[go: up one dir, main page]

CN1252250C - 由干细胞产生神经细胞的方法及培养干细胞的培养基 - Google Patents

由干细胞产生神经细胞的方法及培养干细胞的培养基 Download PDF

Info

Publication number
CN1252250C
CN1252250C CNB2003101233585A CN200310123358A CN1252250C CN 1252250 C CN1252250 C CN 1252250C CN B2003101233585 A CNB2003101233585 A CN B2003101233585A CN 200310123358 A CN200310123358 A CN 200310123358A CN 1252250 C CN1252250 C CN 1252250C
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
neurocyte
substratum
minutes
days
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB2003101233585A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1532280A (zh
Inventor
傅毓秀
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fu Yuxiu
Zheng Hongzhi
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of CN1532280A publication Critical patent/CN1532280A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1252250C publication Critical patent/CN1252250C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/08—Coculture with; Conditioned medium produced by cells of the nervous system
    • C12N2502/081—Coculture with; Conditioned medium produced by cells of the nervous system neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C12N2506/025—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells from extra-embryonic cells, e.g. trophoblast, placenta
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1392—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from mesenchymal stem cells from other natural sources

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明是关于由干细胞产生神经细胞的方法，其包括在培养基中培养神经细胞及在所产生的混合物中培养干细胞。本发明也关于培养干细胞的培养基，其是借由将神经细胞培养于基础培养基而制备。

