CN1303431A

CN1303431A - 抗人组织因子和人源化抗体以及人源化抗体的制作方法

Info

Publication number: CN1303431A
Application number: CN99806658A
Authority: CN
Inventors: 佐藤功; 安达秀树; 薮田尚弘
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1998-04-03
Filing date: 1999-04-02
Publication date: 2001-07-11
Also published as: AU3055699A; ATE512225T1; IL138801A0; TR200002885T2; HUP0101160A2; EP1069185A1; JP2008161198A; BR9909382A; JP4180106B2; US6677436B1; TR200101541T2; EP2363484A2; DK1069185T3; EP2363484A3; KR20010042435A; EP1069185A4; US20040044187A1; ES2364266T3; PT1069185E; SK14812000A3

Abstract

抗TF的人源化抗体,是由下面的A和B构成的。其中A.是由(1)小鼠抗组织因子(TF)单克隆抗体的H链CDR和人抗体的H链FR构成的H链V区、以及(2)含有人抗体H链C区构成的人源化H链;而B.由(1)小鼠抗组织因子(TF)单克隆抗体的L链CDR和人抗体的L链FR构成的L链V区、以及(2)含有人抗体L链C区构成的人源化L链构成。对将小鼠单克隆抗体的CDR移植到人抗体上制作人源化V区后,通过对其中的FR用同源性高的其它人抗体对应的FR进行置换而获得活性高的人源化抗体进行了探索。

Description

抗人组织因子的人源化抗体以及人源化抗体的制作方法

技术领域

本发明涉及由小鼠抗人组织因子(TF)单克隆抗体的可变区(V区)和人抗体的恒定区(C区)构成的人/小鼠嵌合抗体、小鼠抗人组织因子(TF)单克隆抗体的轻链(L链)V区和重链(H链)V区的互补决定区(CDR)移植到人抗体形成的人源化(humanized)抗体、以及构成该抗体的L链或H链的V区的片段。另外本发明还涉及抗人TF的人源化抗体的制作方法。

另外本发明还涉及到编码上述的抗体、特别是编码该抗体V区片段的DNA、以及编码含有V区的L链或H链的DNA。本发明还涉及含有该DNA的重组载体、以及利用该载体转化的宿主。

另外本发明还涉及抗人TF的嵌合抗体以及人源化抗体的制造方法。本发明还涉及以抗人TF的人源化抗体为有效成分的医药组合物和弥散性血管内凝血综合症(DIC)治疗药物。

背景技术

组织因子(TF)是出现在细胞表面的凝血因子Ⅶ受体，通过与凝血因子Ⅶ形成复合物，在激活凝血因子Ⅸ以及因子Ⅹ中起着必不可少的作用，被认为是血液凝固反应的实质上的起始因子。

人们已经知道TF出现在构成血管的纤维母细胞和平滑肌细胞等细胞中，在血管损伤时激活凝血系统，起到止血的功能。

DIC弥散性血管内凝血是由于血管内的凝血系统的激活，全身性的主要在微血管内血栓多发的疾病。由于血小板和凝血因子被消耗后而降低，往往发生与形成血栓的现象相反的出血现象。由于多发的微血栓引起重要脏器的微循环不良，所以一旦出现这种症状，往往留下不可逆的功能障碍，由于DIC的预后为不良，被认为是重要的疾病。

从厚生省特定疾病血液凝固异常症调查研究班平成2年度和4年度的研究报告书推定的基础疾病比例如下：造血系统恶性肿瘤约占30％、实体癌约占20％、感染症约占15％、产科疾病约占10％、肝病约占6％、休克症约占5％、心血管疾病约占3％。而DIC的发病频率为：白血病约为15％、恶性淋巴瘤高达6～7％，而实体癌为3％。

这些疾病总体来看会导致DIC，其起因物质是共同的，即是TF。就是说急性白血病和恶性淋巴瘤、实体癌中肿瘤细胞的TF的生成和表现的异常亢进，感染症(特别是革兰氏阴性菌性败血症)时单核细胞和血管内皮细胞中TF产生和表现的亢进，而重症肝炎是由于来自坏死的肝组织的TF流入血液中，大动脉瘤、心脏瘤和巨大血管瘤是由于在血管内皮形成TF，而产科疾病(羊水栓塞和常位胎盘早期剥离)和手术、外伤和烧伤人们也认为TF流入血液中是DIC的致病机理。

原疾病(基础疾病)的治疗是第一位的，但实际上这并不容易。作为目前的DIC治疗方法有抗凝固疗法和补充疗法。成为抗凝固疗法中心的是肝素制剂(未分级肝素、低分子量肝素)，也用合成蛋白分解酶抑制剂(甲磺酸加贝酯(mesilic acid gabexate)、甲磺酸萘莫司他(mesilic acidnafamostat))或浓缩血浆制剂(抗凝血酶Ⅲ、活化的蛋白C制剂)。作为补充疗法有浓缩血小板和新鲜冷冻血浆(补充纤维蛋白)、洗净红血球等。

然而就目前的治疗药来看，在有效性和副作用方面十分满意的还没有，从DIC中完全解脱几乎是不可能的，所以人们期待着使用治疗效果高，而副作用小的药剂。

作为新的DIC治疗的尝试使用血栓调节素、水蛭素、抗PAF剂。TFPI(组织因子通路抑制剂Tissue Factor Pathway Inhibitor)或FXa选择性抑制剂作为可口服的抗凝固和抗血栓剂已引起人们的注目。而作为中和TF的活性的物质，在WO88/07543中是以小鼠抗人TF单克隆抗体，而在WO968/40921中是以人源化抗TF抗体公开的。

小鼠抗人TF单克隆抗体没有表现出伴随着在DIC中起主要药效的同时的出血倾向等，作为安全而有效的治疗药是有希望的。然而小鼠的单克隆抗体在人中具有高度的免疫原性(有时也称为“抗原性”。)，因此小鼠单克隆抗体对于人的医学疗法的价值受到限制。例如如果将小鼠抗体给予人，可能作为异物被代谢，在人体内小鼠抗体的半衰期比较短，不能充分发挥所期待的效果。另外对于给予的小鼠抗体产生的相应人抗小鼠抗体(HAMA)会引起血清病或其他的变态反应等，对患者不适合，会引起危险的免疫应答。因此不能经常将小鼠单克隆抗体给予人。

为了解决这些问题，开发了使并非来自人的抗体，例如来自小鼠的单克隆抗体的免疫原性降低的方法。其中一种方法是制作抗体的可变区(V区)来自原来的小鼠单克隆抗体，而恒定区(C区)来自适当的人抗体的嵌合抗体的方法。

由于得到的嵌合抗体含有完整的原来的小鼠抗体的可变区，可以预料具有与原来的小鼠抗体相同的特异性，可以结合抗原。另外，在嵌合抗体中实质上减少了来自人以外的氨基酸序列的比例，因此与原来的小鼠抗体的相比，可以预计其免疫原性降低了。但对小鼠可变区产生免疫应答的可能性也是存在的(LoBuglio,A.F.,等，美国国家科学院院报，(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),86,4220-4224,1989)。

降低小鼠抗体免疫原性的第二种方法虽然更复杂些，然而有希望能进一步大幅度降低小鼠抗体的潜在的免疫原性。在该方法中，只将小鼠抗体的可变区中的互补决定区(complementarity determining region；CDR)移植到人可变区，制作“重构的”(reshaped)人可变区。而根据需要为了使重构的人可变区的CDR的结构更接近原来小鼠抗体的结构，有时将支持CDR的框架区(FR)的一部分氨基酸序列从小鼠抗体的可变区移植到人可变区。然后将这些人源化的重构人可变区与人恒定区连接。最终来自重构的人源化抗体的人以外的氨基酸序列的部分只是CDR和很少一部分FR。CDR通过超可变氨基酸序列构成，它们没有表现出种属特异的序列。

有关人源化抗体可参照如下文献：Riechmann,L.等自然(Nature),332,323-327,1988；Verhoeye,M.等科学(Science),239,1534-1536,1998；Kettleborough,C.A.等蛋白质工程(Protein Engng.),4,773-783,1991； Maeda,H人抗体和杂交瘤(Human Antibodies and Hybridoma),2,124-134,1991；Corman,S.D.等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),88,4181-4185,1991；Tempest,P.R生物/技术Bio/Technology,9,266-271,1991；Co,M.S.等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),88,2869-2873,1991；Cater,P等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),89,4285-4289,1992；Co,M.S.等免疫学杂志(J.Immunol.),148,1149-1154,1992；Sato,K等，癌研究(Cancer Res.),53,851-856,1993。

若用以前的人源化技术，在框架区(FR)的一部分含有由小鼠抗体的可变区移植到人可变区的氨基酸序列。因此在作为人的治疗药给药时，虽然是可变区的一个至数个氨基酸，但产生针对含有人体内不存在的氨基酸序列部位的抗体的危险性是存在的。为了避免这一危险性，想出了第三种人源化技术。即关于为了保持三个CDR的立体构造所需要的四个FR(FR1～4)，以一个FR作为一个单位，用数据库中存在的与小鼠抗体的FR同源性高的人抗体的FR进行置换的方法。这种情况下，从数据库中存在的抗体选择数种FR，通过依次进行置换(改组，shuffle)，制备活性更高的人源化抗体。

通过这样的操作，能够制作在可变区中除去CDR的FR含有全都来自人抗体的氨基酸序列的人源化抗体。因此载有小鼠CDR的人源化抗体应当没有象已经含有人CDR的人抗体那么强的免疫原性。

如前所述，可以想象到人源化抗体从治疗目的看是有用的，但在人源化抗体的制造方法中不存在对任意抗体都能普遍适用的统一的方法，为了制作对特定抗原表现出充分的结合活性、中和活性的人源化抗体，必需想各种办法(例如参照Sato,K.癌研究(Cancer Res.),53,851-856,1993)。

发明的公开

本发明的目的在于提供由小鼠抗人组织因子(TF)单克隆抗体的可变区(V区)和人抗体的恒定区(C区)构成的人/小鼠嵌合抗体、小鼠抗人组织因子(TF)单克隆抗体的轻链(L链)V区和重链(H链)V区的互补决定区移植到人抗体形成的人源化(humanized)抗体、该抗体的L链和H链、以及构成该抗体的L链或H链的V区的片段。另外本发明的目的还在于提供抗人TF人源化抗体的制作方法。

另外本发明的目的还在于提供编码上述的抗体、特别是该抗体V区片段的DNA、以及编码含有V区的L链或H链的DNA；提供含有该DNA的重组载体、以及利用该载体转化的宿主；提供以抗人TF的人源化抗体为有效成分的医药组合物和弥散性血管内凝血综合症(DIC)治疗药物。

本发明人就上述课题进行了深入研究，结果获得了小鼠抗人TF的单克隆抗体在人体内的免疫原性降低的抗体，开发出了新的人源化抗体的制作方法，从而完成了本发明。

就是说，本发明涉及含有人抗体的H链C区以及小鼠抗人TF的单克隆抗体的H链V区片段的嵌合H链。作为H链V区，可举出含有如序列号9所示氨基酸序列的片段，作为C区如Cγ4区那样序列的片段。

另外本发明还涉及含有人抗体的L链C区以及小鼠抗人TF的单克隆抗体的L链V区片段的嵌合L链。作为L链V区可举出含有如序列号15所示的氨基酸序列的片段，作为L链C区如Cκ区那样序列的片段。

另外本发明还涉及含有上述嵌合H链和嵌合L链、抗TF的人小鼠嵌合单克隆抗体。

另外本发明还涉及含有人抗体的H链V区的框架区(FR)1～4、以及小鼠抗人TF单克隆抗体的H链V区的互补决定区(CDR)1～3的人源化抗体的H链V区的片段。作为CDRl～3可举出分别含有序列号133～135所示的各个氨基酸序列的片段。作为人抗体的H链V区的FR1可举出与小鼠抗体的H链V区FR1的同源性在40％以上的人抗体FR1，作为FR2可举出与小鼠抗体的H链V区FR2同源性在40％以上的人抗体FR2，作为FR3可举出与小鼠抗体的H链V区FR3同源性在40％以上的人抗体FR3，作为FR4可举出与小鼠抗体的H链V区FR4同源性在40％以上的人抗体FR4。

优选的：作为人抗体的H链V区的FR1，可举出与小鼠抗体的H链V区FR1的同源性在50％以上的人抗体FR1，作为FR2可举出与小鼠抗体的H链V区FR2同源性在70％以上的人抗体FR2，作为FR3可举出与小鼠抗体的H链V区FR3同源性在65％以上的人抗体FR3，作为FR4可举出与小鼠抗体的H链V区FR4同源性在80％以上的人抗体FR4。举些具体的例子：作为人抗体的H链V区的FR1如人抗体L39130；作为FR2如人抗体L39130、人抗体P01825和人抗体Z80844；作为FR3如人抗体L39130、人抗体Z34963、人抗体P01825、人抗体M62723、人抗体Z80844、人抗体L04345、人抗体S78322、人抗体Z26827、人抗体U95239和人抗体L03147；作为FR4如人抗体L39130。

优选的例子：作为人抗体的H链V区的FR1如人抗体L39130；作为FR2如人抗体L39130以及人抗体Z80844；作为FR3如人抗体Z34963、人抗体M62723和人抗体U95239；作为FR4如人抗体L39130。最理想的例子：作为人抗体的H链V区的FR1如人抗体L39130；作为FR2如人抗体L39130；作为FR3如人抗体Z34963和人抗体U95239；作为FR4如人抗体L39130。

另外本发明作为框架区中的编号来自Kabat的规定(Kabat,E.A.等、美国卫生部，美国政府出版局US Dept.Health and Human ServicesUSgovernment Printing Offices,1991)。

另外本发明还涉及含有以序列号30、40、42、50、52、58、60、64、70、72、76、78、82、84表示的任一氨基酸序列的人源化抗体的H链V区的片段。

另外本发明还涉及含有人抗体的L链V区的框架区的FR1～4、以及小鼠抗人TF单克隆抗体的L链V区的互补决定区CDR1～3的人源化抗体的L链V区的片段。作为CDR1～3可举出分别含有序列号136～138所表示的各个氨基酸序列的片段。作为人抗体的L链V区的FR1可举出与小鼠抗体的L链V区FR1的同源性在40％以上的人抗体FR1，作为FR2可举出与小鼠抗体的L链V区FR2同源性在40％以上的人抗体FR2，作为FR3可举出与小鼠抗体的L链V区FR3同源性在40％以上的人抗体FR3，作为FR4可举出与小鼠抗体的L链V区FR4同源性在40％以上的人抗体FR4。

优选的是：作为人抗体的H链V区的FR1可举出与小鼠抗体的L链V区FR1的同源性在75％以上的人抗体FR1，作为FR2可举出与小鼠抗体的L链V区FR2同源性在80％以上的人抗体FR2，作为FR3可举出与小鼠抗体的L链V区FR3同源性在70％以上的人抗体FR3，作为FR4可举出与小鼠抗体的L链V区FR4同源性在80％以上的人抗体FR4。举些具体的例子：作为人抗体的L链V区的FR1如人抗体Z37332；作为FR2如人抗体Z37332和人抗体X93625；作为FR3如人抗体Z37332、人抗体S68699和人抗体P01607；作为FR4如人抗体Z37332。更优选的例子：作为人抗体的L链V区的FR1如人抗体Z37332；作为FR2如人抗体X93625；作为FR3如人抗体S68699；作为FR4如人抗体Z37332。

另外本发明作为框架区中的编号来自Kabat的规定(Kabat,E.A.等、美国卫生部，美国政府出版局,US Dept.Health and Human Services.USgovernment Printing Offices,1991)。

另外本发明还涉及含有序列号93、99、101、107或109表示的氨基酸序列的人源化抗体的L链V区的片段。

另外本发明还涉及含有上述人源化抗体的H链V区的片段以及人抗体的H链C区的片段、抗人TF的人源化抗体的H链。其中作为C区可举出Cγ4区，作为来自人抗体的FR1～4可举出分别来自人抗体L39130(FR1)、人抗体L39130(FR2)、人抗体Z34963(FR3)或人抗体U95239(FR3)、人抗体L39130(FR4)的片段，而作为CDR1～3可举出分别含有序列号133～135所示的氨基酸序列的片段。

另外本发明还涉及含有上述人源化抗体的L链V区的片段以及人抗体的L链C区片段的抗TF的人源化抗体的L链。其中作为C区可举出Cκ区，作为来自人抗体的FR1～4可举出分别来自人抗体Z37332(FR1)、人抗体X93625(FR2)、人抗体S68699(FR3)、人抗体Z37332(FR4)的片段，而作为CDR1～3可举出分别含有序列号136～138所示的氨基酸序列的片段。

另外本发明还涉及含有上述人源化抗体的L链和H链的抗人TF的人源化抗体。

另外本发明还涉及抗人TF的人源化抗体的制作方法。所谓人源化的制作方法是有关维持作为H链或L链的抗原识别部位的CDR1～3构造的FR1～4的选择方法。就是说将各个FR作为一个单位，选择多个与来自小鼠抗体的FR同源性高的人抗体的FR，对这些FR依次进行置换(改组，shuffle)，获得具有所期望的活性的人源化抗体的制作方法。

更详细讲，在本发明的人源化抗体的制造方法的一个例子，在使含有非来自人的互补决定区(CDR)以及来自天然人抗体的框架区(FR)的免疫原性降低的天然人源化抗体的制造方法中，其特征为：

(1)准备对目的抗原具有反应性的非人单克隆抗体，

(2)准备多个对上述(1)的单克隆抗体中的FR的氨基酸序列具有高同源性的人抗体，

(3)对上述(2)中的一种类型人抗体的4个FR用上述(1)的非人的单克隆抗体相应的FR进行置换后，制作第一人源化抗体，

(4)测定上述(3)中制作的人源化抗体与抗原的结合活性或中和抗原的生物活性的能力，

(5)对上述(3)制作的人源化抗体中的1～3个FR利用(2)中准备的人源化抗体中的人抗体(与(3)中使用的抗体不同)相应的FR进行置换后，制作第二人源化抗体，

(6)对上述(5)中制作的第二人源化抗体和上述(3)中得到的第一人源化抗体就有关对抗原的结合性、或中和抗原的生物活性的能力进行比较，选择显示最高活性的人源化抗体，

(7)就上述(6)中选择的人源化抗体实施(3)～(6)阶段操作，然后

(8)反复进行(3)～(6)阶段操作直至获得与上述(1)中的非人单克隆抗体具有同等活性的人源化抗体为止。

如果能获得对人TF具有一定程度中和活性的人源化抗体，对其H链以及L链的V区的特定的FR进一步进行同源性的检索，可以进一步选择同源性高的人抗体。将得到的该人抗体加到上述(2)中的多个人抗体中，反复进行(3)～(6)操作，可以获得具有所期望活性的人源化抗体。

另外本发明还涉及到编码小鼠抗人TF单克隆抗体的H链的V区片段或L链V区片段的DNA。作为H链的V区片段以及L链V区片段的氨基酸序列和DNA可举出分别含有序列号9或15表示的碱基序列的序列。

另外本发明还涉及编码上述嵌合H链或嵌合L链的DNA。作为编码该H链的DNA如含有序列号9所示的碱基序列的序列，编码该L链的DNA如含有序列号15所示的碱基序列的序列。

另外本发明还涉及编码上述人源化抗体的H链V区片段或L链V区片段的DNA。作为编码H链V区片段的DNA如含有序列号29、39、41、49、51、57、59、63、69、71、75、77、81、83表示的任一个碱基序列的DNA，作为编码L链V区的DNA如含有序列号92、98、100、106或108表示的碱基序列的DNA。

另外本发明还涉及编码人源化抗体的H链的DNA。

另外本发明还涉及含有编码序列号30、40、42、50、52、58、60、64、70、72、76、78、82或84表示的任一种氨基酸序列的DNA的人源化抗体的H链的DNA。作为该DNA可举出含有序列号29、39、41、49、51、57、59、63、69、71、75、77、81、83表示的任一个碱基序列的DNA。

另外本发明还涉及编码上述人源化抗体的L链的DNA。

另外本发明还涉及编码序列号93、99、101、107或109表示的氨基酸序列的人源化抗体的L链DNA。作为该DNA可举出含有序列号92、98、100、106或108表示的碱基序列的DNA。

另外本发明还涉及含有上述任一DNA的重组载体。

另外本发明还涉及利用上述重组载体转化的转化体。

另外本发明还涉及到抗人TF的嵌合抗体或人源化抗体的制造方法，其特征是：培养上述转化体，从得到的培养物提取抗人TF的嵌合抗体和人源化抗体。

另外本发明还涉及到以上述人源化抗体为有效成分的医药组合物或DIC治疗剂。

附图的简单说明

图1是比较H链嵌合/L链嵌合抗体、H链人源化a版本/L链嵌合抗体、以及H链嵌合/L链人源化a版本抗体的抗原结合活性的图。

图2是比较H链嵌合/L链嵌合抗体、H链人源化a版本/L链嵌合抗体、以及H链嵌合/L链人源化a版本抗体的对人TF的中和活性的图。

图3是比较H链嵌合/L链嵌合抗体、H链人源化a版本/L链人源化a版本抗体的抗原结合活性的图。

图4是比较小鼠抗TF单克隆抗体抗体ATR-5、H链嵌合/L链嵌合抗体、以及H链人源化版本a/L链人源化版本a抗体对人TF的中和活性的图。

图5是比较H链嵌合/L链嵌合抗体、H链人源化版本b/L链嵌合抗体、以及H链人源化版本b/L链人源化版本a抗体的抗原结合活性的图。

图6是测定H链嵌合/L链嵌合抗体、H链人源化版本c/L链嵌合抗体、以及H链人源化版本d/L链嵌合抗体的抗原结合活性的图。

图7是比较H链嵌合/L链嵌合抗体、H链人源化版本b/L链嵌合抗体、H链人源化版本c/L链嵌合抗体、H链人源化版本d/L链嵌合抗体对人TF的中和活性的图。

图8是比较H链嵌合/L链嵌合抗体、H链人源化版本b/L链人源化版本a抗体对人TF的中和活性的图。

图9是比较H链嵌合/L链嵌合抗体、H链嵌合/L链人源化版本b抗体、以及H链嵌合/L链人源化版本c抗体的抗原结合活性的图。

图10是比较H链嵌合/L链嵌合抗体、H链嵌合/L链人源化版本b抗体、以及H链嵌合/L链人源化版本c抗体对人TF的中和活性的图。

图11是比较H链嵌合/L链嵌合抗体、H链人源化版本b/L链人源化版本b抗体、以及H链人源化版本b/L链人源化版本c抗体的抗原结合活性的图。

图12是比较H链嵌合/L链嵌合抗体、H链人源化版本b/L链人源化版本b抗体、以及H链人源化版本b/L链人源化版本c抗体对人TF的中和活性的图。

图13是比较H链嵌合/L链嵌合抗体、H链人源化版本b/L链人源化版本b抗体、以及H链人源化版本d/L链人源化版本b抗体的抗原结合活性的图。

图14是比较H链嵌合/L链嵌合抗体、H链人源化版本b/L链人源化版本b抗体、以及H链人源化版本d/L链人源化版本b抗体对人TF的中和活性的图。

图15是比较H链嵌合/L链嵌合抗体、H链人源化版本e/L链嵌合抗体、H链人源化版本e/L链嵌合抗体、以及H链人源化版本e/人源化版本b抗体的抗原结合活性的图。

图16是比较H链嵌合/L链嵌合抗体、以及H链人源化版本e/L链嵌合抗体对人TF的中和活性的图。

图17是比较H链嵌合/L链嵌合抗体、以及H链人源化版本g/L链人源化版本b的抗原结合活性的图。

图18是比较H链嵌合/L链嵌合抗体、以及H链人源化版本g/L链人源化版本b抗体对人TF的中和活性的图。

图19是比较H链嵌合/L链嵌合抗体、H链人源化版本b3/L链人源化版本b抗体、以及H链人源化版本d3/L链人源化版本b抗体的抗原结合活性的图。

图20是比较H链嵌合/L链嵌合抗体、H链人源化版本b3/L链人源化版本b抗体、以及H链人源化版本d3/L链人源化版本b抗体对人TF的中和活性的图。

图21是比较H链嵌合/L链嵌合抗体、H链人源化版本i/L链嵌合抗体、以及H链人源化版本j/L链嵌合抗体的抗原结合活性的图。

图22是比较H链嵌合/L链嵌合抗体、H链人源化版本i/L链人源化版本b抗体、以及H链人源化版本j/L链人源化版本b抗体的抗原结合活性的图。

图23是比较H链嵌合/L链嵌合抗体、H链人源化版本i/L链嵌合抗体、以及H链人源化版本j/L链嵌合抗体对人TF的中和活性的图。

图24是比较H链嵌合/L链嵌合抗体、H链人源化版本b/L链人源化版本b抗体、H链人源化版本i/L链人源化版本b抗体、以及H链人源化版本j/L链人源化版本b抗体对人TF的中和活性的图。

图25是比较H链嵌合/L链嵌合抗体、H链嵌合/L链人源化版本b1抗体、以及H链嵌合/L链人源化版本b2抗体的抗原结合活性的图。

图26是比较H链嵌合/L链嵌合抗体、H链嵌合/L链人源化版本b1抗体、以及H链嵌合/L链人源化版本b2抗体对人TF的中和活性的图。

图27是比较H链嵌合/L链嵌合抗体、H链人源化版本b/L链人源化版本b2抗体的抗原结合活性的图。

图28是比较H链嵌合/L链嵌合抗体、H链人源化版本i/L链人源化版本b抗体、H链人源化版本b/L链人源化版本b抗体、以及H链人源化版本b/L链人源化版本b2抗体对人TF的中和活性的图。

图29是比较H链嵌合/L链嵌合抗体、H链人源化版本i/L链人源化版本b1抗体、以及H链人源化版本i/L链人源化版本b2抗体的抗原结合活性的图。

图30是比较H链嵌合/L链嵌合抗体、H链人源化版本i/L链人源化版本b抗体、H链人源化版本i/L链人源化版本b1抗体、以及H链人源化版本i/L链人源化版本b2抗体对人TF的中和活性的图。

图31是比较H链嵌合/L链嵌合抗体、H链人源化版本b/L链人源化版本b抗体、H链人源化版本i/L链人源化版本b抗体、以及H链人源化版本i/L链人源化版本b2抗体d的抗原结合活性的图。

图32是比较H链嵌合/L链嵌合抗体、H链人源化版本b/L链人源化版本b抗体、H链人源化版本i/L链人源化版本b抗体、以及H链人源化版本i/L链人源化版本b2抗体对人TF的中和活性(TF的因子Xa生成抑制活性)的图。

图33是比较H链嵌合/L链嵌合抗体、H链人源化版本b/L链人源化版本b抗体、H链人源化版本i/L链人源化版本b抗体、以及H链人源化版本i/L链人源化版本b2抗体对人TF的中和活性(因子X结合抑制活性)的图。

