胃癌细胞(表24)。
表24对胃癌细胞系MKN45的粘着(n=4)
    乳酸菌 聚合物浓度(mg/ml)   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
唾液乳杆菌WB1004(FREM P-15360)  0  19±5
 50  304±79**
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
实施例17
将异丁烯酸氨烷酯共聚物RS(Eudragit RL100,Rhein)悬浮在80毫升水中，加热到并维持在80C搅拌2小时，使异丁烯酸氨烷酯共聚物RS分散(平均颗粒直径为49.3nm)。然后，加入0.96g克PBS粉末(Dulbecco’s PBS(-)，Nissui Pharmaceutical)并使之溶解，将溶液用水稀释到100毫升并过滤(过滤材料：1.2微米)，得到异丁烯酸氨烷酯共聚物RS的水相分散液。然后，将10毫升该异丁烯酸氨烷酯共聚物RS的水相分散液与10毫升如实施例5中的相同方式制备的乳酸菌悬液(pH7,3×109细胞/ml)混合，得到含乳酸菌的组合物。用如实施例1或实施例5中的相同程序评估了本发明的效果。结果发现本发明含乳酸菌的组合物高度粘着于MKN45胃癌细胞和Caco2结肠癌细胞(表25和26)。
表25对胃癌细胞系MKN45的粘着(n=4)
    乳酸菌 聚合物浓度(mg/ml)   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
唾液乳杆菌WB1004(FREM P-15360)  0  30±5
 0.15  559±50**
加氏乳杆菌(JCM1131)  0  2±2
 2.5  212±68**
鼠李糖乳杆菌(TakanashiMilk Product)  0  5±2
 0.83  31±9**
嗜酸乳杆菌(CIP76.13)  0  7±2
 0.28  13±3*
约氏乳杆菌(CNCM I-1225)  0  7±3
 0.031  20±9*
嗜酸乳杆菌WB2001  0  13±7
 0.28  1139±412**
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
student’s t-试验*：显著差异，p＜0.05
表26对结肠癌细胞系Caco2的粘着性(n=4)
    乳酸菌 聚合物浓度(mg/ml)   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
唾液乳杆菌WB1004(FREM P-15360)  0  233±107
 0.05  3526±484**
加氏乳杆菌(JCM1131)  0  87±33
 0.05  1593±647**
约氏乳杆菌(CNCM I-1225)  0  27±29
 12.5  77±27**
鼠李糖乳杆菌(TakanashiMilk Product)  0  90±95
 0.05  627±385*
屎肠球菌(JCM5804)  0  131±46
 0.05  2451±825**
婴儿双岐杆菌(JCM1222)  0  19±18
 0.05  501±232**
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
student’s t-试验*：显著差异，p＜0.05
实施例18
将异丁烯酸氨烷酯共聚物RS(Eudragit RS100,Rhein)悬浮在80毫升水中，加热到并维持在80℃搅拌2小时，使异丁烯酸氨烷酯共聚物RS分散(平均颗粒直径为60.9纳米)。然后，溶解0.9克氯化钠，并用1N盐酸将溶液调节到pH4，用水稀释到100毫升，然后过滤(1.2微米)，得到异丁烯酸氨烷酯共聚物RS的水相分散液。然后，将10毫升该异丁烯酸氨烷酯共聚物RS的水相分散液与10毫升如实施例1中的相同方式制备的乳酸菌悬液(pH4,3×109细胞/ml)混合，得到含乳酸菌的组合物。用如实施例1或实施例5中的相同程序评估了本发明的效果。结果发现本发明含乳酸菌的组合物高度粘着于MKN45胃癌细胞和Caco2结肠癌细胞(表27和28)。
表27对胃癌细胞系MKN45的粘着(n=4)
    乳酸菌 聚合物浓度(mg/ml)   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
唾液乳杆菌WB1004(FREM P-15360)  0  57±13
 1.5  556±135**
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
表28对结肠癌细胞系Caco2的粘着(n=4)
    乳酸菌 聚合物浓度(mg/ml)   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
唾液乳杆菌WB1004(FREM P-15360)  0  18±5
 3  89±35*
student’s t-试验*：显著差异，p＜0.05
实施例19
如实施例1或实施例5中的相同方式获得的乳酸菌悬液(3×109细胞/ml)(10ml)3000rpm离心10分钟，得到乳酸菌的细胞浓缩液。
将异丁烯酸氨烷酯共聚物E(Eudragit E100,Rhein)悬浮在60毫升水中，并用1N盐酸溶解。然后，加入0.9克氯化钠并溶解。用0.1N氢氧化钠将溶液调节到pH5，用水稀释到100毫升，得到异丁烯酸氨烷酯共聚物E的水溶液。然后，将20毫升该异丁烯酸氨烷酯共聚物E水溶液与上述乳酸菌的细胞浓缩液混合，得到含乳酸菌的组合物。用如实施例1中的相同程序评估了本发明的效果。然而，进行粘着试验30分钟。结果发现本发明含乳酸菌的组合物高度粘着于MKN45胃癌细胞和Caco2结肠癌细胞(表29和30)。
表29对胃癌细胞系MKN45的粘着(n=4)
    乳酸菌 聚合物浓度(mg/ml)   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
