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CN1849388A - 能够刺激粘膜免疫性的乳酸菌 - Google Patents

能够刺激粘膜免疫性的乳酸菌 Download PDF

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CN1849388A
CN1849388A CNA2004800239996A CN200480023999A CN1849388A CN 1849388 A CN1849388 A CN 1849388A CN A2004800239996 A CNA2004800239996 A CN A2004800239996A CN 200480023999 A CN200480023999 A CN 200480023999A CN 1849388 A CN1849388 A CN 1849388A
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lactobacillus
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nric
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Abstract

本发明提供了选自乳杆菌(lactobacillus)ONRICb0239(FERMBP－10064)和乳杆菌(lactobacillus)ONRIC b0240(FERM BP－10065)的乳酸菌，以及含有该菌的组合物，该组合物能够刺激粘膜免疫，更具体来说，组合物是食品或饮料或药物产品的形式。乳酸菌和含有该菌的组合物能够提供良好的粘膜免疫刺激效应，可用于加强宿主防御系统。

Description

能够刺激粘膜免疫性的乳酸菌
技术领域
本发明涉及乳酸菌和含有这些细菌、更具体来说是能够刺激粘膜免疫性的乳酸菌的组合物，以及含有这些细菌的食品和饮料。
技术背景
在植物性食品例如泡菜、辣泡菜(朝鲜泡菜)、面包、清酒(日本酒)、日本豆酱和酱油中检测到了多种乳酸菌。东京农业大学的Sanae Okada教授将在植物性食品中检测到的乳酸菌命名为“植物性乳酸菌”，并建议将它们与来自动物性食物例如发酵奶和乳酪中的乳酸菌区分开来(Japanese Journal of Lactic Acid Bacteria，Vol.13，No.1，pp.23-36(2002))。这是因为植物性乳酸菌在生长环境上与动物性乳酸菌不同，能够利用更多种的糖类，并使它们自己适应在抗细菌物质抗性、酶抗性、氧抗性等方面更严酷的环境。
本发明人研究了这些植物性乳酸菌，已经报道了使用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ONC141作为起始菌种制备的发酵奶具有下列性能：改善人胃肠道微生物群落(Megumi Kumemura，Masamichi Toba，Yoshiro Sogawa，Seiichi Shimizu，Shinzo Kawaguchi，“肠细菌学杂志(Enterobacteriology Magazine)”15，15，(2001))；增加便秘成年人的排便频率(Masamichi Toba，Megumi Kumemura，Satoshi Muneyuki，YoshiroSogawa，Hisao Yoshizawa，Yoichi Yajima，Yutaka Matsuda，HajimeIijima“肠细菌学杂志(Enterobacteriology Magazine)”15，21，(2001))；以及增加了宿主对病原性鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)引起的口腔感染的抗性(IgA产量增加，胃肠道粘膜刺激)(Takeshi Ikenaga，Satoko Yamahira，Hideki Nachi，Masamichi Toba，Hiroshi Okamatsu，“乳制品科学(Milk Science)”，Vol.51，No.1，pp.27-32(2002))。
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ONC141(发酵奶)在已知的植物性和动物性乳酸菌中具有最高的增强宿主对沙门氏菌感染抗性的效应，因此被认为能够增强粘膜免疫功能，对人类宿主防御非常有用。
发明内容
本发明的一个目的是提供新的乳酸菌，它们与本发明人已经研究和开发的那些乳酸菌相比，具有更高的粘膜免疫刺激能力和增强宿主防御机制的能力，并可以用做微生态调节剂，此外还提供了含有这些乳酸菌的终端产品(食品和饮料，例如发酵奶和乳酸菌饮料)。
本发明人新近获得了许多不同的微生物，并使用小鼠派伊尔淋巴结(Peyer’s Patch)细胞培养系统试验了它们诱导IgA产生的能力。结果，本发明人发现了两株乳酸菌，具有特别优良的诱导IgA产生的能力。
本发明人在这个发现的基础上进行了进一步的研究，并完成了本发明。
本发明提供了下列1到15条中概括的发明。
第一条、选自乳杆菌(Lactobacillus)ONRIC b0239(FERM BP-10064)和乳杆菌(Lactobacillus)ONRIC b0240(FERM BP-10065)的乳酸菌菌株。
第二条、第一条中的乳酸菌菌株，该菌株是乳杆菌(Lactobacillus)ONRIC b0239(FERM BP-10064)。
第三条、第一条中的乳酸菌菌株，该菌株是乳杆菌(Lactobacillus)ONRIC b0240(FERM BP-10065)。
第四条、含有第一条的乳酸菌菌株和食用载体或可药用的赋形剂或稀释剂的组合物，该组合物能够刺激粘膜免疫。
第五条、第四条中的组合物，该组合物是食品或饮料的形式。
第六条、第五条中的组合物，该组合物是发酵奶、乳酸菌饮料、发酵植物性饮料、发酵水果饮料、或发酵豆奶饮料。
第七条、在需要刺激粘膜免疫的人类对象中刺激粘膜免疫的方法，包括给该人类对象给药第一到第三条之一的乳酸菌。
第八条、在需要刺激粘膜免疫的人类对象中刺激粘膜免疫的方法，包括给该人类对象给药第四到第六条之一的组合物。
第九条、在需要促进IgA产生治疗的人类对象中促进IgA产生的方法，包括给该人类对象给药第一到第三条之一的乳酸菌。
第十条、在需要促进IgA产生治疗的人类对象中促进IgA产生的方法，包括给该人类对象给药第四到第六条之一的组合物。
第十一条、第一到第三条之一的乳酸菌在人类粘膜免疫刺激中的应用。
第十二条、第四到第六条之一的组合物在人类粘膜免疫刺激中的应用。
第十三条、第一到第三条之一的乳酸菌在促进人类IgA产生中的应用。
第十四条、第四到第六条之一的组合物在促进人类IgA产生中的应用。
第十五条、第一到第三条之一的乳酸菌在制备第四到第六条之一的组合物中的应用。
本发明的乳酸菌菌株和含有细菌的本发明的组合物将在下面描述。
本发明的乳酸菌菌株
本发明的乳酸菌菌株是新近从天然产品中通过下面描述的分离和筛选方法分离和获得的，并已经由本发明人保藏。这些菌株被命名为乳杆菌(Lactobacillus)ONRIC b0239(FERM BP-10064)和乳杆菌(Lactobacillus)ONRIC b0240(FERM BP-10065)。
(1)筛选
(1-1)源微生物
所用的源微生物是从人类肠道内含物、植物性食品和动物性食品中分离并在Otsuka制药有限公司的Otsu Nutraceuticals研究所中保存的乳酸菌。
(1-2)筛选方法
靶菌株的筛选是使用小鼠派伊尔淋巴结细胞培养系统利用诱导IgA产生能力作为指标来进行的。详细的筛选方法在下面的实施例2中进行描述。
(2)通过筛选获得的微生物
(2-1)乳杆菌(Lactobacillus)ONRIC b0239
(a)宏观特征
(a-1)MRS琼脂培养基
圆形到轻微不规则形，半球状，光滑，乳白
(a-2)BL琼脂培养基
圆形到轻微不规则形，半球状，光滑，棕白
(b)微观特征
杆菌，无运动性，无孢子
(c)最适生长温度
30到33℃
(d)生理和生化特征
革兰氏染色能力：阳性
糖类利用
甘油                       -
赤藓糖醇                   -
D-阿拉伯糖                 -
L-阿拉伯糖                 -
核糖                       ±
D-木糖                     ±
L-木糖                     -
核糖醇                     -
β-甲基-D-木糖苷              -
半乳糖                        +
D-葡萄糖                      +
D-果糖                        +
D-甘露糖                      +
L-山梨糖                      -
鼠李糖                        -
半乳糖醇                      -
环己六醇                      -
甘露糖醇                      -
山梨糖醇                      +
α-甲基-D-甘露糖苷            +
α-甲基-D-葡萄糖苷            ±
N-乙基-葡萄糖胺               +
扁桃苷                        +
对苯二酚葡萄糖苷              +