Description

由干细胞产生神经细胞的方法及培养干细胞的培养基
技术领域
本发明是关于由干细胞产生神经细胞的方法及培养干细胞的培养基。
背景技术
许多临床上常见的慢性神经退化疾病，如帕金森氏症、阿兹海默症、亨丁顿氏症及肌萎缩性脊髓侧索硬化症，都是由于中枢神经系统(CNS)中的神经细胞退化及死亡造成的结果。神经细胞不像表皮及肝脏细胞，无法快速地再生。虽然CNS中的干细胞在正常及神经细胞受损的情况下都可复制及分化，但其复制速度相当慢，且分化成神经细胞的比例非常低。CNS中大部分的干细胞会分化成神经胶质细胞，因而无法挽救神经退化疾病。
神经细胞移植已提供一个治疗神经退化疾病的方向，研究人员已试着在活体外及活体内从不同的干细胞产生神经细胞。一般相信干细胞具有某些特性，包括自我更新、多能性、增殖、长寿及分化。在临床的应用上，胚胎、脐带血及骨髓是最普遍的人类干细胞来源。在胚胎中可治疗中枢神经系统病变的干细胞主要是神经干细胞及囊胚的胚胎干细胞(R.L.Rietze et al.，2001，Nature 412；736-739)。研究也指出为了修还脊髓创伤，以胚胎干细胞(J.W.McDonald et al.，1999，NatureMedicine 5：1410-1412)或神经干细胞(Q.L.Cao et al.，2001，Experimental Neurology 167：48-58)移植后，这些细胞主要分化成星细胞及寡树突细胞，极少数转变为神经细胞。除了取得困难、移植后的生存率不高及转变为神经细胞的比例极低外，胚胎组织的移植也因为宗教、法律及道德争议而受到阻碍。
借由直接植入脐带血中的造血干细胞以治疗受损神经细胞仍有待研究。然而，活体外模式显示，脐带血中的造血干细胞培养在含有0.001％的β-巯基乙醇(BME)培养基中可转型成神经细胞的前趋物，其中10％的细胞可进一步被诱导而分化成神经细胞及神经胶质细胞(J.R.Sanchez-Ramos et al.，2001，Experimental Neurology 171：109-115；及Y.Ha et al.，2001，Neuroreport 12(16)：3523-3527)。由于脐带血干细胞转变成神经细胞的比例相对地较低，因此脐带血的应用及研究主要集中在血液疾病。
骨髓中含有造血干细胞，其提供红血球、血小板、单核细胞、颗粒细胞及淋巴细胞前趋物的持续来源。此外，骨髓也含有达到非血液组织干细胞标准的细胞。已有报告老鼠成熟骨髓中的造血干细胞可分化成脑中的微神经胶质细胞及大神经胶质细胞(M.A.Eglitis et al.，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.94：4080-4085)。骨髓基质中的非造血干细胞被称为骨髓基质细胞(BMSC)或骨髓间叶细胞。BMSC在活体外可分化成骨生成细胞、软骨生成细胞、脂肪生成细胞、肌纤维生成细胞及其它系统(M.F.Pittenger et al.，1999，Science 284：143-147及B.E.Petersenet al.，1999，Science 284：1168-1170)。最近，BMSC已被报告可在活体内分化成神经细胞(S.A.Azizi et al.，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.95：3908-3913；及G.C.Kopen et al.，1999，Proc、Natl.Acad.Sci.96：10711-10716)。
以上所有利用多效性细胞产生神经细胞的方法都有一个共通的问题：这些细胞大部分都分化成神经胶质细胞(星状细胞、寡树突细胞等)而非神经细胞。只有在BMSC的活体外培养发现BME在神经分化上有显著的效果，其可诱导80％的培养BMSC分化成神经细胞(D.Woodbury et al.，2000，Journal of Neuroscience Research 61：364-370)。然而，BME对蛋白质具有毒性而不适用于人体(K.White et al.，1973，Journal of pharmaceutical Sciences 62：237-241)。因此仍需要开发更有效率的方法将干细胞转型成神经细胞。
发明内容
本发明是提供由干细胞产生神经细胞的方法，其包括在培养基中培养神经细胞及在所产生的混合物中培养干细胞。
本发明也提供培养干细胞的培养基，其是借由将神经细胞培养于基础培养基而制备。
附图说明
图1表示脐带间叶细胞在(A)FBS-DMEM培养基(控制组)及(B)培养过神经细胞的培养基中培养6天后的型态。
图2表示脐带间叶细胞在培养过神经细胞的培养基中培养6天后，(A)NF及(B)NeuN的免疫染色结果。
图3表示脐带间叶细胞以培养过神经细胞的培养基处理不同时间后，其表现NF的比例。
图4表示脐带间叶细胞以培养过神经细胞的培养基处理后，GluR5、GluR6、GluR7及KA2的西方墨点法结果。
图5表示脐带间叶细胞以培养过神经细胞的培养基培养9天后，其(A)parvalbumin(PV)及(B)calbindin-D28K(CB)的免疫染色结果。
图6表示脐带间叶细胞以培养过神经细胞的培养基培养6天后，其GAD的(A)免疫染色及(B)西方墨点法结果。
图7(A)表示经培养过神经细胞的培养基诱导的脐带间叶细胞在处理后第0、3、6及9天时，其细胞密度的改变(比例尺：100μm)；(B)表示脐带间叶细胞以培养过神经细胞的培养基处理后，以DAPI染色定量细胞密度。