唾液乳杆菌WB1004(FREM P-15360)  0  57±13
 25  140±50*
加氏乳杆菌(JCM1131)  0  28±13
 8  777±197**
鼠李糖乳杆菌(TakanashiMilk Product)  0  5±3
 1.3  138±45**
嗜酸乳杆菌(CIP76.13)  0  14±7
 8  156±30*
约氏乳杆菌(CNCM I-1225)  0  12±3
 8  101±30**
嗜酸乳杆菌WB2001  0  156±20
 3.2  392±81**
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
student’s t-试验*：显著差异，p＜0.05
表30对结肠癌细胞系Caco2的粘着(n=4)
    乳酸菌 聚合物浓度(mg/ml)   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
唾液乳杆菌WB1004(FREM P-15360)  0  18±5
 1.5  182±50**
加氏乳杆菌(JCM1131)  0  126±59
 0.8  1516±366**
鼠李糖乳杆菌(TakanashiMilk Product)  0  65±44
 0.05  431±151**
屎肠球菌(JCM5804)  0  87±79
 0.05  961±284*
双岐双岐杆菌WB1003(FREM P-12612)  0  142±90
 0.8  414±91**
婴儿双岐杆菌(JCM1222)  0  5±4
 0.8  231±64**
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
实施例20
将5克铁乳蛋白(Wako Pure Chemical Ind.)溶解在60毫升水中，然后加入0.9克氯化钠并使之溶解。用1N盐酸将溶液调节到pH4，用水稀释到100毫升，然后过滤(1.2微米)，得到铁乳蛋白水溶液。然后，将10毫升该5％铁乳蛋白水溶液与10毫升如实施例1中的相同方式制备的唾液乳杆菌WB 1004悬液(pH4,3×109细胞/ml)混合，得到含乳酸菌的组合物。用如实施例1中的相同程序评估了本发明的效果。结果发现本发明含乳酸菌的组合物高度粘着于MKN45胃癌细胞(表31)。
表31对胃癌细胞系MKN45的粘着(n=4)
    乳酸菌 聚合物浓度(mg/ml)   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
唾液乳杆菌WB1004(FREM P-15360)  0  57±13
 25  333±71**
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
实施例21
将蛋清溶菌酶(Wako Pure Chemical Ind.)溶解在60毫升水中，然后加入0.9克氯化钠并使之溶解。用1N盐酸将该溶液调节到pH4并用水稀释到100毫升，得到溶菌酶水溶液。然后，将10毫升该溶菌酶水溶液与10毫升如实施例1中的相同方式制备的唾液乳杆菌WB 1004悬液(pH4,3×109细胞/ml)混合，得到含乳酸菌的组合物。用如实施例1中的相同程序评估了本发明的效果。结果发现本发明含乳酸菌的组合物高度粘着于MKN45胃癌细胞和Caco2结肠癌细胞(表32和33)。
表32对胃癌细胞系MKN45的粘着(n=4)
    乳酸菌 聚合物浓度(mg/ml)   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
唾液乳杆菌WB1004(FREM P-15360)  0  30±6
 25  174±42**
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
表33对结肠癌细胞系Caco2的粘着(n=4)
    乳酸菌 聚合物浓度(mg/ml)   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
唾液乳杆菌WB1004(FREM P-15360)  0  24±7
 6.3  47±7*
student’s t-试验*：显著差异，p＜0.05
实施例22
用实施例1或实施例5中的相同方式获得的乳酸菌悬液(3×109细胞/ml)(1ml)3000rpm离心5分钟，得到乳酸菌的细胞浓缩液。在该浓缩液中加入1毫升实施例1、实施例15、实施例17和实施例20中的相同方式制备的脱乙酰壳多糖水溶液、明胶水溶液、Eudragit RL100悬液和乳铁蛋白水溶液的混合液，得到含乳酸菌的组合物。
用如实施例1中的相同程序评估了本发明的效果。结果发现本发明含乳酸菌的组合物高度粘着于MKN45胃癌细胞(表34)。
表34对胃癌细胞系MKN45的粘着(n=4)
    乳酸菌 聚合物 聚合物浓度(mg/ml)   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
唾液乳杆菌WB1004(FREM P-15360) 无  0  61±7
Eudragit RL100明胶AP100  0.210  422±44**
唾液乳杆菌WB1004(FREM P-15360) 无  0  46±12
明胶AP100牛乳铁蛋白  1025  368±73**
唾液乳杆菌WB1004(FREM P-15360) 无  0  46±12
脱乙酰壳多糖10牛乳铁蛋白  1.2525  645±190**
加氏乳杆菌(JCM1131) 无  0  51±24
脱乙酰壳多糖10乳铁蛋白  2.512.5  251±70**
加氏乳杆菌(JCM1131) 无  0  51±24
明胶AP100乳铁蛋白  106.25  230±35**
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