七叶苷                        +
水杨苷                        +
纤维二糖                      +
麦芽糖                        +
乳糖                          +
蜜二糖                        +
蔗糖                          +
海藻糖                        +
菊糖                          -
松三糖                        -
D-棉子糖                      +
Amidon                        -
糖原                          -
木糖醇                        -
龙胆二糖                    +
D-松二糖                    -
D-来苏糖                    -
D-塔格糖                    -
D-岩藻糖                    -
L-岩藻糖                    -
D-阿拉伯糖醇                ±
L-阿拉伯糖醇                -
葡萄糖酸                    -
2-酮-葡萄糖酸               -
5-酮-葡萄糖酸               -
按照Bergey’s系统细菌学手册中显示的判断标准，根据上面的各种特征，将获得的分离株鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株，并命名为乳杆菌(Lactobacillus)ONRIC b0239，于2003年8月6日保藏在独立的管理机构，国立高等工业科学技术研究院国际专利生物保藏中心，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome Tsukuba-shi，Ibaraki-keb，日本，登记号为FERM P-19469。然后它根据布达佩斯公约被转移到一个国际保藏中心，收到的登记号为FERM BP-10064。
(2-2)乳杆菌(Lactobacillus)ONRIC b0240
(a)宏观特征
(a-1)MRS琼脂培养基
圆形到轻微不规则形，半球状，光滑，乳白
(a-2)BL琼脂培养基
圆形到轻微不规则形，半球状，光滑，棕白
(b)微观特征
杆菌，无运动性，无孢子
(c)最适生长温度
30到33℃
(d)生理和生化特征
革兰氏染色能力：阳性
糖类利用
甘油                            -
赤藓糖醇                        -
D-阿拉伯糖                      -
L-阿拉伯糖                      -
核糖                            ±
D-木糖                          -
L-木糖                          -
核糖醇                          -
β-甲基-D-木糖苷                -
半乳糖                          +
D-葡萄糖                        +
D-果糖                          +
D-甘露糖                        +
L-山梨糖                        -
鼠李糖                          -
半乳糖醇                        ±
环己六醇                        -
甘露糖醇                        +
山梨糖醇                        +
α-甲基-D-甘露糖苷              -
α-甲基-D-葡萄糖苷              -
N-乙基-葡萄糖胺                 +
扁桃苷                          +
对苯二酚葡萄糖苷                +
七叶苷                          +
水杨苷                          +
纤维二糖                        +
麦芽糖                     +
乳糖                       +
蜜二糖                     +
蔗糖                       +
海藻糖                     -
菊糖                       -
松三糖                     -
D-棉子糖                   +
Amidon                     -
糖原                       -
木糖醇                     -
龙胆二糖                   +
D-松二糖                   -
D-来苏糖                   -
D-塔格糖                   -
D-岩藻糖                   -
L-岩藻糖                   -
D-阿拉伯糖醇               -
L-阿拉伯糖醇               -
葡萄糖酸                   -
2-酮-葡萄糖酸              -
5-酮-葡萄糖酸              -
按照Bergey’s系统细菌学手册中显示的判断标准，根据上面的各种特征，将获得的分离株鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株，并命名为乳杆菌(Lactobacillus)ONRIC b0240，于2003年8月6日保藏在独立的管理机构，国立高等工业科学技术研究院国际专利生物保藏中心，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome Tsukuba-shi，Ibaraki-keb，日本，登记号为FERM P-19470。然后它根据布达佩斯公约被转移到一个国际保藏中心，收到的登记号为FERM BP-10065。
本发明的组合物
本发明的组合物主要含有本发明的乳酸菌菌株作为活性成分。该组合物可以通过使用适当的可食用的载体(食品材料)制备成食品、饮料或药物产品的形式。该组合物也可以通过使用适当的可药用的赋形剂或稀释剂制备成药物产品的形式。
本发明的组合物获得的显著的粘膜免疫刺激和增强IgA产生被认为是如下导致的：作为肠免疫系统的组成部分的派伊尔淋巴结M细胞在细胞腔中接受了抗原。该抗原由抗原呈递细胞例如树突细胞呈递到CD4 T细胞。当未成熟的B细胞通过T细胞的抗原特异性反应成熟成为IgA抗体产生细胞时，B细胞移动到固有层黏膜最终分化成IgA抗体分泌细胞。尽管尚不清楚本发明的乳酸菌是如何参与IgA产生的增强机制的，至少派伊尔淋巴结M细胞对抗原的摄取对由本发明细菌的存在而引起的IgA产生的增强是必需的。因此，本发明的乳酸菌被推测其功能是作为这样的抗原。为了作为抗原起作用，本发明的乳酸菌不必是活细胞。细菌可以通过常规的热消毒方法进行灭菌。但是，正如众所周知的那样，摄取酵奶等中活的乳酸菌由于肠道内的调节和肠道内的微生物群落平衡效应，对于健康的维护和持久是有效的，摄取活的本发明的乳酸菌也预期具有这些效应，因此在优选情况下活的乳酸菌被包含在本发明的组合物中。
这些乳酸菌(活细胞)可以以例如培养物、这些培养物的粗产物或纯化产物及其冻干粉的形式被包含在本发明的组合物中。
一般来说，培养物可以通过各种方法获得，包括在适合每个菌株的培养基，例如MRS培养基中，在30℃培养大约16小时。
培养后，细胞可以通过例如将培养液在4℃以3000转/分钟的速度离心大约10分钟来回收。它们可以以常规的方式纯化，也可以被冻干。这样获得的冻干粉也可以被用做本发明的组合物的活性成分。
如果需要，组合物中可以补充适当量的适合本发明的微生物维持和生长的营养物质。具体的例子包括用于培养基中培养微生物的营养物质，例如各种碳源如葡萄糖、淀粉、蔗糖、乳糖、糊精、山梨糖醇、果糖等，氮源例如酵母提取物、蛋白胨等，维生素、矿物质、微量金属元素和其它营养物质。这些维生素的例子包括维生素B、维生素D、维生素C、维生素E和维生素K。这些微量金属元素的例子包括锌、硒等。其它的营养物质的例子包括各种寡糖例如乳糖蔗糖、大豆寡糖、乳果糖、乳糖醇、果糖寡糖以及半乳糖寡糖。这些寡糖掺入的量没有特别的限制，但是优选情况下其在本发明的组合物中的浓度为重量比大约1％到3％的范围内。
本发明的组合物的具体的食品和饮料形式包括发酵奶、乳酸菌饮料、发酵蔬菜饮料、发酵水果饮料和发酵豆奶饮料。在本说明书和权利要求中使用的术语“发酵奶”和“乳酸菌饮料”符合前日本卫生福利部的“涉及奶和奶制品的成分等的部颁条令”的条款2-37“发酵奶”和条款2-38“乳酸菌饮料”中的定义。也就是说，“发酵奶”是指通过用乳酸菌或酵母发酵奶或乳制品而制备的糊状或液体制剂。因此，“发酵奶”不仅包括饮料形式的产品而且包括酵奶形式的产品。“乳酸菌饮料”是指利用通过用乳酸菌或酵母发酵奶或乳制品而制备的糊状或液体制剂作为主要原料，用水稀释而制备的饮料。