图8表示脐带间叶细胞以培养过神经细胞的培养基培养3天(3D)及9天(9D)后，以DAPI+BrdU双重染色及NF+BrdU双重染色的结果。
具体实施方式
为克服上术现有技术的缺点，本发明主要目的是借由将神经细胞培养于基础培养基6至9天而制备的培养基培养的脐带间叶细胞，可高度(87％)分化成功能性后分裂神经细胞。
不受限于理论，发明人相信培养的神经细胞可释放出某种物质组合，其提供理想状况使干细胞分化成神经细胞。
在此使用的″干细胞″一词是指任何未分化、多能性(pluripotent)或多效性(multipotent)的哺乳动物细胞，包括但不限于胚胎干(ES)细胞，胚胎生殖(EG)细胞，胚胎癌(EC)细胞，骨髓基质细胞，骨髓造血细胞，脐带血细胞及脐带间叶细胞。以上所有干细胞除了脐带间叶细胞外，都已被报告可分化成神经细胞及/或胶质细胞。然而，经由本发明的培养方法，即使是脐带间叶细胞也可高比例地分化成功能性神经细胞。
因此，任何哺乳动物干细胞皆适用于本发明的方法。较佳是使用间叶细胞如BMSC或脐带间叶细胞。
本发明中用于制备培养基的神经细胞可得自哺乳动物之外围神经系统及中枢神经系统(CNS)。较佳是得自中枢神经系统的神经细胞，更佳是得自脑部，最佳是得自海马回。
本发明的培养基可借由将神经细胞培养于任何现有的培养基而得。本发明适用的基础培养基包括但不限于添加胎牛血清的达尔克必须基本培养基(FBS-DMEM)。
应了解本发明所用的基础培养基可添加一般用于细胞培养的其它添加物。
根据本发明，神经细胞以现有方法在基础培养基中培养3至6天，较佳是5天。所产生的混合物可直接用于培养干细胞。
根据本发明，在成熟神经细胞收成的前，干细胞以现有方法培养于本发明培养基6至12天。较佳是在培养的第九天收成。
培养的神经细胞被移走后，本发明的培养基可分装为小份保存以作为将来使用。
以下分析是用以定性根据本发明的方法所产生的神经细胞。
NF的免疫细胞化学
神经纤维(NF)是神经细胞中的主要细胞骨骼，其负责调整神经细胞树突的大小、外观及直径。只有在发育晚期及成熟期的神经细胞才会表现NF。对NF的免疫染色可用以确定神经细胞处于晚期。
NeuN的免疫细胞化学
神经细胞特定核蛋白(NeuN)是脊椎动物中枢神经系统神经细胞细胞核中的特殊蛋白。在活体外NeuN可和DNA结合。已知在神经细胞发育中，NeuN的出现较NF早。因此对NeuN的免疫染色可用以确定神经细胞处于转型早期。
GluR5、GluR6、GluR7及KA2的西方墨点法
在哺乳动物的CNS中，谷胺酸是主要的刺激神经传导物质。大部分的神经细胞都有谷胺酸受体来接收刺激信息。其中主要有二类谷胺酸受体：离子型及代谢型。离子型受体可依照其不同的选择性激动剂，进一步再分为：NMDA(N-甲基-D-门冬氨酸)受体、AMPA(α-氨基-3-羟基-5-甲基异恶唑-4-丙酸)受体及KA(红藻氨酸)受体。KA受体是由GluR5、GluR6、GluR7、KA1及KA2等次单元形成。因此，利用西方墨点法检测GluR5、GluR6、GluR7及KA2可确定神经细胞具有合成功能性蛋白质的能力。
Ca2+结合蛋白的免疫细胞化学
Ca2+在细胞的信息传递途径中扮演重要的角色。然而，在细胞中大部分的Ca2+并不是单独作用，而是和Ca2+结合蛋白相结合。Ca2+结合蛋白可以缓冲细胞内的Ca2+浓度，进而调节Ca2+的活性。在中枢神经系统中存在着许多种类的Ca2+结合蛋白，分布最广的是parvalbumin(PV)、calbindin-D28K(CB)及calretinin。PV及CB皆属于EF-hand型Ca2+结合蛋白家族。在胚胎神经系统发育期间，PV及CB被认为是神经细胞特定表现的Ca2+结合蛋白。因此，对PV及CB的免疫染色可用以确定神经细胞具有合成功能性蛋白质的能力。
BrdU及DAPI的双重标记
DAPI(4，6-diamidino-2-phenyl-indole diacetate)是一种萤光染料，可自由地通过细胞膜和核膜，并和细胞核中的DNA结合，通常用以计算细胞的数目。此外，在细胞复制过程中，细胞须合成另一组染色体，并将外加的BrdU(溴化去氧尿核苷，其为胸腺嘧啶核苷酸的相似物)纳入所合成的染色体中。因此，观察BrdU的纳入可用以确定细胞的复制。BrdU及DAPI的双重标记可确定神经细胞的复制。
BrdU及NF的双重标记
如上所述，NF的免疫染色用以确定是否为神经细胞，BrdU则片以确定细胞的复制。因此，NF及BrdU的双重标记可确定神经细胞的复制能力。
GAD的免疫细胞化学
GABA是神经传导物质之一，其是由谷胺酸经谷胺酸脱羧酶(GAD)催化而合成。因此，利用对GAD的免疫染色可确定神经细胞具有合成神经传导物质GABA的能力。
根据本发明的方法所产生的神经细胞可用于治疗神经退化疾病，如帕金森氏症、阿兹海默症、亨丁顿氏症，及肌萎缩性脊髓侧索硬化症或因中风及外伤造成的神经细胞死亡。
由以下的实施例对本发明做进一步说明，但不应以此限定本发明的范围。
实施例1人类脐带间叶细胞的制备
人类脐带间叶细胞是从一提供接生服务的诊所(蔡氏妇产科诊所，台北市北投区石牌路一段72号)取得。脐带以无菌操作方式收集并在4℃下储存于HBSS(Biochrom L201-10)不超过24小时。
脐带先泡在75％的乙醇中30秒以消毒。在无菌操作台中将消毒过的脐带置于无钙及无镁离子的缓冲溶液(CMF，Gibco 14185-052)，以消毒过的器具将脐带纵切，并将其中的血管及间叶组织(瓦顿氏凝胶)去除。将间叶组织切成0.5立方公分的小块，以250×g离心5分钟。去除上清液，并以适量的无血清DMEM(Gibco 12100-046)清洗沉淀物二次，再以250×g离心5分钟。间叶组织在37℃下以胶原酶处理14至18小时，清洗后，再以2.5％的胰蛋白酶于37℃及震荡下处理30分钟。加入FBS(Hyclone SH30071.03)至间叶组织以终止胰蛋白酶反应。此时间叶组织已变成间叶细胞。