实施例23
用实施例1或实施例5中的相同方式获得的乳酸菌(3×109细胞/ml)的培养液3000rpm离心5分钟，得到乳酸菌的细胞浓缩液。然后，在获得的细胞浓缩液中加入PBS来制备每毫升含3×109个乳酸菌的悬液。
将脱乙酰壳多糖(脱乙酰壳多糖10)悬浮在30毫升蒸馏水中，并用1N盐酸溶解。用0.1N Na0H将溶液调节到pH5，用水稀释到100毫升，得到脱乙酰壳多糖的水溶液。然后将1毫升该脱乙酰壳多糖溶液与1毫升乳酸菌悬液混合，得到含乳酸菌的组合物。
如下评估了本发明的效果。将THP-1单核白血病细胞以最终浓度6×106个细胞/ml悬浮在PBS中，并将该悬液以每孔50微升分散到96孔微量滴定板的各孔中。
将各用PBS稀释两倍的含乳酸菌组合物的悬液(50微升)或乳酸菌悬液加到孔中的THP-1单核白血病细胞中，并将该板在37℃培育30分钟。然后，将含15％蔗糖的PBS以200微升/孔分散到96孔微量滴定板的各孔中，再放入20微升培育(30分钟)的THP-1单核白血病细胞和含乳酸菌组合物的悬液或乳酸菌悬液的反应混合物，并将该板以500rpm离心5分钟，收集细胞沉淀。用200微升PBS洗涤该沉淀，再500rpm离心5分钟，得到细胞片状沉淀物。革兰氏染色乳酸菌，在光学显微镜下对粘着在细胞上的乳酸菌进行计数。结果发现本发明的该含乳酸菌的组合物高度粘着于THP-1单核白血病细胞(表35)。
表35对单核白血病细胞系THP-1的粘着(n=4)
    乳酸菌 聚合物浓度(mg/ml)   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
加氏乳杆菌(JCM1131)  0  5±4
 5.0  42±4**
约氏乳杆菌(CNCM I-1225)  0  4±1
 1.3  22±7**
鼠李糖乳杆菌(TakanashiMilk Product)  0  1±1
 5.0  16±12*
植物乳杆菌(JCM1149)  0  1±1
 5.0  17±6**
屎肠球菌(JCM5804)  0  1±2
 5.0  22±5**
婴儿双岐杆菌(JCM1222)  0  1±1
 5.0  22±10**
student’s t-试验*：显著差异，p＜0.05
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
实施例24
把1毫升用实施例23中的相同方式获得的乳酸菌悬液与1毫升用实施例17中的相同方式制备的异丁烯酸氨烷酯共聚物RS的水相分散液混合，而制备了含乳酸菌的组合物。用实施例23中的相同程序评估了本发明的效果。结果发现本发明的该含乳酸菌的组合物高度粘着于THP-1单核白血病细胞(表36)。
表36对单核白血病细胞系THP-1的粘着(n=4)
    乳酸菌 聚合物浓度(mg/ml)   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
加氏乳杆菌(JCM1131)  0  1±1
 0.2  24±18*
约氏乳杆菌(CNCM I-1225)  0  1±0.2
 0.8  17±6**
鼠李糖乳杆菌(TakanashiMilk Product)  0  0.3±0.3
 0.2  22±8**
植物乳杆菌(JCM1149)  0  0.2±0.2
 0.05  7±1**
屎肠球菌(JCM5804)  0  14±17
 0.2  88±44**
婴儿双岐杆菌(JCM1222)  0  1±1
 0.8  32±16**
student’s t-试验*：显著差异，p＜0.05
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
实施例25
用1毫升用实施例23中的相同方式制备的乳酸菌悬液与1毫升用实施例19中的相同方式制备的异丁烯酸氨烷酯共聚物E的水相分散液混合，而制备了含乳酸菌的组合物。
如下评估了本发明的效果。将THP-1单核白血病细胞以最终浓度6×106个细胞/ml悬浮在盐水(pH5)中，将该悬液以每孔50微升分散到96孔微量滴定板的各孔中。
将各用盐水(pH4)稀释两倍的含乳酸菌组合物的悬液或乳酸菌悬液以每孔50微升加到事先分布在微量滴定板上的孔中的THP-1单核白血病细胞中，并将该板在37℃培育60分钟。将含15％蔗糖的PBS以200微升/孔分别的分散到96孔微量滴定板的各孔中，每孔再分别的加入20微升已培育60分钟的，含有THP-1单核白血病细胞和所述含乳酸菌组合物的悬液或乳酸菌悬液的反应混合物，并将该板以500rpm离心5分钟，得到细胞浓缩液。用200微升PBS洗涤该浓缩液，再在500rpm离心5分钟而获得细胞片状沉淀物。革兰氏染色乳酸菌，在光学显微镜下对粘着在细胞上的乳酸菌进行计数。结果发现本发明的该含乳酸菌的组合物高度粘着于THP-1单核白血病细胞(表37)。
表37对单核白血病细胞系THP-1的粘着(n=4)
    乳酸菌 聚合物浓度(mg/ml)   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
加氏乳杆菌(JCM1131)  0  7±8
 0.05  104±14**
约氏乳杆菌(CNCM I-1225)  0  10±6
 0.2  49±21**
鼠李糖乳杆菌(TakanashiMilk Product)  0  9±10
 0.05  129±10**
植物乳杆菌(JCM1149)  0  3±3
 3.2  25±3**
屎肠球菌(JCM5804)  0  2±4
 0.2  138±42**
婴儿双岐杆菌(JCM1222)  0  1±1
 0.2  22±11**
student’s t-试验*：显著差异，p＜0.05
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
实施例26
将实施例23中的相同程序获得的乳酸菌培养液(3×109个细胞/ml)以3000rpm离心5分钟，而得到细胞浓缩液。在获得的浓缩液中加入足量盐水(pH4)，得到每毫升含有3×109个乳酸菌的悬液。
将明胶(AP100型，Nitta Gelatin)悬浮于80毫升水中，50℃温热溶解。自然冷却后，加入0.9克氯化钠并使之溶解，用1N盐酸将溶液调节到pH4，用水稀释到100毫升，得到明胶水溶液。然后，将1毫升乳酸菌悬液(在盐水中，pH4)与1毫升上述明胶水溶液混合，得到含乳酸菌的组合物。
如下评估了本发明的效果。将THP-1单核白血病细胞以最终浓度6×106个细胞/ml悬浮在盐水(pH4)中，将该悬液以每孔50微升分散到96孔微量滴定板的各孔中。
将各用盐水(pH4)稀释两倍的含乳酸菌组合物的悬液或乳酸菌悬液以每孔50微升加到事先分布在微量滴定板上的孔中的THP-1单核白血病细胞中，并将该板在37℃培育90分钟。将含15％蔗糖的PBS以200微升/孔分别分散到96孔微量滴定板的各孔中，再加入20微升所述含乳酸菌组合物的悬液或乳酸菌悬液和已培育90分钟的THP-1单核白血病细胞的反应混合物，并将该板以500rpm离心5分钟，得到细胞浓缩液。用200微升PBS洗涤该浓缩液，并重新在500rpm离心5分钟而获得细胞片状沉淀。革兰氏染色乳酸菌，在光学显微镜下对粘着在细胞上的乳酸菌进行计数。结果发现本发明中该含乳酸菌的组合物高度粘着于THP-1单核白血病细胞(表38)。
表38对单核白血病细胞系THP-1的粘着(n=4)
乳酸菌 聚合物浓度(mg/ml)   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
加氏乳杆菌(JCM1131)  0  1±1
 0.32  5±1**
约氏乳杆菌(CNCM I-1225)  0  2±2
 1.3  12±9**
鼠李糖乳杆菌(TakanashiMilk Product)  0  0.2±0.1
 0.32  10±3**
植物乳杆菌(JCM1149)  0  1±0.3
 0.08  2±1*
屎肠球菌(JCM5804)  0  1±2
 5.0  16±9*
婴儿双岐杆菌(JCM1222)  0  1±1
 5.0  11±13*
student’s t-试验*：显著差异，p＜0.05
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
实施例27
为了研究本发明中该含乳酸菌组合物的有效药理学效用，所以要着重注意作为药理学活性物质之一的乳酸菌，用下列方法测定了粘着在细胞上的乳酸菌产生的乳酸量。因此，用实施例1中所述程序分别使在实施例1、12、14、15、17和19中获得的含有乳酸菌(唾液乳杆菌WB 1004或屎肠球菌JCM 5804)的组合物粘着在MKN45胃癌细胞上。用PBS洗涤各系统3次后，加入0.1毫升Hanks平衡盐溶液(Gibco,在下文称为HBSS)，然后37℃培育3小时。用甲醇硫酸甲基化上清液中产生的乳酸，用氯仿抽提，并用气象色谱分析。结果发现粘着在细胞上的含乳酸菌的组合物产生了大量乳酸(表39)。
表39粘着在胃癌细胞系MKN45上的乳酸菌的乳酸生产
    乳酸菌 聚合物 浓度(mg/ml) 乳酸的产量(mM)
唾液乳杆菌WB1004 脱乙酰壳多糖10     0     0.13
    0.64     2.74
 Eudragit RL     0     0.13
    0.04     1.15
 Eudragit E100     0     0.13
    0.3     0.87
明胶AP100     0     0.15
    1.25     0.88
胆甾胺树脂     0     0.15
    0.6     1.79
硫酸鱼精蛋白     0     0.15
    0.3     1.05
屎肠球菌(JCM5804) 明胶AP100     0     0
    0.3     0.27
实施例28
为了研究本发明中该含乳酸菌组合物的有效药理学效用，所以要着重注意作为药理学活性物质之一的乳酸菌，用下列方法测定了粘着在细胞上的乳酸菌产生的乳酸量。因此，用实施例1中所述程序分别使在实施例1、15、17和19中制备的含有乳酸菌(唾液乳杆菌WB 1004)的组合物通过实施例1中所述的相同程序粘着在Caco2结肠癌细胞上。用PBS洗涤各系统3次后，加入0.1毫升HBSS，然后该混合液37℃培育3小时。用甲醇硫酸甲基化上清液中的乳酸，用氯仿抽提，并用气象色谱分析。结果发现粘着在细胞上的该含乳酸菌的组合物产生了大量乳酸(表40)。
表40粘着在结肠癌细胞系Caco2上的乳酸菌的乳酸生产
聚合物 浓度(mg/ml) 乳酸的产量(mM)
脱乙酰壳多糖10     0     0.13
    0.3     0.83
 Eudragit RL     0     0.13
    0.02     0.54
 Eudragit E100     0     0.13
    0.08     0.62
明胶AP100     0     0.14
    0.6     0.33
实施例29
将水溶性脱乙酰壳多糖衍生物(CHGA,Tokyo Kasei)溶于水。用0.5N氢氧化钠将该溶液调节到pH5，用水稀释到100毫升，得到水溶性脱乙酰壳多糖衍生物的水溶液。然后，将10毫升该水溶性脱乙酰壳多糖衍生物的水溶液与10毫升用实施例1中所述的相同方法制备的唾液乳杆菌WB1004悬液混合，得到含乳酸菌的组合物。用实施例1中的相同程序评估了本发明的效果。结果发现本发明中该含乳酸菌的组合物高度粘着于MKN45胃癌细胞(表41)。
表41对胃癌细胞系MKN45的粘着(n=4)
    乳酸菌 聚合物浓度(mg/ml)   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
唾液乳杆菌WB1004(FREM P-15360)  0  55±10
 2.5  1038±172**
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
