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CN105247058A - 具有增加的除草剂耐受性的植物 - Google Patents

具有增加的除草剂耐受性的植物 Download PDF

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CN105247058A CN201480024734.1A CN201480024734A CN105247058A CN 105247058 A CN105247058 A CN 105247058A CN 201480024734 A CN201480024734 A CN 201480024734A CN 105247058 A CN105247058 A CN 105247058A
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Abstract

本发明涉及一种在植物栽培地点控制不想要的植物的方法，所述方法包括步骤：在所述地点提供包含至少一种核酸的植物，所述核酸包含了编码抵抗或耐受HPPD抑制性除草剂的野生型羟苯基丙酮酸双加氧酶或突变羟苯基丙酮酸双加氧酶(mut-HPPD)的核苷酸序列和/或编码抵抗或耐受HPPD抑制性除草剂的野生型尿黑酸茄呢基转移酶或突变尿黑酸茄呢基转移酶(mut-HST)的核苷酸序列，向所述地点施加有效量的所述除草剂。本发明还涉及包含mut-HPPD的植物和获得这类植物的方法。

Description

具有增加的除草剂耐受性的植物
本申请要求在2013年4月30提交的US临时申请US61/817370的优先权，所述文献通过引用的方式完整并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及用于赋予植物农用水平的除草剂耐受性的方法。特别地，本发明涉及具有增加的针对抑制HPPD除草剂、优选地吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的耐受性的植物。更具体地，本发明涉及诱变及杂交育种以及转化方法和通过诱变及杂交育种以及转化所获得的植物，所述植物具有增加的针对抑制HPPD除草剂、优选地吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的耐受性的植物。
背景技术
自二十世纪九十年代早期以来，抑制4-羟苯基丙酮酸双加氧酶(4-HPPD；EC1.13.11.27)(异戊二烯基醌-质体醌和生育酚生物合成中的关键酶)的除草剂已经用于选择性控制杂草。它们阻断该生物合成途径中4-羟苯基丙酮酸转化成尿黑酸(Matringe等人,2005,PestManagSci.,vol61:269–276；Mitchell等人,2001,PestManagSci.vol57:120–128)。认为质体醌是类胡萝卜素生物合成中八氢番茄红素去饱和酶的必需辅因子(Boeger和Sandmann,1998,PesticOutlook,vol9:29–35)。对其抑制导致植物质体醌和维生素E池耗尽，导致漂白症状。类胡萝卜素的丢失、尤其它们作为抗光氧化作用的光系统保护物的功能丧失，导致正在生长的苗组织中叶绿素及光合膜的氧化降解。因此，叶绿体合成和功能遭破坏(Boeger和Sandmann，1998)。尿黑酸茄呢基转移酶(HST)催化质体醌生物合成途径中HPPD之后的步骤。HST是一种异戊烯基转移酶，所述酶既使尿黑酸脱羧，还向它转移来自茄呢基二磷酸酯的茄呢基并因此形成2-甲基-6-茄呢基-1,4-苯醌(MSBQ)(经该生物合成途径变成质体醌的中间体)。HST酶是膜结合型的并且编码它们的基因包含质体靶向序列。
抑制4-HPPD的商用除草剂的最重要化学类别包括吡唑酮类、三酮类和异噁唑类。通过形成稳定的铁–偶极电荷转移复合体，这些抑制剂模拟底物4-羟苯基丙酮酸与活性部位中酶结合的亚铁离子结合。在抑制4-HPPD的除草剂当中，三酮磺草酮(sulcotrione)是这个除草剂类别中农业使用及鉴定其作用机理的首个例子(Schulz等人,1993,FEBSLett.Vol318:162–166)。已经报道这些三酮是纤精酮(来自瓶刷(bottlebrush)植物红千层属某些物种(Callistemonspp)的除草组分)的衍生物(Lee等人,1997,WeedSci.Vol45,162-166)。
这些分子中的某些已经作为除草剂使用，因为抑制植物中该反应导致处理的植物的叶白化及所述植物死亡(Pallett，K.E.等人,1997Pestic.Sci.5083-84)。HPPD作为其靶并且在现有技术中描述的除草剂尤其是异噁唑类(EP418175、EP470856、EP487352、EP527036、EP560482、EP682659、美国专利号5,424,276)，尤其异噁氟草(isoxaflutole)(其是玉米的选择性除草剂)、二酮腈类(EP496630、EP496631)，尤其2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-CF3苯基)丙-1,3-二酮和2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-2,3Cl2苯基)丙-1,3-二酮、如EP625505、EP625508、美国专利号5,506,195中描述的三酮类，尤其磺草酮，或另外吡唑啉盐类(pyrazolinate)。另外，熟知的除草剂吡草磺(topramezone)在易感植物物种中激发与上述抑制4-HPPD的漂白性除草剂相同类型的植物毒性症状，同时正在生长的苗组织中叶绿素损失及坏死。吡草磺(topramezone)属于吡唑酮类或苯甲酰吡唑类的化学类别并且在2006年商业引入。出苗后施加时，该化合物选择性控制玉米间的广谱一年生杂草和阔叶杂草。
三种主要策略可用于使植物耐受除草剂，即(1)用酶将除草剂脱毒，所述酶将除草剂或其活性代谢物转化成无毒产物，例如，用于溴苯腈耐受性或Basta耐受性的酶(EP242236、EP337899)；(2)将靶酶突变成对除草剂或其活性代谢物较不敏感的有功能酶，例如，用于草甘膦耐受性的酶(EP293356，PadgetteS.R.等人,J.Biol.Chem.,266,33,1991)；或(3)过量表达敏感酶，从而根据敏感酶的动力学常数，在植物中产生如此量的靶酶，所述量相对于除草剂而言足够，从而尽管存在该酶的抑制剂，仍具有足够的有功能酶可用。描述了成功获得耐受HPPD抑制剂的植物第三种策略(WO96/38567)。US2009/0172831公开编码氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列具有如此酶活性，从而这些氨基酸序列抵抗HPPD抑制剂除草化学品，尤其三酮抑制剂特异性HPPD突变体。
迄今，现有技术尚未描述含有至少一种本发明突变HPPD核酸的耐受抑制HPPD除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的植物。现有技术尚未描述在除衍生HPPD基因的基因组之外的基因组上含有突变的耐受HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的作物植物。因此，本领域需要鉴定从自额外的基因组和物种HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂耐受性基因。本领域还需要是具有增加的针对除草剂如HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的耐受性并含有至少一种本发明突变的HPPD核酸的作物植物。还需要在这类作物植物或作物植物附近控制杂草生长的方法。这些组合物和方法将允许向含有作物植物或多种作物植物区域施加除草剂时使用顶部喷洒(sprayover)技术。
发明简述
该问题由本发明解决，所述发明涉及一种在植物栽培地点控制不想要的植物的方法，所述方法包括步骤：
a)在所述地点提供包含至少一种核酸的植物，所述核酸包含
(i)编码野生型羟苯基丙酮酸双加氧酶或突变的羟苯基丙酮酸双加氧酶(mut-HPPD)的核苷酸序列，其抵抗或耐受HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂和/或
(ii)编码野生型尿黑酸茄呢基转移酶或突变的尿黑酸茄呢基转移酶(mut-HST)的核苷酸序列，其抵抗或耐受HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂。
b)向所述地点施加有效量的所述除草剂。
此外，本发明涉及一种通过使用mut-HPPD和/或通过使用mut-HST鉴定HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的方法，所述mut-HPPD由包含SEQIDNO:1、51、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、52、54、56、68、69的核苷酸序列或其变体的核酸编码，所述mut-HST由包含SEQIDNO:47或49的核苷酸序列或其变体的核酸编码。
所述方法包括步骤：
a)产生包含编码野生型或mut-HPPD的核酸的转基因细胞或植物，其中表达野生型或mut-HPPD；
b)向a)的转基因细胞或植物并向相同品种的对照细胞或植物施加HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂；
c)在施加所述测试化合物后测定转基因细胞或植物和对照细胞或植物的生长或生存力，并且
d)选择与转基因细胞或植物的生长相比引起对照细胞或植物生长减少的测试化合物。
另一个目的涉及一种鉴定编码mut-HPPD的核苷酸序列的方法，所述mut-HPPD抵抗或耐受HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂，所述方法包括：
a)产生编码mut-HPPD的核酸的文库，
b)通过在细胞或植物中表达每种所产生的编码mut-HPPD的核酸并且用HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂处理所述细胞或植物，筛选所述核酸的群体，
c)将所述编码mut-HPPD的核酸的群体提供的HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂耐受水平与编码对照HPPD的核酸提供的HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂耐受水平比较，
d)选出至少一个编码mut-HPPD的核酸，所述核酸提供与编码对照HPPD的核酸提供的耐受性水平相比显著增加的HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂耐受性水平。
在一个优选实施方案中，与编码对照HPPD的核酸提供的耐受性相比，步骤d)中选出的编码mut-HPPD的核酸提供针对HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂至少有2倍的抗性或耐受性。
可以通过以下方式确定抗性或耐受性：产生包含步骤a)的文库的核酸序列的转基因植物并且比较所述转基因植物与对照植物。
另一个目的涉及一种鉴定含有编码mut-HPPD或mut-HST的核酸的植物或藻类的方法，所述植物或藻类抵抗或耐受HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂，所述方法包括：
a)在植物细胞或绿藻的培养物中确定HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的有效量，
b)用诱变剂处理所述植物细胞或绿藻，
c)使所述诱变的细胞群体与a)中确定的有效量的HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂接触，
d)选择幸存于这些测试条件的至少一个细胞，
e)从d)中选择的细胞PCR扩增HPPD基因和/或HST基因并将其测序并且将这类序列分别与野生型HPPD或HST基因序列比较。
在一个优选实施方案中，诱变剂是甲磺酸乙酯。
另一个目的涉及编码mut-HPPD的分离核酸，所述核酸通过如上文定义的方法可鉴定。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种由野生型或mut-HPPD核酸转化的植物细胞或这样一种植物，所述植物已经被突变以获得表达、优选过量表达野生型或mut-HPPD核酸的植物，其中与植物细胞的野生型品种相比，核酸在植物细胞中的表达导致增加的针对HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的抗性或耐受性。
在一个优选实施方案中，本发明的植物细胞由野生型或mut-HPPD核酸转化，所述mut-HPPD核酸包含SEQIDNO:1、51、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、52、54、56、68、69的序列或其变体或衍生物。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含本发明植物细胞的转基因植物，其中与植物的野生型品种相比，核酸在植物中的表达导致植物增加的针对HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的抗性。
本发明的植物可以是转基因或非转基因的。
优选，与植物的野生型品种相比，核酸在植物中的表达导致植物增加的针对HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的抗性。
在另一个实施方案中，本发明涉及由包含本发明植物细胞的转基因植物产生的种子，其中与种子的野生型品种相比，种子对于增加的针对HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的抗性是纯合(truebreeding)的。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种产生转基因植物细胞的方法，所述转基因植物细胞与植物细胞的野生型品种相比具有增加的针对HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的抗性，所述方法包括用包含野生型或mut-HPPD核酸的表达盒转化植物细胞。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种产生转基因植物的方法，包括：(a)用包含野生型或mut-HPPD核酸的表达盒转化植物细胞，和(b)从所述植物细胞产生具有增加的针对HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的抗性的植物。
优选，表达盒还包含在植物中有功能的转录启动调节区和翻译起始调节区。
在另一个实施方案中，本发明涉及使用本发明的mut-HPPD作为选择标记。本发明提供一种鉴定或选择转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分的方法，所述方法包括a)提供转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分，其中所述转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分包含编码如下文所述的本发明mut-HPPD多肽的分离核酸，其中使用该多肽作为选择标记，并且其中所述转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分可以任选地包含其他的目的分离核酸；b)使转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分与至少一种抑制HPPD的抑制性化合物、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物抑制性化合物接触；c)确定所述植物细胞、植物组织、植物或其部分是否受该抑制剂或抑制性化合物影响；并且d)鉴定或选择转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分。
本发明也体现于含有本文所述突变的纯化mut-HPPD蛋白，所述的纯化mut-HPPD蛋白用于分子建模研究以设计对除草剂耐受性的进一步改善。蛋白质纯化的方法是熟知的，并且可以使用市售产品或专门设计的方法轻易完成，例如在ProteinBiotechnology,Walsh和Headon(Wiley,1994)中描述。
附图简述
图1来自莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardti)(Cr_HPPD1a，Cr_HPPD1b)、展叶剑叶藓(Physcomitrellapatens)(Pp_HPPD1)、稻(Oryzasativa)(Osj_HPPD1)，普通小麦(Triticumaestivum)(Ta_HPPD1)、玉蜀黍(Zeamays)(Zm_HPPD1)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)(At_HPPD)，大豆(Glycinemax)(Gm_HPPD)、葡萄(Vitisvinifera)(Vv_HPPD)和大麦(Hordeumvulgare)(Hv_HPPD)的HPPD酶的氨基酸序列比对结果和保守区域。
*序列衍生自基因组测序计划。基因座ID：GRMZM2G088396
**氨基酸序列基于NCBIGenPept登录号CAG25475
图2显示用于以HPPD/HST序列转化大豆的植物转化载体的载体图。
图3显示表达大麦(Hordeum)L320HP321A突变体HPPD的转基因拟南芥籽苗的萌发测定法。植物依赖[3-(4,5-二氢异噁唑-3-基)-2-甲基-4-甲磺酰基-苯基]-(5-羟-1-甲基-吡唑-4-基)甲酮萌发。
图4显示采用表达拟南芥HPPD或PicruphilusHPPD的突变变体的转基因拟南芥植物的除草剂喷洒试验。平行处理非转基因对照植物并且处理14天后拍照。用不同浓度的抑制剂1([3-(4,5-二氢异噁唑-3-基)-2-甲基-4-甲磺酰基-苯基]-(5-羟-1-甲基-吡唑-4-基)甲酮)和抑制剂2(2-(4-甲磺酰基-2-硝基-苯甲酰)环己烷-1,3-二酮)喷洒植物。
图5显示采用表达大麦HPPD的突变变体的转基因拟南芥植物的除草剂喷洒试验。平行处理非转基因对照植物并且处理14天后拍照。用不同浓度的抑制剂1([3-(4,5-二氢异噁唑-3-基)-2-甲基-4-甲磺酰基-苯基]-(5-羟-1-甲基-吡唑-4-基)甲酮)和抑制剂2(2-(4-甲磺酰基-2-硝基-苯甲酰)环己烷-1,3-二酮)喷洒植物。
图6显示采用过量表达拟南芥HPPD的突变变体的转基因大豆植物的除草剂喷洒试验，在所述突变变体中与非转基因野生型大豆植株(Jake)相比，甲硫氨酸335交换成组氨酸。以不同施加速率平行处理大豆植物并且处理14天后拍照。将植物用0、6.25g/公顷，25g/公顷，和100g/公顷的[3-(4,5-二氢异噁唑-3-基)-2-甲基-4-甲磺酰基-苯基]-(5-羟-1-甲基-吡唑-4-基)甲酮(抑制剂1)喷洒。
图7显示采用过量表达如所示的拟南芥HPPD突变体的转基因大豆植物的除草剂田间试验。图片显示用50g/公顷[3-(4,5-二氢异噁唑-3-基)-2-甲基-4-甲磺酰基-苯基]-(5-羟-1-甲基-吡唑-4-基)甲酮(抑制剂1)处理7天后的初步评估。非转化对照植物标记为野生型。
序列表
表1
发明详述
冠词“一个(a)”和“一种(an)”在本文中用来指该冠词的一个或多于一个(即至少一个)语法对象。例如，“一种要素”意指一种或多种要素。
如本文中所用，字“包含”或变体如“包含了”或“包含着”将理解为意指包括所述的要素、整数或步骤，或成组的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤或成组的要素、整数或步骤。
本发明的发明人已经发现，可以借助过量表达包含SEQIDNO:2、5、8、11、14、17、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、53、55、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67的野生型或突变HPPD酶，明显增加植物对HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的耐受性或抗性。
因此，本发明涉及一种在植物栽培地点控制不想要的植物的方法，所述方法包括步骤：
a)在所述地点提供包含至少一种核酸的植物，所述核酸包含
(i)编码野生型羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)或突变的羟苯基丙酮酸双加氧酶(mut-HST)的核苷酸序列，其抵抗或耐受“HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂”和/或
(ii)编码野生型尿黑酸茄呢基转移酶(HST)或突变的尿黑酸茄呢基转移酶(mut-HST)的核苷酸序列，其抵抗或耐受“HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂”，
b)向所述地点施加有效量的所述除草剂。
术语“控制不想要的植物”将理解为杀死杂草和/或迟滞或抑制杂草的正常生长。在最广泛的意义上，将杂草理解为已知在不想要它们的位置生长的全部植物。本发明的杂草包括例如双子叶和单子叶杂草。双子叶杂草包括，但不限于以下属的杂草：白芥属(Sinapis)、独行菜属(Lepidium)、拉拉藤Galium)、繁缕属(Stellaria)、母菊属(Matricaria)、春黄菊属(Anthemis)、牛膝菊属(Galinsoga)、藜属(Chenopodium)、荨麻属(Urtica)、千里光属(Senecio)、苋属(Amaranthus)、马齿苋属(Portulaca)、苍耳属(Xanthium)、旋花属(Convolvulus)、番薯属(Ipomoea)、蓼属(Polygonum)、田菁属(Sesbania)、豚草属(Ambrosia)、蓟属(Cirsium)、飞廉属(Carduus)、苦苣菜属(Sonchus)、茄属(Solanum)、蔊菜属(Rorippa)、节节菜属(Rotala)、母草属(Lindernia)、野芝麻属(Lamium)、婆婆纳属(Veronica)、苘麻属(Abutilon)、三棘果属(Emex)、曼陀罗属(Datura)、堇菜属(Viola)、鼬瓣花属(Galeopsis)、罂粟属(Papaver)、矢车菊属(Centaurea)、车轴草属(Trifolium)、毛莨属(Ranunculus)和蒲公英属(Taraxacum)。单子叶杂草包括，但不限于以下属的杂草：稗属(Echinochloa)、狗尾草属(Setaria)、黍属(Panicum)、马唐属(Digitaria)、梯牧草属(Phleum)、早熟禾属(Poa)、羊茅属(Festuca)、穇属(Eleusine)、臂形草属(Brachiaria)、黑麦草属(Lolium)、雀麦属(Bromus)、燕麦属(Avena)、莎草属(Cyperus)、高粱属(Sorghum)、冰草属(Agropyron)、狗牙根属(Cynodon)、雨久花属(Monochoria)、飘拂草属(Fimbristyslis)、慈姑属(Sagittaria)、荸荠属(Eleocharis)、藨草属(Scirpus)、雀稗属(Paspalum)、鸭嘴草属(Ischaemum)、尖瓣花属(Sphenoclea)、龙爪茅属(Dactyloctenium)、剪股颖属(Agrostis)、看麦娘属(Alopecurus)和阿披拉草属(Apera)。另外，本发明的杂草可以包括例如正在不想要的位置生长的作物植物。例如，在主要包含大豆植物的大田中存在的自生玉米植物可以视为一种杂草，如果大豆植物田中不希望有玉米植物。
术语“植物”以其最广意义使用，因为它涉及有机物质并且意在涵盖属于植物界的真核生物，其例子包括但不限于维管植物、蔬菜、籽实、花、树、药草、灌木、草类、藤本植物、蕨、藓类植物、真菌和藻类等，以及用于无性繁殖的克隆、吸芽和植物部分(例如插枝、管、苗、根状茎、地下茎、丛、冠部、鳞茎(bulbs)、球茎(corms)、块茎、根状茎、在组织培养中产生的植物/组织等)。术语“植物”还涵盖完整植株、植物的祖先和后代和植物部分、包括种子、苗、茎、叶、根(包括块茎)、花、小花、果实、蒂(pedicle)、花梗(peduncle)、雄蕊、花药、柱头、花柱(style)、子房、花瓣、萼片、心皮、根尖、根盖、根毛、叶毛、种毛、花粉粒、小孢子、子叶、下胚轴、上胚轴、木质部、韧皮部、薄壁组织、胚乳、伴胞、防卫细胞以及任何其他已知器官、组织和植物、组织和器官的细胞，其中各自包含目的基因/核酸。术语“植物”也涵盖植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，再次地其中前述每一者包含目的基因/核酸。
在本发明方法中特别有用的植物包括属于植物界(Viridiplantae)超家族、尤其单子叶和双子叶植物的全部植物，包括饲用或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、树或灌木，其中所述植物选自包含以下物种的名单：槭树属物种(Acerspp.)、猕猴桃属物种(Actinidiaspp.)、秋葵属物种(Abelmoschusspp.)、剑麻(Agavesisalana)、冰草属物种(Agropyronspp.)、匍匐剪股颖(Agrostisstolonifera)、葱属物种(Alliumspp.)、苋属物种(Amaranthusspp.)、欧洲海滨草(Ammophilaarenaria)、凤梨(Ananascomosus)、番荔枝属物种(Annonaspp.)、旱芹(Apiumgraveolens)、落花生属物种(Arachisspp.)、木波罗属物种(Artocarpusspp.)、石刁柏(Asparagusofficinalis)、燕麦属物种(Avenaspp.)(例如燕麦(Avenasativa)、野燕麦(Avenafatua)、比赞燕麦(Avenabyzantina)、野燕麦原变种(Avenafatuavar.sativa)、杂种燕麦(Avenahybrida)、阳桃(Averrhoacarambola)、箣竹属(Bambusasp.)、冬瓜(Benincasahispida)、巴西栗(Bertholletiaexcelsea)、甜菜(Betavulgaris)、芸苔属物种(Brassicaspp.)(例如欧洲油菜(Brassicanapus)、芜青物种(Brassicarapassp.)[卡诺拉油菜、油菜(oilseedrape)、蔓青(turniprape)])、Cadabafarinosa、茶(Camelliasinensis)、美人蕉(Cannaindica)、大麻(Cannabissativa)、辣椒属物种(Capsicumspp.)、Carexelata、番木瓜(Caricapapaya)、大果假虎刺(Carissamacrocarpa)、山核桃属物种(Caryaspp.)、红花(Carthamustinctorius)、栗属物种(Castaneaspp.)、美洲木棉(Ceibapentandra)、苦苣(Cichoriumendivia)、樟属物种(Cinnamomumspp.)、西瓜(Citrulluslanatus)、柑桔属物种(Citrusspp.)、椰子属物种(Cocosspp.)、咖啡属物种(Coffeaspp.)、芋头(Colocasiaesculenta)、非洲梧桐属物种(Colaspp.)、黄麻属(Corchorussp.)、芫荽(Coriandrumsativum)、榛属物种(Corylusspp.)、山楂属物种(Crataegusspp.)、番红花(Crocussativus)、南瓜属物种(Cucurbitaspp.)、香瓜属物种(Cucumisspp.)、菜蓟属物种(Cynaraspp.)、胡萝卜(Daucuscarota)、山马蝗属物种(Desmodiumspp.)、龙眼(Dimocarpuslongan)、薯蓣属物种(Dioscoreaspp.)、柿树属物种(Diospyrosspp.)、稗属物种(Echinochloaspp.)、油棕属(Elaeis)(例如油棕(Elaeisguineensis)、美洲油棕(Elaeisoleifera))、穇子(Eleusinecoracana)、埃塞俄比亚画眉草(Eragrostistef)、蔗茅属物种(Erianthussp.)、枇杷(Eriobotryajaponica)、桉属物种(Eucalyptussp.)、红仔果(Eugeniauniflora)、荞麦属物种(Fagopyrumspp.)、水青冈属物种(Fagusspp.)、苇状羊茅(Festucaarundinacea)、无花果(Ficuscarica)、金桔属物种(Fortunellaspp.)、草莓属物种(Fragariaspp.)、银杏(Ginkgobiloba)、大豆属(Glycinespp.)(例如大豆(Glycinemax)、大豆(Sojahispida)或大豆(Sojamax))、陆地棉(Gossypiumhirstum)、向日葵属物种(Helianthusspp.)(例如向日葵(Helianthusannuus))、长管萱草(Hemerocallisfulva)、木槿属物种(Hibiscusspp.)、大麦属(Hordeumspp.)(例如大麦(Hordeumvulgare))、甘薯(Ipomoeabatatas)、核桃属物种(Juglansspp.)、莴苣(Lactucasativa)、山黧豆属物种(Lathyrusspp.)、兵豆(Lensculinari)、亚麻(Linumusitatissimum)、荔枝(Litchichinensis)、百脉根属物种(Lotusspp.)、棱角丝瓜(Luffaacutangula)、羽扇豆属物种(Lupinusspp.)、Luzulasylvatica、番茄属物种(Lycopersiconspp.)(例如番茄(Lycopersiconesculentum、Lycopersiconlycopersicum、Lycopersiconpyriforme))、硬皮豆属物种(Macrotylomaspp.)、苹果属物种(Malusspp.)、凹缘金虎尾(Malpighiaemarginata)、牛油果(Mammeaamericana)、芒果(Mangiferaindica)、木薯属物种(Manihotspp.)、人心果(Manilkarazapota)、苜蓿(Medicagosativa)、草木樨属物种(Melilotusspp.)、薄荷属物种(Menthaspp.)、芒(Miscanthussinensis)、苦瓜属物种(Momordicaspp.)、黑桑(Morusnigra)、芭蕉属物种(Musaspp.)、烟草属物种(Nicotianaspp.)、木犀榄属物种(Oleaspp.)、仙人掌属物种(Opuntiaspp.)、鸟足豆属物种(Ornithopusspp.)、稻属(Oryzaspp.)(例如稻、阔叶稻(Oryzalatifolia))、稷(Panicummiliaceum)、柳枝稷(Panicumvirgatum)、鸡蛋果(Passifloraedulis)、欧防风(Pastinacasativa)、狼尾草属物种(Pennisetumsp.)、鳄梨属物种(Perseaspp.)、欧芹(Petroselinumcrispum)、虉草(Phalarisarundinacea)、菜豆属物种(Phaseolusspp.)、猫尾草(Phleumpratense)、刺葵属物种(Phoenixspp.)、南方芦苇(Phragmitesaustralis)、酸浆属物种(Physalisspp.)、松属物种(Pinusspp.)、阿月浑子(Pistaciavera)、豌豆属物种(Pisumspp.)、早熟禾属物种(Poaspp.)、杨属物种(Populusspp.)、牧豆草属物种(Prosopisspp.)、李属物种(Prunusspp.)、番石榴属物种(Psidiumspp.)、石榴(Punicagranatum)、西洋梨(Pyruscommunis)、栎属物种(Quercusspp.)、萝卜(Raphanussativus)、波叶大黄(Rheumrhabarbarum)、茶藨子属物种(Ribesspp.)、蓖麻(Ricinuscommunis)、悬钩子属物种(Rubusspp.)、甘蔗属物种(Saccharumspp.)、柳属物种(Salixsp.)、接骨木属物种(Sambucusspp.)、黑麦(Secalecereale)、胡麻属物种(Sesamumspp.)、白芥属物种(Sinapissp.)、茄属(Solanumspp.)(例如马铃薯(Solanumtuberosum)、红茄(Solanumintegrifolium)或番茄(Solanumlycopersicum))、两色蜀黍(Sorghumbicolor)、菠菜属物种(Spinaciaspp.)、蒲桃属物种(Syzygiumspp.)、万寿菊属物种(Tagetesspp.)、酸豆(Tamarindusindica)、可可树(Theobromacacao)、车轴草属物种(Trifoliumspp.)、鸭茅状摩擦禾(Tripsacumdactyloides)、Triticosecalerimpaui、小麦属(Triticumspp.)(例如普通小麦(Triticumaestivum)、硬粒小麦(Triticumdurum)、圆柱小麦(Triticumturgidum)、Triticumhybernum、马卡小麦(Triticummacha)、普通小麦(Triticumsativum)，一粒小麦(Triticummonococcum)或普通小麦(Triticumvulgare))、小金莲花(Tropaeolumminus)、金莲花(Tropaeolummajus)、越桔属物种(Vacciniumspp.)、野碗豆属物种(Viciaspp.)、豇豆属物种(Vignaspp.)、香堇(Violaodorata)、葡萄属物种(Vitisspp.)、玉蜀黍(Zeamays)、Zizaniapalustris、枣属物种(Ziziphusspp.)及其他、苋菜、球蓟(artichoke)、芦笋、花茎甘蓝、抱子甘蓝、卷心菜、卡诺拉油菜、胡萝卜、花椰菜、旱芹、羽衣甘蓝叶绿色、亚麻、羽衣甘蓝、兵豆、菜籽油菜、秋葵、洋葱、马铃薯、稻、大豆、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜、茶和藻类，连同其他。根据本发明的优选实施方案，植物是作物植物。作物植物的例子尤其包含大豆、向日葵、卡诺拉油菜、苜蓿、油菜籽、棉花、番茄、马铃薯或烟草。进一步优选，植物是单子叶植物，如甘蔗。进一步优选，植物是禾谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、高粱或燕麦。