间叶细胞以10％FBS-DMEM使其分散并计算其数量后，便可直接用于培养。
实施例2培养过神经细胞的FBS-DMEM的制备
用以制备培养过神经细胞的FBS-DMEM的神经细胞是取自七天大的史泊格多利(Sprague-Dawley)大鼠的脑部(台湾省台北市阳明大学动物中心)。
在以下的操作之前，先将含有24ml 10％FBS-DMEM的50ml离心管置于37℃培养箱内。
大鼠以i.p.注射给予0.3ml的10％水合氯化物。3至4分钟后，完全麻醉的大鼠以75％乙醇全身消毒。在无菌操作台中将大鼠脑取出并置于CMF中。将脑以900rpm离心5分钟。去除上清液，添加10％FBS-DMEM至沉淀物(脑组织)。以移液器吸放15次将脑组织打散成单细胞。将打散的细胞加至的前准备的50ml离心管，与其中的FBS-DMEM充分混合。将此混合物加至24孔盘的涂覆有聚-L-离胺酸的孔中，在37℃培养箱中培养。第二天加入最终浓度为2μM的阿糖胞苷(Arac)。
培养的第五天，此培养基即可取出用来培养脐带间叶细胞。
实施例3脐带间叶细胞转型为神经细胞
将由实施例1得到的脐带间叶细胞，培养于由实施例2得到的培养过神经细胞的FBS-DMEM培养基中，或培养于FBS-DMEM(对照组)中，置于37℃培养箱。在第3、6、9及12天收集细胞。
如图1(A)所示，培养于FBS-DMEM 6天的脐带间叶细胞(对照组)的形态为纺锤型，且因细胞增殖而互相紧密地贴附。培养于培养过神经细胞的FBS-DMEM培养基6天的脐带间叶细胞显现神经的表型，包括细胞体收缩、精致化历程(process elaboration)及细胞集簇(图1B)。
实施例4分析
在实施例3中收集的细胞用以做以下的分析，其结果描述如下：
(1)NF的免疫染色：
以0.1M磷酸缓冲液(0.1M PBS，pH7.4)清洗生长在盖玻片上6天的细胞5分钟二次；再以固定液(4％多聚甲醛溶于0.1M PBS中)固定20分钟；以0.1M PBS清洗5分钟三次；再以阻断液(0.05％TritonX-100、5％正常山羊血清及3％牛血清白蛋白)处理30分钟以避免非专一性抗体-抗原结合。
处理后的细胞与初级抗体(兔子抗神经纤维200多株IgG，1∶250稀释，Chemicon AB 1982)在4℃下反应至少12至18小时；以0.1M PBS清洗5分钟三次；再与二级抗体(生物素共轭的山羊抗兔子IgG，1∶1000稀释，Sigma b-8895)在室温下反应1小时；以0.1M PBS清洗5分钟三次；接着与亲和素-生物素化-辣根过氧化酶复合物(ABC KIT，Vectorlabs PK-4000)在室温下反应1小时；以0.1M PBS清洗5分钟三次；再以3，3′-二胺基联苯胺(5mg DAB，3.5μl的30％H2O2溶于10ml的50mM Tris缓冲溶液中)显影。
以上得到的样品以浓度渐增(50％、70％、80％、90％、95％及100％)的乙醇及二甲苯进行脱水反应，每一浓度5分钟。盖玻片以封片胶(permount)封在载玻片上并在光学显微镜(Olympus BH-2)下观察。
如图2(A)所示，培养于培养过神经细胞的FBS-DMEM培养基6天的脐带间叶细胞表现NF，显示其已转型成神经细胞。
本实验也测定以培养过神经细胞的FBS-DMEM培养基处理不同时间的脐带间叶细胞表现NF的比例。如图3所示，处理后第3天有59.4％的脐带间叶细胞表现NF，处理后第6天NF的表现量达到最大，87.4％。处理时间延长NF表现量既不升高也不降低(n＝3，单因子变异数分析，续以LSD分析，P＜0.01)。
(II)NeuN的免疫染色：
以0.1M磷酸缓冲液(0.1M PBS，pH7.4)清洗生长在盖玻片上6天的细胞5分钟二次；再以固定液(4％多聚甲醛溶于0.1M PBS中)固定20分钟；以0.1M PBS清洗5分钟三次；再以阻断液(0.05％ TritonX-100、5％正常山羊血清及3％牛血清白蛋白)处理30分钟以避免非专一性抗体-抗原结合。
处理后的细胞与初级抗体(小鼠抗神经核单株IgG，1∶100稀释，Chemicon MAB377)在4℃下反应至少36至42小时；以0.1M PBS清洗5分钟三次；再与二级抗体(生物素共轭的山羊抗老鼠IgG，1∶250稀释，Chemicon AP124B)在室温下反应1小时；再以0.1M PBS清洗5分钟三次；接着与亲和素-生物素化-辣根过氧化酶复合物(ABC KIT，Vectorlabs PK-4000)在室温下反应1小时；以0.1M PBS清洗5分钟三次；再以3，3′-二胺基联苯胺(5mg DAB，3.5μl的30％H2O2溶于10ml的50mM Tris缓冲溶液中)显影。
以上得到的样品以浓度渐增(50％、70％、80％、90％、95％及100％)的乙醇及二甲苯进行脱水反应，每一浓度5分钟。盖玻片以封片胶封在载玻片上并在光学显微镜(Olympus BH-2)下观察。
如图2(B)所示，培养于培养过神经细胞的FBS-DMEM培养基6天的脐带间叶细胞表现NeuN，显示其已转型成神经细胞。
(III)GluR5、GluR6、GluR7及KA2的西方墨点法
(a)细胞膜的制备
