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CN116555284B - GmBBX4基因在调控大豆异黄酮合成中的应用 - Google Patents

GmBBX4基因在调控大豆异黄酮合成中的应用 Download PDF

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CN116555284B
CN116555284B CN202310447471.6A CN202310447471A CN116555284B CN 116555284 B CN116555284 B CN 116555284B CN 202310447471 A CN202310447471 A CN 202310447471A CN 116555284 B CN116555284 B CN 116555284B
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soybean
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gene
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Nanjing Agricultural University
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Abstract

本发明公开了GmBBX4基因在调控大豆异黄酮合成中的应用。其中GmBBX4基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；GmBBX4基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。本发明通过对GmBBX4基因利用CRISPR‑Cas9基因编辑技术创制突变体和创制过量表达转基因大豆株系，发现GmBBX4基因编辑突变体大豆中的次生代谢产物含量显著提高，例如染料木苷、黄豆黄苷、丙二酰基染料木苷、丙二酰基黄豆黄苷和丙二酰基大豆苷进而提升大豆的品质。因此，在植物中进行GmBBX4基因的功能缺失是改进植物品质的有效方式，具有重要的生产和理论研究意义。

Description

GmBBX4基因在调控大豆异黄酮合成中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及GmBBX4基因在调控大豆异黄酮合成中的应用。
背景技术
大豆是我国重要的经济作物之一，富含丰富的蛋白质、油脂以及多种具有生物活性的物质，其中大豆异黄酮是主要存在于豆科植物中的一类黄酮物质，且在大豆种子中含量较为丰富。大豆异黄酮对于植物自身具有提高抵御非生物胁迫和生物胁迫的能力等，对于人体健康具有预防骨质疏松和心脑血管疾病等功效。在大豆中，异黄酮主要分为3类，即染料木苷类（Daidzingroups）、黄豆黄素苷类（Glycitingroups）和大豆苷类（Genistingroups）。均以游离型、葡萄糖苷型、乙酰基葡萄糖苷型、丙二酰基葡萄糖苷型4种主要形式存在。
大豆异黄酮来源于植物中广泛存在的苯丙烷代谢途径，其合成过程受到多种因素的影响，包括环境和其合成途径中多种催化酶的活性。田间环境的不确定性使得研究大豆自身影响异黄酮积累的过程也十分重要。大豆异黄酮在大豆的各组织中均有不同程度的积累，其中成熟籽粒中积累量最为丰富。因此，研究影响大豆籽粒成熟过程中异黄酮积累的过程至关重要。
苯丙烷代谢途径中的多种催化酶的表达受到转录因子的调控。目前，也陆续鉴定出一些MYB家族转录因子促进大豆异黄酮积累。但相关研究仍较为匮乏。B-box家族蛋白是一类具有一个或者两个B-box结构域，广泛存在于高等植物中的一类转录因子家族。无论在模式植物拟南芥中，或是在园艺作物苹果、梨和番茄中，大量的研究表明：BBX蛋白通常通过影响HY5的转录激活活性或能够直接调控多种黄酮合成基因的表达，从而调控黄酮类物质在植物体内的积累。
迄今为止，大豆GmBBX4基因的研究还未见报道。因此，对GmBBX4基因进行克隆和功能研究具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供大豆GmBBX4基因在调控植物异黄酮合成中的应用。
为了实现本发明目的，可以通过以下技术方案实现。
第一方面，本发明保护如下任一种物质在调控植物异黄酮合成中的应用：
（1）大豆B-box类转录因子GmBBX4基因；
（2）大豆B-box类转录因子GmBBX4；
（3）含有大豆B-box类转录因子GmBBX4基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；