图34是比较H链嵌合/L链嵌合抗体、H链人源化版本b/L链人源化版本b抗体、H链人源化版本i/L链人源化版本b抗体、以及H链人源化版本i/L链人源化版本b2抗体对人TF的中和活性(TF的血浆凝固抑制活性)的图。

图35是比较H链嵌合/L链嵌合抗体、H链人源化版本b/L链人源化版本b抗体、H链人源化版本i/L链人源化版本b抗体、以及H链人源化版本i/L链人源化版本b2抗体对在各种条件下处理的TF的反应性的图。

发明的实施方案

以下详细地说明本发明。1．小鼠抗人TF的单克隆抗体的制作

小鼠抗人TF的单克隆抗体是通过从用抗原免疫动物得到的产生抗体细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合制作杂交瘤，从得到的杂交瘤选择产生特异抑制TF活性的抗体的克隆制作的。

即、使从人胎盘纯化的TF作为抗原免疫的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合制作杂交瘤。在杂交瘤的筛选中，抗体与TF的结合能力通过使用TF高表达细胞株J82的Cell-ELISA，以对凝血因子X(Factor X:FX)活化的抑制活性作为指标的测定系统对TF的中和能力进行测定的。其结果成功地建立了产生6种强烈抑制TF/Ⅶa复合物的FX活化的抗体的杂交瘤。(1)抗原的制作

作为用于免疫动物的TF，可以用通过重组DNA方法或化学合成制作的含有一部分TF氨基酸序列的肽、或来自人胎盘的TF等。例如可以使用按照Ito等人的方法(Ito T.等人，生物化学杂志(J.Biochem.)114,691-696,1993)从人胎盘纯化的TF作为抗原。

得到的人TF与佐剂混合，用作抗原。作为佐剂有弗罗因德完全佐剂、弗罗因德的不完全佐剂等，与它们中任一个混合都可以。(2)免疫和挑选产生抗体的细胞

将象上述那样得到的抗原免疫非人哺乳动物、例如小鼠、大鼠、马、猴、家兔、山羊、绵羊等哺乳动物。免疫只要是已有的方法，任一方法都可以用，主要是通过静脉内注射、皮下注射、腹腔注射等方式进行。而免疫的间隔没有特别限定，间隔可从数日到数周，最好是在4～21日间隔内免疫。

最终免疫日后的2～3日后采集产生抗体的细胞。产生抗体的细胞有脾细胞、淋巴细胞、末梢血细胞，一般用脾细胞。抗原的免疫量，一次每只小鼠用0.1～100μg。(3)抗体效价的测定

为了对免疫的动物的免疫应答水平进行确认、而从细胞融合处理后的细胞中选择目的杂交瘤，对免疫的动物的血中的抗体效价、或产生抗体的细胞的培养上清中的抗体效价进行测定。

作为检测抗体的方法有众所周知的技术、例如EIA(酶免疫分析)、RIA(放射性免疫分析)、ELISA(酶联免疫吸附分析)等方法。(4)细胞融合

作为与产生抗体细胞融合的骨髓瘤细胞可以使用取自小鼠、大鼠、人等各种动物的骨髓瘤细胞，本领域技术人员一般能获得的细胞株。作为使用的细胞株可以使用具有抗药性，具有在未融合状态不能在选择性培养基(例如HAT培养基)中生存、只有在融合状态能生存的性质的细胞株。一般使用抗8-氮鸟嘌呤株，该细胞株是缺少次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能在含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和脱氧胸腺嘧啶核苷(HAT)的培养基生存的细胞株。

骨髓瘤细胞最好使用众所周知的各种细胞株，例如，P3(P3x 63 Ag8.653)(免疫学杂志(J.Immunol.),123,1548-1550,1979),P3x 63 Ag8.1当代微生物学与免疫学论题(Current Topics in Micro biology andImmunology,81,1-7,1979),NS-1(Kohler,G.和Milstein,C欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)6,511-519,1976),MPC-11(Margulies.D.H.细胞(Cell)8,405-415,1976),SP2/0(Shulman,M.等,自然(Nature),276,269-270,1978),FO(de St.Groth,S.F.等，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods),35,1-21,1980),S194(Trowbride,I.S实验医学杂志(J.Exp.Med.),148,313-323,1978),R210(Ggalfre,G.等自然(Nature),277,131-133,1979)等细胞株。

产生抗体的细胞可从脾细胞、淋巴结细胞等获得。即从上述各种动物摘出或提取脾脏、淋巴结等，并进行组织破碎。将得到的破碎物悬浮于PBS、DMEM、RPMI1640等培养基或缓冲液中，用不锈钢筛过滤后，通过离心制作产生抗体的目的细胞。

然后使上述骨髓瘤细胞与产生抗体细胞融合。

在MEM、DMEM、RPMI1640培养基等动物细胞培养用培养基中，在有融合促进剂存在下、30～37℃温度条件下使骨髓瘤细胞与产生抗体细胞的混合比例为1∶1～1∶10，使这两种细胞接触5分钟来进行细胞融合。为了促进细胞融合，可以使用平均分子量为1000～6000的聚乙二醇、聚乙烯醇或仙台病毒等融合促进剂或融合病毒。另外，使用采用电刺激(例如电穿孔)的市售的细胞融合装置也可以使产生抗体细胞与骨髓瘤细胞融合。(5)杂交瘤的选择和克隆

从细胞融合处理后的细胞中对目的杂交瘤细胞进行筛选。其方法有利用在选择性培养基中进行细胞选择增殖的方法等。即将细胞悬浮液用适当的培养基稀释后，铺在微量滴定板上，各个孔中加入选择培养基(HAT培养基等)，以后适当地交换选择性培养基进行培养。其结果生存下来的细胞可以作为杂交瘤。

杂交瘤的筛选可以利用极限稀释法、荧光细胞激活分类器法等进行，最终获得产生单克隆抗体的杂交瘤。

产生单克隆抗体的杂交瘤的选择可以将各种测定体系配合起来进行。例如，将象Cell-ELISA那样的抗原识别测定体系或以Factor Xa活性为指标的TF中和活性测定体系、像血浆凝固抑制活性测定体系那样的中和活性测定体系配合起来可以获得具有所期望活性的产生单克隆抗体的杂交瘤。这样筛选可以获得象ATR-2、ATR-3、ATR-4、ATR-5、ATR-7和ATR-8那样产生单克隆抗体的杂交瘤。(6)单克隆抗体的采集

从得到的杂交瘤采集单克隆抗体的方法有通常的细胞培养法或腹水形成法等方法。

在细胞培养法中，将杂交瘤在含有10～20％胎牛血清的RPMI1640培养基、DMEM培养基或无血清培养基等动物细胞培养基中于通常的培养条件下(例如37℃,5％CO₂浓度)培养2～14天，从其培养上清中获得抗体。

在腹水形成法中，向哺乳动物的腹腔内注射杂交瘤(该动物与骨髓瘤细胞来源的哺乳动物同种)，使杂交瘤大量增殖。然后于1～4周后采集腹水或血清。

在上述抗体的采集方法中，需要对抗体进行纯化时，可以适当地选择硫铵盐析法、离子交换层析法、亲和层析法等众所周知的方法，或将这些方法配合起来进行纯化。2．编码小鼠抗人TF的单克隆抗体的V区的DNA的克隆(ⅰ)mRNA的制备

为了进行编码小鼠抗人TF的单克隆抗体的H链和L链V区的DNA的克隆，从收集的杂交瘤通过众所周知的方法，例如利用胍-超离心法(Chirgwin,J.M.等人、生物化学Biochemistry, (1979),18,5294-5299)、AGPC法(Chomezynski,P等人(1987),162,16-159)等制备总RNA,通过mRNA纯化试剂盒(Pharmacia Biotech)附带的寡聚(dT)-纤维素span柱等制备mRNA。另外使用QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia Biotech)，不经过提取总RNA操作也可以制作mRNA。(ⅱ)cDNA的制备和扩增

从上述(ⅰ)中得到的mRNA使用逆转录酶分别合成L链和H链的V区中的cDNA。cDNA的合成可以使用与Oligo-dT引物或L链C区或H链C区进行杂交的适当的引物(例如试剂盒附带的cDNA合成引物)。

cDNA合成反应是将上述mRNA与引物混合，在逆转录酶存在下例如于52℃反应30分钟。

cDNA的扩增是按照L链以及H链都使用5′-Ampli FINDER RACE试剂盒(CLONTECH公司)的5′-RACE法(Frohman,M.A.等美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.USA)85,8998-9002,1988,Belyavsky,A．等核酸研究(Nucleic Acids Res.)17,2919-2932,1989)通过PCR(聚合酶链式反应)实现的。即在上述合成的cDNA两条链的两端连接cDNA衔接物，就编码H链V区和L链V区的片段的DNA(以下也有时将编码L链V区的简称A略记为“L链V区DNA”或“编码L链V区的DNA”(H链V区也一样))进行PCR。

作为扩增H链V区的DNA的引物，例如对于5′-端引物可以使用试剂盒附带的衔接引物1，对于3′-端引物可以使用小鼠抗体的H链恒定区MHC-G1引物(序列号1)(ATR-2、ATR-3、ATR-4和ATR-5)(Cγ1区)或MHC-G2a引物(序列号2)(ATR-7和ATR-8)(Cγ2a区)(S.T.Jones，生物技术(Biotechnology),9,88,1991)。而作为扩增L链V区的DNA的引物，例如对于5′-端引物可以使用试剂盒附带的衔接引物1，对于3′-端引物可以使用小鼠抗体的L链κ链恒定区(Cκ区)引物(例如含有序列号3表示的碱基序列的MKC引物)。(ⅲ)DNA的纯化和碱基序列的确定

就PCR产物按照众所周知的方法进行琼脂糖凝胶电泳，切出目的DNA片段后，进行DNA回收以及纯化，然后与载体DNA连接。

DNA的纯化可以用酚和氯仿萃取(J.Sambrook等，《分子克隆实验手册》“Molecular Cloning，冷泉港实验室出版社Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)或使用市售的试剂盒进行纯化。对于将携带DNA片段的载体DNA可以使用众所周知的载体(例如pUC19、Bluescript等)。

使用常用的连接试剂盒(宝酒造制造)连接上述DNA和上述载体，获得重组载体。然后将获得的重组载体导入大肠杆菌JM109感受态细胞(Nippongene)，挑选抗氨苄青霉素的菌落，按照常规方法制备载体DNA(J.Sambrook等，《分子克隆实验手册》“Molecular Cloning”，冷泉港实验室出版社Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。目的DNA的碱基序列是在将上述载体DNA用限制酶消化后通过常用方法(例如双脱氧法)确定的(J.Sambrook等，《分子克隆实验手册》“MolecularCloning”，冷泉港实验室出版社Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。在本发明中，可以使用自动碱基序列测定仪(DNA Sequencer373A,Perkin-Elmer)。(ⅳ)互补决定区(CDR)

H链V区和L链V区形成抗原结合部位，其整个构造相互具有类似性。即每4个框架区(FR)部分是通过3个超可变区、即互补决定区(CDR)连接的。FR的氨基酸序列比较保守，而CDR区的氨基酸序列的变异性非常高(Kabat,E.A.等，《有免疫学意义的蛋白质的序列》“Sequence ofProteins of Immunological Interest”美国卫生部，US Dept.Health andHuman Services,1983)。

上述4个FR的许多部分都呈现β-折叠片构造，结果3个CDR形成一个环。有时CDR也形成β-折叠片的一部分。因此3个CDR通过FR在立体上相互保持在非常近的位置，于是FR与成对的区域的3个CDR共同形成抗原结合部位。

根据这样的事实，将小鼠抗人TF单克隆抗体的可变区的氨基酸序列套用到由Kabat等人制作的抗体的氨基酸序列数据库(Kabat,E.A.等，《有免疫学意义的蛋白质的序列》“Sequence of Proteins ofImmunological Interest”美国卫生部，US Dept.Health and HumanServices,1983)，通过检索同源性可以找出CDR区。

CDR区序列在制作人源化抗体时只要能保持对人TF的结合活性和中和活性的范围内，那么通过插入、置换或缺失形成的变异体也包含在本发明内。例如与序列号133-138的各个CDR或与序列号139-141,143-144,145-147以及149-150的V区中的各个CDR区同源性为90～100％的序列。优选同源性为95～100％的序列，更优选的同源性为98～100％的序列。3．嵌合抗体的表达载体的制作

只要编码小鼠单克隆抗体的小鼠L链(以下表示抗体的L链或H链时，关于小鼠的也可简写为“小鼠L链”，关于人抗体的H链简写为“人H链”)以及H链V区的DNA片段能被克隆，将编码这些小鼠V区的DNA与编码人抗体恒定区的DNA连接使其表达，可得到嵌合抗人TF抗体。

制作嵌合抗体的基本方法包括将已经存在于克隆的cDNA中的小鼠前导序列和V区序列与编码已经存在于哺乳类细胞的表达载体中的人抗体C区的序列连接。或者是将已经存在于克隆的cDNA中的小鼠前导序列和V区序列与编码人抗体C区的序列连接后，与哺乳类细胞表达载体连接。

人抗体C区的片段可以作成任意的人抗体的H链C区以及人抗体的L链C区的片段，例如有关人H链的片段可举出Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4，以及L链的片段可举出Cλ或Cκ等。

为了制造嵌合抗体，制作在有象增强子/启动子系列那样的表达调控区下含有编码小鼠H链V区和人H链C区DNA的表达载体，以及在有象增强子/启动子系列那样的表达调控区下含有编码小鼠L链V区和人L链C区的DNA的单一的表达载体(例如，参照WO94/11523)。然后用该表达载体同时转化象哺乳类细胞那样的宿主细胞，再将转化的细胞在体外或体内进行培养制造嵌合抗体(例如可参照WO91/16928)。对于单一表达载体可以使用IgG1κ型抗体表达载体N5KG1(V)以及IgG4κ型抗体表达载体N5KG4P。(ⅰ)嵌合抗体H链的构建

嵌合抗体H链表达载体可以通过将编码小鼠H链V区的cDNA导入到含有编码人抗体的H链C区的DNA的适当的表达载体中得到。作为H链C区例如可以举出Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4。

这里，在将编码小鼠H链V区的cDNA插入到表达载体时，利用PCR法可以向该cDNA导入适当的碱基序列。例如为了使该cDNA 5’-末端含有适当的限制酶的识别序列，而使转录效率提高，可以使用使紧靠该cDNA的起始密码子处含有Kozak共有序列(Kozak,M.等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.),196,947-950,1987)那样设计的PCR引物，以及使该cDNA3’-末端含有适当的限制酶的识别序列而设计的PCR引物，进行PCR，将这些合适的碱基序列导入表达载体。

将这样构建的编码小鼠H链V区的cDNA用适当的限制酶处理后，插入到上述表达载体中，构建含有编码H链C区(Cγ1或Cγ4)的DNA的嵌合H链表达载体。(ⅱ)含有编码嵌合抗体L链κ链的cDNA的表达载体的构建

嵌合抗体L链表达载体可以通过将编码小鼠L链V区的cDNA导入含有编码人抗体的L链C区的DNA的适当的表达载体中得到。作为L链C区例如Cκ、Cλ区。

在构建含有编码小鼠L链V区的cDNA的表达载体时，利用PCR法可以向该cDNA导入适当的碱基序列。例如为了使5’-末端含有适当的限制酶的识别序列，而使转录效率提高，可以使用含有Kozak共有序列那样设计的PCR引物，以及为了使3’-末端含有适当的限制酶的识别序列那样设计的PCR引物，进行PCR，将这些适当的碱基序列导入cDNA。

将这样构建的编码小鼠L链V区的cDNA用适当的限制酶处理后，插入到上述表达载体中，构建含有编码L链C区(Cκ区)的DNA的嵌合L链表达载体。4．人源化抗体的制作(1)与人抗体同源性的检索

为了制作将小鼠单克隆抗体的CDR移植到人抗体的人源化抗体，希望小鼠单克隆抗体的FR和人抗体的FR之间存在很高的同源性。因此将小鼠抗人TF单克隆抗体的H链和L链的V区与用Data Bank已经阐明构造的所有已知抗体的V区进行比较。另外同时与Kabat等人根据抗体的FR的长度、氨基酸的同源性等分类的抗体的亚类(人亚类HSG:Humansubgroup)(Kabat,E.A.等、US Dept.Health and Human Services.USgovernment Printing Offices,1991)进行比较。

对于人H链V区，根据Kabat等人进行的HSG分类可以分类为HSGⅠ～Ⅲ，例如，小鼠抗人TF单克隆抗体ATR-5的H链V区与HSGⅠ的共有序列有67.8％的同源性。另外，人L链κ链V区根据Kabat等人进行的HSG分类可以分类为HSGⅠ～Ⅳ，例如，小鼠抗人TF单克隆抗体ATR-5的L链κ链V区与HSGⅠ的共有序列有72.3％的同源性。

按照以往的技术对小鼠抗体进行人源化时，根据需要，为了使人源化V区的CDR的构造更接近原来的小鼠抗体的构造，有时将支持CDR的小鼠抗体的V区的FR的一部分氨基酸序列移植到人V区的FR上。然而有关应当将小鼠抗体的V区的FR中什么样的氨基酸移植到人抗体V区的FR上，没有一定的规则。因此为了保持CDR的构造对必需的氨基酸进行特别确定需要作出更大的努力。

另外，存在着对FR的一部分从小鼠抗体的V区移植到人V区的氨基酸序列产生人抗体的危险性。在本发明中，由于将在人源化抗体中除去CDR的全部氨基酸序列作为来自人抗体的氨基酸序列，所以就保持CDR的立体构造需要的4个FR(FR1～4)，以一个FR作为单位，检索与数据库中存在的小鼠抗体的FR同源性高的人抗体的FR。以下给出了有关单克隆抗体ATR-5的H链和L链的V区的各个FR与数据库进行同源性检索的结果。表1FR的No 登记号与小鼠抗体H链V区的序列号

各个FR的同源性(％)H链FR1 L39130 53.0 110H链FR2 L39130 92.9 111

P01742 71.4 112

Z80844 78.6 113H链FR3 L39130 62.5 114

Z34963 71.9 115

P01825 53.1 116

M62723 68.8 117

Z80844 68.8 118

L04345 65.6 119

S7832 2 75.0 120

Z26827 56.3 121

U95239 65.6 122

L03147 65.6 123H链FR4 L39130 90.9 124表2FR的No 登记号与小鼠抗体L链V区的序列号

各个FR的同源性(％)L链FR1 Z37332 78.3 125L链FR2 X37332 80.0 126

S65921 80.0 127

X93625 80.0 128L链FR3 X37332 71.9 129

S68699 75.0 130

P01607 71.9 131L链FR4 X37332 90.0 132(2)编码人源化抗体V区的DNA的设计

在编码人源化抗体V区的DNA设计中的第一阶段是选择作为设计基础的人抗体V区的各个FR。而在FR改组中，需要在各个FR中选择变异高的人抗体V区FR，

在本发明中，关于单克隆抗体ATR-5的H链，从与小鼠抗体H链整个V区和各个FR的同源性检索的结果，就FR2可以选择出3种，就FR3可以选择出10种人抗体V区FR。关于L链从与小鼠抗体L链整个V区和各个FR的同源性检索的结果，就FR2可以选择出3种，就FR3可以选择出3种人抗体V区FR。

对于人源化H链和L链V区，作为第一版本(版本a:ver.a)，可以选择分别与小鼠单克隆抗体ATR-5的H链和L链V区同源性高的人抗体H链和L链V区L39130和Z37332。在制作这些人源化抗体时，为了容易进行FR改组可以在各CDR内部和FR的适当部位设计适当的限制酶识别部位。通过这样设计，很容易地只对任一个FR进行替换成为可能。

例如，人源化H链CDR1的限制酶EcoT22Ⅰ识别部位、CDR2的限制酶Ba1Ⅰ识别部位、CDR3的限制酶NcoⅠ识别部位和FR3的限制酶XhoⅠ识别部位，例如，人源化L链CDR1的限制酶AflⅡ识别部位、CDR2的限制酶SpeⅠ识别部位、CDR3的限制酶PstⅠ识别部位和FR3的限制酶AccⅢ识别部位。

以这样设计的版本a为基础，就各个FR进行FR改组，可以制作具有所期望活性的人源化抗体。(3)人源化抗体V区片段的制作

对于本发明的人源化抗体，该抗体的C区以及V区的FR是来自人抗体的FR，V区的CDR来自小鼠抗体。对于本发明的人源化抗体的V区的片段，如果作为模板的人抗体的DNA片段能够得到的话，通过利用PCR的所谓CDR移植(CDR-grafting)手法可以制作。所谓CDR移植就是制作编码来自小鼠的CDR的DNA片段，改换为以此DNA片段为模板的人抗体的CDR的手法。

另外，如果作为模板的人抗体的DNA片段不能得到时，用DNA合成仪合成数据库注册的碱基序列，利用PCR法可以制作人源化抗体V区。另外，只注册了氨基酸序列数据的情况下，以该氨基酸序列为基础根据Kabat,E.A.等人报道(US Dept.Health and Human Services.USgovernment Printing Offices,1991)的抗体的密码使用频率，可以类推出整个碱基序列。用DNA合成仪合成该碱基序列，利用PCR法可以制作人源化抗体V区的片段。(ⅰ)编码人源化H链V区的DNA和表达载体的构建

在本发明中，从数据库中获得编码作为人源化抗体的模板的人抗体的H链V区的基因，用DNA合成仪合成编码人源化的H链V区的DNA的整个碱基序列，利用PCR法可以构建。例如，可以将具有与小鼠抗人TF单克隆抗体ATR-5的H链V区高同源性的L39130制作成人源化H链V区版本“a”。为了制作人源化H链V区版本“a”，例如，特别使用序列号22～26所示的5条引物以及序列号27、28所示的2条外部引物。

CDR移植引物hR5Hv1S (序列号22)、hR5Hv2S(序列号23)、hR5Hv4S(序列号24)含有有意义DNA序列，而CDR移植引物hR5Hv3A(序列号25)和hR5Hv5A(序列号26)含有反意义DNA序列，而在各个引物的两端含有18-35bp的互补序列。将hR5Hv1S设计为含有Kozak共有序列(Kazak,M，等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)196,947-950,1987)和SalⅠ识别部位，将hR5Hv5A设计为含有NheⅠ识别部位。而外部引物hR5HPrS(序列号27)和hR5HvPrA(序列号28)与CDR移植引物hR5Hv1S和hR5Hv5A具有同源性。

利用PCR法，使5条引物组装，合成全长的cDNA，再加入外部引物，进行DNA扩增。所谓利用PCR法进行的组装指的是hR5Hv1S、hR5Hv2S、hR5Hv4S、hR5Hv3A和hR5Hv5A通过它们的互补序列进行退火，合成全长人源化H链V区的DNA。

人抗体H链C区可以是任意的人H链C区，例如可以是人H链Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4。

象上述那样构建的人源化抗体H链V区的DNA可以与任意人抗体H链C区、例如人H链C区Cγ1或Cγ4的DNA连接。就象在嵌合抗体H链的构建中叙述的那样，用适当的限制酶处理后，在象增强子/启动子体系那样的表达调控区下与编码人H链C区的DNA连接，制作含有人源化H链V区和人H链C区的DNA的表达载体。(ⅱ)编码人源化L链V区的DNA以及表达载体的构建

在本发明中，与编码H链V区的DNA一样，从数据库中获得编码作为人源化抗体模板的人抗体的L链V区的基因，用DNA合成仪合成编码人源化的L链V区的DNA的整个碱基序列，利用PCR法可以构建。例如，可以将具有与小鼠抗人TF单克隆抗体ATR-5的L链V区高同源性的Z37332制作成人源化L链V区版本“a”。

为了制作人源化L链V区版本“a”，CDR移植引物h5Lv1S(序列号85)、h5Lv4S(序列号86)含有有意义DNA序列，而CDR移植引物h5Lv2A(序列号87)和h5Lv5A(序列号89)含有反意义DNA序列，而在各个引物的两端含有20bp的互补序列。将引物h5Lv1S设计为含有Kozak共有序列(Kozak,M,等人、分子生物学杂志(J.Mol.Biol.196,947-950,1987))和限制酶BglⅡ识别部位，将h5Lv5A设计为含有限制酶SplⅠ识别部位。而外部引物h5LvS(序列号90)和h5Lv5 A(序列号91)与CDR移植引物hSLv1S和h5Lv5A具有同源性。

与人源化H链V区一样，可以利用PCR法，将5条引物组装合成全长的cDNA，再加入外部引物，进行DNA扩增。

人抗体L链C区可以是任意的人L链C区，例如可以是人L链Cλ或Ck。

象上述那样构建的人源化抗体L链V区的DNA可以与任意人抗体L链C区、例如人L链C区Cκ或Cλ区的DNA连接。用适当的限制酶处理后，在象增强子/启动子体系那样的表达调控区下与编码人L链κ链C区的DNA连接，制作含有编码人源化L链V区和人H链κ链C区DNA的表达载体。

象上述那样，即使制作了人源化抗体的V区片段，该V区片段是否具有作为抗体的活性(对抗原的结合活性、中和活性等)也未必清楚。因此，有必要通过与人源化H链的组合利用象COS-7那样的动物细胞表达，研究有无活性。(ⅲ)人源化抗体的H链和L链V区的FR改组

本发明人使含有制作的人源化H链和L链V区的人源化抗体在象COS-7那样的动物细胞中瞬时表达，就抗原结合活性以及中和活性进行研究，结果表明虽然有抗原结合活性和中和活性，但与嵌合抗体相比较，显得不高。

本发明人通过依次改组人源化H链和L链V区的各个FR，可以解决这个问题。在FR的改组中使用的人抗体可以从已有的数据库中选择。选择的人抗体的FR以数据库中已阐明的碱基序列为基础，通过DNA合成仪可以合成。此时如前所述，通过在CDR或FR附加设计的限制酶识别序列，容易改组为上述制作的人源化抗体的H链和L链V区的FR。通过考查这样制作的人源化抗体的活性，可以获得有所期望的抗原结合活性和中和活性的人源化抗体。

例如，可以将人源化抗体V区H链FR3改换为来自人抗体Z34963(GenBank,Borretzen M.等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.),91,12917-12921,1994)的FR3。

FR-改组引物F3RFFS(序列号35)和F3RFBS(序列号36)含有有意义DNA,F3RFFA(序列号37)和F3RFBA(序列号38)含有反意义DNA序列。FR-改组引物F3RFFS、F3RFBS、F3RFFA、 F3RFBA可以通过DNA合成仪合成。

使F3RFFS和F3RFFA、F3RFBS和F3RFBA退火，分别用BalⅠ和XhoⅠ、NcoⅠ和XhoⅠ消化。将它们导入通过BalⅠ和NcoⅠ消化制备的质粒hATR5Hva/CVIDEC(Bal I/NcoⅠ)中，通过确认碱基序列可以得到含有正确序列的质粒。这样获得的含有人源化抗体H链的质粒命名为hATR5Hvb/CVIDEC,hATR5Hva/CVIDEC中含有的人源化H链定为版本“b”。其碱基序列和相应的氨基酸序列如序列号39所示，版本“b”的氨基酸序列如序列号40所示。