细胞膜的制备是由以培养过神经细胞的FBS-DMEM处理不同时间的脐带间叶细胞及七天龄大鼠的脑而得。以0.1M磷酸缓冲液清洗培养的细胞3分钟二次。在4℃下添加Tris-HCl缓冲液(50mM，pH7.4)至细胞，以刮刀将细胞从培养皿上刮除。将刮除的细胞置于一15ml的铁氟龙-玻璃均质机中磨20次以使其均质化，接着在4℃下以30000g离心30分钟。所得到的沉淀物大部分为细胞膜，再磨沉淀物并溶解于适量的Tris-HCl缓冲溶液中，储存于-20℃冰箱中以备将来使用。
(b)蛋白质浓度的测定
为了用于西方墨点法，由以上方法得到的样品中的蛋白质以595nm吸光值测定蛋白质浓度，此蛋白质浓度的测定是依据Bradtord法实施(MM.Bradford，1976，Analytical Biochemistry 72：248-254)。
(c)电泳
样品中的蛋白质以20％SDS-PAGE分离。将凝胶中分离的蛋白质转印至PVDF膜(NEW，NEF1002)以用于西方墨点法
(d)西方墨点法
以TBS溶液(0.9％NaCl溶于50mM Tris-HCl中，pH7.4)清洗含有蛋白质的PVDF膜30分钟二次。以溶有5％脱脂奶粉的TBS缓冲液进行阻断反应60分钟。接着将PVDF膜浸泡于阻断液(0.05％Triton-X100、5％正常山羊血清及3％BSA)60分钟后，以TBS缓冲液清洗，再与初级抗体(兔子抗KA2多株IgG，1∶1800稀释，UPSTATE06-315；山羊抗GluR5多株IgG，1∶30稀释，Santa Cruz sc-7617；山羊抗GluR6多株IgG，1∶30稀释，Santa Cruz sc-7618；山羊抗GluR7多株IgG，1∶30稀释，Santa Cruz sc-7620；及兔子抗谷胺酸去羧基酶多株IgG，1∶1500稀释，Chemicon AB108)在4℃下反应12至18小时。
反应完成之后，以TTBS(0.05％Tween-20溶于TBS中)清洗PVDF膜30分钟二次后，将此膜浸泡于阻断液中60分钟，再与二级抗体(抗Glu5/6/7的生物素-抗山羊/绵羊IgG，1∶200稀释，Sigma B-3148；及抗KAR2/GAD的生物素-抗兔子IgG，1∶250稀释，Chemicon AP187B)在室温下反应1小时。以TTBS清洗反应过后的PVDF膜30分钟二次，再与亲和素-生物素化-辣根过氧化酶复合物(ABC KIT，VectorlabsPK-4000)在室温下反应1小时，以0.1M PBS清洗5分钟三次，再以DAB(5mg DAB，3.5μl的30％H2O2溶于10ml的50mM Tris缓冲溶液中，pH7.4)显影。
如图4所示，脐带间叶细胞在以培养过神经细胞的FBS-DMEM培养基处理前并无表现海人草酸(Kainate)受体次单元。以培养过神经细胞的FBS-DMEM培养基处理后第6天，海人草酸受体次单元，包括GluR6、GluR7及KA2，有少量地表现，处理后第12天，GluR5、GluR6、GluR7及KA2有显著地表现。
(IV)Parvalbumin(PV)及Calbindin-D28K(CB)的免疫染色
以0.1M磷酸缓冲液(0.1M PBS，pH7.4)清洗生长在盖玻片上6天的细胞5分钟二次；再以固定液(2％多聚甲醛及7.5％piric酸溶于0.1M的PBS中)固定20分钟；以0.1M PBS清洗5分钟三次；再以阻断液(0.05％Triton X-100、正常山羊血清及3％牛血清白蛋白)处理30分钟以避免非专一性抗体-抗原结合。
处理后的细胞与初级抗体(山羊抗parvalbumin的多株IgG，1∶40稀释，Santa Cruz sc-7449及山羊抗calbindin多株IgG，1∶40稀释，Santa Cruz sc-7691)在4℃下反应至少12至18小时；以0.1M PBS清洗5分钟三次；再与二级抗体(生物素共轭的小鼠抗山羊/绵羊单株IgG，1∶250稀释，Sigma B3148)在室温下反应1小时；再以0.1M PBS清洗5分钟三次；接着与亲和素-生物素化-辣根过氧化酶复合物(ABC KIT，Vectorlabs PK-4000)在室温下反应1小时；以0.1M PBS清洗5分钟三次；再以3，3′-二胺基联苯胺(5mg DAB，3.5μl的30％H2O2溶于10ml的50mM Tris缓冲溶液中)显影。
以上得到的样品以浓度渐增(50％、70％、80％、90％、95％及100％)的乙醇及二甲苯进行脱水反应，每一浓度5分钟。盖玻片以封片胶封在载玻片上并在光学显微镜(Olympus BH-2)下观察。
如图5所示，培养于培养过神经细胞的FBS-DMEM培养基9天的脐带间叶细胞表现parvalbumin(图5A)及calbindin-D28K(图5B)，显示其已转型成神经细胞并具有合成Ca2+结合蛋白的能力。
(V)GAD的免疫染色及西方墨点法
以0.1M磷酸缓冲液(0.1M PBS，pH7.4)清洗生长在盖玻片上6天的细胞5分钟二次；再以固定液(2％多聚甲醛及7.5％piric酸溶于0.1M的PBS中)固定20分钟；以0.1M PBS清洗5分钟三次；再以阻断液(0.05％Triton X-100、正常山羊血清及3％牛血清白蛋白)处理30分钟以避免非专一性抗体-抗原结合。
处理后的细胞与初级抗体(兔子抗谷胺酸盐去羧基酶多株IgG，1∶1500稀释，Chemicon AB108)在4℃下反应至少12至18小时；以0.1MPBS清洗5分钟三次；再与二级抗体(生物素共轭的山羊抗兔子IgG，1∶300稀释，Sigma b8895)在室温下反应1小时，以0.1M PBS清洗5分钟三次。接着与亲和素-生物素化-辣根过氧化还合物(ABC KIT，Vectorlabs PK-4000)在室温下反应1小时，以0.1M PBS清洗5分钟三次，再以3，3′-二胺基联苯胺(5mg DAB，3.5μl的30％H2O2溶于10ml50mM的Tris缓冲溶液中)显影。