发酵蔬菜饮料、发酵水果饮料和发酵豆奶饮料在本文的后文中描述。
本发明的组合物的其它的食品形式包括含有细胞的微胶囊包裹的形式、固体食物形式(例如颗粒、粉末(包括发酵奶的冻干粉等)、片剂、泡腾片、口香糖、goumi和布丁)、以及上述发酵奶和乳酸菌饮料之外的乳制品。
药物形式的例子包括用于口服给药的形式，例如溶液、乳剂、颗粒、粉末、胶囊、片剂等。
这些食品或饮料形式及药物形式的加工可以以常规的方式进行。用于这些形式的加工的载体可以是任何可食用的载体、可药用的赋形剂和稀释剂。关于可以在食品和饮料形式中使用的食用载体及加工的详细情况将在下面的“组合物的食品和饮料形式”章节中描述。在制备食品形式中，特别优选的载体是那些具有具有良好口感和增味效果的载体。药品形式的加工以及可使用的药用赋形剂和稀释剂将在下面的“组合物的药品形式”章节中描述。
在本发明的组合物中掺入的乳酸菌的量可以被适当地选择，以便获得大约每100克组合物108到1011细胞的浓度(细胞计数不必需是活细胞计数；当包括了死细胞数量时，应该将其被计算作灭菌前活细菌的数量；在本文后文中也是同样)。活细胞数量用下面的方式确定。将稀释的样品加到琼脂细菌培养基上，在37℃厌氧培养，对形成的克隆进行计数。因为活细胞数量与浊度彼此相关，因此，如果活细胞数量与浊度之间的这种相关性被事先确定，就可以利用测定浊度代替活细胞计数来计算活细胞数量。掺入的乳酸菌的量可以按照将要制备的本发明的组合物的形式以及所用的乳酸菌的种类等来进行适当的调整，使用上面提到的范围作为准则。
因为本发明的组合物被设计为包含有乳酸菌(主要是活细胞)，在将组合物加工成最终产物的过程中不推荐使用例如热和压力这样的条件。因此，例如在将本发明的组合物加工成固体食品形式的过程中，优选以冻干细胞的形式将乳酸菌直接配制，或用适当的包裹试剂处理冻干细胞并使用包裹的细胞。
组合物的食品和饮料形式
本发明的组合物的代表性的优选食品和饮料形式包括发酵奶、乳酸菌饮料、发酵蔬菜饮料、发酵水果饮料、发酵豆奶饮料等。发酵蔬菜饮料、发酵水果饮料、发酵豆奶饮料在后面详细描述。这种形式的加工可以通过以下的步骤进行，包括将乳酸菌在含有乳酸菌的营养物质例如来自蔬菜或水果的汁液、豆奶(大豆乳液)等的适当的发酵原料中培养，从而引起这些原料的发酵。用作发酵材料的蔬菜和水果包括切屑、压碎片、磨屑、压榨汁液、酶处理产物及其稀释液或浓缩液。可用的蔬菜包括例如南瓜、胡萝卜、西红柿、甜椒、芹菜、菠菜、有色甘薯、玉米、beats、甘蓝、香芹、卷心菜和花椰菜。可用的水果包括例如苹果、桃、香蕉、草莓、葡萄、西瓜、柑和橘。
蔬菜和水果的切屑、压碎片和磨屑可以通过例如下面的方法获得，包括清洗至少一种蔬菜和水果，并在需要时将其进行煮白处理，例如放在热水中，然后通过破碎机、搅拌机、食品加工机、粉碎机、MycolloiderTM(Tokushu Kika Kogyo股份有限公司产品)等切碎、粉碎或磨碎。压榨汁液可以通过使用过滤压力汁液搅拌机等来制备。压榨汁液也可以将磨碎物通过滤布过滤来制备。酶处理产物可以通过使用纤维素酶、果胶酶、原果胶酶等作用于切屑、压碎片、磨屑或压榨汁液来制备。稀释液包括1到50倍的水稀释液。浓缩液包括通过例如冷冻浓缩、减压浓缩等方法浓缩1到100倍的汁液。
豆奶是另一种特别的发酵原料的例子，可以以常规的方式从大豆材料制备。这样的豆奶的例子包括通过将有皮的大豆浸泡在水中、用适当的磨例如胶体磨湿磨大豆、以常规的方式将研磨物匀浆、然后将水溶性的大豆蛋白溶解在水中而制备的匀浆液。
为了使用乳酸菌进行发酵，优选事先制备起始物并用起始物接种发酵材料。这样的起始物的代表性例子是通过将本发明的乳酸菌接种到补充了酵母提取物的事先在90到121℃以常规方式灭菌5到20分钟的10％的脱脂奶粉或发酵材料，然后培养本发明的乳酸菌获得的培养物。这样制备的起始物经常在每克培养物中含有大约107到大约109个乳酸菌细胞。
用于起始物的发酵材料也可以补充促进发酵的物质以确保本发明的乳酸菌的良好生长，例如各种碳源例如葡萄糖、淀粉、蔗糖、乳糖、糊精、山梨糖醇、果糖等，氮源例如酵母提取物、蛋白胨等，维生素和矿物质。
乳酸菌接种物一般来说应该等同于每立方厘米发酵液不少于大约1×106活细胞数，优选大约1×107活细胞数。至于培养条件，发酵温度一般在大约20到大约45℃的范围内、优选在大约25到大约37℃的范围内选择，发酵时间在大约5到72小时的范围内选择。
这样获得的乳酸发酵产品可以是凝块的形式(酵奶样或布丁样的形式)，这样的产品可以直接作为固体食品消化。这样凝块形式的乳酸发酵产品可以进一步匀浆以制备所需的饮料形式。匀浆可以使用常规的匀浆器来进行。具体来说，可以使用Gaulin高压匀浆器(LAB 40)在大约200到大约1000kgf/cm2、优选在大约300到大约800kgf/cm2、或Sanwa机器工业股份公司的匀浆器(产品号HAx4571，H20-A2等)在不少于150kg/cm2的压力下进行。通过这样的匀浆，可以获得具有极好的可口性、具体来说有光滑口感的饮料产品。在进行匀浆过程中，如果需要也可能进行适当的稀释、加入有机酸调整pH、和/或加入适当量的各种一般用于饮料制造中的其它添加剂，例如寡糖、果汁、增稠剂、表面活性剂和调味剂。优选的添加剂和它们的量(基于凝块形式的发酵产品的重量百分比)是例如8％葡萄糖(重量百分比，下文同)、8％蔗糖、8％糊精、0.1％柠檬酸、0.2％脂肪酸甘油酯和0.1％调味剂。
这样获得的本发明的饮料可以被无菌地分配到适当的容器中以提供最终产品。该产品具有良好的可口性，使得可以顺滑地吞咽，并具有愉快的香味。
产品的使用量(摄取量)可以按照接受者的年龄、性别、体重和疾病的严重程度等进行适当地选择，没有具体的限制。一般来说，具有活菌数大约每毫升106-109细胞的产品可以以每天大约50-1000毫升的摄取速度给予人体。
本发明的组合物的食品形式的另一个具体的例子是泡腾产品形式的组合物。该产品的制备方法是配制10到35％(重量百分比，下面同)的碳酸钠和/或碳酸氢钠和20到70％中和剂作为泡腾成分，以及0.01到50％本发明的乳酸菌(冻干细胞)。使用的中和剂是能够中和碳酸钠和/或碳酸氢钠产生二氧化碳气体的酸性化合物。这样的化合物的代表性例子是有机酸例如L-酒石酸、柠檬酸、延胡索酸和抗坏血酸。
在本发明的泡腾产品中的泡腾成分的量使得当本发明的产品溶解在水中时，溶液是酸性的，具体来说酸度大约是pH3.5-4.6。更具体来说，含量可以在10-35％的碳酸钠和/或碳酸氢钠以及20-70％中和剂的范围内选择。具体来说，碳酸钠的量可以在11-31％的范围内选择，优选为22-26％；并且/或碳酸氢钠在10-35％的范围内，优选为20-30％。最优选的是单独使用碳酸氢钠，在20-25％的范围内。中和剂的量从20-70％的范围内选择，优选30-40％。具体来说，最优选的是使用范围在20-25％内的L-酒石酸和范围在8-15％内的抗坏血酸。
本发明的泡腾产品含有本发明的乳酸菌和泡腾成分作为主要成分，也可以补充适当量的各种已知添加剂，例如赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、渗透压调节剂、电解质、甜味剂、调味剂、色素、pH调节剂等。这样的添加剂的例子包括淀粉例如小麦淀粉、土豆淀粉、玉米淀粉、糊精等；糖类例如蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、乳糖等；糖醇例如山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇等；糖苷例如连接糖(coupling sugar)、巴拉金糖等；赋形剂例如磷酸钙、硫酸钙等；粘合剂和增稠剂例如淀粉、糖类、明胶、阿拉伯树胶、糊精、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、羟基丙基纤维素、黄原胶、果胶、黄蓍胶、酪蛋白、藻酸等；润滑剂例如亮氨酸、异亮氨酸、L-缬氨酸、糖酯、氢化油、硬脂酸、硬脂酸镁、滑石粉、聚乙二醇等；崩解剂例如结晶纤维素(商标名“Avicel”，Asahi化学工业股份有限公司产品)、羧甲基纤维素(CMC)、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、羧甲基纤维素钙(CMC-Ca)等；表面活性剂例如脂肪酸聚氧乙烯脱水山梨醇酯(聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯)、卵磷脂等；二肽例如阿斯巴甜、阿力甜等；以及甜味剂例如甜菊糖醇(stevia)、糖精等。这些添加剂可以参考每种添加剂与主要成分的关系、制剂的性质、生产制剂的方法等其它因素来进行适当的选择，并使用适当的量。
此外，维生素、具体来说是氰钴胺素和抗坏血酸(维生素C)，可以以适当的量加入到本发明的泡腾产品中。对量没有具体的限制，但是例如维生素C通常最多添加到30％，优选在大约5％到大约25％的范围内。
生产本发明的泡腾产品的方法可以基本上与生产这种泡腾片的常规方法相同。因此，本发明的泡腾片形式的产品的制备可以通过称量预定量的相应成分、将它们混合、然后通过例如直接的粉末压缩方法或湿或干颗粒压缩方法来加工它们。
这样获得的本发明的产品可以简单地通过放置在水中被转变成适合口服的饮料的形式，并口头给药。
对其给药量(摄取量)没有具体的限制，可以根据接受者的年龄、性别、体重、疾病严重程度以及其它变量来适当地决定。一般来说，1-2片每片大约1.5到6.0克重的本发明的泡腾片溶解到100-300毫升水中，产生用于人类接受者的单剂量。
组合物的药物形式