实施例30
分别将脱乙酰壳多糖寡聚物(脱乙酰壳多糖四聚物，脱乙酰壳多糖五聚物和脱乙酰壳多糖六聚物；Seikagaku Kogyo)溶于水。将各溶液用1N氢氧化钠调节到pH7，并用水稀释到1毫升，得到脱乙酰壳多糖寡聚物的水溶液。然后将0.5ml该脱乙酰壳多糖寡聚物的水溶液与0.5ml用实施例1中的相同程序制备的唾液乳杆菌WB1004悬液(pH7,2×109个细胞/ml)混合，而得到含乳酸菌的组合物。用实施例1中的相同程序(培育时间：30分钟)评估了本发明的效果。结果发现该含乳酸菌的组合物高度粘着于MKN45胃癌细胞(表42)。
表42对胃癌细胞系MKN45的粘着(n=4)
    样品 聚合物浓度(mg/ml)   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
脱乙酰壳多糖四聚物  0  190±27
 12.5  324±101*
脱乙酰壳多糖五聚物  0  190±27
 25  444±51**
脱乙酰壳多糖六聚物  0  190±27
 25  1058±161**
student’s t-试验*：显著差异，p＜0.05
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
实施例31
用实施例1或实施例5中所述的程序制备了乳酸菌(3×109细胞/ml)的悬液。
将脱乙酰壳多糖(脱乙酰壳多糖10，脱乙酰≥80％,0.5％粘度：5到20cps WakoPure Chemical Ind.)悬浮在50毫升水中，用1N盐酸滴加使之溶解。用0.1N氢氧化钠将溶液调节到pH5，用水稀释到100毫升，得到脱乙酰壳多糖水溶液。然后，将乳酸菌悬液3000rpm离心10分钟获得的乳酸菌细胞浓缩液(1.5×109细胞)与1毫升脱乙酰壳多糖水溶液混合，而得到含乳酸菌的组合物。
如下评估本发明的效果。将HeLa子宫癌细胞以最终浓度为每毫升5×104细胞悬浮在10％血清-Eagles MEM中，并以100微升/孔分散到96孔微量滴定板的孔中。37℃培养3日后，用PBS洗涤粘着在微量滴定板上的子宫癌HeLa细胞3次，来制备单层HeLa细胞。然后，将用PBS(pH5)稀释两倍的0.1ml该含乳酸菌的组合物悬液或乳酸菌悬液加到单层HeLa细胞中，37℃培育10分钟后，用PBS洗涤细胞。革兰氏染色乳酸菌，并在光学显微镜下对粘着在细胞上的乳酸菌计数。结果发现本发明中该含乳酸菌的组合物高度粘着于子宫癌HeLa细胞(表43)。
实施例43对子宫癌细胞系HeLa的粘着(n=4)
乳酸菌 聚合物浓度(mg/ml)   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
唾液乳杆菌WB1004(FREM P-15360)  0  17±6
 0.5  601±168**
唾液乳杆菌唾液亚种(CIP103140)  0  17±3
 0.5  554±50**
唾液乳杆菌水杨苷亚种(JCM1150)  0  9±2
 0.25  1790±335*
嗜酸乳杆菌(CIP76.13)  0  23±8
 0.5  395±79**
短乳杆菌WB1005(FREM P-15361)  0  32±5
 0.25  355±74**
干酪乳杆菌(CIP103137)  0  3±2
 2.5  330±108**
瑞士乳杆菌(JCM1120)  0  47±16
 0.3  632±171**
植物乳杆菌(JCM1149)  0  11±3
 0.6  657±211**
类干酪乳杆菌类干酪亚种(CIP103918)  0  4±2
 0.6  1824±361**
鼠李糖乳杆菌(JCM1136)  0  6±3
 0.6  756±50**
发酵乳杆菌(JCM1173)  0  1±1
 0.3  1486±414**
德氏乳杆菌乳亚种(JCM1248)  0  3±2
 0.15  1301±364**
德氏乳杆菌保加利亚亚种(JCM1002)  0  2±1
 1.25  447±36**
德氏乳杆菌保加利亚亚种(Meiji Milk Products)  0  6±4
 0.6  295±40**
约氏乳杆菌(CNCM I-1225)  0  3±1
 0.6  590±102**
加氏乳杆菌(JCM1131)  0  14±5
 0.15  1567±415**
嗜酸乳杆菌WB2001  0  18±10
 0.15  1308±343**
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
实施例32
将1毫升用实施例17所述的程序制备的异丁烯酸氨烷酯共聚物RS与1毫升用实施例31的程序获得的乳酸菌悬液(3×109个细胞/ml)混合，制备得到含乳酸菌的组合物。用实施例31中的相同方式评估了本发明的效果。结果发现本发明含乳酸菌的组合物高度粘着于子宫癌HeLa细胞(表44)。
实施例44对子宫癌细胞系HeLa的粘着(n=4)
 乳酸菌 聚合物浓度(mg/ml)   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
唾液乳杆菌WB1004(FREM P-15360)  0  7±2
 0.16  1736±427**
唾液乳杆菌唾液亚种(CIP103140)  0  17±3
 0.5  563±90**
唾液乳杆菌水杨苷亚种(JCM1150)  0  9±2
 0.125  352±79**
嗜酸乳杆菌(CIP76.13)  0  23±8
 0.5  177±25**
短乳杆菌WB1005(FREM P-15361)  0  32±5
 0.125  323±59**
干酪乳杆菌(CIP103137)  0  3±2
 2.5  38±9**
瑞士乳杆菌(JCM1120)  0  47±16
 0.28  150±21**
植物乳杆菌(JCM1149)  0  11±3
 0.28  654±195**