以上得到的样品以浓度渐增(50％、70％、80％、90％、95％及100％)的乙醇及二甲苯进行脱水反应，每一浓度5分钟。盖玻片以封片胶封在载玻片上并在光学显微镜(Olympus BH-2)下观察。
如图6(A)所示，培养于培养过神经细胞的FBS-DMEM培养基6天后的脐带间叶细胞表现GAD，显示其已转型成神经细胞并具有合成神经传导物质GABA的能力。如图6(B)所示，脐带间叶细胞可在处理后第6天被诱导出表现GAD的能力，且在第12天GAD的表现量有显著地增加。
(III)、(IV)及(V)的结果证明根据本发明的方法得到的神经细胞具功能性且可合成具有神经细胞特征的蛋白质及神经传导物质。
(VI)DAPI染色
以0.1M磷酸缓冲液清洗处理后的细胞5分钟二次，然后以50μg/ml的DAPI染色30分钟。细胞以Tris缓冲液(Tris-HCl 50mM，pH7.3)完全清洗并以包埋剂(Tris∶甘油＝1∶1)包埋，在萤光显微镜下观察及计算细胞数目。
图7(A)显示细胞密度的显微影像。利用DAPI标记(蓝色)测定处理后第0、3、6及9天的细胞数目。图7(B)显示脐带间叶细胞以培养过神经细胞的FBS-DMEM培养基处理不同时间后的细胞密度。在不同的处理后时间点，利用DAPI染色测定细胞密度的改变。结果指出处理后第9天的细胞密度显著高于第3天的细胞密度(n＝3，单因子变异数分析，续以LSD分析，P＜0.01)。
(VII)BrdU及DAPI的双重染色
给予生长在盖玻片上的细胞最终浓度为50μM的BrdU(SigmaB5002，配制为50mM库存溶液)，并使其继续生长24小时。以0.1M磷酸缓冲液(0.1M PBS，pH7.4)清洗细胞5分钟二次；再以固定液(70％乙醇于50mM甘胺酸缓冲液中，pH2.0)在-20℃下固定30分钟；以0.1M PBS清洗5分钟三次；再以阻断液(0.05％Triton X-100、5％正常山羊血清及3％牛血清白蛋白)处理30分钟以避免非专一性抗体-抗原结合。
处理后的细胞接着与初级抗体(小鼠抗BrdU单株IgG，ChemiconMAB3222，以0.66mM CaCl2及1mM β-巯基乙醇于66mM的Tris缓冲液中1∶100稀释)在4℃下反应至少36至42小时；以0.1M PBS清洗5分钟三次；再与二级抗体(萤光素共轭的山羊抗小鼠IgG，1∶50稀释，Chemicon AP124F)及1mg/ml DAPI(Sigma D9542)在室温下反应1小时；以0.1M PBS清洗5分钟三次。盖玻片以包埋剂(Vector H-1000)固定于在载玻片上，以指甲油密封，在萤光显微镜(Olympus BX50)下观察。并计算单位面积内被BrdU标记的细胞数目。
(VIII)BrdU及NF的双重染色
给予生长在盖玻片上的细胞最终浓度为50μM的BrdU(SigmaB5002，配置为50mM库存溶液)，并使其继续生长超过24小时。以0.1M磷酸缓冲液(0.1M PB，pH7.4)清洗细胞5分钟二次；再以固定液(70％乙醇于50mM胺基乙酸缓冲液中，pH2.0)在-20℃下固定30分钟；以0.1M PBS清洗5分钟三次；再以阻断液(0.05％Triton X-100、5％正常山羊血清及3％牛血清白蛋白)处理30分钟以避免非专一性抗体-抗原结合。
处理后的细胞与初级抗体(小鼠抗BrdU单株IgG，ChemiconMAB3222，以0.66mM CaCl2、1mM β-巯基乙醇于66mM的Tris缓冲溶液1∶100稀释)在4℃下反应至少12至18小时后；再与另一初级抗体(兔子抗神经纤维多株IgG，1∶250稀释，Chemicon AB1982)在4℃下反应至少12至18小时；以0.1M PBS清洗5分钟三次；再与二级抗体(萤光素共轭的山羊抗老鼠IgG，1∶50稀释，Chemicon AP124F及若丹明(Rhodamine)共轭的山羊抗兔子IgG，1∶50稀释，ChemiconAP132R)在室温下反应1小时；以0.1M PBS清洗5分钟三次。盖玻片以包埋剂(Vector H-1000)固定于在载玻片上，以指甲油密封，在萤光显微镜(Olympus BX50)下观察。并计算单位面积内被BrdU标记的细胞数目。
图8显示脐带间叶细胞以培养过神经细胞的FBS-DMEM培养基处理3天后的增殖分析结果(A-F)。大部分被DAPI标记的细胞(A中的蓝色)为BrdU-阳性(B中的绿色)。(C)是结果(A)及(B)的合并。处理后第3天的细胞已分化成可表现NF的细胞(D中的红色)，仍被BrdU标记(E中的绿色)。(F)是结果(D)及(E)的合并。以培养过神经细胞的FBS-DMEM处理后第9天的细胞失去增殖能力(G-L)。所有被DAPI标记的细胞(G中的蓝色)为BrdU-阴性(H中的绿色)。(I)是结果(G)及(H)的合并。处理后第9天的细胞已分化成可表现NF的细胞(J中的红色)，但大部分无法被BrdU标记(K中的绿色)。(L)是结果(J)及(K)的合并。总结来说，大部分的细胞在第9天已转型成神经细胞并停止增殖，由此得知此神经细胞在第9天已进入后分裂阶段。
(VII)及(VIII)的结果显示，以培养过神经细胞的含血清的DMEM培养基培养的脐带间质细胞可增殖并分化成神经细胞。
由以上的描述得知，本领域技术人员可轻易了解本发明中的必要特征，且在不悖离其精神及范围下，可做各种改变及修改以使本发明适用于各种用途及情况。