在一个优选实施方案中，已经事先通过下述方法产生该植物，所述方法包括通过引入并过量表达如本文以更多细节中描述的野生型或mut-HPPD和/或野生型或mut-HST转基因，重组地制备植物。
在另一个优选实施方案中，已经事先通过下述方法产生该植物，所述方法包括原位诱变植物细胞，以获得表达mut-HPPD和/或mut-HST的植物细胞。
如本文中公开，本发明的核酸用来增强植物的除草剂耐受性，其中所述植物在它们的基因组中包含编码耐除草剂的野生型或mut-HPPD蛋白和/或野生型或mut-HST蛋白的基因。如本文所述，这种基因可以是内源基因或转基因。
因此，在另一个实施方案中本发明涉及一种增加或增强植物的HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂耐受性或抗性的方法，所述方法包括过量表达编码包含SEQIDNO:2、5、8、11、14、17、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、53、55、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67的野生型或mutHPPD酶的核酸。
在一个实施方案中，野生型HPPD酶包含SEQIDNO:40、44或46。
另外，在某些实施方案中，本发明的核酸序列可以与任何目的多核苷酸序列的组合堆叠以产生具有所需表型的植物。例如，本发明的核酸可以与编码具有农药和/或杀昆虫(insecticidal)活性的多肽(例如苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)毒素蛋白)的任何其它多核苷酸堆叠(在美国专利号5,366,892；5,747,450；5,737,514；5,723,756；5,593,881；和Geiser等人,(1986)Gene48:109中公开)。所产生的组合也可以包括任一种目的多核苷酸的多重拷贝。
以举例方式，可以与本发明核酸堆叠的多核苷酸包括编码赋予对害虫/病原体如病毒、线虫、昆虫或真菌等抗性的多肽的核酸。可以与本发明核酸堆叠的示例性多核苷酸包括编码以下对象的多核苷酸：具有农药和/或杀昆虫活性的多肽，如其他苏云金芽孢杆菌毒蛋白(在美国专利号5,366,892；5,747,450；5,737,514；5,723,756；5,593,881；和Geiser等人,(1986)Gene48:109)中描述)、凝集素(VanDamme等人,(1994)PlantMol.Biol.24:825)、pentin(在美国专利号5,981,722中描述)等；有利于疾病或除草剂抗性的性状(例如，烟曲霉毒素脱毒基因(美国专利号5,792,931)；无毒力和疾病抗性基因(Jones等人,(1994)Science266:789；(1993)Science262:1432；Mindrinos等人,(1994)Cell78:1089)；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体如S4和/或Hra突变；草甘膦(glyphosate)抗性(例如，美国专利号4,940,935和5,188,642中描述的5-烯醇式-丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因；或在Castle等人,(2004)Science,304:1151-1154中和美国专利申请公开号20070004912、20050246798和20050060767中描述的草甘膦N-乙酰转移酶(GAT)基因)；草铵膦(glufosinate)抗性(例如，在美国专利号5,561,236和5,276,268中描述的膦丝菌素乙酰基转移酶基因PAT和BAR)；对包括磺酰脲、DHT(2,4D)和PPO除草剂在内的除草剂的抗性(例如，草甘膦乙酰基转移酶、芳氧基链烷酸酯双加氧酶、乙酰乳酸合酶和原卟啉原氧化酶)；尤其针对HPPD除草剂赋予除草剂抗性或耐受性的细胞色素P450或其变体(美国专利申请序列号12/156,247；美国专利号6,380,465；6,121,512；5,349,127；6,649,814；和6,300,544；及PCT专利申请公开号WO2007000077)；和有利于加工过程或加工产品的性状如高油(例如，美国专利号6,232,529)；改性油(例如，脂肪酸去饱和酶基因(美国专利号5,952,544；WO94/11516))；改性淀粉(例如，ADPG焦磷酸酶(AGPase)、淀粉合酶(SS)、淀粉支化酶(SBE)和淀粉去分支酶(SDBE))；和聚合物或生物塑料(例如，美国专利号5,602,321；促进聚羟基链烷酸酯(PHA)表达的β-酮硫解酶、聚羟基丁酸酯合酶和乙酰乙酰-CoA还原酶(Schubert等人,(1988)J.Bacteriol.170:5837-5847))；所述文献的公开内容通过引用的方式并入本文。
在一个特别优选的实施方案中，植物包含至少一种额外的异源核酸，所述异源核酸包含(iii)编码除草剂耐受酶的核苷酸序列，所述除草剂耐受酶选自5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、草甘膦乙酰基转移酶(GAT)、细胞色素P450、膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)、乙酰羟酸合酶(AHAS；EC4.1.3.18，也称作乙酰乳酸合酶或ALS)、原卟啉原氧化酶(PPGO)、八氢番茄红素去饱和酶(PD)和麦草畏(dicamba)降解酶，如WO02/068607中公开。
通常，术语“除草剂”在本文中用来意指杀死、控制或否则不利地调节植物生长的活性成分。该除草剂的优选量或浓度是“有效量”或“有效浓度”。术语“有效量”或“有效浓度”分别意指这样的量或浓度，所述量或浓度足够杀死相似的野生型植物、植物组织、植物细胞或宿主细胞或抑制其生长，但是所述量不杀死本发明的抗除草剂植物、植物组织、植物细胞和宿主细胞或不严重抑制其生长。一般地，除草剂的有效量是农业生产系统中例行用来杀死目的杂草的量。这种量是本领域普通技术人员已知的。将用于本发明的HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂是在任何生长阶段或在种植或出苗之前直接施加至植物或施加至植物的地点时，它们显示除草活性。观察到的效果取决于待控制的植物物种、植物的生长阶段、稀释物的施加参数和喷雾液滴大小、固态组分的粒度、使用时的环境条件、所用的具体化合物、使用的具体辅助剂和载体、土壤类型等，以及施加的化学品的量。如本领域已知，可以调节这些因素和其他因素以促进非选择性或选择性除草作用。通常，优选出苗后施加HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂至相对不成熟的不想要的植物以实现对杂草的最大控制。
“耐除草剂的”或“抗除草剂的”意指耐受或抵抗下述水平的至少一个种除草剂的植物，所述水平通常会杀死正常植物或野生型植物或抑制其生长。“耐除草剂的mut-HPPD蛋白”或“抗除草剂的mut-HPPD蛋白”意指在已知干扰HPPD活性的至少一种除草剂存在并且在该除草剂的已知抑制野生型mut-HPPD蛋白的HPPD活性的浓度或水平时，这种mut-HPPD蛋白相对野生型mut-HPPD蛋白的HPPD活性显示更高的HPPD活性。另外，这种耐除草剂或抗除草剂的mut-HPPD蛋白的HPPD活性可以在本文中称作“耐除草剂”或“抗除草剂”HPPD活性”。
在一个优选实施方案中，HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂选自双环磺草酮(benzobicyclon)、吡草酮(benzofenap)、异噁氟草(isoxaflutole)、硝磺酮(mesotrione)、磺酰草吡唑(pyrasulfotole)、吡唑特(pyrazolynate)、苄草唑(pyrazoxyfen)、磺草酮(sulcotrione，特糠酯酮(tefuryltrione)、环磺酮(tembotrione)、吡草磺(topramezone)、氟吡草酮(bicyclopyrone)(4-羟-3-[[2-(2-甲氧基乙氧基)甲基]-6-(三氟甲基)-3-吡啶基]羰基]-双环[3.2.1]-辛-3-烯-2-酮)。
可用于本发明的HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂经常最好与一种或多种其他靶向HPPD和/或靶向HST的除草剂一起施加以获得对更广泛种类不想要的植物的控制。与其他靶向HPPD和/或靶向HST的除草剂组合使用时，本发明要求保护的化合物可以与其他除草剂或多种除草剂一起配制、与其他除草剂或多种除草剂罐混或与其他除草剂或多种除草剂依次施加。
可用于本发明的除草剂化合物可以与额外的除草剂组合使用，其中作物植物天然耐受或它因表达如上文提到的一种或多种额外转基因而抵抗或它因如下文所述的诱变和育种方法而抵抗所述额外的除草剂。
除非已经包含于以上公开的内容中，否则本发明的HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂还可以与来自如下群组的化合物组合使用：
a)来自脂质生物合成抑制剂群组：
禾草灭(Alloxydim)、禾草灭钠盐(Alloxydim-natrium)、丁氧环酮(Butroxydim)、烯草酮(Clethodim)、炔草酸(Clodinafop)、炔草酸酯(Clodinafop-propargyl)、噻草酮(Cycloxydim)、Cyhalofop、氰氟草酯(Cyhalofop-butyl)、氯甲草(Diclofop)、禾草灵(Diclofop-methyl)、噁唑禾草灵(Fenoxaprop)、噁唑禾草灵Fenoxaprop-ethyl、高效唑禾草灵灵(Fenoxaprop-P)、精噁唑禾草灵(Fenoxaprop-P-ethyl)、吡氟禾草灵(Fluazifop)、Fluazifop-butyl、Fluazifop-P、精吡氟禾草灵(Fluazifop-P-butyl)、氟吡禾灵(Haloxyfop)、氟吡甲禾灵(Haloxyfop-methyl)、Haloxyfop-P、高效氟吡禾灵(Haloxyfop-P-methyl)、噁唑酰草胺(Metamifop)、唑啉草酯(Pinoxaden)、环苯草酮(Profoxydim)、喔草酯(Propaquizafop)、喹禾灵(Quizalofop)、禾草克(Quizalofop-ethyl)、Quizalofop-tefuryl、Quizalofop-P、精喹禾灵(Quizalofop-P-ethyl)、喹禾糠酯(Quizalofop-P-tefuryl)、稀禾定(Sethoxydim)、醌肟草(Tepraloxydim)、肟草酮(Tralkoxydim)、呋草黄(Benfuresat)、丁草特(Butylat)、环草敌(Cycloat)、茅草枯(Dalapon)、哌草丹(Dimepiperat)、EPTC、禾草畏(Esprocarb)、灭草呋喃(Ethofumesat)、四氟丙酸(Flupropanat)、草达灭(Molinat)、坪草丹(Orbencarb)、克草猛(Pebulat)、苄草丹(Prosulfocarb)、TCA、杀草丹(Thiobencarb)、仲草丹(Tiocarbazil)、野麦畏(Triallat)和灭草猛(Vernolat)；
b)来自ALS抑制剂群组：
磺氨黄隆(Amidosulfuron)、四唑黄隆(Azimsulfuron)、苄嘧黄隆(Bensulfuron)、苄嘧黄隆(Bensulfuron-methyl)、双草醚(Bispyribac)、双草醚钠盐(Bispyribac-natrium)、氯嘧黄隆(Chlorimuron)、氯嘧黄隆(Chlorimuron-ethyl)、绿黄隆(Chlorsulfuron)、醚黄隆(Cinosulfuron)、氯酯磺草胺(Cloransulam)、氯酯磺草胺(Cloransulam-methyl)、环丙黄隆(Cyclosulfamuron)、唑嘧磺胺(Diclosulam)、Ethametsulfuron、胺苯磺隆(Ethametsulfuron-methyl)、乙氧嘧黄隆(Ethoxysulfuron)、啶嘧黄隆(Flazasulfuron)、双氟磺草胺(Florasulam)、氟唑磺隆(Flucarbazon)、氟唑磺隆钠盐(Flucarbazon-natrium)、氟吡磺隆(Flucetosulfuron)、氟唑啶草(Flumetsulam)、氟啶黄隆(Flupyrsulfuron)、氟啶嘧磺隆钠(Flupyrsulfuron-methyl-natrium)、甲酰胺黄隆(Foramsulfuron)、吡氯黄隆(Halosulfuron)、氯吡嘧磺隆(Halosulfuron-methyl)、咪草酯(Imazamethabenz)、咪草酸(Imazamethabenz-methyl)、咪草啶酸(Imazamox)、甲基咪草烟(Imazapic)、灭草烟(Imazapyr)、灭草喹(Imazaquin)、咪草烟(Imazethapyr)、啶咪黄隆(Imazosulfuron)、碘黄隆(Iodosulfuron)、碘甲磺隆钠盐(Iodosulfuron-methyl-natrium)、甲磺胺黄隆(Mesosulfuron)、唑草磺胺(Metosulam)、甲磺隆(Metsulfuron)、精甲磺胺黄隆(Metsulfuron-methyl)、烟黄隆(Nicosulfuron)、嘧苯胺磺隆(Orthosulfamuron)、环丙氧黄隆(Oxasulfuron)、五氟磺草胺(Penoxsulam)、氟嘧磺隆(Primisulfuron)、氟嘧磺隆(Primisulfuron-methyl)、丙苯磺隆(Propoxycarbazon)、丙苯磺隆钠盐(Propoxycarbazon-natrium)、氟丙黄隆(Prosulfuron)、吡嘧黄隆(Pyrazosulfuron)、吡嘧黄隆乙酯(Pyrazosulfuron-ethyl)、嘧啶肟草醚(Pyribenzoxim)、Pyrimisulfan、Pyriftalide、Pyriminobac、肟啶草(Pyriminobac-methyl)、嘧硫苯甲酸(Pyrithiobac)、嘧硫苯甲酸(Pyrithiobac)-natrium、吡唑磺草胺(Pyroxsulam)、玉嘧黄隆(Rimsulfuron)、嘧黄隆(Sulfometuron)、甲嘧磺隆(Sulfometuron-methyl)、乙黄黄隆(Sulfosulfuron)、Thiencarbazon、噻酮磺隆(Thiencarbazon-methyl)、Thifensulfuron、噻吩磺隆(Thifensulfuron-methyl)、醚苯黄隆(Triasulfuron)、Tribenuron、苯黄隆(Tribenuron-methyl)、三氟啶黄隆(Trifloxysulfuron)、Triflusulfuron、氟胺磺隆(Triflusulfuron-methyl)和三氟甲磺隆(Tritosulfuron)；
c)来自光合作用抑制剂群组：
莠灭净(Ametryn)、氨唑草酮(Amicarbazon)、阿托拉辛(Atrazin)、苯达松(Bentazon)、苯达松钠盐(Bentazon-natrium)、除草定(Bromacil)、溴酚肟(Bromofenoxim)、溴苯腈(Bromoxynil)及其盐和酯、Chlorobromuron、杀草敏(Chloridazon)、绿麦隆(Chlortoluron)、枯草隆(Chloroxuron)、氰草津(Cyanazin)、异苯敌草(Desmedipham)、敌草净(Desmetryn)、噁唑隆(Dimefuron)、戊草津(Dimethametryn)、敌草快(Diquat)、敌草快二溴盐(Diquat-dibromid)、敌草隆(Diuron)、伏草隆(Fluometuron)、环嗪酮(Hexazinon)、碘苯腈(Ioxynil)及其盐和酯、异丙隆(Isoproturon)、Isouron、卡灵草(Karbutilat)、环草定(lenacil)、利谷隆(linuron)、苯嗪草(Metamitron)、噻唑隆(Methabenzthiazuron)、吡喃隆(Metobenzuron)、甲氧隆(Metoxuron)、赛克津(Metribuzin)、绿谷隆(Monolinuron)、草不隆(Neburon)、百草枯(Paraquat)、百草枯二氯盐(Paraquat-dichlorid)、百草枯二甲基硫酸盐(Paraquat-dimetilsulfat)、蔬草灭(Pentanochlor)、苯敌草(Phenmedipham)、乙苯敌草(Phenmedipham-ethyl)、扑灭通(Prometon)、扑草净(Prometryn)、敌稗(Propanil)、扑灭津(Propazin)、Pyridafol、哒草特(Pyridat)、环草隆(Siduron)、西玛津(Simazin)、西草净(Simetryn)、丁唑隆(Tebuthiuron)、特草定(Terbacil)、特丁通(Terbumeton)、特丁津(Terbuthylazin)、去草净(Terbutryn)、噻苯隆(Thidiazuron)和草达津(Trietazin)；
d)来自原卟啉原IX氧化酶抑制剂群组：
氟锁草醚(Acifluorfen)、氟锁草醚钠盐(Acifluorfen-natrium)、唑啶草酮(Azafenidin)、Bencarbazon、双苯嘧草酮(Benzfendizon)、苯并噁嗪酮(Benzoxazinone)(如WO2010/145992中所述)、治草醚(Bifenox)、氟丙嘧草酯(Butafenacil)、Carfentrazon、唑酮草酯(Carfentrazon-ethyl)、甲氧除草醚(Chlomethoxyfen)、吲哚酮草酯(Cinidon-ethyl)、Fluazolat、氟哒嗪草酮(Flufenpyr)、氟哒嗪草酯(Flufenpyr-ethyl)、氟烯草酸(Flumiclorac)、氟亚胺草酯(Flumiclorac-pentyl)、氟噁嗪酮(Flumioxazin)、乙羧氟草醚(Fluoroglycofen)、Fluoroglycofen-ethyl、达草氟(Fluthiacet)、嗪草酸甲酯(Fluthiacet-methyl)、氟黄胺草醚(Fomesafen)、Halosafen、乳氟禾草灵(Lactofen)、炔丙噁唑草(Oxadiargyl)、恶草灵(Oxadiazon)、氟硝草醚(Oxyfluorfen)、Pentoxazon、Profluazol、双唑草腈(Pyraclonil)、Pyraflufen、吡草醚(Pyraflufen-ethyl)、苯嘧磺草胺(Saflufenacil)、甲磺草胺(Sulfentrazon)、噻二唑草胺(Thidiazimin)、2-氯-5-[3,6-二氢-3-甲基-2,6-二氧代-4-(三氟甲基)-1(2H)-嘧啶基]-4-氟-N-[(异丙基)甲基氨磺酰]苯甲酰胺(H-1；CAS372137-35-4)、[3-[2-氯-4-氟-5-(1-甲基-6-三氟甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-3-基)苯氧基]-2-吡啶基氧]乙酸乙酯(H-2；CAS353292-31-6)、N-乙基-3-(2,6-二氯-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(carboxamid)(H-3；CAS452098-92-9)、N-四氢化糠基-3-(2,6-二氯-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(H-4；CAS915396-43-9)、N-乙基-3-(2-氯-6-氟-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(H-5；CAS452099-05-7)和N-四氢化糠基-3-(2-氯-6-氟-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(H-6；CAS45100-03-7)；
e)来自漂白除草剂群组：
苯草醚(Aclonifen)、氨基三唑(Amitrol)、氟丁酰草胺(Beflubutamid)、双环磺草酮(Benzobicyclon)、吡草酮(Benzofenap)、异噁草酮(Clomazon)、吡氟草胺(Diflufenican)、氟啶草酮(Fluridon)、氟咯草酮(Flurochloridon)、呋草酮(Flurtamon)、异噁唑草酮(Isoxaflutol)、硝磺草酮(Mesotrion)、达草灭(Norflurazon)、氟吡酰草胺(Picolinafen)、Pyrasulfutol、苄草唑(Pyrazolynat)、苄草唑(Pyrazoxyfen)、磺草酮(Sulcotrion)、特糠酯酮(Tefuryltrion)、环磺酮(Tembotrion)、吡唑草酮(Topramezon)、4-羟-3-[[2-[(2-甲氧基乙氧基)甲基]-6-(三氟甲基)-3-吡啶基]羰基]双环并[3.2.1]辛-3-烯-2-酮(H-7；CAS352010-68-5)和4-(3-三氟甲基苯氧基)-2-(4-三氟甲基苯基)嘧啶(H-8；CAS180608-33-7)；
f)来自EPSP合酶抑制剂群组：
草甘膦(Glyphosat)、草甘膦-异丙胺盐(Glyphosat-isopropylammonium)和草硫膦(Glyphosat-trimesium)(Sulfosat)；
g)来自谷氨酰胺合酶抑制剂群组：
双丙氨酰膦(Bilanaphos)(双丙胺膦(Bialaphos))、双丙氨酰膦钠盐(Bilanaphos-natrium)、草铵膦(Glufosinat)和草铵膦胺盐(Glufosinat-ammonium)；
h)来自DHP合酶抑制剂群组：黄草灵(Asulam)；
i)来自有丝分裂抑制剂群组：
胺草磷(Amiprophos)、甲基胺草磷(Amiprophos-methyl)、氟草胺(Benfluralin)、抑草磷(Butamiphos)、双丁乐灵(Butralin)、卡草胺(Carbetamid)、氯普芬(Chlorpropham)、敌草索(Chlorthal)、氯酞酸甲酯(Chlorthal-dimethyl)、敌乐胺(Dinitramin)、氟硫草定(Dithiopyr)、丁氟消草(Ethalfluralin)、氟消草(Fluchloralin)、黄草消(Oryzalin)、胺硝草(Pendimethalin)、氨氟乐灵(Prodiamin)、苯胺灵(Propham)、炔苯酰草胺(Propyzamid)、牧草胺(Tebutam)、噻氟啶草(Thiazopyr)和氟乐灵(Trifluralin)；
j)来自VLCFA抑制剂群组：
乙草胺(Acetochlor)、甲草胺(Alachlor)、莎稗磷(Anilofos)、丁草胺(Butachlor)、苯酮唑(Cafenstrol)、克草胺(Dimethachlor)、二甲吩草胺(Dimethanamid)、高效二甲吩草胺(Dimethenamid-P)、双苯酰草胺(Diphenamid)、四唑酰草胺(Fentrazamid)、氟噻草胺(Flufenacet)、苯噻草胺(Mefenacet)、吡草胺(Metazachlor)、异丙甲草胺(Metolachlor)、异丙甲草胺-S(Metolachlor-S)、萘丙胺(Naproanilid)、草萘胺(Napropamid)、烯草胺(Pethoxamid)、哌草磷(Piperophos)、丙草胺(Pretilachlor)、毒草安(Propachlor)、异丙草胺(Propisochlor)、派罗克杀草砜(Pyroxasulfon)(KIH-485)和噻醚草胺(Thenylchlor)；
式2的化合物：
特别优选的式2化合物是：
3-[5-(2,2-二氟-乙氧基)-1-甲基-3-三氟甲基-1H-吡唑-4-基甲磺酰基]-4-氟-5,5-二甲基-4,5-二氢-异噁唑(2-1)；3-{[5-(2,2-二氟-乙氧基)-1-甲基-3-三氟甲基-1H-吡唑-4-基]-氟-甲磺酰基}-5,5-二甲基-4,5-二氢-异噁唑(2-2)；4-(4-氟-5,5-二甲基-4,5-二氢-异噁唑-3-磺酰基甲基)-2-甲基-5-三氟甲基-2H-[1,2,3]三唑(2-3)；4-[(5,5-二甲基-4,5-二氢-异噁唑-3-磺酰基)-氟-甲基]-2-甲基-5-三氟甲基-2H-[1,2,3]三唑(2-4)；4-(5,5-二甲基-4,5-二氢-异噁唑-3-磺酰基甲基)-2-甲基-5-三氟甲基-2H-[1,2,3]三唑(2-5)；3-{[5-(2,2-二氟-乙氧基)-1-甲基-3-三氟甲基-1H-吡唑-4-基]-二氟-甲磺酰基}-5,5-二甲基-4,5-二氢-异噁唑(2-6)；4-[(5,5-二甲基-4,5-二氢-异噁唑-3-磺酰基)-二氟-甲基]-2-甲基-5-三氟甲基-2H-[1,2,3]三唑(2-7)；3-{[5-(2,2-二氟-乙氧基)-1-甲基-3-三氟甲基-1H-吡唑-4-基]-二氟-甲磺酰基}-4-氟-5,5-二甲基-4,5-二氢-异噁唑(2-8)；4-[二氟-(4-氟-5,5-二甲基-4,5-二氢-异噁唑-3-磺酰基)-甲基]-2-甲基-5-三氟甲基-2H-[1,2,3]三唑(2-9)；
k)来自纤维素生物合成抑制剂群组：
氯硫酰草胺(Chlorthiamid)、敌草腈(Dichlobenil)、胺草唑(Flupoxam)和异恶草胺(Isoxaben)；
l)来自解偶联除草剂群组：
地乐酚(Dinoseb)、特乐酚(Dinoterb)和DNOC及其盐；
m)来自植物生长激素除草剂群组：
2,4-滴(2,4-D)及其盐和酯、2,4-滴丁酸(2,4-DB)及其盐和酯、氯氨吡啶酸(Aminopyralid)及其盐wie氯氨吡啶酸(Aminopyralid)-三(2-羟丙基)铵和其酯、草除灵(Benazolin)、草除灵乙酯(Benazolin-ethyl)、草灭畏(Chloramben)及其盐和酯、稗草胺(Clomeprop)、二氯吡啶酸(Clopyralid)及其盐和酯、麦草畏(Dicamba)及其盐和酯、2,4-滴丙酸(Dichlorprop)及其盐和酯、高2,4-滴丙酸(Dichlorprop-P)及其盐和酯、氟草烟(Fluroxypyr)、氟草烟丁氧甲酯(Fluroxypyr-butometyl)、氟草烟甲酯(Fluroxypyr-meptyl)、MCPA及其盐和酯、2甲4氯乙硫酯(MCPA-thioethyl)、2甲4氯丁酸(MCPB)及其盐和酯、2甲4氯丙酸(Mecoprop)及其盐和酯、高2-甲-4-氯丙酸(Mecoprop-P)及其盐和酯、毒莠定(Picloram)及其盐和酯、二氯喹啉酸(Quinclorac)、喹草酸(Quinmerac)、TBA(2,3,6)及其盐和酯、绿草定(Triclopyr)及其盐和酯和5,6-二氯-2-环丙基-4-嘧啶碳酸(H-9；CAS858956-08-8)及其盐和酯；
n)来自植物生长激素转运抑制剂群组：氟吡草腙(Diflufenzopyr)、氟吡草腙钠盐(Diflufenzopyr-natrium)、抑草生(Naptalam)和抑草生钠盐(Naptalam-natrium)；
o)来自其他除草剂群组：溴丁酰草胺(Bromobutid)、整形醇(Chlorflurenol)、整形素(Chlorflurenol-methyl)、环庚草醚(Cinmethylin)、苄草隆(Cumyluron)、茅草枯(Dalapon)、棉隆(Dazomet)、野燕枯(Difenzoquat)、野燕枯甲基硫酸盐(Difenzoquat-metilsulfate)、噻节因(Dimethipin)、DSMA、杀草隆(Dymron)、草藻灭(Endothal)及其盐、乙苯酰草(Etobenzanid)、麦草氟(Flamprop)、麦草氟异丙酯(Flamprop-isopropyl)、麦草氟甲酯(Flamprop-methyl)、高效麦草氟异丙酯(Flamprop-M-isopropyl)、高效麦草氟甲酯(Flamprop-M-methyl)、芴醇(Flurenol)、芴丁酯(Flurenol-butyl)、调嘧醇(Flurprimidol)、调节膦(Fosamin)、杀木膦铵盐(Fosamine-ammonium)、茚草酮(Indanofan)、Maleinicacid-hydrazid、氟磺酰草胺(Mefluidid)、威百亩(Metam)、叠氮甲烷(Methylazid)、甲基溴(Methylbromid)、甲基莎扑隆(Methyl-dymron)、Methyljodid。MSMA、油酸、噁嗪草酮(Oxaziclomefon)、壬酸、稗草畏(Pyributicarb)、灭藻醌(Quinoclamin)、苯氧丙胺津(Triaziflam)、灭草环(Tridiphan)和6-氯-3-(2-环丙基-6-甲基苯氧基)-4-哒嗪酮(H-10；CAS499223-49-3)及其盐和酯。
优选安全剂C的例子是解草酮(Benoxacor)、解草酸(Cloquintocet)、解草胺腈(Cyometrinil)、环丙磺酰胺(Cyprosulfamid)、烯丙酰草胺(Dichlormid)、Dicyclonon、增效磷(Dietholate)、解草唑(Fenchlorazol)、解草啶(Fenclorim)、解草安(Flurazol)、氟草肟(Fluxofenim)、解草恶唑(Furilazol)、双苯噁唑酸(Isoxadifen)、吡唑解草酸(Mefenpyr)、Mephenat、萘酸酐、解草腈(Oxabetrinil)、4-(二氯乙酰基)-1-氧杂-4-氮杂螺(azaspiro)[4.5]癸烷基(decan)(H-11；MON4660、CAS71526-07-3)和2,2,5-三甲基-3-(二氯乙酰基)-1,3-噁唑烷(oxazolidin)(H-12；R-29148、CAS52836-31-4)。
群组a)至o)的化合物和安全剂C是已知的除草剂和安全剂，参见例如TheCompendiumofPesticideCommonNames(http://www.alanwood.net/pesticides/)；B.Hock,C.Fedtke,R.R.Schmidt,Herbicides,GeorgThiemeVerlag,Stuttgart1995。其他除草效应物已知来自WO96/26202、WO97/41116、WO97/41117、WO97/41118、WO01/83459和WO2008/074991以及来自W.等人(编著)“ModernCropProtectionCompounds”，第1卷，WileyVCH,2007和其中应用的文献。
与本发明的HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂可结合使用的一些除草剂包括双环磺草酮(benzobicyclon)、硝磺酮(mesotrione)、磺草酮(sulcotrione)、特糠酯酮(tefuryltrione)、环磺酮(tembotrione)、4-羟-3-[[2-(2-甲氧基乙氧基)甲基]-6-(三氟甲基)-3-吡啶基]羰基]-双环[3.2.1]-辛-3-烯-2-酮(氟吡草酮(bicyclopyrone))、ketospiradox或其游离酸、吡草酮(benzofenap)、磺酰草吡唑(pyrasulfotole)、吡唑特(pyrazolynate)、苄草唑(pyrazoxyfen)、吡草磺(topramezone)、[2-氯-3-(2-甲氧基乙氧基)-4-(甲磺酰基)苯基](l-乙基-5-羟-1H-吡唑-4-基)-甲酮、(2,3-二氢-3,3,4-三甲基-1,1-二氧苯并[b]噻吩-5-基)(5-羟-1-甲基-1H-吡唑-4-基)-甲酮、异噁氯草酮(isoxachlortole)、异噁氟草(isoxaflutole)、α-(环丙基羰基)-2-(甲磺酰基)-β-氧代-4-氯-苯丙腈和α-(环丙基羰基)-2-(甲磺酰基)-β-氧代-4-(三氟甲基)-苯丙腈。
在一个优选实施方案中，额外的除草剂是吡草磺(topramezone)。
在一个特别优选的实施方案中，额外的除草剂是
(1-乙基-5-丙-2-烯基氧-1H-吡唑-4-基)-[4-甲磺酰基-2-甲基-3-(3-甲基-4,5-二氢-异噁唑-5-基)-苯基]-甲酮
或
(1-乙基-5-羟-1H-吡唑-4-基)-[4-甲磺酰基-2-甲基-3-(3-甲基-4,5-二氢-异噁唑-5-基)-苯基]-甲酮。
EP09177628.6中更详细地描述了上述化合物，所述专利通过引用的方式完整并入本文。
可以与本发明化合物结合使用的特别优选的除草剂包括磺酰胺(sulfonamides)如唑草磺胺(metosulam)、氟唑啶草(flumetsulam)、氯酯磺草胺(cloransulam-methyl)、唑嘧磺胺(diclosulam)、五氟磺草胺(penoxsulam)和双氟磺草胺(florasulam)、磺酰脲类如氯嘧黄隆(chlorimuron)、苯黄隆(tribenuron)、嘧黄隆(sulfometuron)、烟黄隆(nicosulfuron)、绿黄隆(chlorsulfuron)、磺氨黄隆(amidosulfuron)、醚苯黄隆(triasulfuron)、氟丙黄隆(prosulfuron)、三氟甲磺隆(tritosulfuron)、噻磺隆(thifensulfuron)、乙黄黄隆(sulfosulfuron)和甲磺隆(metsulfuron)、咪唑啉酮类如灭草喹(imazaquin)、甲基咪草烟(imazapic)、咪唑乙烟酸(ima-zethapyr)、灭草烟(imzapyr)、咪草酯(imazamethabenz)和咪草啶酸(imazamox)、苯氧基链烷酸类如2,4-滴(2,4-D)、2甲4氯(MCPA)、2,4-滴丙酸(dichlorprop)和2甲4氯丙酸(mecoprop)、吡啶基氧乙酸类(pyridinyloxyaceticacids)如绿草定(triclopyr)和氟草烟(fluroxypyr)、羧酸如二氯吡啶酸(clopyralid)、毒莠定(picloram)、氯氨吡啶酸(aminopyralid)和麦草畏(dicamba)、二硝基苯胺类(dinitroanilines)如氟乐灵(trifluralin)、benefin、氟草胺(benfluralin)和胺硝草(pendimethalin)、氯乙酰苯胺类(chloroacetanilides)如甲草胺(alachlor)、乙草胺(acetochlor)和异丙甲草胺(metolachlor)、半卡巴腙类(semicarbazones)(植物生长激素运输抑制剂)如整形醇(chlorflurenol)和氟吡草腙(diflufenzopyr)、芳氧基苯氧基丙酸酯(aryloxyphenoxypropionates)如吡氟禾草灵(fluazifop)、氟吡禾灵(haloxyfop)、氯甲草(diclofop)、炔草酸(clodinafop)和噁唑禾草灵(fenoxaprop)和其他常见的除草剂，包括草甘膦(glyphosate)、草铵膦(glufosinate)、氟锁草醚(acifluorfen)、苯达松(bentazon)、异恶草酮(clomazone)、fumiclorac、伏草隆(fluometuron)、氟黄胺草醚(fomesafen)、乳氟禾草灵(lactofen)、利谷隆(linuron)、异丙隆(isoproturon)、西玛津(simazine)、达草灭(norflurazon)、百草枯(paraquat)、敌草隆(diuron)、吡氟草胺(diflufenican)、氟吡酰草胺(picolinafen)、cinidon、稀禾定(sethoxydim)、肟草酮(tralkoxydim)、喹草酸(quinmerac)、异恶草胺(isoxaben)、溴苯腈(bromoxynil)、赛克津(metribuzin)和硝磺酮(mesotrione)。