所述转录因子GmBBX4的氨基酸序列为如下（A1）或（A2）：
（A1）由序列表中SEQ ID NO .2所述的氨基酸序列组成的蛋白质；
（A2）将序列表中SEQ ID NO .2所述的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的由（1）衍生的蛋白质。
第二方面，本发明保护如下任一种物质在制备调控植物异黄酮合成的产品中的应用：
（1）大豆B-box类转录因子GmBBX4基因；
（2）大豆B-box类转录因子GmBBX4；
（3）含有大豆B-box类转录因子GmBBX4基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；
所述转录因子GmBBX4的氨基酸序列为如下（A1）或（A2）：
（A1）由序列表中SEQ ID NO .2所述的氨基酸序列组成的蛋白质；
（A2）将序列表中SEQ ID NO .2所述的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的由（1）衍生的蛋白质。
第三方面，本发明保护如下任一种物质在培育高/低异黄酮植物中的应用：
（1）大豆B-box类转录因子GmBBX4基因；
（2）大豆B-box类转录因子GmBBX4；
（3）含有大豆B-box类转录因子GmBBX4基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；
所述转录因子GmBBX4的氨基酸序列为如下（A1）或（A2）：
（A1）由序列表中SEQ ID NO .2所述的氨基酸序列组成的蛋白质；
（A2）将序列表中SEQ ID NO .2所述的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的由（1）衍生的蛋白质。
第四方面，本发明保护如下任一种物质在制备培育高/低异黄酮植物的产品中的应用：
（1）大豆B-box类转录因子GmBBX4基因；
（2）大豆B-box类转录因子GmBBX4；
（3）含有大豆B-box类转录因子GmBBX4基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；
所述转录因子GmBBX4的氨基酸序列为如下（A1）或（A2）：
（A1）由序列表中SEQ ID NO .2所述的氨基酸序列组成的蛋白质；
（A2）将序列表中SEQ ID NO .2所述的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由（1）衍生的蛋白质。
第五方面，本发明保护如下任一种物质在植物育种中的应用：
（1）大豆B-box类转录因子GmBBX4基因；
（2）大豆B-box类转录因子GmBBX4；
（3）含有大豆B-box类转录因子GmBBX4基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；
所述转录因子GmBBX4的氨基酸序列为如下（A1）或（A2）：
（A1）由序列表中SEQ ID NO .2所述的氨基酸序列组成的蛋白质；
（A2）将序列表中SEQ ID NO .2所述的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的由（1）衍生的蛋白质。
利用CRISPR-Cas9系统对所述GmBBX4的编码基因进行编辑。发现GmBBX4突变后，籽粒中大豆异黄酮的含量显著增高。与之相反，过量表达GmBBX4后，籽粒中大豆异黄酮含量明显降低。
在具体的实施方案中，所述大豆B-box类转录因子GmBBX4基因具有序列表中SEQID NO .1所述的核苷酸序列。
在具体的实施方案中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
优选的，所述双子叶植物为豆科植物。
在具体的实施方案中，所述异黄酮选自染料木苷、黄豆黄苷、丙二酰基染料木苷、丙二酰基黄豆黄苷和丙二酰基大豆苷中的一种或多种。
第六方面，本发明保护一种提高大豆异黄酮含量的方法：
所述方法包括降低前文所述的转录因子GmBBX4的含量和/活性；
优选的，所述降低前文所述的转录因子GmBBX4的含量和/活性利用CRISPR-Cas9系统对所述GmBBX4的编码基因进行编辑来实现。
上述CRISPR-Cas9系统中靶向GmBBX4编码基因的gRNA的核苷酸序列为：GmBBX4-gRNA1: GAGTGTACGGACTCGAAGAACGG和GmBBX4-gRNA2: GCTGACGTCAGCATCGGCGTCGG。
第七方面，本发明保护一种抑制大豆异黄酮含量的方法：
所述方法包括提高前文所述的转录因子GmBBX4的含量和/活性；
所述提高前文所述的转录因子GmBBX4的含量和/活性通过提高所述的转录因子GmBBX4基因的表达量来实现。
在具体的实施方案中，所述提高所述的转录因子GmBBX4基因的表达量通过将过量表达GmBBX4的重组植物表达载体转入植物中来实现。
通过转基因技术将过量表达GmBBX4的重组植物表达载体转入大豆栽培品种Williams 82（以下简称为：Wm82）中，在大豆中提高GmBBX4的表达量。发现GmBBX4过量表达后，籽粒中大豆异黄酮的含量显著降低。
重组植物表达载体具体通过如下方法构建获得：将GmBBX4基因片段通过同源重组的方法构建至JRH0641载体从而获得重组植物表达载体。
本发明的显著优点在于：
本发明首次提供B-box家族基因GmBBX4基因所编码的蛋白在调控大豆异黄酮积累中的应用。因此，通过本发明可以获得高大豆异黄酮和低大豆异黄酮的植物品系，具有重要的应用价值。
附图说明
图1为本发明大豆gmbbx4突变体基因编辑形式（1A）和YFP-GmBBX4转基因株系的过表达表达量检测示意图（1B、1C）。
图2为本发明大豆GmBBX4突变后和过量表达后总异黄酮含量测定结果。
图3为本发明大豆GmBBX4突变后和过量表达后染料木苷含量测定结果。
图4为本发明大豆GmBBX4突变后和过量表达后黄豆黄苷含量测定结果。
图5为本发明大豆GmBBX4突变后和过量表达后丙二酰基染料木苷含量测定结果。
图6为本发明大豆GmBBX4突变后和过量表达后丙二酰基化黄豆黄苷含量测定结果。
图7为本发明大豆GmBBX4突变后和过量表达后丙二酰基化大豆苷含量测定结果。
实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购得。以下实施例中载体测序的确定，均由常规测序公司测序确定。
大豆(Glycine max)品种Wm 82由国家大豆改良中心（National Center forSoybean Improvement）提供。
本发明中所用基因编辑载体为JRH0912，过量表达载体为JRH0641，均由国家大豆改良中心（National Center for Soybean Improvement）提供。
实施例1 大豆GmBBX4基因突变体植物表达载体的构建。
本发明提供了用于构建表达载体所用的引物，其包括用于扩增包含guide RNA序列的引物：
GmBBX4-1+sgRNA-F：AATGTGCCACCACATGGATTGAGTGTACGGACTCGAAGAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA
GmBBX4-2+sgRNA-F：AATGTGCCACCACATGGATTGGACGGGGATGCGCTCGTGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA
(gRNA+sgRNA)-R: GCTCGGCAACGCGTTCTAGAAAAAAAAGCACCGACTCGGT
用于扩增U6片段的序列的引物
U6-Xbal-F: GGAAGCTTAGGCCTTCTAGAAAAATAAATGGTAAAATGTC
U6-R: CAATCCATGTGGTGGCACAT
用于双靶点连接所需接头引物
Dual-U6-F1:GCCTTCTAGAGAGACCAAAATAAATGGTAAAATGTCAA
Dual-U6-R1:TCTCGAATTCGAGACCAAAAAAAGCACCGACTCGGTGC
Dual-U6-F2:GGTCTCGAATTCGAGACCAAAATAAATGGTAAAATGTC
Dual-U6-R2:TTGTAGATCTGAGACCAAAAAAAGCACCGACTCGGTGC
重组质粒GmBBX4-gRNA的构建
KOD Plus为TOYOBO公司的产品。
1.gRNA片段的获得
(1)制备反应体系1。反应体系1为50 μL，由1 μL KOD Plus、5 μL 10×PCRBuffer、5 μL dNTP、25 mM MgSO4、1.5 μL引物GmBBX4-1+sgRNA-F水溶液(浓度为10 μM)、1.5 μL引物(gRNA+sgRNA)-R水溶液(浓度为10 μM)、1 μL载体JRH0951和34 μL ddH2O组成。
载体JRH0951记载于如下文献中：Sun X, Hu Z, Chen R, Jiang Q, Song G,Zhang H, Xi Y. (2015). Targeted 845 mutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9 system. Sci. Rep. 5(1), 1-10.
(2)完成步骤(1)后，取所述反应体系1，进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶回收试剂盒（庄盟国际生物基因科技有限公司) 回收gRNA片段。
反应程序为：94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，57 ℃ 30 s，68 ℃ 10 s，35个循环；12℃保存。
2.U6启动子片段的获得
(1)制备反应体系2。反应体系2为 50μL，由1 μL KOD Plus、5 μL 10×PCRBuffer、5 μL dNTP、25 mM MgSO4、1.5 μL引物U6-Xbal-F水溶液(浓度为10 μM)、1.5 μL引物U6-R水溶液(浓度为10 μM) 1 μL载体JRH0951和34 μL ddH2O组成。
(2)完成步骤(1)后，取所述反应体系2，进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶回收试剂盒（庄盟国际生物基因科技有限公司)回收的U6启动子片段。
反应程序为：94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，57 ℃ 30 s，68 ℃ 10 s，35个循环；12℃保存。
3.U6-gRNA片段的获得
(1)制备反应体系3。反应体系3为50 μL，由1 μL KOD Plus、5 μL 10×PCRBuffer、5 μL dNTP、25 mM MgSO4、1.5 μL引物U6-Xbal-F水溶液(浓度为10 μM)、1.5 μL引物(gRNA+sgRNA)-R水溶液(浓度为10 μM) 0.5 μL gRNA片段、0.5 μL U6片段和34 μLddH2O组成。。
(2)完成步骤(1)后，取所述反应体系3，进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶回收试剂盒（庄盟国际生物基因科技有限公司) 回收的U6-gRNA片段。
反应程序为：94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，57 ℃ 30 s，68 ℃ 10 s，35个循环；12℃保存。
4.制备U6-gRNA1和U6-gRNA2片段，
(1).制备反应体系4和5。
反应体系4为50 μL，由1 μL KOD Plus、5 μL 10×PCR Buffer、5 μL dNTP、25 mMMgSO4、1.5 μL引物Dual-U6-F1水溶液(浓度为10 μM),1.5 μL Dual-U6-R1引物水溶液(浓度为10 μM) 1 μL U6-gRNA1片段和34 μL ddH2O组成。
反应体系5为50 μL，由1 μL KOD Plus、5 μL 10×PCR Buffer、5 μL dNTP、25 mMMgSO4、1.5 μL Dual-U6-F2引物水溶液(浓度为10 μM),1.5 μL Dual-U6-R2引物水溶液(浓度为10 μM) 1 μL U6-gRNA2片段和34 μL ddH2O组成。
(2)完成步骤(1)后，取所述反应体系4和5，进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶回收试剂盒（庄盟国际生物基因科技有限公司)回收的Dual-U6-gRNA1和Dual-U6-gRNA2片段。
反应程序为：94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，57 ℃ 30 s，68 ℃ 15 s，35个循环；12℃保存
5.用限制性内切酶XbaⅠ和BglⅡ双酶切载体JRH0912，回收约14000bp的载体骨架。
载体JRH0912记载于如下文献中：Meng，Y .，Y .Hou，H .Wang，R .Ji，B .Liu，J.Wen，L .Niu and H .Lin(2017) .Targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 system inthe model legume Medicago truncatula .Plant Cell Rep 36(2) :371-374 .在文献中的名称为 pFGC5941-Cas9。载体JRH0912中含有Cas9蛋白。
6.连接产物的获得
(1)将1 μL Dual-U6-gRNA1、1 μL Dual-U6-gRNA2片段(约100 ng)、0.5 μL步骤5回收的载体骨架(50 ng)和 2.5 μL 2 × ClonExpress Mix（Vazyme，C115）混合，得到连接体系。
(2)取所述连接体系，50 ℃反应45min，得到连接产物。
7.将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(吐露港)，得到若干单克隆。
8.分别以各个单克隆为模板，以引物912-F: 5’-acatttaatacgcgatagaaaac-3’和912-R: 5’-cgtgctccaccatgttgacggatc-3’组成的引物对进行PCR扩增。含有目的片段大小1000bp的克隆，送菌液测序，得到阳性克隆。
9.将阳性单克隆接种至LB液体培养基，培养，得到菌液；然后从菌液中提取质粒，即重组质粒GmBBX4-gRNA。
根据测序结果，对重组质粒GmBBX4-gRNA结构描述如下：将载体JRH0912的限制性内切酶XbaⅠ和BglⅡ的识别序列间的DNA小片段替换为SEQ ID No. 3所示的DNA分子，得到重组质粒。
实施例2 大豆GmBBX4过表达载体的构建
提取大豆Wm 82幼苗嫩叶片的总RNA,利用反转录试剂盒合成cDNA。
本发明提供了用于构建过表达载体所用的引物，其包括用于扩增目的片段的引物及融合标签的引物
JRH0641-EYFP-F: GGAGAGCCACCATGCTCGAGATGGGCAAGGGCGAGGAG
JRH0641-EYFP-GmBBX4-R：GTCGCAGAGCTTGGAAGCCATGAAGCCTGCTTTTTTGTACAAAC
JRH0641-GmBBX4-F：GTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGCTTCCAAGCTCTGCGAC
JRH0641-GmBBX4-R：CTGGGGGAGGACCACTAGTACACGACGGAACGACGCCGTA
1.融合标签YFP片段的获得
(1)制备反应体系1。反应体系1为50 μL，由1 μL KOD Plus、5 μL 10×PCRBuffer、5 μL dNTP、25 mM MgSO4、1.5 μL引物JRH0641-EYFP-F水溶液(浓度为10μM)、1.5 μL引物JRH0641-EYFP-GmBBX4-R水溶液(浓度为10 μM)、1 μL载体pEargateway 104和34 μLddH2O组成
载体pEargateway 104记载于如下文献中：Katzen F (2007) Gatewayrecombinational cloning: a biological operating system.Expert Opin DrugDiscov 4:571–589.
(2)完成步骤(1)后，取所述反应体系1，进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶回收试剂盒（庄盟国际生物基因科技有限公司)回收gRNA片段。
反应程序为：94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，57 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，35个循环；12℃保存
2.GmBBX4 CDS片段的获得
(1)制备反应体系2。反应体系2为50 μL，由1 μL KOD Plus、5 μL 10×PCRBuffer、5 μL dNTP、25 mM MgSO4、1.5 μL引物JRH0641-GmBBX4-F水溶液(浓度为10μM)、1.5μL引物JRH0641-GmBBX4-R水溶液(浓度为10 μM)、1 μL 大豆cDNA和34 μL ddH2O组成
(2)完成步骤(1)后，取所述反应体系1，进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶回收试剂盒（庄盟国际生物基因科技有限公司)回收gRNA片段。
反应程序为：94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，57 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，35个循环；12℃保存
3.用限制性内切酶XhoⅠ和SpeⅠ双酶切载体JRH0641，回收线性化载体。
载体JRH0641记载于如下文献中：Lyu, X., Cheng, Q., Qin, C., Li, Y., Xu,X., Ji, R., Mu, R., Li, H., Zhao, T., Liu, J., Zhou, Y., Li, H., Yang, G.,Chen, Q., and Liu, B. (2020). GmCRY1s Modulate Gibberellin Metabolism toRegulate Soybean Shade Avoidance in Response to Reduced Blue Light. Mol.Plant.
3.连接产物的获得
(1)将1 μLYFP片段、1 μLGmBBX4片段、0.5 μL步骤3回收的载体骨架(50 ng)和2.5 μL 2 × ClonExpress Mix（Vazyme,C115）混合，得到连接体系。
(2)取所述连接体系，50 ℃反应30min，得到连接产物。
4.将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(吐露港)，得到若干单克隆。
分别以各个单克隆为模板，进行菌液PCR扩增检测。含有YFP-GmBBX4目的片段大小1740bp的克隆，送菌液测序，得到阳性克隆。
5.将阳性单克隆接种至LB液体培养基，培养，得到菌液；然后从菌液中提取质粒，即重组质粒YFP-GmBBX4。
根据测序结果，对重组质粒YFP-GmBBX4结构描述如下：将载体JRH0641的限制性内切酶XhoⅠ和SpeⅠ的识别序列间的DNA小片段替换为编码SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列，得到重组质粒。
实施例3 转基因大豆植株的获得
1.将构建好重组质粒转化农杆菌EHA105后，进行大豆转化。
2.将重组质粒转化大豆品种Wm 82以下简称大豆，经过筛选、分化和生根后，获得T0代拟转基因大豆植株。具体步骤依次如下：
(1)用15 mL浓盐酸和100 mL次氯酸钠反应出的氯气对大豆进行灭菌2.5 h-3 h。拿出，在超净台中吹干氯气。
(2)种子催芽：将大豆均匀播种在萌发培养基内，每皿20-30粒左右。
(3)农杆菌侵染：将大豆对半切开，去掉一部分胚尖，在分生区部分划伤口，即为侵染对象：大豆外植体，置于OD600 nm为0.6左右的重组农杆菌菌液，室温振荡30 min；取出外植体在无菌条件下吹10 min，然后平铺于共培养培养基，暗培养5天。
(4)用无菌水和加入激素的液体诱导培养基各洗4-5次，确保将农杆菌洗净。将伸长的胚芽切掉，只保留3-4 mm，胚芽朝下斜插于固体芽诱导培养基中，置于16h light/8hdark，25 ℃培养室中培养2周。
(5)15天后有的外植体开始出芽，有芽的从桩部将芽切掉并转到新的固体芽诱导培养基中，没长芽的扔掉，继续在温室中光照培养。
(6)15天后，将长芽的继代到新的固体芽诱导培养基中，没有长芽的豆瓣扔掉，温室培养15天。外植体在固体芽诱导培养基中共培养30天。
(7)将长好的愈伤组织与豆瓣分离，扔掉外植体，把愈伤组织上黑色表面刮掉，转到固体芽伸长培养基中，每15天更换一次新的固体伸长培养基，一般继代4-5次，合计60-80天。愈伤在伸长培养的同时也在筛选，在筛选的过程中会有苗长出来。
(8)当苗长到约4-5 cm的时候从愈伤上切下来，移到生根培养基中。
(9)在生根培养基中培养20-30天左右，长得壮实有发达根系的苗子就可以开始将苗移入一次性杯中的纯蛭石环境下放在弱光炼苗，利用另一个一次性塑料杯罩于幼苗上，以达到保湿的目的，一般炼苗5天。
(10)待适应数天后，观察到明显生长的根时去掉保湿所用的一次性杯子。将其移入含有营养土的大盆中，继续培养。
实施例4 转基因大豆阳性植株的获得和突变类型的分子鉴定
为了确定转基因阳性植株，取T0代鲜嫩叶片，进行DNA提取，进行PCR检测。
对于CRISPR敲除载体，我们检测其basta抗性基因和Cas9蛋白。并根据其gRNA所在位置进行PCR扩增，进行测序。
对于过表达GmBBX4转基因株系，我们检测其basta抗性基因，并根据重组载体，设计特异引物，检测T0代植物中T-DNA的插入。对阳性植株自交两代后鉴定其纯合，并同时检测GmBBX4的转录水平和蛋白水平表达。
经Sanger测序后，获得gmbbx4植株，其不含有Cas9蛋白。其编辑形式如图1A所示。
经对转基因株系的转录和蛋白水平鉴定，获得YFP-GmBBX4 #1和YFP-GmBBX4 #3植株, 如图1B、1C所示。
实施例5.突变体大豆和转基因大豆异黄酮含量测定
实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：
待温室中的待测大豆（Wm82、gmbbx4-1和gmbbx4-2）成熟后，收获种子，置于37℃烘箱中，烘干至恒重。随机选取50粒种子，每5粒为一个重复，测定异黄酮含量。
提取异黄酮的步骤如下： (1)称取0.02 g大豆粉置于2 mL 离心管中。 (2)加入80%色谱级甲醇溶液1.0 mL（料液比为 1：50)，涡旋 30s，放置漂浮板上，50 ℃超声(频率40kHz, 功率 300 W)辅助提取1 h，期间每隔十分钟取出上下颠倒混匀。 (3)12000 rpm 4 ℃离心10 min。 (4)取上清液过 0.22 μm 有机相针式滤器，注入 Agilent 自动进样专用小瓶(2 mL)， -20 ℃保存待上机检测。
异黄酮含量用超高效液相色谱(UPLC)法测定: DIONEX Ultimate 3000，柱温 40℃，DAD 检测器，检测波长 254 nm，色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 µm, 2.1 mm*100mm column)。进样量：2 μL，流动相：A：0.5%乙酸(分析 纯)，B：100%乙腈(Merck)。流动相流速：0.4 mL/min，梯度洗脱为：0–16 min 15% -26% B (v/ v), 16–16.1 min 26%–15% B,16.1–18 min 15% B。
大豆Wm 82种子，gmbbx4突变体种子和YFP-GmBBX4转基因大豆种子中的总异黄酮含量如图2所示。gmbbx4中总异黄酮含量是野生型含量的1.32倍。YFP-GmBBX4转基因大豆种子中总异黄酮含量分别为野生型的含量的0.78倍和0.81倍。
大豆Wm 82种子，gmbbx4突变体种子和YFP-GmBBX4转基因大豆种子中的染料木苷含量如图3所示。gmbbx4中染料木苷含量是野生型含量的2.01倍。YFP-GmBBX4转基因大豆种子中染料木苷含量分别为野生型的含量的0.63倍和0.85倍。
大豆Wm 82种子，gmbbx4突变体种子和YFP-GmBBX4转基因大豆种子中的黄豆黄苷含量如图4所示。gmbbx4中黄豆黄苷含量是野生型含量的1.27倍。YFP-GmBBX4转基因大豆种子中黄豆黄苷含量分别为野生型的含量的0.96倍和0.86倍。
大豆Wm 82种子，gmbbx4突变体种子和YFP-GmBBX4转基因大豆种子中的丙二酰基染料木苷含量如图5所示。gmbbx4中丙二酰基染料木苷含量是野生型含量的1.72倍。YFP- GmBBX4转基因大豆种子中丙二酰基染料木苷含量分别为野生型的含量的0.61倍和0.86倍。
大豆Wm 82种子，gmbbx4突变体种子和YFP-GmBBX4转基因大豆种子中的丙二酰基黄豆黄苷含量如图6所示。gmbbx4中丙二酰基黄豆黄苷含量是野生型含量的1.22倍。YFP- GmBBX4转基因大豆种子中丙二酰基黄豆黄苷含量分别为野生型的含量的0.83倍和0.86倍。
大豆Wm 82种子，gmbbx4突变体种子和YFP-GmBBX4转基因大豆种子中的丙二酰基大豆苷含量如图7所示。gmbbx4中丙二酰基大豆苷含量是野生型含量的1.41倍。YFP-GmBBX4转基因大豆种子中丙二酰基大豆苷含量分别为野生型的含量的0.83倍和0.84倍。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。

Claims (11)

1.如下任一种物质在调控大豆异黄酮合成中的应用：
（1）大豆B-box类转录因子GmBBX4基因；
（2）大豆B-box类转录因子GmBBX4；
（3）含有大豆B-box类转录因子GmBBX4基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；
所述转录因子GmBBX4的氨基酸序列为由序列表中SEQ ID NO .2所述的氨基酸序列；
所述大豆B-box类转录因子GmBBX4基因为序列表中SEQ ID NO .1所述的核苷酸序列。
2.如下任一种物质在制备调控大豆异黄酮合成的产品中的应用：
（1）大豆B-box类转录因子GmBBX4基因；
（2）大豆B-box类转录因子GmBBX4；
（3）含有大豆B-box类转录因子GmBBX4基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；
所述转录因子GmBBX4的氨基酸序列为由序列表中SEQ ID NO .2所述的氨基酸序列；
所述大豆B-box类转录因子GmBBX4基因为序列表中SEQ ID NO .1所述的核苷酸序列。
3.如下任一种物质在培育高/低异黄酮大豆中的应用：
（1）大豆B-box类转录因子GmBBX4基因；
（2）大豆B-box类转录因子GmBBX4；
（3）含有大豆B-box类转录因子GmBBX4基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；
所述转录因子GmBBX4的氨基酸序列为由序列表中SEQ ID NO .2所述的氨基酸序列；
所述大豆B-box类转录因子GmBBX4基因为序列表中SEQ ID NO .1所述的核苷酸序列。
4.如下任一种物质在制备培育高/低异黄酮大豆的产品中的应用：
（1）大豆B-box类转录因子GmBBX4基因；
（2）大豆B-box类转录因子GmBBX4；
（3）含有大豆B-box类转录因子GmBBX4基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；
所述转录因子GmBBX4的氨基酸序列为由序列表中SEQ ID NO .2所述的氨基酸序列；
所述大豆B-box类转录因子GmBBX4基因为序列表中SEQ ID NO .1所述的核苷酸序列。
5.如下任一种物质在大豆育种中的应用：
（1）大豆B-box类转录因子GmBBX4基因；
（2）大豆B-box类转录因子GmBBX4；
（3）含有大豆B-box类转录因子GmBBX4基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；
所述转录因子GmBBX4的氨基酸序列为由序列表中SEQ ID NO .2所述的氨基酸序列；
所述大豆B-box类转录因子GmBBX4基因为序列表中SEQ ID NO .1所述的核苷酸序列；
所述大豆育种的目的为获得高/低异黄酮大豆。
6.根据权利要求1-5任一所述的应用，其特征在于，所述异黄酮选自染料木苷、黄豆黄苷和丙二酰基大豆苷中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述染料木苷为丙二酰基染料木苷，所述黄豆黄苷为丙二酰基黄豆黄苷。
8.一种调控大豆异黄酮合成的方法，其特征在于，选自如下（B1）或（B2）
（B1）提高大豆异黄酮含量的方法：
所述方法包括降低权利要求1所述的转录因子GmBBX4的含量和/活性；
所述降低权利要求1所述的转录因子GmBBX4的含量和/活性利用CRISPR-Cas9系统对所述GmBBX4的编码基因进行编辑来实现；
（B2）抑制大豆异黄酮含量的方法：
所述方法包括提高权利要求1所述的转录因子GmBBX4的含量和/活性；
所述提高权利要求1所述的转录因子GmBBX4的含量和/活性通过提高所述的转录因子GmBBX4基因的表达量来实现。
9.根据权利要求8所述的调控大豆异黄酮合成的方法，其特征在于，所述CRISPR-Cas9系统中靶向GmBBX4基因的gRNA的核苷酸序列为：
GmBBX4-gRNA1: GAGTGTACGGACTCGAAGAACGG；
GmBBX4-gRNA2: GCTGACGTCAGCATCGGCGTCGG。
10.根据权利要求8所述的调控大豆异黄酮合成的方法，其特征在于，所述提高所述的转录因子GmBBX4基因的表达量通过将过量表达GmBBX4的重组植物表达载体转入植物中来实现。
11.根据权利要求10所述的调控大豆异黄酮合成的方法，其特征在于，所述重组植物表达载体具体通过如下方法构建获得：将GmBBX4基因片段通过同源重组的方法构建至JRH0641载体从而获得重组植物表达载体。
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