Claims (15)

1.一种由干细胞产生神经细胞的方法，其特征在于，该方法包括在培养基中培养取自脑部海马回的神经细胞及在所产生的混合物中培养干细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在加入该干细胞之前，该神经细胞在该培养基中培养3至6天。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，该神经细胞培养5天。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该干细胞是选自由胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、胚胎癌细胞、骨髓基质细胞、骨髓造血细胞、脐带血细胞及脐带间叶细胞所组成的群。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，该干细胞是骨髓基质细胞或脐带间叶细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用于培养神经细胞的培养基是含血清的DMEM。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该干细胞在该混合物中培养6至12天。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括从培养过干细胞的混合物中收集神经细胞的步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在培养第6至12天的期间收集该神经细胞。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在培养第6至9天的期间收集该神经细胞。
11.一种培养干细胞的培养基，其特征在于，该培养基是通过在基础培养基中培养取自脑部海马回的神经细胞而制备。
12.根据权利要求11所述的培养基，其特征在于，该基础培养基是含血清的DMEM。
13.根据权利要求11所述的培养基，其特征在于，该神经细胞已从该基础培养基移除。
14.根据权利要求11所述的培养基，其特征在于，该神经细胞在该基础培养基中培养3至6天。
15.根据权利要求14所述的培养基，其特征在于，该神经细胞在该基础培养基中培养5天。
CNB2003101233585A 2002-12-13 2003-12-15 由干细胞产生神经细胞的方法及培养干细胞的培养基 Expired - Fee Related CN1252250C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/318,997 2002-12-13
US10/318,997 US7252995B2 (en) 2002-12-13 2002-12-13 Method of generating neurons from stem cells and medium for culturing stem cells