类干酪乳杆菌类干酪亚种(CIP103918)  0  4±2
 0.09  503±127**
鼠李糖乳杆菌(JCM1136)  0  6±3
 0.8  331±79**
发酵乳杆菌(JM1173)  0  1±1
 0.8  253±27**
德氏乳杆菌乳亚种(JCM1248)  0  3±2
 2.5  438±64**
德氏乳杆菌保加利亚亚种(JCM1002)  0  2±1
 0.28  324±94**
德氏乳杆菌保加利亚亚种(Meiji Milk Products)  0  6±4
 0.03  70±23**
约氏乳杆菌(CNCM I-1225)  0  3±1
 0.28  171±16**
加氏乳杆菌(JCM1131)  0  19±8
 0.28  653±158**
嗜酸乳杆菌WB2001  0  7±1
 0.28  312±51**
鼠李糖乳杆菌(Takanashi MilkProducts)  0  4±1
 0.28  66±11**
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
实施例33
同实施例1或实施例5液体培养生长乳酸菌，然后以最终浓度3×109细胞/ml悬浮在PBS中。
在3000rpm离心10分钟上述乳酸菌悬液获得的细胞浓缩液(1.5×109个细胞)中加入1毫升用实施例19中的相同方式制备的异丁烯酸氨烷酯共聚物E水溶液，得到含乳酸菌的组合物。用实施例31中的相同程序评估了本发明的效果。结果发现本发明含乳酸菌的组合物高度粘着于子宫癌HeLa细胞(表45)。
实施例45对子宫癌细胞系HeLa的粘着(n=4)
 乳酸菌 聚合物浓度(mg/ml)   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
唾液乳杆菌WB1004(FREM P-15360)  0  71±18
 20  1566±284**
嗜酸乳杆菌(CIP76.13)  0  3±3
 3.2  10±3*
约氏乳杆菌(CNCM I-1225)  0  3±2
 8  19±4**
加氏乳杆菌(JCM1131)  0  16±9
 3.2  492±117**
嗜酸乳杆菌WB2001  0  12±2
 3.2  76±12*
鼠李糖乳杆菌(TakanashiMilk Products)  0  9±4
 8  25±12*
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
student’s t-试验*：显著差异，p＜0.05
实施例34
同实施例1液体培养生长乳酸菌，然后以最终浓度3×109细胞/ml悬浮在PBS中。
3000rpm离心10分钟上述乳酸菌悬液获得的细胞浓缩液(1.5×109个细胞)中加入1毫升用实施例15中的相同方式制备的明胶水溶液，得到含乳酸菌的组合物。用实施例31中的相同程序评估了本发明的效果。结果发现本发明含乳酸菌的组合物高度粘着于子宫癌HeLa细胞(表46)。
实施例46对子宫癌细胞系HeLa的粘着(n=4)
 乳酸菌 聚合物浓度(mg/ml)   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
唾液乳杆菌WB1004(FREM P-15360)  0  3±2
 16  169±42**
唾液乳杆菌唾液亚种(CIP103140)  0  11±6
 6.4  259±84**
唾液乳杆菌水杨苷亚种(JCM1150)  0  8±5
 6.4  314±105**
嗜酸乳杆菌(CIP76.13)  0  3±1
 1.0  20±5**
干酪乳杆菌(CIP103137)  0  4±2
 16  11±4*
瑞士乳杆菌(JCM1120)  0  47±7
 1.0  75±14*
植物乳杆菌(JCM1149)  0  13±8
 16  117±40**
类干酪乳杆菌类干酪亚种(CIP103918)  0  6±2
 1.0  33±9**
鼠李糖乳杆菌(JCM1136)  0  10±4
 16  150±15**
德氏乳杆菌乳亚种(JCM1248)  0  28±7
 6.4  428±101**
德氏乳杆菌保加利亚亚种(JCM1002)  0  1±1
 40  29±9**
约氏乳杆菌(CNCM I-1225)  0  3±2
 16  26±8**
加氏乳杆菌(JCM131)  0  92±9
 1.0  236±33**
嗜酸乳杆菌WB2001  0  12±2
 2.5  44±13*
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
student’s t-试验*：显著差异，p＜0.05
实施例35
如实施例1或实施例5液体培养生长乳酸菌，然后以最终浓度3×109细胞/ml悬浮在PBS中。
将明胶(LCP型，Nitta Gelatin)溶于80毫升水中，然后加入并溶解0.9克氯化钠。用1N盐酸将该溶液调节到pH3，并用水稀释到100毫升，得到明胶水溶液。将1毫升明胶水溶液加到通过3000rpm离心10分钟乳酸菌悬液获得的细胞浓缩液(1.5×109个细胞/ml)中，制得含乳酸菌的组合物。用实施例31中的相同程序评估了本发明的效果。结果发现本发明含乳酸菌的组合物高度粘着于子宫癌HeLa细胞(表47)。
表47含乳酸菌的组合物
乳酸菌 聚合物浓度(mg/ml)   粘着细胞数±标准偏差(细胞/10000μm2)
唾液乳杆菌WB1004(FREM P-15360)  0  20±11
 2.5  72±16**
嗜酸乳杆菌(CIP76.13)  0  8±5
 16  24±9*
加氏乳杆菌(JCM1131)  0  16±9
 6.4  139±25**
鼠李糖乳杆菌(Takanashi Milk Products)  0  9±4
 1  25±12*
student’s t-试验**：显著差异，p＜0.01
student’s t-试验*：显著差异，p＜0.05