本发明的HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂还可以与草甘膦和草铵膦组合用于耐受草甘膦的或耐受草铵膦的作物。
通常优选使用与下述除草剂组合的本发明化合物，所述除草剂对正在处理的作物有选择性并且在所用的施加率时补足受本发明这些化合物控制的杂草谱。通常还优选将本发明的化合物和其他互补性除草剂在相同时间作为组合制剂或作为罐混物施加。
术语“mut-HPPD核酸”指一种HPPD核酸，所述HPPD核酸具有从野生型HPPD核酸突变而来的序列并且向其中表达该核酸的植物赋予增加的“HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂”耐受性。另外，术语“突变的羟苯基丙酮酸双加氧酶(mut-HPPD)”指将野生型一级序列SEQIDNO:2、5、8、11、14、17、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、53、55、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、其变体、衍生物、同源物、直向同源物或旁系同源物的氨基酸替换为另一个氨基酸。表述“突变的氨基酸”将在下文用来指另一种氨基酸替换的氨基酸，因而指蛋白质的一级序列中突变的位点。
术语“mut-HST核酸”指一种HST核酸，所述HST核酸具有从野生型HST核酸突变而来的序列并且向其中表达该核酸的植物赋予增加的“HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂”耐受性。另外，术语“突变的尿黑酸茄呢基转移酶(mut-HST)”指将野生型一级序列SEQIDNO:48或50的氨基酸替换为另一个氨基酸。表述“突变的氨基酸”将在下文用来指另一种氨基酸替换的氨基酸，因而指蛋白质的一级序列中突变的位点。
本领域中已经描述了几种HPPD和它们的一级序列，尤其细菌如假单胞菌(Pseudomonas)(Ruetschi等人,Eur.J.Biochem.,205,459-466,1992，WO96/38567)，植物如拟南芥(WO96/38567，GenebankAF047834)或胡萝卜(WO96/38567，Genebank87257)、球孢子菌(Coccicoides)(GenebankCOITRP)的HPPD、芸苔属(Brassica)、棉花、集胞藻(Synechocystis)和番茄的HPPD(US7,297,541)、哺乳动物如小鼠或猪的HPPD。另外，已经描述人工HPPD序列，例如在US6,768,044；US6,268,549中描述；
在一个优选实施方案中，(i)的核苷酸序列包含SEQIDNO:1、51、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、52、54、56、68、69的序列或其变体或衍生物。
在一个特别优选的实施方案中，可用于本发明的mut-HPPD核酸包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:52的突变核酸序列或其变体或衍生物。
在另一个优选实施方案中，(ii)的核苷酸序列包含SEQIDNO:47或49的序列或其变体或衍生物。
另外，本领域技术人员将理解(i)或(ii)的核苷酸序列涵盖SEQIDNO:1、51、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、52、54、56、68、69的同源物、旁系同源物和直向同源物及分别地涵盖SEQIDNO:47或49的同源物、旁系同源物和直向同源物，如本文定义。
术语"变体"相对于某序列(例如，多肽或核酸序列如–例如–本发明的转录调节性核苷酸序列)而言意图指基本上相似的序列。对于包含可读框的核苷酸序列，变体包括因为遗传密码的简并性而编码与天然蛋白相同的氨基酸序列的那些序列。可以使用熟知的分子生物学技术鉴定天然存在的等位基因变体(如这些变体)，例如用聚合酶链反应(PCR)和杂交技术。变体核苷酸序列也包括合成衍生的核苷酸序列，如通过例如使用位点定向诱变法产生的那些核苷酸序列，并且对于可读框而言，编码天然蛋白，以及编码相对于天然蛋白而言具有氨基酸置换的多肽的那些核苷酸序列。通常，本发明的核苷酸序列变体将对SEQIDNO:1、51、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、52、54、56、68、69、47或49的核苷酸序列具有至少30、40、50、60至70％，例如优选71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％至79％、通常至少80％、例如、81％-84％、至少85％，例如86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％至98％和99％核苷酸“序列同一性”。“变体”多肽意指从SEQIDNO:2、5、8、11、14、17、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、53、55、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67的蛋白质通过对该天然蛋白的N-末端和/或C末端缺失(所谓截短)或添加一个或多个氨基酸；在该天然蛋白中一个或多个位点处缺失或添加一个或多个氨基酸，或置换该天然蛋白中一个或多个位点处的一个或多个氨基酸所衍生的多肽。此类变体可以例如因遗传多态性或因人类操作产生。用于此类操作的方法通常是本领域已知的。
在一个优选实施方案中，可用于本发明的多核苷酸的变体将与SEQIDNO:1或SEQIDNO:52的核苷酸序列具有至少30％、40％、50％、60％直到70％，例如优选71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、至79％、通常至少80％、例如，81％-84％、至少85％、例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％直到98％和99％核苷酸“序列同一性”。
认识到本发明的多核苷酸分子和多肽涵盖包含下述核苷酸或氨基酸序列的多核苷酸分子和多肽，所述核苷酸或氨基酸序列与SEQIDNO:1、51、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、52、54、56、68、69、47或49中所述的核苷酸序列或与SEQIDNO:2、5、8、11、14、17、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、53、55、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、48或50中所述的氨基酸序列足够相同。术语“充分相同”在本文中用来指含有足够或最小数目的与第二氨基酸或核苷酸序列相同或等同(例如具有相似侧链的)氨基酸残基或核苷酸的第一氨基酸或核苷酸序列，从而所述的第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有共同的结构性结构域和/或共同的功能活性。
“序列同一性”指两个最佳比对的DNA或氨基酸序列在组分(例如核苷酸或氨基酸)的整个比对窗口范围内不变的程度。测试序列和参考序列的已比对区段的“同一性分数”是由两个比对序列所共有的相同组分的数目除以参考序列区段(即完整的参考序列或参考序列的更小限定的部分)中组分的总数目。“％同一性”是同一性分数乘以100。用于比对比较窗口的最佳序列比对是本领域技术人员熟知的并且可以由以下工具实施：如Smith和Waterman的局部同源性算法、Needleman和Wunsch的同源性比对算法、Pearson和Lipman的相似性搜索方法，并且优选由这些算法的计算机化执行，如作为GCGWisconsinPackage(AccelrysInc.,Burlington,Mass.)的部分可获得的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA。
术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可互换地使用并且指任意长度的聚合非分支形式的核苷酸：核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，或这二者的组合。
蛋白质的“衍生物”包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，它们相对于所讨论的未修饰蛋白具有氨基酸置换、缺失和/或插入并且与作为所述肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶来源的未修饰蛋白具有相似的生物活性和功能活性。
蛋白质的“同源物”包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，它们相对于所讨论的未修饰蛋白具有氨基酸置换、缺失和/或插入并且与作为所述肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶来源的未修饰蛋白具有相似的生物活性和功能活性。
缺失指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸。
插入指向蛋白质中的预定位点引入一个或多个氨基酸残基。插入可以包含氨基端融合和/或羧基端融合以及单个或多个氨基酸的序列内插入。通常，在氨基酸序列内部的插入会比氨基端融合或羧基端融合更小，约1-10个残基级别。氨基端或羧基端融合蛋白或融合肽的实例包括如酵母双杂交系统中所用转录激活物的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、蛋白A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、-表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。
置换指蛋白质的氨基酸以具有相似特性(如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α-螺旋结构或β-折叠结构的倾向性)的其他氨基酸替换。氨基酸置换一般是单个残基的，不过可以是簇集性的，这取决于置于多肽上的功能性约束条件，并且可以为1到10个氨基酸变动；插入通常会是约1-10个氨基酸残基级别。氨基酸置换优选是保守性氨基酸置换。保守性置换表是本领域熟知的(见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.FreemanandCompany(编著))。
表3：保守性氨基酸置换的例子
残基 保守性置换 残基 保守性置换
Ala Ser Leu Ile；Val
Arg Lys Lys Arg；Gln
Asn Gln；His Met Leu；Ile
Asp Glu Phe Met；Leu；Tyr
Gln Asn Ser Thr；Gly
Cys Ser Thr Ser；Val
Glu Asp Trp Tyr
Gly Pro Tyr Trp；Phe
His Asn；Gln Val Ile；Leu
Ile Leu、Val
氨基酸置换、缺失和/或插入可以使用本领域熟知的肽合成技术如固相肽合成法等或通过重组DNA操作而容易地进行。用于操作DNA序列以产生蛋白质的置换、插入或缺失变体的方法是本领域熟知的。例如，用于在DNA中预定位点处产生置换突变的技术是本领域技术人员熟知的并且包括M13诱变法、T7-Gen体外诱变法(USB，Cleveland，OH)、QuickChange位点定向诱变法(Stratagene，SanDiego，CA)、PCR介导的位点定向诱变或其他位点定向诱变法。
“衍生物”还包括这样的肽、寡肽、多肽，其中与天然存在形式的蛋白质(如目的蛋白)的氨基酸序列相比，它们包含以非天然存在的氨基酸残基对氨基酸的取代或者非天然存在的氨基酸残基的添加。蛋白质的“衍生物”也包含这样的肽、寡肽、多肽，其中与所述多肽的天然存在形式的氨基酸序列相比，它们包含天然存在的改变(糖基化、酰化、异戊二烯化、磷酸化、肉豆蔻酰化、硫酸盐化等)的氨基酸残基或非天然改变的氨基酸残基。与衍生某种衍生物的氨基酸序列相比，该衍生物可以也包含与所述氨基酸序列共价或非共价结合的一个或多个非氨基酸置换或添加(例如报道分子或其它配体)，如为促进检测该衍生物而结合的报道分子，和与天然存在的蛋白质的氨基酸序列相对比的非天然存在的氨基酸残基。此外，“衍生物”也包括天然存在形式蛋白质与标签肽如FLAG、HIS6或硫氧还蛋白(对于标签肽的综述，见Terpe,Appl.Microbiol.Biotechnol.60,523-533,2003)的融合物。
“直向同源物”和“旁系同源物”涵盖用来描述基因祖先关系的进化概念。旁系同源物是相同物种内起源于先祖基因复制的基因；而直向同源物是来自不同生物的起源于物种形成的基因，并且也源自共同的祖先基因。表1中显示这类直向同源物的非限制例子列表。
本领域熟知，旁系同源物和直向同源物可以共有在给定位点(如特定底物的结合袋或与其他蛋白质相互作用的结合基序)携带合适氨基酸残基的不同结构域。
术语“结构域”指沿进化相关蛋白质的序列比对结果而在特定位置处保守的一组氨基酸。尽管在其他位置处的氨基酸可以在同源物之间不同，然而在特定位置处高度保守的氨基酸指示在蛋白质结构、稳定性或功能方面可能是必需的氨基酸。结构域因通过在蛋白质同源物家族的比对序列中的高保守程度而被鉴定，它们可以用作鉴定物以确定任意的所讨论多肽是否属于先前已鉴定的多肽家族。
术语“基序”或“共有序列”指在进化相关蛋白质的序列中的短保守区。基序往往是结构域的高度保守部分，不过也可以仅包括该结构域的部分，或可以位于保守结构域之外(若该基序的全部氨基酸位于定义的结构域之外)。
存在用于鉴定结构域的专业数据库，例如，SMART(Schultz等人，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95,5857-5864；Letunic等人，(2002)NucleicAcidsRes30,242-244)、InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31,315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994),Ageneralizedprofilesyntaxforbiomolecularsequencesmotifsanditsfunctioninautomaticsequenceinterpretation(引自)ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议文集.AltmanR.,BrutlagD.,KarpP.,LathropR.,SearlsD.编著，第53-61页,AAAIPress,MenloPark；Hulo等，Nucl.Acids.Res.32:D134-D137,(2004))或Pfam(Bateman等，NucleicAcidsResearch30(1):276-280(2002))。一组用于计算机芯片上分析蛋白质序列的工具是在ExPASY蛋白质组服务器上可获得的(瑞士生物信息研究所(Gasteiger等人,ExPASy:Theproteomicsserverforin-depthproteinknowledgeandanalysis,NucleicAcidsRes.31:3784-3788(2003))。也可以使用常规技术如通过序列比对鉴定结构域或基序。
用于比对序列以比较的方法是本领域熟知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch算法((1970)JMolBiol48:443-453)以找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个序列的总体(即，覆盖完整序列的)比对结果。BLAST算法(Altschul等人,(1990)JMolBiol215:403-10)计算序列同一性百分数并且进行两个序列之间相似性的统计分析。用于开展BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心(NCBI)可公开获得的。同源物可以使用例如ClustalW多重序列比对算法(版本1.83)，以默认配对比对参数和百分数评分方法轻易地鉴定。也可以使用MatGAT软件包中的可用方法之一确定总体相似性和同一性百分数(Campanella等，BMCBioinformatics.2003年7月10日；4:29.MatGAT:anapplicationthatgeneratessimilarity/identitymatricesusingproteinorDNAsequences))。如对本领域技术人员显而易见，可以进行少许手工编辑以优化保守基序之间的比对。此外，作为使用全长序列鉴定同源物的替代，也可以使用特定的结构域。使用上文提及的程序，使用默认参数，可以确定在完整核酸或氨基酸序列范围或所选结构域或保守基序范围内的序列同一性值。对于局部比对，Smith-Waterman算法是特别有用的(SmithTF,WatermanMS(1981)J.Mol.Biol147(1)；195-7)。
本发明的发明人已经令人惊讶地发现，与具有SEQIDNO:2、5、8、11、14、17、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、53、55、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67的野生型HPPD酶的活性相比，通过置换一个或多个关键氨基酸残基，可以显著增加除草剂耐受性或抗性。mut-HPPD的优选置换是增加植物的除草剂耐受性、但任由双加氧酶的生物活性基本上不受影响的那些置换。
因此，在本发明的另一个目的中，包含SEQIDNO:2、5、8、11、14、17、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、53、55、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的HPPD酶的关键氨基酸残基由任何其他氨基酸置换。
在一个实施方案中，HPPD酶、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物的关键氨基酸残基由如上表3中所述的保守氨基酸置换。
本领域技术人员将理解，也可以置换紧邻下文所提及的氨基酸位置而存在的氨基酸。因此，在另一个实施方案中，可用于本发明的mutHPPD包含SEQIDNO:2、5、8、11、14、17、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、53、55、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67的序列或其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中距关键氨基酸±3、±2或±1个氨基酸位置的氨基酸由任何其他氨基酸置换。
基于本领域熟知的技术，可以形成高度特征性序列样式，借助所述序列样式可以检索具有所需活性的其他mut-HPPD候选物。
本发明涵盖也将通过使用合适的序列样式检索其他mut-HPPD候选物。熟练的读者将理解本发明序列模式不受该模式的两个相邻氨基酸残基之间的确切距离限制。以上序列模式中两个相邻者之间的每个距离例如可以彼此独立地变动直至±10、±5、±3、±2或±1个氨基酸位置，而没有明显影响所需的活性。
与基于如根据本发明所获得的结晶学数据对各个氨基酸残基的上述功能性和空间分析相一致，可以鉴定作为潜在有用的本发明mut-HPPD候选物的特征的独特局部氨基酸序列。
在一个特别优选的实施方案中，mut-HPPD指SEQIDNO:2的变体或衍生物，其中置换选自下表4a。
表4a：(序列IDNo：2)：单氨基酸置换
关键氨基酸位置 置换物
Val212 Ile、Leu
Val213 Thr、Ala
Asn215 Ala、His
Ala236 Leu、Ser、Arg
Phe238 Val、Ala
Leu250 Val、Met
Ser252 Thr
Pro265 Ala
Asn267 Tyr、Gln
Gln278 His、Asn、Ser
Ile279 Thr
Arg309 Lys、Ala
Leu320 Asn；Gln，His，Tyr，
Pro321 Ala、Arg、Gly、Asn
Leu334 Glu、Cys
Leu353 Met、Tyr、Ala、Ser
Phe366 Ile；Leu，Tyr
Gly371 Ile、Phe
Thr375 Pro
Phe377 Ala、Leu、Ser
Gly403 Arg
Phe404 Leu、Pro
Lys406 Thr
Gly407 Cys、His
Phe409 Ile、His
Glu411 Thr
Leu412 Met、Phe、Trp、Ala、Ser
Ile416 Val、Phe
Ser410 Gly
Val254 Ala
应当理解，除上表中提到的那些氨基酸之外，任意氨基酸也可以用作置换物。检验此类突变体功能的测定法是本领域轻易可获得的并且在本发明的实施例部分分别描述。
在一个优选实施方案中，mut-HPPD的氨基酸序列在与SEQIDNO:2的以下一个或多个位置212、213、215、236、238、250、252、254、265、267、278、279、309、320、321、334、353、366、371、375、377、403、404、406、407、409、411、410、412或416相对应的位置处与野生型HPPD的氨基酸序列不同。
这些氨基酸位置处差异的例子包括但不限于以下一种或多种：
对应于位置236或在位置236处的氨基酸除丙氨酸之外；
对应于位置411或在位置411处的氨基酸除谷氨酸之外；
对应于位置320或在位置320处的氨基酸除亮氨酸之外；
对应于位置403或在位置403处的氨基酸除甘氨酸之外；
对应于位置334或在位置334处的氨基酸除亮氨酸之外；
对应于位置353或在位置353处的氨基酸除亮氨酸之外；
对应于位置321或在位置321处的氨基酸除脯氨酸之外；
对应于位置212或在位置212处的氨基酸除缬氨酸之外；
对应于位置407或在位置407处的氨基酸除甘氨酸之外；
对应于位置377或在位置377处的氨基酸除苯丙氨酸之外；
对应于位置412或在位置412处的氨基酸除亮氨酸之外；
对应于位置278或在位置278处的氨基酸除谷氨酰胺之外；
对应于位置406或在位置406处的氨基酸除赖氨酸之外；
对应于位置404或在位置404处的氨基酸除苯丙氨酸之外；
对应于位置409或在位置409处的氨基酸除苯丙氨酸之外；
对应于位置416或在位置416处的氨基酸除异亮氨酸之外；
对应于位置250或在位置250处的氨基酸除亮氨酸之外；
对应于位置267或在位置267处的氨基酸除天冬酰胺之外；
对应于位置252或在位置252处的氨基酸除丝氨酸之外；
对应于位置265或在位置265处的氨基酸除脯氨酸之外；
对应于位置371或在位置371处的氨基酸除甘氨酸之外；
对应于位置375或在位置375处的氨基酸除苏氨酸之外；
对应于位置309或在位置309处的氨基酸除精氨酸之外；
对应于位置279或在位置279处的氨基酸除异亮氨酸之外；
对应于位置366或在位置366处的氨基酸除苯丙氨酸之外；
对应于位置238或在位置238处的氨基酸除苯丙氨酸之外；
对应于位置213或在位置213处的氨基酸除缬氨酸之外；
对应于位置215或在位置215处的氨基酸除天冬酰胺之外；
对应于位置410或在位置410处的氨基酸除丝氨酸之外；
对应于位置254或在位置254处的氨基酸除缬氨酸之外；
在一些实施方案中，mutHPPD酶包含在以下位置具有一个或多个置换的SEQIDNO:2的多肽、其变体、衍生物、同源物或直向同源物：
对应于位置236或在位置236处的氨基酸是亮氨酸、丝氨酸或精氨酸；
对应于位置411或在位置411处的氨基酸是苏氨酸；
对应于位置320或在位置320处的氨基酸是天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸或酪氨酸；
对应于位置403或在位置403处的氨基酸是精氨酸；
对应于位置334或在位置334处的氨基酸是谷氨酸的酸或半胱氨酸；
对应于位置353或在位置353处的氨基酸是甲硫氨酸、酪氨酸、丙氨酸或丝氨酸；
对应于位置321或在位置321处的氨基酸是丙氨酸、精氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；
对应于位置212或在位置212处的氨基酸是异亮氨酸或亮氨酸；
对应于位置407或在位置407处的氨基酸是半胱氨酸或组氨酸；
对应于位置377或在位置377处的氨基酸是丙氨酸、亮氨酸或丝氨酸；
对应于位置412或在位置412处的氨基酸是甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丙氨酸或丝氨酸；
对应于位置278或在位置278处的氨基酸是组氨酸、天冬酰胺或丝氨酸；
对应于位置406或在位置406处的氨基酸是苏氨酸；
对应于位置404或在位置404处的氨基酸是亮氨酸或脯氨酸；
对应于位置409或在位置409处的氨基酸是异亮氨酸或组氨酸；
对应于位置416或在位置416处的氨基酸是缬氨酸或苯丙氨酸；
对应于位置250或在位置250处的氨基酸是缬氨酸或甲硫氨酸；
对应于位置267或在位置267处的氨基酸是酪氨酸或谷氨酰胺；
对应于位置252或在位置252处的氨基酸是苏氨酸；
对应于位置265或在位置265处的氨基酸是丙氨酸；
对应于位置371或在位置371处的氨基酸是异亮氨酸或苯丙氨酸；
对应于位置375或在位置375处的氨基酸是脯氨酸；
对应于位置309或在位置309处的氨基酸是赖氨酸或丙氨酸；
对应于位置279或在位置279处的氨基酸是苏氨酸；
对应于位置366或在位置366处的氨基酸是异亮氨酸、亮氨酸或酪氨酸；
对应于位置238或在位置238处的氨基酸是缬氨酸或丙氨酸；
对应于位置213或在位置213处的氨基酸是苏氨酸或丙氨酸；
对应于位置215或在位置215处的氨基酸是丙氨酸或组氨酸；
对应于位置410或在位置410处的氨基酸是甘氨酸；
对应于位置254或在位置254处的氨基酸是丙氨酸。
另外，本发明的发明人已经令人惊讶地发现，与野生型HPPD酶或已经置换仅一个氨基酸残基的HPPD酶的活性相比，通过将SEQIDNO:2的至少两个关键氨基酸残基置换为特定残基，可以显著地增加除草剂耐受性或抗性。因此，在本发明的另一个优选实施方案中，mut-HPPD的变体或衍生物涉及SEQIDNO:2的多肽，其中两个、三个、四个或五个关键氨基酸由另一个氨基酸残基置换。在表4b中描述了特别优选的双重、三重、四重或五重突变。
表4b：(相对于序列IDNo：2)：联合氨基酸置换
组合编号 关键氨基酸位置及其置换物
1 A236L、E411T
2 L320H、P321A
3 L320H、P321R
4 L320N、P321A
5 L320N、P321R
6 L320Q、P321A
7 L320Q、P321R
8 L320Y、P321A
9 L320Y、P321R
10 L353M、P321R
11 L353M、P321R、A236L
12 L353M、P321R、A236L、E411T
13 L353M、P321R、E411T
14 L353M、P321R、L320H
15 L353M、P321R、L320N
16 L353M、P321R、L320Q
17 L353M、P321R、L320Y
18 L353M、P321R、V212I
19 L353M、P321R、V212I、L334E
20 L353M、P321R、V212L、L334E
21 L353M、P321R、V212L、L334E、A236L
22 L353M、P321R、V212L、L334E、A236L、E411T
23 L353M、P321R、V212L、L334E、E411T
24 L353M、P321R、V212L、L334E、L320H
25 L353M、P321R、V212L、L334E、L320N
26 L353M、P321R、V212L、L334E、L320Q
27 L353M、P321R、V212L、L334E、L320Y
28 L353M、V212I
在一个特别优选的实施方案中，可用于本发明的包含SEQIDNO:2的多肽、其变体、衍生物、同源物、旁系同源物或直向同源物的mutHPPD酶包含以下一种或多种情况：对应于位置320或在位置320处的氨基酸是组氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺；氨基酸位置334是谷氨酸；氨基酸位置353是甲硫氨酸；对应于位置321或在位置321处的氨基酸丙氨酸或精氨酸；对应于位置212或在位置212处的氨基酸是异亮氨酸。
在一个尤其特别优选的实施方案中，mutHPPD涉及包含SEQIDNO:2的多肽，其中与位置320相对应或在位置320处的亮氨酸由组氨酸置换，并且与位置321相对应或在位置321处的脯氨酸由丙氨酸置换。
在另一个尤其特别优选的实施方案中，mutHPPD涉及包含SEQIDNO:2的多肽，其中与位置353相对应或在位置353处的亮氨酸置换为甲硫氨酸，与位置321相对应或在位置321处的脯氨酸置换为精氨酸，并且与位置320相对应或在位置320处的亮氨酸置换为天冬酰胺。
在另一个尤其特别优选的实施方案中，mutHPPD涉及包含SEQIDNO:2的多肽，其中与位置353相对应或在位置353处的亮氨酸置换为甲硫氨酸，与位置321相对应或在位置321处的脯氨酸置换为精氨酸，并且与位置320相对应或在位置320处的亮氨酸置换为谷氨酰胺。
在一个特别优选的实施方案中，mut-HPPD涉及SEQIDNO:53的变体或衍生物，其中置换选自下表4c。
表4c：(序列IDNo:53)：单氨基酸置换
应当理解，除上表中提到的那些氨基酸之外，任意氨基酸也可以用作置换物。检验此类突变体功能的测定法是本领域轻易可获得的并且在本发明的实施例部分分别描述。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD氨基酸序列在与SEQIDNO:53的以下位置相对应的一个或多个位置或在SEQIDNO:53的以下一个或多个位置处不同于HPPD的野生型氨基酸序列：
228、230、251、253、265、267、280、282、291、293、294、324、335、336、337、339、340、363、368、381、385、386、390、392、393、419、421、422、424、427、431、425、269。
这些氨基酸位置处差异的例子包括但不限于以下一种或多种：
对应于位置228或在位置228处的氨基酸除缬氨酸之外；
对应于位置230或在位置230处的氨基酸除天冬酰胺之外；
对应于位置251或在位置251处的氨基酸除丙氨酸之外；
对应于位置253或在位置253处的氨基酸除苯丙氨酸之外；
对应于位置265或在位置265处的氨基酸除亮氨酸之外；
对应于位置267或在位置267处的氨基酸除丝氨酸之外；
对应于位置280或在位置280处的氨基酸除脯氨酸之外；
对应于位置282或在位置282处的氨基酸除天冬酰胺之外；
对应于位置291或在位置291处的氨基酸除赖氨酸之外；
对应于位置293或在位置293处的氨基酸除谷氨酰胺之外；
对应于位置294或在位置294处的氨基酸除异亮氨酸之外；
对应于位置324或在位置324处的氨基酸除精氨酸之外；
对应于位置335或在位置335处的氨基酸除甲硫氨酸之外；
对应于位置336或在位置336处的氨基酸除脯氨酸之外；
对应于位置337或在位置337处的氨基酸除丝氨酸之外；
对应于位置339或在位置339处的氨基酸除脯氨酸之外；
对应于位置340或在位置340处的氨基酸除脯氨酸之外；
对应于位置363或在位置363处的氨基酸除谷氨酸之外；
对应于位置368或在位置368处的氨基酸除亮氨酸之外；
对应于位置381或在位置381处的氨基酸除苯丙氨酸之外；
对应于位置385或在位置385处的氨基酸除亮氨酸之外、
对应于位置386或在位置386处的氨基酸除甘氨酸之外；
对应于位置390或在位置390处的氨基酸除苏氨酸之外；
对应于位置392或在位置392处的氨基酸除苯丙氨酸之外；
对应于位置393或在位置393处的氨基酸除异亮氨酸之外；
对应于位置419或在位置419处的氨基酸除苯丙氨酸之外；
对应于位置421或在位置421处的氨基酸除赖氨酸之外；
对应于位置422或在位置422处的氨基酸除甘氨酸之外；
对应于位置424或在位置424处的氨基酸除苯丙氨酸之外；
对应于位置427或在位置427处的氨基酸除亮氨酸之外；
对应于位置431或在位置431处的氨基酸除异亮氨酸之外；
对应于位置425或在位置425处的氨基酸除丝氨酸之外；
对应于位置269或在位置269处的氨基酸除缬氨酸之外。
在一些实施方案中，mut-HPPD酶在与SEQIDNO:53的以下位置相对应的位置包含一个或多个置换：
对应于位置228或在位置228处的氨基酸是Thr或Ala；
对应于位置230或在位置230处的氨基酸是Ala或His；
对应于位置251或在位置251处的氨基酸是Ser或Arg；
对应于位置253或在位置253处的氨基酸是Val或Ala；
对应于位置265或在位置265处的氨基酸是Val或Met；
对应于位置267或在位置267处的氨基酸是苏氨酸；
对应于位置280或在位置280处的氨基酸是Ala；
对应于位置282或在位置282处的氨基酸是Tyr或Gln；
对应于位置291或在位置291处的氨基酸是Arg或Ala；
对应于位置293或在位置293处的氨基酸是丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、组氨酸、天冬酰胺或丝氨酸、优选组氨酸、天冬酰胺或丝氨酸；
对应于位置294或在位置294处的氨基酸是苏氨酸；
对应于位置324或在位置324处的氨基酸是Lys或Ala；
对应于位置335或在位置335处的氨基酸是丙氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸、优选Gln、Asn、His或Tyr；
对应于位置336或在位置336处的氨基酸是丙氨酸、精氨酸、Gly或Asn，优选丙氨酸或甘氨酸；
对应于位置337或在位置337处的氨基酸是丙氨酸、苏氨酸或脯氨酸、优选苏氨酸或脯氨酸；
对应于位置339或在位置339处的氨基酸缺失；
对应于位置340或在位置340处的氨基酸是甘氨酸；
对应于位置363或在位置363处的氨基酸是谷氨酰胺；
对应于位置368或在位置368处的氨基酸是甲硫氨酸或酪氨酸、优选甲硫氨酸；
对应于位置381或在位置381处的氨基酸是Ile；Leu或Tyr、优选异亮氨酸或亮氨酸；
对应于位置385或在位置385处的氨基酸是缬氨酸、丙氨酸、Gln或Asp、优选缬氨酸或天冬氨酸；
对应于位置386或在位置386处的氨基酸是Ile或Phe；
对应于位置390或在位置390处的氨基酸是Pro；
对应于位置392或在位置392处的氨基酸是丙氨酸、亮氨酸或丝氨酸、优选丙氨酸；
对应于位置393或在位置393处的氨基酸是Ala、Leu、Phe、Val、优选亮氨酸；
对应于位置419或在位置419处的氨基酸是Leu或Pro；
对应于位置421或在位置421处的氨基酸是苏氨酸；
对应于位置422或在位置422处的氨基酸是组氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸、优选组氨酸或半胱氨酸；
对应于位置424或在位置424处的氨基酸是Ile或His；
对应于位置427或在位置427处的氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸、Ala、Ser或Met、优选苯丙氨酸；
对应于位置431或在位置431处的氨基酸是Val或Phe；
对应于位置425或在位置425处的氨基酸是甘氨酸；
对应于位置269或在位置269处的氨基酸是丙氨酸。
另外，本发明的发明人已经发现，与野生型HPPD酶或已经置换仅一个氨基酸残基的HPPD酶的活性相比，通过将SEQIDNO:53的至少两个关键氨基酸残基置换为特定残基，可以显著地增加除草剂耐受性或抗性。因此，在本发明的另一个优选实施方案中，mut-HPPD的变体或衍生物涉及SEQIDNO:53的多肽、其同源物、直向同源物或旁系同源物，其中两个、三个、四个或五个关键氨基酸由另一个氨基酸残基置换。在表4d中描述了特别优选的双重、三重、四重或五重突变。
表4d：(相对于序列IDNo:53)：联合氨基酸置换
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala或Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala、Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln，并且对应于SEQIDNO:53的位置385或在SEQIDNO:53的位置385处的氨基酸是Ala、Val。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln，并且对应于SEQIDNO:53的位置385或在SEQIDNO:53的位置385处的氨基酸是Ala。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln，并且对应于SEQIDNO:53的位置385或在SEQIDNO:53的位置385处的氨基酸是Val。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln，并且对应于SEQIDNO:53的位置385或在SEQIDNO:53的位置385处的氨基酸是Ala。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln，并且对应于SEQIDNO:53的位置385或在SEQIDNO:53的位置385处的氨基酸是Val。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala、Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln，并且对应于SEQIDNO:53的位置385或在SEQIDNO:53的位置385处的氨基酸是Ala、Val，并且对应于SEQIDNO:53的位置393或在SEQIDNO:53的位置393处的氨基酸是Ala、Leu。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln，并且对应于SEQIDNO:53的位置385或在SEQIDNO:53的位置385处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置393或在SEQIDNO:53的位置393处的氨基酸是Ala。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln，并且对应于SEQIDNO:53的位置385或在SEQIDNO:53的位置385处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置393或在SEQIDNO:53的位置393处的氨基酸是Leu。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln，并且对应于SEQIDNO:53的位置385或在SEQIDNO:53的位置385处的氨基酸是Val，并且对应于SEQIDNO:53的位置393或在SEQIDNO:53的位置393处的氨基酸是Ala。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln，并且对应于SEQIDNO:53的位置385或在SEQIDNO:53的位置385处的氨基酸是Val，并且对应于SEQIDNO:53的位置393或在SEQIDNO:53的位置393处的氨基酸是Leu。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln，并且对应于SEQIDNO:53的位置385或在SEQIDNO:53的位置385处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置393或在SEQIDNO:53的位置393处的氨基酸是Ala。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln，并且对应于SEQIDNO:53的位置385或在SEQIDNO:53的位置385处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置393或在SEQIDNO:53的位置393处的氨基酸是Leu。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln，并且对应于SEQIDNO:53的位置385或在SEQIDNO:53的位置385处的氨基酸是Val，并且对应于SEQIDNO:53的位置393或在SEQIDNO:53的位置393处的氨基酸是Ala。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln，并且对应于SEQIDNO:53的位置385或在SEQIDNO:53的位置385处的氨基酸是Val，并且对应于SEQIDNO:53的位置393或在SEQIDNO:53的位置393处的氨基酸是Leu。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置385或在SEQIDNO:53的位置385处的氨基酸是Ala、Val，并且对应于SEQIDNO:53的位置393或在SEQIDNO:53的位置393处的氨基酸是Ala、Leu。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置385或在SEQIDNO:53的位置385处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置393或在SEQIDNO:53的位置393处的氨基酸是Ala。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置385或在SEQIDNO:53的位置385处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置393或在SEQIDNO:53的位置393处的氨基酸是Leu。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置385或在SEQIDNO:53的位置385处的氨基酸是Val，并且对应于SEQIDNO:53的位置393或在SEQIDNO:53的位置393处的氨基酸是Ala。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置385或在SEQIDNO:53的位置385处的氨基酸是Val，并且对应于SEQIDNO:53的位置393或在SEQIDNO:53的位置393处的氨基酸是Leu。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Ala、Trp、Phe、Leu、Ile、Val、Asn、Gln、His、Tyr、Ser、Thr、Cys，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala、Arg、Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Trp，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Trp，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Trp，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Phe，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Phe，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Phe，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Leu，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Leu，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Leu，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Ile，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Ile，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Ile，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Val，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Val，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Val，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Asn，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Asn，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Asn，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Gln，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Gln，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Gln，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是His，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是His，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是His，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Tyr，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Tyr，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Tyr，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Ser，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Ser，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Ser，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Thr，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Thr，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Thr，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Cys，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Cys，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Cys，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Ala、Trp、Phe、Leu、Ile、Val、Asn、Gln、His、Tyr、Ser、Thr、Cys，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala、Arg、Gly，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Trp，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Trp，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Trp，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Phe，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Phe，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Phe，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Leu，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Leu，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Leu，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Ile，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Ile，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Ile，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Val，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Val，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Val，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Asn，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Asn，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Asn，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Gln，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Gln，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Gln，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是His，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
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对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是His，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
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对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是His，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
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对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Tyr，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
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对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Tyr，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
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对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Ser，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Ser，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Ser，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
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对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Thr，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
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对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Thr，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Cys，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Cys，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Cys，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly，并且对应于SEQIDNO:53的位置363或在SEQIDNO:53的位置363处的氨基酸是Gln。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Ala、Trp、Phe、Leu、Ile、Val、Asn、Gln、His、Tyr、Ser、Thr、Cys，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala、Arg、Gly，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Ala、Pro、Thr，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Pro，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Thr，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Pro，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Thr，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Pro，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Thr，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Trp，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
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对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Trp，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Pro，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Trp，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Thr，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Trp，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Trp，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Pro，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Trp，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Thr，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Trp，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Trp，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Pro，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Trp，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Thr，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Phe，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Phe，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Pro，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Phe，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Thr，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Phe，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Phe，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Pro，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Phe，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Thr，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Phe，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
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对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Phe，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Pro，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
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对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Phe，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Thr，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
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对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Leu，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Pro，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
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对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Leu，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Thr，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
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对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Leu，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
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对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Leu，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Pro，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Leu，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Thr，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Leu，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Leu，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Pro，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
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对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Leu，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Thr，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
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对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Ile，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
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对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是His，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是His，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Pro，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
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对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是His，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Thr，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
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对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是His，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
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在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Cys，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Pro，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Cys，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Thr，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Cys，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Cys，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Pro，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Cys，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Arg，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Thr，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Cys，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Ala，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Cys，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Pro，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个优选实施方案中，mut-HPPD包含SEQIDNO:53的序列、其变体、衍生物、直向同源物、旁系同源物或同源物，其中：
对应于SEQIDNO:53的位置335或在SEQIDNO:53的位置335处的氨基酸是Cys，并且对应于SEQIDNO:53的位置336或在SEQIDNO:53的位置336处的氨基酸是Gly，并且对应于SEQIDNO:53的位置337或在SEQIDNO:53的位置337处的氨基酸是Thr，并且对应于SEQIDNO:53的位置339或在SEQIDNO:53的位置339处的氨基酸缺失，并且对应于SEQIDNO:53的位置340或在SEQIDNO:53的位置340处的氨基酸是Gly。
在另一个实施方案中，SEQIDNO:67的HPPD酶的变体或衍生物包含以下一个或多个置换：
与位置8相对应或在位置8处的丙氨酸由苏氨酸置换；
与位置68相对应或在位置68处的甘氨酸由丙氨酸置换；
在位置261处的缬氨酸由丙氨酸置换；
与位置301相对应或在位置301处的甲硫氨酸由异亮氨酸置换；
与位置327相对应或在位置327处的甲硫氨酸由亮氨酸置换；
与位置328相对应或在位置328处的丙氨酸由脯氨酸置换；
与位置331相对应或在位置331处的苏氨酸由脯氨酸置换；
与位置341相对应或在位置341处的精氨酸由谷氨酸置换；
与位置352相对应的或在位置352处的赖氨酸由天冬酰胺置换；
与位置360相对应或在位置360处的亮氨酸置换为甲硫氨酸；
与位置383相对应或在位置383处的亮氨酸置换为苯丙氨酸；
与位置414相对应或在位置414处的甘氨酸由天冬氨酸置换。
在另一个实施方案中，SEQIDNO:67的HPPD酶的变体或衍生物包含以下一个或多个置换：
与位置8相对应或在位置8处的丙氨酸由苏氨酸置换；
与位置44相对应或在位置44处的组氨酸由谷氨酰胺置换；
在位置68处的甘氨酸由丙氨酸置换；
与位置71相对应或在位置71处的丙氨酸由缬氨酸置换；
在位置98处的苯丙氨酸由亮氨酸置换；
与位置233相对应或在位置233处的苯丙氨酸由甲硫氨酸置换；
与位置253相对应或在位置253处的丙氨酸由苏氨酸置换；
与位置261相对应或在位置261处的缬氨酸由丙氨酸置换；
与位置301相对应或在位置301处的甲硫氨酸由异亮氨酸置换；
与位置316相对应或在位置316处的谷氨酰胺由精氨酸置换；
与位置327相对应或在位置327处的甲硫氨酸由亮氨酸置换；
与位置328相对应或在位置328处的丙氨酸由脯氨酸置换；
与位置331相对应或在位置331处的苏氨酸由脯氨酸置换；
与位置341相对应或在位置341处的精氨酸由半胱氨酸置换；
与位置352相对应的或在位置352处的赖氨酸由天冬酰胺置换；
与位置360相对应或在位置360处的亮氨酸置换为甲硫氨酸；
与位置383相对应或在位置383处的亮氨酸置换为苯丙氨酸；
与位置417相对应的或在位置417处的丝氨酸由甘氨酸置换。
在又一个优选的实施方案中，氨基酸序列与SEQIDNO:57的HPPD的氨基酸序列在对应于位置418或在位置418处不同。优选，对应于位置418或在位置418处的氨基酸除丙氨酸之外。更优选，对应于位置418或在位置418处的氨基酸是苏氨酸。
在又一个优选的实施方案中，氨基酸序列与SEQIDNO:57的HPPD的氨基酸序列在对应于位置237或在位置237处不同。优选，对应于位置237或在位置237处的氨基酸除丝氨酸之外。更优选，对应于位置237或在位置237处的氨基酸是亮氨酸。
在下表4e中列出相应位置，即待置换的优选位点
将处于技术人员知识范围内的是鉴定SEQIDNO:2、5、8、11、14、17、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、53、55、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67和分别地SEQIDNO:48或50的同源物、直向同源物和旁系同源物(如表1中描述的那些)之间共有的保守区域和基序。已经鉴定到可以代表合适结合基序的这类保守区域，可以选出与表4a和4b、4c和4d中所列的氨基酸相对应的氨基酸以置换为任何其他氨基酸，优选置换为如表3中所示的保守氨基酸，并且更优选置换为表4a和4b、4c和4d的氨基酸。
此外，本发明涉及一种通过使用mut-HPPD和/或通过使用mut-HST鉴定HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的方法，所述mut-HPPD由包含SEQIDNO:1、51、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、52、54、56、68、69的核苷酸序列或其变体或衍生物的核酸编码，所述mut-HST由包含SEQIDNO:47或49的核苷酸序列或其变体或衍生物的核酸编码。
所述方法包括步骤：
a)产生包含编码mut-HPPD的核酸的转基因细胞或植物，其中表达mut-HPPD；
b)向a)的转基因细胞或植物并向相同品种的对照细胞或植物施加HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂；
c)在施加所述HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂后测定转基因细胞或植物和对照细胞或植物的生长或生存力，并且
d)选择与转基因细胞或植物的生长相比引起对照细胞或植物生长减少的HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂。
“对照细胞”或“相似的野生型植物、植物组织、植物细胞或宿主细胞”分别意指缺少本文公开的本发明除草剂抗性特征和/或特定多核苷酸的植物、植物组织、植物细胞或宿主细胞。使用术语“野生型”因此不意图暗示植物、植物组织、植物细胞或其它宿主细胞在其基因组中缺少重组DNA，和/或不拥有与本文中所公开那些除草剂抗性特征相异的除草剂抗性特征。
另一个目的涉及一种鉴定编码mut-HPPD的核苷酸序列的方法，所述mut-HPPD抵抗或耐受HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂，所述方法包括：
a)产生编码mut-HPPD的核酸的文库，
b)通过在细胞或植物中表达每种所产生的编码mut-HPPD的核酸并且用HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂处理所述细胞或植物，筛选所述核酸的群体，
c)将所述编码mut-HPPD的核酸的群体提供的HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂耐受水平与编码对照HPPD的核酸提供的HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂耐受水平比较，
d)选出至少一个编码mut-HPPD的核酸，所述核酸提供与编码对照HPPD的核酸提供的耐受性水平相比显著增加的HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂耐受性水平。
在一个优选实施方案中，与编码对照HPPD的核酸提供的抗性或耐受性相比，步骤d)中选出的编码mut-HPPD的核酸提供细胞或植物针对HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂至少2倍的抗性或耐受性。
在又一个优选实施方案中，与编码对照HPPD的核酸提供的抗性或耐受性相比，步骤d)中选出的编码mut-HPPD的核酸提供细胞或植物针对HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂至少有2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍的抗性或耐受性。
可以通过以下方式确定抗性或耐受性：产生包含步骤a)的文库的核酸序列的转基因植物或宿主细胞，优选植物细胞，并且比较所述转基因植物与对照植物或宿主细胞、优选植物细胞。
另一个目的涉及一种鉴定含有核酸的植物或藻类的方法，所述核酸包含编码mut-HPPD或mut-HST的核苷酸序列，所述mut-HPPD或mut-HST抵抗或耐受HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂，所述方法包括：
a)在植物细胞或绿藻的培养物中确定HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的导致所述细胞死亡的有效量。
b)用诱变剂处理所述植物细胞或绿藻，
c)使所述诱变的细胞群体与a)中确定的有效量的HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂接触，
d)选择幸存于这些测试条件的至少一个细胞，
e)从d)中选择的细胞PCR扩增HPPD基因和/或HST基因并将其测序并且将这类序列分别与野生型HPPD或HST基因序列比较。
在一个优选实施方案中，所述诱变剂是甲磺酸乙酯(EMS)。
技术人员熟知的许多方法可用于获得合适的候选核酸以从多种不同潜在来源生物(包括微生物、植物、真菌、藻类、混合培养物等)以及DNA环境来源(如土壤)鉴定编码mut-HPPD的核苷酸序列。这些方法包括尤其制备cDNA或基因组DNA文库、使用适当简并的寡核苷酸引物、使用基于已知序列的探针或互补测定法(例如，依赖酪氨酸生长)以及使用诱变法和改组法以提供重组或改组的mut-HPPD编码序列。
包含编码候选HPPD和对照HPPD的序列的核酸可以在酵母中、在细菌宿主菌株中、在藻类中或在高等植物如烟草或拟南芥中表达，并且在不同浓度的所选择的HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂存在下，根据转化菌株或植物的目视指示表型筛选编码HPPD的序列的相对内在耐受性水平。根据例如GR50(减少50％生长的浓度)或MIC(最低抑制浓度)值，便利表述剂量反应和与这些指示表型(棕色的形成、生长抑制、除草效应等)相关的剂量反应的相对偏移，其中值增加对应于表达的HPPD的内在耐受性增加。例如，在基于细菌(如大肠杆菌)转化的相对快速的测定体系中，可以表达每种编码mut-HPPD的序列，例如，作为处于可控启动子如lacZ启动子的表达控制下的DNA序列并且例如通过使用合成性DNA，考虑如密码子使用等这类问题，目的在于尽可能获得不同HPPD序列的可比较表达水平。可以依赖不同浓度的所选择的HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂，任选在补充酪氨酸的培养基中，接种表达包含替代性候选HPPD序列的核酸的这类菌株，并且基于抑制棕色、褐黄病色素形成的程度和MIC，估计表达的HPPD酶的相对内在耐受性水平。
在另一个实施方案中，将候选核酸转化入植物材料以产生转基因植物，所述转基因植物再生成形态正常的能育植物，随后测量所述能育植物对选择的HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的差异性耐受性。使用合适选择标记如卡那霉素的许多适合转化方法、双元载体(如来自农杆菌的双元载体)和植物再生(例如从烟草叶盘再生)是本领域熟知的。任选地，对照植物种群同样地用表达对照HPPD的核酸转化。备选地，未转化的双子叶植物如拟南芥或烟草可以用作对照，因为在任何情况下，这种植物表达其自身的内源HPPD。在除草剂的一系列不同浓度，基于植物损伤、分生组织漂白症状等以正常方式评价一系列原代植物转化事件或其后代针对HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的除草剂耐受性水平的平均数和分布。这些数据可以根据例如从剂量/反应曲线推导的GR50值表述，所述剂量/反应曲线以“剂量”在x-轴上作图并且以“杀死百分数”、“除草效应”、“正在出苗的绿色植株数”等在y-轴上作图，其中GR50值增加对应于表达的HPPD的内在耐受性水平增加。除草剂可以在出苗前或出苗后适当地施加。
另一个目的涉及编码mut-HPPD的分离核酸，其中所述核酸通过如上文定义的方法可鉴定。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种由野生型或mut-HPPD核酸转化的植物细胞或这样一种植物细胞，所述植物细胞已经被突变以获得表达野生型或mut-HPPD核酸的植物，其中与植物细胞的野生型品种相比，核酸在植物细胞中的表达导致增加的针对HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的抗性或耐受性。
术语“表达/表达着”或“基因表达”意指一个特定基因或多个特定基因或特定遗传构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”尤其意指某个基因或多个基因或基因构建体转录成结构性RNA(rRNA、tRNA)或mRNA，所述mRNA随后翻译成或不翻译成蛋白质。该过程包括DNA的转录和所得mRNA产物的加工。
为了获得所需的效应，即，耐受或抵抗本发明的HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的植物，应当理解通过本领域技术人员已知的方法和手段“过量表达”至少一种核酸。
如本文中所用的术语“增加的表达“或“过量表达”意指相对于原有野生型表达水平是额外的任何形式表达。用于增加基因或基因产物的表达的方法是本领域内充分记录过的，并且包括例如由适宜启动子驱动的过量表达、使用转录增强子或翻译增强子。可以在非异源形式的多核苷酸的适宜位置(一般是上游)内引入作为启动子或增强子元件的分离核酸，以便上调编码目的多肽的核酸的表达。例如，内源性启动子可以通过突变、缺失和/或取代而在体内改变(见Kmiec，US5,565,350；Zarling等，WO9322443)，或可以将分离的启动子以相对于本发明基因的正确方向及距离引入植物细胞，以便控制基因表达。
如果需要多肽表达，则通常希望在多核苷酸编码区的3'末端包括多聚腺苷酸化区。多聚腺苷化区可以源自天然基因、来自多种其他植物基因或来自T-DNA。待添加的3'末端序列可以源自例如胭脂碱合酶基因或章鱼碱合酶基因或备选地来自另一种植物基因或较不优选来自任何其他真核基因。
内含子序列也可以添加至5'非翻译区(UTR)或部分编码性序列的编码序列上，以增加在胞浆内积累的成熟信息的量。已经证实可剪接内含子在植物表达构建体和动物表达构建体中转录单位内的包含在mRNA水平及蛋白质水平上增加基因表达至多达1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cellbiol.8:4395-4405；Callis等(1987)GensDev1:1183-1200)。此类内含子增强基因表达的作用一般在所述内含子置于转录单位的5'末端附近时最强烈。玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子的用途是本领域已知的。对于一般信息，见：《玉米手册》，第116章，编者Freeling和Walbot，Springer，N.Y.(1994)。
如本文中所提及的术语“引入”或“转化”包括外源性多核苷酸转移至宿主细胞内，无论用于转化的方法是什么。能够后续克隆性增殖(无论通过器官发生或胚发生)的植物组织可以用本发明的遗传构建体转化并且可以从中再生完整植物。所选的具体组织根据可用于并且最好适于正在进行转化的具体物种的克隆性增殖系统而变化。示例性靶组织包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、大配子体、愈伤组织、现存的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷酸可以瞬时或稳定地引入宿主细胞并且可以非整合地维持，例如作为质粒。备选地，多核苷酸可以整合至宿主基因组内。产生的转化植物细胞随后可以用来以本领域技术人员已知的方式再生出转化的植物。
外来基因转移至植物基因组内称作转化。植物物种的转化现在是相当常规的技术。有利地，几种转化方法中的任一方法可以用来将目的基因引入合适的祖先细胞。所述的用于转化植物组织或植物细胞并从植物组织或植物细胞再生出植物方法可以用于瞬时转化或用于稳定转化。转化方法包括使用脂质体、电穿孔法、增加游离DNA摄入的化学品、DNA直接注射至植物、粒子枪轰击法、使用病毒或花粉的转化法和显微投射法(microprojection)。转化方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇法(Krens，F.A.等人,(1982)Nature296,72-74；NegrutiuI等人,(1987)PlantMolBiol8:363-373)；原生质体的电穿孔法(ShillitoR.D.等人,(1985)Bio/Technol3,1099-1102))；对植物材料的微量注射法(CrosswayA等人,(1986)Mol.GenGenet202:179-185)；DNA或RNA涂布的粒子轰击法(KleinTM等人,(1987)Nature327:70)、用(非整合性)病毒感染等。转基因植物，包括转基因作物植物，优选通过农杆菌介导的转化法产生。有利的转化方法是在植物中的转化法。为此目的，例如有可能将农杆菌作用于植物种子或有可能用农杆菌接种植物分生组织。根据本发明，已经证明将转化的农杆菌悬液作用于完整植物或至少作用于花原基是特别有利的。随后继续培育该植物直至获得所处理植物的种子(Clough和Bent，PlantJ.(1998)16,35-743)。用于农杆菌介导的稻转化的方法包括用于稻转化的熟知方法，如以下任一文献中描述的那些方法：欧洲专利申请EP1198985A1、Aldemita和Hodges(Planta199:612-617,1996)；Chan等人(PlantMolBiol22(3):491-506,1993)、Hiei等人(PlantJ6(2):271-282,1994)，所述文献的公开内容通过引用的方式如同充分描述那样并入本文。在玉米转化的情况下，优选的方法如Ishida等人(Nat.Biotechnol14(6):745-50,1996)或Frame等人(PlantPhysiol129(1):13-22,2002)描述，其公开内容通过引用的方式如同充分描述那样并入本文。所述方法例如还在B.Jenes等人,TechniquesforGene,引自：TransgenicPlants,第1卷,EngineeringandUtilization,编者S.D.Kung和R.Wu,AcademicPress(1993)128-143和PotrykusAnnu.Rev.PlantPhysiol.PlantMolec.Biol.42(1991)205-225)中描述。待表达的核酸或构建体优选克隆至适于转化根癌农杆菌的载体，例如pBin19(Bevan等人,Nucl.AcidsRes.12(1984)8711)。由这种载体转化的农杆菌随后可以按照已知方式用于转化植物，例如作为模型使用的植物，如拟南芥属植物(拟南芥属于本发明的范围，不视为作物植物)，或作物植物，例如烟草植物，通过在农杆菌溶液中浸泡擦伤的叶或切碎的叶并随后将它们在合适培养基中培育。借助根癌农杆菌转化植物例如由和Willmitzer在Nucl.AcidRes.(1988)16，9877中描述，或尤其从F.F.White，用于高等植物中基因转移的载体(VectorsforGeneTransferinHigherPlants)；在TransgenicPlants，第1卷，EngineeringandUtilization，S.D.Kung和R.Wu编著，AcademicPress，1993，第15-38页中获知。
除了转化体细胞(其随后必需再生成完整植物)之外，也可以转化植物分生组织的细胞，并且尤其那些发育成配子的细胞。在这种情况下，转化的配子遵循天然的植物发育过程，产生转基因植物。因此，例如，将拟南芥种子用农杆菌处理并且从正在发育的植物获得种子，其中一定比例的所述植物被转化并且因此是转基因的[Feldman,KA和MarksMD(1987)MolGenGenet208:274-289；FeldmannK(1992),引自：CKoncz,N-HChua和JShell编著,MethodsinArabidopsisResearch.WordScientific,Singapore,第274-289页]。备选方法基于反复去掉花序并使莲座叶丛中心中的切除部位与转化的农杆菌温育，因而转化的种子同样可以在较晚的时间点获得(Chang(1994)PlantJ.5:551-558；Katavic(1994)MolGenGenet,245:363-370)。然而，尤其有效的方法是改良的真空渗入法，如“花浸染”法。在真空浸润拟南芥属植物的情况下，将完整的植物在减压下用农杆菌悬液处理[Bechthold,N(1993).CRAcadSciParisLifeSci,316:1194-1199]，而在“花浸染法”的情况下，将正在发育的花组织与表面活性剂处理的农杆菌混悬液短暂孵育[Clough,SJ和Bent,AF(1998)ThePlantJ.16,735-743]。在这两种情况下均收获某个比例的转基因种子，并且这些种子可以通过在如上所述的选择条件下培育而与非转基因种子区分。此外，质体的稳定转化是有利的，因为质体在大部分作物中以母系方式遗传，这降低或消除了转基因经花粉流动的风险。叶绿体基因组的转化一般通过已经在Klaus等人,2004[NatureBiotechnology22(2),225-229]中示意性展示的方法实现。简而言之，将待转化的序列连同选择标记基因一起克隆至与叶绿体基因组同源的侧翼序列之间。这些同源性侧翼序列指导位点特异性整合至原质体系内。已经对许多不同的植物物种描述了质体转化法，并且综述出自Bock(2001)Transgenicplastidsinbasicresearchandplantbiotechnology.JMolBiol.2001年9月21日；312(3):425-38或Maliga,P(2003)Progresstowardscommercializationofplastidtransformationtechnology,TrendsBiotechnol.21,20-28。其他的生物技术进展最近已经以无标记质体转化体的形式报道，其中所述无标记质体转化体可以通过瞬时共整合的标记基因产生(Klaus等人,2004,NatureBiotechnology22(2),225-229)。可以借助技术人员熟悉的全部方法再生出基因修饰的植物细胞。合适的方法可以在S.D.Kung和R.Wu,Potrykus或和Willmitzer的上述出版物中找到。
通常，在转化后，对植物细胞或细胞群体选择一个或多个标记的存在，其中所述的标记由连同目的基因一起被共转移的植物可表达基因编码，随后将转化的材料再生成完整植物。为了选出转化的植物，转化中所获得的植物材料原则上经历选择性条件，从而转化的植物可以与未转化的植物区分。例如，按上述方式获得的种子可以种植，并且在初始培育期后，经受喷洒所致的合适选择作用。另一种可能性在于将种子(如果适宜，在消毒后)在使用合适选择剂的琼脂板上培育，从而仅转化的种子可以长成植物。备选地，对转化的植物筛选选择标记(如上文所述的选择标记)的存在。
在DNA转移和再生后，也可以对推定转化的植物，例如使用DNA印迹分析，评价目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造。备选或额外地，可以使用RNA印迹分析和/或蛋白质印迹分析，监测新引入的DNA的表达水平，这两项技术均是本领域普通技术人员熟知的。
可以通过多种手段增殖产生的转化植物，如通过克隆性增殖或经典育种技术。例如，第一世代(或T1)转化植物可以自交并且可以选择纯合的第二世代(或T2)转化体，并且随后可以通过经典育种技术进一步增殖T2植物。产生的转化生物可以采取多种形式。例如，它们可以是转化细胞与非转化细胞的嵌合体；克隆性转化体(例如，全部细胞经转化以含有表达盒)；转化的组织的和未转化组织的移植体(例如，在植物中，向未转化的接穗嫁接的转化根砧木)。
优选，野生型或mut-HPPD核酸(a)或野生型或mut-HST核酸(b)包含选自以下的多核苷酸序列：a)如SEQIDNO:1、51、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、52、54、56、68、69中所示的多核苷酸或其变体或衍生物；b)如SEQIDNO:47或49中所示的多核苷酸或其变体或衍生物；c)编码如SEQIDNO:2、5、8、11、14、17、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、53、55、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67中所示的多肽的多核苷酸或其变体或衍生物；d)包含a)至c)中任一者任何的至少60个连续核苷酸的多核苷酸；和e)与a)至d)中任一者的多核苷酸互补的多核苷酸。
优选，与植物的野生型品种相比，核酸在植物中的表达导致增加的针对HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的抗性。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含本发明植物细胞的植物，优选转基因植物，其中与植物的野生型品种相比，核酸在植物中的表达导致植物增加的针对HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的抗性。
本文所述的植物可以是转基因作物植物或非转基因植物。
为本发明目的，“转基因的”、“转基因”或“重组”就核酸序列、包含该核酸序列的表达盒、遗传构建体或载体或用本发明核酸序列、表达盒或载体转化的生物而言意指不处于其天然遗传环境中或已经通过重组方法被修饰，全部这些构建体均通过重组方法产生，其中
(a)编码本发明方法中有用的蛋白质的核酸序列，或
(b)与本发明核酸序列有效连接的基因控制序列，例如启动子，或
(c)(a)和(b)
不处于其天然遗传环境中或已经通过重组方法被修饰，修饰有可能采取例如取代、添加、倒位或插入一个或多个核苷酸残基的形式。天然遗传环境理解为意指来源植物中的天然基因组基因座或染色体基因座或在基因组文库中存在的。在基因组文库的情况下，优选保留、至少部分地保留该核酸序列的天然遗传环境。该环境分布在该核酸序列的至少一侧并且具有至少50bp，优选至少500bp，特别优选至少1000bp，最优选至少5000bp序列长度。天然存在的表达盒–例如核酸序列的天然启动子与编码本发明方法中所用的多肽的对应核酸序列的天然存在组合，如上文所定义–当这种表达盒通过非天然性合成(“人工”)方法(如诱变处理)修饰时，变成转基因表达盒。合适的方法例如在US5,565,350或WO00/15815中描述。
为本发明目的，如上所述，将转基因植物因而理解为意指在本发明方法中使用的核酸不处在所述植物基因组中它们的天然基因座内，所述核酸有可能同源或异源地表达。然而，如所提及，转基因还意指尽管本发明核酸或在本发明方法中所用核酸处于植物基因组中该核酸的天然位置内，然而其序列相对于天然序列而言已经受到修饰，和/或所述天然序列的调节序列已经受到修饰。转基因优选理解为意指本发明核酸在基因组中的非天然基因座内表达，即发生核酸的同源表达或优选异源表达。在本文中提及优选的转基因植物。另外，术语“转基因的”指含有至少一种重组多核苷酸的全部或部分的任意植物、植物细胞、愈伤组织、植物组织或植物部分。在多种情况下，该重组多核苷酸的全部或部分稳定地整合至染色体或整合至稳定的染色体外元件，从而它被传递到后续世代中。出于本发明的目的，术语“重组多核苷酸”指已经通过基因工程予以改变、重排或修饰的多核苷酸。例子包括任何克隆的多核苷酸，或与异源序列连接或接合的多核苷酸。术语“重组”不指因天然存在的事件(如自发突变)或因非自发诱变随后选择性育种而产生的多核苷酸改变。
含有因非自发诱变和选择性育种所致突变的植物在本文中称作非转基因植物并且包括在本发明中。在其中植物是转基因的并且包含多个mut-HPPD核酸的实施方案中，核酸可以衍生自不同的基因组或衍生自相同的基因组。备选地，在其中植物是非转基因的并且包含多个mut-HPPD核酸的实施方案中，核酸位于不同的基因组上或位于相同的基因组上。
在某些实施方案中，本发明涉及通过突变育种法产生除草剂抗性植物。这类植物包含编码mut-HPPD和/或mut-HST的多核苷酸并且耐受一种或多种“HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂”。此类方法可以包括例如使植物或种子暴露于致变物、尤其化学致变物例如甲磺酸乙酯(EMS)，并且选择具有增强的针对至少一种或更多种HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的耐受性的植物。
然而，本发明并不限于通过包括化学诱变剂EMS在内的诱变方法产生的除草剂耐受性植物。本领域已知的任意诱变方法可以用来产生本发明的除草剂抗性植物。这类诱变方法可以涉及例如使用以下任一种或更多种诱变剂：辐射，如X-射线、γ射线(例如，钴60或铯137)、中子(例如，原子反应堆中铀235的核裂变产物)、β辐射(例如，从放射性同位素如磷32或碳14发射)和紫外辐射(优选250至290nm)和化学诱变剂如碱基类似物(例如，5-溴-尿嘧啶)、相关的化合物(例如8-乙氧咖啡因)、抗生素(例如链黑菌素)、烷基化剂(例如硫芥、氮芥、环氧化物、乙烯亚胺、硫酸酯、磺酸酯、砜、内酯)、叠氮化物、羟胺、亚硝酸或吖啶。除草剂抗性植物也可以使用选择植物细胞的组织培养方法产生，所述的组织培养方法包括产生除草剂抗性突变并随后从中再生除草剂抗性植物。例如，参见美国专利号5,773,702和5,859,348，两者均通过引用的方式完整地并入本文。突变育种法的进一步细节可以在“"PrincipalsofCultivarDevelopment”Fehr,1993MacmillanPublishingCompany中找到，其中所述文献的公开内容通过过引用的方式并入本文。
除非由上下文另外清晰地指明，否则除上文的定义之外，术语“植物”意在包括处于任何成熟或发育阶段的作物植物，以及取自或源自任意这种植物的任何组织或器官(植物部分)。植物部分包括但不限于茎、根、花、胚珠、雄蕊、叶、胚胎、分生组织区、愈伤组织、花药培养物、配子体、孢子体、花粉、小孢子、原生质体等。
本发明的植物包含至少一种mut-HPPD核酸或过量表达的野生型HPPD核酸，并且与植物的野生型品种相比，具有增加的针对HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的耐受性。本发明的植物可能具有来自不同基因组的多种野生型或mut-HPPD核酸，原因在于这些植物可能含有多于一个基因组。例如，植物含有两个基因组，通常称作A基因组和B基因组。因为HPPD是必需的代谢酶，所以假定每个基因组具有编码HPPD酶的至少一个基因(即至少一个HPPD基因)。如本文所用，术语“HPPD基因座”指HPPD基因在基因组上的位置，并且术语“HPPD基因”和“HPPD核酸”指编码HPPD酶的核酸。每个基因组上的HPPD核酸在其核苷酸序列方面不同于另一个基因组上的HPPD核酸。本领域技术人员可以通过本领域技术人员已知的遗传杂交和/或测序法或核酸外切酶消化法，确定每个HPPD核酸的起源基因组。
本发明包括包含一个、两个、三个或更多个mut-HPPD等位基因的植物，其中与该植物的野生型品种相比，所述植物具有增加的针对HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的耐受性。mut-HPPD等位基因可以包含选自以下的核苷酸序列：如SEQIDNO:1、51、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、52、54、56、68、69中所限定的多核苷酸或其变体或衍生物，编码如SEQIDNO:2、5、8、11、14、17、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、53、55、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67中所限定的多肽的多核苷酸或其变体或衍生物、同源物、直向同源物、旁系同源物、包含前述任何多核苷酸的至少60个连续核苷酸的多核苷酸；和与前述任何多核苷酸互补的多核苷酸。
“等位基因”或“等位变体”是给定基因的替代形式，位于相同染色体位置内。等位变体包括单核苷酸多态性(SNP)，以及小插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的尺寸通常小于100bp。SNP和INDEL形成在大部分生物的天然存在的多态性株系中的序列变体的最大集合。
术语“品种”指物种内部通过共有共同特征或性状集合所限定的一组植物，所述共同特征或性状集合由本领域技术人员接受作为足以区分一个栽培品种或品种与另一个栽培品种或品种。在任何术语中均不存在下述暗示：任何给定栽培品种或品种的全部植物将在全基因水平或分子水平上是遗传相同的或任何给定的植物将在全部基因座纯合。如果纯合的栽培品种或品种自我授粉后全部后代均含有特定性状，则认为该栽培品种或品种对该性状“纯合”。术语“繁育系”或“株系”指栽培品种内部通过共有共同特征或性状集合所限定的一组植物，所述共同特征或性状集合由本领域技术人员接受作为足以区分一个繁育系或株系与另一个繁育系或株系。在任何术语中均不存在下述暗示：任何给定繁育系或株系的全部植物将在全基因水平或分子水平是遗传相同的或任何给定的植物将在全部基因座纯合。如果纯合繁育系或繁育系自我授粉后全部后代均含有特定性状，则认为该繁育系或株系对该性状“纯合”。在本发明中，性状因植物或种子的HPPD基因中的突变所致。
在一些实施方案中，使用传统植物育种法，由此在所得的后代植物中引入耐受HPPD抑制性除草剂状。在一个实施方案中，本发明提供一种产生耐受HPPD抑制性除草剂的后代植物的方法，所述方法包括：将亲本植物与耐受HPPD抑制性除草剂的植物杂交以将耐受HPPD抑制性除草剂的植物的耐受HPPD抑制性除草剂的特征引入后代植物的种质中，其中后代植物相对亲本植物具有增加的针对HPPD抑制性除草剂的耐受性。在其他实施方案中，该方法还包括步骤：通过传统植物育种技术将耐受HPPD抑制性除草剂的特征种质渗入，以获得具有耐受HPPD抑制性除草剂的特征的后代植物。
包含编码mut-HPPD和/或mut-HST的多核苷酸的本发明抗除草剂植物也用于通过涉及有性繁殖的常规植物育种法提高植物的除草剂抗性的方法中。所述方法包括将作为本发明除草剂抗性植物的第一植物与第二植物杂交，其中所述的第二植物可以抵抗或可以不抵抗与第一植物相同的除草剂，或可以抵抗与第一植物不同的除草剂。第二植物可以是与所述第一植物杂交时，能够产生有活力的子代植物(即种子)的任意植物。通常，但非必定，第一植物和第二植物属于相同的物种。这些方法可以任选地涉及选择后代植物，所述后代植物包含第一植物的mut-HPPD和/或mut-HST多肽和第二植物的除草剂抗性特征。与第一或第二植物或这两种植物比较时，由本发明的这种方法产生的子代植物具有提高的除草剂抗性。当第一和第二植物抵抗不同的除草剂时，所述子代植物会具有所述第一和第二植物的联合除草剂耐受特征。本发明的方法还可以包括第一次杂交的子代植物与这种植物回交的一个或多个世代，所述的植物具有与第一或第二植物相同的品系或基因型。备选地，第一次杂交或任意后续杂交的子代可以与第三植物杂交，其中所述的第三植物具有不同于第一或第二植物的不同品系或基因型。本发明也提供用本发明的至少一种多核苷酸分子、表达盒或转化载体所转化的植物、植物器官、植物组织、植物细胞、种子和非人宿主细胞。此类转化的植物、植物器官、植物组织、植物细胞、种子和非人宿主细胞针对在这样的除草剂水平上的至少一种除草剂具有增强的耐受性或抗性，所述的除草剂水平分别杀死非转化的植物、植物组织、植物细胞或非人宿主细胞或抑制其生长。优选，本发明的转化的植物、植物组织、植物细胞和种子是拟南芥和作物植物。
在其他方面，本发明的植物包括这些些植物，其中除耐受HPPD抑制性除草剂之外，所述植物已经通过育种、诱变或基因工程经历进一步基因修饰，例如已经因常规育种或基因工程方法而使其变得耐受施加其他特定类别的除草剂，如AHAS抑制剂；植物生长激素除草剂；漂白性除草剂如羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)抑制剂或八氢番茄红素去饱和酶(PDS)抑制剂；EPSPS抑制剂如草甘膦；谷氨酰胺合成酶(GS)抑制剂如草铵膦；脂质生物合成抑制剂如乙酰CoA羧化酶(ACCase)抑制剂；或苯腈类{即溴苯腈(bromoxynil)或碘苯腈(ioxynil))除草剂。因此，可以通过多基因修饰，使得耐受HPPD抑制性除草剂的本发明植物抵抗多个类别的除草剂，如同时对草甘膦和草铵膦的抗性或同时对草甘膦和来自另一个类别的除草剂如HPPD抑制剂、AHAS抑制剂或ACCase抑制剂的抗性。这些除草剂抗性技术例如在如下文献中描述：PestManagementScience(卷，年，页)：61,2005,246；61,2005,258；61,2005,277；61,2005,269；61,2005,286；64,2008,326；64,2008,332；WeedScience57,2009,108；AustralianJournalofAgriculturalResearch58,2007,708；Science316,2007,1185；和其中引用的参考文献。例如，在一些实施方案中，耐受HPPD抑制性除草剂的本发明植物可以耐受ACCase抑制剂，如“dim类”{例如，噻草酮(cycloxydim)、稀禾定(sethoxydim)、烯草酮(clethodim)或醌肟草(tepraloxydim))、“fop类”{例如，炔草酸(clodinafop)、氯甲草(diclofop)、吡氟禾草灵(fluazifop)、氟吡禾灵(haloxyfop)或喹禾灵(quizalofop))和“den类”(如唑啉草酯(pinoxaden))；耐受植物生长激素除草剂，如麦草畏(dicamba)；耐受EPSPS抑制剂，如草甘膦；耐受其他HPPD抑制剂；及耐受GS抑制剂，如草铵膦。
除这些类别的抑制剂之外，耐受HPPD抑制性除草剂的本发明植物也可以耐受具有其他作用模式的除草剂，例如，叶绿素/类胡萝卜素色素抑制剂、细胞膜破坏剂、光合作用抑制剂、细胞分裂抑制剂、根抑制剂、苗抑制剂及其组合。
这类耐受性性状可以例如表现为突变体或野生型HPPD蛋白，表现为突变体AHASL蛋白、突变体ACCase蛋白、突变体EPSPS蛋白质，或突变体谷氨酰胺合成酶蛋白；或表现为突变体天然、近交或转基因芳氧基链烷酸酯双加氧酶(AAD或DHT)、卤代芳腈水解酶(BXN)、2,2-二氯丙酸脱卤素酶(DEH)、草甘膦-N-乙酰转移酶(GAT)、草甘膦脱羧酶(GDC)、草甘膦氧化还原酶(GOX)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、膦丝菌素乙酰转移酶(PAT或bar)或具有除草剂降解活性的CYP450s蛋白。耐受HPPD抑制性除草剂的本发明植物也可以与其他性状堆叠，所述其他性状包括但不限于杀虫性状如BtCry和对鞘翅类，鳞翅类，线虫或其他害虫具有杀虫活性的其他蛋白质；营养或营养药性状如调节的含油量或油谱性状、高蛋白质或高氨基酸浓度性状，和本领域已知的其他类型性状。
另外，在其他实施方案中，还涵盖耐受HPPD抑制性除草剂的植物，其中通过使用重组DNA技术和/或通过育种和/或否则选择用于这类特征的其他方法，使得所述植物能够合成一种或多种杀虫蛋白，尤其来自细菌属芽孢杆菌属(Bacillus)、特别地来自苏云金芽孢杆菌的那些已知蛋白，如[δ]-内毒素，例如CrylA(b)、CrylA(c)、CrylF，CryIF(a2)、CryllA(b)、CrylllA、CrylllB(bl)或Cry9c；营养期杀虫蛋白(VIP)，例如VIP1、VIP2、VIP3或VIP3A；线虫定植性细菌例如光杆状菌属某些物种(Photorhabdusspp.)或致病杆菌属某些物种(Xenorhabdusspp.)的杀虫蛋白；动物产生的毒素，如蝎毒素、蛛形动物毒素、胡峰毒素或其他的昆虫特异性神经毒素；真菌产生的毒素，如链霉菌毒素、植物凝集素，如豌豆凝集素或大麦凝集素；凝集素(agglutinin)；蛋白酶抑制剂如胰蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、patatin、半胱氨酸蛋白酶抑制剂或木瓜蛋白酶抑制剂；核糖体失活蛋白(RIP)，如蓖麻毒蛋白、玉蜀黍-RIP、相思豆毒蛋白、软瓜蛋白、肥皂草毒蛋白或异株泻根毒蛋白(bryodin)；类固醇代谢酶，如3-羟类固醇化酶、蜕皮甾醇-IDP-葡糖基转移酶、胆固醇氧化酶、蜕皮激素抑制剂或HMG-CoA-还原酶；离子通道阻滞剂，如钠通道阻滞剂或钙通道阻滞剂；保幼激素酯酶；利尿激素受体(helicokinin受体)；苯乙烯合酶(stilbensynthase)、联苄合酶、几丁质酶或葡聚糖酶。在本发明的上下文中，这些杀虫蛋白或毒素应当明确地还理解为前毒素、杂合蛋白、截短或修饰的蛋白质。杂合蛋白以蛋白质结构域的新组合为特征(见，例如WO02/015701)。这些毒素或能够合成这些毒素的基因修饰植物的其他例子在例如EP-A374753、WO93/007278、WO95/34656、EP-A427529、EP-A451878、WO03/18810和WO03/52073中公开。用于产生此类基因修饰植物的方法通常是本领域技术人员已知的并且在例如上文提到的出版物中描述。基因修饰植物中所含有的这些杀虫蛋白赋予产生这些蛋白质的植物针对来自节肢动物全部分类群的害虫，尤其针对甲虫(鞘翅目(Coeloptera))、双翅昆虫目(双翅目(Diptera)和蛾(鳞翅目(Lepidoptera))以及针对线虫(Nematoda)的耐受性。
在一些实施方案中，一种或多种蛋白质毒素(例如，杀虫蛋白)在耐受HPPD抑制性除草剂的植物中的表达有效控制例如包括以下纲和目成员的生物：鞘翅目(Coleoptera)如美洲大豆象(菜豆象(Acanthoscelidesobtectus))；叶甲(杨毛臀萤叶甲(Agelasticaalni))；叩甲(直条叩甲(Agrioteslineatus)、暗色叩甲(Agriotesobscurus)、二色叩甲(Agriotesbicolor))；谷盗(米扁虫(Ahasverusadvena))；马铃薯鳃金龟(summerschafer，Amphimallonsolstitialis)；家俱窃蠹(furniturebeetle，Anobiumpunctatum)；花象属物种(Anthonomusspp.)(象鼻虫)；甜菜隐食甲(Pygmymangoldbeetle，Atomarialinearis)；地毯甲虫类(圆皮蠹属物种(Anthrenusspp.)、毛皮蠹属(Attagenusspp.))；豇豆象(四纹豆象(Callosobruchusmaculates))；干果甲虫(黄斑露尾甲(Carpophilushemipterus))；卷心菜荚象甲(白菜房原象甲(Ceutorhynchusassimilis))；冬油菜茎象甲(Ceutorhynchuspicitarsis)；线虫(烟草金针虫(Conoderusvespertinus)和Conoderusfalli)；香蕉象甲(Cosmopolitessordidus)；新西兰草地蛴螬(新西兰草金龟(Costelytrazealandica))；六月金龟(绿六月花金龟(Cotinisnitida))；向日葵茎象(Cylindrocopturusadspersus)；火腿皮蠹(Dermesteslardarius)；玉米根虫(玉米根萤叶甲(Diabroticavirgifera))、Diabroticavirgiferavirgifera和巴氏根萤叶甲(Diabroticabarberi)；墨西哥豆瓢虫(Epilachnavarivestis)；北美家天牛(Hylotropesbajulus)；紫苜蓿叶象(Hyperapostica)；裸蛛甲(Gibbiumpsylloides)；烟草甲(Lasiodermaserricorne)；科罗拉多马铃薯甲虫(马铃薯叶甲(Leptinotarsadecemlineata))；粉蠹属(Lyctus)甲虫{粉蠹属某些物种、露尾甲(油菜花露尾甲(Meligethesaeneus))；五月鳃金龟(Melolonthamelolontha)；美洲蜘蛛甲(Meziumamericanum)；goldenspiderbeetle，Niptushololeucs；谷盗类(锯谷盗(Oryzaephilussurinamensis)和大眼锯谷盗(OryzaephilusMercator))；葡萄黑耳喙象(Otiorhynchussulcatus)；芥甲虫(辣根猿叶甲(Phaedoncochleariae))、十字花科植物跳甲(蔬菜黄条跳甲(Phyllotretacruciferae))；黄曲条跳甲(Phyllotretastriolata)；卷心菜茎跳甲(油菜蚤跳甲(Psylliodeschrysocephala))；蛛甲属(Ptinus)某些物种(蜘甲)；谷蠹(Rhizoperthadominica)；豌豆象(条纹根瘤象甲(Sitonalineatus))；米象和谷象(米象(Sitophilusoryzae)和谷象(Sitophilusgranaries))；红色瓜子象(黄褐小爪象(Smicronyxfulvus))；窃蠹(药材甲(Stegobiumpaniceum))；大黄粉虫(黄粉虫(Tenebriomolitor))、粉甲(赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)和杂拟谷盗(Triboliumconfusum))；仓库和橱柜甲虫{斑皮蠹属(Trogoderma)某些物种；向日葵叶甲(Zygogrammaexclamationis)；革翅目(Dermaptera)(蠼螋类)如欧洲球螋(普通蠼螋(Forficulaauricularia)和河岸蠼螋(Labidurariparia)；网翅目(Dictyoptera)如东方蜚蠊(Blattaorientalis)；温室马陆(Oxidusgracilis)；甜菜潜叶萧(Pegomyiabetae)；欧小萧(fritfly)(黑麦秆萧(Oscinellafrit))；果萧(实萧属(Dacus)某些物种、果萧属(Drosophila)某些物种)；等翅目(Isoptera)(白蚁类)包括来自草白蚁科(Hodotermitidae)、木白蚁科(Kalotermitidae)、澳白蚁科(Mastotermitidae)、鼻白蚁科(Rhinotermitidae)、齿白蚁科(Serritermitidae)、白蚁科(Termitidae)、原白蚁科(Termopsidae)的物种；美洲牧草盲蝽(Lyguslineolaris)；黑豆蚜(Aphisfabae)；棉花蚜或甜瓜蚜(棉蚜(Aphisgossypii))；苹果绿蚜(苹果蚜(Aphispomi))；橘刺粉虱(茶园黑刺粉虱(Aleurocanthusspiniferus))；甘薯粉虱(烟粉虱(Bemesiatabaci))；甘蓝蚜(Brevicorynebrassicae)；梨黄木虱(Cacopsyllapyricola)；黑醋栗蚜(茶藨隐瘤蚜(Cryptomyzusribis))；葡萄根瘤蚜(Daktulosphairavitifoliae)；柑橘木虱(Diaphorinacitri)；马铃薯微叶蝉(蚕豆微叶蝉(Empoascafabae))；beanleafhopper(EmpoascaSolana)；假眼小绿叶蝉(vineleafhopper，Empoascavitis)；绵蚜(苹果绵蚜(Eriosomalanigerum))；欧洲果蚧(水木球蜡蚧(Eulecaniumcorni))；桃粉蚜(桃大尾蚜(Hyalopterusarundinis))；灰飞虱(Laodelphaxstriatellus)；马铃薯蚜(马铃薯长管蚜(Macrosiphumeuphorbiae))；桃蚜(Myzuspersicae)；黑尾叶蝉(Nephotettixcinticeps)；褐飞虱(Nilaparvatalugens)；蛇麻蚜(蛇麻疣额蚜(Phorodonhumuli))；黍缢蚜(禾谷缢管蚜(Rhopalosiphumpadi))；麦长管蚜(Sitobionavenae)；鳞翅目(Lepidoptera)如棉褐带卷蛾(Adoxophyesorana，summerfruittortrixmoth)；果黄卷蛾(Archipspodana)(果树梢卷蛾)；梨潜蛾(Bucculatrixpyrivorella，pearleafminer)；棉潜蛾(Bucculatrixthurberiella，cottonleafperforator)；松尺蠖(Bupaluspiniarius，pinelooper)；苹果蠹蛾(Carpocapsapomonella，codlingmoth)；二化螟(Chilosuppressalis，stripedriceborer)；云杉卷叶蛾(Choristoneurafumiferana，easternsprucebudworm)；条纹向日葵螟(Cochylishospes)(带纹向日葵蛾)；西南玉米杆草螟(Diatraeagrandiosella)(西南玉米螟)；环针单纹卷蛾(Eupoeciliaambiguella，Europeangrapeberrymoth)；棉铃虫(Helicoverpaarmigera)(棉铃虫)；谷实夜蛾(Helicoverpazea)(棉铃虫)；烟蚜夜蛾(Heliothisvirescens)(烟夜蛾幼虫)、向日葵斑螟(Homeosomaelectellum)(向日葵蛾)；后黄卷叶蛾(Homonamagnanima，orientalteatreetortrixmoth)；苹细蛾(Lithocolletisblancardella，Spottedtentiformleafminer)；舞毒娥(Lymantriadispar)(gypsymoth)；黄褐天幕毛虫(Malacosomaneustria)(天幕毛虫)；甘蓝夜蛾(Mamestrabrassicae，cabbagearmyworm)；蓓带夜蛾(Mamestraconfigurata，Berthaarmyworm)；冬尺蛾(Operophterabrumata，wintermoth)；欧洲玉米螟(Ostrinianubilalis，Europeancornborer)、小眼夜蛾(Panolisflammea，松美蛾(pinebeautymoth)、柑桔潜叶蛾(Phyllocnistiscitrella，citrusleafminer)；大菜粉蝶(Pierisbrassicae)(菜粉蝶)；薄荷灰夜蛾(Rachiplusiani)(大豆尺蠖)；甜菜夜蛾(Spodopteraexigua，beetarmywonn)；海灰翅夜蛾(Spodopteralittoralis，cottonleafworm)；棉大卷叶螟(Syleptaderogata，cottonleafroller)；粉纹夜蛾(Trichoplusiani)(甘蓝尺蠖)；直翅目(Orthoptera)如家蟋(Achetadomesticus)、树蝗类(Anacridiumspp.)、飞蝗(Locustamigratoria)、双带黑蝗(Melanoplusbivittatus)、异黑蝗(Melanoplusdifferentialis)、红足黑蝗(Melanoplusfemurrubrum)、飞蝗(血黑蝗(Melanoplussanguinipes))、北方蝼蛄(六指蝼蛄(Neocurtillahexadectyla))、红翅蝗(Nomadacrisseptemfasciata)、短翅蝼蛄(Scapteriscusabbreviatus)、南方蝼蛄(Scapteriscusborellii)、褐色蝼蛄(Scapteriscusvicinus)和沙漠蝗(Schistocercagregaria)；综合亚纲(Symphyla)如白松虫(Scutigerellaimmaculata)；缨翅目(Thysanoptera)如烟蓟马类(烟蓟马(Frankliniellafusca))、花蓟马类(花蓟马(Frankliniellaintonsa))、西花蓟马类(西花蓟马(Frankliniellaoccidentalism))、棉芽蓟马(梳缺花蓟马(Frankliniellaschultzei))、温室条篱蓟马(Hercinothripsfemoralis))、大豆蓟马类(Neohydatothripsvariabilis)、椪柑蓟马(柑桔黄绿蓟马(Pezothripskellyanus))、鳄梨蓟马(Scirtothripsperseae)、甜瓜蓟马(棕榈蓟马(Thripspalmi))和洋葱蓟马类(烟蓟马(Thripstabaci))等以及包含前述一种或多种生物的组合。
在一些实施方案中，一种或多种蛋白质毒素(例如，杀虫蛋白)在耐受HPPD抑制性除草剂的植物中的表达有效控制跳甲虫，即叶甲科(Chrysomelidae)跳甲族的成员、优选对抗条跳甲属物种(Phyllotretaspp.)、如蔬菜黄条跳甲(Phyllotretacruciferae)和/或Phyllotretatriolata。在其他实施方案中、一种或多种蛋白质毒素(例如、杀虫蛋白)在耐受HPPD抑制性除草剂的植物中的表达有效控制卷心菜荚象甲(seedpodweevil)、蓓带夜蛾(Berthaarmyworm)、草盲蝽(Lygusbugs)或小菜蛾(diamondbackmoth)。
应当理解除mut-HPPD核酸之外，本发明的植物可以包含野生型HPPD核酸。构思了耐受HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的株系可以在多种HPPD同工酶的仅一种同工酶中含有突变。因此，本发明包括了除一种或多种野生型HPPD核酸之外还包含一种或多种mut-HPPD核酸的植物。
在另一个实施方案中，本发明涉及由包含本发明植物细胞的转基因植物产生的种子，其中与种子的野生型品种相比，种子对于增加的针对HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的抗性是纯合的。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种产生转基因植物细胞的方法，所述转基因植物细胞与植物细胞的野生型品种相比具有增加的针对HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的抗性，所述方法包括用包含编码如上文限定的野生型或mut-HPPD的核酸的表达盒转化植物细胞。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种产生转基因植物的方法，包括：(a)用包含编码野生型或mut-HPPD的核酸的表达盒转化植物细胞，和(b)从植物细胞产生具有增加的针对HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的抗性的植物。
因此，编码可用于本发明的野生型或mut-HPPD的HPPD核酸在用于目的植物中表达的表达盒中提供。该盒将包括与编码本发明野生型或mut-HPPD的HPPD核酸序列有效连接的调节序列。如本文所用，术语“调节元件”指能够调节有效连接的多核苷酸转录的多核苷酸。它包括但不限于启动子、增强子、内含子、5’UTR和3’UTR。“有效连接”意指启动子与第二序列之间的功能性连接，其中所述启动子序列启动并介导对应于所述第二序列的DNA序列转录。通常，有效连接意指连接的核酸序列是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，是连续并且处于相同的可读框中。该盒可以额外地含有待共转化至该生物中的至少一个额外基因。备选地，可以在多个表达盒上提供额外的基因。
这种表达盒备有用于插入处在调节区转录性调控下的HPPD核酸序列的多个限制性位点。该表达盒可以额外地含有选择标记基因。
该表达盒将以5'-3'转录方向包含在植物中有功能的转录和翻译起始区(即，启动子)、本发明的mut-HPPD核酸序列以及转录和翻译终止区(即，终止区)。启动子可以是天然的或模拟的，或对植物宿主和/或对本发明的HPPD序列是外来或异源的。另外，启动子可以是天然序列或备选地是合成序列。在启动子对于植物宿主是“外来的”或“异源的”的情况下，意指该启动子在引入此启动子的天然植物中不存在。在启动子相对于本发明的HPPD核酸序列是“外来”或“异源”的情况下，意指该启动子相对于本发明有效连接的HPPD核酸序列不是天生或天然存在的启动子。如本文中所用，嵌合基因包含与转录起始区有效连接的编码序列，其中所述转录起始区相对于所述编码序列是异源的。
尽管可能优选使用异源启动子表达本发明的HPPD核酸，但可以使用天然启动子序列。此类构建体将改变植物或植物细胞中HPPD蛋白的表达水平。因此，改变了植物或植物细胞的表型。
终止区可以相对于转录起始区是天然的，可以相对于有效连接的HPPD目的序列是天然的，可以相对于植物宿主是天然的，或可以从另一个来源衍生(即相对于该启动子、目的HPPD核酸序列、植物宿主或其任意组合为外来或异源)。便利的终止区从根瘤农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒可获得，如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。还参见Guerineau等人,(1991)MoI.Gen.Genet.262:141-144；Proudfoot(1991)Cell64:671-674；Sanfacon等人,(1991)GenesDev.5:141-149；Mogen等人,(1990)PlantCell2:1261-1272；Munroe等人,(1990)Gene91:151-158；Ballas等人,(1989)NucleicAcidsRes.17:7891-7903；和Joshi等人,(1987)NucleicAcidRes.15:9627-9639。根据需要，基因可以为转化的植物中增加的表达进行优化。即，可以使用植物优选的密码子合成所述基因用于改进的表达。参见，例如，Campbell和Gowri(1990)PlantPhysiol.92:1-11对宿主优选的密码子选择的讨论。用于合成植物优选基因的方法是本领域可获得的。参见，例如，美国专利号5,380,831和5,436,391以及Murray等人,(1989)NucleicAcidsRes.17:477-498，所述文献通过引用的方式并入本文。
增强细胞宿主中基因表达的额外序列修饰是已知的。这些包括消除编码假多聚腺苷化信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复序列和可能有损于基因表达的充分表征的其它此类序列。可以调整序列的G-C含量至相对于给定细胞宿主为平均的水平，如通过参考该宿主细胞中表达的已知基因所计算。当可能时，修饰该序列以避开预测的发夹二级mRNA结构。用于增强基因表达的核苷酸序列也可以用在植物表达载体中。这些核苷酸序列包括玉米Adhl的内含子、内含子l基因(Callis等人,GenesandDevelopment1:1183-1200,1987)和来自烟草花叶病毒(TMV)、玉米褪绿斑驳病毒和苜蓿花叶病毒的前导序列(W-序列)(Gallie等人,NucleicAcidRes.15:8693-8711,1987和Skuzeski等人,PlantMoI.Biol.15:65-79,1990)。已经显示来自玉米皱缩-1基因座的第一内含子增加嵌合基因构建体中基因的表达。美国专利号5,424,412和5,593,874公开了特定内含子在基因表达构建体中的用途，并且Gallie等人,1994,PlantPhysiol.106:929-939也显示在组织特异性的基础上内含子用于调节基因表达。为进一步增强或优化mut-HPPD基因表达，本发明的植物表达载体还可以包含含有基质结合区(MAR)的DNA序列。之后，用此类修饰的表达系统转化的植物细胞可以表现出本发明核苷酸序列的过量表达或组成型表达。
该表达盒可以额外在表达盒构建体中含有5’前导序列。此类前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的并且包括：小RNA病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎病毒5'非编码区)(Elroy-Stein等人,(1989)Proc.Natl.Acad.ScLUSA86:6126-6130)；马铃薯Y病毒前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Gallie等人,(1995)Gene165(2):233-238)、MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒)(Virology154:9-20)和人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak等人(1991)Nature353:90-94)；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA(AMVRNA4)的非翻译前导序列(Jobling等人,(1987)Nature325:622-625))；烟草花叶病毒(TMV)(前导序列Gallie等人,(1989),引自MolecularBiologyofRNACech编著(Liss,NewYork)，第237-256页)；玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommel等人,(1991)Virology81:382-385)。还参见Della-Cioppa等人,(1987)PlantPhysiol.84:965-968。也可以使用已知增强翻译的其它方法，例如内含子等。
在制备表达盒时，可以操作多种DNA片段，从而使得DNA序列处于合适方向并且根据需要处于正确的可读框中。为此目的，可以使用衔接头或连接体来连接所述DNA片段或可以包括其它操作以提供方便的限制性位点、移除多余的DNA、移除限制性位点等。为此目的，可以涉及体外诱变、引物修复、限制作用、复性和再置换，例如转换和颠换。
可以在本发明的实践中使用众多启动子。可以基于想要的结果选择启动子。核酸可以与用于植物中表达的组成型启动子、组织优选启动子或其它启动子组合。例如，此类组成型启动子包括Rsyn7启动子的核心启动子和在WO99/43838和美国专利号6,072,050中披露的其它组成型启动子；核心CaMV35S启动子(Odell等人,(1985)Nature313:810-812)；稻肌动蛋白(McElroy等人,(1990)PlantCell2:163-171)；遍在蛋白(Christensen等人,(1989)PlantMol.Biol.12:619-632和Christensen等人,(1992)PlantMol.Biol.18:675-689)；pEMU(Last等人,(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588)；MAS(Velten等人,1(1984)EMBOJ.3:2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。其它组成型启动子包括例如美国专利号5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611。
组织优选启动子可以用来在特定的植物组织中达到增强的HPPD表达。此类组织优选的启动子包括但不限于，叶优选的启动子、根优选的启动子、种子优选的启动子和茎优选的启动子。组织优选的启动子包括Yamamoto等人(1997)PlantJ.12(2):255-265；Kawamata等人(1997)PlantCellPhysiol.38(7):792-803；Hansen等人(1997)Mol.GenGenet.254(3):337-343；Russell等人(1997)TransgenicRes.6(2):157-168；Rinehart等人(1996)PlantPhysiol.112(3):1331-1341；VanCamp等人(1996)PlantPhysiol.112(2):525-535；Canevascini等人(1996)PlantPhysiol.112(2):513-524；Yamamoto等人(1994)PlantCellPhysiol.35(5):773-778；Lam(1994)ResultsProbl.CellDiffer.20:181-196；Orozco等人(1993)PlantMolBiol.23(6):1129-1138；Matsuoka等人(1993)ProcNatl.Acad.Sci.USA90(20):9586-9590和Guevara-Garcia等人(1993)PlantJ.4(3):495-505所公开的启动子。如果需要，可以修饰此类启动子用于弱表达。在一个实施方案中，将目的核酸靶向到叶绿体用于表达。以这种方式，在目的核酸不直接被插入叶绿体时，表达盒会额外包含叶绿体靶向序列，该靶向序列包含编码指引目的基因产物到叶绿体中的叶绿体转运肽的核苷酸。此类转运肽是本领域已知的。就叶绿体靶向序列而言，“有效连接”意指编码转运肽(即叶绿体靶向序列)的核酸序列与本发明的HPPD核酸连接，从而这两个序列是连续的并处于相同可读框中。参见，例如，VonHeijne等人,(1991)PlantMol.Biol.Rep.9:104-126；Clark等人,(1989)J.Biol.Chem.264:17544-17550；Della-Cioppa等人,(1987)PlantPhysiol.84:965-968；Romer等人,(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196:1414-1421；和Shah等人,(1986)Science233:478-481。可以通过将叶绿体靶向序列有效连接到编码本发明成熟HPPD蛋白的核苷酸序列的5’端，将本领域已知的任何叶绿体转运肽融合到本发明的成熟HPPD蛋白的氨基酸序列上。叶绿体靶向序列是本领域已知的并且包括核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)的叶绿体小亚基(deCastroSilvaFilho等人,(1996),PlantMol.Biol.30:769-780；Schnell等人,(1991),J.Biol.Chem.266(5):3335-3342)；5-(烯醇式丙酮酰)莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)(Archer等人,(1990),J.Bioenerg.Biomemb.22(6):789-810)；色氨酸合酶(Zhao等人,(1995),J.Biol.Chem.270(11):6081-6087)；质体蓝素(Lawrence等人,(1997),J.Biol.Chem.272(33):20357-20363)；分支酸合酶(Schmidt等人,(1993),J.Biol.Chem.268(36):27447-27457)；和集光叶绿素a/b结合蛋白(LHBP)(Lamppa等人,(1988),J.Biol.Chem.263:14996-14999)。还参见VonHeijne等人,(1991)PlantMol.Biol.Rep.9:104-126；Clark等人,(1989)J.Biol.Chem.264:17544-17550；Della-Cioppa等人,(1987)PlantPhysiol.84:965-968；Romer等人,(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196:1414-1421；和Shah等人,(1986)Science233:478-481。
用于转化叶绿体的方法是本领域已知的。参见，例如，Svab等人,(1990),Proc.Natl.Acad.ScLUSA87:8526-8530；Svab和Maliga,(1993),Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:913-917；Svab和Maliga,(1993),EMBOJ.12:601-606。该方法依赖于基因枪递送含有选择性标记的DNA和通过同源重组靶向该DNA到质体基因组。另外，质体转化可以通过组织优选性表达细胞核编码且指向质体的RNA聚合酶反式地激活质体携带的沉默转基因来实现。这种系统已经在McBride等人,(1994),Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:7301-7305中报道。待靶向至叶绿体的目的核酸可以为叶绿体中的表达进行优化以引起植物细胞核和这种细胞器之间密码子选择的差异。以这种方式，目的核酸可以使用叶绿体优选的密码子合成。参见，例如，通过引用方式并入本文的美国专利号5,380,831。
在一个优选实施方案中，编码野生型或mut-HPPD(a)或HST核酸(b)的HPPD核酸包含选自以下的多核苷酸序列：a)如SEQIDNO:1、51、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、52、54、56、68、69中所示的多核苷酸或其变体或衍生物；b)如SEQIDNO:47或49中所示的多核苷酸或其变体或衍生物；c)编码如SEQIDNO:2、5、8、11、14、17、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、53、55、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67中所示的多肽的多核苷酸或其变体或衍生物；d)包含a)至c)中任一者至少60个连续核苷酸的多核苷酸；和e)与a)至d)中任一者的多核苷酸互补的多核苷酸。
优选，表达盒还包含在植物中有功能的转录启动调节区和翻译起始调节区。
尽管本发明的多核苷酸作为选择性标记基因用于植物选择，不过本发明的表达盒可以包含另一个选择性标记基因以选择转化的细胞。选择性标记基因(包括本发明的那些选择性标记基因)用于选择转化的细胞或组织。标记基因包括，但不限于编码抗生素耐药性的基因，如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的那些基因，以及赋予针对除草剂化合物(如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D))抗性的基因。通常参见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3:506-511；Christopherson等人,(1992)Proc.Natl.Acad.ScLUSA89:6314-6318；Yao等人,(1992)Cell71:63-72；Reznikoff(1992)MoIMicrobiol6:2419-2422；Barkley等人,(1980)引自TheOperon,第177-220页；Hu等人,(1987)Cell48:555-566；Brown等人,(1987)Cell49:603-612；Figge等人,(1988)Cell52:713-722；Deuschle等人,(1989)Proc.NatlAcad.AcLUSA86:5400-5404；Fuerst等人,(1989)Proc.NatlAcad.ScLUSA86:2549-2553；Deuschle等人,(1990)Science248:480-483；Gossen(1993)海德堡大学博士论文；Reines等人,(1993)Proc.NatlAcad.ScLUSA90:1917-1921；Labow等人,(1990)MoICellBiol10:3343-3356；Zambretti等人,(1992)Proc.NatlAcad.ScLUSA89:3952-3956；Bairn等人,(1991)Proc.NatlAcad.ScLUSA88:5072-5076；Wyborski等人,(1991)NucleicAcidsRes.19:4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)TopicsMoIStruc.Biol10:143-162；Degenkolb等人,(1991)Antimicrob.AgentsChemother.35:1591-1595；Kleinschnidt等人,(1988)Biochemistry27:1094-1104；Bonin(1993)海德堡大学博士论文；Gossen等人,(1992)Proc.NatlAcad.ScLUSA89:5547-5551；Oliva等人,(1992)Antimicrob.AgentsChemother.36:913-919；Hlavka等人,(1985)HandbookofExperimentalPharmacology,第78卷(Springer-Verlag,Berlin)；Gill等人,(1988)Nature334:721-724。此类公开内容通过引用的方式并入本文。上述选择标记基因的列表不意在限制。可以在本发明中使用任意的选择标记基因。
本发明还提供包含表达盒的分离的重组表达载体，所述表达盒含有如上文所述的HPPD核酸，其中与宿主细胞的野生型品种相比，该载体在宿主细胞中的表达导致增加的针对HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的耐受性。如本文中所用，术语“载体”指能够运输已经与之连接的另一个核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其指额外DNA区段可以连入其中的环形双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以连入病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加体型哺乳动物载体)。其他载体(例如非附加体型哺乳动物载体)在引入宿主细胞时整合到该宿主细胞的基因组中，并因而随宿主基因组一起复制。另外，某些载体能够指导与它们有效连接的基因表达。此类载体在本文中称作“表达载体”。通常，重组DNA技术中使用的表达载体经常处于质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换地使用，因为质粒是最常用形式的载体。然而，本发明意在包括起到同等功能的其他形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺联病毒)。
本发明的重组表达载体包含处于这种形式的本发明核酸，其中所述形式适于该核酸在宿主细胞中表达，这意指该重组表达载体包含基于待用于表达的宿主细胞而选择的与待表达核酸序列有效连接的一个或多个调节序列。调节序列包括指导核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中组成型表达的那些调节序列和指导这种核苷酸序列仅在某些宿主细胞中或在某些条件下表达的那些调节序列。本领域技术人员会理解，表达载体的设计可能取决于此类因素，如待转化细胞的选择、所需的多肽表达水平等。可以将本发明的表达载体引入宿主细胞，因而以产生如本文所述的核酸编码的多肽或肽，包括融合多肽或融合肽(例如，mut-HPPD多肽、融合多肽等)。
在本发明的优选实施方案中，HPPD多肽在植物及植物细胞如单细胞植物细胞(如，藻类)中(见Falciatore等，1999，MarineBiotechnology1(3):239-251及其中参考文献)和来自高等植物(例如，种子植物，如作物植物)的植物细胞中表达。HPPD多核苷酸可以由任意方法“引入”植物细胞，所述方法包括转染法、转化或转导法、电穿孔法、粒子轰击法、农杆菌感染法、生物射弹法等。
可以在Sambrook等人(MolecularCloning：ALaboratoryManual.,第2版,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989)和其他实验室手册如MethodsinMolecularBiology,1995,第44卷,Agrobacteriumprotocols,Gartland和Davey编著,HumanaPress,Totowa,NewJersey中找到用于转化或转染宿主细胞(包括植物细胞)的合适方法。由于希望增加的针对HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的耐受性是遗传至种类多样的植物中的一般性状，植物如玉米、小麦、黑麦、燕麦、小黑麦、稻、大麦、大豆、落花生、棉花、欧洲油菜和卡诺拉油菜、木薯、辣椒、向日葵和万寿菊、茄科植物如马铃薯、烟草、茄子和番茄、野豌豆属(Vicia)物种、豌豆、苜蓿、灌木植物(咖啡、可可、茶)、柳属(Salix)物种、树(油棕榈、椰子)、多年生牧草。作为本发明又一个实施方案，饲料作物植物也是用于基因工程的优选靶植物。在一个优选实施方案中，植物是作物植物。饲草作物包括但不限于小麦草(Wheatgrass)、虉草(Canarygrass)、雀麦草(Bromegrass)、披碱草(WildryeGrass)、早熟禾(Bluegrass)、鸭茅(Orchardgrass)、苜蓿、Salfoin、百脉根(BirdsfootTrefoil)、杂车轴草(Alsikeclover)、红车轴草(redclover)和草木樨(Sweetclover)。
在本发明的一个实施方案中，通过农杆菌介导的基因转移实现向植物中转染mut-HPPD多核苷酸。本领域技术人员已知的一种转化方法是将正开花的植物浸入农杆菌溶液，其中所述农杆菌含有mut-HPPD核酸，随后繁育转化的配子。农杆菌介导的植物转化可以使用例如GV3101(pMP90)(Koncz和Schell，1986，Mol.Gen.Genet.204:383-396)或LBA4404(Clontech)根癌农杆菌菌株进行。可以通过标准转化及再生技术进行转化(Deblaere等人，1994,Nucl.Acids.Res.13:4777-4788；Gelvin,StantonB.和Schilperoort,RobertA，PlantMolecularBiologyManual,第2版.-Dordrecht:KluwerAcademicPubl.,1995.-引自Sect.,RingbucZentraleSignatur:BT11-PISBN0-7923-2731-4；Glick,BernardR.和Thompson,JohnE.,MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,BocaRaton:CRCPress,1993360S.,ISBN0-8493-5164-2)。例如，油菜可以通过子叶或下胚轴转化法进行转化(Moloney等人,1989,PlantCellReport8:238-242；DeBlock等人,1989,PlantPhysiol.91:694-701)。抗生素对于农杆菌和植物选择的用途取决于转化所用的双元载体和农杆菌菌株。油菜籽油菜选择通常使用卡那霉素作为植物选择标记进行。可以使用例如Mlynarova等人,1994,PlantCellReport13:282-285描述的技术进行针对亚麻的农杆菌介导的基因转移。可以使用例如在欧洲专利号0424047、美国专利号5,322,783、欧洲专利号0397687、美国专利号5,376,543或美国专利号5,169,770中描述的技术进行大豆的转化。玉米的转化可以通过粒子轰击法、聚乙二醇介导的DNA摄取法或借助碳化硅纤维技术实现。(参见，例如，Freeling和Walbot“《玉米手册》”SpringerVerlag:NewYork(1993)ISBN3-540-97826-7)。玉米转化的具体实施例存在于美国专利号5,990,387中，并且小麦转化的具体实施例可以在PCT申请号WO93/07256中找到。
根据本发明，引入的HPPD多核苷酸可以在植物细胞中稳定地维持，如果它并入非染色体的自主性复制子或整合至植物染色体中。备选地，引入的mut-HPPD多核苷酸可以存在于染色体外非复制型载体上并且瞬时表达或短期有活性。在一个实施方案中，可以产生其中mut-HPPD多核苷酸集成至染色体中的同源重组微生物，制备载体，所述载体含有HPPD基因的至少一部分，其中已经向所述HPPD基因的至少一部分引入缺失、添加或置换以因而改变(例如功能性破坏)内源HPPD基因并产生mut-HPPD基因。为了借助同源重组产生点突变，DNA-RNA杂交体可以用于称做嵌合修复的技术中(Cole-Strauss等人,1999,NucleicAcidsResearch27(5):1323-1330和Kmiec,1999,GenetherapyAmericanScientist.87(3):240-247)。其他在小麦属(Triticum)物种中的同源重组方法也是本领域熟知的并且构思用于本文。
在同源重组载体中，野生型或mut-HPPD基因可以在其5’和3’末端处旁侧分布有HPPD基因的额外核酸分子，以允许在微生物或植物中同源重组在载体携带的外源野生型或mut-HPPD基因和内源HPPD基因之间发生。这种额外的侧翼HPPD核酸分子具有与内源性基因成功同源重组的足够长度。一般，载体中包含数百个碱基对直到数千碱基的侧翼DNA(均在5’末端和3’末端)(关于同源重组载体的描述，参见例如，Thomas,K.R.和Capecchi,M.R.,1987,Cell51:503，或关于展叶剑叶藓中基于cDNA的重组，参见Strepp等人,1998,PNAS,95(8):4368-4373)。然而，由于mut-HPPD基因通常在非常少的氨基酸处不同于HPPD基因，所以侧翼序列并非总是必需。将同源重组载体引入微生物或植物细胞(例如借助聚乙二醇介导的DNA)，并且使用本领域已知的技术选择其中引入的mut-HPPD基因已经与内源mut-HPPD基因同源重组的细胞。
在另一个实施方案，可以产生重组微生物，其含有允许引入的基因受调节表达的所选择系统。例如，在使mut-HPPD基因置于lac操纵子控制下的载体上包含mut-HPPD基因允许该基因仅在IPTG存在下表达。此类调节系统是本领域熟知的。
本发明的另一方面涉及已经向其中引入本发明重组表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中互换地使用。应当理解此类术语不仅指具体的主题细胞，它们还适用于这种细胞的子代或潜在子代。因为某些修饰可以因突变或环境影响而出现于后续世代中，故而此类子代实际上可以与亲代细胞不完全相同，但仍包含于如本文中所用的该术语的范围内。宿主细胞可以是任何原核细胞或真核细胞。例如、mut-HPPD多核苷酸可以在细菌细胞如谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)、昆虫细胞、真菌细胞、或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)、藻类、纤毛虫、植物细胞、真菌或其他微生物如谷氨酸棒状杆菌中表达。其他合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。
本发明的宿主细胞，如培养下的原核或真核宿主细胞，可以用来产生(即，表达)mut-HPPD多核苷酸。因此，本发明还提供使用本发明的宿主细胞产生mut-HPPD多肽的方法。在一个实施方案中，该方法包括在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞(已经向其中引入编码mut-HPPD多肽的重组表达载体，或已经向其基因组中引入编码野生型或mut-HPPD多肽的基因)直至产生mut-HPPD多肽。在另一个实施方案中，方法还包括从培养基或宿主细胞分离mut-HPPD多肽。本发明的另一方面涉及分离的mut-HPPD及其生物活性部分。“分离的”或“纯化的”多肽或其生物活性部分在通过重组DNA技术产生时不含某些细胞物质，或在化学合成时不含某些化学前体或其它化学品。语言“基本上不含细胞材料”包括多肽的制品，在所述制品中mut-HPPD多肽与天然或重组地产生所述多肽的细胞的某些细胞组分分离。在一个实施方案中，语言“基本上不含细胞物质”包括具有小于约30％(按干重计)非mut-HPPD物质(本文也称作“杂质性多肽”)、更优选小于约20％非mut-HPPD物质、仍然更优选小于约10％非mut-HPPD物质和最优选小于约5％非mut-HPPD物质的mut-HPPD多肽制品。
当重组地产生mut-HPPD多肽或其生物活性部分时，它还优选基本上不含培养基，即，培养基占所述多肽制备物的体积少于约20％、更优选小于约10％并且最优选小于约5％。语言“基本上不含化学前体或其他化学品”包括这样的mut-HPPD多肽制品，其中多肽与参与该多肽合成的化学前体或其他化学品分离。在一个实施方案中，语言“基本上不含化学前体或其他化学品”包括具有小于约30％(按干重计)化学前体或非mut-HPPD化学品、更优选小于约20％化学前体或非mut-HPPD化学品、仍然更优选小于约10％化学前体或非mut-HPPD化学品和最优选小于约5％化学前体或非mut-HPPD化学品的mut-HPPD多肽制品。在优选的实施方案中，分离的多肽或其生物活性部分不含来自衍生mut-HPPD多肽的相同生物的杂质性多肽。一般，通过在除之外的植物中或在微生物如谷氨酸棒状杆菌、纤毛虫、藻类或真菌中重组表达例如mut-HPPD多肽产生这类多肽。
如上文所述，本发明教授了与植物或种子的野生型品种相比增加作物植物或种子的针对HPPD的抑制剂除草剂(优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物)的耐受性的组合物和方法。在一个优选实施方案中，如此增加作物植物或种子的HPPD抑制性除草剂耐受性，从而植物或种子可以经受住施加优选大约1-1000gaiha-1、更优选20-160gaiha-1和最优选40-80gaiha-1HPPD抑制性除草剂。如本文所用，“经受住”HPPD抑制性除草剂施加意指这类施加不杀死或损伤植物。
另外，本发明提供涉及使用如上文所列的至少一种HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的方法。
在这些方法中，所述HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂可以通过本领域已知的任意方法施加，所述方法包括但不限于种子处理、土壤处理和叶处理。在施加之前，可以将HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂转化成常用制剂，例如溶液剂、乳剂、混悬剂、喷粉剂(dusts)、粉剂、糊剂和粒剂。使用形式取决于具体的预期目的；在每种情况下，应当确保本发明化合物的精细和均匀分布。
通过提供具有增加的针对HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的耐受性的植物，类型众多的制剂可以用于保护植物免受杂草影响，从而增强植物生长并且降低对营养的竞争。HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂可以本身在围绕本文所述的作物植物的区域内用于出苗前、出苗后、种植前和种植时控制杂草，或可以使用含有其他添加物的HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂制剂。HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂也可以用作种子处理。HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂制剂中存在的添加物包括其他除草剂、去垢剂、佐药、铺展剂、粘合剂、稳定剂或其他等。HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂制剂可以是湿式或干式制品并且可以包括，但不限于悬浮散剂(flowablepowder)、乳油(emulsifiableconcentrate)和液态母液(liquidconcentrate)。可以根据常规方法施加HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂和除草剂制剂，例如通过喷洒、灌溉、撒粉等。
PCT/EP2009/063387和PCT/EP2009/063386中详述了合适的制剂，所述文献通过引用的方式并入本文。
还应当理解前文涉及本发明的优选实施方案并且可以在其中进行众多改变而不脱离本发明的范围。本发明由以下实施例进一步说明，所述实施例不应当以任何方式解释为对本发明的范围加以限制。相反，应当清楚地理解，可以求助于可在阅读本说明书后本身启发本领域技术人员而不脱离本发明精神的多种其他实施方式、修改及其等同物。
实施例
实施例1：克隆编码HPPD的基因
(A)克隆拟南芥HPPD
使用引物HuJ101和HuJ102(表5)，通过标准PCR技术从拟南芥cDNA扩增拟南芥AtHPPD部分编码序列(SEQIDNo:52)。
表5：用于AtHPPD扩增的PCR引物(SEQIDNO:70、71)
引物名称 引物序列(5’→3’)
HuJ101 GGCCACCAAAACGCCG
HuJ102 TCATCCCACTAACTGTTTGGCTTC
根据制造商的说明书，在载体(Invitrogen，Carlsbad，美国)中克隆PCR产物。通过进行微量质粒制备，从大肠杆菌TOP10分离所得到的质粒通过DNA测序证实编码N末端加His6标签的AtHPPD的表达盒。
(B)莱茵衣藻HPPD1的克隆
将莱茵衣藻HPPD1(CrHPPD1)编码序列(SEQIDNo:54)针对大肠杆菌中的表达进行密码子优化并作为合成基因提供(Entelechon，雷根斯堡，德国)。使用引物Ta1-1和Ta1-2(表6)，通过标准PCR技术扩增部分合成基因。
表6：用于CrHPPD1扩增的PCR引物(SEQIDNO:72、73)
引物名称 引物序列(5’→3’)
Ta1-1 GGCGCTGGCGGTGCGTCCACTAC
Ta1-2 TCAAACGTTCAGGGTACGCTCGTAGTCTTCGATG
根据制造商的说明书，在载体(Invitrogen，Carlsbad，美国)中克隆PCR产物。通过进行微量质粒制备，从大肠杆菌TOP10分离所得到的质粒通过DNA测序证实编码N末端加His6标签的CrHPPD1的表达盒。
(C)莱茵衣藻HPPD2的克隆
将莱茵衣藻HPPD2(CrHPPD2)编码序列(SEQIDNo:56)针对大肠杆菌中的表达进行密码子优化并作为合成基因提供(Entelechon，雷根斯堡，德国)。使用引物Ta1-3和Ta1-4(表7)，通过标准PCR技术扩增部分合成基因。
表7：用于CrHPPD2扩增的PCR引物(SEQIDNO:74、75)
引物名称 引物序列(5’→3’)
Ta1-3 GGTGCGGGTGGCGCTGGCACC
Ta1-4 GGTGCGGGTGGCGCTGGCACC
根据制造商的说明书，在载体(Invitrogen，Carlsbad，美国)中克隆PCR产物。通过进行微量质粒制备，从大肠杆菌TOP10分离所得到的质粒通过DNA测序证实编码N末端加His6标签的CrHPPD2的表达盒。
(D)大豆HPPD的克隆
将大豆HPPD(GmHPPD；Glyma14g03410)编码序列针对大肠杆菌中的表达进行密码子优化并作为合成基因提供(Entelechon，雷根斯堡，德国)。使用引物Ta2-65和Ta2-66(表8)，通过标准PCR技术扩增部分合成基因。
表8:用于GmHPPD扩增的PCR引物(SEQIDNO:76、77)
引物名称 引物序列(5’→3’)
Ta2-65 CCAATCCCAATGTGCAACG
Ta2-66 TTATGCGGTACGTTTAGCCTCC
根据制造商的说明书，在载体(Invitrogen，Carlsbad，美国)中克隆PCR产物。通过进行微量质粒制备，从大肠杆菌TOP10分离所得到的质粒通过DNA测序证实编码N末端加His6标签的GmHPPD的表达盒。
(E)克隆玉蜀黍HPPD
将玉蜀黍HPPD(ZmHPPD；GRMZM2G088396)编码序列针对大肠杆菌中的表达进行密码子优化并作为合成基因提供(Entelechon，雷根斯堡，德国)。使用引物Ta2-45和Ta2-46(表9)，通过标准PCR技术扩增部分合成基因。
表9：用于ZmHPPD扩增的PCR引物(SEQIDNO:78、79)
根据制造商的说明书，在载体(Invitrogen，Carlsbad，美国)中克隆PCR产物。通过进行微量质粒制备，从大肠杆菌TOP10分离所得到的质粒通过DNA测序证实编码N末端加His6标签的ZmHPPD的表达盒。
(F)克隆稻HPPD
将稻HPPD(OsHPPD；Os02g07160)编码序列针对大肠杆菌中的表达进行密码子优化并作为合成基因提供(Entelechon，雷根斯堡，德国)。使用引物Ta2-63和Ta2-64(表10)，通过标准PCR技术扩增部分合成基因。
表10：用于OsHPPD扩增的PCR引物(SEQIDNO:80、81)
引物名称 引物序列(5’→3’)
Ta2-63 CCGCCGACTCCAACCCC
Ta2-64 TTAAGAACCCTGAACGGTCGG
根据制造商的说明书，在载体(Invitrogen，Carlsbad，美国)中克隆PCR产物。通过进行微量质粒制备，从大肠杆菌TOP10分离所得到的质粒通过DNA测序证实编码N末端加His6标签的OsHPPD的表达盒。
(G)基因合成和亚克隆
其他编码野生型HPPD的基因，如大麦(SEQIDNO:1/2)或干热嗜酸菌(Picrophilustorridus)HPPD基因(SeqIDNO:39/40)由Geneart(雷根斯堡，德国)或Entelechon(雷根斯堡，德国)合成并亚克隆到修饰的pET24D(Novagen)表达载体中，产生N末端加His标签的表达构建体。
实施例2：重组HPPD酶的异源表达和纯化
在大肠杆菌中产生并过量表达重组HPPD酶。将化学感受态BL21(DE3)细胞(Invitrogen，Carlsbad，美国)用(参见实施例1)或用其他表达载体根据制造商的说明书转化。
转化的细胞在37℃于自诱导培养基(补充有100μg/ml氨苄青霉素的ZYM5052)中培育6小时随后，在25℃培育24小时。
在OD600(在600nm的光密度)8至12，通过离心收获细胞(8000xg)。将细胞沉淀物重悬于补充有无EDTA完整蛋白酶抑制剂混合物(Roche-Diagnostics)的裂解缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液，0.5MNaCl，10mM咪唑，pH7.0)中并使用AvestinPress匀浆。通过离心(40,000xg)使匀浆澄清。在ProtinoNi-IDA1000装填柱(Macherey-Nagel)上根据制造商的说明书通过亲和层析法纯化加His6标签的HPPD或突变变体。纯化的HPPD或突变变体针对补充有10％甘油的100mM磷酸钠缓冲液pH7.0透析并贮存在-86℃。使用Bio-Rad蛋白质测定法(Bio-RadLaboratories，Hercules，美国)，根据Bradford法测定蛋白质含量。通过SDS-PAGE估计酶制备物的纯度。
实施例3：HPPD活性的测定法
HPPD从4-羟苯基丙酮酸(4-HPP)和O2产生尿黑酸和CO2。HPPD的活性测定法基于反相HPLC分析尿黑酸。
分析混合物可以在总体积505μl中含有150mM磷酸钾缓冲液pH7.0、50mML-抗坏血酸、100μM过氧化氢酶(Sigma-Aldrich)，1μMFeSO4和0.2单位纯化的HPPD酶。1单位定义为在20℃为每分钟产生1nmolHGA所需的酶量。
在预温育30分钟后，通过添加4-HPP至终浓度0.05mM启动反应。允许反应在室温进行45分钟。通过添加50μl4.5M磷酸终止反应。使用0.2μM孔径PVDF过滤装置，过滤样品。
使用90％20mMNaH2PO4pH2.2，10％甲醇(v/v)，通过等强度(isocratic)洗脱，在UPLCHSST3柱(粒度1.8μm，规格2.1x50mm；Waters)上分析5μl澄清的样品。
在750mV(模式：DC；极性：阳性)电化学检测HGA并通过积分峰面积，将其定量(Empower软件；Waters)。
将抑制剂溶解于DMSO(二甲基亚砜)中至浓度0.5mM。从这种母液，在DMSO中制备连续5倍稀释物，所述稀释物用于本测定法中。相应的抑制剂溶液占1％的分析体积。因此，最终的抑制剂浓度范围分别是从5μM至320pM。通过设定未抑制的酶活性为100％，将活性归一化。使用非线性回归计算IC50值。
实施例4：野生型HPPD酶的体外表征
使用以上实施例中描述或本领域熟知的方法，将纯化的重组野生型HPPD酶就它们的动力学特性和针对HPPD抑制性除草剂的敏感性表征。使用底物抑制模型，通过非线性回归用软件GraphPadPrism5(GraphPad软件，LaJolla，美国)计算表观米氏常数(Km)和最大反应速率(Vmax)。假定酶制备物纯度为100％，从Vmax计算表观kcat值。从至少三次独立实验计算Km值和IC50值的加权均数(按标准误)。竞争性抑制的Cheng-Prusoff等式(Cheng,Y.C.；Prusoff,W.H.BiochemPharmacol1973,22,3099-3108)用来计算解离常数(Ki)。
作为除草剂耐受性性状使用的HPPD酶的野外使用性能可能不仅取决于其缺少针对HPPD抑制性除草剂敏感性，还取决于其活性。为了评估除草剂耐受性性状的潜在性能，使用以下式计算耐受性指数(TI)：
T I = k c a t × K i K m
通过对拟南芥野生型HPPD归一化耐受性指数，能够轻易对每种性状比较和排序。
表11和表12中描述了体外测定法中获得的数据的例子。
表11：针对多种HPPD酶测定4-HPP的米氏常数(Km)、转换数(kcat)、催化效率(kcat/Km)和的解离常数(Ki)。
*该实施例中使用的抑制HPPD的除草剂是[[3-(4,5-二氢异噁唑-3-基)-2-甲基-4-甲磺酰基-苯基]-(5-羟-1-甲基-吡唑-4-基)甲酮(抑制剂1)和2-(4-甲磺酰基-2-硝基-苯甲酰)环己烷-1,3-二酮(抑制剂2)。
表12:对拟南芥HPPD归一化的多种HPPD酶的耐受性指数
该实施例中使用的抑制HPPD的除草剂是[[3-(4,5-二氢异噁唑-3-基)-2-甲基-4-甲磺酰基-苯基]-(5-羟-1-甲基-吡唑-4-基)甲酮(抑制剂1)和2-(4-甲磺酰基-2-硝基-苯甲酰)环己烷-1,3-二酮(抑制剂2)、2-羟-3-[2-(2-甲氧基乙氧基甲基)-6-(三氟甲基)吡啶-3-羰基]双环并[3.2.1]辛-2-烯-4-酮(抑制剂3)和2-[2-氯-4-甲磺酰基-3-(2,2,2-三氟乙氧基甲基)苯甲酰]环己烷-1,3-二酮(抑制剂4)。
包含参比SEQIDNO:53作为代表性数目的实验中的比较对照，并且表12中给出的值是来自许多实验的平均值。在以上实施例中，对来自不同生物的多种HPPD酶给出的TI值参比SEQIDNO:53的值归一化。
因此，可以从以上实施例见到，选择包含编码大麦HPPD的区域的多核苷酸作为编码抗抑制剂的HPPD的一种多核苷酸，因为发现针对抑制剂1的耐受性指数比拟南芥HPPD的同样耐受性指数高3.7倍。可以进一步见到，相对于参比SEQIDNO:53，包含编码不同生物HPPD酶的区域的全部多核苷酸至少高1.7倍地抵抗抑制剂1。
此外，选择包含编码黑麦草HPPD或燕麦HPPD的区域的多核苷酸作为编码抵抗抑制剂的HPPD的转基因，因为发现其针对本发明中所测试的全部抑制剂的耐受性指数比针对参比SEQIDNO:53观察到的耐受性指数大得多。因此，黑麦草HPPD和燕麦HPPD可用作本发明中赋予除草剂耐受性的性状。
显而易见，抵抗除草剂的任何HPPD酶均是本发明主题的一部分，即便本文中未例举这种蛋白质。
实施例5：理性诱变
借助结构生物学和序列比对，可以选择某些数目的可能直接或间接参与结合“HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂”的氨基酸并且随后将它们诱变并获得耐受HPPD的酶。
(A)位点定向诱变
根据制造商的说明书，用QuikChangeII位点定向诱变试剂盒(Stratagene，SantaClara，美国)进行基于PCR的位点定向诱变。
这项技术需要用于每种突变的两个化学合成的DNA引物(正向引物和反向引物)。表13中列出了可以用于位点定向诱变AtHPPD(SEQIDNO:52/53)的所例举引物。
表13：用于位点定向诱变AtHPPD的PCR引物(SEQIDNO：82至147)
表14中列出了可以用于位点定向诱变HvHPPD(SEQIDNO:1/2)的所例举引物。
表14：用于位点定向诱变HvHPPD的PCR引物(SEQIDNO：148至155)
通过进行微量质粒制备从大肠杆菌TOP10分离并且通过DNA测序证实突变的质粒。
通过逐步诱变方案实现单氨基酸置换的组合。
(B)HPPD突变体的体外表征
通过上文描述的方法获得纯化的突变体HPPD酶。使用描述的HPPD活性测定法实施剂量反应和动力学测量。使用底物抑制模型，通过非线性回归用软件GraphPadPrism5(GraphPad软件，LaJolla，美国)计算表观米氏常数(Km)和最大反应速率(Vmax)。假定酶制备物纯度为100％，从Vmax计算表观kcat值。从至少三次独立实验计算Km值和IC50值的加权均数(按标准误)。竞争性抑制的Cheng-Prusoff等式(Cheng,Y.C.；Prusoff,W.H.BiochemPharmacol1973,22,3099-3108)用来计算解离常数(Ki)。
作为除草剂耐受性性状使用的优化HPPD酶的野外使用性能可能不仅取决于其缺少针对HPPD抑制性除草剂的敏感性，还取决于其活性。为了评估除草剂耐受性性状的潜在性能，使用以下式计算耐受性指数(TI)：
T I = k c a t × K i K m
通过对相应野生型HPPD归一化耐受性指数，能够轻易对每种性状比较和排序。
表15和表16中描述了获得的数据的例子。
表15：在拟南芥HPPD(SEQID:53)中生成的多种HPPD突变体的归一化耐受性指数。
该实施例中使用的抑制HPPD的除草剂是[[3-(4,5-二氢异噁唑-3-基)-2-甲基-4-甲磺酰基-苯基]-(5-羟-1-甲基-吡唑-4-基)甲酮(抑制剂1)和2-(4-甲磺酰基-2-硝基-苯甲酰)环己烷-1,3-二酮(抑制剂2)、2-羟-3-[2-(2-甲氧基乙氧基甲基)-6-(三氟甲基)吡啶-3-羰基]双环并[3.2.1]辛-2-烯-4-酮(抑制剂3)和2-[2-氯-4-甲磺酰基-3-(2,2,2-三氟乙氧基甲基)苯甲酰]环己烷-1,3-二酮(抑制剂4)。
表16：在大麦HPPD(SEQID:2)中生成的多种HPPD突变体的归一化耐受性指数。
该实施例中使用的抑制HPPD的除草剂是[[3-(4,5-二氢异噁唑-3-基)-2-甲基-4-甲磺酰基-苯基]-(5-羟-1-甲基-吡唑-4-基)甲酮(抑制剂1)和2-(4-甲磺酰基-2-硝基-苯甲酰)环己烷-1,3-二酮(抑制剂2)、2-羟-3-[2-(2-甲氧基乙氧基甲基)-6-(三氟甲基)吡啶-3-羰基]双环并[3.2.1]辛-2-烯-4-酮(抑制剂3)和2-[2-氯-4-甲磺酰基-3-(2,2,2-三氟乙氧基甲基)苯甲酰]环己烷-1,3-二酮(抑制剂4)。
多个结论可以从表15和表16中的数据导出。HPPD突变体的特性显示，在编码序列内部的某些氨基酸置换显著改善了HPPDSEQIDNO:2和53针对HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的耐受性指数。
可以从表15中描述的结果见到，对SEQIDNO:53中位置381处苯丙氨酸的某些置换在针对抑制剂1的耐受性指数方面引起HPPDSEQIDNO:53显著改善。此外，位置335处甲硫氨酸至组氨酸，连同位置336处的脯氨酸交换成丙氨酸或甘氨酸(SEQIDNO:53)的联合突变，导致HPPD酶明显改善，因为与针对参比HPPDSEQIDNO:53所观察的抑制剂1耐受性相比，发现突变HPPD酶具有更大的抑制剂1耐受性。位置363处的谷氨酸额外突变成谷氨酰胺，连同M335H、P336A一起，导致HPPD酶进一步改善，因为这种突变形式赋予比参比酶SEQIDNO:53所观察的耐受性指数高6.4倍的用抑制剂1测量的耐受性指数。
另外，可以从表16中描述的结果见到，对SEQIDNO:2中位置320处亮氨酸的某些置换、优选交换成组氨酸，在改善相对于如表16中所述的全部测试抑制剂的耐受性指数方面引起大麦HPPD酶(SEQIDNO:2)显著改善。因此，可以选择这些突变体，优选编码包含其中亮氨酸320交换成组氨酸的大麦HPPD的突变体的多核苷酸，作为这样的突变体，所述突变体编码抵抗抑制剂的HPPD并且可用于产生耐受除草剂的植物。
此外，位置320处的亮氨酸至组氨酸，连同位置321处的脯氨酸交换成丙氨酸(SEQIDNO:2)的联合突变，导致HPPD酶明显改善，因为发现突变HPPD酶具有显著改善的对抗HPPD抑制性除草剂的行为，因为与参比HPPDSEQIDNO:2相比，其耐受性指数相对于抑制剂1增加5.1倍，相对于抑制剂2增加3.5倍，相对于抑制剂3增加2.5倍，并且相对于抑制剂4增加4.3倍。
此外，可以选择包含编码其中精氨酸309交换成赖氨酸的大麦HPPD(SEQIDNO:2)的区域的多核苷酸作为编码抵抗抑制剂的HPPD的转基因，因为发现突变体的耐受性指数针对本发明中测试的全部抑制剂显著改善。
显而易见，这些实施例显示，可以选择一种突变体HPPD酶作抵抗抑制HPPD的除草抑制剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草抑制剂的酶，因为该突变体的耐受性指数大于野生型酶的耐受性指数。另外，将有可能获得下述HPPD酶的任何突变或突变组合均是本发明主题物的部分，其中所述HPPD酶抵抗HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂，即便本文中未例举这种蛋白质。
实施例6
制备表达异源HPPD和/或HST酶并耐受“HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂”的植物
用于产生稳定转化的植物的多种方法是本领域熟知的。
可以通过Olhoft等人(美国专利2009/0049567)描述的方法产生耐受抑制HPPD的除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的大豆(Glycinemax)植物或玉米(玉蜀黍(Zeamays))植物。简而言之，使用如Sambrook等人(Molecularcloning(2001)ColdSpringHarborLaboratoryPress)描述的标准克隆技术，将编码HPPD或HST的多核苷酸克隆至双元载体中。最终载体构建体含有HPPD或HST编码序列，其旁侧分布有启动子序列(例如遍在蛋白启动子(PcUbi)序列)和终止子序列(例如胭脂碱合酶终止子(NOS)序列)和抗性标记基因盒(例如AHAS)(图2)。任选地，HPPD或HST基因可以提供选择手段。
农杆菌介导的转化法用来将DNA引入籽苗外植体的初生节处的大豆叶腋分生组织细胞中。在用农杆菌接种并与之共培养后，将外植体转移至幼苗诱导培养基，不进行选择，持续1周。所述外植体随后转移至含有1-3μM灭草烟(Arsenal)的幼苗诱导培养基，持续3周，以选择转化的细胞。在主要结节处具有健康愈伤组织/枝条垫的外植体随后转移到含有1-3μM灭草烟的幼苗伸长培养基，直至幼苗伸长或外植体死亡。再生后，将转化体移栽至小花钵中的土壤内，置于生长箱中(16小时白昼/8小时夜晚；25℃白昼/23℃夜晚；65％相对湿度；130-150mEm-2s-1)并且随后通过Taqman分析法检验T-DNA的存在。在几周后，将健康、转基因阳性单拷贝事件移栽至较大花钵并允许其在生长箱中生长。
通过McElver和Singh描述的方法进行玉米植物的转化(WO2008/124495)。借助农杆菌介导的转化，将含有HPPD或HST序列的植物转化载体构建体引入玉米不成熟胚胎中。将转化的细胞在补充有0.5-1.5μM咪草烟(imazethapyr)的选择培养基中选择3-4周。转基因小植物在植物再生培养基上再生并且此后生根。转基因小植物就转基因的存在性接受TaqMan分析，随后移植至盆栽混合物并在温室中生长至成熟。
通过如McElver和Singh描述的“花浸染法”，用HPPD或HST序列转化拟南芥(WO2008/124495)。转基因拟南芥植物接受TaqMan分析以分析整合基因座的数目。
通过如Peng等人描述的原生质体转化法进行稻的转化(US6653529)。
在温室研究中测试含有HPPD或HST序列的大豆、玉米、稻和拟南芥T0或T1转基因植物针对“HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂”的改善耐受性。
实施例7：温室实验
在温室实验中测试表达异源HPPD或HST酶的转基因植物针对HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的耐受性。
对于出苗前处理，播种后通过精细撒布型喷嘴直接施加除草剂。温和地灌溉容器以促进萌发和生长并随后用透明塑料罩盖住直至植物已经生根。这种罩子引起试验植物均匀萌发，除非这种萌发已经遭受除草剂破坏。
对于出苗后处理，取决于植物习性，首先将试验植物培育至3至15cm高度，并随后仅用除草剂处理。为此目的，将试验植物直接播种并且在同一个容器中培育，或首先将它们分别培育并在处理之前数天移栽至试验容器中。
为了检验T0植物，可以使用插枝。在大豆植物的情况下，用于插枝的最佳苗高约7.5至10cm，同时存在至少两个茎节。每种插枝取自原始转化体(母本植物)并浸入生根激素粉剂(吲哚-3-丁酸，IBA)中。随后将插枝置于bio-dome内部的绿洲楔块(oasiswedge)中。还同时取得野生型插枝以充当对照。将插枝在bio-dome中保持5-7天并且随后移栽至花钵并且随后在生长箱适应两天或更多天。随后，将插枝转移至温室，适应大约4天，并且随后进行如所示的喷洒试验。
根据物种，保持植物在10-25℃或20-35℃。试验时间延续3周。在这段时间期间，管护植物并且评价它们对各种处理的反应。在处理后2周和3周进行除草剂损伤评价。按0至9分评定植物损伤，0表示无损伤并且9表示彻底死亡。
也可以在拟南芥中评估对HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的耐受性。在这种情况下，在48孔平板中对转基因拟南芥植物分析针对HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的改善耐受性。通过在乙醇+水(以体积计70+30)中搅拌5分钟，用乙醇+水(以体积计70+30)漂洗一次并用无菌去离子水漂洗两次，对种子进行表面消毒。将种子重悬于溶解在水中的0.1％琼脂内(w/v)。将每孔四至五颗种子铺种在由半强度MurashigeSkoog营养液pH5.8(Murashige和Skoog(1962)PhysiologiaPlantarum15:473-497)组成的固态营养培养基上。将化合物溶解于二甲基亚砜(DMSO)中并添加至固化前的培养基(DMSO终浓度0.1％)。将多孔平板在生长箱中在22℃、75％相对湿度和110μmolPhot*m-2*s-1温育，14小时:10小时昼:夜光周期。播种后7至10天，通过与野生型植物比较，评价生长抑制情况。通过含有HPPD和/或HST序列的转基因植物的植物生长IC50值除以野生型植物的植物生长IC50值，计算耐受性系数。
另外，可以在温室中研究对T1和T2转基因拟南芥植物测试改善的HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂耐受性。在处理后2–3周进行除草剂损伤评定并且按0至100％评分排序，0％表示无损伤并且100％表示彻底死亡。
表17：在HPPD抑制剂存在下转基因拟南芥植物的萌发测定法。耐受性系数是来自平行评价的5个T2事件的均值。图3中显示代表性结果。
*该实施例中使用的抑制HPPD的除草剂是[[3-(4,5-二氢异噁唑-3-基)-2-甲基-4-甲磺酰基-苯基]-(5-羟-1-甲基-吡唑-4-基)甲酮(抑制剂1)和2-(4-甲磺酰基-2-硝基-苯甲酰)环己烷-1,3-二酮(抑制剂2)，n.d.未测定。
结果显示与未转化的对照植物相比，包含编码拟南芥HPPD的多核苷酸的植物对HPPD抑制性除草剂具有增加的耐受性，其对抑制剂1而言是9倍并且对抑制剂2而言是10倍。另外，可以从表17中所述的结果见到，将SEQIDNO:53中位置381处的苯丙氨酸置换成亮氨酸或异亮氨酸导致显著的抑制剂1耐受性。与野生型相比，这种突变体显示耐受性增加90倍。此外，位置335处的甲硫氨酸至组氨酸连同位置336处的脯氨酸交换成丙氨酸和位置363处的谷氨酸交换成谷氨酰胺的联合突变(SEQIDNO:53)导致HPPD酶明显改善，因为发现与未转化的野生型对照相比，突变的HPPD酶对抑制剂1具有25倍增加的耐受性。因此，在拟南芥HPPD序列(SEQ-ID：53)中引入氨基酸置换和随后在拟南芥中过量表达产生耐受HPPD抑制性除草剂的植物，并且因此，这些多核苷酸可以用来产生耐受除草剂的作物植物。显而易见，这里未描述的突变体是本发明的部分。
另外，可以从上述结果见到，与未转化的野生型对照相比，对SEQIDNO:2中320位置处亮氨酸的某些置换、优选交换成组氨酸，导致HPPD酶明显改善。因此，可以选择这些突变体，优选编码包含其中亮氨酸320交换成组氨酸的大麦HPPD的多核苷酸的突变体，作为包含抗抑制剂型HPPD的突变体，因为与野生型相比，这些植物对抑制HPPD的化合物具有超过100倍增加的耐受性并且因此可用于产生耐受除草剂的植物。此外，表达基于SEQ-ID:2的多核苷酸的植物对抑制HPPD的化合物(抑制剂1)显示明显的耐受性，所述多核苷酸包含位置320处的亮氨酸至组氨酸和位置321处的脯氨酸至丙氨酸的联合突变，因为发现这些植物对HPPD抑制性除草剂具有比未转化的对照高300倍的耐受性。因此显而易见，用编码大麦HPPD及其突变变体的多核苷酸转化的转基因拟南芥株系在本发明中具有突出意义，因为这些植物对抑制剂1具有增加的耐受性并且可以用来产生耐受HPPD抑制性除草剂的作物植物。
结果进一步显示，包含编码来自不同分类系统(如古细菌嗜酸古菌或细菌红球菌)的HPPD酶的多核苷酸的植物对抑制剂1分别具有10倍和32倍更高的耐受性系数。因此，可能选择编码来自不同生命进化枝的HPPD的多核苷酸以产生HPPD抗性植物。
显而易见，将有可能获得下述HPPD酶的任何突变或突变组合均是本发明主题物的部分，其中所述HPPD酶抵抗HPPD抑制性除草剂并且可以在植物中转化以介导除草剂耐受性，即便本文中未例举这种蛋白质。
表19：过量表达基于大麦HPPD的多核苷酸序列的转基因拟南芥植物(T2)的温室测试。除草剂处理后2周进行损伤评价。图5中显示代表性结果。
*该实施例中使用的抑制HPPD的除草剂是[[3-(4,5-二氢异噁唑-3-基)-2-甲基-4-甲磺酰基-苯基]-(5-羟-1-甲基-吡唑-4-基)甲酮(抑制剂1)和2-(4-甲磺酰基-2-硝基-苯甲酰)环己烷-1,3-二酮(抑制剂2)。
用不同的HPPD抑制性除草剂按剂量范围0.78-6.25g/ha喷洒转基因拟南芥植物，并且在处理后2周进行损伤评价。如表18中所述，对照植物被施加的全部除草剂剂量严重损伤，至少85％的叶物质在最低施加率时受损。当施加剂量3.125g/ha时，与对照相比，表达嗜酸古菌HPPD的植物对抑制剂1的易感性低1.6倍，并且耐受性在按两种最低施加率喷洒后增加，产生6.8倍耐受性。此外，过量表达嗜酸古菌HPPD(SEQ-ID:40)的拟南芥植物抵抗抑制剂2，因为不能在测试的施加率观察到叶损伤，而野生型对照植物严重受损。
另外，包含下述多核苷酸序列的转基因拟南芥植物对本发明中测试的HPPD抑制剂显示增加耐受性，所述多核苷酸序列编码其中氨基酸M335、P336、E363交换成H335、A335、Q363的SEQ-IDNO:53。施加最高浓度的有效成分仅导致最多15％的叶物质受损，相比之下野生型植物中100％受损。
此外，表19中所述的结果显示，包含编码其中亮氨酸320交换成组氨酸的SEQ-IDNO:2的多核苷酸的转基因拟南芥植物抵抗抑制剂2，而以本发明中测试的最低浓度施加抑制剂1时，这些植物对它的耐受性增加6.5倍。亮氨酸320至组氨酸和脯氨酸321至丙氨酸的联合突变产生在如实施例中所述的HPPD抑制剂处理时无损伤的HPPD抑制剂抗性植物株系。因此，大麦HPPD(SEQ-ID:2)中引入的突变具有突出意义并且可以用来产生抵抗HPPD抑制性除草剂的植物。
显而易见，将有可能获得下述HPPD酶的任何突变或突变组合均是本发明主题物的部分，其中所述HPPD酶抵抗HPPD抑制性除草剂并且可以在植物中转化，即便本文中未例举这种蛋白质。
用HPPD抑制性除草剂按剂量范围6.25-100g/ha喷洒转基因大豆植物，并且在处理后2周进行损伤评价。如表20中所述，对照植物被施加的全部除草剂剂量严重损伤，至少87.5％的叶物质在最低施加率时受损。与未转化的野生型相比，包含编码拟南芥HPPD野生型或其突变形式的多核苷酸的植物对抑制剂1的敏感性更低。例如，采用按25g/ha施加的抑制剂1处理时，包含编码SEQIDNO:53的多核苷酸的大豆植物显示仅3％的叶物质损伤，并且在用100g/ha有效成分(抑制剂1)喷洒后具有2倍耐受性。
它可以从以上实施例见到，可以选择编码被转化到作物植物的HPPD的多核苷酸作为赋予针对HPPD抑制性除草剂、尤其针对吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的抗性的一种多核苷酸，因为发现用这种多核苷酸转化的植物比非转化对照植物更少受吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂损害。
实施例8：田间试验
在田间实验中测试表达异源HPPD或HST酶的转基因植物针对HPPD抑制性除草剂的耐受性。
研究可以田间试验位置实施以评价HPPD除草剂对含有不同转基因的大豆品种的表型特征和物候特征的影响。
试验设计为采用分块处理设计(split-plottreatmentdesign)的完全随机区组试验。该试验含有由‘除草剂处理’(除草剂和施加率的组合)定义的主区。出苗后在V2-V3植物生长阶段应用除草剂处理。每个主区含有由‘转基因事件’(‘Jake’含有不同HPPD表达构建体之一的商业大豆品种)和Jake(对照)定义的子区。
每种试验区由1.2m长单行组成并且毗邻试验区相隔0.76m。含有转基因事件的每个试验区播下24颗T1种子。对照品种Jake按相同的播种率播种。在施加除草剂处理之前确定每个植物的转基因事件接合性。
在植物生长的不同营养期和繁殖期期间评价HPPD除草剂处理代表每个转基因事件和对照品种的植物的表型特征和物候特征的影响，包括对每个除草剂处理的耐受性。对采集自每个子区的数据实施方差分析，并且适宜情况下计算Student’st检验或Tukey’s检验以比较均值。本发明田间试验中所用的抑制剂是[[3-(4,5-二氢异噁唑-3-基)-2-甲基-4-甲磺酰基-苯基]-(5-羟-1-甲基-吡唑-4-基)甲酮(抑制剂1)。
如可以从图7见到，采用50g/ha抑制剂1处理7天后，表达包含突变拟南芥HPPD序列的多核苷酸的大豆植物显示低度-中度损伤。相反，未转化的对照植物显示严重除草剂损伤。
因此，本实施例表明可以选择突变体HPPD酶作为抵抗HPPD抑制性除草剂的一种HPPD酶，因为表达突变拟南芥HPPD蛋白的大豆植物的田间耐受性大于野生型对照植物。
显而易见，将有可能获得下述HPPD酶的任何突变或突变组合均是本发明主题物的部分，其中所述HPPD酶抵抗HPPD抑制性除草剂并且可以在植物中转化，即便本文中未例举这种蛋白质。

Claims (21)

1.一种在植物栽培地点控制不想要的植物的方法，所述方法包括步骤：
a)在所述地点提供包含至少一种核酸的植物，所述核酸包含
(i)编码抵抗或耐受HPPD抑制性除草剂的野生型羟苯基丙酮酸双加氧酶或突变的羟苯基丙酮酸双加氧酶(mut-HPPD)的核苷酸序列和/或
(ii)编码抵抗或耐受HPPD抑制性除草剂的野生型尿黑酸茄呢基转移酶或突变的尿黑酸茄呢基转移酶(mut-HST)的核苷酸序列
b)向所述地点施加有效量的所述除草剂，
其中(i)的核苷酸序列包含SEQIDNO:1、51、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、52、54、56、68、69的序列或其变体或衍生物，并且其中抑制HPPD的除草剂是吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物，并且其中mut-HPPD包含在与SEQIDNO:2的以下位置相对应的一个或多个位置与野生型HPPD的氨基酸序列不同的多肽：
对应于位置236或在位置236处的氨基酸除丙氨酸之外；
对应于位置411或在位置411处的氨基酸除谷氨酸之外；
对应于位置320或在位置320处的氨基酸除亮氨酸之外；
对应于位置403或在位置403处的氨基酸除甘氨酸之外；
对应于位置334或在位置334处的氨基酸除亮氨酸之外；
对应于位置353或在位置353处的氨基酸除亮氨酸之外；
对应于位置321或在位置321处的氨基酸除脯氨酸之外；
对应于位置212或在位置212处的氨基酸除缬氨酸之外；
对应于位置407或在位置407处的氨基酸除甘氨酸之外；
对应于位置377或在位置377处的氨基酸除苯丙氨酸之外；
对应于位置412或在位置412处的氨基酸除亮氨酸之外；
对应于位置278或在位置278处的氨基酸除谷氨酰胺之外；
对应于位置406或在位置406处的氨基酸除赖氨酸之外；
对应于位置404或在位置404处的氨基酸除苯丙氨酸之外；
对应于位置409或在位置409处的氨基酸除苯丙氨酸之外；
对应于位置416或在位置416处的氨基酸除异亮氨酸之外；
对应于位置250或在位置250处的氨基酸除亮氨酸之外；
对应于位置267或在位置267处的氨基酸除天冬酰胺之外；
对应于位置252或在位置252处的氨基酸除丝氨酸之外；
对应于位置265或在位置265处的氨基酸除脯氨酸之外；
对应于位置371或在位置371处的氨基酸除甘氨酸之外；
对应于位置375或在位置375处的氨基酸除苏氨酸之外；
对应于位置309或在位置309处的氨基酸除精氨酸之外；
对应于位置279或在位置279处的氨基酸除异亮氨酸之外；
对应于位置366或在位置366处的氨基酸除苯丙氨酸之外；
对应于位置238或在位置238处的氨基酸除苯丙氨酸之外；
对应于位置213或在位置213处的氨基酸除缬氨酸之外；
对应于位置215或在位置215处的氨基酸除天冬酰胺之外；
对应于位置410或在位置410处的氨基酸除丝氨酸之外；
对应于位置254或在位置254处的氨基酸除缬氨酸之外；
2.根据权利要求1所述的方法，其中(ii)的核苷酸序列包含SEQIDNO:47或49的序列或其变体或衍生物。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中植物包含至少一个额外的异源核酸，所述异源核酸包含(iii)编码耐除草剂的酶的核苷酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中将吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物结合一种或多种其他除草剂一起施加。
5.一种通过使用mut-HPPD和/或通过使用mut-HST鉴定吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物除草剂的方法，所述mut-HPPD由包含SEQIDNO:1、51、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、52、54、56、68、69的核苷酸序列或其变体或衍生物的核酸编码，所述mut-HST由包含SEQIDNO:47或49的核苷酸序列或其变体或衍生物的核酸编码。
6.根据权利要求5所述的方法，包括步骤：
a)产生包含编码mut-HPPD的核酸的转基因细胞或植物，其中表达mut-HPPD；
b)向a)的转基因细胞或植物并向相同品种的对照细胞或植物施加抑制HPPD的测试化合物；
c)在施加所述测试化合物后测定转基因细胞或植物和对照细胞或植物的生长或生存力，并且
d)选择与转基因细胞或植物的生长相比引起对照细胞或植物生长减少的测试化合物。
7.一种鉴定编码mut-HPPD的核苷酸序列的方法，所述mut-HPPD抵抗或耐受HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物，所述方法包括：
a)产生编码mut-HPPD的核酸的文库，
b)通过在细胞或植物中表达每种所产生的编码mut-HPPD的核酸并且用HPPD抑制性除草剂处理所述细胞或植物，筛选所述核酸的群体
c)将所述编码mut-HPPD的核酸的群体提供的吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物耐受水平与编码对照HPPD的核酸提供的HPPD抑制性除草剂耐受水平比较，
d)选出至少一个编码mut-HPPD的核酸，所述核酸提供与编码对照HPPD的核酸提供的耐受性水平相比显著增加的吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物耐受性水平。
8.根据权利要求7所述的方法，其中与编码对照HPPD的核酸提供的耐受性相比，步骤d)中选出的编码mut-HPPD的核酸提供针对HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物至少有2倍的耐受性。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中通过以下方式确定抗性或耐受性：产生包含步骤a)的文库的核酸序列的转基因植物并且比较所述转基因植物与对照植物。
10.编码mut-HPPD的分离核酸，其中mut-HPPD包含在与SEQIDNO:2的以下位置相对应的一个或多个位置与野生型HPPD的氨基酸序列不同的多肽：
对应于位置236或在位置236处的氨基酸除丙氨酸之外；
对应于位置411或在位置411处的氨基酸除谷氨酸之外；
对应于位置320或在位置320处的氨基酸除亮氨酸之外；
对应于位置403或在位置403处的氨基酸除甘氨酸之外；
对应于位置334或在位置334处的氨基酸除亮氨酸之外；
对应于位置353或在位置353处的氨基酸除亮氨酸之外；
对应于位置321或在位置321处的氨基酸除脯氨酸之外；
对应于位置212或在位置212处的氨基酸除缬氨酸之外；
对应于位置407或在位置407处的氨基酸除甘氨酸之外；
对应于位置377或在位置377处的氨基酸除苯丙氨酸之外；
对应于位置412或在位置412处的氨基酸除亮氨酸之外；
对应于位置278或在位置278处的氨基酸除谷氨酰胺之外；
对应于位置406或在位置406处的氨基酸除赖氨酸之外；
对应于位置404或在位置404处的氨基酸除苯丙氨酸之外；
对应于位置409或在位置409处的氨基酸除苯丙氨酸之外；
对应于位置416或在位置416处的氨基酸除异亮氨酸之外；
对应于位置250或在位置250处的氨基酸除亮氨酸之外；
对应于位置267或在位置267处的氨基酸除天冬酰胺之外；
对应于位置252或在位置252处的氨基酸除丝氨酸之外；
对应于位置265或在位置265处的氨基酸除脯氨酸之外；
对应于位置371或在位置371处的氨基酸除甘氨酸之外；
对应于位置375或在位置375处的氨基酸除苏氨酸之外；
对应于位置309或在位置309处的氨基酸除精氨酸之外；
对应于位置279或在位置279处的氨基酸除异亮氨酸之外；
对应于位置366或在位置366处的氨基酸除苯丙氨酸之外；
对应于位置238或在位置238处的氨基酸除苯丙氨酸之外；
对应于位置213或在位置213处的氨基酸除缬氨酸之外；
对应于位置215或在位置215处的氨基酸除天冬酰胺之外；
对应于位置410或在位置410处的氨基酸除丝氨酸之外；
对应于位置254或在位置254处的氨基酸除缬氨酸之外；
11.编码mut-HPPD的分离核酸，其中mut-HPPD包含在与SEQIDNO:53的以下位置相对应的一个或多个位置与野生型HPPD的氨基酸序列不同的多肽：
对应于位置228或在位置228处的氨基酸除缬氨酸之外；
对应于位置230或在位置230处的氨基酸除天冬酰胺之外；
对应于位置251或在位置251处的氨基酸除丙氨酸之外；
对应于位置253或在位置253处的氨基酸除苯丙氨酸之外；
对应于位置265或在位置265处的氨基酸除亮氨酸之外；
对应于位置267或在位置267处的氨基酸除丝氨酸之外；
对应于位置280或在位置280处的氨基酸除脯氨酸之外；
对应于位置282或在位置282处的氨基酸除天冬酰胺之外；
对应于位置291或在位置291处的氨基酸除赖氨酸之外；
对应于位置293或在位置293处的氨基酸除谷氨酰胺之外；
对应于位置294或在位置294处的氨基酸除异亮氨酸之外；
对应于位置324或在位置324处的氨基酸除精氨酸之外；
对应于位置335或在位置335处的氨基酸除甲硫氨酸之外；
对应于位置336或在位置336处的氨基酸除脯氨酸之外；
对应于位置337或在位置337处的氨基酸除丝氨酸之外；
对应于位置339或在位置339处的氨基酸除脯氨酸之外；
对应于位置340或在位置340处的氨基酸除脯氨酸之外；
对应于位置363或在位置363处的氨基酸除谷氨酸之外；
对应于位置368或在位置368处的氨基酸除亮氨酸之外；
对应于位置381或在位置381处的氨基酸除苯丙氨酸之外；
对应于位置385或在位置385处的氨基酸除亮氨酸之外；
对应于位置386或在位置386处的氨基酸除甘氨酸之外；
对应于位置390或在位置390处的氨基酸除苏氨酸之外；
对应于位置392或在位置392处的氨基酸除苯丙氨酸之外；
对应于位置393或在位置393处的氨基酸除异亮氨酸之外；
对应于位置419或在位置419处的氨基酸除苯丙氨酸之外；
对应于位置421或在位置421处的氨基酸除赖氨酸之外；
对应于位置422或在位置422处的氨基酸除甘氨酸之外；
对应于位置424或在位置424处的氨基酸除苯丙氨酸之外；
对应于位置427或在位置427处的氨基酸除亮氨酸之外；
对应于位置431或在位置431处的氨基酸除异亮氨酸之外；
对应于位置425或在位置425处的氨基酸除丝氨酸之外；
对应于位置269或在位置269处的氨基酸除缬氨酸之外。
12.由野生型或mut-HPPD核酸转化的转基因植物细胞，其中与植物细胞的野生型品种相比，核酸在植物细胞中的表达导致增加的针对HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物的抗性或耐受性，
并且其中野生型或mut-HPPD核酸包含选自以下的多核苷酸序列：a)如SEQIDNO:1、51、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、52、54、56、68、69中所示的多核苷酸或其变体或衍生物；b)如SEQIDNO:47或49中所示的多核苷酸或其变体或衍生物；c)编码如SEQIDNO:2、5、8、11、14、17、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、53、55、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、48、50中所示的多肽的多核苷酸或其变体或衍生物；d)包含a)至c)中任一者的至少60个连续核苷酸的多核苷酸；和e)与a)至d)中任一者的多核苷酸互补的多核苷酸。
13.包含如权利要求12的任一者中所限定的植物细胞的转基因植物，其中与植物的野生型品种相比，核酸在植物中的表达导致植物增加的针对HPPD抑制性除草剂，优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物的抗性。
14.植物，表达包含SEQIDNO:2的诱变或重组mut-HPPD、其同源物，直向同源物或旁系同源物，其中氨基酸序列在一个或多个氨基酸位置不同于相应野生型植物的HPPD氨基酸序列：
对应于位置236或在位置236处的氨基酸除丙氨酸之外；
对应于位置411或在位置411处的氨基酸除谷氨酸之外；
对应于位置320或在位置320处的氨基酸除亮氨酸之外；
对应于位置403或在位置403处的氨基酸除甘氨酸之外；
对应于位置334或在位置334处的氨基酸除亮氨酸之外；
对应于位置353或在位置353处的氨基酸除亮氨酸之外；
对应于位置321或在位置321处的氨基酸除脯氨酸之外；
对应于位置212或在位置212处的氨基酸除缬氨酸之外；
对应于位置407或在位置407处的氨基酸除甘氨酸之外；
对应于位置377或在位置377处的氨基酸除苯丙氨酸之外；
对应于位置412或在位置412处的氨基酸除亮氨酸之外；
对应于位置278或在位置278处的氨基酸除谷氨酰胺之外；
对应于位置406或在位置406处的氨基酸除赖氨酸之外；
对应于位置404或在位置404处的氨基酸除苯丙氨酸之外；
对应于位置409或在位置409处的氨基酸除苯丙氨酸之外；
对应于位置416或在位置416处的氨基酸除异亮氨酸之外；
对应于位置250或在位置250处的氨基酸除亮氨酸之外；
对应于位置267或在位置267处的氨基酸除天冬酰胺之外；
对应于位置252或在位置252处的氨基酸除丝氨酸之外；
对应于位置265或在位置265处的氨基酸除脯氨酸之外；
对应于位置371或在位置371处的氨基酸除甘氨酸之外；
对应于位置375或在位置375处的氨基酸除苏氨酸之外；
对应于位置309或在位置309处的氨基酸除精氨酸之外；
对应于位置279或在位置279处的氨基酸除异亮氨酸之外；
对应于位置366或在位置366处的氨基酸除苯丙氨酸之外；
对应于位置238或在位置238处的氨基酸除苯丙氨酸之外；
对应于位置213或在位置213处的氨基酸除缬氨酸之外；
对应于位置215或在位置215处的氨基酸除天冬酰胺之外；
对应于位置410或在位置410处的氨基酸除丝氨酸之外；
对应于位置254或在位置254处的氨基酸除缬氨酸之外；
并且其中在植物中表达时，与植物的相应野生型品种相比，所述诱变或重组mut-HPPD赋予植物增加的除草剂耐受性，优选针对吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物的耐受性。
15.表达包含SEQIDNO:53的诱变或重组mut-HPPD、其同源物，直向同源物或旁系同源物的植物，其中氨基酸序列在一个或多个氨基酸位置不同于相应野生型植物的HPPD氨基酸序列：
对应于位置228或在位置228处的氨基酸除缬氨酸之外；
对应于位置230或在位置230处的氨基酸除天冬酰胺之外；
对应于位置251或在位置251处的氨基酸除丙氨酸之外；
对应于位置253或在位置253处的氨基酸除苯丙氨酸之外；
对应于位置265或在位置265处的氨基酸除亮氨酸之外；
对应于位置267或在位置267处的氨基酸除丝氨酸之外；
对应于位置280或在位置280处的氨基酸除脯氨酸之外；
对应于位置282或在位置282处的氨基酸除天冬酰胺之外；
对应于位置291或在位置291处的氨基酸除赖氨酸之外；
对应于位置293或在位置293处的氨基酸除谷氨酰胺之外；
对应于位置294或在位置294处的氨基酸除异亮氨酸之外；
对应于位置324或在位置324处的氨基酸除精氨酸之外；
对应于位置335或在位置335处的氨基酸除甲硫氨酸之外；
对应于位置336或在位置336处的氨基酸除脯氨酸之外；
对应于位置337或在位置337处的氨基酸除丝氨酸之外；
对应于位置339或在位置339处的氨基酸除脯氨酸之外；
对应于位置340或在位置340处的氨基酸除脯氨酸之外；
对应于位置363或在位置363处的氨基酸除谷氨酸之外；
对应于位置368或在位置368处的氨基酸除亮氨酸之外；
对应于位置381或在位置381处的氨基酸除苯丙氨酸之外；
对应于位置385或在位置385处的氨基酸除亮氨酸之外；
对应于位置386或在位置386处的氨基酸除甘氨酸之外；
对应于位置390或在位置390处的氨基酸除苏氨酸之外；
对应于位置392或在位置392处的氨基酸除苯丙氨酸之外；
对应于位置393或在位置393处的氨基酸除异亮氨酸之外；
对应于位置419或在位置419处的氨基酸除苯丙氨酸之外；
对应于位置421或在位置421处的氨基酸除赖氨酸之外；
对应于位置422或在位置422处的氨基酸除甘氨酸之外；
对应于位置424或在位置424处的氨基酸除苯丙氨酸之外；
对应于位置427或在位置427处的氨基酸除亮氨酸之外；
对应于位置431或在位置431处的氨基酸除异亮氨酸之外；
对应于位置425或在位置425处的氨基酸除丝氨酸之外；
对应于位置269或在位置269处的氨基酸除缬氨酸之外。
并且其中在植物中表达时，与植物的相应野生型品种相比，所述HPPD赋予植物增加的除草剂耐受性，优选针对吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物的耐受性。
16.由包含如权利要求12任一者中所限定的植物细胞的转基因植物或根据权利要求13至15任一者所述的植物产生的种子，其中与种子的野生型品种相比，种子对于HPPD抑制性除草剂抗性增加是纯合的。
17.一种产生转基因植物细胞的方法，所述转基因植物细胞与植物细胞的野生型品种相比具有增加的针对HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物的抗性，所述方法包括用包含HPPD核酸的表达盒转化植物细胞。
18.一种产生转基因植物的方法，包括：(a)用包含HPPD核酸的表达盒转化植物细胞，和(b)从所述植物细胞产生具有增加的针对HPPD抑制性除草剂、优选吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物的抗性的植物。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中HPPD核酸包含选自以下的多核苷酸序列：a)如SEQIDNO:1、51、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、52、54、56、68、69中所示的多核苷酸或其变体或衍生物；b)如SEQIDNO:47或49中所示的多核苷酸或其变体或衍生物；c)编码如SEQIDNO:2、5、8、11、14、17、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、53、55、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、48、50中所示的多肽的多核苷酸或其变体或衍生物；d)包含a)至c)中任一者的至少60个连续核苷酸的多核苷酸；和e)与a)至d)中任一者的多核苷酸互补的多核苷酸。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的方法，其中表达盒还包含在植物中有功能的转录起始调节区和翻译起始调节区。
21.一种鉴定或选择转化的植物细胞、植物组织、植物或其部份的方法，包括：i)提供转化的植物细胞、植物组织，植物或其部份，其中所述转化的植物细胞、植物组织、植物或其部份包含如SEQIDNO:1、51、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、52、54、56、68、69中所示的多核苷酸或其变体或衍生物，其中多核苷酸编码作为选择标记使用的HPPD多肽，并且其中所述转化的植物细胞、植物组织、植物或其部份可以包含另一种分离的多核苷酸；ii)使转化的植物细胞、植物组织、植物或其部份与至少一种吡唑酮、异噁唑或三酮衍生物接触；iii)确定植物细胞、植物组织、植物或其部份是否受抑制性化合物影响；和iv)鉴定或选择转化的植物细胞、植物组织、植物或其部份。
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