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1532280A CN1532280A (zh) 2004-09-29
CN1252250C true CN1252250C (zh) 2006-04-19

Family

ID=32506529

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB2003101233585A Expired - Fee Related CN1252250C (zh) 2002-12-13 2003-12-15 由干细胞产生神经细胞的方法及培养干细胞的培养基

Country Status (2)

Country Link
US (1) US7252995B2 (zh)
CN (1) CN1252250C (zh)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7807458B2 (en) 2003-01-30 2010-10-05 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Veterans Affairs Multilineage-inducible cells and uses thereof
WO2004097720A1 (en) * 2003-04-24 2004-11-11 Koninklijke Philips Electronics N.V. Non-invasive left ventricular volume determination
GB0409807D0 (en) * 2004-04-30 2004-06-09 Univ Brunel Method and system for reinnervation of skeletal muscle
US8642334B2 (en) 2009-02-17 2014-02-04 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Methods of neural conversion of human embryonic stem cells
US9677042B2 (en) 2010-10-08 2017-06-13 Terumo Bct, Inc. Customizable methods and systems of growing and harvesting cells in a hollow fiber bioreactor system
AU2012332269B2 (en) 2011-11-04 2018-05-31 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Midbrain dopamine (DA) neurons for engraftment
AU2014256876B2 (en) 2013-04-26 2020-11-12 Cornell, University Cortical interneurons and other neuronal cells produced by the directed differentiation of pluripotent and multipotent cells
EP3068867B1 (en) 2013-11-16 2018-04-18 Terumo BCT, Inc. Expanding cells in a bioreactor
CN105940101A (zh) 2013-11-21 2016-09-14 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 由人多能干细胞特化功能性颅基板衍生物
US11008547B2 (en) 2014-03-25 2021-05-18 Terumo Bct, Inc. Passive replacement of media
US20160090569A1 (en) 2014-09-26 2016-03-31 Terumo Bct, Inc. Scheduled Feed
WO2017004592A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Terumo Bct, Inc. Cell growth with mechanical stimuli
WO2017205667A1 (en) 2016-05-25 2017-11-30 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
US11104874B2 (en) 2016-06-07 2021-08-31 Terumo Bct, Inc. Coating a bioreactor
US11685883B2 (en) 2016-06-07 2023-06-27 Terumo Bct, Inc. Methods and systems for coating a cell growth surface
US11624046B2 (en) 2017-03-31 2023-04-11 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
CN117247899A (zh) 2017-03-31 2023-12-19 泰尔茂比司特公司 细胞扩增
US12234441B2 (en) 2017-03-31 2025-02-25 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
CN110333346A (zh) * 2019-07-12 2019-10-15 陈彩丽 一种活细胞内蛋白质的免疫荧光标记方法
EP4314244A1 (en) 2021-03-23 2024-02-07 Terumo BCT, Inc. Cell capture and expansion
US12152699B2 (en) 2022-02-28 2024-11-26 Terumo Bct, Inc. Multiple-tube pinch valve assembly

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7132286B2 (en) * 2001-06-18 2006-11-07 Psychiatric Genomics, Inc. Method for neural stem cell differentiation using valproate

Also Published As

Publication number Publication date
US20040115806A1 (en) 2004-06-17
CN1532280A (zh) 2004-09-29
US7252995B2 (en) 2007-08-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1252250C (zh) 由干细胞产生神经细胞的方法及培养干细胞的培养基
CN101056974A (zh) 鉴定和分离来自非骨软骨间充质组织的多潜能细胞
JP6687757B2 (ja) ３ｄ軟骨オルガノイドブロックを調製するための方法
CN1636054A (zh) 来自人胚胎干细胞的间充质细胞和成骨细胞
CN1961069A (zh) 获得间充质干细胞的方法
CN1452655A (zh) 间充质类干细胞的培养方法
CN101748096A (zh) 亚全能干细胞、其制备方法及其用途
RU2014136711A (ru) Стромальные стволовые клетки
CN105112361A (zh) 用于细胞的生物反应器放大的细胞培养系统
CA2934100C (en) Mammalian muscle-derived stem cells
CN108486050B (zh) 从犬的脐带制备间充质干细胞的方法
CN101316926A (zh) 用于分化干细胞的方法及其在牙病治疗中的用途
CN106282108A (zh) 一种具有免疫调节功能的脾脏间充质干细胞及其制备方法与应用
CN1548531A (zh) 用于产生体细胞的细胞系统
Morikawa et al. Applications of mesenchymal stem cells and neural crest cells in craniofacial skeletal research
KR20120063377A (ko) 세포배양 삽입체를 이용한 인간 배아줄기세포 유래 중간엽 세포의 분리방법
CN102703380A (zh) 亚全能干细胞、其制备方法及其用途
CN100497602C (zh) 一种干细胞、其制备方法及其用途
Keller et al. Osteogenesis from pluripotent stem cells: neural crest or mesodermal origin
JP2020516241A (ja) 筋肉由来の前駆細胞分化した細胞を取得する方法
CN1890365A (zh) 制备用于移植的细胞的方法
CN108795853B (zh) 制备犬胎膜间充质干细胞的方法和犬胎膜间充质干细胞
JPWO2019189947A1 (ja) ヒト臍帯由来間葉系幹細胞から骨芽細胞の製造を目的としたアクチン重合阻害剤による分化誘導技術
CN1610738A (zh) 诱导中胚层干细胞,es细胞,或无限增殖化的中胚层干细胞分化成神经细胞的方法
Kanmaz et al. Isolation and Characterization of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells (ADSCs) from Sheep and Goats

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: FU YUXIU; ZHENG HONGZHI

Free format text: FORMER OWNER: FU YUXIU

Effective date: 20060623

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20060623

Address after: Taipei city of Taiwan Province

Co-patentee after: Zheng Hongzhi

Patentee after: Fu Yuxiu

Address before: Taipei city of Taiwan Province

Patentee before: Fu Yuxiu

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20060419

Termination date: 20181215

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee