CN1238008A - Hppd基因和抑制剂 - Google Patents
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Abstract
公开了得自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的编码4－羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)的核酸序列。另外还公开了含有编码HPPD的DNA的载体及被转化的细胞。本发明还描述了鉴定除草剂抗性HPPD和作为HPPD抑制剂的除草剂的方法，以及赋予植物以除草剂抗性的方法。再者，还描述了控制杂草的方法。
Description
发明的领域
本发明涉及编码4-羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)的DNA，HPPD抑制性除草剂，以及筛选化合物以鉴定HPPD抑制性除草剂的方法。本发明还涉及对除草剂的抑制作用有抗性的HPPD变异体，筛选HPPD变异体的方法，以及含有除草剂抗性HPPD的植物。
发明的背景
在植物中，4-羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD,EC1.13.11.27)是生物合成质体醌和生育酚的关键酶。4-羟苯基丙酮酸(通过莽草酸途径衍生于分支酸)被氧化并被HPPD脱羧形成尿黑酸(Fiedler和Schultz，植物生物学进展(Dev.Plant Biol.)8:537,1982；Fiedler等人，Planta 155:511,1982)。然后尿黑酸发生聚异戊二烯化和脱羧而产生一系列质体醌和生育酚。
在动物中，HPPD参予酪氨酸代谢。人和小鼠中这一途径的遗传缺陷导致遗传性Ⅰ型酪氨酸血症。可用NTBC，即2-(2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰基)-1,3-环己二酮治疗这种疾病，NTBC是一种HPPD抑制剂，可防止有肝脏毒性的酪氨酸代谢中间产物的形成(Ellis等人，Tox.and Appl.Pharm.133:12,1995)。
由于质体醌和生育酚是植物的基本化合物，所以该酶的抑制剂是潜在的除草剂。目前已证明三酮类HPPD抑制剂具有除草活性(Prisbylia等人，Brighton Crop Protection Conference:Weeds,British Crop Protection Council,Surrey,UK,pp 731-738,1993；Schulz等人，FEBS Letts.318:162,1993)。玉米选择性硫康三酮(sulcotrione)(2-(2-氯-4-甲磺酰苯甲酰基)-1,3-环己二酮引起敏感植物的强烈退色，伴有类胡萝卜素和叶绿素的丢失及八氢番茄红素和酪氨酸的增加(Barta等人，Pest.Sci.45:286,1995；Soeda等人，Pestic.Biochem.Physio1.29:35,l987,Mayonado等人，Pestic.Biochem.Physiol.35:138,1989)。用硫康三酮处理浮萍属严重地抑制了生长，并可用尿黑酸消除除草作用。已显示从玉米中提取的部分纯化的酶将受到硫康三酮的严重抑制，计算的IC50为45nM(Schulz等人，1993，上述文献)。对从稗子中部分纯化的HPPD的分析(Echinochloa crus-galli L.)显示，硫康三酮是该酶的强有力的竞争性抑制剂，其Ki值为9.8nM(Secor，植物生理学(Plant Physiol.)106:1429,1994)。加拿大专利申请No.2,116,421公开了鉴定由2-苯甲酰环六胺1,3-二酮衍生的HPPD抑制剂的方法。
从T-DNA接尾标记的拟南芥属(Arabidopsis)群体中分离的白化突变体(psdl)最初是借助严重的色素缺陷选择的，后者被认为是由于类胡萝卜素生物合成基因的缺陷造成的(Norris等人，植物细胞(Plant Cell)7:2139,1995)。当白化psdl突变体在MS2培养基上发芽并继后移入加有4-羟苯基丙酮酸(OHPP)或尿黑酸(HGA)的MS2培养基中生长时，植物在HGA上变绿，但在OHPP上则没有变绿。进一步分析这种突变体表明，引起白化表型的缺陷并不是直接由于类胡萝卜素生物合成酶的突变，而是由于阻止类胡萝卜素生物合成所必需的质体醌生物合成的HPPD的突变所致。
尽管这一途径在植物中很重要，但以前尚没有分离出编码这种质体醌和生育酚生物合成所需的植物酶的基因。因此，本领域需要用于提供HPPD基因、用作除草剂的HPPD抑制剂，以及除草剂抗性HPPD变体的方法和组合物。本发明人已分离了编码植物HPPD的基因，在大肠杆菌中表达了该基因，并已证明了细菌表达的植物HPPD是有酶促活性的，而且其酶促活性是受三酮除草剂抑制的。
附图的简要说明
图1显示拟南芥4-羟苯基丙酮酸双加氧酶(At HPPD)的氨基酸序列，并将该序列与得自小鼠、人、猪和除虫链霉菌(S.Aver)的相关序列一一对齐给出。
图2是图解说明由用拟南芥属HPPD基因(“拟南芥属”)转化的大肠杆菌生产褐色色素，并与用对照载体(“质粒”)转化的大肠杆菌相比较。显示向培养基中加入渐增浓度的酪氨酸对色素形成的影响。
图3A显示用对照载体转化的大肠杆菌培养基的HPLC洗脱曲线。图3B显示用拟南芥属HPPD基因转化的大肠杆菌培养基的HPLC洗脱曲线。箭头指出真正尿黑酸标准品的洗脱位置。图3B中的插入框是说明尿黑酸峰的吸收谱。
图4是图解说明渐增硫康三酮的浓度对衍生于用拟南芥属HPPD基因转化的大肠杆菌的细胞提取物的HPPD酶促活性的影响。
发明的概要
本发明提供编码植物4-羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)，特别是衍生于拟南芥HPPD的纯化的分离的核酸，及其序列保守变体和功能保守变体；含有与转录调节元件可操作地连接的HPPD编码核酸的载体；含有HPPD载体的细胞，其中包括但不只限于细菌、真菌、植物、昆虫和哺乳动物细胞。在一个实施方案中，提供了高水平表达植物HPPD的细菌细胞。另外本发明还包括HPPD多肽和由之衍生的酶促活性片段。
在另一个方面，本发明提供按下述步骤完成的鉴定除草剂/HPPD抑制剂的方法：
(a)提供表达植物HPPD的微生物细胞；
(b)于存在试验化合物的条件下培养细胞以形成试验培养物，并在没有试验化合物的条件下培养细胞以形成对照培养物；
(c)监测试验和对照培养物中尿黑酸或其氧化产物的水平；并且
(d)鉴定相对于对照培养物的试验培养物中，作为抑制HPPD的化合物的降低尿黑酸或其氧化产物水平的任何化合物。在上述方法中，例如通过检测所说的培养物在450nm处的吸光率，或肉眼检查褐色色素的形成以完成监测步骤。或者，也可鉴定作为抑制试验培养物生长之化合物的抑制剂，其中通过向培养物中加入尿黑酸来逆转抑制作用。
再一个方面，本发明提供按下述步骤完成的鉴定除草剂抗性HPPD变体的方法；
(a)提供表达植物HPPD的细胞群体；
(b)诱变所说的细胞群体；
(c)在抑制非诱变的细胞生长的条件下，使所说的诱变细胞群体与除草剂接触；
(d)根据细胞生长和/或色素形成情况回收对所说除草剂的抑制作用有抗性的细胞；并且
(e)检测所回收的细胞中的编码HPPD的核酸序列。或者，亦可在体外对编码HPPD的DNA进行随机或位点特异性诱变，然后在异源细胞中表达并筛选或选择表现除草剂抗性的细胞。
再一个方面，本发明包括有除草剂抗性的变异的HPPD蛋白质。当除草剂抗性HPPD变异蛋白质在为维持生存力而需要HPPD活性的细胞中表达时，则表现有：
(ⅰ)单独即足以维持表达它的细胞的存活力的催化活性；或与也在该细胞中表达的任何除草剂抗性HPPD变异蛋白质结合的催化活性，其可以是与第一种HPPD变异体蛋白质相同或不同的，并足以维持表达该蛋白质的细胞的存活性；以及
(ⅱ)比野生型HPPD有更大除草剂抗性的催化活性。
还提供了编码除草剂抗性HPPD变体的核酸，包括该核酸的DNA载体，含有编码变体HPPD的载体的细胞。例如在导入及选择任何其他所需的基因的质粒和方法中，可使用编码除草剂抗性HPPD变体的基因作为遗传标记。
另一个方面，本发明提供向细胞或细胞群体，特别是植物细胞或细胞群体如种子赋予除草剂抗性的方法。突变HPPD基因，特别是拟南芥HPPD基因，以改变除草剂抑制HPPD的酶促活性的能力。将突变的基因克隆到适合的表达载体中，并在以足够水平被表达的条件下将基因转入除草剂敏感性细胞中，以为细胞提供除草剂抗性。
本发明还包括控制杂草的方法，其中培养包含本发明的除草剂抗性HPPD基因的作物，并用控制杂草有效量的除草剂处理之。发明的详细描述
本发明包括编码植物4-羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)的分离的，纯化的核酸，产生酶促活性HPPD的表达系统，以及鉴定HPPD抑制剂的筛选方法。
本发明还包括筛选和产生对除草剂的抑制作用有抗性的植物HPPD变体的方法、编码这些变体的DNA，包括这些DNA的载体、HPPD变体蛋白质，以及表达这些变体的细胞。另外还提供了表达这些变体以在植物中产生除草剂抗性的方法和控制杂草的方法。编码拟南芥属HPPD的基因的分离和特性鉴定
本发明人已使用下述方法分离并测序了编码拟南芥HPPD的基因。简单地说，使用基于PCR的方法(Amaravadi等人，生物技术(Biotechniques)16:98,1994)筛选拟南芥λYes cDNA文库(Elledge等人，美国国家科学院院报88:1731,1991)。
引物：基于同源于哺乳动物HPPD序列的拟南芥属EST序列(GenBank ID No:T20952)合成称为ATHPPD1F的正向引物(5′-CGTGCTCAGCGATGATCAGA-3′)，和称为ATHPPD1R的反向引物(5′-CGGCCTGTCACCTAGTGGTT-3′)。
使用1μl等份(含有3×106pfu/ml)的cDNA噬菌体文库作为模板DNA以聚合酶链反应(PCR)评价引物。为进行PCR反应，50μl反应混合物含有1×PCR缓冲液、各200mM三磷酸脱氧核苷、1.25单位AmpliTaq DNA聚合酶(均购自Perkin Elmer)和各7.5pmole引物。将反应混合物加热至95℃2分钟并进行35次扩增循环：95℃1分钟，48℃2分钟，72℃1分钟30秒。然后于72℃保温7分钟。产生112bp预测大小的片段。将该片段克隆到pCRⅡ载体(TA克隆试剂盒，Invitrogen)并测序，发现其完全相同于拟南芥属EST序列(在被报导的EST序列中加入了3个尚未确定的残基)。
文库筛选：以40,000pfu/平皿的密度将cDNA文库铺敷在13个含有NZCYM琼脂的平皿上。将各平皿中的噬菌体洗入SM中，并使用13个个别噬斑集合物的等分样品作为模板，以ATHPPD1F和ATHPPD1R引物对进行PCR反应。PCR条件如上所述(第一次循环使用各1μl洗脱的噬菌体集合物作为模板，继后各次循环则使用5μl)。在第一次循环中，可见13份噬菌体集合物中有10个为阳性。选择其中一份阳性集合物作进一步筛选。在第二次循环中，从10个平皿(5,000pfu/平皿)中得到的洗脱物产生1份阳性集合物。在第三次循环中，10个平皿(约20pfu/平皿)中得到2份阳性集合物。从平皿中移出第三轮阳性集合物，并挑出36个独立的噬斑进行筛选，以找出单个HPPD阳性噬斑。通过载体的自动亚克隆性质从该噬菌体中切出携带插入物的质粒。限制性酶切分析表明该质粒含有1.5kb插入物。
序列分析：使用Wizard DNA纯化系统(Promega)制备用于测序的模板DNA。使用fmol DNA测序系统(Promega)进行测序反应，并在Hydrolink Long Ranger(AT Biochem)凝胶上进行序列胶电泳。从cDNA文库中分离含HPPD质粒的插入段，并使用除一系列内部引物外的，在XhoⅠ克隆位点的相反侧与λYes载体杂交的两个引物：上述ATHPPD1F和ATHPPD1R；和
ATHPPD2F(5’-CTTCTACCGATTAACGAGCCAGTG-3’)；
ATHPPD2R(5’-CACTGGCTCGTTAATCGGTAGAAG-3’)；
ATHPPD3F(5’-TCCATCACATCGAGTTCTGGTGCG-3’)；
ATHPPD3R(5’-AAAAGGAATCGGAGGTCACCGGA-3')；
ATHPPD4F(5’-CTGAGGTTAAACTATACGGCGA-3’)；及
ATHPPD4R(5′-TCGCCGTATAGTTTAACCTCAG-3′)进行序列测定。对两条链进行序列分析以进一步证实所有的序列信息。使用Wisconsin Package，Version 8.0(Genetics计算机集团，Madison，Wisconsin)中的软件完成HPPD核苷酸序列的翻译，序列比较及多个序列排列。
结果表明，1.5kb插入段含有445个氨基酸的开放读框(图1)。GenEMBL数据库的TFASTA检索鉴定了5个有部分同源性的已知序列：链霉菌属HPPD(U11864)；大鼠F同种抗原(M18405)、小鼠HPPD(D29987)；猪HPPD(D13390)；和人HPPD(X72389)。拟南芥属序列与上述那些序列的直接成对比较显示56％平均相似性和37％平均相同性。此外，还在拟南芥属序列中观察到许多已被指出为哺乳动物HPPD中金属结合位点的保守的酪氨酸和组氨酸残基(Ruetschi等人，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)205:459,1992；Denoya等人，细菌学杂志(J.Bacteriol.)176:5312,1994)。
HPPD基因在拟南芥属中的基因组组构：使用按Dellaporta的方法(Dellaporta等人，植物分子生物学通讯(Plant Mol.Biol.Rep.)1:19,1983)从拟南芥属籽苗中制备的基因组DNA进行Southern印迹分析。用限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ消化10μgDNA，然后在0.9％琼脂糖凝胶上分离消化产物，使用VacuGene Ⅺ真空印迹系统(Pharmacia)转移到Duralon-UV膜(Stratagene)上并使用Stratalinker UV交联剂(Stratagene)交联。按下述方法制备HPPD探针：(ⅰ)从HPPD/λYes质粒DNA的消化产物中凝胶纯化(使用GeneClean试剂盒，Bio 101,Inc.)Xho 1/SstⅠ片段。该片段含有ATG起始密码子上游的50个碱基序列并延伸到TGA终止密码子上游55碱基的位置；(ⅱ)使用Prime-It Fluor荧光标记试剂盒(Stratagene)标记该片段。使用QuikHyb迅速杂交溶液(Stratagene)使标记的探针于68℃与膜杂交2小时。用0.1×SSC/0.1％SDS于室温下将膜洗一次并于60℃洗两次，然后使用发光器非放射活性检测系统(Stratagene)观察杂交带。
在BamHⅠ和HindⅢ消化产物中，都只有一条在高度严格条件下与探针杂交的带。在EcoRⅠ消化产物中观察到两条带，反映HPPD序列中存在有内部EcoRⅠ位点。这些结果提示HPPD是由拟南芥属中的单拷贝基因编码的。
然后使用引物ATHPPD5F(5′-CCATGGGCCACCAAAACG-3′)和ATHPPD5R(5′-CTGCAGTCATCCCACTAACTGTTTG-3′)从拟南芥属基因组DNA中扩增完整的HPPD编码序列。将所得到的稍大于相应cDNA片段的基因组HPPD片段克隆到pCRⅡ载体(TA克隆试剂盒，Invitrogen)中并进行序列分析。检测到定位在cDNA序列之核苷酸位置1163-1164处的107bp单个内含子。
核酸、载体、表达系统和多肽
在本发明的实践中，使用如在Sambrook等人，1989，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；DNA克隆：实用方法，Vol:Ⅰ&Ⅱ,1985(D.N.Glover编辑)；寡核苷酸合成，1984(M.L.Gait编辑)；转录和翻译，1984(Hames和Higgins编辑)；酶学中分子克隆方法的实践指南(Academic Press,Inc.)，和蛋白质纯化：原理和实践，第二版(Springer-Verlag，纽约)中详细描述的分子生物学、微生物学、重组DNA及蛋白质生物化学技术。
本发明包括编码植物HPPD的核酸序列、由之衍生的酶促活性片段及相关的其他种植物的HPPD衍生序列。本文使用的术语，“从HPPD序列衍生的”核酸序列是指相应于该序列之一个区域的核酸序列，同源或互补于该序列的序列，以及“序列保守性变体”和“功能保守性变体”。序列保守性变体是其中在给定的密码子位置上一个或多个核苷酸的改变不导致该位置所编码的氨基酸的改变的那些变体。功能保守性变体是在HPPD中给定的氨基酸残基已发生改变，但没有改变HPPD多肽的总体构象和功能的那些变体，所说的改变包括但不只限于用具有相似物理-化学性质(如酸性、碱性、疏水性质等等)的氨基酸取代某个氨基酸。可以按照本文所述的方法鉴定仍保留酶促活性的HPPD片段，例如在大肠杆菌中表达，然后以酶学方法检测细胞提取物。
可使用本文提供的方法和组合物，以常规实验分离从拟南芥以外的植物中衍生的HPPD序列。例如，可在中度严格条件下(例如在65℃2×SSC水溶液中)使包括全部或部分拟南芥属HPPD序列的核酸与衍生于其他种植物的cDNA或基因组DNA杂交，以鉴定HPPD同系物。可从市场上购得衍生于不同种植物的cDNA文库(Clontech,PaloAlto,CA:Stratagene,La Jolla,CA)。另外，也可使用基于PCR的方法扩增来自其他种植物cDNA或基因组DNA的HPPD相关序列。例如可使用下文详细描述的方法在大肠杆菌中表达所鉴定的序列，以进一步证实由相当于HPPC编码序列的序列编码之多肽的酶促活性。因此，衍生于双子叶和单子叶植物的HPPD序列也包括在本发明范围内。
本发明的核酸包括任何长度的含嘌呤和嘧啶聚合物，可以是多聚核糖核苷酸或多聚脱氯核糖核苷酸或混合的多核糖-多脱氧核糖核苷酸。其中包括单链和双链分子，即DNA-DNA、DNA-RNA及RNA-RNA杂合体，以及碱基与氨基酸骨架接合形成的“蛋白质核酸”(PNA)。其中还包括含有修饰的碱基的核酸。可直接从细胞中分离核酸。另外，也可使用化学合成链或基因组材料作为模板，以PCR技术产生本发明的核酸。可使用本文提供的序列信息合成并可进一步设计用于PCR的引物，以根据需要导入新的适当的限制位点，从而有利于将序列掺入适于重组表达的给定载体中。
本发明的核酸可以侧接天然拟南芥属调节序列，或者可与异源序列，包括启动子、增强子、反应元件、信号序列、聚腺苷酸化序列、内含子、5′和3′非编码区等相连接。也可用本领域已知的许多方法修饰核酸。这些修饰的非限制实例包括甲基化、“加帽”、用类似物取代一个或多个天然核苷酸，以及例如用不带电荷的键(如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)和用带电荷的键(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)进行核苷酸间修饰。核酸可含有一个或多个另外的共价连接部分，例如蛋白质(如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)、嵌入剂(如吖啶、补骨脂素等)、螯合剂(如金属、放射活性金属、铁、氧化金属等)，以及烷基化剂。可形成甲基或乙基磷酸三酯或烷基氨基磷酸酯键而衍生核酸。此外，可用能够提供可检测信号的标记直接或间接修饰本发明的核酸序列。可举例的标记包括放射性同位素、荧光分子、生物素等。
本发明还提供包含已公开的HPPD序列或其衍生物或片段的核酸载体。已描述了许多适于在各种真核和原核宿主中复制和/或表达的载体，包括质粒和真菌载体。非限制性的例子包括pKK质粒(Clontech)、pUC质粒、pET质粒(Novagen,Inc.,Medison,WI),或pRSET或pREP(Invitrogen,San Diego,CA)，并可使用本文公开或列出的，或相关领域技术人员已知的方法转化许多合适的宿主细胞。重组克隆载体常常包括一个或多个用于克隆或表达的复制系统，一个或多个用于在宿主中选择的标记，如抗生素抗性标记，以及一个或多个表达盒。可用适当的方法如电穿孔、CaCl2介导的DNA摄入、真菌感染、微粒轰击、显微注射或其他已建立的方法转化/转染/感染适当的宿主细胞。
适当的宿主细胞包括细菌、古细菌、真菌、特别是酵母，及植物和动物细胞，特别是哺乳动物细胞。其中特别有用的是大肠杆菌、枯草杆菌、酿酒酵母、卡尔斯伯酵母、粟酒裂殖酵母、SF9细胞、C129细胞、293细胞、链孢霉属及CHO细胞、COS细胞、Hela细胞和无限增殖化哺乳动物髓样和淋巴样细胞系。优选的复制系统包括M13、C01E1、SV40、杆状病毒、λ、腺病毒等。已分离了许多转录起始和终止调节区，并显示它们对异源蛋白质在各种宿主中的转录和翻译是有效的。这些区域的实例、分离方法、操作方法等都是本领域已知的。在适当的表达条件下，可使用宿主细胞作为重组产生的HPPD衍生的肽和多肽的来源。
有利的是，载体也可包含可操作地连接到HPPD部分上的转录调节元件(即启动子)。启动子可任选地含有操纵子部分和/或核糖体结合位点。与大肠杆菌相容的细菌启动子的非限制性实例包括：trc启动子、β内酰胺酶(青霉素酶)启动子、乳糖启动子、色氨酸(trp)启动子、阿拉伯糖BAD操纵子启动子、λ衍生的P1启动子和N基因核糖体结合位点，以及从trp的序列衍生的杂合tac启动子和lac UV5启动子。酵母启动子的非限制性实例包括3-磷酸甘油酸激酶启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子、半乳糖激酶(GAL1)启动子、半乳糖差向异构酶启动子和醇脱氢酶(ADH)启动子。适于哺乳动物细胞的启动子包括但不只限于病毒启动子和得自猿猴病毒40(SV40)、Rous肉瘤病毒(RSV)、腺病毒(ADV)和牛乳头瘤病毒(BPV)的启动子。哺乳动物细胞还可能需要终止子序列和聚A加入序列，并且还可包括提高表达的增强子序列。另外还希望有引起基因扩增的序列。此外，还可包括有利于重组产物从细菌、酵母和动物细胞等细胞中分泌的序列，如分泌信号序列和/或激素原前区域序列。
也可经重组过程将编码野生型或变异HPPD多肽的核酸导入细胞。例如，可将这样的序列导入细胞中，从而在内源基因或实质上与该基因相同的序列的位点实现同源重组。也可使用其他基于重组的方法，如非同源重组或通过同源重组删除内源基因。
可从野生型或突变体拟南芥属细胞中，或已导入或表达了HPPD衍生的蛋白质编码序列的异源生物体或细胞(包括但不只限于细菌、真菌、昆虫、植物和哺乳动物细胞)中分离本发明的HPPD衍生的多肽，包括功能保守性HPPD变异体。此外，这些多肽可以是重组融合蛋白质的一部分。也可使用市售的自动合成设备和方法化学合成多肽，这些方法包括但不只限于专有固相合成、部分固相方法、片段缩合或经典的溶液合成方法。
“纯化”HPPD多肽是指在不受表达多肽的细胞中其他成份干扰情况下，以可检测其酶促活性的形式分离HPPD多肽。纯化多肽的方法是本领域已知的，其中包括但不只限于制备性圆盘凝胶电泳、等电聚焦、HPLC、反相HPLC、凝胶过滤、离子交换和分配层析，以及逆流分配法。在某些情况下，最好在重组系统中产生多肽，其中HPPD蛋白质含有便于纯化的附加序列标记，例如但不只限于聚组氨酸序列。然后在适当的固相基质上层析，以从宿主细胞的粗制溶胞产物中纯化所需的多肽。或者，可使用抗HPPD或由之衍生的肽的抗体作为纯化试剂。其他纯化方法也是适用的。
本发明还包括HPPD多肽的衍生物和同系物。为某些目的，可通过核苷酸的取代、加入或删除来改变编码肽的核酸序列，借以提供功能等同分子，即功能保守变异体。例如，可用有相似性质的另一种氨基酸，例如带正电荷的氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氧酸)、带负电荷的氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)、极性中性氨基酸及非极性氨基酸取代序列内的一个或多个氨基酸残基。
例如可用磷酸化、硫酸化、酰化或其他蛋白质修饰作用修饰所分离的多肽。也可以用能提供可检测信号的标记例如用放射性同位素和荧光化合物直接或间接修饰这些多肽。鉴定HPPD抑制剂/除草剂的筛选方法
可使用本发明的方法和组合物鉴定能够抑制HPPD的功能，并因而可用作除草剂或用作开发有用除草剂的前体的化合物。为此，可提供表达HPPD并因而从4-羟苯基丙酮酸(OHPP)产生尿黑酸的细胞而达到这一目的。在有试验化合物时培养表达HPPD的细胞培养物以形成试验培养物，并在没有试验化合物时培养产生对照培养物。在适当条件下使培养持续足够时间以便干扰HPPD功能。在与试验化合物温育开始后的预定时间，进行试验以监测HPPD酶促活性。在一优选实施方案中，根据尿黑酸氧化和/或聚合而产生的红-褐色素的出现，肉眼监测HPPD活性(La Du等人，摘自褐黄病(Ochronosis)，病理学中的色素，M.Wolman(编辑)，Academic Press,NY,1969)。另外，可使用下文实施例1中描述的常规方法监测细胞提取物中的HPPD酶促活性。针对培养物样品和试验样品，检测中均另外包括对照，例如不表达HPPD的宿主细胞(例如用含有以相反方向连接的HPPD基因或无插入片段的表达质粒转化的宿主细胞)。因为HPPD抑制性化合物降低相对于对照培养物之试验培养物中的HPPD活性，从而可鉴定HPPD抑制性化合物。
可用于实践本发明的宿主细胞包括但不只限于细菌、真菌、昆虫、哺乳动物细胞和植物细胞。较好是使用细菌细胞。所使用的细菌细胞最好是相对于野生型宿主细胞来说，表现提高了对试验化合物的膜通透性的变异体细胞(例如大肠杆菌的imp突变体)。
本发明的方法较好适应于高流通量筛选，允许在单一检测中试验多种化合物。这样的抑制性化合物例如可见于天然产物库、发酵库(包括植物和微生物)、组合文库、化合物存储库及合成的化合物文库中。例如，可从Maybridge化学公司(Trevillet,Cornwall,UK)、Comgenex(Princeton,NJ)、Brandon Associates(Merrimack,NH)和Microsource(New Milford,CT)购得合成化合物文库。稀有化合物文库可得自Aldrich Chemical Company,Inc.(Milwaukee,WI)。另外，例如可从Pan Laboratories(Bothell,WA)或Myco Search(NC)得到细菌、真菌、植物和动物细胞提取物形式的天然化合物文库，并且可很容易地生产。另外，可通过常规的化学、物理和生物化学手段很容易地修饰天然和合成产生的文库和化合物(B1ondelle等人，TibTech 14:60,1996)。本发明的HPPD抑制剂检测法的优点在于可容纳许多不同类型的溶剂，因而可以试验许多不同来源的化合物。
一旦用本发明的方法鉴定了化合物为HPPD抑制剂，即可进行体内和体外试验以进一步确定HPPD抑制活性的性质和机理。例如，可按下文实施例1中所述的方法确定已鉴定的化合物对纯化的或部分纯化的HPPD的体外酶促活性的影响。例如，可使用经典的酶动力学作图来区别竞争性和非竞争性抑制剂。
可以修饰使用本发明的方法鉴定为HPPD抑制剂的化合物，以提高其用作商品除草剂的效力、效能、摄入量、稳定性及适应性。可使用本领域已知的方法完成和检验这些修饰。除草剂抗性HPPD变异体的分离
本发明包括分离对HPPD抑制剂/除草剂的作用有抗性的HPPD变异体。HPPD变异体可以是天然存在的或者可以是通过随机或位点特异性诱变得到的。
在一个实施方案中，使用本领域已知的方法诱变表达HPPD的细胞或生物体的群体，然后对这些细胞或生物体进行筛选或选择以鉴定对HPPD抑制剂的毒性作用有抗性的变异体。然后例如使用PCR技术从抗性细胞或生物体中分离变异的HPPD基因。
在另一个实施方案中，可体外对分离的HPPD基因进行随机或位点特异性诱变，然后将诱变的基因译本再导入适当的细胞如大肠杆菌细胞中，并按上述方法选择或筛选之。
在适当的宿主细胞中表达变异的HPPD基因，并将变异HPPD多肽的酶促性质与野生型HPPD相比较。给定的突变较好是产生保留有对4-羟苯基丙酮酸(OHPP)之酶促活性的HPPD变异多肽，即其可将OHPP转化成尿黑酸(并因而预期是在体内有生物学活性的)，同时与野生型HPPD相比表现对选择的除草剂有相对更大抗性的催化活性。当在为维持存活性而需要HPPD活性的细胞中表达时，该变异的HPPD表现有(ⅰ)单独即足以使表达它的细胞维持存活性的催化活性；或者与也在该细胞中表达的任何除草剂抗性HPPD变异体蛋白质结合，足以维持表达该蛋白质之细胞的存活性的催化活性，该变异蛋白质可以是与第一种变异体蛋白质相同或不同的；以及(ⅱ)比野生型HPPD有更大抗除草剂抗性的催化活性。
因此，任何一种特异性HPPD变异体蛋白质都不一定有为维持细胞存活性所需的总催化活性，但必须在单独或与同样HPPD变异体附加拷贝的催化活性和/或其他HPPD变异体蛋白质的催化活性合并的情况下，具有一定的催化活性，以便足可维持需要有HPPD活性参与的细胞存活性。例如，可以将编码突变体基因的多个拷贝导入细胞中，或者导入进一步包括相对强的启动子的基因，以提高变异体的产率，从而可将催化活性增至最大的可接受的水平。
更大抗性是指由除草剂减小变异体的催化活性，要比由除草剂降低野生型HPPD催化活性时达到更小的程度。优选的有更大抗性的变异体HPPD保留为维持细胞、植物或生物体(其中加有同样浓度的同样除草剂)的存活性所需的足够催化活性，而野生型HPPD则不会保留为维持细胞、植物或生物体的存活性所需的足够催化活性。
在没有除草剂时，优选的催化活性至少为没有除草剂时野生型HPPD催化活性的至少约5％，最好约大于20％。
对于三酮抗性变异体HPPD来说，HPPD变异体蛋白质最好具有：
(ⅰ)在没有所说的除草剂时，约大于所说的野生型HPPD之催化活性的20％以上的催化活性；
(ⅱ)与野生型HPPD相比对三酮除草剂表现有更大抗性的催化活性。
可使用除草剂抗性HPPD变异体作为正常情况下对除草剂抑制生长和/或色素形成的作用敏感的细胞中的遗传标志。在一个实施方案中，将编码除草剂抗性HPPD变异体的DNA掺入到质粒中，并使之处于适当启动子的控制下。然后将任何所需的基因掺入质粒中，并将最后的重组质粒导入除草剂敏感性细胞内。然后在足以抑制生长和/或色素形成之浓度的除草剂存在下培养细胞，借以选择或筛选已用该质粒转化的细胞。化学物质抗性植物和含有变异的HPPD基因的植物
本发明包括转基因细胞，例如其中已导入了编码除草剂抗性HPPD变异体的种子、生物体和植物。下列表1中列出了适当的受体植物的实例。表1受体植物
| 俗名 | 科 | 拉丁名 |
| 玉米 | 禾本科 | Zea mays |
| 玉米，Dent | 禾本科 | Zea mays dentiformis |
| 玉米，Flint | 禾木科 | zea mays vulgaris |
| 玉米，Pop | 禾木科 | Zea mays microsperma |
| 玉米，Soft | 禾木科 | zea mays amylacea |
| 玉米，Sweet | 禾木科 | Zea mays smyleasaccharata |
| 玉米，Sweet | 禾木科 | Zea mays saccharate |
| 玉米，Waxy | 禾木科 | Zea mays ceratina |
| 小麦，Dinkel | Pooideae | Triticum spelta |
| 小麦，Durum | Pooideae | Triticum durum |
| 小麦，English | Pooideae | Triticum turgidum |
| 小麦，Large Spelt | Pooideae | Triticum spelta |
| 小麦，Polish | Pooideae | Triticum polonium |
| 小麦，poulard | Pooideae | Triticum turgidum |
| 小麦，singlegrained | Pooideae | Triticum monococcum |
| 小麦，Small spelt | Pooideae | Triticum monococcum |
| 小麦，Soft | Pooideae | Triticum aestivum |
| 稻米 | Oryza sativa | |
| 稻米，American Wild | 禾木科 | Zizania aquatica |
| 稻米，Australian | 禾木科 | Oryza australiensis |
| 稻米，Indian | 禾木科 | Zizania aquatica |
| 稻米，Red | 禾木科 | Oryza glaberrima |
| 稻米，Tuscarora | 禾木科 | Zizania aquatica |
| 稻米，West African | 禾木科 | Oryza glaberrima |
| 大麦 | Pooideae | Hordeum vulgare |
| 大麦，AbyssinianIntermediate，alsoIrregular | Pooideae | Hordeum irregulare |
| 大麦，AncestralTworow | Pooideae | Hordeum spontaneum |
| 大麦，Beardless | Pooideae | Hordeum trifurcatum |
| 大麦，Egyptian | Pooideae | Hordeum trifurcatum |
| 大麦，fourrowed | Pooideae | Hordeum vulgare polystichon |
| 大麦，sixrowed | Pooideae | Hordeum vulgare hexastichon |
| 俗名 | 科 | 拉丁名 |
| 大麦，Tworowed | Pooideae | Hordeum distichon |
| 棉花，Abroma | 双子叶植物纲 | Abroma augusta |
| 棉花，AmericanUpland | 锦葵科 | Gossypium hirsutum |
| 棉花，Asiatic Tree,also Indian Tree | 锦葵科 | Gossypium arboreum |
| 棉花，Brazilian,also，Kidney,and,Pernambuco | 锦葵科 | Gossypium barbadensebrasiliense |
| 棉花， Levant | 锦葵科 | Gossypium hertaceum |
| 棉花，Long Silk,alsoLong Staple,Sea Island | 锦葵科 | Gossypium barbadense |
| 棉花，Mexican,alsoShort Staple | 锦葵科 | Gossypium hirsutum |
| 大豆，Soya | 豆科 | Glycine max |
| 糖甜菜 | 藜科 | Beta vulgaris altissima |
| 甘蔗 | 木本植物 | Arenga pinnata |
| 番茄 | 茄科 | Lycopersicon esculentum |
| 番茄，Cherry | 茄科 | Lycopersicon esculentumcerasiforme |
| 番茄，Common | 茄科 | Lycopersicon esculentumcommune |
| 番茄，Currant | 茄科 | Lycopersiconpimpinellifolium |
| 番茄，Husk | 茄科 | Physalis ixocarpa |
| 番茄，Hyenas | 茄科 | Solanum incanum |
| 番茄，Pear | 茄科 | Lycopersicon esculentumpyriforme |
| 番茄，Tree | 茄科 | Cphomandra betacea |
| 马铃薯 | 茄科 | Solanum tuberosum |
| 马铃薯，Spanish，甜土豆 | 旋花科 | Ipomoea batatas |
| 黑麦，Common | Pooideae | Secale cereale |
| 黑麦，Mountain | Pooideae | Secale montanum |
| 胡椒，Bell | 茄科 | Capsicum annuum grossum |
| 胡椒，Bird,alsoCayenne,Guinea | 茄科 | Capsicum annuum mimimum |
| 胡椒，Bonnet | 茄科 | Capsicum sinense |
| 胡椒，Bullnose,alsoSweet | 茄科 | Capsicum annuum grossum |
| 俗名 | 科 | 拉丁名 |
| 胡椒，Cherry | 茄科 | Capsicum annuumcerasiforme |
| 胡椒，Cluster,alsoRed Cluster | 茄科 | Capsicum annuumfasciculatum |
| 胡椒，Goat,alsoSpur | 茄科 | Capsicum frutescens |
| 胡椒，Long | 茄科 | Capsicum frutescens longum |
| 胡椒，OranamentalRed,also Wrinkled | 茄科 | Capsicum annuumabbreviatum |
| 胡椒，Tabasco Red | 茄科 | Capsicum annuum conoides |
| 莴苣，Garden | 菊科 | Lactuca sativa |
| 莴苣，Asparagus,also Celery | 菊科 | Lactuca sativa asparagina |
| 莴苣，Blue | 菊科 | Lactuca perennis |
| 莴苣，Blue,alsoChicory | 菊科 | Lactuca pulchella |
| 莴苣，Cabbage,also | 菊科 | Lactuca sativa capitata |
| 莴苣，Cos,alsoLongleaf,Romaine | 菊科 | Lactuca sativa longifolia |
| 莴苣，Crinkle,alsoCurled,Cutting,Leaf | 菊科 | Lactuca sativa crispa |
| 旱芹 | 伞形科 | Apitm graveolens dulce |
| 旱芹，Blanching,alsoGarden | 伞形科 | Apium graveolens dulce |
| 旱芹，Root,alsoTurniprooted | 伞形科 | Apium graveolens rapaceum |
| 茄子，Garden | 茄科 | Solanum melongena |
| 高粱 | 高粱属 | All crop species |
| 紫苜蓿 | 豆科 | Medicago sativum |
| 胡萝卜 | 伞形科 | Daucus carota sativa |
| 豆，Climbing | 豆科 | Phaseolus vulgaris vulgaris |
| 豆，Sprouts | 豆科 | Phaseolus aureus |
| 豆，Brazilian Broad | 豆科 | Canavalia ensiformis |
| 豆，Broad | 豆科 | Vicia faba |
| 豆，Common,alsoFrench,White,Kidney | 豆科 | Phaseolus vulgaris |
| 豆，Egyptian | 豆科 | Dolichos lablab |
| 豆，Long,alsoYardlong | 豆科 | Vigna sesquipedalis |
| 俗名 | 科 | 拉丁名 |
| 豆，Winged | 豆科 | Psophocarpus tetragonolobus |
| 燕麦，also Common,Side,Tree | 燕麦属 | Sativa |
| 燕麦，Black,alsoBristle,Lopsided | 燕麦属 | Strigosa |
| 燕麦，Bristle | 燕麦属 | |
| 豌豆，also Garden,Green,Shelling | 豆科 | Pisum,sativum sarivum |
| 豌豆，Blackeyed | 豆科 | Vigna sinensis |
| 豌豆，Edible Podded | 豆科 | Pisum sativum axiphium |
| 豌豆，Grey | 豆科 | Pisum sativum speciosum |
| 豌豆，Winged | 豆科 | Tetragonolobus purpureus |
| 豌豆，Wrinkled | 豆科 | Pisum sativum medullare |
| 向日葵 | 菊科 | Helianthus annuus |
| 南瓜，Autumn,Winter | 双子叶植物纲 | Cucurbita maxima |
| 南瓜，Bush,alsoSummer | 双子叶植物纲 | Cucurbita pepo melopepo |
| 南瓜，Turban | 双子叶植物纲 | Cucurbita maximaturbaniformis |
| 黄瓜 | 双子叶植物纲 | Cucumis sativus |
| 黄瓜， African,also Bitter | Momordica charantia | |
| 黄瓜， Squirting,also Wild | Ecballium elaterium | |
| 黄瓜， Wild | Cucumis anguria | |
| 杨树，Califomia | 木本植物 | Populus trichocarpa |
| 杨树，European Black | Populus nigra | |
| 杨树，Gray | Populus canescens | |
| 杨树，Lombardy | Populus italica | |
| 杨树，Silverleaf,alsoWhite | Populus alba | |
| 杨树，WesternBalsam | Populus trichocarpa | |
| 烟草 | 茄科 | Nicotiana |
| 拟南芥 | 十字花科 | Arabidopsis thaliana |
| 草皮草 | 毒麦属 | |
| 草皮草 | 翦股颖属 |
| 俗名 | 科 | 拉丁名 |
| 草皮草的其他科 | ||
| 车轴草 | 豆科 |
变异体HPPD多肽在转基因植物中的表达赋予植物以抗除草剂，如硫康三酮等三酮类除草剂的高水平抗性，从而得以在培养转基因植物期间使用这些除草剂。
将外来基因导入植物中的方法是本领域已知的。这些方法的非限制性实例包括土壤杆菌感染、颗粒轰击、聚乙二醇(PEG)处理原生质体、原生质体电穿孔、微量注射、大量注射、分蘖注射、花粉管途径导入、干种子吸涨、激光穿孔及电泳(例如参见B.Jenes等人，和S.W.Ritchie等人，摘自转基因植物(Trnsgenic Plants),Vol.1,基因工程及其利用(Engineering and Utilization)，编者：S.-D.Kung,R Wu,Academic Press,Inc.,Harcourt Brace Jovanovich 1993；和L.Mannonen等人，生物技术的评价性综述(Critical Reviews inBiotechnology),14:287-310,1994)。
在一优选实施方案中，将编码变异体HPPD的DNA克隆到含有抗生素抗性标志基因的DNA载体中，并将含有重组HPPD DNA的质粒导入含有Ti质粒的根瘤土壤杆菌中。例如美国专利No.4,490,838中和An等人，植物分子生物学手册(Plant Mol.Biol.Manual)A3:1-19(1988)中描述了这种“双重载体系统”。然后将被转化的土壤杆菌与受体植物的叶盘共培养，以感染和转染植物细胞。然后在促进茎干形成的再生培养基中，首先于便于选择被转化的细胞的适当抗生素存在下，然后于除草剂存在下培养被转化的植物细胞。在用编码除草剂抗性HPPD的DNA成功地转化的植物细胞中，甚至在抑制未被转化的细胞再生之植物的茎干形成浓度的除草剂存在下，也可见茎干形成。例如用聚合酶链反应(PCR)分析证实变异体HPPD DNA的存在后，试验被转化的植物耐受除草剂喷雾的能力，和它们在除草剂存在下的种子发芽、根发生及增殖的能力。
可使用本发明的方法和组合物生产可掺入植物中的除草剂抗性HPPD变异体，以为植物提供选择性除草剂抗性。可将HPPD的中间变异体(例如，表现有亚最佳比活性和高除草剂抗性，或表现有最佳比活性和次高除草剂抗性的变异体)用作设计有足够比活性和高抗性的第二代HPPD变异体的模板。
可将除草剂抗性HPPD基因以单或多拷贝转化到作物中以提供除草剂抗性。
对具有降低的除草剂敏感性的作物物种进行遗传工程，可以：
(1)提高特别有效的和环境上无害的除草剂的除草谱及应用的灵活度；
(2)提高这些除草剂的商业价值；
(3)对除草剂抗性作物物种有效地使用除草剂以降低农田中的杂草压力并相应的增加收获产量；
(4)提高除草剂抗性植物的种子销售额；
(5)提高对因为以前播种时施用的除草剂的存留而造成的作物损害的抗性；
(6)减少对由于不良气候条件造成的除草剂特性改变的敏感性；
(7)提高对不均匀地或错施的除草剂的耐受性。
例如，可以栽培含有转基因HPPD变异蛋白质的植物。可以用控制杂草有效量的，HPPD变异体转基因植物对其有抗性的除草剂处理作物，从而在对栽培的作物没有有害影响的情况下控制农田中的杂草。
优选实施方案的描述
下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。实施例1：拟南芥属HPPD在大肠杆菌中的表达
完成下述实验以证明大肠杆菌中高水平酶促活性拟南芥属HPPD的产生。
A．克隆和细菌转化：
使用基于PCR的方法将HPPD编码序列克隆到pKK233-2表达载体(Clontech)中，从而使HPPD的ATG起始密码子是在有trc启动子的读框内。称为ATHPPD6F的引物(5′-GAAATCCATGGCACCAAAACG-3′)在HPPD起始密码子(黑体字)区域内杂交，并包括单个碱基改变(从A变为C，斜体字)以产生NcoⅠ位点(划下线部分)。引物ATHPPD6R(5′-CTTCTCCATGGTCATCCCACTAACTGT-3′)，其在HPPD终止密码子(黑体字)的区域内杂交，并包括编码区外的NcoⅠ位点(划下线部分)。
使用上述引物并以从上述cDNA文库中分离的HPPD序列作为模板完成PCR反应。反应混合物(100μl)含有下列成分：2ng质粒DNA、1XPCR缓冲液、各200mM三磷酸脱氧核苷酸、2.5单位Ampli Tag DNA聚合酶(Perldn Elmer)、13pmol引物ATHPPD6F、和11pmol引物ATHPPD6F。将反应混合物加热至95℃保持2分钟，然后使用30次循环进行扩增：95℃,1分钟；55℃,2分钟；72℃,1.5分钟。然后于72℃保温反应7分钟。
扩增1.3Kb PCR产物。在1.2％Nu Sieve GTG凝胶(FMC)上分辨并纯化(Gene Clean,Bio 101)该片段。用NcoⅠ消化经纯化的片段并连接到NcoⅠ消化的、碱性磷酸酶处理的pKK233-2载体(Clontech)中。将连接混合物转化到DH5α文库效率感受态细胞(GibcoBRL)中。当在含氨苄青霉素的LB中培养过夜时，根据红褐颜色的生成鉴定表达HPPD的转化体。
还使用空pKK233-2载体转化DH5α细胞制备了转化体，以在酶检测试验中用作对照。
B．在大肠杆菌中产生褐色色素和尿黑酸
观察生长在固体培养基上的用拟南芥属HPPD基因转化的大肠杆菌菌落和液体培养物和液体培养物产生的褐色色素。未被转化的大肠杆菌或用对照载体转化的大肠杆菌未见有相似的褐色色素形成。在培养基内添加酪氨酸可增加褐色色素(其表现在450nm处有特征性吸收)的形成(图2)。
已知当放置时或当碱化并与氧接触时，由于褐黄色素的形成而使尿黑酸本身变为褐色(La Du等人，摘自褐黄病(Ochronosis)，病理学中的色素，M.wolman(编辑)，Academic Press,NY,1969)。在某些细菌中，由于尿黑酸的天然分泌和氧化而形成相似的色素(Trias等人，加拿大微生物学杂志(Can.J.Microbiol.)35:1037,1989；Coodwin等人，加拿大微生物学杂志40:28,1995)。因此，褐色色素的出现提示用上述拟南芥属HPPD基因转化的大肠杆菌细胞产生了大量的尿黑酸。此外，由于酪氨酸被代谢成羟苯基丙酮酸(从而为HPPD提供另外的底物)，所以随酪氨酸存在量的增加而增加显色程度这一现象，即支持褐色色素是由于HPPD活性而产生的这一结论。
使用基于HPLC的方法直接检测尿黑酸，则进一步证实了这一结论。检测尿黑酸的HPLC条件与Denoya等人(细菌学杂志176:5312,1994)所述的条件完全相同。HPLC系统由Waters 510释放组件(WatersAssoc.,Milford,MA)、Waters996光电二极管阵列检测器、WISP710B自动加样器和Waters840数据积分系统组成。使用与装有C18树脂的不锈钢保护柱相连的Phenomenex Spherisorb 5ODS(1)C18反相柱(颗粒大小为5mm,250×4.6mm内径)。流动相(10mM乙酸∶甲醇；85∶15 V/V)的流速为1ml/分钟。波长定在292nm。与100ml冰醋酸混合以酸化培养液样品(1ml)并离心澄清之。将50ml混合物注入柱顶。将相当于尿黑酸的洗脱峰与尿黑酸标准品比较以鉴定并定量分析之。
由对照组大肠杆菌细胞的过夜培养物得到的培养基未见有痕量尿黑酸(图3A)。相反，HPPD转化的大肠杆菌则产生了高水平的尿黑酸(图3B)。在8分钟时洗脱与真正尿黑酸共迁移的峰值部分，并发现其具有与真正尿黑酸(插入框)相同的吸收谱。
C．HPPD活性的检测
于30℃用溶于50mM磷酸钾缓冲液(pH7.3)中的0.1mg/ml溶菌酶处理大肠杆菌转化体10分钟。超声(3次，每次5秒钟，使用Vibra Cell超声发生器，Sonics和Material,Inc.,Danbury,CT)并离心分离提取物。在已用50mM磷酸盐缓冲液(pH7.3)平衡的Econo-Pac 10DG柱(Bio-Rad,Richmond,CA)上使上清液脱盐。使用含有脱盐的HPPD的提取物进行HPPD活性检测。
根据从14C-羟苯基丙酮酸释放的14CO2的俘获量测定HPPD酶促活性(Schulz等人，FEBS Letts,318:162,1993；Secor，植物生理学(Plant Physiol.)106:1429,1994)。在20ml闪烁瓶中进行反应，每个小瓶盖以血清塞，借以悬浮含有50μl氢氧化苄乙氧铵(benzethonium hydroxide)的聚丙烯孔。每450μl反应混合物含有：50mM磷酸钾缓冲液(pH7.3),50μl新鲜制备的150mM还原态谷胱甘肽和3mM二氯靛酚的1∶1(V/V)混合物、2500单位过氧化氢酶，以及细菌提取物(HPPD的来源)。加入所指出的酶抑制剂。加入按Secor(1994，上述文献)所述方法制备的14C-羟苯基丙酮酸(50μl2mM溶液)以开始反应，反应于30℃进行30分钟。加入100μl4N硫酸终止反应并将混合物继续保温30分钟。在闪烁计数器中计数俘获到氢氧化苄乙氧铵中的放射活性。
结果表明，用拟南芥属HPPD基因转化的大肠杆菌细胞表达了很高水平的HPPD活性，即2.7μmol/mg蛋白质/小时。相反，在未被转化的或对照大肠杆菌细胞中则未能检测到HPPD活性。再者，发现HPPD活性是对硫康三酮的抑制作用有敏感性(图4)。可见大于1μM的硫康三酮几乎完全抑制HPPD活性。引起活性的50％抑制所需的硫康三酮浓度为100nM。实施例2：高流通量筛选试验化合物以鉴定HPPD抑制剂
使用下述方法，以高流通量方式鉴定HPPD抑制剂。
在加有100μg/ml氨苄青霉素的Luria培养液中37℃过夜培养用实施例1中所述拟南芥属HPPD基因转化的大肠杆菌。
将1升含有100μg/ml氨苄青霉素和1mM酪氨酸的熔化的LB琼脂冷却到50℃。然后加入0.1ml过夜大肠杆菌培养物，并将150ml混合物倒入各个9×9无菌Sumilon生物托盘(Vangard International,Nepture,NJ)中。
使平板固化并干燥30分钟。将试验化合物(多达25μl)加于试验平皿的样品孔(144孔/平皿，直径5cm,12个×12排)或加样点(6×96种化合物/平皿)。将平皿37℃保温过液。
监测(ⅰ)大肠杆菌的生长及(ⅱ)褐色色素强度，以记分评定各平皿。将其中细菌细胞是活的但色素减少的区带记为HPPD抑制剂阴性。
本文提到的所有专利、专利申请、文章、出版物及试验方法均列入本文作为参考。
本领域技术人员可以根据上面的详细说明对本发明作出许多改动和变化。这些显而易见的改动均将落入等批权利要求范围内。
Claims (25)
1．纯化的分离的编码植物HPPD的核酸。
2．如权利要求1中限定的核酸，其衍生于拟南芥。
3．如权利要求2中限定的核酸，其中所说的核酸选自SEQ ID N0:1，其序列保守变异体和其功能保守变异体。
4．包含可操作地连接到转录调节元件上的权利要求3的核酸序列的DNA载体。
5．包含如权利要求4中限定的DNA载体的细胞，其中所说的细胞选自细菌、真菌、植物、昆虫及哺乳动物细胞。
6．如权利要求5中限定的细胞，其中所说的细胞是细菌细胞。
7．如权利要求5中限定的细胞，其中所说的细胞是植物细胞。
8．包含权利要求7中限定的细胞的种子。
9．包括由权利要求2中限定的DNA编码的蛋白质的HPPD蛋白质。
10．鉴定除草剂/HPPD抑制剂的方法，该方法包括：
(a)提供表达植物HPPD的微生物细胞；
(b)于存在试验化合物的条件下培养细胞以形成试验培养物，并在没有试验化合物的条件下培养细胞以形成对照培养物；
(c)监测试验和对照培养物中尿黑酸或其氧化产物的水平；并且
(d)鉴定相对于对照培养物的试验培养物中，作为抑制HPPD的化合物的降低尿黑酸或其氧化产物水平的任何化合物。
11．如权利要求10中限定的方法，其中所说的微生物细胞是大肠杆菌。
12．如权利要求10中限定的方法，其中所说的监测包括测定所说的培养物在450nm处的吸光率。
13．如权利要求10中限定的方法，其中所说的监测包括检测褐色色素的形成。
14．鉴定除草剂抗性HPPD变异体的方法，该方法包括：
(a)提供表达植物HPPD的细胞群体；
(b)诱变所说的细胞群体；
(c)在抑制非诱变的细胞生长或色素产生的条件下，使所说的诱变的细胞群体与除草剂接触；
(d)根据细胞生长和/或色素产生情况回收对所说除草剂的抑制作用有抗性的细胞；并且
(e)检测所回收的细胞中的编码HPPD的核酸序列以鉴定除草剂抗性HPPD变异体。
15．变异体HPPD蛋白质，其中所说的蛋白质是除草剂抗性的。
16．如权利要求15中限定的变异体HPPD蛋白质，其中当所说的变异体HPPD蛋白质在为维持生存力而需要HPPD活性的细胞中表达时，则表现有：
(ⅰ)单独即足以维持表达它的细胞的存活力的催化活性；或与也在该细胞中表达的任何除草剂抗性HPPD变异蛋白质结合的催化活性，其可以是与第一种HPPD变异体蛋白质相同或不同的，并足以维持表达该蛋白质之细胞的存活性；以及
(ⅱ)比野生型HPPD有更大除草剂抗性的催化活性。
17．如权利要求15中限定的变异体HPPD蛋白质，其中所说的蛋白质得自于拟南芥。
18．编码如权利要求15中限定的变异体HPPD蛋白质的核酸。
19．包括如权利要求18中限定的核酸的DNA载体。
20．包含如权利要求19中限定的DNA载体的细胞，其中所说的细胞选自细菌、真菌、植物、昆虫和哺乳动物细胞。
21．如权利要求20中限定的细胞，其中所说的细胞是细菌细胞。
22．如权利要求20中限定的细胞，其中所说的细胞是植物细胞。
23．包含如权利要求22中限定的细胞的种子。
24．为植物提供除草剂抗性的方法，所说的方法包括在适于在所说的植物中表达所说的核酸条件下，将编码如权利要求16中限定的除草剂抗性HPPD变异体的核酸导入所说的植物中。
25．控制杂草的方法，其包括在控制杂草有效量的所说的除草剂存在下，培养含有除草剂抗性HPPD基因的作物。
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