本发明的组合物可以使用适当的可药用的载体以及作为主要成分的本发明的乳酸菌制造成普通的药物产品，并投入实际应用。可用的可药用的载体的例子包括各种稀释剂和赋形剂例如填料、补充剂、粘合剂、增湿剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂等，这些在本技术领域是众所周知的。这些载体可以按照产生的药物制剂的单位剂量形式来选择性地使用。
药物产品的单位剂量形式可以从各种剂量形式中选择。代表性的形式是片剂、丸剂、粉剂、溶液、悬浮液、乳液、颗粒和胶囊。
片剂可以使用作为药物载体的下列物质来制备，例如赋形剂如乳糖、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、碳酸钙、高岭土、结晶纤维素、硅酸、磷酸钾等；粘合剂例如水、乙醇、丙醇、净糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、明胶溶液、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂例如羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、低取代的羟丙基纤维素、干淀粉、藻酸钠、琼脂粉、海带多糖粉、碳酸氢钠、碳酸钙等；表面活性剂例如脂肪酸聚氧乙烯失水山梨醇酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯等；崩解抑组合物例如蔗糖、硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸附促进剂例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；增湿剂例如甘油、淀粉等；吸附剂例如淀粉、乳糖、高岭土、膨润土、硅胶等；以及润滑剂例如纯化的滑石粉、硬脂酸盐、硼酸粉末、聚乙二醇等。
此外，如果需要，片剂可以包被上标准的包被材料，以提供糖包被的片剂、明胶包被的片剂、肠衣包被的片剂、薄膜包被的片剂等，或加工成多层的片剂例如双层片剂。
丸剂可以使用如下的药物载体制备，例如赋形剂如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、高岭土、滑石粉等；粘合剂例如阿拉伯树胶粉、黄蓍胶粉、明胶、乙醇等；以及崩解剂例如海带多糖、琼脂等。
此外，如果需要，增色剂、防腐剂、香味化合物、调味剂、甜味剂和其它药物物质也可以被掺入到本发明的药物产品中。
被掺入到本发明的药物产品中的本发明的乳酸菌的数量没有特别的限制，可以从广泛的范围内适当地选择。一般来说推荐的比例是每单位剂量形式药物产品大约107-1012细胞。
给药药物产品的方法没有特别的限制，可以根据药物产品的形式、病人的年龄、性别和其它变量、疾病的严重程度等来进行适当的决定。例如，片剂、丸剂、溶液、悬浮液、乳液、颗粒和胶囊可以口服给药。
药物产品的剂量可以根据给药的方法、病人的年龄、性别和其它变量、疾病的严重程度等来进行适当的选择，但是优选为每公斤体重每天大约0.5-20毫克本发明的乳酸菌、即活性成分。药物产品可以一天给药1-4个分剂。
本发明组合物的改造使得一旦摄入(给药)，组合物中的乳酸菌定居在下消化道中作为肠道微生物群落的部分，在那里可以获得乳酸菌的预期效果例如肠道调节和肠道微生物群落改善。因此，特别优选的药物产品形式是肠溶片，通过它乳酸菌可以被运送到肠道而避免了胃酸的攻击。
本发明的乳酸菌菌株和含有细菌的组合物，一旦被摄取或给药，能够刺激人类粘膜免疫并促进IgA产生。因此本发明提供了在需要刺激粘膜免疫的人类对象中刺激粘膜免疫的方法，包括给该人类对象给药本发明的乳酸菌；在需要刺激粘膜免疫的人类对象中刺激粘膜免疫的方法，包括给该人类对象使用本发明的组合物；在需要促进IgA产生治疗的人类对象中促进IgA产生的方法，包括给该人类对象使用本发明的乳酸菌；以及在需要促进IgA产生治疗的人类对象中促进IgA产生的方法，包括给该人类对象使用本发明的组合物。
本发明还提供了本发明的乳酸菌在人类粘膜免疫刺激中的应用；本发明的组合物在人类粘膜免疫刺激中的应用；本发明的乳酸菌在促进人类IgA产生中的应用；本发明的组合物在促进人类IgA产生中的应用。
此外，本发明提供了本发明的乳酸菌在制备本发明的组合物中的应用。
本发明的效果
本发明提供了新的乳酸菌，它们具有极好的诱导IgA产生能力，能够有效地提供改善的人类粘膜免疫刺激，特别是肠道免疫刺激性，并且增强宿主的防御系统，以及提供含有细菌的组合物。更具体来说，提供了食品或药物产品形式的组合物。
附图简述
图1显示给药本发明的乳酸菌对派伊尔淋巴结细胞IgA产生的影响。
图2显示给药本发明的乳酸菌对IgG产生的影响。
实施本发明的最佳方式
提供了下面的实施例和实验例进一步详细地描述本发明。
实施例1
关于本发明的组合物配制的例子在下面显示。
(1)发酵豆奶饮料的制备
按照下面的配方称量成分，然后混合来制备饮料形式的本发明的组合物。
乳杆菌(Lactobacillus)ONRIC b0239发酵的豆奶          100mL
乳蔗糖(含量55％)                                    10.0g
维生素和矿物质                                      适量
调味剂                                              适量
水                                                  适量
合计                                                150mL
乳杆菌(Lactobacillus)ONRIC b0239发酵的豆奶是通过在1升豆奶(蛋白含量大约5g/100mL)中加入108个乳杆菌(Lactobacillus)ONRICb0239(FERM BP-10064)细胞，然后在37℃发酵48小时而获得的。发酵奶的细菌细胞含量是1×109细胞/mL。
(2)发酵牛奶的制备
按照下面的配方称量成分，然后混合来制备发酵牛奶形式的本发明的组合物。
乳蔗糖(含量55％)                                 10.0g
乳杆菌(Lactobacillus)ONRIC b0240发酵的牛奶       100mL
维生素和矿物质                                   适量
调味剂                                           适量
水                                               适量
合计                                             150mL
乳杆菌(Lactobacillus)ONRIC b0240发酵的牛奶是通过在1升牛奶中加入108个乳杆菌(Lactobacillus)ONRIC b0240(FERM BP-10065)细胞，然后在37℃发酵24小时而获得的。牛奶的细菌细胞含量是1×108细胞/mL。
(3)冷冻干燥的发酵牛奶粉的制备
使用大约107个乳杆菌(Lactobacillus)ONRIC b0239(FERMBP-10064)细胞，在37℃对100克牛奶进行乳酸发酵24小时，然后对发酵产品(包括细菌)进行冷冻干燥以制备粉末。
得到的粉末和各种其它成分按照下面的配方称量，然后混合来制备发酵牛奶冻干粉形式的本发明的组合物。粉末的细菌细胞含量是1×109细胞/mL。
乳杆菌(Lactobacillus)ONRIC b0239发酵
的牛奶的冷冻干燥粉                           2.2g
赋形剂                                       适量
维生素和矿物质                               适量
调味剂                                       适量
合计                                         20g
玉米淀粉被用作赋形剂。
(4)粉末的制备
按照下面的配方称量成分，然后混合来制备粉末形式的本发明的组合物。
酪蛋白                                     4.5g
乳蔗糖(含量55％)                           10.0g
乳杆菌(Lactobacillus)ONRIC b0240冻干粉     1.0g
维生素和矿物质                             适量
调味剂                                     适量
合计                                       20g
乳杆菌(Lactobacillus)ONRIC b0240冻干粉是通过在10％脱脂奶粉水溶液、即生长乳杆菌(Lactobacillus)的发酵原料中于37℃培养乳杆菌(Lactobacillus)ONRIC b0240(FERM BP-10065)24-48小时，然后冷冻干燥而获得的。粉末的细菌细胞含量是109-1010细胞/mL。
(5)颗粒的制备
按照下面的配方称量成分，然后混合来制备颗粒形式的本发明的组合物。
乳蔗糖(含量55％)                                10.0g
乳杆菌(Lactobacillus)ONRIC b0240冻干粉          1.0g
山梨醇                                          适量
维生素和矿物质                                  适量