实施例36
为了研究本发明中含乳酸菌的组合物的有效药理学作用，要着重注意作为药理学活性物质之一的乳酸菌，用下列程序测定了粘着在细胞上的乳酸菌产生的乳酸量。因此，分别使实施例31到35中的相同方法获得的含有乳酸菌(唾液乳杆菌WB 1004或屎肠球菌JCM 5804)的组合物通过实施例31中所述的相同方法粘着在子宫癌HeLa细胞上。用PBS洗涤各系统3次后，加入0.1毫升HBSS，然后37℃培育混合物3小时。用甲醇硫酸甲基化上清液中产生的乳酸，用氯仿抽提，并用气象色谱分析。结果发现粘着在细胞上的该含乳酸菌的组合物产生了大量乳酸(表48)。
表48粘着在子宫癌细胞系HeLa上的乳酸菌的乳酸生产
乳酸菌 聚合物 浓度(mg/ml)   乳酸的产量(mM)
唾液乳杆菌WB1004 脱乙酰壳多糖10     0     0.21
    0.6     0.70
 Eudragit RL 100     0     0.21
    0.04     0.65
 Eudragit E100     0     0.21
    0.08     0.46
明胶AP100     0     0.13
    1.25     0.80
屎肠球菌(JCM5804) 明胶AP100     0     0
    0.3     0.27
试验实施例1
对含唾液乳杆菌WB1004的组合物对胃癌细胞表面的幽门螺杆菌存在的抑制作用的试验
1)单层人胃癌细胞系MKN45的制备
将人胃癌MNK45细胞以每毫升5×104个细胞的最终浓度悬浮在10％FCS-PRMI 1640培养液中，再将悬液以每孔0.1ml分布到96孔微量滴定板的孔内。37℃培养3日后，用PBS洗涤粘着在微量滴定板上的细胞3次，制得单层。
2)唾液乳杆菌WB 1004的培养以及细胞悬液和含乳酸菌的组合物的制备
将唾液乳杆菌WB 1004接种在MRS Broth中，37℃液体培养16小时。培养完成后，3000rpm离心培养液5分钟，得到细胞浓缩液。在获得的细胞浓缩液中加入PBS，制得含有3×109/ml唾液乳杆菌WB 1004的细胞悬液。取出一部分该细胞悬液，与等份的由脱乙酰壳多糖10(0.25％水溶液)、EudragitRL(0.008％水悬液)和Eudragit E100(0.008％水悬液)组成的溶液混合，得到含有乳酸菌的组合物。
3)幽门螺杆菌的培养和细胞悬液的制备
幽门螺杆菌ATCC 43504在含有5％马去纤维蛋白血的脑心浸液(BHI)琼脂培养液(Difco)中37℃微量氧培养4天。培养完成后，用白金环收集适量的细胞，用HBSS洗涤，以浊度(540nm)为5(大约5×108个细胞/ml)的浓度悬浮在HBSS中。
4)对细胞表面上幽门螺杆菌存在的抑制作用的试验
在单层MKN45细胞中加入100微升唾液乳杆菌WB 1004的悬液或含乳酸菌的组合物的悬液(两者都是1.6×109个细胞/ml)，使在37℃粘着1小时。用PBS作为对照。用PBS洗涤细胞3次后，加入50微升幽门螺杆菌悬液，该混合物在37℃培育2到4小时。用PBS洗涤单层MKN45细胞3次，用下列程序测定细胞表面上存活的幽门螺杆菌数。
因此，加50微升0.5％的胰岛素(Gibco)，在37℃作用于单层细胞2分钟，使细胞从微量滴定板上分离。然后，加入100微升5％的FCS-BHI培养液(Difco)，从而灭活胰岛素。适当的用稀释剂稀释后，将悬液涂在含5％马去纤维血的BHI琼脂平板上，测定每孔每单层细胞存在的细胞数。为了抑制唾液乳杆菌WB 1004的生长，在培养基中加入每毫升5微克的甲氧苄氨嘧啶和每毫升10微克的万古霉素，37℃微量氧培养3日。
结果发现含乳酸菌的组合物悬液显著抑制了幽门螺杆菌在胃癌细胞表面的存在。另一方面，唾液乳杆菌WB1004的悬液几乎不导致抑制(表49)。
表49含乳酸菌的组合物对在胃癌细胞表面上幽门螺杆菌存在的抑制
    样品(聚合物) 幽门螺杆菌在胃癌细胞表面上的比率(％)
含乳酸菌的组合物(脱乙酰壳多糖)     ＜1
含乳酸菌的组合物(Eudragit RL)     4
含乳酸菌的组合物(Eudragit E100)     15
    乳酸菌     80
    对照     100
试验实施例2
对含唾液乳杆菌WB1004的组合物对结肠癌细胞表面的大肠杆菌存在的抑制作用的试验
1)单层人结肠癌Caco2细胞的制备
将人胃癌MNK45细胞以每毫升5×104个细胞的最终浓度悬浮在20％FCS-Eagle’s MEM Broth中，并将悬液以每孔0.1ml分布到96孔微量滴定板的孔内。37℃培养3日后，用PBS洗涤粘着在微量滴定板上的细胞3次，制得单层。
2)唾液乳杆菌WB 1004的培养以及细胞悬液和含乳酸菌的组合物的制备
将唾液乳杆菌WB 1004接种在MRS Broth中，37℃液体培养16小时。培养完成后，3000rpm离心培养液5分钟，得到细胞浓缩液。在获得的细胞浓缩液中加入PBS，制得含有3×109/ml唾液乳杆菌WB 1004的细胞悬液。取出一部分该细胞悬液，与等份的0.25％脱乙酰壳多糖10溶液混合，而得到含有乳酸菌的组合物。
3)大肠杆菌的培养和细胞悬液的制备
在BHI培养液中30℃需氧培养大肠杆菌ATCC 25922 6小时。培养完成后，3000rpm离心培养液5分钟，得到细胞浓缩液。在获得的细胞浓缩液中加入MRSBroth制得每毫升含有大约6×105个细胞的大肠杆菌ATCC 25922悬液。
4)对细胞表面上细菌存在的抑制作用的分析
在单层Caco2细胞中加入100微升唾液乳杆菌WB 1004悬液或含乳酸菌的组合物的悬液(两者都是1.6×109个细胞/ml)，使在37℃粘着1小时。用PBS作为对照。用PBS洗涤细胞3次后，加入100微升大肠杆菌悬液，该混合物在37℃培育2到4小时。用PBS洗涤Caco2单层3次，用下列程序测定大肠杆菌的存活数。因此，加50微升0.5％的胰岛素(Gibco)在37℃作用于单层细胞2小时，使细胞从微量滴定板上分离。然后，加入100微升BHI培养液来灭活胰岛素。适当的用稀释剂稀释后，将悬液涂在DHI琼脂平板(NissuiPharmaceutical)上，测定每孔单层细胞上存在的细胞数。
结果发现含乳酸菌的组合物悬液显著抑制了大肠杆菌在结肠癌细胞表面的存在(表50)。
表50含乳酸菌的组合物对结肠癌细胞表面上大肠杆菌存在的抑制
    样品(聚合物) 大肠杆菌在结肠癌细胞表面上的比率(％)
含乳酸菌的组合物(脱乙酰壳多糖)     12
    乳酸菌     65
    对照     100
配方实施例1
如实施例1制备100毫升含唾液乳杆菌WB 1004的组合物，然后向其内加入50克蔗糖、1克抗坏血酸和甜味剂来制造糖浆。
配方实施例2
如实施例1制备100毫升含唾液乳杆菌WB 1004的组合物，向其内加入50克蔗糖、1克抗坏血酸和10克明胶和甜味剂，然后冷冻，来制造冻胶。
配方实施例3
如实施例1制备含唾液乳杆菌WB 1004的组合物(100毫升)，再冻干，将得到的粉末与100克商业酸奶(MEIJI Bulgaria Yogurt,MEIJI MilkProducts)混合，来制造含唾液乳杆菌WB 1004的组合物-酸奶食品。
配方实施例4
如实施例1制备含唾液乳杆菌WB 1004的组合物(100毫升)，再冻干，将得到的粉末填充入铝包中，以制造一种伴商业酸奶(MEIJI Bulgaria Yogurt,MEIJI Milk Products)的唾液乳杆菌WB 1004组合物，饮食前临时混合。
配方实施例5
如实施例1制备含唾液乳杆菌WB 1004的组合物(100毫升)，再冻干，并在得到的粉末中加入100克乳糖、10克玉米淀粉、10克羟丙基纤维素和5克氢化油后，用压片机挤压混合物从而得到每片重240毫克的片剂。
配方实施例6
如实施例1制备含唾液乳杆菌WB 1004的组合物(100毫升)，再冻干，并在得到的粉末中加入100克乳糖、10克玉米淀粉、10克羟丙基纤维素后，用流化床粒化机使混合物粒化并干燥，然后用30-网筛选择大小，得到细粒。
配方实施例7
如实施例1制备含唾液乳杆菌WB 1004的组合物(100毫升)，再冻干，并将得到的粉末与5克液态石蜡混合。分别将75克白色矿脂预先融化，以小部分加到上述混合物中。通过外部冷却的容器，使整个混合物在搅拌下固化，以得到油膏型的栓剂。
配方实施例8
如实施例1制备含唾液乳杆菌WB 1004的组合物(100毫升)，再冻干，并将得到的粉末与9克聚乙二醇1500和2克聚乙二醇4000捏和。在逐步冷却后，将捏和物分成10份，用栓剂模成型，而得到栓剂。
配方实施例9
如实施例1制备含唾液乳杆菌WB 1004的组合物(100毫升)，再冻干，并在得到的粉末中加入100克乳糖、10克玉米淀粉和5克硬脂酸镁后，用压片机挤压混合物来得到片剂型栓剂。
工业应用性
由上构成的本发明能增强乳酸菌在消化道和/或泌尿生殖器官中显示的药理作用，并拮抗乳酸菌从消化道和/或泌尿生殖器官清除的药理活性。因此本发明的贡献是极其有效的除去幽门螺杆菌、除去肠出血性大肠杆菌和治疗食物过敏，并能提供用于治疗和/或预防泌尿生殖器官感染的药物学产品和食物。

Claims (19)

1．一种含乳酸菌的组合物，其特征在于，该组合物含有在消化道和/或泌尿生殖器官中显示药物作用的乳酸菌，
增强了所述乳酸菌对消化道和/或泌尿生殖器官的粘着性，从而加强了所述药物作用。
2．如权利要求1所述的含乳酸菌的组合物，其特征在于，一种大分子物质的配方导致增强所述乳酸菌对消化道和/或泌尿生殖器官的粘着。
3．如权利要求2所述的含乳酸菌的组合物，其特征在于，所述大分子物质是碱性聚合物。
4．如权利要求3所述的含乳酸菌的组合物，其特征在于，所述碱性聚合物是脱乙酰壳多糖。
5．如权利要求3所述的含乳酸菌的组合物，其特征在于，所述碱性聚合物是聚赖氨酸。
6．如权利要求3所述的含乳酸菌的组合物，其特征在于，所述碱性聚合物是胆甾胺树脂。
7．如权利要求3所述的含乳酸菌的组合物，其特征在于，所述碱性聚合物是鱼精蛋白。
8．如权利要求3所述的含乳酸菌的组合物，其特征在于，所述碱性聚合物是明胶。
9．如权利要求3所述的含乳酸菌的组合物，其特征在于，所述碱性聚合物是异丁烯酸氨烷酯共聚物E。
10．如权利要求3所述的含乳酸菌的组合物，其特征在于，所述碱性聚合物是异丁烯酸氨烷酯共聚物RS。
11．如权利要求3所述的含乳酸菌的组合物，其特征在于，所述碱性聚合物是乳铁蛋白。
12．如权利要求3所述的含乳酸菌的组合物，其特征在于，所述碱性聚合物是溶菌酶。
13．如权利要求1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12所述的含乳酸菌的组合物，其特征在于，所述药理学作用是除去幽门螺杆菌。
14．如权利要求1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12所述的含乳酸菌的组合物，其特征在于，所述药理学作用是除去肠出血性大肠杆菌。
15．如权利要求1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12所述的含乳酸菌的组合物，其特征在于，所述药理学作用是对食物过敏的治疗活性。
16．如权利要求1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12所述的含乳酸菌的组合物，其特征在于，所述药理学作用是对泌尿生殖器官感染的治疗和/或预防活性。
17．如权利要求16所述的含乳酸菌的组合物，其特征在于，所述泌尿生殖器官是阴道。
18．一种药物学产品，其特征在于，该药物学产品包含如权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17所述的含乳酸菌的组合物。
19．一种食品，其特征在于，该食品包含如权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15所述的含乳酸菌的组合物。
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