同样，有关从数据库选择出的来自其他人抗体V区H链和L链的FR也可以改组为人源化抗体V区H链和L链的FR。

为了选择用于进行人源化抗体的H链V区和L链V区的FR改组的更理想的人抗体，可以象以下那样进行。即，通过人源化抗体H链版本“b”和嵌合抗体L链的组合，具有与嵌合抗体或小鼠抗体同等的中和活性。然而如果人源化抗体H链版本“b”和人源化抗体L链版本“a”组合，中和活性将比嵌合抗体或小鼠抗体低。

这种情形下，为了对FR进行改组，选择作为候补的人抗体，例如对人源化抗体H链版本“b”的FR3(登记号No.Z34963：序列号115)进行同源性检索，可以选择与该序列同源性高的人抗体。例如这样选择的人抗体H链V区FR3可举出U95239(序列号122)和L03147(序列号123)。

这样制作的人源化抗体V区H链氨基酸序列如表3和4所示，而人源化抗体V区L链的氨基酸序列如表5所示。

表3

H链V区的氨基酸序列

FR1 CDR1 FR2 CDR2

1 2 3 4 5 6

123456789012345678901234567890 12345 67890123456789 012A3456789012345

L39130(a) QVQLLESGAVLARPGTSVKISCKASGFNIK DYYMH WVKQRPGQGLEWIG GNDPANGHSMYDPKFQG

Z34963(b) ----------------------------------------------------------------------

M30885(c) ----------------------------------------------------------------------

M62723(d) ----------------------------------------------------------------------

Z80844(e) ----------------------------------------------------------------------

L04345(f) ----------------------------------------------------------------------

S78322(g) ----------------------------------------------------------------------

Z26827(h) ----------------------------------------------------------------------

U95239(i) ----------------------------------------------------------------------

L03147(j) ----------------------------------------------------------------------

P01742(b1) --------------------------R-A-----M-----------------------------------

P01742(d1) --------------------------R-A-----M-----------------------------------

Z80844(b3) --------------------------R-A-----------------------------------------

Z80844(d3) --------------------------R-A-----------------------------------------

表4

H链V区的氨基酸序列(续)

FR3 CDR3 FR4

7 8 9 10 11

67890123456789012ABC345678901234 56789012 34567890123

L39130(a) RAKLTAATSASIAYLEFSSLTNEDSAVYYCAR DSGYAMDY WGQGTLVTVSS

234963(b) -VTI--D--TNT--M-L---RS--T-I---------------------------

M30885(c) -VTMLVD--KNQFS-RL--V-AA-T-----------------------------

M62723(d) -VTI--DE-T-T--M-L---RS------F-------------------------

Z80844(e) -VSI--DE-TK---M-LN--RS--T---F-------------------------

L04345(f) -VTI--DT-T-T--M-LR--RSD-T-----------------------------

S78322(g) K-T---DE-S-T--MQL---RS------S-------------------------

Z2G827(h) -VTMS-DK-S-A---QWT--KAS-T-I-F-------------------------

U95239(i) -VTI--D--T-TVFM-L---RS--T----------------------------

L03147(j) -VTF--D---NT--M-LR--RSA-T-----------------------------

P01742(b1) -VTI--D--TNT--M-L---RS--T-I---------------------------

P01742(d1) -VTI--DE-T-T--M-L---RS------F-------------------------

Z80844(b3) -VTI--D--TNT--M-L---RS--T-I---------------------------

Z80844(d3) -VTI--DE-T-T--M-L---RS-------F------------------------

表5

L链V区的氨基酸序列

FR1 CDRl FR2 CDR2

1 2 3 4 5

12345678901234567890123 45678901234 567890123456789 0123456

Z37332(a) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC KASQDIKSFLS WYQQKPGKAPKLLIY YATSLAD

S68699(b) -----------------------------------------------------------

P01607(c) -----------------------------------------------------------

S65921(b1) -------------------------------F------S--T-----------------

X93625(b2) ------------------------------------E----S-----------------

FR3 CDR3 FR4

6 7 8 9 10

78901234567890123456789012345678 901234567 8901234567

Z37332(a) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC LQHGESPYT FGGGTKVEIK

S68699(b) -------------Y---------------------------------------

P01607(c) -------------Y------------I--------------------------

S65921(b1) -------------Y---------------------------------------

X93625(b2) -------------Y---------------------------------------

象上述那样构建的人源化抗体H链和L链V区各个版本可以与任意的人抗体H链C区和L链C区连接，例如可分别与人H链Cγ4和人L链Cκ区的DNA连接。用适当的限制酶处理后，在象增强子/启动子系统那样的表达调控区的调控区下与编码人H链Cγ4和L链Cκ区的DNA连接，制作含有编码人源化H链和L链V区各版本的DNA与分别编码人H链Cγ4和人L链Cκ区DNA的表达载体。

另外将象上述那样构建的编码人源化抗体H链和L链C区的DNA和人源化L链及人L链C区的DNA导入单一的表达载体(例如参照WO94/11523)，然后用该表达载体转化宿主细胞，再将转化的宿主在体外或体内进行培养，可以使其产生人源化抗体。5．嵌合抗体和人源化抗体的制造

为了制造嵌合抗体或人源化抗体，将编码H链V区和H链C区的DNA以及编码L链V区和L链C区的DNA与单一载体连接，转化适当的宿主细胞，可以使其产生抗体。即为了表达嵌合抗体，在象增强子/启动子系统那样的表达调控区的调控下，将存在于克隆的cDNA中的编码小鼠前导序列和小鼠H链V区和人H链C区的DNA、以及编码小鼠前导序列和小鼠L链V区和人L链C区的DNA导入单一的表达载体(例如，参照WO94/11523)。

为了表达人源化抗体，在象增强子/启动子系列那样的表达调控区的调控下，将编码人源化H链V区和人H链C区的DNA、编码人源化L链V区和人L链C区的DNA导入单一的表达载体(例如，参照WO94/11523)。然后用这些载体转化宿主细胞，将被转化的宿主在体内或体外培养，使其产生目的嵌合抗体或人源化抗体。

另外可以制作含有H链V区和L链V区的各2种表达载体。即、对于嵌合抗体来说，制作在象增强子/启动子系统那样的表达调控区的调控下含有编码小鼠H链V区和人H链C区的DNA的表达载体，以及制作在象增强子/启动子系统那样的表达调控区的调控下含有编码小鼠L链V区和人L链C区的DNA的表达载体，而对于人源化抗体，制作在象增强子/启动子系统那样的表达调控区的调控下含有编码人源化H链V区和人H链C区的DNA的表达载体，以及制作在象增强子/启动子系统那样的表达调控区的调控下含有编码人源化L链V区和人L链C区的DNA构成的表达载体。

或者，对于嵌合抗体来说，制作在象增强子/启动子系统那样的表达调控区的调控下含有编码小鼠H链V区和人H链C区的DNA以及编码小鼠L链V区和人L链C区的DNA的表达载体；而对于人源化抗体，制作在象增强子/启动子系统那样的表达调控区的调控下含有编码人源化H链V区和人H链C区的DNA以及编码人源化L链V区和人L链C区的DNA构成的表达载体。

然后用这些表达载体同时转化象哺乳类细胞那样的宿主细胞，再将转化的细胞在体外或体内进行培养制造嵌合抗体或人源化抗体(例如可参照WO91/16928)。

培养象上述那样用编码目的嵌合抗体或人源化抗体的基因转化的转化体，产生的嵌合抗体或人源化抗体可以从细胞内或细胞外分离纯化至均一为止。

可以使用蛋白A琼脂糖柱对作为本发明目的蛋白质的嵌合抗体或人源化抗体进行分离纯化。此外，也可以使用通常蛋白质分离纯化用的方法，没有任何限制。例如对各种层析、超滤、盐析、透析等方法适当地选择、组合，可以分离纯化嵌合抗体或人源化抗体。

为了制造抗人TF的本发明嵌合抗体或人源化抗体，可以使用任何表达体系。例如，使用真核细胞时，可以有动物细胞(例如建立的哺乳类细胞系)、真菌(丝状菌)细胞或酵母细胞等，使用原核细胞时，可以用细菌细胞(例如大肠杆菌等)等。本发明的嵌合抗体或人源化抗体优选在哺乳类细胞、例如COS细胞或CHO细胞中表达。

这样的情况下，为了在哺乳类细胞中表达可以使用有用的常见的启动子。例如，最好使用人巨细胞病毒前期(human cytomegalovirus immediateearly；HCMV)启动子。含有HCMV启动子的表达载体的例子中有HCMV-VH-VCγ1,HCMV-VL-VCK等，包括来自 pSV2neo的载体(WO92-19759)。

此外作为可用于本发明的于哺乳动物细胞内进行基因表达的启动子，可以使用逆病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿病毒40(SV40)等病毒启动子和人多肽链延伸因子1α(HEF-lα)等来自哺乳动物细胞的启动子。例如，使用SV40启动子时，按照Mulligan等人的方法((自然Nature),277,108,1979)，而使用HEF-1α启动子时，按照Mizushima等人的方法(核酸研究(Nucleic Acids Research(,18,5322,1990)很容易实施。

作为复制原点可以使用来自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头状瘤病毒(BPV)等的复制原点，而为了在宿主细胞系中扩增基因的拷贝数，表达载体可以含有作为选择标记的磷酸转移酶APH(3′)Ⅱ或Ⅰ(neo)基因、胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(DHFR)基因等。6．嵌合抗体和人源化抗体的抗原结合活性以及中和活性的评价(1)利用ELISA测定抗体浓度

获得的纯化抗体的浓度可以利用ELISA进行测定。

抗体浓度测定用的ELISA板按如下操作制备。向ELISA用96孔板(例如Maxisorp,NUNC)的各个孔加入浓度为1μg/ml的山羊抗人IgGγ抗体(BioSource)100μl进行固相化。

用200μl稀释的缓冲液(以下称为DB。例如50mM Tris-HCl、1mMMgCl₂、0.1M NaCl、0.05％Tween20、0.02％NaN₃、1％牛血清白蛋白(BSA)、pH7.2)封闭后，将表达嵌合抗体、或人源化抗体的COS-7细胞或CHO细胞的培养上清、或纯化的嵌合抗体、或人源化抗体阶段稀释后加到各个孔中。然后加入结合了碱性磷酸酶的山羊抗人IgG抗体100μl、加入1mg/ml的底物溶液(Sigma104、对硝基苯磷酸、SIGMA)、然后用微量板读数仪(Bio-Rad)测定405/655nm处的吸光度。作为浓度测定的标准可以用IgG4κ(The Bingding Site)。(2)抗原结合能力的测定

按如下操作制备抗原结合测定用的Cell ELISA板。向细胞培养用96孔板中的60孔加入人膀胱癌细胞J82(ATCC HTB-1)，每孔细胞数为1×10⁶个。然后将培养板置于CO₂培养箱中培养一天(含有10％胎牛血清(GIBCO)的RPMI1640培养基)，使细胞铺满。将培养基倒掉，用300μl的PBS将各孔洗2次。向各孔加入100μl的含有4％多聚甲醛的PBS(以下称之PFA/PBS)，静置于冰上10分钟，使细胞固相化。

将PFA/PBS倒掉，用300μl的PBS将各孔洗2次，用200μl的DB进行封闭。然后向各孔加入100μl含有嵌合抗体或人源化抗体的培养上清、或用DB阶段稀释后的纯化的嵌合抗体或人源化抗体，于室温培养2小时，用RB洗净后，加入100μl的用DB稀释1000倍的结合了碱性磷酸酶的山羊抗人IgGγ抗体(BioSource)。于室温下培养1小时，用RB洗净后，加入底物溶液，然后用微量板读数仪(Bio-Rad)测定405/655nm的吸光度。(3)中和活性的测定

小鼠抗体、嵌合抗体和人源化抗体的中和活性可以通过以来自人胎盘的凝血液酶、Thromborel S(Behringwerke AG)对因子Xa的生成抑制活性为指标进行测定。即，向1.25mg/ml的Thromborel S 10μl和稀释到适当浓度的抗体10μl加入缓冲液(含有5mMCaCl₂、0.1％的BSA)60μl，在96孔板中于室温反应1小时。

然后分别加入3.245μg/ml的人因子X(セルサス实验室)和82.5ng/ml的人因子Ⅶa(Enzyme Research)10μl，于室温反应1小时。加入10μl的0.5M EDTA终止反应，加入50μl发色底物溶液，用微量板读数仪(Bio-Rad)测定405/655nm的吸光度。以没有加抗体的1小时吸光度为100％活性，通过从各个吸光度变化算出的残存活性(％)，测定出中和活性。

发色底物溶液是按照附带的说明书溶解テストチ-ム发色底物S-2222(Chromogenix)，然后用精制水稀释2倍后，以1∶1比例与聚戊烯液(0.6mg/ml hexadimethyline bromide,SIGMA)混合制备的。7．通过人源化抗体和可溶性TF的相互作用解析反应动力学

利用BIACORE可以测定本发明的抗TF抗体的动力学参数、即解离常数(KD)、解离速率常数(kdiss)和结合速率常数(kass)。

将重组型蛋白G固相化于传感器芯片上，使抗体与它结合，作为抗原可以使用纯化的重组型TF(将FLAG peptide tag付在1-219的可溶性TF上)(以下称为可溶性TF)，将制备成各种浓度的可溶性TF作为分析对象。通过从得到的传感图算出动力学参数(解离速率常数kdiss和结合速率常数kass)，可以求出解离常数。关于动力学的解析可以参考“用新型的基于生物传感器的分析体系对单克隆抗体-抗原相互作用进行动力学分析”“Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigen interactionswith a new biosensor based analytical system”(karlsson,R.等(1991)免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods) 145,229-240.)等文献。

本发明的抗TF抗体解离常数(KD)越是小的值，中和活性越好。在本发明的抗TF抗体中，KD值在2.30×10^-8[1/M]以下比较好，若是在2.30×10^-9[1/M]以下更好，而在1.17×10^-9[1/M]以下最好。

而KD是由解离速率常数(kdiss)和结合速率常数(kass)2个参数决定的(KD=kdiss/kass)。因此如果kdiss的值小，而kass值大，显然KD值就变小了。

具体来说，本发明的抗TF抗体，kdiss的值如果在9.52×10^-3[1/sec]以下就可以。kdiss值在9.52×10^-4[1/sec]以下比较好，最好是在6.35×10^-4[1/sec]以下。

而kass的值如果在4.15×10^-4[1/M·sec]以上就可以。kass值在4.15×10⁵[1/M·sec]以上比较好，最好在4.65×10^-5[1/M·sec]以上。

再者kdiss的值如果在9.52×10^-3[1/sec]以下，而kass的值在4.15×10⁴[1/M·sec]以上的抗体也是优选的。

具体来说，本发明的抗TF抗体，KD值处于1.09×10^-10～2.30×10^-8[1/M]范围，优选处于1.09×10^-9～2.30×10^-9[1/M]范围内，最优选处于1.09×10^-9～1.39×10^-8[1/M]范围内。

而kdiss值处于5.06×10^-4～9.52×10^-3[1/sec]范围，优选处于5.06×10^-4～9.52×10^-4[1/sec]之内，最优选为5.06×10^-4～6.49×10^-4[1/sec]。

kass的值处于4.15×10⁴～5.44×10⁵[1/M·sec]范围，优选处于4.15×10⁵～5.44×10⁵ [1/M·sec]之内，最优选为4.65×10⁵～5.44×10⁵[1/M·sec]。

这些KD值、kdiss值和kass值除了通过BIACORE以外也可以通过扫描图解析、或BIACORE等的表面プラズモン共振传感器芯片等得到，但优选利用BIACORE获得。8．人源化抗体对人TF反应性的测定

利用点印迹杂交法可以研究本发明的人源化抗体对非变性TF、非还原下变性TF、还原下变性TF的反应性。

TF可以使用从人组织纯化的，或在CHO细胞等哺乳动物细胞中表达、纯化的TF等，进行研究。而变性剂可以用盐酸胍或SDS等代替尿素，还原剂也可以用2-巯基乙醇等SH还原试剂代替DTT。在人源化抗体的检测中可以使用用各种各样物质标记的抗人IgG抗体。这里所说的标记物质是指，例如放射性物质、生物素、FITC等荧光物质、过氧化物酶和碱性磷酸酶等酶。本发明的抗TF抗体与非变性TF、非还原下变性TF以及还原下变性TF均可发生反应。9．含有人源化抗体为有效成分的医药组合物和DIC治疗剂

为了确认抗人TF的人源化抗体的治疗效果，可以通过将人源化抗人TF抗体给予表现高DIC症状的动物，测定DIC的指标可以确认其治疗效果。

在本发明中使用的抗体是抗人TF的人源化抗体。该抗体是通过与人TF结合，中和人TF活性的抗体，其中优选人源化ATR5抗体。人源化ATR5抗体的制作方法在实施例中有记载。

本发明中使用的抗体通过将盐析法、使用HPLC等凝胶过滤法、使用蛋白A柱等亲和层析法等通常的纯化手段配合使用，可以纯化到高纯度。这样纯化的抗体利用放射免疫测定法(RIA)、酶免疫测定法(EIA、ELISA)、或荧光抗体法(免疫荧光分析，Immunofluorescence Analysis)等通常的免疫学上手段高精度地确认人TF。

含有本发明的抗TF人源化抗体为有效成分的医药组合物和DIC治疗剂可以通过非口服方式经全身或局部给药。例如，可以选择点滴等静脉注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射，可以根据患者的年龄、症状选择适当的给药方法。有效的给药量每一次每1kg体重可在0.01mg至1000mg的范围内选择。或者每个患者10mg/body、优选选自1～1000mg/body的给药量。

含有本发明的抗TF人源化抗体为有效成分的医药组合物和DIC治疗剂按照给药途径程序也可以是含有医药上容许的载体或添加剂的制剂。作为这样的载体和添加物的例子，如水、医药上容许的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、明胶、琼脂、二甘油、甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HAS)、甘露醇、山梨醇、乳糖、容许作为医药添加物的表面活性剂等。使用的添加剂按照本发明的剂型从上述的添加剂中适当地选择一种或选择几种组合使用，并没有限定。

本发明可以提供抗人TF的亲和抗体和人源化抗体以及人源化抗体的制作方法。这些抗体由于在人体内的抗原性低，作为治疗药物是有用的。

下面通过实施例更具体地说明本发明。实施例1．编码小鼠抗人TF单克隆抗体的V区的DNA的克隆(1)mRNA的制备

使用Quick Prep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia Biotech)由杂交瘤ATR-2、ATR-3、ATR-4、ATR-5(IgG1κ)、ATR-7和ATR-8(IgG2aκ)制备mRNA。按照试剂盒附带的处方，将各个杂交瘤细胞在萃取缓冲液中完全匀浆破碎，使用寡聚(dT)-纤维素span柱纯化mRNA，进行乙醇沉淀。将mRNA溶解于萃取缓冲液中。(2)编码小鼠抗体V区的基因的cDNA的制作和扩增(ⅰ)H链V区cDNA的克隆

编码小鼠抗人TF单克隆抗体H链V区的基因的克隆按照5’-RACE法(Frohman,M.A.等美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85,8998-9002,1988,Belyavsky,A.等，核酸研究(Nucleic AcidsRes.)17,2919-2932,1989)进行。在5’-RACE法中，使用MarathoncDNA扩增试剂盒(CLONTECH)，操作按照试剂盒附带的处方进行。

通过以上述那样制备的mRNA大约1μg作为模板，加入试剂盒附带的cDNA合成引物，与逆转录酶于42℃，反应60分钟，进行朝向cDNA的逆转录。再通过用DNA聚合酶Ⅰ、DNA连接酶、RNaseH于16℃下使其反应1.5小时，用T4 DNA聚合酶于16℃下使其反应45分钟，合成双链cDNA。用酚和氯仿萃取双链cDNA，通过乙醇沉淀回收。

通过用T4 DNA连接酶于16℃下反应过夜，在双链cDNA的两端连接cDNA衔接头。反应混合液用10mM Tricine-KOH(pH8.5)、0.1mMEDTA溶液稀释50倍。以此为模板利用PCR扩增编码H链V区的基因。对于5′-端引物可以使用试剂盒附带的衔接头引物1，对于3′-端引物可以使用MHC-G1引物(序列号1)(ATR-2、ATR-3、ATR-4和ATR-5)或MHC-G2a引物(序列号2)(ATR-7和ATR-8)(S.T.Jones，等，生物技术(Biotechnology),9,88-89,1991)。

针对ATR-2、3、4和5抗体H链V区的PCR溶液100μl中含有120mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM KCl、6mM(NH)₂SO₄、0.1％TritonX-100、0.001％BSA、0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、1mMMgCl₂、2.5单位的KOD DNA聚合酶(东洋纺织制造)、30～50pmole的衔接头引物1和MHC-G1引物、以及连接了cDNA衔接头的cDNA的反应混合物1～5μl。

无论进行的那个PCR都使用热循环仪480(Perkin-Elmer)，进行30次循环，每一温度循环为：94℃30秒钟、55℃30秒钟、74℃1分钟。(ⅱ)L链V区cDNA的克隆

编码小鼠抗人TF单克隆抗体L链V区的基因的克隆按照5’-RACE法(Frohman,M.A.等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA) 85,8998-9002,1988,Belyavsky,A.等,核酸研究(Nucleic AcidsRes.) 17,2919-2932,1989)进行。在5’-RACE法中，使用MarathoncDNA扩增试剂盒(CLONTECH)操作按照试剂盒附带的处方进行。通过以上述那样制备的mRNA大约1μg作为模板，加入cDNA合成引物，与逆转录酶于42℃，反应60分钟，进行朝向cDNA的逆转录。

再通过用DNA聚合酶Ⅰ、DNA连接酶、RNaseH于16℃下使其反应1.5小时，用T4 DNA聚合酶于16℃下使其反应45分钟，合成双链cDNA。用酚和氯仿萃取双链cDNA，通过乙醇沉淀回收。通过用T4 DNA连接酶于16℃下反应过夜，在双链cDNA的两端连接cDNA衔接头。反应混合液用10mM TriciRe-KOH(pH8.5)、0.1mM EDTA溶液稀释50倍。以此为模板利用PCR扩增编码L链V区的基因。对于5′-端引物使用衔接头引物1，对于3′-端引物使用MKC引物(序列号3)(S.T.Jones，等,生物技术(Biotechnology),9,88-89,1991)。

PCR溶液在100μl中含有120mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM KCl、6mM(NH₄)₂SO₄、0.1％Triton X-100、0.00l％BSA、0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、1mM MgCl₂、2.5单位的KOD DNA聚合酶(东洋纺织制造)、30～50pmole的衔接头引物1和MKC引物、以及连接了cDNA衔接头的cDNA的反应混合物1μl。

PCR使用热循环仪480(Perkin-Elmer),进行30次循环，每一温度循环为：94℃30秒钟、55℃30秒钟、74℃1分钟。(3)PCR产物的纯化和片段化

用酚和氯仿萃取上述的PCR反应混合液，通过乙醇沉淀回收扩增的DNA片段。通过限制酶XmaⅠ(New England Biolabs)于37℃对DNA片段消化1小时。通过使用了2％到3％的NuSieve GTG琼脂糖(FMCBioProducts)的琼脂糖凝胶电泳分离XmaⅠ消化混合物，切出含有作为H链V区的大约500bp长、作为L链V区的大约500bp长的DNA片段的琼脂糖凝胶片。用酚和氯仿萃取琼脂糖凝胶片，用乙醇使DNA片段沉淀后，溶解于10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA溶液(以下称为TE)10μl。

上述制备的含有编码小鼠H链V区和L链V区的基因的XmaⅠ消化DNA片段和用XmaⅠ消化制备的pUC19质粒载体用DNA连接试剂盒ver.2(宝酒造)，按照附带的处方于16℃反应1小时，进行连接。

将该连接混合物加入到大肠杆菌JM109感受态细胞(日本基因，Nippongene)100μl中，冰上静置30分钟，42℃静置1分钟。

然后加入300μl的高感受态肉汤(Hi-Competence Broth)(日本基因，Nippongene)，于37℃培养1小时后，将该大肠杆菌涂在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基(以下称为LBA琼脂培养基)(分子克隆实验手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)Sambrook等，冷泉港实验室出版社Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)上，于37℃下培养过夜，得到大肠杆菌转化体。

将该转化体在3ml或4ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(以下称为LBA培养基)中于37℃培养过夜，用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)从菌体级分中制备质粒DNA，进行碱基序列的确定。(4)编码小鼠抗体V区的cDNA的基因的碱基序列的确定

上述质粒中的cDNA编码区的碱基序列使用Dye Terminator CycleSequencing FS Ready Reaction Kit(Perkin-Elmer)，通过DNA测序仪373A(Perkin-Elmer)确定。作为确定序列用的引物使用M13引物M4(宝酒造)(序列号4)和M13引物RV(宝酒造)(序列号5)，通过确认两个方向的碱基序列确定序列。

将含有来自于这样得到的杂交瘤ATR-2、ATR-3、ATR-4、ATR-5、ATR-7和ATR-8的编码小鼠H链V区基因的质粒分别命名为ATR-xHv/pUC19(x=2、3、4、5、7或8)，而含有编码小鼠L链V区基因的质粒分别命名为ATR-xLv/pUC19(x=2、3、4、5、7或8)。ATR-xHv/pUC19中含有的编码各个小鼠抗体的H链V区的基因的碱基序列(包括相应的氨基酸序列)分别如序列号6到11所示，而ATR-xLv/pUC19(x=2、3、4、5、7或8)中含有的编码各个小鼠抗体的L链V区的基因的碱基序列(包括相应的氨基酸序列)分别如序列号12到17所示。实施例2.嵌合抗体的构建

制作将小鼠ATR-5抗体V区连接到人抗体C区的嵌合ATR-5抗体。通过将编码ATR-5抗体V区的基因连接到编码人抗体C区的表达载体上构建嵌合抗体表达载体。(1)嵌合抗体H链V区的构建

为了与编码人抗体H链C区的表达载体连接，利用PCR法对ATR-5抗体H链V区进行修饰。5′-端引物ch5HS(序列号18)与编码V区的DNA的5′-末端杂化，而且设计成含有Kozak共有序列(Kozak.M.等分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)196,947-950,1987)和限制酶SalⅠ的识别序列。3′-端引物ch5HA(序列号19)与编码J区的DNA的3′-末端杂交，而且设计成含有限制酶NheⅠ的识别序列。

PCR溶液100μl中含有120mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM KCl、6mM(NH₄)₂SO₄、0.1％Triton X-100、0.001％BSA、0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、1mM MgCl₂、2.5单位的KOD DNA聚合酶(东洋纺织制造)、50pmole的ch5HS引物和ch5HA引物、以及作为模板的1μl质粒ATR5Hv/pUC19。PCR使用DNA热循环仪480(Perkin-Elmer),进行30次循环，每一温度循环为：94℃30秒钟、55℃30秒钟、74℃1分钟。

用酚和氯仿萃取上述的PCR反应混合液，通过乙醇沉淀回收扩增的DNA片段。通过限制酶NheⅠ(宝酒造)于37℃对DNA片段消化1小时。然后用限制酶SalⅠ于37℃消化1小时。通过使用了3％的NuSieve GTG琼脂糖(FMC BioProducts)的琼脂糖凝胶电泳分离该消化混合物，切出含有大约450bp长的DNA片段的琼脂糖凝胶片。用酚和氯仿萃取琼脂糖凝胶片，用乙醇使DNA片段沉淀后，溶解于20μlTE中。

关于克隆载体使用导入了限制酶NheⅠ、SalⅠ以及SplⅠ、BglⅡ的识别序列的改变的pUC19载体(以下称为CVIDEC)。上述制备的含有编码小鼠H链V区的基因片段和通过NheⅠ以及SalⅠ消化制备的CVIDEC载体用DNA连接试剂盒ver.2(宝酒造)，按照附带的处方于16℃反应1小时，进行连接。

将该连接混合物加入到大肠杆菌JM109感受态细胞(Nippongene)100μl中，冰上静置30分钟，42℃静置1分钟。然后加入300μl的Hi-Competence Broth(Nippongene)，于37℃培养1小时后，将该大肠杆菌涂在含有100μg/ml氨苄青霉素的LBA琼脂培养基上，于37℃下培养过夜，得到大肠杆菌转化体。将该转化体在3ml的LBA培养基中于37℃培养过夜，用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)从该菌体级分中制备质粒DNA。

质粒中的cDNA编码区的碱基序列使用Dye Terminator CycleSequencing FS Ready Reaction Kit(Perkin-Elmer)，通过DNA测试仪373A(Perkin-Elmer)确定。作为确定序列用的引物使用M13引物M4(宝酒造)和M13引物RV(宝酒造)，通过确认两个方向的碱基序列确定序列。含有编码该ATR-5抗体H链V区的基因、5′-端带有SalⅠ识别序列和Kozak共有序列、3′-端带有NheⅠ识别序列的质粒命名为chATR5Hv/CVIDEC。(2)嵌合抗体L链V区的构建

为了与编码人抗体L链C区的表达载体连接，利用PCR法对ATR-5抗体L链V区进行修饰。5′-端引物ch5LS(序列号20)与编码V区的DNA的5′-末端杂交，而且设计成含有Kozak共有序列(Kozak.M.等分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)196,947-950,1987)和限制酶BglⅡ的识别序列。3′-端引物ch5LA(序列号21)与编码J区的DNA的3′-末端杂交,而且设计成含有限制酶SplⅠ的识别序列。

PCR溶液100μl中含有120mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM KCl、6mM(NH₄)₂SO₄、0.1％Triton X-100、0.001％BSA、0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、1mM MgCl₂、2.5单位的KOD DNA聚合酶(东洋纺织制造)、50pmole的ch5LS引物和ch5LA引物、以及作为模板的1μl质粒ATR5Lv/pUC19。PCR使用DNA热循环仪480(Perkin-Elmer),进行30次循环，每一温度循环为：94℃30秒钟、55℃30秒钟、74℃1分钟。

用酚和氯仿萃取上述的PCR反应混合液，通过乙醇沉淀回收扩增的DNA片段。利用限制酶SplⅠ(宝酒造)于37℃对DNA片段消化1小时。然后用限制酶BglⅡ于37℃消化1小时。通过使用了3％的NuSieve GTG琼脂糖(FMC BioProducts)的琼脂糖凝胶电泳分离该消化混合物，切出含有大约400bp长的DNA片段的琼脂糖凝胶片。用酚和氯仿萃取琼脂糖凝胶片，用乙醇使DNA片段沉淀后，溶解于20μlTE中。

上述制备的含有编码小鼠L链V区的基因片段和通过SplⅠ以及BglⅡ消化制备的CVIDEC载体用DNA连接试剂盒ver.2(宝酒造)，按照附带的处方于16℃反应1小时，进行连接。

将该连接混合物加入到大肠杆菌JM109感受态细胞(Nippongene)100μl中，冰上静置30分钟，42℃静置1分钟。然后加入300μl的Hi-Competence Broth(Nippongene)，于37℃培养1小时后，将该大肠杆菌涂在含有100μg/ml氨苄青霉素的LBA琼脂培养基上，于37℃下培养过夜，得到大肠杆菌转化体。将该转化体在3ml的LBA培养基中于37℃培养过夜，用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)从菌体级分制备质粒DNA。

质粒中的cDNA编码区的碱基序列使用Dye Terminator CycleSequencing FS Ready Reaction Kit(Perkin-Elmer)，通过DNA测序仪373A(Perkin-Elmer)确定。作为确定序列用的引物使用M13引物M4(宝酒造)和M13引物RV(宝酒造)，通过确认两个方向的碱基序列确定序列。含有编码该ATR-5抗体L链V区的基因、5′-端带有BglⅡ识别序列和Kozak共有序列、3′-端带有SplⅠ识别序列的质粒命名为chATR5Lv/CVIDEC。(3)嵌合抗体表达载体的构建

用从IDEV社引入的抗体表达载体构建嵌合表达载体。在载体中使用了IgG1型抗体表达载体N5KG1(V)和IgG4型抗体表达载体N5KG4P。通过在位于表达载体N5KG1(V)和N5KG4P的人抗体H链C区前面的SalⅠ-NheⅠ部位连接编码ATR-5抗体H链V区的基因，以及在位于人抗体L链C区前面的BglⅡ-SplⅠ部位连接编码ATR-5的L链V区的基因，制作嵌合ATR-5抗体表达载体。(ⅰ)H链V区的导入

质粒chATR5Hv/CVIDEC用限制酶NelⅠ(宝酒造)于37℃消化3小时，然后用限制酶SalⅠ于37℃消化3小时。通过使用了1.5％的NuSieveGTG琼脂糖(FMC BioProducts)的琼脂糖凝胶电泳分离该消化混合物，切出含有大约450bp长的DNA片段的琼脂糖凝胶片。用酚和氯仿萃取琼脂糖凝胶片，用乙醇使DNA片段沉淀后，溶解于20μlTE中。

N5KG1(V)和N5KG4P用限制酶NheⅠ(宝酒造)于37℃消化3小时，然后用限制酶SalⅠ于37℃消化3小时。通过使用了1.5％的NuSieveGTG琼脂糖(FMC BioProducts)的琼脂糖凝胶电泳分离该消化混合物，切出含有大约9000bp长的DNA片段的琼脂糖凝胶片。用酚和氯仿萃取琼脂糖凝胶片，用乙醇使DNA片段沉淀后，溶解于60μlTE中。

上述制备的含有编码H链V区的基因的SalⅠ-NheⅠDNA片段与SalⅠ和NheⅠ消化的N5KG1(V)或N5KG4P用DNA连接试剂盒ver.2(宝酒造)，按照附带的处方于16℃反应1小时，进行连接。

将该连接混合物加入到大肠杆菌JM109感受态细胞(Nippongene)100μl中，冰上静置30分钟，42℃静置1分钟。然后加入300μl的Hi-Competence Broth(Nippongene)，于37℃培养1小时后，将该大肠杆菌涂在100μg/ml的LBA琼脂培养基上，于37℃下培养过夜，得到大肠杆菌转化体。将该转化体在3ml的LBA培养基中于37℃培养过夜，用QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)从菌体级分制备质粒DNA。将含有编码这些嵌合ATR-5抗体H链的基因的质粒分别命名为chATR5Hv/N5KG1(V)和chATR5Hv/N5KG4P。(ⅱ)L链V区的导入

质粒chATR5Lv/CVIDEC用限制酶BglⅡ(宝酒造)和SplⅠ(宝酒造)于37℃消化1.5小时。通过使用了1.5％的NuSieve GTG琼脂糖(FMCBioProducts)的琼脂糖凝胶电泳分离该消化混合物，切出含有大约400bp长的DNA片段的琼脂糖凝胶片。用酚和氯仿萃取琼脂糖凝胶片，用乙醇使DNA片段沉淀后，溶解于20μlTE中。

质粒chATR5Hv/N5KG1(V)和chATR5Hv/N5KG4P用限制酶BglⅡ(宝酒造)和SplⅠ(宝酒造)于37℃消化1.5小时。通过使用了1.5％的NuSieve GTG琼脂糖(FMC BioProducts)的琼脂糖凝胶电泳分离该消化混合物，切出含有大约9400bp长的DNA片段的琼脂糖凝胶片。用酚和氯仿萃取琼脂糖凝胶片，用乙醇使DNA片段沉淀后，溶解于20μlTE中。

上述制备的含有编码L链V区的基因的SplⅠ-BglⅡ DNA片段与SplⅠ和BglⅡ消化的chATR5Hv/N5KG1(V)或chATR5Hv/N5KG4P用DNA连接试剂盒ver.2(宝酒造)，按照附带的处方于16℃反应1小时，进行连接。

将该连接混合物加入到大肠杆菌JM109感受态细胞(Nippongene)100μl中，冰上静置30分钟，42℃静置1分钟。然后加入300μl的Hi-Competence Broth(Nippongene)，于37℃培养1小时后，将该大肠杆菌涂在100μg/ml的LBA琼脂培养基上，于37℃下培养过夜，得到大肠杆菌转化体。将该转化体在含有50μg/ml氨苄青霉素的2×YT培养基11中，于37℃下培养过夜，用Plasmid Maxi Kit(QIAGEN)从菌体级分制备质粒DNA。将含有编码这些嵌合ATR-5抗体的基因的质粒分别命名为chATR5/N5KG1(V)和chATR5/N5KG4P。(4)转染COS-7细胞

为了评价嵌合抗体的抗原结合活性和中和活性，使上述表达质粒转染COS-7细胞，使嵌合抗体瞬时表达。

采用Gene Pulser装置(Bio Rad)通过电穿孔将chATR5/N5KG1(V)或chATR5/N5KG4P导入COS-7细胞。向悬浮在グルベツコPBS(-)(以下称为PBS)中的0.78ml COS-7细胞(细胞浓度为1×10⁷/ml)加入质粒50μg，以1500V,25μF的静电容量加脉冲。

于室温下经10分钟恢复期后，将电穿孔处理的细胞悬浮于含有5％Ultra Low IgG胎牛血清(GIBCO)的DMEM培养基(GIBCO)，使用10cm培养皿，于CO₂培养箱中培养。经24小时培养后，抽滤除去培养上清，加入新的无血清培养基HBCHO(ア-バインサイェンティフィツク)。再培养72小时后，收集上清，经离心分离除去细胞碎片。(5)抗体的纯化

使用rProtein A Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech)按如下操作从COS-7细胞的培养上清纯化嵌合抗体。

将1ml的rProtein A Sepharose Fast Flow填充到柱子中，用10倍量的TBS洗，使柱子平衡。将COS-7细胞的培养上清加到已平衡好的柱子上，用10倍量的TBS洗柱子。

接下来用13.5ml的2.5mM HCl(pH3.0)洗，将吸附的抗体级分从柱子中洗脱下来，马上加1.5ml的1M Tris-HCl(pH8.0)中和洗脱液。

就纯化的抗体级分用centriprepl00(Amicon)进行2次超滤，将溶剂置换为含有150mM NaCl的50mM Tris-HCl(pH7.6)(以下称为TBS)，最终浓缩到大约1.5ml。(6)稳定产生CHO的细胞株的确立

为了确立稳定生产嵌合抗体的细胞株，将上述表达质粒导入于CHO-S-SFMⅡ无血清培养基(GIBCO)驯化的CHO细胞(DG44)中。

用限制酶SspⅠ(宝酒造)切质粒chATR5/N5KG1(V)或chATR5/N5KG4P，使之成直链DNA，用酚和氯仿萃取后，经乙醇沉淀回收DNA。使用Gene Pulser装置(Bio Rad)通过电穿孔将成直链的DNA导入DG44细胞。向悬浮于PBS中的0.78ml DG44细胞(细胞浓度为1×10⁷/ml)加入质粒10μg，以1500V,25μF的静电容量加脉冲。

于室温下经10分钟恢复期后，将电穿孔处理的细胞悬浮于含有次黄嘌呤、胸腺嘧啶脱氧核苷(GIBCO)的CHO-S-SFMⅡ培养基(GIBCO)。使用2块96孔板(Falcon)在CO₂培养箱中培养。培养开始后第二天换成含有次黄嘌呤、胸腺嘧啶脱氧核苷(GIBCO)和500μg/ml的GENETICIN(G418硫酸盐、GIBCO)CHO-S-SFMⅡ培养基(GIBCO)的选择培养基，选择导入了抗体基因的细胞。换成选择培养基后2周前后，于显微镜下观察细胞，确认细胞增殖正常后，通过后述的抗体浓度测定ELISA测定抗体产生量，挑选抗体产生量多的细胞。实施例3.人源化抗体的构建(1)人源化抗体H链的构建(ⅰ)人源化H链版本“a”的构建

通过采用PCR法的CDR移植制作人源化ATR-5抗体H链。为了制作含有来自人抗体L39130(DDBJ,Gao L.等人、未发表、1995)的FR的人源化ATR-5抗体H链版本“a”，使用了7个PCR引物。CDR移植引物hR5Hv1S(序列号22)、hR5Hv2S(序列号23)和hR5Hv4S(序列号24)含有有意义DNA序列，而CDR移植引物hR5Hv3A(序列号25)和hR5Hv5A(序列号26)含有反意义DNA序列，而且各个引物的两端含有18-35bp的互补序列。

将hR5Hv1S设计成含有Kozak共有序列(Kozak,M,等人、分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)196,947-950,1987)和SalⅠ识别部位，将hR5Hv5A设计为含有NheⅠ识别部位。而外部引物hR5HPrS(序列号27)与CDR移植引物hR5Hv1S具有同源性，hR5HvPrA(序列号28)与CDR移植引物hR5Hv5A具有同源性。

CDR移植引物hR5Hv1S、hR5Hv2S、hR5Hv3A、hR5Hv4S和hR5Hv5A以及外部引物hR5HPrS和hR5HvPrA是由Pharmacia Biotech合成和纯化的。

PCR使用KOD DNA聚合酶(东洋纺织制造)，98μl中含有120mMTris-HCl(pH8.0)、10mM KCl、6mM(NH₄)₂SO₄、0.1％Triton X-100、0.001％BSA、0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、1mMMgCl₂、2.5单位的KOD DNA聚合酶(东洋纺织制造)、CDR移植引物hR5Hv1S、hR5Hv2S、hR5Hv3A、hR5Hv4S和hR5Hv5A各5pmole。使用附带的缓冲液，进行5次循环，每一温度循环为：94℃30秒钟、50℃1分钟、72℃1分钟。再加入100 pmole的外部引物hR5HPrS和hR5HvPrA，在100μl体系中进行25次同样温度循环。通过使用了2％的NuSieve GTG琼脂糖(FMC Bio.Products)的琼脂糖凝胶电泳分离经PCR扩增的DNA片段。

切出含有大约430bp长的DNA片段的琼脂糖凝胶片，添加3倍量的TE，经酚萃取、酚·氯仿萃取、氯仿萃取纯化DNA。纯化的DNA用乙醇沉淀后，其中的三分之一溶解于17μl水。得到的PCR反应混合物经NheⅠ和SalⅠ消化，然后与经NheⅠ和SalⅠ消化制备的质粒载体CVIDEC使用DNA连接酶试剂盒ver.2(宝酒造)，按照附带的处方进行连接反应。

将该连接混合物加入到大肠杆菌JM109感受态细胞(Nippongene)100μl中，冰上静置30分钟，42℃静置1分钟。然后加入300μl的Hi-Competence Broth(Nippongene)，于37℃培养1小时后，将该大肠杆菌涂在100μg/ml LBA琼脂培养基上，于37℃下培养过夜，得到大肠杆菌转化体。将该转化体在3ml的LBA培养基中于37℃培养过夜，用QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)制备质粒DNA。

质粒中的cDNA编码区的碱基序列使用Dye Terminator CycleSequencing FS Ready Reaction Kit(Perkin-Elmer)，通过DNA测序仪373A(Perkin-Elmer)确定。作为确定序列用的引物使用M13引物M4(宝酒造)和M13引物RV(宝酒造)，通过确认两个方向的碱基序列确定序列。

为了确认在EcoT22I识别部位前或后的变异或缺失，连接含有各个正确序列的片段，再度对CVIDEC进行亚克隆，确定碱基序列。含有正确碱基序列的质粒命名为hATR5Hva/CVIDEC。序列号29给出了hATR5Hva/CVIDEC中含有的人源化H链版本“a”的碱基序列和相应的氨基酸序列。版本“a”的氨基酸序列如序列号30所示。(ⅱ)人源化H链版本“b”和“c”的构建

版本“b”和“c”是通过FR改组法将版本“a”的FR3置换为来自其它抗体的FR3制作的。在制作版本“b”时，为了将FR3置换为来自人抗体Z34963(DDBJ、Borretzen M.等人、美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A01,12917-12921)的FR3,制作了4个编码FR3的DNA引物。FR改组引物F3RFFS(序列号31)和F3RFBS(序列号32)含有有意义DNA序列，F3RFFA(序列号33)和F3RFBA(序列号34)含有反有意义DNA序列。

F3RFFS和F3RFFA相互含有互补序列，两端含有BalⅠ和XhoⅠ的识别序列。在制作版本“c”时，为了将FR3置换为来自人抗体P01825(SWISS-PROT、Poljak RJ.等人、生物化学Biochemistry,16,3412-3420,1977)的FR3，制作了4个编码FR3的DNA引物。FR改组引物F3NMFS(序列号35)和F3NMBS(序列号36)含有有意义DNA序列，F3NMFA(序列号37)和F3NMBA(序列号38)含有反意义DNA序列。F3RFBS和F3RFBA相互含有互补序列，两端含有XhoⅠ和NcoⅠ的识别序列。

F3RFFS、F3RFBS、F3RFFA、F3RFBA、F3NMFS、F3NMBS、F3NMFA和F3NMBA是由Pharmacia Biotech合成的。将F3RFFS和F3RFFA、F3RFBS和F3RFBA退火，分别用BalⅠ和XhoⅠ、NcoⅠ和XhoⅠ消化。将它们导入通过BalⅠ和NcoⅠ消化制备的质粒hATR5Hva/CVIDEC(BalⅠ/NcoⅠ)中，确定碱基序列。具有正确碱基序列的质粒命名为hATR5Hvb/CVIDEC。序列号39给出了质粒hATR5Hvb/CVIDEC中包含的人源化H链版本“b”的碱基序列以及相应的氨基酸序列。而序列号40给出了版本“b”的氨基酸序列。

将F3NMFS和F3NMFA、F3NMBS和F3NMBA退火，分别用BalⅠ和XhoⅠ、NcoⅠ和XhoⅠ消化。将它们导入通过BalⅠ和NcoⅠ消化制备的质粒hATR5 Hva/CVIDEC(BalⅠ/NcoⅠ)，确定碱基序列。具有正确碱基序列的质粒命名为hATR5Hvc/CVIDEC。序列号41给出了质粒hATR5Hvc/CVIDEC中包含的人源化H链版本“c”的碱基序列以及相应的氨基酸序列。而序列号42给出了版本“c”的氨基酸序列。(ⅲ)人源化H链版本“d”和“e”的构建

版本“d”和“e”是通过FR改组法将版本“a”的FR3置换为来自其它抗体的FR3制作的。在制作版本“d”时，为了将FR3置换为来自人抗体M62723(DDBJ、Pascual V.等人，临床研究杂志(J.Clin.Invest.),86,1320-1328,1990)的FR3,制作了4个编码FR3的DNA引物。FR改组引物F3EPS(序列号43)含有有意义DNA序列，F3EPA(序列号44)含有反意义DNA序列，引物的3′末端含有18bp的互补序列。

而外部引物F3PrS(序列号45)含有有意义DNA序列，F3PrA(序列号46)与FR改组引物F3EPS和F3EPA有同源性，也可以用于其它的FR3的改组中。在制作版本“e”时，为了将FR3置换为来自人抗体Z80844(DDBJ、Thomsett AR.等人，未出版)的FR3，制作了2个编码FR3的DNA引物。FR改组引物F3VHS(序列号47)含有有意义DNA序列，F3VHA(序列号48)含有反意义DNA序列，引物的3′末端含有18bp的互补序列。F3EPS、F3EPA、F3PrS、F3PrA、F3VHS和F3VHA是由Pharmacia Biotech合成的。

PCR使用KOD DNA聚合酶(东洋纺织制造)，向100μl反应混合液加入1μM的FR改组引物F3EPS和F3EPA，或F3VHS和F3VHA各5μl、于0.2mM dNTPs、1.0mM MgCl₂、2.5U的KOD DNA聚合酶的条件下，使用附带的缓冲液，进行5次循环，每一温度循环为：94℃30秒钟、50℃ 1分钟、74℃1分钟。再加入100 pmole的外部引物F3PrS、F3PrA，进行25次同样的温度循环。

通过使用了2％的NuSieve GTG琼脂糖(FMC Bio.Products)的琼脂糖凝胶电泳分离经PCR扩增的DNA片段。切出含有424bp长的DNA片段的琼脂糖凝胶片，添加3倍量的TE(ml/g)，经酚萃取、酚·氯仿萃取、氯仿萃取纯化DNA片段。纯化的DNA用乙醇沉淀后，其中的三分之一溶解于14μl水中。得到的PCR反应混合物经BalⅠ和NcoⅠ消化，然后导入经BalⅠ和NcoⅠ消化制备的质粒hATR5Hva/CVIDEC(BalⅠ/NcoⅠ)中，确定碱基序列。

含有正确碱基序列的质粒命名为hATR5 Hvd/CVIDEC和hATR5Hve/CVIDEC。序列号49给出了hATR5 Hvd/CVIDEC中含有的人源化H链版本“d”的碱基序列和相应的氨基酸序列，序列号50给出了版本“d”的氨基酸序列，序列号51给出了hATR5Hve/CVIDEC中含有的人源化H链版本“e”的碱基序列和相应的氨基酸序列。序列号52给出了版本“e”的氨基酸序列。(ⅳ)人源化H链版本“f”和“g”的构建

版本“f”和“g”是通过FR改组法将版本“a”的FR3置换为来自其它抗体的FR3制作的。为了在制作版本“f”时置换为来自人抗体L04345(DDBJ、Hillson JL实验医学杂志(J.Exp.Med.),178,331-336,1993)的FR3，在制作版本“g”时置换为来自人抗体S78322(DDBJ、Bejcek BE.等，癌症研究(Cancer Res.),55,2346-2351,1995)的FR3，各合成了两个编码FR3的DNA引物。版本“f”FR改组引物F3SSS(序列号53)含有有意义DNA序列，F3SSA(序列号54)含有反意义DNA序列，引物的3′末端含有18bp的互补序列。

版本“g”FR改组引物F3CDS(序列号55)含有有意义DNA序列，F3CDA(序列号56)含有反意义DNA序列，引物的3′末端含有18bp的互补序列。F3SSS、F3SSA、F3CDS、F3CDA是由Pharmacia Biotech合成和纯化的。PCR使用KOD DNA聚合酶(东洋纺织制造)，向100μl反应混合液中加入1μM的FR改组引物F3SSS和F3SSA，或F3CDS和F3CDA各5μl、于含有0.2mM dNTPs、1.0mM MgCl₂、2.5U的KODDNA聚合酶的条件下，使用附带的缓冲液，进行5次循环，每一温度循环为：94℃30秒钟、50℃1分钟、74℃ 1分钟。再加入100 pmole的外部引物F3PrS、F3PrA，进行25次同样的温度循环。

通过使用了2％的NuSieve GTG琼脂糖(FMC Bio.Products)的琼脂糖凝胶电泳分离经PCR扩增的DNA片段。切出含有大约424bp长的DNA片段的琼脂糖凝胶片，添加3倍量(ml/g)的TE，经酚萃取、酚·氯仿萃取、氯仿萃取纯化DNA片段。纯化的DNA用乙醇沉淀后，其中的三分之一溶解于14μl水中。得到的PCR反应混合物经BalⅠ和NcoⅠ消化，然后导入经BalⅠ和NcoⅠ消化制备的质粒hATR5Hva/CVIDEC(BalⅠ/NcoⅠ)中，确定碱基序列。

具有正确碱基序列的质粒命名为hATR5Hvf/CVIDEC和hATR5HVg/CVIDEC。序列号57和58给出了质粒hATR5Hvf/CVIDEC中含有的人源化H链版本“f”的碱基序列和对应的氨基酸序列以及版本“f”的氨基酸序列。序列号59、60给出了hATR5Hvg/CVIDEC中含有的人源化H链版本“g”的碱基序列和对应的氨基酸序列和版本“g”的氨基酸序列。(ⅴ)人源化H链版本“h”的构建

版本“h”是通过FR改组法将版本“a”的FR3置换为来自其它抗体的FR3制作的。在制作版本“h”时，为了置换为来自人抗体Z26827(DDBJ、Van Der Stoep等，实验医学杂志(J.Exp.Med.),177,99-107,1993)的FR3，各合成了两个编码FR3的DNA引物。版本“h”FR改组引物F3ADS(序列号61)含有有意义DNA序列，F3ADA(序列号62)含有反意义DNA序列，引物的3′末端含有18bp的互补序列。

F3ADS和F3ADA是由Pharmacia Biotech合成和纯化的。PCR使用KOD DNA聚合酶(东洋纺织制造)，向100μl反应混合液加入1μM的FR改组引物F3ADS和F3ADA，各5μl、在含有0.2mMdNTPs、1.0mM MgCl₂、2.5U的KOD DNA聚合酶的条件下，使用附带的缓冲液，进行5次循环，每一温度循环为：94℃30秒钟、50℃1分钟、74℃1分钟。然后再加入100 pmole的外部引物F3PrS、F3PrA，进行25次同样的温度循环。通过使用了2％的NuSieve GTG琼脂糖(FMC Bio.Products)的琼脂糖凝胶电泳分离经PCR扩增的DNA片段。

切出含有424bp长的DNA片段的琼脂糖凝胶片，添加3倍量(ml/g)的TE，经酚萃取、酚·氯仿萃取、氯仿萃取纯化DNA片段。纯化的DNA用乙醇沉淀后，其中的三分之一溶解于14μl水中。得到的PCR反应混合物经BalⅠ和NcoⅠ消化，然后导入经BalⅠ和NcoⅠ消化制备的质粒hATR5Hva/CVIDEC(BalⅠ/NcoⅠ)中，确定碱基序列。具有正确碱基序列的质粒命名为hATR5Hvh/CVIDEC。序列号63给出了hATR5Hvh/CVIDEC中含有的人源化H链版本“h”的碱基序列和对应的氨基酸序列。而序列号64给出了版本“h”的氨基酸序列。(ⅵ)人源化H链版本“i”和“j”的构建

版本“i”和“j”是通过FR改组法将版本“a”的FR3置换为来自其它抗体的FR3制作的。在制作版本“i”时，为了置换为来自人抗体U95239(DDBJ、Manheimer-Lory AJ未出版)的FR3，在制作版本“j”时为了置换为来自人抗体L03147(DDBJ、Collet TA.等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.),89,10026-10030,1992)的FR3,各合成了两个编码FR3的DNA引物。版本“i”FR改组引物F3MMS(序列号65)含有有意义DNA序列，F3MMA(序列号66)含有反意义DNA序列，引物的3′末端含有18bp的互补序列。

版本“j”FR改组引物F3BMS(序列号67)含有有意义DNA序列，F3BMA(序列号68)含有反意义DNA序列，引物的3′末端含有18bp的互补序列。F3MMS、F3MMA、F3BMS、F3BMA是由PharmaciaBiotech合成和纯化的。PCR使用Ampli Taq Gold(Perkin-Elmer)，向100μl反应混合液中加入lμM的FR改组引物F3MMS和F3MMA、或F3BMS和F3BMA各5μl、在含有0.2mM dNTPs、1.5mM MgCl₂、2.5U的Amplo Taq Gold的条件下，使用附带的缓冲液，进行5次循环，每一温度循环为：94℃ 30秒钟、50℃1分钟、74℃1分钟。然后再加入100 pmole的外部引物F3PrS、F3PrA，进行25次同样的温度循环。

通过使用了2％的NuSieve GTG琼脂糖(FMC Bio.Products)的琼脂糖凝胶电泳分离经PCR扩增的DNA片段。切出含有424bp长的DNA片段的琼脂糖凝胶片，添加3倍量(ml/g)的TE，经酚萃取、酚·氯仿萃取、氯仿萃取纯化DNA片段。纯化的DNA用乙醇沉淀后，其中的三分之一溶解于14μl水中。得到的PCR反应混合物经BalⅠ和NcoⅠ消化，然后导入经BalⅠ和NcoⅠ消化制备的质粒hATR5Hva/CVIDEC(BalⅠ/NcoⅠ)中，确定碱基序列。

具有正确碱基序列的质粒命名为hATR5Hvi/CVIDEC和hATR5Hvi/CVIDEC。序列号69和70给出了hATR5Hvi/CVIDEC中含有的人源化H链版本“i”的碱基序列和对应的氨基酸序列以及版本“i”的氨基酸序列。序列号71和72给出了hATR5Hvj/CVIDEC中含有的人源化H链版本“j”的碱基序列和对应的氨基酸序列和版本“j”的氨基酸序列。(ⅶ)人源化H链版本“b1”和“d1”的构建

版本“b1”和“d1”是通过FR改组法将版本“b”和和“d”的FR2置换为来自其它抗体的FR2制作的。为了置换为来自人抗体P01742(SwiSS-PROT、Cunningham BA.等人，生物化学(Biochemistry)，9,3161-3170,1970)的FR2，制作了两个编码FR2的DNA引物。FR改组引物F2MPS(序列号73)含有有意义DNA序列，F2MPA(序列号74)含有反意义DNA序列，而相互具有互补序列，两端含有EcoT221和BalⅠ的识别序列。

F2MPS、F2MPA是由Pharmacia Biotech合成和纯化的。使F2MPS和F2MPA退火，用EcoT22Ⅰ和BalⅠ消化。将它们导入通过EcoT22Ⅰ和BalⅠ消化制备的质粒hATR5Hvb/CVIDEC(EcoT22Ⅰ/BalⅠ)和hATR5Hvd/CVIDEC(EcoT22Ⅰ/BalⅠ)，确定碱基序列。具有正确碱基序列的质粒命名为hATR5 Hvbl/CVIDEC和hATR5 Hvd1/CVIDEC。序列号75和76给出了质粒hATR5 Hvb1/CVIDEC中包含的人源化H链版本“b1”的碱基序列以及对应的氨基酸序列以及版本“b1”的氨基酸序列。序列号77和78给出了质粒hATR5 Hvd1/CVIDEC中包含的人源化H链版本“d1”的碱基序列以及对应的氨基酸序列以及版本“d1”的氨基酸序列。(ⅷ)人源化H链版本“b3”和“d3”的构建

版本“b3”和“d3”是通过FR改组法将版本“b”和“d”的FR2置换为来自其它抗体的FR2制作的。为了置换为来自人抗体Z80844(DDBJ、Thomsett AR.等人、未出版)的FR2，制作了两个编码FR2的DNA引物。FR改组引物F2VHS(序列号79)含有有意义DNA序列，F2VHA(序列号80)含有反意义DNA序列，相互具有互补序列，两端含有EcoT221和BalⅠ的识别序列。F2VHS、F2VHA是委托PharmaciaBiotech合成和纯化的。

使F2VHS和F2VHA退火，用EcoT22Ⅰ和BalⅠ消化。将它们导入通过EcoT22Ⅰ和BalⅠ消化制备的质粒hATR5Hvb/CVIDEC(EcoT22Ⅰ/BalⅠ)和hATR5 Hvd/CVIDEC(EcoT22Ⅰ/BalⅠ)中，确定碱基序列。具有正确碱基序列的质粒命名为hATR5Hvb3/CVIDEC和hATR5Hvd3/CVIDEC。序列号81和82给出了质粒hATR5Hvb3/CVIDEC中包含的人源化H链版本“b3”的碱基序列以及对应的氨基酸序列以及版本“b3”的氨基酸序列。序列号83和84给出了质粒hATR5Hvd3/CVIDEC中包含的人源化H链版本“d3”的碱基序列以及对应的氨基酸序列以及版本“d3”的氨基酸序列。(2)人源化抗体L链V区的构建(ⅰ)版本“a”

通过采用PCR法的CDR移植制作人源化ATR-5抗体L链。为了制作含有来自人抗体Z37322(DDBJ,Welschof M等人，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)179,203-214,1995)的框架区的人源化抗体L链(版本“a”)，使用了7个PCR引物。

CDR移植引物h5Lv1S(序列号85)和h5Lv4S(序列号86)含有有意义DNA序列，而CDR移植引物h5Lv2A(序列号87)、h5Lv3A(序列号88)和h5Lv5A(序列号89)含有反意义DNA序列，而且各个引物的两端含有20bp的互补序列。外部引物h5LvS(序列号90)与h5LvA(序列号91)与CDR移植引物h5Lv1S和h5Lv5A具有同源性。CDR移植引物h5Lv1S、h5Lv4S、h5Lv2A、h5Lv3A、h5Lv5A、h5LvS和h5LvA是委托Pharmacia Biotech合成和纯化的。

PCR溶液，100μl中含有120mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM KCl、6mM(NH₄)₂SO₄、0.1％Triton X-100、0.001％BSA、0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、1mM MgCl₂、2.5单位的KOD DNA聚合酶(东洋纺织制造)、5pmole的CDR移植引物h5Lv1S、h5Lv2A、h5Lv3A、h5Lv4S、h5Lv5A。

PCR使用热循环仪480(Perkin-Elmer)，通过5次循环，每一温度循环为：94℃30秒钟、50℃1分钟、74℃1分钟，对5条CDR移植引物进行组装。然后向该反应混合液中加入100 pmole的外部引物h5LvS和h5LvA，进行25次温度循环，每一温度循环为：94℃30秒钟、52℃1分钟、72℃1分钟，扩增制备的DNA片段。

通过使用了2％的NuSieve GTG琼脂糖(FMC Bio.Products)的琼脂糖凝胶电泳分离PCR反应混合液，切出含有大约400bp长的DNA片段的琼脂糖凝胶片，用酚以及氯仿萃取琼脂糖凝胶片、用乙醇沉淀回收的DNA。回收的DNA片段经SplⅠ和BglⅡ于37℃下，消化4小时。该消化混合物用酚及氯仿萃取，DNA片段用乙醇沉淀后，溶解于10μl TE中。使用DNA连接酶试剂盒ver.2(宝酒造)，使含有上述那样制备的编码人源化抗体L链V区的基因的SplⅠ-BglⅡ DNA片段与经SplⅠ和BglⅡ消化制备的CVIDEC载体，按照附带的处方于16℃下使其反应1小时，进行连接。

将该连接混合物加入到大肠杆菌JM109感受态细胞(Nippongene)100μl中，冰上静置30分钟，42℃静置1分钟。然后加入300μl的Hi-Competence Broth(Nippongene)，于37℃培养1小时后，将该大肠杆菌涂在100μg/ml LBA琼脂培养基上，于37℃下培养过夜，得到大肠杆菌转化体。将该转化体在3ml的LBA培养基中于37℃培养过夜，用QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)从菌体级分制备质粒DNA。

质粒中的cDNA编码区的碱基序列使用Dye Terminator CycleSequencing FS Ready Reaction Kit(Perkin-Elmer)，通过DNA测序仪373A(Perkin-Elmer)确定。作为确定序列用的引物使用M13引物M4(宝酒造)和M13引物RV(宝酒造)，通过确认两个方向的碱基序列确定序列。含有编码该人源化抗体L链V区的基因，在5’端带有BglⅡ识别序列和Kozak序列，3’端带有SplⅠ识别序列的质粒命名为hATR5Lva/CVIDEC。序列号92给出了人源化L链版本“a”的碱基序列(含有对应的氨基酸序列)。而序列号93为版本“a”的氨基酸序列。(ⅱ)版本“b”和“c”

版本“b”和“c”是通过置换(FR改组)版本“a”的FR3制作的。在制作版本“b”时，使用了来自人抗体S68699(DDBJ、Hougs L等人，实验与临床免疫遗传学(Exp.Clin.Immunogenet.)10,141-151,1993)的FR3，在制作版本“c”时，使用了来自人抗体P011607(SWISS-PROT、Epp O等人，生物化学(Biochemistry)14,4943-4952,1975)的FR3。

编码版本“b”的FR3的引物F3SS(序列号94)和F3SA(序列号95)，或编码版本“c”的FR3的引物F3RS(序列号96)和F3RA(序列号97)相互含有互补序列，两端带有限制酶KpnⅠ和PstⅠ的识别序列。F3SS、F3SA、F3RS、F3RA是委托Pharmacia Biotech合成和纯化的。将各100pmole的F3SS和F3SA、或F3RS和F3RA，通过于96℃下处理2分钟，50℃下处理2分钟，使其退火，制作双链DNA片段。

该双链DNA片段先经限制酶KpnⅠ(宝酒造)于37℃消化1小时，然后再经PstⅠ(宝酒造)于37℃消化1小时。该消化混合物用酚及氯仿萃取，DNA片段用乙醇沉淀后，溶解于TE中。

质粒hATR5Lva/CVIDEC先经限制酶KpnⅠ(宝酒造)于37℃消化1小时，然后再经PstⅠ(宝酒造)于37℃消化1小时。该消化混合物通过使用了1.5％的NuSieve GTG琼脂糖(FMC Bio.Products)的琼脂糖凝胶电泳分离，切出含有大约3000bp长的DNA片段的琼脂糖凝胶片，用酚以及氯仿萃取琼脂糖凝胶片、用乙醇使DNA片段沉淀后，溶解于TE中。

使用DNA连接酶试剂盒ver. 2(宝酒造)，使含有上述那样制备的编码版本“b”或“c”的FR的KpnⅠ-PstⅠDNA片段与经KpnⅠ和PstⅠ消化除去FR3的hATR5Lva/CVIDEC载体，按照附带的处方于16℃下使其反应1小时，进行连接。

含有编码置换了这些人源化抗体L链版本“a”的FR3的版本“b”或“c”的基因的质粒分别命名为hATR5Lvb/CVIDEC、hATR5Lvc/CVIDEC。序列号98、99给出了质粒hATR5Lvb/CVIDEC中含有的人源化L链版本“b”的碱基序列以及对应的氨基酸序列和版本“b”的氨基酸序列。序列号100、101给出了质粒hATR5Lvc/CVIDEC中含有的人源化L链版本“c”的碱基序列以及对应的氨基酸序列和版本“c”的氨基酸序列。(ⅲ)版本“b1”和“b2”

版本“b1”和“b2”是通过置换版本“b”的FR2制作的。在制作版本“b1”时，使用了来自人抗体S65921(DDBJ、Tonge DW等，免疫学年鉴(Year Immunol.)7,52-62,1993)的FR2，在制作版本“b2”时，使用了来自人抗体X93625(DDBJ、Cox JP等人，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)24,827-836,1994)的FR2。

编码版本“b1”的FR2的引物F2SS(序列号102)和F2SA(序列号103)，或编码版本“b2”的FR2的引物F2XS(序列号104)和F2XA(序列号105)相互含有互补序列，两端带有AflⅠ和SpeⅠ的识别序列。F2SS、F2SA、F2XS、F2XA是由Pharmacia Biotech合成。将各100pmole的F2SS和F2SA、或F2XS和F2XA，于96℃下处理2分钟，50℃下处理2分钟，使其退火，制作双链DNA片段。

该双链DNA片段经限制酶AflⅡ(宝酒造)以及SpeⅠ(宝酒造)于37℃消化1小时。该消化混合物用酚及氯仿萃取，DNA片段用乙醇沉淀后，溶解于TE中。

质粒hATR5Lvb/CVIDEC经限制酶AflⅡ(宝酒造)以及SpeⅠ(宝酒造)于37℃消化1小时。该消化混合物通过使用了1.5％的NuSieve GTG琼脂糖(FMC Bio.Products)的琼脂糖凝胶电泳分离，切出含有大约3000bp长的DNA片段的琼脂糖凝胶片，用酚以及氯仿萃取琼脂糖凝胶片、用乙醇使DNA片段沉淀后，溶解于TE中。

使用DNA连接酶试剂盒ver.2(宝酒造)，使含有上述那样制备的编码版本“b1”或“b2”的FR2的AflⅡ-SpeⅠDNA片段与经AfiⅡ以及SpeⅠ消化除去FR2的hATR5Lvb/CVIDEC载体，按照附带的处方于16℃下使其反应1小时，进行连接。

含有编码置换了这些人源化抗体L链版本“b”的FR2的版本“b1”或“b2”的基因的质粒分别命名为hATR5Lvb1/CVIDEC、hATR5Lvb2/CVIDEC。序列号106、107给出了质粒hATR5Lvb1/CVIDEC中含有的人源化L链版本“b”的碱基序列以及对应的氨基酸序列和版本“b1”的氨基酸序列。序列号108、109给出了质粒hATR5Lvb2/CVIDEC中含有的人源化L链版本“b2”的碱基序列以及对应的氨基酸序列和版本“b2”的氨基酸序列。(3)人源化抗体表达载体的构建(ⅰ)人源化H链与嵌合L链的组合

用NheⅠ和SalⅠ消化含有H链V区的质粒hATR5Hva/CVIDEC，回收人源化H链V区的cDNA片段，导入经NheⅠ和SalⅠ消化的chATR-5抗体表达质粒载体chATR5/N5KG4P制备的chATR5/N5KG4P(SaⅡ/NheⅠ)。这样制作的质粒命名为hHva-chLv/N5KG4P。

用NheⅠ和SalⅠ消化含有H链V区的质粒hATR5Hvb/CVIDEC，回收人源化H链V区的cDNA片段，导入经NheⅠ和SalⅠ消化的chATR-5抗体表达质粒载体chATR5/N5KG4P制备的chATR5/N5KG4P(SalⅠ/NheⅠ)。这样制作的质粒命名为hHvb-chLv/N5KG4P。

用NheⅠ和SalⅠ消化含有H链V区的质粒hATR5Hvc/CVIDEC、hATR5 Hvd/CVIDEC和hATR5Lve/CVIDEC，回收人源化H链V区的cDNA，导入经NheⅠ和SalⅠ消化的chATR-5抗体表达质粒载体chATR5/N5KG4P制备的chATR5/N5KG4P(SalⅠ/NheⅠ)。这样制作的质粒分别命名为hHvc-chLv/N5KG4P、hHvd-chLv/N5KG4P、hHve-chLv/N5KG4P。

用NheⅠ和SalⅠ消化含有H链V区的质粒hATR5Hvf/CVIDEC和hATR5Hvh/CVIDEC，回收人源化H链V区的cDNA，导入经NheⅠ和SalⅠ消化的chATR-5抗体表达质粒载体chATR5/N5KG4P制备的chATR5/N5KG4P(SalⅠ/NheⅠ)。这样制作的质粒分别命名为hHvf-chLv/N5KG4P和hHvh-chLv/N5KG4P。

用NheⅠ和SalⅠ消化含有H链V区的质粒hATR5Hvi/CVIDEC及hATR5Hvj/CVIDEC，回收人源化H链V区的cDNA，导入经NheⅠ和SalⅠ消化的chATR-5抗体表达质粒载体chATR5/N5KG4P制备的chATR5/N5KG4P(SalⅠ/NheⅠ)。这样制作的质粒分别命名为hHvi-chLv/N5KG4P和hHvj-chLv/N5KG4P。

用NheⅠ和SalⅠ消化含有H链V区的质粒hATR5Hvb1/CVIDEC和hATR5 Hvd1/CVIDEC，回收人源化H链V区的cDNA，导入经NheⅠ和SalⅠ消化的chATR-5抗体表达质粒载体chATR5/N5KG4P制备的chATR5/N5KG4P(SalⅠ/NheⅠ)。这样制作的质粒分别命名为hHVb1-chLv/N5KG4P和hHvd1-chLv/N5KG4P。(ⅱ)人源化L链和嵌合H链的组合

用抗体表达载体N5KG4P，通过与嵌合H链组合使人源化抗体表达，进行人源化L链的评价。

质粒hATR5Lva/CVIDEC、hATR5Lvb/CVIDEC、hATR5Lvc/CVIDEC、hATR5Lvb1/CVIDEC、hATR5Lvb2/CVIDEC用限制酶BglⅡ(宝酒造)及SplⅠ(宝酒造)于37℃消化2～3小时。该消化混合物通过使用了1.5％或2％的NuSieve GTG琼脂糖(FMC Bio.Products)的琼脂糖凝胶电泳分离，切出含有大约400bp长的DNA片段的琼脂糖凝胶片，用酚以及氯仿萃取琼脂糖凝胶片、用乙醇使DNA片段沉淀后，溶解于TE中。

使用DNA连接酶试剂盒ver.2(宝酒造)，使含有编码上述各个版本人源化L链V区基因的SplⅠ-BglⅡ DNA片段与经SplⅠ以及BglⅡ消化的chATR5Hv/N5KG4P，按照附带的处方于16℃下使其反应1小时，进行连接。

将该连接混合物加入到大肠杆菌JM109感受态细胞(Nippongene)100μl中，冰上静置30分钟，42℃静置1分钟。然后加入300μl的Hi-Competence Broth(Nippongene)，于37℃培养1小时后，将该大肠杆菌涂在100μg/ml LBA琼脂培养基上，于37℃下培养过夜，得到大肠杆菌转化体。

将该转化体在250ml或500ml的LBA培养基中于37℃培养过夜，用Plasmid Maxi Kit(QIAGEN)从菌体级分制备质粒DNA。导入了编码这些嵌合H链和人源化L链的基因的质粒分别命名为chHv-hLva/N5KG4P、chHv-hLvb/N5KG4P、chHv-hLvc/N5KG4P、chHv-hLvb1/N5KG4P和chHv-hLvb2/N5KG4P。(ⅲ)人源化H链和人源化L链的组合

用NheⅠ和SalⅠ消化含有H链V区的质粒hATR5Hva/CVIDEC，回收人源化H链V区的cDNA片段，导入经NheⅠ和SalⅠ消化的含有人源化chATR-5抗体L链版本“a”cDNA序列的质粒chHv-hLva/N5KG4P制备的hLva/N5KG4P(SalⅠ/NheⅠ)。这样制作的质粒命名为hHva-hLva/N5KG4P。

用NheⅠ和SalⅠ消化含有H链V区的质粒hATR5Hvb/CVIDEC及hATR5Hvc/CVIDEC，回收人源化H链V区的cDNA片段，导入经NheⅠ和SalⅠ消化的含有人源化chATR-5抗体L链版本“a”cDNA序列的质粒chHv-hLva/N5KG4P制备的hLva/N5KG4P(SalⅠ/NheⅠ)。这样制作的质粒命名为hHvb-hLva/N5KG4P和hHvc-hLva/5KG4P。

用NheⅠ和SalⅠ消化含有H链V区的质粒hATR5Hvb/CVIDEC、hATR5 Hvd/CVIDEC和hATR5Hve/CVIDEC，回收人源化H链V区的cDNA片段，导入经NheⅠ和SalⅠ消化的含有人源化chATR-5抗体L链版本“b”cDNA序列的质粒chHv-hLvb/N5KG4P制备的hLvb/N5KG4P(SalⅠ/NheⅠ)。这样制作的质粒命名为hHvb-hLvb/N5KG4P、hHvd-hLvb/N5KG4P和hHve-hLvb/N5KG4P。

用NheⅠ和SalⅠ消化含有H链V区的质粒hATR5Hvf/CVIDEC、hATR5Hvg/CVIDEC和hATR5Hvh/CVIDEC，回收人源化H链V区的cDNA片段，导入经NheⅠ和SalⅠ消化的含有人源化chATR-5抗体L链版本“b”cDNA序列的质粒chHv-hLvb/N5KG4P制备的hLvb/N5KG4P(SalⅠ/NheⅠ)。这样制作的质粒命名为hHvf-hLvb/N5KG4P、hHvg-hLvb/N5KG4P和hHvh-hLvb/N5KG4P。

用NheⅠ和SalⅠ消化含有H链V区的质粒hATR5Hvi/CVIDEC和hATR5Hvj/CVIDEC，回收人源化H链V区的cDNA片段，导入经NheⅠ和SalⅠ消化的含有人源化chATR-5抗体L链版本“b”cDNA序列的质粒chHv-hLvb/N5KG4P制备的hLvb/N5KG4P(SalⅠ/NheⅠ)。这样制作的质粒命名为hHvi-hLvb/N5KG4P和hHvj-hLvb/N5KG4P。

用NheⅠ和SalⅠ消化含有H链V区的质粒hATR5Hvbl/CVIDEC和hATR5Hd1/CVIDEC，回收人源化H链V区的cDNA片段，导入经NheⅠ和SalⅠ消化的含有人源化chATR-5抗体L链版本“b”cDNA序列的质粒chHv-hLvb/N5KG4P制备的hLvb/N5KG4P(SalⅠ/NheⅠ)。这样制作的质粒命名为hHvb1-hLvb/N5KG4P和hHvd1-hLvb/N5KG4P。

用NheⅠ和SalⅠ消化含有H链V区的质粒hATR5Hvb3/CVIDEC和hATR5Hd3/CVIDEC，回收人源化H链V区的cDNA片段，导入经NheⅠ和SalⅠ消化的含有人源化chATR-5抗体L链版本“b”cDNA序列的质粒chHv-hLvb/N5KG4P制备的hLvb/N5KG4P(SalⅠ/NheⅠ)。这样制作的质粒命名为hHvb3-hLvb/N5KG4P和hHvd3-hLvb/N5KG4P。

用NheⅠ和SalⅠ消化含有H链V区的质粒hATR5Hvb/CVIDEC，回收人源化H链V区的cDNA片段，导入经NheⅠ和SalⅠ消化的含有人源化chATR-5抗体L链版本“b1”和“b2”cDNA序列的质粒chHv-hLvbl/N5KG4P和chHv-hLvb2/N5KG4P制备的hLvb1/N5KG4P(SalⅠ/NheⅠ)和hLvb2/N5KG4P(SalⅠ/NheⅠ)。这样制作的质粒命名为hHvb-hLvb1/N5KG4P和hHvb-hLvb2/N5KG4P。

用NheⅠ和SalⅠ消化含有H链V区的质粒hATR5Hvi/CVIDEC，回收人源化H链V区的cDNA片段，导入经NheⅠ和SalⅠ消化的含有人源化chATR-5抗体L链版本“b1”和“b2”cDNA序列的质粒chHv-hLvb1/N5KG4P和chHv-hLvb2/N5KG4P制备的hLvb1/N5KG4P(SalⅠ/NheⅠ)和hLvb2/N5KG4P(SalⅠ/NheⅠ)。这样制作的质粒命名为hHvi-hLvb1/N5KG4P和hHvi-hLvb2/N5KG4P。(4)转染COS-7细胞

为了评价人源化抗体的抗原结合活性和中和活性，使上述表达质粒在COS-7细胞中瞬时表达。

利用Gene Pulser装置(Bio-Rad)通过电穿孔将构建的表达质粒载体导入COS-7细胞。向悬浮在PBS中的0.78ml COS-7细胞(细胞浓度为1×10⁷/ml)加入质粒50μg或20μg，以1500V，25μF的静电容量加脉冲。

于室温下经10分钟恢复期后，将电穿孔处理的细胞悬浮于含有5％Ultra Low IgG胎牛血清(GIBCO)的DMEM培养基(GIBCO)，使用10em培养皿或15cm培养皿，于CO₂培养箱中培养。经24小时培养后，抽滤除去培养上清，加入新的无血清培养基HBCHO(ア-バインサイエンティフイツク)。再培养72小时或96小时后，收集上清，经离心分离除去细胞碎片。(5)抗体的纯化

使用AffiGel Protein A MAPSⅡ试剂盒(Bio-Rad)或rProtein ASepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech)从COS-7细胞的培养上清纯化抗体。使用AffiGel Protein A MAPSⅡ试剂盒的纯化按照试剂盒附带的处方进行。使用rProtein A Sepharose Fast Flow的纯化按如下操作进行。

将1ml的rProtein A Sepharose Fast Flow填充到柱子中，用10倍量的TBS洗使柱子平衡。将COS-7细胞的培养上清加到已平衡好的柱子上，用10倍量的TBS洗柱子。接下来用13.5ml的2.5mM HCl(pH3.0)洗，将吸附的抗体级分从柱子中洗脱下来，马上加1.5ml的1M Tris-HCl(pH8.0)中和洗脱液。

就纯化的抗体级分用centriprep30或100(Amicon)进行2～3次超滤，将溶剂置换为TBS，最终浓缩到大约1.5ml。实施例4.抗体的定量和活性评价(1)利用ELISA测定抗体浓度

抗体浓度测定用的ELISA板按如下操作制备。对ELISA用96孔板(Maxisorp,NUNC)的各个孔用固相化缓冲液(0.1M NaHCO₃、0.02％NaN₃、pH9.6)(以下称为CB)配制成浓度为1μg/ml的山羊抗人IgG抗体(BioSource)100μl进行固相化，用200μl稀释的缓冲液(50mMTris-HCl、1mM MgCl₂、0.1M NaCl、0.05％Tween20、0.02％NaN₃、1％牛血清白蛋白(BSA)、pH8.1)封闭后，将使抗体表达的COS-7细胞培养上清或纯化的抗体阶段稀释后加到各个孔中。

于室温培养1小时后，用含有0.05％Tween20ダルベツコPBS(以下称为RB)洗净后，加入用DB稀释1000倍后的结合了碱性磷酸酶的山羊抗人IgGγ抗体(BioSource)100μl。于室温培养1小时后，用DB洗净后，加入Sigma104(对硝基苯磷酸、SIGMA)以浓度1mg/ml溶解于底物缓冲液(50mM NaHCO₃、10mM MgCl₂、pH9.8)后配成的溶液(以下称为底物溶液)、然后用微量板读数仪(Bio-Rad)测定405/655nm的吸光度。作为浓度测定的标准可以用IgG4κ(The Bingding Site)。(2)抗原结合能力的测定

按如下操作制备抗原结合测定用的Cell ELISA板。向细胞培养用96孔板中的60孔加入人膀胱癌细胞J82(ATCC HTB-1)，每孔细胞数为1×10⁶个。然后将培养板置于CO₂培养箱中培养一天(含有10％胎牛血清(GIBCO)的RPMI1640培养基)，使细胞附着。倒掉培养基，用300μl的PBS将各孔洗2次。向各孔加入100μl的含有4％的多聚甲醛的PBS(以下称之PFA/PBS)，静置于冰上10分钟，使细胞固相化。

将PFA/PBS倒掉，用300μl的PBS将各孔洗2次，用250μl的DB进行封闭。然后向各孔加入用DB阶段稀释合后的培养上清或纯化的抗体100μl，于室温培养2小时，用RB洗净后，加入100μl的用DB稀释1000倍的结合了碱性磷酸酶的山羊抗人IgGγ抗体(BioSource)。于室温下培养1小时，用RB洗净后，加入底物溶液，然后用微量板读数仪(Bio-Rad)测定405/655nm的吸光度。(3)中和活性的测定

小鼠抗体、嵌合抗体和人源化抗体的中和活性可以通过以来自人胎盘的凝血激酶、Thromborel S(Behringwerke AG)对因子Xa的生成抑制活性为指标进行测定。即，向1.25mg/ml的Thromborel S 10μl和稀释到适当浓度的抗体10μl中加入缓冲液(含有5mMCaCl₂、0.1％的BSA的TBS)60μl，在96孔板中于室温反应1小时。然后分别加入3.245μg/ml的人因子X(セルサス实验室)和82.5ng/ml的人因子Ⅶa(エンザィム·リサ-チ)10μl，于室温反应1小时。

加入10μl的0.5M EDTA终止反应，加入50μl发色底物溶液，用微量板读数仪(Bio-Rad)测定405/655nm的吸光度。没有加抗体的1小时的吸光度为活性100％，从各个吸光度变化算出残存活性(％)。

发色底物溶液是按照附带的说明书溶解テストチ-ム发色底物S-2222(Chromogenix)，然后用精制水稀释2倍后，以1∶1比例与聚戊烯溶液(0.6mg/mlハキサジメチリンブロマイド、SIGMA)混合制备的。(4)活性评价(ⅰ)人源化H链版本“a”和嵌合L链的组合

制作人源化H链版本“a”和嵌合L链组合的抗体(a-ch)，通过cellELISA研究抗原结合能力时发现，抗体浓度高时，对抗原的结合量降低(图1)。由于从Fxa产生抑制表现的抗原中和能力与阳性对照的嵌合抗体(ch-ch)比具有较弱的活性(图2)。因此人源化H链应当通过FR改组进行版本升级。这里所用的嵌合抗体是在COS-7细胞表达、纯化的抗体，进行评价的抗体。(ⅱ)人源化L链版本“a”和嵌合H链的组合

制作人源化L链版本“a”和嵌合H链组合的抗体(ch-a)，通过cellELISA研究抗原结合能力时，确认具有嵌合抗体同等或以上的抗原结合能力(图1)。另外，抗原中和能力与阳性对照的嵌合抗体比活性弱(图2)。因此人源化L链也应当通过FR改组进行版本升级。这里所用的嵌合抗体是在COS-7细胞表达、纯化的抗体，进行评价的抗体。(ⅲ)人源化H链版本“a”和人源化L链版本“a”的组合

制作人源化H链版本“a”和人源化L链版本“a”组合的抗体(a-a)，通过cell ELISA研究抗原结合能力时，抗体浓度高对抗原的结合量降低(图3)。另外，由于从Fxa产生抑制表现的抗原中和能力与阳性对照的嵌合抗体比活性相当弱(图4)。因此人源化H链和L链也应当通过FR改组进行版本升级。这里所用的嵌合抗体是在COS-7细胞表达、纯化了的抗体，进行了评价的抗体。

(ⅳ)人源化H链版本“b”、“c”以及“d”和人源化L链版本“a”的组合

通过FR改组制作使版本升级的人源化H链版本“a”和嵌合L链组合的抗体(分别为“b-ch”、“c-ch”和“d-ch”)，通过cell ELISA研究抗原结合能力时，可以看到“d-ch”与嵌合抗体具有同等的抗原结合活性，而“b-ch”和“c-ch”表现出稍差的抗原结合活性(图5,6)。另外，抗原中和能力与阳性对照的嵌合抗体比“b-ch”大致相同，而“c-ch”和“d-ch”活性稍弱一些(图7)。因此人源化H链版本“b”和“d”在人源化H链中被认为是表现高活性的版本。(ⅴ)人源化H链版本“b”和人源化L链版本“a”的组合

通过FR改组制作使版本升级的人源化H链版本“b”和人源化L链版本“a”组合的抗体(“b-a”)，通过cell ELISA研究抗原结合能力时，抗体浓度高时，对抗原的结合量降低(图5)。另外，抗原中和能力与阳性对照的嵌合抗体比，活性相当弱(图8)。因此“b-a”是比“a-a”活性高的版本。而这里所用的嵌合抗体是在COS-7细胞表达、纯化的抗体，是进行了评价的抗体。

(ⅵ)人源化L链版本“b”、“c”和嵌合H链的组合

制作人源化L链版本“b”、“c”和嵌合H链组合的抗体(分别为“ch-b”“ch-c”)时，无论哪一种抗体都表现出与嵌合抗体同等活性(图9和10)。因此版本“b”和“c”成了人源化抗体L链的候补。人们认为来自小鼠抗体的氨基酸残基数少一个的版本“b”在抗原性方面比版本“c”好。而这里所用的嵌合抗体是在CHO细胞DG44表达、纯化的抗体，进行了评价的抗体。在以下的评价中也用该抗体作为阳性对照。(ⅶ)人源化H链版本“b”和人源化L链版本“b”以及“c”的组合

制作使人源化H链版本“b”与人源化L链版本“b”以及“c”组合的抗体(分别为“b-b”和“b-c”)，测定抗原结合能力和抗原中和能力。无论那种抗体与抗原结合能力、抗原中和能力表现出的活性都比嵌合抗体略差(图11和12)。(ⅷ)人源化H链版本“b”以及“d”和人源化L链版本“b”的组合

通过FR改组制作使版本升级的人源化H链和人源化L链版本“b”组合的抗体(分别为“b-b”和“d-b”)，通过cell ELISA研究抗原结合能力时，可以看到“d-b”与嵌合抗体具有同等的抗原结合活性，而“b-b”在高浓度时表现出稍差的抗原结合活性(图13)。另外，抗原中和能力与阳性对照的嵌合抗体比，“b-b”活性稍弱，而“d-b”与嵌合抗体相比活性相当弱(图14)。因此可见“b-b”是抗原活性中和能力高的版本，而“d-b”是抗原结合能力高的版本。(ⅸ)人源化H链版本“e”与嵌合L链和人源化L链版本“b”的组合

制作人源化L链版本“e”和嵌合L链以及人源化版本“b”组合的抗体(分别为“e-ch”和“e-b”)时，“e-ch”与嵌合抗体具有同等的抗原结合活性，而“e-b”抗体表达量非常低、而且抗原结合能力几乎丧失(图15)。另外，“e-ch”的抗原中和能力与阳性对照的嵌合抗体比活性相当弱(图16)。因此人们认为H链版本“e”与L链版本“b”的组合效果差。(ⅹ)人源化H链版本“f”、“g”和“h”与人源化L链版本“b”的组合

制作人源化H链版本“f”、“g”和“h”与人源化L链版本“b”组合的抗体(分别为“f-b”、“g-b”和“h-b”)时，“f-b”和“h-b”的抗体抗体表达量非常低。而虽然也制作了版本“f”、“h”与嵌合L链组合的抗体，但没有表达。“g-b”低浓度即达到饱和，表现的抗原结合能力比嵌合抗体弱(图17)。而“g-b”的抗原中和能力与嵌合抗体比，活性相当弱(图18)。(ⅹⅰ)人源化H链版本“b1”和“d1”与人源化L链版本“b”的组合

制作人源化H链版本“b1”和“d1”与人源化L链版本“b”组合的抗体(分别为“b1-b”和“d1-b”)时，无论那种抗体几乎都没有表达。而虽然也制作了它们与嵌合L链组合的抗体，但没有表达。(xⅱ)人源化H链版本“b3”和“d3”与人源化L链版本“b”的组合

制作人源化H链版本”b3”和“d3”与人源化L链版本“b”组合的抗体(分别为“b3-b”和“d3-b”)时，“d3-b”的抗原结合能力比嵌合抗体稍差，“b3-b”的抗原结合能力比嵌合抗体更差(图19)。“b3-b”的抗原中和能力比“b-b”活性高，但不及嵌合抗体的活性，“d3-b”与“b-b”具有同等程度的活性(图20)。(xⅲ)人源化H链版本“i”和“j”与嵌合L链以及人源化L链版本“b”的组合

制作人源化H链版本“i”和“j”与嵌合L链版本“b”组合的抗体(分别为“i-ch”和“j-ch”)、与人源化版本“b”组合的抗体(分别为“i-b”和“j-b”)，测定抗原结合能力和抗原中和能力。无论那种抗体都表现出与嵌合抗体具有几乎同等的抗原结合活性(图21、22)。可以确认“i-ch”具有比嵌合抗体活性高的抗原中和能力，“j-ch”的抗原中和能力的活性比嵌合抗体弱得多(图23)。“i-b”与嵌合抗体具有同等程度的活性，而“j-b”与嵌合抗体比活性弱得多(图24)。(ⅹⅳ)人源化H链版本“b1”和“b2”

制作人源化L链版本“b1”和“b2”与嵌合H链组合的抗体(分别为“ch-b1”和“ch-b2”)、时，无论那种抗体都表现出与嵌合抗体具有同等的抗原结合活性(图25)。关于抗原结合能力，“ch-b1”表现出与嵌合抗体同等的活性，而“ch-b2”在高浓度一侧可以看到一定程度超过嵌合抗体的活性(图26)。版本“b1”和“b2”都可以成为人源化抗体L链的候补，但在具有更高活性这一点看，版本“b2”更好。(ⅹⅴ)人源化H链版本“b”和人源化L链版本“b2”的组合

制作人源化H链版本“b”和与人源化版本“b2”组合的抗体(“b-b2”)，测定抗原结合能力和抗原中和能力。抗原结合能力比嵌合抗体稍差(图27)。抗原中和能力超过“b-b”，不及“i-b”的活性(图28)。(ⅹⅵ)人源化H链版本“i”和人源化L链版本“b1”或“b2”的组合

制作人源化H链版本“i”与人源化L链版本“b1”或“b2”组合的抗体(分别为“i-b1”和“i-b2”)，测定了抗原结合能力和抗原中和能力。“i-b2”的抗原结合能力大致与嵌合抗体同等，而“i-b1”稍差(图29)。而“i-b1”和“i-b2”的抗原中和能力，其活性超过嵌合抗体和“i-b”，二者的强弱次序为“i-b2”＞“i-b1”(图30)。实施例5.CHO细胞产生人源化抗体的制作和活性评价(1)CHO稳定产生细胞株的确立

为了确立稳定产生人源化抗体(b-b、i-b和I-b2)的细胞株，将抗体表达质粒导入于无血清培养基驯化的CHO细胞(DG44)中。

用限制酶SspⅠ(宝酒造)切质粒DNA、hHvb-hLvb/N5KG4P、hHvi-hLvb/N5KG4P和hHvi-hLvb2/N5KG4P，使之成直链DNA，用酚和氯仿萃取后，经乙醇沉淀回收DNA。使用电穿孔装置(Gene Pulser；BioRad)将成直链的DNA导入DG44细胞。将DG44细胞悬浮于PBS中(细胞密度为1×10⁷/ml)，向大约0.8ml的该悬浮液中加入上述DNA 10～50μg，以1500V,25μF的静电容量加脉冲。

于室温下经10分钟恢复期后，将处理的细胞悬浮于含有次黄嘌呤、胸腺嘧啶脱氧核苷(GIBCO)(以下称为HT)的CHO-S-SFMⅡ培养基(GIBCO)，然后加到2块96孔平底板(Falcon)，每孔100μl，在CO₂培养箱中培养。培养开始8～9小时后，加入含有HT和1mg/ml的GENETICIN(GIBCO)的CHO-S-SFMⅡ培养基(每孔100μl)，换成500μg/ml的GENETICIN选择培养基，选择导入了抗体基因的细胞。每3～4日将1/2量的培养基换成新鲜的培养基，从换成选择培养基后大约2周的时间，其4～5日后回收观察到细胞正常增殖的孔的培养上清。通过上述的抗体浓度测定ELISA测定该培养上清中出现的抗体浓度，挑选出抗体产生量高的细胞。(2)人源化抗体的大量纯化

将象上面那样挑选出的表达人源化抗体(“b-b”、“i-b”和“i-b2”)的DG44细胞株用2L摇瓶(CONING)在500ml/瓶的CHO-S-SFMII培养基中培养数日后，回收培养液，加入新鲜的CHO-S-SFMII培养基，再培养。培养液通过离心分离除去细胞碎片，用0.22μm或0.4μm的过滤膜过滤。反复上述操作，分别得到总量约2L的培养上清。将得到的培养上清加到连有Protein A亲和柱(Poros)的ConSep LC100系统(Millipore)纯化抗体。(3)通过ELISA测定抗体浓度

抗体浓度测定用的ELISA板按如下操作制备。向ELISA用96孔板(例如Maxisorp,NUNC)的各个孔加入CB至浓度为1μg/ml的山羊抗人IgGγ抗体(BioSource)100μl进行固相化。用200μlDB封闭后，向各孔加入经DB阶段稀释的使抗体表达的COS-7细胞的培养上清或纯化的抗体。

于室温下培养1小时，用RB洗净后，然后加入用DB稀释了1000倍的结合了碱性磷酸酶的山羊抗人IgGγ抗体(BioSource)100μl。于室温下培养1小时，用RB洗净后，加入100μl底物溶液，然后用微量板读数仪(Bio-Rad)测定405/655nm的吸光度。作为浓度测定的标准物可以用IgG4 κ(The Bingding Site)。(4)抗原结合能力的测定

按如下操作制备抗原结合测定用的Cell ELISA板。细胞使用人膀胱癌细胞J82(ATCC HTB-1)。将该细胞1×10⁶个加入到细胞培养用96孔板中。然后将培养板置于CO₂培养箱中培养一天(含有10％胎牛血清(GIBCO)的RPMI1640培养基)，使细胞铺满。将培养基倒掉，用PBS将各孔洗2次。向各孔加入100μl的PFA/PBS，静置于冰上10分钟，使细胞固相化。

将PFA/PBS倒掉，用300μl的PBS将各孔洗2次，用250μl的DB进行封闭。以上面测定结果为基础，将纯化抗体从10μg/ml开始，等比为2进行阶段稀释，然后向各孔加入100μl稀释的抗体，于室温培养2小时，用RB洗净后，加入100μl的用DB稀释1000倍的结合了碱性磷酸酶的山羊抗人IgGγ抗体(BioSource)。于室温下培养1小时，用RB洗净后，加入底物溶液100μl，然后用微量板读数仪(Bio-Rad)测定405/655nm的吸光度。

(5)TF中和活性(抑制因子Xa产生的活性)的测定

人源化抗体抑制因子Xa产生的活性可以通过以来自人胎盘的凝血激酶、Thromborel S(Behringwerke AG)引起的抑制因子Xa产生的活性为指标进行测定。即，向5mg/ml的Thromborel S 10μl和抗体10μl中加入缓冲液(含有5mM CaCl₂、0.1％的BSA的TBS)60μl，在96孔板中于室温反应1小时。抗体用缓冲液从200μg/ml开始以公比为5那样进行阶段稀释。

然后分别加入3.245μg/ml的人因子X(セルサス·ラボラトリ-ズ)和82.5ng/ml的人因子Ⅶa(エンザィム·リサ-チ)10μl，进一步于室温反应45分钟。加入10μl的0.5MEDTA终止反应。加入50μl发色底物溶液，用微量板读数仪(Bio-Rad)测定405/655nm的吸光度。于室温再反应30分钟，再次测定405/655nm的吸光度。以没有加抗体的30分钟吸光度为活性100％，通过从各个吸光度变化算出残存活性(％)。

发色底物溶液是按照附带的说明书溶解テストチ-ム发色底物S-2222(Chromogenix)，以1∶1比例与聚戊烯溶液(0.6mg/mlハキサジメチリンブロマイド、SIGMA)混合制备的。(6)TF中和活性(因子X结合抑制活性)的测定

人源化抗体的因子X结合抑制活性是通过使用来自人胎盘的凝血激酶、Thromborel S(Behringwerke AG)，预先形成TF和因子Ⅶa的复合物，以该复合物引起的因子X结合抑制活性为指标进行测定的。即，向5mg/ml的Thromborel S 10μl和82.5ng/ml的因子Ⅶa(エンザイム·リサ-チ)10μl中加入缓冲液(含有5mM CaCl₂、0.1％的BSA的TBS)60μl，在96孔板中于室温反应1小时。

加入抗体溶液10μl，于室温下反应5分钟后，然后加入3.245μg/ml的人因子X(セルサス·ラボラトリ-ズ)10μl，进一步于室温反应45分钟。而抗体溶液用缓冲液从200μg/ml开始以等比为2进行阶段稀释。加入10μl的0.5M EDTA终止反应。加入50μl发色底物溶液，用微量板读数仪(Bio-Rad)测定405/655nm的吸光度。于室温再反应30分钟，再次测定405/655nm的吸光度。以没有加抗体的30分钟内吸光度为活性100％，通过从各个吸光度变化算出残存活性(％)。

发色底物溶液是按照附带的说明书溶解テストチ-ム发色底物S-2222(Chromogenix)，以1∶1比例与聚戊烯溶液(0.6mg/mlハキサジメチリンブロマィド、SIGMA)混合制备的。(7)TF中和活性(血浆凝固抑制活性)的测定

人源化抗体的TF中和活性(血浆凝固抑制活性)是以使用来自人胎盘的凝血激酶、Thromborel S(Behringwerke AG)的凝血酶原为指标进行测定的。即，向样品杯中加入人血浆(コスモ·バィオ)100μl,加入稀释为各种浓度的抗体50μl，于37℃加温3分钟。然后加入预先于37℃加温的1.25mg/ml的Thromborel S 50μl，使血浆开始凝固。该凝固时间通过连有Amelung KC-10A(均自エム·シ-·メディヵル)测定。

抗体用含有0.1％的BSA的TBS(以下称为BSA-TBS)从80μg/ml开始以等比为2进行阶段稀释。以没加测定抗体的凝固时间为100％的TG血浆凝固活性，通过画出Thromborel S浓度和凝固时间的检测曲线，从添加了抗体时的各个凝固时间可以算出TF残存活性。

标准曲线是通过测定Thromborel S浓度和凝固时间作出的。向适当稀释的Thromborel S 50μl中加入50μl的BSA-TBS，于37℃加温3分钟。然后加入预先于37℃加温的人血浆100μl，开始凝固时开始测定凝固时间。Thromborel S从6.25μg/ml开始以等比为2用含有25mM的CaCl2的ハンクス缓冲液(GIBCO)阶段稀释。横轴为Thromborel S浓度，纵轴为凝固时间作成对数图，以此作为标准曲线。(8)活性评价

“b-b”、“i-b”和“i-b2”的人源化抗体都具有与嵌合抗体同等以上的活性(图31)。就因子Xa产生抑制活性、因子X结合抑制活性和血浆凝固抑制活性来说，“b-b”、“i-b”和“i-b2”的人源化抗体也都具有与嵌合抗体同等以上的活性，按照“i-b2”＞“i-b”＞“b-b”的顺序活性依次增强(图32、33、34)。实施例6.使用BIACORE对TF和抗TF抗体的相互作用中的反应动力学进行解析

利用BIACORE可以进行抗原抗体反应动力学的解析。将重组型蛋白G于传感器芯片固相化，使抗体与它结合，作为抗原可以使用纯化的重组型TF(将FLAG peptide tag付在1-219上的可溶性TF)(以下称为可溶性TF)，将制备成各种浓度的可溶性TF作为分析对象。通过从得到的传感图算出动力学参数(解离速率常数kdiss和结合速率常数kass)。关于动力学的解析可以参考“采用新型的基于生物传感器的分析系统对单克隆抗体-抗原相互作用的动力学分析”“Kinetic analysis ofmonoclonal antibody-antigen interactions with a new biosensor basedanalytical system”(Karlsson,R.等(1991)免疫法方法杂志J.Immunol.Methods 145,229-240.)等文献。(1)蛋白G向传感器芯片的固相化

蛋白G(ZYMED)向传感器芯片CM5(BIACORE)的固相化。

作为流动缓冲液使用HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES pH7.4,0.15MNaCl,3mMEDTA,0.05％聚山梨醇酯20(v/v))(BIACORE)，流速为5μl。利用100μl的0.05MN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)/0.2M盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)的注入将传感器芯片CM5的羧甲基葡聚糖的羧基活化。然后注入10μl的50μg/ml蛋白G，反复进行3次进行固相化。蛋白G是通过溶解于10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中使其浓度为10mg/ml,用10mM醋酸钠缓冲液(pH4.0)稀释成50μg/ml来制备的。然后再注入100μl的1.0M乙醇胺-盐酸(pH8.5)，封闭过量的活性基团。再注入10μl的10mM甘氨酸盐酸缓冲液(pH2.5)和10μl的10mM盐酸，洗去非共价结合的物质。添加到各个流式池中，注入10μl的72nM的人源化抗体版本“ib2”，确认大约结合1000RU。(2)固相化抗TF抗体与人TF的相互作用

人TF是通过使在氨基酸序列1-219的C末端连接了FLAG肽后的产物在CHO细胞中表达、纯化的。它可用作可溶性人TF。

用HBS-EP作流动缓冲液，流速为20μL/分，注入10μl的72nM的抗体溶液，使抗体固相化。用HBS-EP缓冲液稀释抗体。以30μL/分的流速向固相化抗体注入各种浓度的可溶性人TF溶液40μL，分析以进行注入的80秒为结合相，然后改换为HBS-EP缓冲液，作为120秒的解离相。解离相结束后，通过注入10μL的20mM的盐酸，使传感器芯片再生。将该结合、解离和再生作为分析的一个循环，可以得到有关各种抗体的传感图。而可溶性人TF溶液是用HBS-EP缓冲液，配成250nM、125nM、62.5nM、31.3nM、15.6nM、7.81nM、3.91nM各种浓度。空白用注入稀释用的HBS-EP缓冲液得到的传感图。

以上实验分别在流式池的1～3中进行的。(3)相互作用的动力学的解析

读入目的数据文件，就目的反应区域，以HBS-EP缓冲液的传感图作为基线，比较通过重叠画的反应曲线。再利用作为通过曲线拟合进行动力学参数(结合速率常数kass和解离速率常数kdiss)计算的BIACORE专用的解析应用软件的“BIAevaluation 2.1”(Pharmacia)，进行相互作用的动力学解析。而在求结合速率常数kass中，利用了解析模型4(BIAevaluation 2.1 A1～A5)。由从各个流动池算出的值可得到各种抗体的动力学参数。结果(从各个流动池算出的值的平均值±标准偏差)如表6所示。表6嵌合以及人源化抗TF抗体的动力学参数(n=3)

	嵌合	b-b	i-b	i-b2
	嵌合	b-b	i-b	i-b2	kdiss[×10^-4 l/s]	5.06±0.12	9.52±0.22	6.49±0.17	6.35±0.15
kass[×10⁵ l/Ms]	4.65±0.32	4.15±0.27	4.67±0.30	5.44±0.36	kdiss[×10^-4 l/s]	5.06±0.12	9.52±0.22	6.49±0.17	6.35±0.15
kass[×10⁵ l/Ms]	4.65±0.32	4.15±0.27	4.67±0.30	5.44±0.36	KD[×10^-9M]	1.09±0.09	2.30±0.15	1.39±0.13	1.17±0.11

实施例7．人源化抗TF抗体对人TF的反应性的测定

利用点印迹杂交法(《修订版用于分子生物学研究的蛋白质实验法》(羊土社)竹绳忠臣/编p.101)研究对非变性TF、非还原TF、非还原下变性TF、还原下变性TF的反应性。TF使用使细胞外区域带有的FLAG标记的TF在CHO细胞表达、纯化的TF(shTF)。将shTF分别用以下3种缓冲液(缓冲液A:10mM Tris-HCl,pH8.0；缓冲液B:10mMTris-HCl,pH8.0,8M尿素；缓冲液C:10mMTris-HCl,pH8.0,8M尿素，5mMDTT)稀释。用缓冲液A处理的为非变性的TF，用缓冲液B处理的为非还原下变性TF，还原下变性TF是用缓冲液C处理后制备的。各个样品于室温下处理24小时。处理后将样品印迹在硝基纤维素膜(Bio-Rad)上。样品分别取0.5μl、1μl和2μl(3μg/ml)点在膜上，将膜风干。用DB(50mM Tris-HCl,pH8.1,0.15M NaCl,1M MgCl₂,0.05％(v/v)Tween 20,0.02％(w/v)NaN₃,1％(w/v)BSA)封闭。用含有人源化抗TF抗体的DB或DB(对照)使膜反应。用含有0.05％(v/v)Tween 20的PBS洗净后，用含有过氧化物酶标记抗人IgG抗体(DAKO)的DB使其反应。用含有0.05％(v/v)Tween 20的PBS洗净后，用ECL Western印迹试剂(Amersham)处理，暴露于X光片30秒钟。

如图35所示那样嵌合抗TF抗体和人源化抗体(版本“bb”“ib”和“ib2”)对非变性TF、非还原下变性TF、还原下变性TF都反应。实施例8．在大鼠急性DIC模型中抗血栓作用的确认

关于抗TF抗体的抗血栓作用可以通过使用大鼠的组织促凝血酶原激酶诱发的DIC模型确认。即通过用3小时连续向SD系雄性大鼠静脉注射人组织促凝血酶原激酶溶液(用量为40mg/kg)制作DIC模型。抗TF抗体(嵌合和人源化抗TF抗体i-b2)分别以0.2mg/kg的用量在开始注射组织促凝血酶原激酶溶液前5分钟向静脉内注射。组织促凝血酶原激酶溶液连续注射结束15分钟后，从腹部大动脉采集加柠檬酸的血液，测定血小板数、活化部分组织促凝血酶原激酶时间(aPTT)、纤维蛋白原浓度(Fib)、可溶性纤维蛋白单体复合物(sFMC)浓度、凝血酶/抗凝血酶Ⅲ复合物(TAT)浓度。

测定的结果如表7所示那样，由于连续注入组织促凝血酶原激酶，可以确认血小板减少、aPTT延长、纤维蛋白原浓度减少、sFMC和TAT浓度上升，呈现明显的凝固亢进状态。与此相反，嵌合和人源化抗体都大致同样强烈抑制这些变化。

这些结果表明：人源化抗TF抗体作为抗血栓药是很有用的。表7

测定项目	没有注入组织促凝血酶原激酶的正常组	给予溶剂的对照组	给予嵌合抗体细	给予人源化抗体组
测定项目	没有注入组织促凝血酶原激酶的正常组	给予溶剂的对照组	给予嵌合抗体细	给予人源化抗体组	血小板数(×10⁴/mm³)	115.5±11.8	82.9±14.3	100.7±12.9	96.1±13.3
aPTT(秒)	20.1±1.1	36.2±13.9	22.3±0.7^a)	21.8±1.3^a)	血小板数(×10⁴/mm³)	115.5±11.8	82.9±14.3	100.7±12.9	96.1±13.3
aPTT(秒)	20.1±1.1	36.2±13.9	22.3±0.7^a)	21.8±1.3^a)	纤维蛋白原浓度(正常组为100％)	100.0±4.2	64.8±20.0	101.0±6.6^a)	98.9±5.7^a)
sFMC浓度(μg/ml)	74.2±5.5	3517±3645	129.9±46.8^a)	66.5±23.0^a)	纤维蛋白原浓度(正常组为100％)	100.0±4.2	64.8±20.0	101.0±6.6^a)	98.9±5.7^a)
sFMC浓度(μg/ml)	74.2±5.5	3517±3645	129.9±46.8^a)	66.5±23.0^a)	TAT浓度(ng/ml)	3.4±0.6	29.6±31.0	3.8±0.7^b)	4.2±0.9

(平均值±标准偏差)相对于给予溶剂的对照组的有显著性差异：a):p＜0.01,b)p＜0.05参考例1．抗TF单克隆抗体的制作1．人TF的纯化

从人胎盘纯化TF是按照Ito等人的方法(Ito,T.等人生物化学杂志(J.Biochem.)114,691-696,1993)进行的。即将人胎盘在含有10mM氯化苯甲脒、1mM苯甲磺酰氟、1mM氟磷酸二异丙酯和0.02％NaN₃的Tris缓冲生理盐水(TBS,pH7.5)中匀浆后，用冷丙酮对沉淀脱脂，将得到的脱脂粉末悬浮于含有2％Triton X-100的上述缓冲液中，将TF溶化。

使用Concanavalin A-Sepharose 4B柱(Pharmacia)和使TF抗体结合的Sepharose 4B柱(Pharmacia)进行亲和层析，从上述的上清中得到纯化TF。经超滤膜(PM-10,Amicon)浓缩、作为纯化标准品于4℃下保存。

利用市售的抗TF单克隆抗体(American Diagnostica)和多克隆抗体(American Diagnostica)组合的夹心(Sandwich)ELISA，以重组型TF为标准对纯化标准品中的TF含量进行定量。

另外通过对使用4-20％浓度梯度的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE后的凝胶进行银染色，对纯化标准品的纯度进行确认。2．免疫和杂交瘤的制作

将纯化人TF(约70μg/ml)与等量的Freund完全佐剂(Difco)混合后作为TF，以10μg/小鼠的量向5周龄的Balb/c系雄性小鼠(日本チヤ-ルスリバ-)的腹部皮下进行免疫。于免疫后第12、18和25日，使用与Freund不完全佐剂混合的TF，以5μg/小鼠的量向小鼠皮下进行追加免疫，作为最终免疫，于第32日以5μg/小鼠的量向腹腔内注入用PBS稀释的TF溶液。

最终免疫3日后，从4只小鼠中制备脾细胞，使用聚乙二醇法与细胞数为脾细胞数1/5的小鼠骨髓瘤细胞株P3U1融合。将融合细胞悬浮于含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基(以下称为RPMI-培养基)(Lifetech oriental)，向96孔板(每只小鼠400个孔)加入细胞(每孔约400个细胞)。融合后，第1、2、3、5日，通过将一半培养基换成含有HAT(大日本制药)和condimed H1(Boehringer Mannheim GmbH)的RPMI-1640培养基(以下称为HAT-培养基)进行杂交瘤的HAT选择。

利用下面的筛选法对选择的杂交瘤通过2次有限稀释克隆化。

有限稀释，两块96孔板中每一孔接种0.8个细胞。对通过镜检能够确认是单一菌落的孔进行如下给出的TF结合活性和TF中和活性的测定，选择克隆。得到的克隆从HAT-培养基转到RPMI-培养基中驯化，在确认通过驯化抗体产生能力没有降低的基础上，再次进行有限稀释，进行完全的克隆化。通过以上操作，能够确立能够产生强烈抑制TF/因子Ⅶa复合物和因子X结合的6种抗体(ATR-2、3、4、5、7和8)的杂交瘤。3．腹水的制作和抗体的纯化

确立的杂交瘤的腹水的制作按照常规方法进行。即将在体外进行继代的杂交瘤106个移植到预先2次向腹腔注入矿物油的Balb/c系雄性小鼠的腹腔内。移植后1～2周从腹部肥大的小鼠回收腹水。

从腹水纯化抗体是使用配备了蛋白A柱(日本ガィシ)的ConSepLC100系统(Millipore)进行的。4．Cell-ELISA

将通过对已知TF高表达的来自人膀胱癌细胞J82(Fair D.S.等人、生物化学杂志(J.Biol.Chem.)262,11692-11698,1987)由ATCC导入，在RPMI-培养基中，于37℃、5％CO₂、100％湿度条件下进行继代、维持。

按如下操作制作Cell ELISA用的板：将J82细胞以10⁵个/孔的浓度接种于96孔板中，在上述条件下培养一天后，除去培养基，用磷酸缓冲生理盐水(PBS)洗2次，加入4％多聚甲醛溶液(PFA)，通过在冰冷条件下静置10分钟，进行固相化。除去PFA，用PBS洗净后，加入含有1％BSA和0.02％叠氮钠的Tris缓冲液(封闭缓冲液)，在使用之前保存在4℃下。

Cell-ELISA操作如下。即，从上述制作的板中除去封闭液，加入抗TF抗体溶液或杂交瘤培养上清，于室温反应1.5小时。用含有0.05％的Tween20的PBS洗净后，加入结合了碱性磷酸酶的山羊抗小鼠IgG(H+L)(Zymed)，使其反应1小时，洗净后，加入浓度1mg/ml的对硝基苯磷酸二钠(Sigma)，1小时后，通过测定在405nm的吸光度，对结合于J82细胞的抗TF抗体量进行定量。5．以因子Xa活性为指标的TF中和活性测定体系

向含有50μl的5mM CaCl₂和0.1％牛血清白蛋白的Tris缓冲生理盐水(TBS,pH7.6)中加入10μl来自人胎盘的凝血激酶溶液(5mg/ml)(Thromborel S)(Boehring)和10μl因子Ⅶa溶液(82.5ng/ml)(American Diagnostica)，于室温反应1小时，使其形成TF/因子Ⅶa复合物后，添加10μl稀释到指定浓度的抗TF抗体溶液或杂交瘤培养上清以及10μl因子X(3.245μg/ml)(Celsus Laboratorise)，反应45分钟，加入10μl的0.5M EDTA终止反应。再加入50μl 2mM S-2222(第一化学药品)，将30分钟内405nm吸光度变化作为TF的因子Xa产生活性。利用这一方法可以测定抑制TF/因子Ⅶa复合物和因子X结合的抗体的活性。6．血浆凝固抑制活性测定体系

使用市售的正常人血浆(コ-ジンバイオ)，该血浆100μl与适当稀释的抗TF抗体溶液50μl混合后，于37℃下反应3分钟，添加50μl来自人胎盘的凝血激酶溶液(1.25mg/ml)，用血浆凝固时间测定装置(CR-A:Amelung)测定直至血浆凝固为止的时间。7．抗体同型的确定

关于杂交瘤的培养上清或纯化抗体使用小鼠单克隆抗体同型测定试剂盒(Amersham公司制造)确认抗体同型，结果如下所示。

表8

抗TF单克隆抗体的免疫球蛋白同型

ATR-2 IgG1,k

ATR-3 IgG1,k

ATR-4 IgG1,k

ATR-5 IgG1,k

ATR-7 IgG2a,k

ATR-8 IgG2a,k参考例2．可溶性TF的制作方法

可溶性TF(shTF)是按以下过程制作的。

将编码人TF的贯通区(第220个氨基酸)以下置换为FLAG肽M2的TF的基因插入到哺乳动物细胞用的表达载体(新霉素抗性基因、含有DHFR基因)中，导入CHO细胞。人TF的cDNA序列以James H.Morrissey等人的报告(细胞(Cell)(1987)50,129-135)为参考。序列号151给出了该可溶性人TF的基因序列和氨基酸序列。利用G418进行药剂选择、挑选表达细胞，再用氨基蝶呤进行表达扩增，确立shTF表达细胞。

将该细胞在无血清培养基CHO-S-SFMII(GIBCO)培养，得到含有shTF的培养上清。用同容量的40mM Tris盐酸缓冲液(pH8.5)稀释2倍，加到用20mM Tris盐酸缓冲液(pH8.5)平衡的Q-Sepharose FastFlow柱(100mL,Pharmacia Biotech)，用含有0.1M NaCl的同样的缓冲液洗净后，将NaCl的浓度调到0.3M，从柱子洗脱出shTF。向得到的shTF加硫酸铵，硫酸铵终浓度为2.5M，经离心(10000rpm、20分钟)使杂蛋白沉淀。上清中加入Butyl TOYOPEARL(30ml,TOSOH)，用含有2.5M的硫酸铵的50mM Tris盐酸缓冲液(pH6.8)洗净。于50mMTris盐酸缓冲液(pH6.8)中，使硫酸铵浓度由2.5M直线下降到0M，将shTF洗脱出来。含有shTF的峰级分用Centri-Prep 10(Amicon)浓缩。将该浓缩液加到用含有150mM NaCl的20mM Tris盐酸缓冲液(pH7.0)平衡的TSK gel G3000SWG柱(21.5×600mm,TOSOH)，回收shTF峰级分。对此级分用0.22μm的过滤膜进行过滤灭菌，作为可溶性人TF(shTF)。样品的吸光度280nm的摩尔吸光系数为ε=40130、分子量为43210，可算出样品的浓度。

序列表<223>记载的内容如下。序列号：1：引物MHC-G1序列号：2：引物MHC-G2a序列号：3：引物MKC序列号：4：M13引物M4序列号：5：M13引物RV序列号：6：小鼠抗TF单克隆抗体ATR-2的H链V区的氨基酸序列和编码它的碱基序列序列号：7：小鼠抗TF单克隆抗体ATR-3的H链V区的氨基酸序列和编码它的碱基序列序列号：8：小鼠抗TF单克隆抗体ATR-4的H链V区的氨基酸序列和编码它的碱基序列序列号：9：小鼠抗TF单克隆抗体ATR-5的H链V区的氨基酸序列和编码它的碱基序列序列号：10：小鼠抗TF单克隆抗体ATR-7的H链V区的氨基酸序列和编码它的碱基序列序列号：11：小鼠抗TF单克隆抗体ATR-8的H链V区的氨基酸序列和编码它的碱基序列序列号：12：小鼠抗TF单克隆抗体ATR-2的L链V区的氨基酸序列和编码它的碱基序列序列号：13：小鼠抗TF单克隆抗体ATR-3的L链V区的氨基酸序列和编码它的碱基序列序列号：14：小鼠抗TF单克隆抗体ATR-4的L链V区的氨基酸序列和编码它的碱基序列序列号：15：小鼠抗TF单克隆抗体ATR-5的L链V区的氨基酸序列和编码它的碱基序列序列号：16：小鼠抗TF单克隆抗体ATR-7的L链V区的氨基酸序列和编码它的碱基序列序列号：17：小鼠抗TF单克隆抗体ATR-8的L链V区的氨基酸序列和编码它的碱基序列序列号：18：引物ch5HS序列号：19：引物ch5HA序列号：20：引物ch5LS序列号：21：引物ch5LA序列号：22：CDR移植引物hR5Hv1S序列号：23：CDR移植引物hR5Hv2S序列号：24：CDR移植引物hR5Hv4S序列号：25：CDR移植引物hR5Hv3A序列号：26：CDR移植引物hR5Hv5A序列号：27：引物hR5HvPrS序列号：28：引物hR5HvPrA序列号：29：人源化H链V区版本“a”的氨基酸序列和编码它的碱基序列序列号：30：人源化H链V区版本“a”的氨基酸序列序列号：31：FR改组引物F3RFFS序列号：32：FR改组引物F3RFBS序列号：33：FR改组引物F3RFFA序列号：34：FR改组引物F3RFBA序列号：35：FR改组引物F3NMFS序列号：36：FR改组引物F3NMBS序列号：37：FR改组引物F3NMFA序列号：38：FR改组引物F3NMBA序列号：39：人源化H链V区版本“b”的氨基酸序列和编码它的碱基序列序列号：40：人源化H链V区版本“b”的氨基酸序列序列号：41：人源化H链V区版本“c”的氨基酸序列和编码它的碱基序列序列号：42：人源化H链V区版本“c”的氨基酸序列序列号：43：FR改组引物F3EPS序列号：44：FR改组引物F3EPA序列号：45：引物F3PrS序列号：46：引物F3PrA序列号：47：FR改组引物F3vHS序列号：48：FR改组引物F3vHA序列号：49：人源化H链V区版本“d”的氨基酸序列和编码它的碱基序列序列号：50：人源化H链V区版本“d”的氨基酸序列序列号：51：人源化H链V区版本“e”的氨基酸序列和编码它的碱基序列序列号：52：人源化H链V区版本“e”的氨基酸序列序列号：53：FR改组引物F3SSS序列号：54：FR改组引物F3SSA序列号：55：FR改组引物F3CDS序列号：56：FR改组引物F3CDA序列号：57：人源化H链V区版本“f”的氨基酸序列和编码它的碱基序列序列号：58：人源化H链V区版本“f”的氨基酸序列序列号：59：人源化H链V区版本“g”的氨基酸序列和编码它的碱基序列序列号：60：人源化H链V区版本“g”的氨基酸序列序列号：61：FR改组引物F3ADS序列号：62：FR改组引物F3ADA序列号：63：人源化H链V区版本“h”的氨基酸序列和编码它的碱基序列序列号：64：人源化H链V区版本“h”的氨基酸序列序列号：65：FR改组引物F3MMS序列号：66：FR改组引物F3MMA序列号：67：FR改组引物F3BMS序列号：68：FR改组引物F3BMA序列号：69：人源化H链V区版本“i”的氨基酸序列和编码它的碱基序列序列号：70：人源化H链V区版本“i”的氨基酸序列序列号：71：人源化H链V区版本“j”的氨基酸序列和编码它的碱基序列序列号：72：人源化H链V区版本“j”的氨基酸序列序列号：73：FR改组引物F2MPS序列号：74：FR改组引物F2MPA序列号：75：人源化H链V区版本“b1”的氨基酸序列和编码它的碱基序列序列号：76：人源化H链V区版本“b1”的氨基酸序列序列号：77：人源化H链V区版本“d1”的氨基酸序列和编码它的碱基序列序列号：78：人源化H链V区版本“d1”的氨基酸序列序列号：79：FR改组引物F2VHS序列号：80：FR改组引物F2VHA序列号：81：人源化H链V区版本“b3”的氨基酸序列和编码它的碱基序列序列号：82：人源化H链V区版本“b3”的氨基酸序列序列号：83：人源化H链V区版本“d3”的氨基酸序列和编码它的碱基序列序列号：84：人源化H链V区版本“d3”的氨基酸序列序列号：85：FR改组载体Lv1S序列号：86：FR改组载体h5Lv4S序列号：87：FR改组载体h5Lv2A序列号：88：FR改组载体h5Lv3A序列号：89：FR改组引物h5Lv5A序列号：90：引物h5LvS序列号：91：引物h5LvA序列号：92：人源化L链V区版本“a”的氨基酸序列和编码它的碱基序列序列号：93：人源化L链V区版本“a”的氨基酸序列序列号：94：FR改组引物F3SS序列号：95：FR改组引物F3SA序列号：96：FR改组引物F3RS序列号：97：FR改组引物F3RA序列号：98：人源化L链V区版本“b”的氨基酸序列和编码它的碱基序列序列号：99：人源化L链V区版本“b”的氨基酸序列序列号：100：人源化L链V区版本“c”的氨基酸序列和编码它的碱基序列序列号：101：人源化L链V区版本“c”的氨基酸序列序列号：102：FR改组引物F2SS序列号：103：FR改组引物F2SA序列号：104：FR改组引物F2XS序列号：105：FR改组引物F2XA序列号：106：人源化L链V区版本“b1”的氨基酸序列和编码它的碱基序列序列号：107：人源化L链V区版本“b1”的氨基酸序列序列号：108：人源化L链V区版本“b2”的氨基酸序列和编码它的碱基序列序列号：109：人源化L链V区版本“b2”的氨基酸序列序列号：110：人源化H链V区所有版本的FR1的氨基酸序列序列号：111：人源化H链V区版本“a”～ “j”的FR2的氨基酸序列序列号：112：人源化H链V区版本“b1”及“d1”的FR2的氨基酸序列序列号：113：人源化H链V区版本“b3”及“d3”的FR2的氨基酸序列序列号：114：人源化H链V区版本“a”的FR3的氨基酸序列序列号：115：人源化H链V区版本“b”、“b1”及“b3”的FR3的氨基酸序列序列号：116：人源化H链V区版本“c”的FR3的氨基酸序列序列号：117：人源化H链V区版本“d”、“d1”及“d3”的FR3的氨基酸序列序列号：118：人源化H链V区版本“e”的FR3的氨基酸序列序列号：119：人源化H链V区版本“f”的FR3的氨基酸序列序列号：120：人源化H链V区版本“g”的FR3的氨基酸序列序列号：121：人源化H链V区版本“h”的FR3的氨基酸序列序列号：122：人源化H链V区版本“i”的FR3的氨基酸序列序列号：123：人源化H链V区版本“j”的FR3的氨基酸序列序列号：124：人源化H链V区所有版本的FR4的氨基酸序列序列号：125：人源化L链V区所有版本的FR1的氨基酸序列序列号：126：人源化L链V区版本“a”, “b”和“c”的FR2的氨基酸序列序列号：127：人源化L链V区版本“b1”的FR2的氨基酸序列序列号：128：人源化L链V区版本“b2”的FR2的氨基酸序列序列号：129：人源化L链V区版本“a”的FR3的氨基酸序列序列号：130：人源化L链V区版本“b”、“b1”及“b2”的FR3的氨基酸序列序列号：131：人源化L链V区版本“c”的FR3的氨基酸序列序列号：132：人源化L链V区所有版本的FR4的氨基酸序列序列号：133：人源化H链V区所有版本的CDR1的氨基酸序列序列号：134：人源化H链V区所有版本的CDR2的氨基酸序列序列号：135：人源化H链V区所有版本的CDR3的氨基酸序列序列号：136：人源化L链V区所有版本的CDR1的氨基酸序列序列号：137：人源化L链V区所有版本的CDR2的氨基酸序列序列号：138：人源化L链V区所有版本的CDR3的氨基酸序列序列号：139：小鼠抗TF单克隆抗体ATR-2的H链V区的氨基酸序列序列号：140：小鼠抗TF单克隆抗体ATR-3的H链V区的氨基酸序列序列号：141：小鼠抗TF单克隆抗体ATR-4的H链V区的氨基酸序列序列号：142：小鼠抗TF单克隆抗体ATR-5的H链V区的氨基酸序列序列号：143：小鼠抗TF单克隆抗体ATR-7的H链V区的氨基酸序列序列号：144：小鼠抗TF单克隆抗体ATR-8的H链V区的氨基酸序列序列号：145：小鼠抗TF单克隆抗体ATR-2的L链V区的氨基酸序列序列号：146：小鼠抗TF单克隆抗体ATR-3的L链V区的氨基酸序列序列号：147：小鼠抗TF单克隆抗体ATR-4的L链V区的氨基酸序列序列号：148：小鼠抗TF单克隆抗体ATR-5的L链V区的氨基酸序列序列号：149：小鼠抗TF单克隆抗体ATR-7的L链V区的氨基酸序列序列号：150：小鼠抗TF单克隆抗体ATR-8的L链V区的氨基酸序列序列号：151：可溶性人TF的氨基酸序列和编码它的碱基序列序列号：152：可溶性人TF的氨基酸序列

序列表<110>中外制药株式会社<120>抗人组织因子的人源化抗体以及人源化抗体的制作方法<130>G821<150>JP 10-91850<151>1998-04-03<160>152<210>1<211>28<212>DNA<213>人工合成序列(Artificial Sequence)<220><223>引物MHC-G1(Primer MHC-G1)<400>1ggatcccggg ccagtggata gacagatg 28<210>2<211>27<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>引物MHC-G2a<400>2ggatcccggg agtggataga ccgatgg 27<210>3<211>27<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>引物MKC<400>3ggatcccggg tggatggtgg gaagatg 27<210>4<211>17<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>M13引物M4<400>4gttttcccag tcacgac 17<210>5<211>17<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>M13引物RV<400>5caggaaacag ctatgac 17<210>6<211>411<212>DNA<213>小鼠<220><221>sig-peptide<222>(1)…(57)<220><221>mat-peptide<222>(58)…(441)<223>编码抗TF的小鼠单克隆抗体ATR-2的H链V区的核苷酸序列<400>6atg gaa tgg agc tgg atc ttt ctc ttc ctc ctg tca gga act aca ggt 48Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Thr Gly

-15 -10 -5gtc cac tct gag atc cag ctg cag cag tct gga cct gag ctg gtg aag 96Val His Ser Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys

1 5 10cct ggg gct tca gtg aag gta tcc tgc aag gct tct ggt tac tca ttc 144Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe

15 20 25act gac tac aac atg tac tgg gtg aag cag agc cat gga aag agc ctt 192Thr Asp Tyr Asn Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu30 35 40 45gag tgg att gga tat att gat cct tac aat ggt ggt act atc tac aac 240Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Ash Gly Gly Thr Ile Tyr Asn

50 55 60cag aag ttc aag ggc aag gcc aca ttg act gtt gac aag tcc tcc agc 288Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

65 70 75aca gcc ttc atg cat ctc aac agc ctg aca tct gag gac tct gca gtc 336Thr Ala Phe Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

80 85 90tat tac tgt gca aga gga ggg gaa ggg tac tac ttt gac tac tgg ggc 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Glu Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

95 100 105caa ggc acc act ctc aca gtc tcc tca 411Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser110 115<210>7<211>411<212>DNA<213>小鼠<220><221>sig-peptide<222>(1)…(57)<220><221>mat-peptide<222>(58)…(441)<223>编码抗TF的小鼠单克隆抗体ATR-3的H链V区的核苷酸序列<400>7atg gaa tgg agc tgg atc ttt ctc ttc ctc ctg tca gga act aca ggt 48Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Thr Gly

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50 55 60ccg aag ttc cag ggc aag gcc agt ata aca gca gac aca tcc tcc aac 288Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Ser Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ash

65 70 75aca gcc tac ctg cag ctc agc agc ctg aca tct gag gac act gcc gtc 336Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val

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-15 -10 -5gtc aat tca gag gtt cag ctg cag cag tct ggg act aac ctt gtg agg 96Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Asn Leu Val Arg

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-20 -15 -10ttt cca ggt atc aga tgt gac atc aag atg acc cag tct cca tcc tcc 96Phe Pro Gly Ile Arg Cys Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

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20 25 30Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

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50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

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100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

115<210>51<211>414<212>DNA<213>人工合成序列<220><221>sig-peptide<222>(1)…(57)<220><221>mat-peptide<222>(58)…(414)<223>编码人源化H链V区的版本“e”的核苷酸序列<400>51atg aaa tgc agc tgg gtc atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg 49Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly

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50 55 60Gln Gly Arg Val Ser Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Lys Ile Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

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80 85 90gag agc ccg tac acg ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa 381Glu Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

95 100 105<210>93<211>107<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>人源化L链V区的版本“a”的氨基酸序列<400>93Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Ser Phe

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35 40 45Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Tyr

85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

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tgtaatcggt accagac 77<210>96<211>77<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>FR改组引物(Shuffling primer) F3RS<400>96gtctggtacc gattacactc tcaccatctc gagcctccag cctgaagata ttgcaactta 60ctattgtctg cagaaca 77<210>97<211>77<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>FR改组引物(shuffling primer) F3RA<400>97tgttctgcag acaatagtaa gttgcaatat cttcaggctg gaggctcgag atggtgagag 60tgtaatcggt accagac 77<210>98<211>381<212>DNA<213>人工合成序列<220><221>sig-peptide<222>(1)…(60)<220><221>mat-peptide<222>(61)…(381)<223>编码人源化L链V区的版本“b”的核苷酸序列<400>98atg agg gcc cct gct cag ttt ttt ggg atc ttg ttg ctc tgg ttt cca 48Met Arg Ala Pro Ala Gln Phe Phe Gly Ile Leu Leu Leu Trp Phe Pro-20 -15 -10 -5ggg atc cga tgt gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct 96Glu Ile Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

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65 70 75agc ctc cag cct gaa gat ttt gca act tac tat tgt ctg cag cat ggt 336Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly

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20 25 30Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Tyr

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100 105<210>100<211>381<212>DNA<213>人工合成序列<220><221>sig-peptide<222>(1)…(60)<220><221>mat-peptide<222>(61)…(381)<223>编码人源化L链V区的版本“c”的核苷酸序列<400>100atg agg gcc cct gct cag ttt ttt ggg atc ttg ttg ctc tgg ttt cca 48Met Arg Ala Pro Ala Gln Phe Phe Gly Ile Leu Leu Leu Trp Phe Pro-20 -15 -10 -5ggg atc cga tgt gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct 96Gly Ile Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

30 35 40aag ctc ctg atc tat tat gca act agt ttg gca gat ggg gtc cca tca 240Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser45 50 55 60agg ttc agt ggc tcc gga tct ggt acc gat tac act ctc acc atc tcg 288Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75agc ctc cag cct gaa gat att gca act tac tat tgt ctg cag cat ggt 336ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly

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35 40 45Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Tyr

85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105<210>102<211>72<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>FR改组引物(Shuffling primer) F2SS<400>102gtctcttaag ttggttccag cagaaaccag ggaaatctcc taagaccctg atctactatg 60caactagtaa ca 72<210>103<211>72<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>FR改组引物(Shuffling primer) F2SA<400>103tgttactagt tgcatagtag atcagggtct taggagattt ccctggtttc tgctggaacc 60aacttaagag ac 72<210>104<211>72<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>FR改组引物(Shuffling primer) F2XS<400>104gtctcttaag ttggtatcag cagaaaccag agaaagcccc taagtccctg atctattatg 60caactagtaa ca 72<210>105<211>72<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>FR改组引物(Shuffling primer) F2XA<400>105tgttactagt tgcataatag atcagggact taggggcttt ctctggtttc tgctgatacc 60aacttaagag ac 72<210>106<211>381<212>DNA<213>人工合成序列<220><221>sig-peptide<222>(1)…(60)<220><221>mat-peptide<222>(61)…(381)<223>编码人源化L链V区的版本“b1”的核苷酸序列<400>106acg agg gtc cct gct cag ttt ttt ggg atc ttg ttg ctc tgg ttt cca 48Met Arg Ala Pro Ala Gln Phe Phe Gly Ile Leu Leu Leu Trp Phe Pro-20 -15 -10 -5ggg atc cga tgt gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct 96Gly Ile Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

15 20 25att aaa agc ttc tta agt tgg ttc cag cag aaa cca ggg aaa tct cct 192Ile Lys Ser Phe Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro

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35 40 45Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Tyr

85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105<210>108<211>381<212>DNA<213>人工合成序列<220><221>sig-peptide<222>(1)…(60)<220><221>mat-peptide<222>(61)…(381)<223>编码人源化L链V区的版本“b2”的核苷酸序列<400>108atg agg gcc cct gct cag ttt ttt ggg atc ttg ttg ctc tgg ttt cca 48Met Arg Ala Pro Ala Gln Phe Phe Gly Ile Leu Leu Leu Trp Phe Pro-20 -15 -10 -5ggg atc cga tgt gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct 96Gly Ile Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

15 20 25att aaa agc ttc tta agt tgg tat cag cag aaa cca gag aaa gcc cct 192Ile Lys Ser Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro

30 35 40aag tcc ctg atc tat tat gca act agt ttg gca gat ggg gtc cca tca 240Lys Ser Leu Ile Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser45 50 55 60agg ttc agt ggc tcc gga tct ggt acc gat tac act ctc acc atc tcg 288Arg Phe Set Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75age ctc cag cct gaa gat ttt gca act tac tat tgt ctg cag cat ggt 336Set Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly

95 100 105<210>109<211>107<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>人源化L链V区的版本“b2”的氨基酸序列<400>109Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Ser Phe

20 25 30Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105<210>110<211>30<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>人源化H链V区的所有版本的FR1的氨基酸序列<400>110Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg Pro Gly Thr

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5 10<210>114<211>32<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>人源化H链V区的版本“a”的FR3的氨基酸序列<400>114Arg Ala Lys Leu Thr Ala Ala Thr Ser Ala Ser Ile Ala Tyr Leu Glu

5 10 15Phe Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

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5 10 15Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30<210>116<211>32<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>人源化H链V区的版本“c”的FR3的氨基酸序列<400>116Arg Val Thr Met Leu Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg

5 10 15Leu Ser Ser Va1 Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

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5 10 15Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg

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5 10 15Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg

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5 10 15Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

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5 10 15Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Ser Cys Ala Arg

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5 10 15Trp Thr Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Arg

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5 10 15Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

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5 10 15Leu Arg Ser Leu Arg Ser Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

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5 10 15<210>127<211>15<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>人源化L链V区的版本“b1”的FR2的氨基酸序列<400>127Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile Tyr

5 10 15<210>128<211>15<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>人源化L链V区的版本“b2”的FR2的氨基酸序列<400>128Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr

5 10 15<210>129<211>32<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>人源化L链V区的版本“a”的FR3的氨基酸序列<400>129Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

5 10 15Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys

20 25 30<210>130<211>32<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>人源化L链V区的版本“b”、“b1”和“b3”的FR3的氨基酸序列<400>130Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr

5 10 15Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys

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5 10 15Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys

20 25 30<210>132<211>10<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>人源化L链V区的所有版本的FR4的氨基酸序列<400>132Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

5 10<210>133<211>5<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>人源化H链V区的所有版本的CDR1的氨基酸序列<400>133Asp Tyr Tyr Met His

5<210>134<211>17<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>人源化H链V区的所有版本的CDR2的氨基酸序列<400>134Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp Pro Lys Phe Gln

5 10 15Gly<210>135<211>8<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>人源化H链V区的所有版本的CDR3的氨基酸序列<400>135Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr

5<210>136<211>11<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>人源化L链V区的所有版本的CDR1的氨基酸序列<400>136Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Ser Phe Leu Ser

5 10<210>137<211>7<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>人源化L链V区的所有版本的CDR2的氨基酸序列<400>137Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp

5<210>138<211>9<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>人源化L链V区的所有版本的CDR3的氨基酸序列<400>138Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Tyr Thr

5<210>139<211>118<212>PRT<213>小鼠<220><223>小鼠抗TF的单克隆抗体ATR-2的H链V区的氨基酸序列<400>139Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

20 25 30Asn Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe65 70 75 80Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

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100 105 110Thr Leu Thr Val Ser Ser

115<210>140<211>118<212>PRT<213>小鼠<220><223>小鼠抗TF的单克隆抗体ATR-3的H链V区的氨基酸序列<400>140Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

20 25 30Asn Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe

85 90 95Ala Arg Gly Gly Glu Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110Thr Leu Thr Val Ser Ser

115<210>141<211>117<212>PRT<213>小鼠<220><223>小鼠抗TF的单克隆抗体ATR-4的H链V区的氨基酸序列<400>141Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

5 10 15Leu Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45Gly Leu Ile Asp Pro Gln Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60Gln Gly Lys Ala Ser Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95Asp Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110Val Thr Val Ser Ser

115<210>142<211>117<212>PRT<213>小鼠<220><223>小鼠抗TF的单克隆抗体ATR-5的H链V区的氨基酸序列<400>142Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Asn Leu Val Arg Pro Gly Ala

5 10 15Leu Val Lys Leu Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60Gln Gly Lys Ala Ser Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110Val Thr Val Ser Ser

115<210>143<211>118<212>PRT<213>小鼠<220><223>小鼠抗TF的单克隆抗体ATR-7的H链V区的氨基酸序列<400>143Asp Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ser

5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Asp Tyr

20 25 30Asn Ile Phe Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Thr Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Asn Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe65 70 75 80Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95Ala Arg Gly Phe Tyr Tyr Asp Tyr Asp Cys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110Leu Val Thr Val Ser Ala

115<210>144<211>118<212>PRT<213>小鼠<220><223>小鼠抗TF的单克隆抗体ATR-8的H链V区的氨基酸序列<400>144Asp Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

20 25 30Asn Ile Phe Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Thr Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60Asn Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe65 70 75 80Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95Ala Arg Gly Phe Tyr Tyr Asp Tyr Asp Cys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110Leu Val Thr Val Ser Ala

115<210>145<211>107<212>PRT<213>小鼠<220><223>小鼠抗TF的单克隆抗体ATR-2的L链V区的氨基酸序列<400>145Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu Gly

5 10 15Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp

20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Val Leu Ile

35 40 45Tyr Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ala65 70 75 80Glu Asp Phe Val Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Tyr Ser Thr Pro Tyr

85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105<210>146<211>107<212>PRT<213>小鼠<220><223>小鼠抗TF的单克隆抗体ATR-3的L链V区的氨基酸序列<400>146Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu Gly

5 10 15Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp

20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Va1 Leu Ile

35 40 45Tyr Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ala65 70 75 80Glu Asp Phe Val Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Tyr Ser Thr Pro Tyr

85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105<210>147<211>107<212>PRT<213>小鼠<220><223>小鼠抗TF的单克隆抗体ATR-4的L链V区的氨基酸序列<400>147Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly

5 10 15Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lya Ala Ser Gln Asp Ile Lys Thr Phe

20 25 30Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Trp Gln Ser Pro Lys Thr Leu Ile

35 40 45Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser65 70 75 80Asp Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Tyr

85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105<210>148<211>107<212>PRT<213>小鼠<220><223>小鼠抗TF的单克隆抗体ATR-5的L链V区的氨基酸序列<400>148Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly

5 10 15Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Ser Phe

20 25 30Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Trp Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile

35 40 45Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Asn Leu Glu Ser65 70 75 80Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Tyr

85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105<210>149<211>112<212>PRT<213>小鼠<220><223>小鼠抗TF的单克隆抗体ATR-7的L链V区的氨基酸序列<400>149Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Tle Gly

5 10 15Gln Pro Ala Ser Val Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Asp

85 90 95Thr His Phe Pro Asp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110<210>150<211>112<212>PRT<213>小鼠(Mouse)<220><223>小鼠抗TF的单克隆抗体ATR-8的L链V区的氨基酸序列<400>150Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly

5 10 15Gln Pro Ala Ser Val Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

85 90 95Thr His Phe Pro Asp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110<210>151<211>780<212>DNA<213>人(Homo sopiens)<220><223>编码可溶性人TF的DNA(DNA coding for soluble human TF)<400>151atg gag acc cct gcc tgg ccc cgg gtc ccg cgc ccc gag acc gcc gtc 48Met Glu Thr Pro Ala Trp Pro Arg Val Pro Arg Pro Glu Thr Ala Val

-30 -25 -20gct cgg acg ctc ctg ctc ggc tgg gtc ttc gcc cag gtg gcc ggc gct 96Ala Arg Thr Leu Leu Leu Gly Trp Val Phe Ala Gln Val Ala Gly Ala-15 -10 -5 -1tca ggc act aca aat act gtg gca gca tat aat tta act tgg aaa tca 144Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser1 5 10 15act aat ttc aag aca att ttg gag tgg gaa ccc aaa ccc gtc aat caa 192Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln

20 25 30gtc tac act gtt caa ata agc act aag tca gga gat tgg aaa agc aaa 240Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys

35 40 45tgc ttt tac aca aca gac aca gag tgt gac ctc acc gac gag att gtg 288Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val

50 55 60aag gat gtg aag cag acg tac ttg gca cgg gtc ttc tcc tac ccg gca 366Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala65 70 75 80ggg aat gtg gag agc acc ggt tct gct ggg gag cct ctg tat gag aac 384Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn

85 90 95tcc cca gag ttc aca cct tac ctg gag aca aac ctc gga cag cca aca 432Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr

100 105 110att cag agt ttt gaa cag gtg gga aca aaa gtg aat gtg acc gta gaa 480Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu

115 120 125gat gaa cgg act tta gtc aga agg aac aac act ttc cta agc ctc cgg 529Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg130 135 140gat gtt ttt ggc aag gac tta att tat aca ctt tat tat tgg aaa tct 576Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser145 150 155 160tca agt tca gga aag aaa aca gcc aaa aca aac act aat gag ttt ttg 624Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu

165 170 175att gat gtg gat aaa gga gaa aac tac tgt ttc agt gtt caa gca gtg 672Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val

180 185 190att ccc tcc cga aca gtt aac cgg aag agt aca gac agc ccg gta gag 720Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu

195 200 205tgt atg ggc cag gag aaa ggg gaa ttc aga gaa gac tac aaa gac gat 768Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Asp Tyr Lys Asp Asp210 215 220gac gat aaa taa 780Asp Asp Lys225<210>152<211>259<212>PRT<220><223>可溶性人TF的氨基酸序列<400>152Met Glu Thr Pro Ala Trp Pro Arg Val Pro Arg Pro Glu Thr Ala Val

-30 -25 -20Ala Arg Thr Leu Leu Leu Gly Trp Val Phe Ala Gln Val Ala Gly Ala-15 -10 -5 -1Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser1 5 10 15Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln

20 25 30Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys

35 40 45Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val

50 55 60Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala65 70 75 80Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn

85 90 95Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr

100 105 110Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu

115 120 125Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg130 135 140Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser145 150 155 160Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu

165 170 175Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val

180 185 190Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu

195 200 205Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Asp Tyr Lys Asp Asp210 215 220Asp Asp Lys225

Claims

1．含有小鼠抗人组织因子(TF)单克隆抗体的重链(H)可变区(V)和人抗体H链恒定区(C)构成的嵌合H链，该H链V区是含有下面任一个氨基酸序列的嵌合H链：

(1)序列号：139的氨基酸序列(ATR-2)

(2)序列号：140的氨基酸序列(ATR-3)

(3)序列号：141的氨基酸序列(ATR-4)

(4)序列号：142的氨基酸序列(ATR-5)

(5)序列号：143的氨基酸序列(ATR-7)

(6)序列号：144的氨基酸序列(ATR-8)。

2．权利要求1记载的嵌合H链，其中上述的H链V区含有序列号142的氨基酸序列。

3．权利要求1或2记载的嵌合H链，其中上述的H链C区是Cγ1,Cγ2，Cγ3或Cγ4区。

4．权利要求1～3任一项记载的嵌合H链，其中上述的H链V区含有序列号142的氨基酸序列，而上述的H链C区是Cγ4。

5．含有小鼠抗人组织因子(TF)单克隆抗体的轻链(L)V区和人抗体L链C区构成的嵌合L链，该L链V区是含有下面任一个氨基酸序列的嵌合L链：

(1)序列号：145的氨基酸序列(ATR-2)

(2)序列号：146的氨基酸序列(ATR-3)

(3)序列号：147的氨基酸序列(ATR-4)

(4)序列号：148的氨基酸序列(ATR-5)

(5)序列号：149的氨基酸序列(ATR-7)

(6)序列号：150的氨基酸序列(ATR-8)。

6．权利要求5记载的嵌合L链，其中上述的L链V区含有序列号148的氨基酸序列。

7．权利要求5或6记载的嵌合L链，其中上述的L链C区是Cλ或Cκ区。

8．权利要求5～7任一项记载的嵌合L链，其中上述的L链V区含有序列号148的氨基酸序列，而上述的L链C区是Cκ。

9．由权利要求1～4任一项记载的嵌合H链和权利要求5～8任一项记载的嵌合L链构成的人TF的嵌合抗体。

10．由权利要求4记载的嵌合H链和权利要求8记载的嵌合L链构成的人TF的嵌合抗体。

11．在小鼠抗人TF单克隆抗体的H链V区互补性决定区(CDR)和人抗体H链V框架区(FR)构成的人源化H链V区中，上述CDR含有如下氨基酸序列的人源化H链V区：H-CDR1:Asp Tyr Tyr Met His (序列号：133)H-CDR2:Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr

Asp Pro Lys Phe Gln Gly (序列号：134)H-CDR3:Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr (序列号：

135)

12．上述FR含有如下氨基酸序列的人源化H链V区：H-FR1:Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu

Ala Arg Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys

Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys (序列号：1

10)H-FR2：可为下面序列(1)～(3)中的任一个序列，

(1) Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp IleGly (序列号：111)

(2) Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp MetGly (序列号：112)

(3) Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp IleGly (序列号：113)H-FR3：可为下面序列(1)～(10)中的任一个序列，

(1) Arg Ala Lys Leu Thr Ala Ala Thr Ser Ala Ser Ile Ala

Tyr Leu Glu Phe Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg(序列号：114)(2) Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ash Thr Ala

Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala

Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg(序列号：115)(3) Arg Val Thr Met Leu Val Asp Thr Ser Lys Ash Gln Phe

Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg(序列号：116)(4) Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala

Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala

Val Tyr Phe Cys Ala Arg(序列号：117)(5) Arg Val Ser Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Lys Ile Ala

Tyr Met Glu Leu Ash Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala

Val Tyr Phe Cys Ala Arg(序列号：118)(6) Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala

Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg(序列号：119)(7) Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala

Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala

Val Tyr Ser Cys Ala Arg(序列号：120)(8) Arg Val Thr Met Ser Ala Asp Lys Ser Ser Ser Ala Ala

Tyr Leu Gln Trp Thr Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala

Ile Tyr Phe Cys Ala Arg(序列号：121)(9) Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val

Phe Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg(序列号：122)(10) Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ash Thr

Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Ala Asp

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg(序列号：123

)FR4: Trp G1y G1n G1y Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

Ser(序列号：124)

13．含有下列序列号给出的氨基酸序列的权利要求11或12记载的人源化H链V区：序列号：30(版本a)；序列号：40(版本b)；序列号：42(版本c)；序列号：50(版本d)；序列号：52(版本e)；序列号：58(版本f)；序列号：60(版本g)；序列号：64(版本h)；序列号：70(版本i)；序列号：72(版本j)；序列号：76(版本b1)；序列号：78(版本d1)；序列号：82(版本b3)；序列号：84(版本d3)。

14．含有序列号：40(版本b)的氨基酸序列的权利要求11～13中任一项记载的人源化H链V区。

15．含有序列号：70(版本1)的氨基酸序列的权利要求11～13中任一项记载的人源化H链V区。

16．在由小鼠抗人TF单克隆抗体的L链V区CDR和人L链V区FR构成的人源化L链V区中，上述CDR含有如下氨基酸序列的人源化L链V区：

L- CDR1:Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Ser Phe Leu Ser(配列番号：136)

L- CDR2:Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp(序列号：137)

L - CDR3:Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Tyr Thr(序列号：138)。

17．权利要求16记载的人源化L链V区，其中上述FR含有如下氨基酸序列：

L- FR1: Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

Cys(序列号：125)

L-FR2：可为下面序列(1)～(3)中的任一个序列，

(1) Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu LeuIle Tyr(序列号：126)

(2) Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr LeuIle Tyr(序列号：127)

(3) Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser LeuIle Tyr(序列号：128)

L-FR3：可为下面序列(1)～(3)中的任一个序列，

(1) Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp

Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys(序列号：129)

(2) Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp

Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys(序列号：130)

(3) Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp

Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys(序列号：131)

L- FR4:Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys(序列号：132)

18．含有序列号：93(版本a)；序列号：99(版本b)；序列号：101(版本c)；序列号：107(版本b1)；序列号：109(版本b2)给出的氨基酸序列的权利要求16或17中任一项记载的人源化L链V区。

19．含有序列号：99(版本b)的氨基酸序列的权利要求16～18中任一项记载的人源化L链V区。

20．含有序列号：109(版本b2)的氨基酸序列的权利要求16～18中任一项记载的人源化L链V区。

21．由含有权利要求11～15中任一项记载的人源化H链V区和人抗体H链C区构成的人TF的抗体的人源化H链。

22．由含有权利要求14记载的人源化H链V区(版本b)和人抗体H链C区构成的人TF的抗体的人源化H链。

23．由含有权利要求15记载的人源化H链V区(版本i)和人抗体H链C区构成的人TF的抗体的人源化H链。

24．权利要求21～23中任一项记载的人源化H链，其中上述人抗体的H链C区是Cγ1,Cγ2,Cγ3或Cγ4区。

25．由含有权利要求16～20中任一项记载的人源化L链V区和人抗体L链C区构成的人TF的抗体的人源化L链。

26．由含有权利要求19记载的人源化L链V区(版本b)和人抗体L链C区构成的人TF的抗体的人源化L链。

27．由含有权利要求20记载的人源化L链V区(版本b2)和人抗体L链C区构成的人TF的抗体的人源化L链。

28．权利要求25～27中任一项记载的人源化L链，其中上述人抗体的L链C区是Cλ或Cκ区。

29．由含有权利要求21～24中任一项记载的人源化H链和权利要求25～28中任一项记载的人源化L链构成的人TF的人源化抗体。

30．由含有权利要求22记载的人源化H链(版本b)和权利要求26记载的人源化L链(版本b)构成的人TF的人源化抗体。

31．由含有权利要求23记载的人源化H链(版本i)和权利要求26记载的人源化L链(版本b)构成的人TF的人源化抗体。

32．由含有权利要求23记载的人源化H链(版本i)和权利要求27记载的人源化L链(版本b2)构成的人TF的人源化抗体。

33．编码权利要求1～4中任一项记载的嵌合H链的DNA。

34．编码权利要求2～4中任一项记载的嵌合H链的DNA。

35．编码权利要求5～8中任一项记载的嵌合L链的DNA。

36．编码权利要求6～8中任一项记载的嵌合L链的DNA。

37．编码权利要求11～15中任一项记载的人源化H链V区的DNA。

38．编码权利要求14记载的人源化H链V区(版本b)的DNA。

39．编码权利要求15记载的人源化H链V区(版本i)的DNA。

40．编码权利要求16～20中任一项记载的人源化L链V区的DNA。

41．编码权利要求19记载的人源化L链V区(版本b)的DNA。

42．编码权利要求20记载的人源化L链V区(版本b2)的DNA。

43．编码权利要求21～24中任一项记载的人源化H链的DNA。

44．编码权利要求22或24记载的人源化H链(版本b)的DNA。

45．编码权利要求23或24记载的人源化H链(版本i)的DNA。

46．编码权利要求25～28中任一项记载的人源化L链的DNA。

47．编码权利要求26或28记载的人源化L链(版本b)的DNA。

48．编码权利要求27或28记载的人源化L链(版本b2)的DNA。

49．含有编码权利要求33记载的嵌合H链的DNA的表达载体。

50．含有编码权利要求34记载的嵌合H链的DNA的表达载体。

51．含有编码权利要求35记载的嵌合L链的DNA的表达载体。

52．含有编码权利要求36记载的嵌合L链的DNA的表达载体。

53．含有由编码权利要求33记载的嵌合H链的DNA和编码权利要求35记载的嵌合L链的DNA构成的表达载体。

54．含有由编码权利要求34记载的嵌合H链的DNA和编码权利要求36记载的嵌合L链的DNA构成的表达载体。

55．含有编码权利要求43记载的人源化H链的DNA的表达载体。

56．含有编码权利要求44记载的人源化H链(版本b)的DNA的表达载体。

57．含有编码权利要求45记载的人源化H链(版本i)的DNA的表达载体。

58．含有编码权利要求46记载的人源化L链的DNA的表达载体。

59．含有编码权利要求47记载的人源化L链(版本b)的DNA的表达载体。

60．含有编码权利要求48记载的人源化L链(版本b2)的DNA的表达载体。

61．含有由编码权利要求43记载的人源化H链的DNA和编码权利要求46记载的人源化L链的DNA构成的表达载体。

62．含有由编码权利要求44记载的人源化H链(版本b)的DNA和编码权利要求47记载的人源化L链(版本h)的DNA构成的表达载体。

63．含有由编码权利要求45记载的人源化H链(版本i)的DNA和编码权利要求47记载的人源化L链(版本b)的DNA构成的表达载体。

64．含有由编码权利要求45记载的人源化H链(版本i)的DNA和编码权利要求48记载的人源化L链(版本b2)的DNA构成的表达载体。

65．通过含有由编码权利要求49记载的嵌合H链的DNA构成的表达载体和编码权利要求51记载的嵌合L链的DNA构成的表达载体转化的宿主。

66．通过含有由编码权利要求50记载的嵌合H链的DNA构成的表达载体和编码权利要求52记载的嵌合L链的DNA构成的表达载体转化的宿主。

67．通过权利要求53记载的表达载体转化的宿主。

68．通过权利要求54记载的表达载体转化的宿主。

69．通过含有编码权利要求55记载的人源化H链的DNA构成的表达载体和含有编码权利要求58记载的人源化L链的DNA构成的表达载体转化的宿主。

70．通过含有编码权利要求56记载的人源化H链(版本b)的DNA构成的表达载体和含有编码权利要求59记载的人源化L链(版本b)的DNA构成的表达载体转化的宿主。

71．通过含有编码权利要求57记载的人源化H链(版本i)的DNA构成的表达载体和含有编码权利要求59记载的人源化L链(版本b)的DNA构成的表达载体转化的宿主。

72．通过含有编码权利要求57记载的人源化H链(版本i)的DNA构成的表达载体和含有编码权利要求6记载的人源化L链(版本b2)的DNA构成的表达载体转化的宿主。

73．通过权利要求61记载的表达载体转化的宿主。

74．通过权利要求62记载的表达载体转化的宿主。

75．通过权利要求63记载的表达载体转化的宿主。

76．通过权利要求64记载的表达载体转化的宿主。

77．抗人TF的嵌合抗体的制造方法，其特征是：培养权利要求65记载的宿主，从该培养物中提取嵌合抗体。

78．抗人TF的嵌合抗体的制造方法，其特征是：培养权利要求66记载的宿主，从该培养物中提取嵌合抗体。

79．抗人TF的嵌合抗体的制造方法，其特征是：培养权利要求67记载的宿主，从该培养物中提取嵌合抗体。

80．抗人TF的嵌合抗体的制造方法，其特征是：培养权利要求68记载的宿主，从该培养物中提取嵌合抗体。

81．抗人TF的人源化抗体的制造方法，其特征是：培养权利要求69记载的宿主，从该培养物中提取人源化抗体。

82．抗人TF的人源化抗体的制造方法，其特征是：培养权利要求70记载的宿主，从该培养物中提取人源化抗体。

83．抗人TF的人源化抗体的制造方法，其特征是：培养权利要求71记载的宿主，从该培养物中提取人源化抗体。

84．抗人TF的人源化抗体的制造方法，其特征是：培养权利要求72记载的宿主，从该培养物中提取人源化抗体。

85．抗人TF的人源化抗体的制造方法，其特征是：培养权利要求73记载的宿主，从该培养物中提取人源化抗体。

86．抗人TF的人源化抗体的制造方法，其特征是：培养权利要求74记载的宿主，从该培养物中提取人源化抗体。

87．抗人TF的人源化抗体的制造方法，其特征是：培养权利要求75记载的宿主，从该培养物中提取人源化抗体。

88．抗人TF的人源化抗体的制造方法，其特征是：培养权利要求76记载的宿主，从该培养物中提取人源化抗体。

89．在使含有来自非人的互补决定区(CDR)以及来自天然人抗体的框架区(FR)的免疫原性降低的天然人源化抗体的制造方法，其特征为：

(1)准备对目的抗原具有反应性的非人单克隆抗体，

(2)准备多个相对于上述(1)的单克隆抗体中FR的氨基酸序列具有高同源性的人抗体，

(3)通过对上述(2)中的一种类型人抗体的4个FR用上述(1)的非人的单克隆抗体的对应的FR置换后，制作第一人源化抗体，

(4)对上述(3)中制作的人源化抗体与抗原的结合活性或中和抗原生物活性的能力进行测定，

(5)通过使用(2)中准备的人源化抗体中的人抗体(与(3)中使用的抗体不同)相对应的FR对上述(3)制作的人源化抗体中的1～3个FR进行置换，制作第二人源化抗体。

(6)对于上述(5)中制作的第二人源化抗体和上述(3)中得到的第一人源化抗体就它们对抗原的结合性、或中和抗原生物活性的能力进行比较，选择显示较高活性的人源化抗体，

(7)就上述(6)中选择的人源化抗体实施(3)～(6)阶段操作，然后

(8)反复进行(3)～(6)阶段操作直至获得具有与上述(1)中的非人单克隆抗体同等活性的人源化抗体为止。

90．权利要求89记载的方法，其中上述目的抗原是人组织因子(TF)。

91．利用权利要求89方法获得的人源化抗体。

92．利用权利要求90方法获得的人源化抗体。

93．由权利要求29～32和92中任一项记载的人源化抗体构成的弥散性血管内凝血综合症(DIC)治疗剂。