调味剂                                          适量
合计                                            20g
使用的乳杆菌(Lactobacillus)ONRIC b0240冻干粉与实施例1-(4)中所用的相同。
(6)含有乳杆菌(Lactobacillus)的微胶囊
乳杆菌(Lactobacillus)ONRIC b0239(FERM BP-10064)以实施例1-(4)中中同样的方式冷冻干燥。每克获得的冻干粉含有6×1010个细胞，与乳蔗糖一起分散在融化的氢化椰子油(熔点34℃)中，制备成含有乳酸菌(25％)、油(70％)和寡糖(5％)的混合融化物。得到的融化物通过三重同心喷嘴最内部的喷嘴以0.3米/秒的平均流速滴加到流动的冷却油中；氢化椰子油(熔点34℃)和氢化大豆油的混合融化物通过内部喷嘴附近的中间喷嘴以0.3米/秒的平均流速滴加；用来形成胶囊壳的明胶/果胶溶液(体积比85/15)通过最外部的喷嘴以0.3米/秒的平均流速滴加，这就产生了三层无缝胶囊(每克胶囊1.4×109个细胞)，直径为2.5毫米。
内含物、中间涂层和外部胶囊壳的重量比是35∶35∶30。
胶囊被空气干燥，然后进行真空干燥或真空冻干以便将胶囊的水活性减少到Aw值为0.20或以下，热传导率为0.16kcal/mh℃或以下。Aw值的测定使用了电阻抗型的水活性仪(Aw仪，WA-360，Shibaura电子股份有限公司产品)。热传导率使用Fitch方法测量。
实施例2
在本实施例中，在体外使用了派伊尔淋巴结细胞培养系统按照Yasui等和Ikenaga等中描述的方法(Yasui，H.等，Microbial Ecology inHealth and Disease，5，155(1992)；Ikenaga，T.等，Milk Science，51，27(2002))对本发明的乳酸菌的诱导IgA产生的能力进行了试验。试验如下。
(1)实验动物
使用了纯株系SPF/VAF BALB/cAnNCrj雌性小鼠。
将获得的试验小鼠隔离检疫一个星期。在隔离检疫期间，随意地供应固态饮食(MF，Oriental Yeast股份有限公司产品)和自来水。
(2)派伊尔淋巴结细胞培养方法
在隔离检疫期后，将80只小鼠分成8组，每组10只小鼠，使得每组的平均体重基本相同。分组后，每天处死10只小鼠，取出小肠，从小肠中分离出派伊尔淋巴结。将派伊尔淋巴结放置在含有MEM[Eagle’s MEM(NISSUI产品)，2mM谷氨酰胺(GIBCO产品)，1mM丙酮酸钠(GIBCO产品)，以及MEM非基本氨基酸(GIBCO产品)]的离心管中，用冰冷却。将细胞通过一个筛子制备出单细胞悬浮液，用5mLMEM洗涤孔。将细胞悬浮液过滤，在4℃以1000转/分钟的速度离心10分钟。离心后，吸取出培养上清液，将沉淀悬浮在5mL MEM中。将此步骤重复两遍后，将沉淀悬浮在10mL含有5％FBS(GIBCO产品)的MEM中，并对活派伊尔淋巴结细胞进行计数。将细胞悬浮液接种到96孔板中制备细胞培养板。
(3)试验细胞的制备
乳杆菌(Lactobacillus)ONRIC b0239(FERM BP-10064)和乳杆菌(Lactobacillus)ONRIC b0240(FERM BP-10065)被用做本发明的乳酸菌。这些细菌被培养在适合它们培养的培养基中，直到达到静止生长期，然后将得到的培养液在7000g离心10分钟(4℃)。细胞用PBS(-)洗三次，悬浮在5mL生理盐水中。为了确定细胞的数量，在660nm测量浊度。然后将细胞在100℃高压灭菌30分钟。确定了660nm处浊度1.0等价于2.0×109细胞/毫升。
(4)培养上清液中IgA浓度的测定
在前面(2)中制备的派伊尔淋巴结细胞被悬浮在含有5％FBS的MEM中，调整到2.5×106细胞/毫升，将200μL悬浮液接种到96孔细胞培养板中。将20μL上面(3)中制备的浓度为2.0×109细胞/毫升的试验细胞悬浮液加到板的每个孔中，在存在5％CO2的情况下在37℃培养7天。
20μL浓度为50μg/mL的LPS(脂多糖)代替20μL上述细胞作为阳性对照。
随后，使用商业化的试剂盒通过ELISA测定了获得的培养上清液的总IgA浓度。
(5)本发明的乳酸菌的增强IgA产生活性
下面的表1显示了本发明的乳酸菌的增强IgA产生活性，其指标为刺激指数(S.I.)，即前面(4)中测定的含有本发明的乳酸菌的上清液的总IgA浓度相对于对照培养上清液中的总IgA浓度的值，对照培养上清液的制备是通过在MEM中加入10μL PBS(-)，然后以同样的方式培养无细胞培养基7天作为参照(1.0)。
使用各种已知的乳酸菌获得的试验结果显示在表1-4中。阳性对照(LPS 50μg/mL)的试验结果被标明为“阳性对照(LPS)”。表中“菌株号”下面显示的缩写代表下列的微生物保藏中心：
ATCC：美国典型培养物保藏中心；Manassas，VA，U.S.A.
JCM：日本理化研究所微生物包藏中心，RIKEN
NRIC：东京农业大学NODAI培养物保藏中心；Setagaya-ku，东京，日本。
表1
  株系号   属   种   亚种   IgAS.I.
  对照(PBS)   1
  阳性对照(LPS)   13.1
  ONRIC b0239   Lactobacillus   plantarum   5.61
  ONRIC b0240   Lactobacillus   plantarum   6.31
  JCM 1132   Lactobacillus   acidophilus   1.15
  ATCC 43121   Lactobacillus   acidophilus   1.1
  JCM 1059   Lactobacillus   brevis   1.2
  JCM 1115   Lactobacillus   buchneri   1.17
  JCM 1134   Lactobacillus   casei   casei   1.03
  JCM 1096   Lactobacillus   curvatus   1.63
  JCM 1002   Lactobacillus   delbrueckii   bulgaricus   1.23
  JCM 1012   Lactobacillus   delbrueckii   delbrueckii   1.41
  JCM 1248   Lactobacillus   delbrueckii   lactis   1.31
  JCM 1173   Lactobacillus   fermentum   1.08
  JCM 1131   Lactobacillus   gasseri   1.15
  JCM 1155   Lactobacillus   hilgardii   1.11
  JCM 2012   Lactobacillus   iohnsonii   1.11
  JCM 8572   Lactobacillus   kefirgranum   1.08
  JCM 5818   Lactobacillus   kefiri   1.21
  JCM 8130   Lactobacillus   paracasei   paracasei   1.11
  JCM 1171   Lactobacillus   paracasei   tolerans   1.11
  JCM 1149   Lactobacillus   plantatum   1.66
  JCM 1551   Lactobacillus   plantarum   1.14
  JCM 8341   Lactobacillus   plantarum   1.18
  JCM 1112   Lactobacillus   reuteri   1.15
  ATCC 7469   Lactobacillus   rhamnosus   1.05
  JCM 1157   Lactobacillus   sakei   sakei   1.52
  JCM 1150   Lactobacillus   salivarius   salicinius   1.06
  JCM 1231   Lactobacillus   salivarius   salivarius   1.14
  JCM 9504   Lactobacillus   suebicus   1.28
  JCM 5885   Pediococcus   acidilactici   (pentosaceus)   1.51
  JCM 5890   Pediococcus   pentosaceus   1.44
  JCM 6124   Leuconostoc   mesenteroides   mesenteroides   1
  NRIC 0103   Enterococcus   faecalis   1.06
  NRIC 0110   Enterococcus   faecalis   1.08
  NRIC 0134   Lactobacillus   brevis   1.07
  NRIC 0137   Lactobacillus   brevis   1.13
  NRIC 1713   Lactobacillus   brevis   1.08
  NRIC 1950   Lactobacillus   brevis   1.12
  NRIC 1964   Lactobacillus   brevis   1.07
  NRIC 1965   Lactobacillus   brevis   1.07
表2
株系号 属 种 亚种   IgAS.I.
  NRIC 1042   Lactobacillus   casei   casei   1.00
  NRIC 1597   Lactobacillus   casei   casei   0.96
  NRIC 1917   Lactobacillus   casei   casei   1.01
  NRIC 1941   Lactobacillus   casei   casei   1.02
  NRIC 1962   Lactobacillus   casei   casei   1.00
  NRIC 1963   Lactobacillus   casei   casei   1.05
  NRIC 1968   Lactobacillus   casei   casei   1.07
  NRIC 1975   Lactobacillus   curvatus   1.02
  NRIC 1976   Lactobacillus   curvatus   1.14
  NRIC 1977   Lactobacillus   curvatus   1.04
  NRIC 1978   Lactobacillus   curvatus   1.11
  NRIC 1979   Lactobacillus   curvatus   0.99
  NRIC 0191   Lactobacillus   delbrueckii   bulgaricus   1.07
  NRIC 1682   Lactobacillus   delbrueckii   lactis   1.12
  NRIC 0129   Lactobacillus   fermentum   1.00
  NRIC 0131   Lactobacillus   fermentum   1.19
  NRIC 0132   Lactobacillus   fermentum   1.03
  NRIC 0135   Lactobacillus   fermentum   1.02
  NRIC 0139   Lactobacillus   fermentum   1.14
  NRIC 0141   Lactobacillus   fermentum   1.08
  NRIC 0142   Lactobacillus   fermentum   0.94
  NRIC 0143   Lactobacillus   fermentum   1.04
  NRIC 0144   Lactobacillus   fermentum   0.97
  NRIC 0145   Lactobacillus   fermentum   1.09
  NRIC 0146   Lactobacillus   fermentum   1.05
  NRIC 0147   Lactobacillus   fermentum   1.05
  NRIC 1949   Lactobacillus   fermentum   1.09
  NRIC 1952   Lactobacillus   fermentum   1.06
  NRIC 1955   Lactobacillus   fermentum   1.12
  NRIC 1966   Lactobacillus   hilgardii   0.94
  NRIC 1967   Lactobacillus   hilgardii   1.06
  NRIC 1936   Lactobacillus   paracasei   paracasei   0.96
  NRIC 1937   Lactobacillus   paracasei   paracasei   0.94
  NRIC 1942   Lactobacillus   paracasei   paracasei   0.93
  NRIC 1944   Lactobacillus   paracasei   paracasei   1.00
  NRIC 1945   Lactobacillus   paracasei   paracasei   0.98
  NRIC 1946   Lactobacillus   paracasei   paracasei   1.01
  NRIC 1934   Lactobacillus   paracasei   tolerans   1.09
  NRIC 1935   Lactobacillus   paracasei   tolerans   1.03
  NRIC 1938   Lactobacillus   paracasei   tolerans   1.03
表3
  株系号   属   种   亚种   IgAS.I.
  NRIC 1939   Lactobacillus   paracasei   tolerans   1.01
  NRIC 1940   Lactobacillus   paracasei   tolerans   1.01
  NRIC 1943   Lactobacillus   paracasei   tolerans   0.99
  NRIC 1947   Lactobacillus   paracasei   tolerans   0.98
  NRIC 0391   Lactobacillus   pentosus   1.00
  NRIC 0392   Lactobacillus   pentosus   1.04
  NRIC 0393   Lactobecillus   pentosus   1.19
  NRIC 0394   Lactobacillus   pentosus   1.15
  NRIC 1919   Lactobacillus   plantarum   1.32
  NRIC 1920   Lactobacillus   plantarum   1.08
  NRIC 1921   Lactobacillus   plantarum   1.14
  NRIC 1922   Lactobacillus   plantarum   1.37
  NRIC 1923   Lactobacillus   plantarum   0.96
  NRIC 1957   Lactobacillus   plantarum   1.01
  NRIC 1958   Lactobacillus   plantarum   1.31
  NRIC 1715   Lactobacillus   reuteri   0.95
  NRIC 1974   Lactobacillus   reuteri   1.16
  NRIC 1980   Lactobacillus   reuteri   1.31
  NRIC 1599   Lactobacillus   sakei   0.97
  NRIC 1600   Lactobacillus   sakei   1.52
  NRIC 1601   Lactobacillus   sakei   1.07
  NRIC 1602   Lactobacillus   sakei   1.37
  NRIC 1603   Lactobacillus   sakei   1.03
  NRIC 1575   Leuconostoc   lactis   0.85
  NRIC 1576   Leuconostoc   lactis   0.92
  NRIC 1578   Leuconostoc   lactis   1.00
  NRIC 1580   Leuconostoc   lactis   1.03
  NRIC 1582   Leuconostoc   lactis   0.93
  NRIC 1750   Leuconostoc   lactis   1.03
  NRIC 1087   Leuconostoc   mesenteroides   mesenteroides   1.33
  NRIC 1507   Leuconostoc   mesenteroides   mesenteroides   1.02
  NRIC 1541   Leuconostoc   mesenteroides   mesenteroides   0.90
  NRIC 0124   Pediococcus   acidilactici   0.93
  NRIC 0122   Pediococcus   pentosaceus   1.03
  NRIC 0123   Pediococcus   pentosaceus   0.96
  NRIC 1913   Pediococcus   pentosaceus   1.62
  NRIC 1914   Pediococcus   pentosaceus   1.05
  NRIC 1915   Pediococcus   pentosaceus   1.28
  NRIC 0001   Saccharomvces   cerevisiae   1.04
  NRIC 0002   Saccharomvces   cerevisiae   1.02
  NRIC 0004   Saccharomvces   Cerevisiae   1.12
表4
  株系号   属   种   亚种   IgAS.I.
  NRIC 0005   Saccharomvces   cerevisiae   1.00
  NRIC 0006   Saccharomvces   cerevisiae   1.01
  NRIC 0007   Saccharomvces   cerevisiae   0.98
  NRIC 0008   Saccharomvces   cerevisiae   0.97
  NRIC 0009   Saccharomvces   cerevisiae   0.98
  NRIC 0011   Saccharomvces   cerevisiae   1.03
  NRIC 00l3   Saccharomvces   cerevisiae   0.95
  NRIC 0014   Saccharomvces   cerevisiae   0.94
  NRIC 0015   Saccharomvces   cerevisiae   1.04
  NRIC 0016   Saccharomvces   cerevisiae   0.88
  NRIC 0059   Saccharomvces   cerevisiae   1.12
  NRIC 0060   Saccharomvces   cerevisiae   1.11
  NRIC 1412   Saccharomvces   cerevisiae   1.00
  NRIC 1414   Saccharomvces   cerevisiae   1.03
  NRIC 1415   Saccharomvces   cerevisiae   0.85
  NRIC 1417   Saccharomvces   cerevisiae   0.97
  NRIC 1461   Saccharomvces   cerevisiae   0.92
  NRIC 1465   Saccharomvces   cerevisiae   1.00
  NRIC 1466   Saccharomvces   cerevisiae   1.07
  NRIC 1624   Saccharomvces   cerevisiee   0.91
  NRIC 1478   Saccharomvces   cerevisiae   0.91
  NRIC 1482   Saccharomvces   cerevisiae   0.94
  NRIC 1483   Saccharomvces   cerevisiae   1.24
  NRIC 1484   Saccharomvces   cerevisiae   0.87
  NRIC 1485   Saccharomvces   cerevisiae   0.95
  NRIC l486   Saccharomvces   cerevisiae   1.04
  NRIC 1487   Saccharovces   cerevisiae   0.91
  NRIC 1488   Saccharomvces   cerevisiae   0.91
  NRIC 1489   Saccharomvces   cerevisiae   0.84
  NRIC 1490   Saccharomvces   cerevisiae   0.88
  NRIC 1811   Saccharomvces   cerevisiae   1.03
如同表1-4中显示的那样，PBS对照的IgA产量被当作1，阳性对照的平均S.I.为13.1，表明了IgA产量的强烈增强。因此证实了该培养系统可用于评估派伊尔淋巴结细胞的IgA产量。
根据诱导IgA产生的能力，对各种乳酸菌进行的比较表明本发明的乳酸菌ONRIC b0239和ONRIC b0240分别具有S.I.值为5.61和6.31，因此与其它菌株相比具有明显较高的诱导IgA产生的能力，这些其它菌株的S.I.值是0.8-1.4。
IgA抑制病原菌侵入，中和病毒和毒素，抑制饮食性过敏原侵入。这些IgA的增加对于宿主防御是重要的。
实施例3
在本实施例中，通过下面的方式在体内试验了本发明的乳酸菌的诱导IgA产生的能力。
(1)实验动物及其饲养
购买50只雄性的8周龄BALB/c小鼠，并隔离检疫一个星期。在隔离检疫期间和随后的试验期间，随意地供应MF固态饮食(OrientalYeast股份有限公司产品)和自来水。
在隔离检疫期后，将小鼠分成3组，即生理盐水给药组(15只小鼠)，本发明的乳酸菌(活细胞)给药组(15只小鼠)，以及本发明的乳酸菌(非活细胞)给药组(15只小鼠)
(2)制备用于口服的本发明的乳酸菌
通过下列方法制备了用于口服的本发明的乳酸菌(活的和非活的细胞)。
活细胞：
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)b0240(FERM BP-10065；在本文后面简称为“b0240”)在MRS培养基中培养直到达到静止生长期，得到的培养物在3500rpm离心10分钟(4℃)。细胞用生理盐水离心清洗两次，悬浮于生理盐水中，使浓度达到4×109CFU/mL。
非活细胞：
将获得的活细胞高压灭菌(121℃加热15分钟)，然后使用超声清洗器(BRANSON)超声45分钟。
(3)试验方法
将(2)中制备的本发明的乳酸菌(活细胞)给本发明的乳酸菌(活细胞)给药组的15只小鼠(5+5+5＝15只小鼠)口服，分别在每天早晨以109CFU/250μL/小鼠/天的剂量口服7天(5只小鼠)、14天(5只小鼠)或21天(5只小鼠)。同样地，将(2)中制备的本发明的乳酸菌(非活细胞)给本发明的乳酸菌(非活细胞)给药组的15只小鼠口服，分别口服7天(5只小鼠)、14天(5只小鼠)或21天(5只小鼠)。在相应的给药期后，每个组的小鼠被斩首处死，将它们的血收集在管中，以3000转/分钟的速度在4℃离心10分钟以获得血清。派伊尔淋巴结细胞通过下面的方法制备。在处死每组的小鼠后，取出小肠，用眼科剪刀从小肠的外表面取下派伊尔淋巴结。将派伊尔淋巴结放置在含有不完全培养基(含有10mg庆大霉素的RPMI1640)的24孔微孔板中，用冰冷却。得到的培养液通过筛子制备出单细胞悬浮液，用5mL不完全培养基洗涤孔。将获得的悬浮液过滤，在4℃以1000转/分钟的速度离心10分钟。离心后，吸取出培养上清液，将沉淀悬浮在5mL不完全培养基中。将包括清洗、过滤、离心和吸取的上述步骤重复一次后，将获得的沉淀用作派伊尔淋巴结细胞。
生理盐水给药组的对照小鼠(15只小鼠)在饲养中没有给予本发明的乳酸菌(活的和非活的细胞)，它们的血清和派伊尔淋巴结细胞，在试验开始后7天(5只小鼠)、14天(5只小鼠)或21天(5只小鼠)时以与上述相同的方式制备。
IgA产生试验
这样制备的派伊尔淋巴结细胞(沉淀)被悬浮在0.5mL完全培养基中(含有2mM L-谷氨酰胺、50μM巯基乙醇、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素和10％FBS的RPMI1640)，调整使得细胞浓度为2×106细胞/mL。在对活细胞的数目进行计数后，将100μL细胞悬浮液接种到96孔细胞培养板的每个孔中。
派伊尔淋巴结细胞产生的IgA的量通过两种方法评估，即一种方法包括如上培养派伊尔淋巴结细胞，然后测量产生的IgA的量，另一种方法包括将派伊尔淋巴结细胞在含有作为派伊尔淋巴结细胞刺激物的本发明的乳酸菌(非活细胞)的培养细胞中培养，然后测量产生的IgA的量。在后一种方法中使用的条件被认为更接近真实的体内环境。具体来说，当在本试验中本发明的乳酸菌(活的和非活的细胞)被口服时，预计被消化的乳酸菌将给派伊尔淋巴结细胞提供一些刺激。
作为派伊尔淋巴结细胞刺激物的本发明的乳酸菌(非活细胞)按照下面的方法制备。
用于派伊尔淋巴结刺激的本发明的乳酸菌(非活细胞)
前面制备的用于口服的本发明的乳酸菌(活细胞)悬浮液进一步用磷酸缓冲液稀释，使浓度达到107CFU/mL(660nm处浊度为0.275)，将得到的细胞悬浮液高压灭菌(121℃加热15分钟)，然后使用超声波清洗器(BRANSON 2510)超声45分钟。
在使用派伊尔淋巴结细胞刺激物的方法中，10μL用于派伊尔淋巴结细胞刺激的本发明的乳酸菌(非活细胞)被加到每个孔中，然后在每个孔中加入100mL无FCS的RPMI1640，在存在5％CO2的情况下于37℃将派伊尔淋巴结细胞培养7天。在不使用派伊尔淋巴结细胞刺激物的方法中，10μL生理盐水代替本发明的乳酸菌(非活细胞)被加到每个孔中，然后通过同上的步骤培养派伊尔淋巴结细胞。
(4)测量
从细胞培养溶液通过离心分离培养上清液，并将它们在-80℃冷冻储存直到它们用于测量培养上清液中产生的IgA的总浓度。
培养上清液的总IgA浓度和血清的总IgG浓度使用商业化的试剂盒通过ELISA测定。
(5)结果
图1和图2显示了结果(分别为IgA浓度和IgG浓度)。
图1是一个条形图，显示了培养上清液的IgA浓度(μg/mL)。在图1中，白色的条显示了对照的生理盐水给药组的结果(标为“生理盐水”)。斜线条显示了本发明的乳酸菌(活b0240细胞)给药组的结果(标为“b0240活细胞”)。黑色的条显示了本发明的乳酸菌(非活b0240细胞)给药组的结果(标为“b0240非活细胞”)。“无刺激”表示来自每个组的小鼠的派伊尔淋巴结细胞在不含本发明的乳酸菌(非活细胞)的培养系统中培养的情况。“细胞刺激”表示来自每个组的小鼠的派伊尔淋巴结细胞在本发明的乳酸菌(非活细胞)的刺激下，通过在培养系统中加入乳酸菌培养的情况。每组使用5只小鼠获得的结果显示为平均值±标准偏差(平均值±SD)。在结果上方显示的p值代表了学生t-检验中相对于对照的显著水平。
图1中显示的结果清楚地表明：
(1)7天给药
在细胞刺激的情况下，本发明的乳酸菌(非活细胞)给药组与生理盐水给药组相比具有明显高的值(p＝0.01.0)。
(2)14天给药
在无刺激的情况下，本发明的乳酸菌(非活细胞)给药组与对照组(在给药生理盐水后无刺激)相比具有明显高的值(p＝0.048)(无刺激的黑色条)。
在细胞刺激的情况下，本发明的乳酸菌给药组两组(非活细胞和活细胞)与对照组(生理盐水给药组)相比都具有明显高的值(分别为p＝0.034和p＝0.002)。
(3)21天给药
在无刺激的情况下，本发明的乳酸菌(非活细胞)给药组与对照组相比具有明显高的值(p＝0.047)。
在细胞刺激的情况下，本发明的乳酸菌(非活细胞和活细胞)给药组两组与对照组相比都具有明显高的值(分别为p＝0.015和p＝0.005)。
图2是一个条形图，显示了本发明的乳酸菌(非活细胞)给药21天对IgG产量的影响。血清IgG浓度(μg/mL)作图在纵轴上。
图2显示的结果清楚地表明，本发明的乳酸菌(非活细胞)给药组与对照组(生理盐水给药组)相比具有明显高的血清IgG浓度(p＝0.0064)；本发明的乳酸菌(活细胞)给药组与对照组(生理盐水给药组)相比也具有明显高的血清IgG浓度。
上述的结果被认为是如下发生的：本发明的乳酸菌通过刺激派伊尔淋巴结或小肠上皮细胞中的免疫活性细胞和周围的免疫活性细胞诱导了粘膜免疫反应，最终增加了派伊尔淋巴结细胞的总IgA产量。结果也清楚地显示，给药本发明的乳酸菌不仅可以增加IgA，也可以增加血清IgG。这些情况表明摄取本发明的乳酸菌不仅刺激了粘膜免疫，而且刺激了系统免疫，以致于体内免疫反应被加倍刺激，从而使宿主生物体能够从内部和外部防御。由于不仅活细胞而且非活细胞都显示了这样的活性，本发明的乳酸菌被预期可用于新的益生方法，例如口服疫苗。
实施例4
本实施例将要证实本发明的乳酸菌防止下呼吸道流感感染的有效性。
粘膜免疫是病原接触到粘膜时感染防御机制的第一步(Brandtzaeg，P.，Curr.Top.Microbiol.Immunol.146：13 1989)。粘膜分泌的IgA(S-IgA)具有针对病原例如细菌和病毒的防御性质(Czinn，S.J.等，Vaccine11：637，1993；Renegar，K.等，J.Immunol.146：1972，1991)，在中和微生物产生的毒素的过程中也发挥重要作用(Brandtzaeg，P.，APMIS 103：1，1995；Kilian，M.等，Microbiol.Rev.52：296 1988)。近年来在针对通过粘膜免疫系统的感染防护效应的传染病药物方面进行了许多研究和开发。流感感染在免疫系统发育不全的儿童和免疫功能已经降低的老年人中有高的死亡率，因此需要开发更有效的疫苗代替现有疫苗。具体来说，因为流行的流感病毒的类型每年都改变，在病毒感染位点由粘膜免疫产生的中度特异性IgA的基础上开发粘膜疫苗代替透皮给药产生的高特异性IgG，已经进行了各种尝试。使用乳酸菌的食品例如发酵奶，已经被报道具有基于IgA的感染防护效应。例如Yasui等进行了轮状病毒(为一种造成婴儿腹泻主要原因的病毒)感染小鼠的实验，其中B.breve YIT4064被给药母鼠，然后用母鼠的奶喂养子鼠，报道结果抑制了子鼠的腹泻(H.Yasui等，J.Infect.Dis.，172：403，1995)。Yasui等还报道了B.breve YIT4064的给药增加了血清中流感病毒特异性IgG，从而保护小鼠抵抗流感感染，这是因为针对流感病毒感染的保护程度与体液免疫和细胞免疫例如呼吸道中的粘膜免疫球蛋白A(IgA)和血清IgG的水平相关(H.Yasui等，Clin.Diagn.Lab.Immunol.6：186，1999)。
为了研究乳酸菌的基于IgA的感染防护效应，使用流感病毒(IFV)到达下呼吸道的下呼吸道感染模型小鼠，使用感染后存活的天数作为指标评估了摄取本发明的组合物(使用本发明的乳酸菌制备的发酵奶)的感染防护效应。试验按照下面的方法进行。
(1)实验动物
5周龄SPF/VA/VAF纯系雌性小鼠(BALB/cAnNCrj株系)从CharlesRiver日本公司购买，在下面显示的条件下隔离检疫4天，然后分成3组(蒸馏水组、牛奶组和含有本发明的乳酸菌的发酵奶组)使得每组的平均体重基本上相同。
饲料供应：MF固体饮食(Oriental Yeast股份有限公司产品)/自由喂食
水供应：自来水/从瓶中随意喂食
环境：温度23±2℃；湿度60±10％。
照明时间：照明期，7:00到19:00；暗期，19:00到7:00。
(2)试验方法
试验物((1)蒸馏水、(2)牛奶或(3)含有本发明的乳酸菌的发酵奶)随着MF固体饮食(Oriental Yeast股份有限公司产品)给药每组小鼠(n＝45)2个星期。
试验用的牛奶是通过用蒸馏水稀释LL牛奶(Oaso牛奶；RakunouMothers(Kumamoto乳制品合作联合公司)产品)到75％而制备。含有本发明的乳酸菌的试验用发酵奶是使用悬浮在10％脱脂奶水溶液中的植物乳杆菌(L.plantarum)ONRIC b0240并在-80℃冷冻储存作为起始物而制备的。起始物(活细胞数：108细胞)被加入到1升牛奶中，于33℃发酵16小时，使浓度达到5×107细胞/mL，用蒸馏水稀释到75％。
试验物通过供水瓶随意喂食。喂食摄取量通过比较试验物的起始重量和喂食后的重量得出的试验物的重量减少值计算出来。
开始摄食两周后，每组的小鼠用“Ketalar”(克他命盐酸盐)麻醉，用IFV通过一个鼻腔用于鼻腔接种，给药50μL浓度为10、102或103pfu/50μL PBS/小鼠(每组15只小鼠)的IFV溶液感染小鼠。每天检查每组中小鼠的存活或死亡。从感染开始到证实死亡期间，小鼠可以自由接近试验物。
储存在Otsuka制药股份有限公司微生物研究所的IFV：A/PR/8/34/H1N1株系被用做IFV株系。该株被悬浮在含有0.1％BSA和10mM HEPES的MEM中，用PBS(+)稀释使浓度达到10-103pfu/50μL，从而提供了用于IFV接种的病毒溶液。PBS(+)通过将9.55克PBS(-)粉末(Kojin-Bio股份公司产品)、100.00mg无水氯化钙和46.90mg无水氯化镁溶解在蒸馏水中使体积达到1000mL而制备。
结果
每组中的小鼠在鼻腔接种IFV后存活的天数在每天早晨(8:30-9:00)和晚上(17:30-18:00)通过观察进行检查，即一日两次。
当病毒以102pfu/小鼠的浓度接种时，对照组(蒸馏水给药组)和比较组(牛奶给药组)中的所有小鼠都在7天内死亡。当病毒以103pfu/小鼠的浓度接种时，两组中的所有小鼠都在第6天晚上前死亡。相反，含有本发明的乳酸菌的发酵奶给药组显示出小鼠的存活期超过对照组的趋势。
当病毒以10pfu/小鼠的浓度接种时，在14天时所有组中70％或以上的小鼠都存活；在含有本发明的乳酸菌的发酵奶给药组中86.7％的小鼠存活，因此显示出与对照组(80％)相比增加存活率的趋势。
从开始摄取试验物到感染时，每两天用电子称测量每组中的小鼠的重量，在感染后每天早晨(8:30-9:00)测量。在每个测量日对存活的小鼠进行测量，同一组中小鼠所有测量值的平均值被显示为获得的值。
在所有组中，从第2天起观察到轻微的重量减少。在所有组中重量变化的趋势是相似的，没有观察到明显的区别。
体会
从该试验的结果和实施例2和3中的结果，推论出本发明的乳酸菌和含有乳酸菌的发酵奶具有针对IFV感染的防护效果。
工业实用性
本发明提供了能够刺激粘膜免疫和促进IgA产生的乳酸菌，以及含有该菌的组合物。该乳酸菌和组合物可以抑制传染性微生物通过粘膜的侵入，从而提供了宿主保护性效应。

Claims (15)

1.乳酸菌菌株，该菌株选自乳杆菌(lactobacillus)ONRICb0239(FERM BP-10064)和乳杆菌(lactobacillus)ONRIC b0240(FERMBP-10065)。
2.权利要求1中的乳酸菌菌株，该菌株是乳杆菌(lactobacillus)ONRIC b0239(FERM BP-10064)。
3.权利要求1中的乳酸菌菌株，该菌株是乳杆菌(lactobacillus)ONRIC b0240(FERM BP-10065)。
4.含有权利要求1中的乳酸菌菌株和可食用载体或可药用赋形剂或稀释剂的组合物，该组合物能够刺激粘膜免疫。
5.权利要求4中的组合物，该组合物是食品或饮料的形式。
6.权利要求5中的组合物，该组合物是发酵奶、乳酸菌饮料、发酵蔬菜饮料、发酵水果饮料或发酵豆奶饮料。
7.在需要刺激粘膜免疫的人类对象中刺激粘膜免疫的方法，包括给该人类对象给药权利要求1-3之一的乳酸菌。
8.在需要刺激粘膜免疫的人类对象中刺激粘膜免疫的方法，包括给该人类对象给药权利要求4-6之一的组合物。
9.在需要促进IgA产生治疗的人类对象中促进IgA产生的方法，包括给该人类对象给药权利要求1-3之一的乳酸菌。
10.在需要促进IgA产生治疗的人类对象中促进IgA产生的方法，包括给该人类对象给药权利要求4-6之一的组合物。
11.权利要求1-3之一的乳酸菌在人类粘膜免疫刺激中的应用。
12.权利要求4-6之一的组合物在人类粘膜免疫刺激中的应用。
13.权利要求1-3之一的乳酸菌在促进人类IgA产生中的应用。
14.权利要求4-6之一的组合物在促进人类IgA产生中的应用。
15.权利要求1-3之一的乳酸菌在制备权利要求4-6之一的组合物中的应用。
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