CN1232503C

CN1232503C - 丙烯羧酸偕胺肟衍生物,其制备方法及其药物组合物

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Publication number: CN1232503C
Application number: CNB018084400A
Authority: CN
Inventors: P·利特拉迪纳吉; B·苏米基; K·塔卡克斯
Original assignee: N-Gene Research Laboratories Inc
Current assignee: N-Gene Research Laboratories Inc
Priority date: 2000-03-20
Filing date: 2001-03-13
Publication date: 2005-12-21
Anticipated expiration: 2021-03-13
Also published as: IL151669A0; US20050165019A1; DE60103140T2; RU2264387C2; SK13502002A3; BR0109430A; CA2404128C; NZ521792A; PT1268407E; NO20024341L; DE60103140D1; JP2003528073A; ES2220753T3; US20030153559A1; MXPA02009216A; PL358393A1; US6887872B2; CA2404128A1; TR200401912T4; EP1268407B1

Abstract

本发明涉及新的丙烯羧酸偕胺肟衍生物及其N-氧化物和/或几何异构体和/或旋光异构体和/或药用酸加成盐和/或季铵盐衍生物。这些新的化合物适于治疗与氧和/或能量缺乏有关的病症、或基于PARP抑制的疾病特别是自身免疫性或神经变性疾病和/或病毒疾病、和/或中毒引起的疾病。

Description

丙烯羧酸偕胺肟衍生物，其制备方法及其药物组合物

发明领域

本发明涉及新的丙烯羧酸偕胺肟衍生物，其制备方法及其药物组合物。这些新的化合物有价值的药学作用，因此，它们可以特别用于与细胞的能量缺乏相关的状态、心脏和大脑的缺氧状态、神经变性疾病、自身免疫和/或病毒疾病的治疗，进一步用于中毒引起的疾病。

发明背景

一些Δ²-1，2，4-噁二唑啉-5-酮衍生物的制备描述于Chem.Ber.，103，2330-2335(1970)，其中没有提及其任何可能的生物作用。由上述化合物，制备5，6-二氢-4H-1，2，4-噁二嗪衍生物在Chem.Ber.，108，1911-1923(1975)中进行了讨论，其中同样没有提及任何生物作用。

由HU-P No.179 951知1，2，4-噁二唑啉-5-酮衍生物具有外周血管舒张、抗心绞痛和抗心律不齐作用。由HU-P No.180 708知1，2，4-噁二嗪衍生物具有外周血管舒张和降血压、抗心律不齐、轻微的抗炎和利尿作用。但是，已知的1，2，4-噁二唑啉-5-酮和1，2，4-噁二嗪衍生物不含有任何链烯基取代基，即它们无法得自丙烯羧酸偕胺肟。

本发明的目的是制备具有有价值的药学作用的新化合物。

发明概述

我们发现上述目的可以通过涉及下式的新的丙烯羧酸偕胺肟衍生物及其N-氧化物或几何异构体和/或旋光异构体和/或药用酸加成盐和/或季铵盐衍生物来实现

其中

R表示C₁-C₂₀烷基、苯基，其中后者被1-3个取代基任选地取代——其中取代基是卤原子和/或C₁-C₂烷基和/或C₁-C₂烷氧基和/或氨基和/或(C₁-C₄烷基)氨基和/或二(C₁-C₄烷基)氨基和/或(C₁-C₄烷酰基)氨基——，此外还表示5-或6-员饱和或不饱和杂环基团，其中含有一个或两个氮原子或一个硫原子作为杂原子且所述杂环基团任选地与一个或多个苯环和/或一个或多个杂环基团稠合，而

R′表示氢原子，或

R与R′一起形成C₅-C₇环烷基，其任选地与苯环稠合，

R₄和R₅独立地表示氢原子、C₁-C₅烷基、C₁-C₅烷酰基或苯基，其中后者被1-3个取代基任选地取代——其中取代基是卤原子和/或C₁-C₂烷基和/或C₁-C₂烷氧基——，或

R₄和R₅与相邻的氮原子一起形成5-或6-员饱和或不饱和杂环基团，其可以含有另一个氮原子和/或氧原子和/或硫原子作为杂原子并可以与苯环稠合，且此杂环基团和/或此苯环可以带有一个或两个取代基，其中该取代基是卤原子和/或C₁-C₂烷基和/或C₁-C₂烷氧基，

R₁和R₂表示氢原子，而

R₃指氢原子、羟基或C₁-C₅烷氧基，或

R₁与R₂一起形成羰基或硫羰基，其中的碳原子与比邻R₁的氧原子和比邻R₂的氮原子结合，而

R₃表示氢原子，卤原子，羟基，C₁-C₅烷氧基，C₁-C₅烷硫基，C₁-C₂₀烷酰氧基，含有一个或多个双键的C₃-C₂₂链烯酰氧基，甲磺酰氧基，苯磺酰氧基或甲苯磺酰氧基，或

R₂是氢原子，而

R₁与R₃一起在比邻R₁的氧原子和比邻R₃的碳原子之间形成一个价键。

优选实施方案的描述

在说明书和权利要求书中，C₁-C₂₀烷基，例如，指甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、异丁基、正戊基、正己基、正庚基、正癸基、十二烷基、十六烷基、十八烷基等。

卤原子主要指氟、氯或溴原子，优选氯和溴原子。

C₁-C₂烷基是甲基或乙基，而C₁-C₂烷氧基是甲氧基或乙氧基。

C₁-C₄烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基或异丁基。C₁-C₅烷基除上述基团外，例如，正戊基。

(C₁-C₄烷基)氨基是，例如，甲基氨基、乙基氨基、异丙基氨基等。二(C₁-C₄烷基)氨基是，例如，二甲基氨基、二乙基氨基、甲基异丙基氨基等。

C₁-C₄烷酰基优选是，甲酰基、乙酰基、正丙酰基或正丁酰基。除所述所列基团外，C₁-C₅烷酰基也可以是，例如，正戊酰基。

含有一个或两个氮原子或硫原子作为杂原子的5-或6-员饱和或不饱和杂环基团是，例如，吡咯基、pyratolyl、咪唑基、噻吩基、吡啶基、哌啶基、嘧啶基、哌嗪基等。

任选地与苯环稠合的C₅-C₇环烷基是，例如，环戊基、环己基、环庚基、二氢化茚基或四氢萘基。

除了与取代基R₄和R₅相邻的氮原子外还可以含有氮原子和/或氧原子和/或硫原子作为杂原子的5-或6-员饱和或不饱和杂环基团，除上述杂环基团外，可以是，例如，4-吗啉基。

C₁-C₂₀烷酰氧基是，例如，甲酰氧基、乙酰氧基、丙酰氧基、丁酰氧基、辛酰氧基、棕榈酰氧基、硬脂酰氧基等。

C₃-C₂₂链烯酰氧基一般可以含有1-6个双键，并优选是，亚麻酰氧基、亚油酰氧基、二十二碳六烯酰氧基、二十碳五烯酰氧基或二十碳四烯酰氧基。

式I的丙烯羧酸偕胺肟衍生物及其N-氧化物的药用酸加成盐是与以下酸形成的酸加成盐：无机酸，如盐酸、硫酸、磷酸等，或有机酸，如乙酸、富马酸、乳酸、酒石酸、琥珀酸、苹果酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等。

在式I化合物及其N-氧化物的季铵盐衍生物中，丙烯羧酸偕胺肟的一个或多个氮原子被季铵化，即，例如，其它C₁-C₄烷基或苯基(C₁-C₄烷基)连接在所述碳原子上，因此所述碳原子变为带正电荷。在式I化合物中存在的氮原子，特别适合的是与取代基R₄和R₅相邻的一个氮原子，被季铵化。在式I中，如果R表示含有一个氮原子的杂环基团如吡啶基，则所述杂环基团的该氮原子也可以被季铵化。

式I化合物的N-氧化物中，一个或多个氮原子以氧化形式存在，因此，有一个氧原子也结合在所述碳原子上。存在于式I中的氮原子，特别适合的是与取代基R₄和R₅相邻的，可以以N-氧化物的形式存在。在式I中，如果R表示含有一个氮原子的杂环基团如吡啶基，所述杂环基团的该氮原子也可以以N-氧化物的形式存在。

由于式I中存在的双键，新的式I的丙烯羧酸衍生物及其N-氧化物可以以几何异构体的形式存在，即顺式或反式异构体或者其任何混合物。本发明包括纯的几何异构体及其任何混合物。

除几何异构形式外，某些式I的化合物及其N-氧化物含有一个或多个手性碳原子，于是，这些化合物也可以以旋光异构体的形式存在。本发明还包括纯的旋光异构体及其任何混合物。

优选的一类本发明的化合物包括下式的丙烯羧酸偕胺肟衍生物

其中

R₁和R₂表示氢原子，R₃表示氢原子、羟基或C₁-C₅烷氧基，

R，R′，R₄和R₅定义如上，

及其N-氧化物或几何异构体和/或旋光异构体和/或药用酸加成盐和/或季铵盐衍生物。

另一类本发明优选的化合物包括下式的噁二唑啉衍生物

其中

R₁与R₂一起形成羰基或硫羰基，其中的碳原子与比邻R₁的氧原子和比邻R₂的氮原子结合，

R₃表示氢原子、卤原子、羟基、C₁-C₅烷氧基、C₁-C₅烷硫基、C₁-C₅烷酰氧基、含有一个或多个双键的C₃-C₂₂链烯酰氧基、甲磺酰氧基、苯磺酰氧基或甲苯磺酰氧基，

X表示氧原子或硫原子，

R，R′，R₄和R₅定义如式I，

进一步优选的本发明的一类化合物包括下式的噁二嗪衍生物

其中

R₂是氢原子，而

R₁与R₃一起在比邻R₁的氧原子和比邻R₃的碳原子之间形成一个价键，R、R′、R₄和R₅定义如式I，

式I的丙烯羧酸偕胺肟衍生物制备如下：

a)为了制备式Ia的丙烯羧酸偕胺肟衍生物，其中R₁、R₂和R₃表示氢原子，R、R′、R₄和R₅定义如式I，下式的丙烯衍生物

其中R、R′、R₃、R₄和R₅定义如上，Y表示卤原子或式-SR₆的基团，其中R₆指氢原子或C₁-C₄烷基，与羟胺反应；或

b)为了制备式Ia的丙烯羧酸偕胺肟衍生物，其中R₁和R₂表示氢原子，R₃表示氢原子或羟基，R、R′、R₄和R₅定义如式I，式Ib的噁二唑啉衍生物，其中R、R′、R₃、R₄和R₅定义如上，X表示氧原子或硫原子，与碱金属氢氧化物的水溶液反应；或

c)为了制备式Ib的噁二唑啉衍生物，其中R₃表示氢原子，X表示氧原子，R、R′、R₄和R₅定义如式I，下式的Δ²-1，2，4-噁二唑啉衍生物

其中R和R′定义如上，与下式的氨基烷基卤化物反应

其中Z指卤原子，R₃、R₄和R₅定义如上；或

d)为了制备式Ib的噁二唑啉衍生物，其中R₃表示氢原子或羟基，X表示氧原子，R、R′、R₄和R₅定义如式I，式III的Δ²-1，2，4-噁二唑啉衍生物，其中R和R′定义如上，与下式的1，3-二卤代丙烷反应

其中Z和Z₁独立地表示卤原子，R₃定义如上，并将所得下式的Δ²-1，2，4-噁二唑啉基烷基卤化物

其中R、R′、R₃和Z定义如上，与下式的胺反应

其中R₄和R₅定义如上；或

e)为了制备式Ib的噁二唑啉衍生物，其中R₃表示羟基，X表示氧原子，R、R′、R₄和R₅定义如式I，式III的Δ²-1，2，4-噁二唑啉衍生物，其中R和R′定义如上，与环氧氯丙烷反应，并将所形成的下式的Δ²-1，2，4-噁二唑啉基烷基氯

其中R和R′定义如上，与式VII的胺反应，其中R₄和R₅定义如上；或

f)为了制备式Ib的噁二唑啉衍生物，其中R₃表示羟基，X表示氧原子，R、R′、R₄和R₅定义如式I，式VIII的Δ²-1，2，4-噁二唑啉基烷基氯，其中R和R′定义如上，与酸结合剂反应，并将所形成的下式的环氧化物

g)为了制备式Ib的噁二唑啉衍生物，其中R₃表示氢原子或羟基，X表示氧原子或硫原子，R、R′、R₄和R₅定义如式I，式Ia的丙烯羧酸偕胺肟衍生物，其中R、R′、R₃、R₄和R₅定义如上，与下式的碳酸衍生物反应

其中X定义如上，Z₂和Z₃独立地表示卤原子、C₁-C₄烷氧基或C₁-C₄烷巯基；或

h)为了制备式Ic的噁二嗪衍生物，其中R、R′、R₄和R₅定义如式I，式Ib的噁二唑啉衍生物，其中R、R′、R₄和R₅定义如上，X表示氧原子或硫原子，R₃指卤原子、甲磺酰氧基、苯磺酰氧基或甲苯磺酰氧基，在水的存在下与碱金属氢氧化物反应；或

i)为了制备式Ic的噁二嗪衍生物，其中R、R′、R₄和R₅定义如式I，下式的环化合物

其中R和R′定义如上，R₇表示卤原子、甲磺酰氧基、苯磺酰氧基或甲苯磺酰氧基，与式VII的胺反应，其中R₄和R₅定义如上；或

j)为了制备下式的季铵盐衍生物

其中R、R′、R₁、R₂、R₃、R₄和R₅定义如式I，R₈表示C₁-C₄烷基或苯基(C₁-C₄烷基)基团，Y表示卤原子或式R₈-SO₄的基团，其中R₈定义如上，式III的Δ²-1，2，4-噁唑啉衍生物，其中R和R′定义如上，与下式的季铵烷基卤化物反应

其中R₃、R₄、R₅、R₈和Y定义如上，Z表示卤原子；或

k)为了制备下式的N-氧化物

其中R、R′、R₁、R₂、R₃、R₄和R₅定义如式I，式III的Δ²-1，2，4-噁二唑啉衍生物，其中R和R′定义如上，与下式的化合物反应

其中R₃、R₄和R₅定义如上，Z表示卤原子；且

如果需要，所得式Ib的化合物，其中R₃表示羟基，R、R′、R₄和R₅定义如式I，X表示氧原子或硫原子，与卤化试剂反应得到式Ib的化合物，其中R₃是卤原子；或

如果需要，所得式Ib的化合物，其中R₃表示羟基，R、R′、R₄和R₅定义如式I，X表示氧原子或硫原子，与C₁-C₂₀烷基酰卤化物或含有一个或多个双键的C₃-C₂₂烯基酰卤化物反应得到式Ib的化合物，其中R₃表示C₁-C₂₀烷酰氧基或C₃-C₂₂烯酰氧基；或

如果需要，所得式Ib的化合物，其中R₃表示羟基，R、R′、R₄和R₅定义如式I，X表示氧原子或硫原子，与C₁-C₅烷基卤化物反应得到式Ib的化合物，其中R₃表示C₁-C₅烷氧基；或

如果需要，所得式Ib的化合物，其中R₃表示卤原子，R、R′、R₄和R₅定义如式I，X表示氧原子或硫原子，与C₁-C₅烷醇或C₁-C₅硫代烷醇的碱金属盐反应得到式Ib的化合物，其中R₃指C₁-C₅烷氧基或C₁-C₅烷硫基；或

如果需要，所得式Ib的化合物，其中R₃表示羟基，R、R′、R₄和R₅定义如式I，X表示氧原子或硫原子，与甲基磺酰基卤化物、苯磺酰基卤化物或甲苯磺酰基卤化物反应得到式Ib的化合物，其中R₃表示甲基磺酰氧基，苯磺酰氧基或甲苯磺酰氧基；且

如果需要，所得式I的化合物与无机酸或有机酸反应得到药用酸加成盐，或由酸加成盐得到游离碱，和/或用烷基化试剂将式I化合物的一个或多个氮原子季铵化，和/或式I的化合物与氧化剂反应将其一个或多个氮原子转变为N-氧化物。

在本发明的方法a)中，式II的丙烯衍生物与羟胺的反应在溶剂或溶剂混合物中用羟胺碱进行，该碱也可以通过加入强碱就地从其酸加成盐中释放。所形成的式Ia的产物用本领域技术人员已知的方式分离，例如，通过从该反应混合物中结晶或通过将该反应混合物蒸发或通过沉淀其酸加成盐。

如果使用式II的丙烯衍生物，其中Y表示卤原子，该溶剂是无水惰性有机溶剂，例如，卤代烃如氯仿、二氯甲烷等，烃如苯、甲苯等，或者是常用于酰化反应的任何其它溶剂如吡啶。

如果使用式II的丙烯衍生物，其中Y表示式-SR₆的基团，除上述类型的溶剂外，例如，也可以将烷醇作为有机溶剂来使用。

式II的丙烯衍生物，其中Y表示卤原子，通常为氯原子，——实际上所述化合物是亚胺酰基卤化物，一般是亚胺酰基氯，由下式的相应的酰胺

其中R、R′、R₄和R₅定义如式I，R₃表示氢原子或C₁-C₅烷氧基，通过与卤化试剂，一般是亚硫酰氯、三氯化磷、五氯化磷等，以文献中已知的方式反应来制备。

式II的丙烯衍生物，其中Y表示巯基，例如，可以由相应的式XVI的酰胺与五氯化磷在有机溶剂如甲苯、二甲苯或吡啶中以文献中已知的方式反应来制备。式II的丙烯衍生物，其中Y表示烷硫基，通过式II的丙烯衍生物，其中Y指巯基，与烷基化试剂反应来制备。在本发明的方法b)中，通过使用Chem.Ber.， 103，2330-2335(1970)的方法将噁二唑啉环打开，该方法包括在含水介质中进行碱水解。作为碱金属氢氧化物，在其水溶液中一般使用氢氧化钾或氢氧化钠，如果需要，该溶液中也加入有机溶剂，优选脂族醇如甲醇或乙醇。在本发明的方法中，在反应混合物的沸点，在短时间内，此噁二唑啉开环，并以良好的收率得到式Ia的化合物。可以如方法a)，以本领域技术人员已知的方式分离反应产物。

在本发明的方法c)中，该反应在有机溶剂中，在酸结合剂的存在下，一般在该反应混合物的沸点下进行，该有机溶剂对该反应而言是惰性的。惰性有机溶剂是，例如，烷醇如甲醇或乙醇，烃如苯、甲苯或二甲苯或其混合物。作为酸结合剂，可以使用无机或有机碱。该反应混合物可以用常规方法处理，例如，蒸发溶剂和结晶产物或沉淀其酸加成盐。

式III的Δ²-1，2，4-噁二唑啉衍生物可以由相应的偕胺肟通过与碳酸衍生物反应来制备。一些具有代表性的偕胺肟见Chem.Rews.， 62，155(1962)。按照该文献中描述的方法，由相应的丙烯羧基腈通过与羟胺反应可以制备新的偕胺肟。大多数式IV的氨基烷基卤化物是已知化合物，它们可以购买或可以以简单的方式通过1，3-二卤代丙烷与式VII的胺反应来制备。

在本发明的方法d)中，烷基化反应——即式III的Δ²-1，2，4-噁二唑啉衍生物与式V的1，3-二卤代丙烷的反应，和氨基化反应——即所形成的式VI的Δ²-1，2，4-噁二唑啉基烷基卤化物与式VII的胺的反应，都在对该反应是惰性的有机溶剂中，在酸结合剂一般是无机碱如氢氧化钠或碳酸钠的存在下，一般在该反应混合物的沸点下进行。在烷基化反应中所形成的式VI的Δ²-1，2，4-噁二唑啉基烷基卤化物或者结晶，或者不经结晶在蒸发后用于胺化反应。所形成的式Ib的反应产物以本领域技术人员已知的方式用上述任何方法进行分离。惰性有机溶剂可以是烃或卤代脂族或芳族烃如氯仿，烷醇如甲醇或乙醇，酮如丙酮或所述溶剂的混合物。

在本发明方法e)中，式III的Δ²-1，2，4-噁二唑啉衍生物环氧氯丙烷的反应在惰性溶剂中或者在不存在任何溶剂的情况下，一般在该反应混合物的沸点下进行，优选环氧氯丙烷过量。惰性溶剂可以是，例如，烃，醚如二噁烷、四氢呋喃等。碱如氢氧化钠、碳酸钠等用作催化剂。反应结束时，蒸发溶剂并将该残余物结晶。所形成的式VIII的Δ²-1，2，4-噁二唑啉基烷基氯与式VII的胺以方法d)的胺化反应中所描述的类似方式反应。所形成的式Ib的反应产物以本领域技术人员已知的方式用所述任何方法进行分离。

在本发明方法f)中，酸结合剂是，例如，碱金属碳酸盐如碳酸钠、碳酸钾等，或碱金属氢氧化物如氢氧化钠、氢氧化钾等。为了制备式IX的环氧化物，该反应在惰性有机溶剂中，一般在该反应混合物的沸点下进行。作为惰性溶剂，使用，例如，烃，丙酮，醚如四氢呋喃或二噁烷，卤代脂族或芳族烃。将反应混合物过滤，蒸发滤液，并将所形成的式IX的环氧化物结晶，再以方法d)中胺化反应方式与式VII的胺反应，该优选优选在烷醇中进行。作为可以选择的步骤，不分离式IX的环氧化物，而是将式VII的胺直接加入到已制备了该环氧化物的反应混合物中，然后将此反应混合物进一步加热。所形成的式Ib的反应产物以本领域技术人员已知的方式用所述任何方法进行分离。

在本发明方法g)中，式X的任何碳酸或硫代碳酸衍生物可以用于该环的环合，在式Ia的该部分具有式-C(＝N-OH)-NH-的情况下，该试剂能够在羟基的氧原子和氨基的氮原子之间分别形成羰基或硫羰基。适宜的化合物包括碳酸和硫代碳酸卤化物如光气和硫光气，卤化物酯如氯甲酸乙酯或氯代硫代甲酸烷基酯，或酯如碳酸二烷基酯，单、二和三硫代碳酸酯，黄原酸酯等。惰性有机溶剂用于该环合反应，但是，该反应也可以在不存在任何溶剂的条件下进行。将该反应混合物冷却或加热，一般来说该环合反应在反应混合物的沸点下进行。所形成的式Ib的反应产物以本领域技术人员已知的方式用所述任何方法进行分离。

如果式X的碳酸，其中Z₂和Z₃之一或都表示卤原子，用于该反应，任何将适宜的烃、卤代脂族或芳族烃或醚用作惰性溶剂。如果Z2和Z₃都表示烷氧基或烷巯基，则除上述的之外惰性有机溶剂也可以是烷醇。

在本发明的方法h)中，实际上，噁二唑啉环转变为噁二嗪环。为此，使用Chem.Ber.， 108，1911-1923(1975)的方法。一般来说，氢氧化钠或氢氧化钾用作碱金属氢氧化物。该反应在有机溶剂如烷醇和碱金属氢氧化物水溶液的混合物中，在该反应混合物的沸点下进行。所形成的式Ic的反应产物以本领域技术人员已知的方式用所述任何方法进行分离。

在本发明的方法i)中，该反应在惰性有机溶剂或若干此类溶剂的混合物中，在存在或不存在酸结合剂的条件下进行。惰性有机溶剂是，例如，烃，卤代脂族或芳族烃，醚或烷醇，优选丁醇。该反应也可以在不存在任何有机溶剂的条件下进行，在此情况下过量的式VII的胺可以用作溶剂。所形成的式Ic的反应产物以本领域技术人员已知的方式用所述任何方法进行分离。

在本发明的方法j)和k)中，该方法类似于方法c)所述。式XIII的季铵烷基卤化物通过将相应的式IV的氨基烷基卤化物季铵化来制备。式XV的化合物可以由相应的式IV的氨基烷基卤化物与氧化剂反应来制备。

式Ib的噁二唑啉衍生物，其中R₃表示羟基，可以通过与卤化试剂反应，转变为相应的式Ib的化合物，其中R₃表示卤原子。优选亚硫酰氯、三氯化磷或五氯化磷用作卤化试剂，而该卤化反应在类似反应中所常用的有机溶剂中进行，或者在不存在任何溶剂的情况下进行，例如，在过量的卤化试剂中。卤化反应后，用常用的方法处理该反应混合物。

式Ib的噁二唑啉衍生物，其中R₃表示羟基，可以与C₁-C₂₀烷基羧酸或C₃-C₂₂烯基羧酸的活性酰化衍生物卤化物、酸酐、叠氮化物等，或者与甲基磺酰基卤化物、苯磺酰基卤化物或甲苯磺酰基卤化物，在惰性有机溶剂优选芳烃或卤代芳烃或脂族烃的存在下，在存在或不存在酸结合剂的条件下反应。所形成的相应的式Ib的反应产物通过上述常规方法分离。

式Ib的化合物，其中R₃表示羟基，可以以类似的方式与C₁-C₅烷基卤化物反应。在此情况下，该化合物的一个或多个氮原子可以同时被季铵化。

式Ib的化合物，其中R₃表示卤原子，优选氯原子，与烷醇或硫代烷醇的碱金属盐的反应，可以在上述反应条件下进行。

如果需要，式I的化合物可以转变为药用盐或者从其酸加成盐中游离出。在成盐过程中，如果使用了旋光活性的有机酸，例如，樟脑酸、樟脑磺酸、酒石酸或酒石酸衍生物，可能能够分离具有手性中心的化合物的立体异构体。在此情况下，该反应以本领域技术人员已知的方式，通过将与旋光活性有机酸形成的酸加成盐分级结晶来进行。

如果需要，式I的丙烯羧酸偕胺肟衍生物的一个或多个氮原子被季铵化。为此，式I的化合物与式R₈-Y的烷基化试剂反应，其中R₈表示C₁-C₄烷基或苯基(C₁-C₄烷基)，Y表示卤原子，得到式XII的季铵盐衍生物，其中R₈和Y定义如上。此季铵化反应也可以用式(R₈)₂SO₄的硫酸二烷基酯进行，其中R₈定义如上。在后种情况下，得到了式XII的季铵盐衍生物，其中Y指式R₈-SO₄基团。该季铵化反应在惰性有机溶剂中或在不存在任何溶剂的情况下进行。

或者，式I化合物的其它氮原子或另外的氮原子也可以季铵化。在式I中，如果R表示含氮原子的杂环基团如吡啶基，此吡啶基的氮原子可以季铵化，即该氮原子也可以季铵化。

当式I的化合物转变为N-氧化物时，一般氧化连接取代基R₄和R₅的氮原子。在此情况下，一般用过氧化氢，优选在含烷醇如甲醇的溶液中，适合地在室温下进行氧化反应。在式I中，如果R表示含氮原子的杂环基团如吡啶基，吡啶基的该氮原子可以同时或者代替上述氮原子用氧化剂转变为N-氧化物。在此情况下，氧化剂优选是过酸，例如3-氯-过苯甲酸，而该氧化反应在惰性有机溶剂，一般在芳烃如苯或甲苯中，适合地在室温下进行。

当然，式I化合物的N-氧化物也可以以本领域已知的方式转变为药用酸加成盐或其季铵盐衍生物。

本发明化合物的药学作用通过以下试验来检测。

PARP抑制的检测

已知释放活性氧(ROS)，例如，氢氧基、过氧化物、过氧亚硝酸盐、过氧化氢形式在肝组织中源源不断[Richter，C.，FEBS Lett.，241，1-5(1988)]且在低含量范围内它们在控制重要的生理过程中起一定作用[Beck，K.F.等，J.Exp.Biol.， 202，645-53(1999)；McDonald，L.J.and Murad，F.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.， 211，1-6(1966)](如血管扩张、血小板凝集、白细胞附着)。在急、慢性炎症中释放活性氧的浓度明显较高，例如，在大多数自身免疫性疾病中[Taraza，C.等，Rom.J.Intern.Med.， 35，89-98(1997)]，在局部缺血后心力衰竭、脑局部缺血(中风)的情况下[Brain Pathology，9，119-131(1999)]。ROS的来源包括正常组织细胞，部分由于炎性组织中存在的白细胞和巨噬细胞，部分由于炎性细胞因子的诱导作用。

除了其它以外，释放活性氧破坏DNA。DNA的损坏在细胞中引起复杂的防御和修复过程。此过程的一个重要因素是聚(腺苷二磷酸核糖)聚合酶(PARP)的激活。PARP是核排列的酶，其大量存在于几乎所有细胞中，并促进腺苷二磷酸核糖单元由烟酸腺嘌呤二核苷酸(NAD)向蛋白质转运，并构建聚(腺苷二磷酸核糖)链。该酶的主要底物包括其本身[Gonzalez，R.等，Mol.Cell.Biochem.， 138，33-37(1994)]、核蛋白、组蛋白、拓扑异构酶I和II、转录因子。在DNA链一处断裂的情况下，PARP酶的活性由某种因子提高了约500倍[Menissier deMurcia，J.等，J.Mol.Biol.， 210，229-233(1989)]。由于极度高的DNA破坏造成的PARP酶激活引起NAD浓度极度降低。结果，细胞中腺苷三磷酸(ATP)的合成降低，同时，由于细胞试图通过使用ATP由腺苷二磷酸核糖和烟酰胺来恢复NAD水平，ATP的利用越来越高。这些生化过程破坏了在一些疾病如自身免疫性疾病临床表现[Szabó，C.等，Trends Pharmacol.Sci.， 19，287-98(1998)]、心脏和脑的缺血状态及神经变性疾病的治疗中的重要物质。可以通过抑制PARP酶、降低细胞中烟酰胺和腺苷二磷酸核糖水平及抑制NAD合成用腺苷三磷酸的消耗，消除NAD异化作用。

体外对分离的酶的PARP抑制的检测

按照Shah，G.M.[Anal.Biochem.， 227，1-13(1995)]的方法，从大鼠肝脏中分离聚(腺苷二磷酸核糖)聚合酶。在130μl的反应混合物中检测PARP活性，该反应混合物组成如下：100mM的tris-HCl缓冲液，pH8.0，10mM的MgCl₂，10％甘油，1.5mM的DTT，100μg的(32P)或(3H)NAD+，10μg的活化DNA，10μg的组蛋白。[Tris-HCl是三(羟基甲基)氨基甲烷盐酸盐]。孵育10分钟后，用8％高氯酸停止反应，并通过离心(10分钟，10.000g)。将沉淀物用8％高氯酸洗涤3次，并用闪烁计数器检测结合到蛋白上的放射性。结果见表I。

表I

化合物(实施例号)	PARP I_0.5(mg/l)
化合物(实施例号)	PARP I_0.5(mg/l)	2	9±2
3	8±1	2	9±2
3	8±1	4	14±2
5	13±2	4	14±2
5	13±2	6	17±3
8	12±2	6	17±3
8	12±2	9	7±1
10	28±4	9	7±1
10	28±4	12	18±3
13	20±3	12	18±3
13	20±3	14	9±2
16	18±3	14	9±2

由四组平行的检测得到上述数据。

从表I中可以看出部分被测化合物是非常好的PARP抑制剂(I_0.5＜10mg/l)。大部分被测化合物可以视为良好的PARP抑制剂(I_0.5＝10-28mg/l)。

式I的化合物对局部缺血性心力衰竭和再灌注性心律不齐的作用

大多数情况下，供给性疾病中发生心肌损伤和心肌细胞死亡。供给性疾病最普通的形式是缺氧。进行性心肌损伤是心肌局部缺血，它可能由于急性低氧症/缺氧症、冠状动脉闭塞、痉挛或慢性冠状动脉疾病而形成。急性心肌梗塞的局部缺血部分，接着是过度的血流相，即所谓的再灌注相。可能发生再灌注的致命后果心律不齐(包括室性心动过速和纤)。这些是再灌注损伤的第一个表现。通过给药来防止再灌注心肌紊乱，是要预防梗塞后早期的致命危险。

在雄性SPRD大鼠(可接受的体重范围：300-350g)中进行试验。通过使用戊巴比妥[5-乙基-5-(1-甲基丁基)-2，4，6-(1H，3H，5H)-嘧啶三酮](60mg/kg腹膜内)麻醉动物，并保留自主呼吸。气管切开术后插入气管插管用呼吸器(Kutesz，Hungarian Academy of Sciences制造)帮助动物呼吸。控制ECGII的标准电极。给右股动脉进行插管并连接压力传感器(BPR-01，Experimetria，Hungary)和前置放大器。通过动脉血压的搏动信号启动脉力血流计(HG-M，Experimetria，Hungary)。给表面颈静脉插管以进行给药。进行胸廓切开术后，将一根丝线(编成辫，外套4-0)置于左前冠状(LAD)动脉下。几分钟的稳定期过后，使LAD动脉闭塞5分钟，接着再灌注10分钟。开始时的正常状态下和上述阶段中记录ECG。由ECG数据，以秒为单位测定室性心动过速和纤颤的时间范围。此外，记录接受处理的动物组中的存活率。

所得结果表明本发明的化合物适于预防再灌注引起的心律不齐。例如，用实施例2处理的动物在再灌注后与对照组相比显示了超过50％的存活时间。

在大脑局部缺血中检测式I的化合物

人局部缺血发作后，海马CA1区的锥体细胞细胞大部分被破坏，而该区(CA2，CA3)的其它细胞并不如此敏感[Crain，B.J.等：在蒙古沙土鼠短暂前脑局部缺血后选择性的神经元死亡，银浸渗研究，Neuroscience， 27，402(1988)]。按照一些作者的观点，记忆力的失调与海马细胞的死亡有关[Walker，A.E.等：中风NINCDS，NIH的国内调查：临床发现，Stroke， 12，Suppl.， 1，1-44(1981)]。哺乳动物的中枢神经系统对局部缺血性损伤不是同等敏感的。由于其解剖学上的特点，蒙古沙土鼠(Meriones unguiculatus)更适于检测脑局部缺血，因为此类中90％的基底接合系统(Circulus Wilisi)中断，因此，在颈动脉和脊椎动脉系统之间没有联系。因此，给颈动脉加压可以诱发广泛的前脑局部缺血。

本试验的目的是确定式I的新化合物是否在大脑局部缺血中具有保护作用。该试验在蒙古沙土鼠中进行。将这些动物用2％的三氟溴氯乙烷[2-溴-2-氯-1，1，1-三氟-乙烷]、68％的氧化氮和30％的氧气的混合物麻醉。在麻醉中，在两侧给颈动脉施压5分钟。神经元没有立即破坏，因此，施压后有4天的再灌注(迟发型细胞死亡)。在如此处理4天后，在CA1锥体区80-90％的细胞被破坏。

为了确定学习和记忆能力以及运动过强，在Y-迷宫中检测动物。

用组织切片研究CA1区的细胞死亡。用缓冲的甲醛灌注动物，取出大脑并在甲醛中固定。染色后对大脑切片被破坏的CA1区的生长进行研究。

在这些试验中使用下列物质：

GYKI-52466(参照物)，剂量为40mg/kg腹膜内，局部缺血后给药30分钟；尼莫地平[1，4-二氢-2，6-二甲基-4-(3-硝基苯基)-3，5-吡啶二甲酸2-甲氧基乙基1-甲基乙基酯](参照物)，剂量为10mg/kg腹膜内，局部缺血后给药5和30分钟；式I的新的化合物，剂量为25mg/kg腹膜内，局部缺血后给药5和30分钟。

试验组：

-局部缺血对照，

-局部缺血后接受参照物治疗，

-局部缺血后接受被测物质治疗，

-假的操作。

在该试验中，能够确定式I的化合物在大脑局部缺血中具有保护作用。

式I化合物抗自身免疫性疾病的作用

自身免疫性疾病是其中机体启动对抗其正常构成部分的免疫反应的疾病[Ring，G.H.等，Semin.Nephrol.， 19，25-33(1999)；Theofilopoulos，A.N.，Ann.N.Y.Acad.Sci.， 841，225-235(1998)]。不同的自身免疫性疾病在启动该过程的抗原方面彼此不同，但是，在进行性自身免疫性过程的细胞组织破坏的机理方面存在极大的相似性[Szabó，C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 95，3867-3872(1998)]。首先，自身免疫性疾病包括如下：

-激素性疾病：胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)；

-肝病：肝炎；

-皮肤病：大泡性天疱疮样狼疮、普通天疱疮、牛皮癣、硬皮病、白癜风；

-成血器官的疾病：肉状瘤病；

-关节病：类风湿性关节炎；

-血管病：结节性脉管炎、无脉病、结节性多动脉炎、强直性脊椎炎；

-肠疾病：溃疡性结肠炎；

-肌肉和神经系统的疾病：多发性硬化、重症肌无力、慢性炎性脱髓鞘性多神经病。

在所列出的自身免疫性疾病中，用小鼠研究了对链脲霉素引起的I型糖尿病的预防。

体内碳水化合物代谢的主要调节剂胰岛素，由胰腺的胰岛细胞产生并转运到血流中。β细胞的损伤或破坏引起胰岛素产生的降低或停止，这导致I型糖尿病的发展。β细胞对ROS和氧化氮的毒性作用特别敏感。对氧化氮引起的DNA破坏的研究带来了一种假设，即PARP酶的过度激活及NAD水平的降低造成β细胞的死亡[Heller，B.等，J.Biol.Chem.，270，11176-180(1995)]。根据类似的机理，链脲霉素(SZ)[2-脱氧-2-(3-甲基-3-亚硝基脲基)-D-吡喃葡萄糖]破坏产生胰岛素的β细胞，因此，当用于动物试验中时提供了I型糖尿病的模型[Yamamoto，H.等，Nature， 294，284-286(1981)]。链脲霉素通过烷基化作用和氧化氮的形成破坏DNA，如上所述氧化氮的引起PARP酶的激活。检测了通过单剂量的式I的丙烯羧酸偕胺肟衍生物是否可以防止单剂量的链脲霉素的升高血糖的作用。用CD-1雄性小鼠进行试验。将动物分为3组，每组8只动物。第一组腹膜内接受160mg/kg的链脲霉素(Sigma)，第二组接受160mg/kg的链脲霉素并口服200mg/kg的式I的化合物，第三组作为对照。在处理后第3天检测血糖浓度。然后，处死动物，并采集血清样本检测胰岛素。

发现被测的本发明化合物显著降低链脲霉素升高的血糖水平。

对胰岛素抗性的作用

II型糖尿病不是胰岛素依赖性的。此类疾病的病理本质上是外周组织，特别是纹状(骨骼)肌和脂肪组织对胰岛素的敏感性的降低或丧失。自然，此不敏感性不能通过胰岛β细胞的过度产生(过多分泌)得到补偿。重要的是强调胰岛素抗性，即使没有肾糖尿病的发作，导致若干心血管调节紊乱。因此，胰岛素抗性是冠状血管疾病的独立的危险因素。由于胰岛素抗性的中枢病生理重要性，目标是增加胰岛素敏感性的药物治疗的可能性在药物开发中是非常重要的。在临床上仅有的真正的胰岛素敏化剂药物是所谓的噻唑烷二酮类。它们的毒性(主要是肝毒性)是其应用的限制因素。胰岛素敏化剂降低血糖、甘油三酯和胰岛素，其机理是靶组织(肝、骨骼肌、脂肪细胞)中胰岛素敏感性增加[Colca，J.R.和Morton，D.R.：抗高血糖的噻唑烷：Ciglitazone及其类似物，见《新的抗糖尿病药物》，Bailey，C.J.和Flatt，P.R.编辑，Smith-Gordon，New York，1990，pp.255-261]。

调查了用本发明的化合物处理是否影响正常的和血胆固醇过多的清醒兔子的胰岛素敏感性。成年雄性白色新西兰兔重3-3.5kg，在动物室中关养(每天12小时光照/黑暗，温度22-25℃，湿度50-70％)，用商购的实验室饲料喂养，并在整个过程中自由地饮水。2周的适应期后开始试验。将兔子随机分为两组。给一半的动物继续喂正常的兔饲料，而给第二组动物喂8周富含1.5％胆固醇的饲料。将个大组分为4个组：

-不处理组，

-用本发明化合物处理组，静脉内10mg/kg，每天两次，共4天，

-用7-硝基吲唑作为NOS抑制剂处理组：在5分钟内使用5mg/kg的7-硝基吲唑，在此之前以5分钟的输液间隔使用胰岛素，

-如上所述用7-硝基吲唑和本发明的化合物处理组。

麻醉动物并将聚乙烯插管插入到右颈静脉和左颈动脉的两个主枝中。将这些插管通过颈后伸出，并充入含肝素的生理盐水。

对分离血管的研究

由兔子的胸主动脉和颈动脉，制备4mm长的血管环，并水平置于两个小的L形玻璃钩上，其中一个连接力量传感器(SG-02，Experimetria，London，UK)以检测和记录等距张力。在充满Krebs溶液的结构室(5ml)中进行这些试验，该溶液中充入了95％的氧气和5％的二氧化碳。将起始静止张力分别设为主动脉环20mN，颈动脉环10mN。平衡时间总计为60分钟。接着，以累积的方式让血管环接触浓度逐步升高的去甲肾上腺素。最大的反应后，从该结构室中清洗去甲肾上腺素直到张力回到原来的基线水平。为了研究血管对乙酰胆碱的反应性，用去甲肾上腺素的EC₅₀浓度预处理这些环。获得适当的收缩后，让样本接触浓度逐步升高的乙酰胆碱氯化物。

在第二套血管反应性研究中，给独立分组的颈动脉环进行电场刺激。起始张力设定为10mN后，让这些环平衡1小时。然后，研究对电场刺激(100刺激，20V，0.1ms和20Hz)的两个连续脉冲的收缩反应。然后，在1μM的阿托品和4μM的胍乙啶(“非肾上腺素能非胆碱能＝NANC溶液)的存在下，重复该场刺激方案。用带有完整内皮的环和内皮层被轻轻除去的环完成整个试验。

按照Szilvássy[Szilvássy，Z.等，Coron art.Dis.， 4，443/452(1993)；Am.J.Physiol.，266，H2033-H2041(1994)]测定组织环GMP(鸟苷一磷酸)含量：

用预冷的Wollenberger夹子将肌肉环立即冷冻并在液氮中粉碎。然后，将这些样本在比样本的重量高出10倍的6％(v/v)三氯乙酸中在预先保持在-70℃下的研钵中匀化。解冻后，在4℃下处理这些样本。用Janetzki K-24离心机(Leipzig，Germany)以15000g离心沉积10分钟，接着用5ml以水饱和的乙醚在Wortex萃取器中将上清夜萃取5分钟。除去乙醚馏分，并再重复5次萃取。然后，在氮气下将这些样本蒸发，用Amersham放免检测试剂盒检测环GMP含量。数值表示为pmol/mg湿组织重。

高胰岛素血的优糖血(euglycaemic)夹研究：

以恒定的速度(13mU/kg)通过一个静脉插管在120分钟内输入人常规胰岛素。这样的胰岛素输液速度在稳定状态中产生100±5μM/ml的血浆胰岛素免疫活性。以10分钟的间隔从动脉插管中采集血样(0.3ml)以检测血糖浓度。通过第二个静脉插管进行变速葡萄糖输液将血糖浓度维持恒定(5.5±0.5mmol/l)。当血糖稳定至少30分钟时，我们将该状态定义为稳定状态，以10分钟的间隔再采集血样(0.5ml)以检测血浆胰岛素。在稳定状态中，用葡萄糖输液的速度来描述胰岛素敏感性的特性。

从这些检测中获得了如下结果：

1.在正常兔子的血管中，1μM的本发明化合物不改变对累积增加的乙酰胆碱浓度(1nm-10μM)带来的舒张反应。

2.在试验性胆固醇过多血症中，在本发明化合物的存在下乙酰胆碱带来的血管舒张明显变小。

3.场刺激引起孵育在Krebs溶液中的颈动脉张力的升高。但是，在NANC溶液中，在所用的对刺激方案的反应中，观察到舒张反应。这两种反应都不受本发明化合物的影响。

4.除去内皮显著增加了场刺激造成的收缩并降低了NANC舒张。本发明的化合物减轻了场刺激引起的收缩并增加了无内皮血管环中NANC舒张。

5.与在正常兔样本中所见的相比较，在高胆固醇血症动物的血管环中，场刺激引起的收缩升高，而NANC舒张反应减弱。不论内皮是否存在，在高胆固醇血症兔子的环中，本发明的化合物显著降低了电刺激诱发的收缩并放大了NANC舒张反应。

6.与正常环相比较，高胆固醇血症兔子的环中基线环GMP浓度显著降低。用1μM的本发明化合物孵育几乎校正了此降低。但是，在正常环中被测化合物对静息环GMP含量没有作用。场刺激造成正常动物的样本中环GMP浓度升高。在高胆固醇血症兔子的环中，所用的该刺激方案不能引起环GMP的任何升高。本发明化合物对场刺激引起的正常环中的组织环GMP含量升高没有作用，但是在高胆固醇血症兔子的样本中观察到了环GMP的巨大升高。

7.在清醒兔子中，接触富含胆固醇的饮食导致胰岛素敏感性的显著降低。用本发明化合物处理4天，几乎恢复了高胆固醇血症动物的胰岛素敏感性。但是，本发明的化合物对正常动物的胰岛素敏感性没有作用。

8.神经系统氧化氮合酶抑制剂7-硝基吲唑，本身在正常动物中造成了胰岛素抗性。本发明的化合物不能改变此胰岛素抗性状态。此外，在试验性高胆固醇血症中，7-硝基吲唑阻断本发明化合物的胰岛素抗性改善作用。

结论：

给出的这些结果表明本发明的化合物在与清醒兔子的试验性高胆固醇血症有关的胰岛素抗性状态中增加胰岛素的降血糖作用。这些结果还提供了此胰岛素敏化作用与氧化氮能(nitrergic)路径强烈相关的证据，最近已表明对其的影响在调节胰岛素敏感性中起主要作用[Shankar，R.R.等，Diabetes， 49，684-687(2000)]。外周胰岛素敏感性的肝脏神经激素调节可以描述如下[Lautt，W.W.，Can.J.Physiol.， 77，553-562(1999)]：

-胰岛素的血液水平存在一种饭后升高。

-在对此胰岛素水平升高的反应中，肝脏副交感神经反射被激活。

-此反射引起乙酰胆碱的释放，乙酰胆碱激活毒蕈硷能受体。

-毒蕈碱能激活导致氧化氮(NO)的释放。

-只在进食状态，氧化氮引起肝胰岛素敏化因子(HISS)的释放，该因子具有胰岛素胰岛素协同或胰岛素样作用。

-HISS增加骨骼肌的葡萄糖摄取。此HISS机制对氧化氮合成的阻断敏感，并可以被外源性NO-供体激活。HISS机制适合与肝脏感觉纤维的功能紧密相关。血浆胰岛素水平的饭后增加激活了肝脏感觉神经纤维的氧化氮能亚群，其引起从相邻的纤维中释放感觉神经递质。这些感觉神经递质通过其激素样特性到达血流并升高组织中的胰岛素敏感性。

就在最近的研究中，Steppan等着眼于肥胖和胰岛素抗性之间的被人忽视的联系[Steppan，C.M.等，Nature， 409，307-312(2001)]。简言之，脂肪细胞产生产生一种称为抵抗素的激素。抵抗素增加靶组织(脂肪和骨骼肌)对胰岛素的降血糖作用的敏感性。因此，对抵抗素分泌的药理学抑制可能是治疗非胰岛素依赖性糖尿病和胰岛素抗性综合征中药理学作用的新机制。在目前已知的药物中，噻唑烷二酮类的一些成员可以通过脂肪细胞中的过氧化物酶体增殖激活肌γ核受体可以抑制胰岛素分泌。

式I的化合物对胰岛素敏感性具有作用，它们能够通过氧化氮能机制和感觉神经递质缓解胰岛素抗性。胰岛素敏感性的正常化在发病率和死亡率高的疾病如II型糖尿病、高血压、冠心病、肥胖和一些内分泌疾病中具有关键作用。

本发明化合物预防毒性作用的用途

1)这些化合物对小鼠内毒素引起的死亡的作用

在集中看护的病房中，脓毒性休克是最常见的死因。革兰氏阴性细菌引起的感染导致血压过低，导致一些器官功能不全，并最后导致机体的虚脱。通过给试验动物注射脂多糖(LPS)——一种细菌膜组分，产生了休克样状态并最后导致死亡。LPS激活NF-κB/Rel类转录因子，其调节若干参与休克的病理机制的递质产生的调节(如TNF-α、白细胞介素、NO合酶)[Oliver，F.J.等：对在聚(ADP核糖)聚合酶-1缺陷小鼠中作为缺陷NF-κB激活结果的内毒素休克的抵抗性，EMBO J.， 18(16)，4446-4454(1999)]。PARP-1基因与NF-κB功能上有联系，因此，在PARP缺乏中，也不进行依赖于NF-κB的转录，在内毒素休克中炎性介体的释放也变得不能充分调节。该试验的目的是确定是否可以通过式I的化合物抑制PARP-1来防止内毒素引起的死亡。

在这些试验中，使用C57BL/6小鼠(Charles River BreedingLtd.)。在试验中，所用LPS的剂量和类型与上述Oliver，F.J.的文摘所述相同：得自大肠杆菌0111：B4(Sigma)的脂多糖。在试验中，还使用3-氨基-苯甲酰胺(Sigma)。至少跟踪观察两次24小时存活率。在用LPS处理后1和6小时，给动物口服式I的化合物。

发现被测的式I化合物显著降低了内毒素造成的死亡。

2)化合物对乙酰氨基酚(醋氨酚)引起的肝毒性的作用

已知多种非甾类抗风湿药[Peters，M.等，Clin.Inves.， 71，875-881(1993)]和止痛药具有显著的肝毒性[Krger，H.等，Gen.Pharmac.， 27，167-170(1996)]。大剂量对乙酰氨基酚引起肝脏和肾脏机能不全[Meredeth，T.J.等，Arch.Inter.Med.， 141，397-400(1981)]。最近明显意识到聚(ADP核糖)聚合酶抑制剂消除对乙酰氨基酚引起的肝损伤[Krger，H.等，Gen.Pharmac.， 27，167-170(1996)]。从文献中得知对乙酰氨基酚是细胞色素P-450的诱导剂。对乙酰氨基酚对细胞色素P-450系统的作用产生结合蛋白质的巯基的活性醌亚胺，因此导致细胞内谷胱甘肽的快速缺失[Jollow，D.J.等，Pharmacol.， 12，251-271(1 974)]。失活的蛋白质分别导致肝细胞的破坏和肝坏死。细胞内谷胱甘肽分别是最重要的抗氧剂和释放活性氧的最强清除剂。依赖于谷胱甘肽的抗氧剂保护系统的弱化导致氧自由基的细胞内水平升高[Miesel，R.等，Inflamatin， 17，283-294(1993)]。这些氧自由基是强的PARP诱导剂，影响蛋白质的翻译后过程。由于PARP活化的升高，细胞的NAD储存减少，可能开始细胞凋亡[Hoschino，J.等，J.Steroid Mol.Biol.， 44，113-119(1993)]。因此，烟酰胺，PARP酶的一种选择性抑制剂，抑制肝脏中GOT和GPT酶的释放，如用对乙酰氨基酚引起肝炎的小鼠中所示[Krger，H.and Ehrlich，W.见：《L-色氨酸：药物和药物安全性中的展望》，Kochen，W.和Steinhart，H.编，Verl.Belin，1994]。

检查了对乙酰氨基酚引起的肝损伤是否可以用式I的新化合物来防止。肝损伤的症状以对乙酰氨基酚引起的GOT和GTP酶水平的升高为特征。这些试验用体重30-40g的雄性NMRI小鼠进行。用式I的化合物预处理动物，口服7天。在第8天，让小鼠禁食12小时，然后口服500mg/kg的对乙酰氨基酚和指定剂量的式I化合物。16小时后，将这些动物放血致使并检测血清的GOT和GPT酶活性。用Mann和Whitney的非参数检验分析结果。对于这些结果，给出平均值和标准偏差，其中p＜0.05被看做具有显著性。

发现与生理盐水处理的对照组相比，单一的口服对乙酰氨基酚升高了雄性NMRI小鼠的GOT和GPT活性。但是，式I的化合物在口服预处理7天后，非常显著地降低了GOT和GPT酶的活性。例如，在以50mg/kg的剂量给药的实施例12的化合物中，观察到了非常有利的护肝作用。

3)化合物对百草枯毒性的作用

百草枯[1，1′-二甲基-4，4′-双吡啶]，早期用作杀虫剂的化合物，通过超氧自由基的形成产生毒性作用。使用NADH和NAD(P)H作为电子供体的氧化还原酶参与超氧自由基的形成[NAD(P)H是磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原形式]。在传递对百草枯引起的氧化应激的细胞反应中，蛋白p66起重要作用[Migligaccio，E.等，Nature， 402，309-313]。该机制归因于超氧化物的灭活(如升高超氧化物歧化酶的水平)有效降低了百草枯的毒性。超氧自由基在若干疾病的病理中具有重要作用(如局部缺血再氧合、梗塞、炎性疾病)。通过使用百草枯得到了在这些疾病中所具有的超氧化物负荷的简单模型。

体外对百草枯毒性的作用

在37℃下，在含有5％二氧化碳的空气中，Hepa-1肝细胞瘤细胞在添加了10％小牛血清的RPMI-1640培养基中生长，而PC-12大鼠嗜铬细胞瘤细胞生长于添加了10％小牛血清和5％马血清的RPMI-1640培养基中。用100μl的培养基，96孔Costar培养板的每孔中加入5×10³个细胞。部分培养物不接受任何处理并用作对照。部分细胞用浓度渐增的百草枯处理，部分用相同浓度的百草枯和3、10及30μg/ml浓度的被测化合物处理。让细胞再生长3天，然后用SRB染色。较高的百草枯浓度导致细胞死亡，而较低的百草枯浓度部分抑制细胞生长。被测化合物的作用基于对百草枯毒性的降低来检测。

对体内百草枯毒性的作用

百草枯对小鼠具有明显的毒性。腹膜内使用剂量70mg/kg导致动物在2天内死亡。调节超氧化物形成、中和及氧化应激的机制也能够降低体内百草枯毒性。

将体重20-22g的CFLP小鼠分组，每组10只动物，并分别用50和70mg/kg的百草枯进行腹膜内给药。部分组别在百草枯给药前和后还用被测化合物处理6小鼠。对于被测化合物，使用100mg/kg的口服剂量。被测化合物的效果基于小鼠存活率的增加进行测定。

发现式I的化合物显著降低了百草枯的毒性。

式I化合物对神经变性疾病的作用

如上所述，由于ROS造成的DNA损伤，PARP酶被激活，随之细胞释放NAD，于是导致细胞死亡。在局部缺血样脑局部缺血引起的神经元死亡期间不仅仅观察到PARP激活的极端速度，在其它神经变性疾病如早老性痴呆、帕金森氏病和肌萎缩性侧索硬化中也被证实具有一定作用[Love等，Neuropathol.Appl.Neurobiol.， 25，98-108(1999)；Eliasson等，Nat.Med.， 10，1089-1095(1997)]。

对试验性肌萎缩性侧索硬化的作用

肌萎缩性侧索硬化(ALS)是致命性的进行性神经变性疾病。在发展中国家中它是最常见的成人期发作的运动神经元疾病。ALS包括皮层、脑干和脊髓中运动神经元紊乱，其引起骨骼肌萎缩、麻痹和死亡[Rowland，L.P.《神经变性疾病》，pp.507-521(1994)]。在一部分ALS病例中，该疾病是家族性的。家族性病例部分是由Cu/Zn超氧化物歧化酶-1(SOD-1)基因的错义突变引起[Deng，R.H.等，Science， 261，1047(1993)]。SOD-1是一种在神经组织中含量丰富的胞质酶，其在抗氧自由基引起的细胞损伤中起重要作用。突变的酶维持接近正常水平的酶活性。体外研究表明SOD-1突变导致自由基产生的功能的获得和提高。

具有突变的SOD-1基因的转基因小鼠出现的症状类似于ALS。在转基因小鼠中已经超表达了若干种人突变SOD-1基因(G93A，V148G)，并将所产生的疾病模型应用于抗-ALS药物筛选[Gurney，M.E.，J.Neurol.Sci.， 152 Suppl.1，67-73(1997)]。

家族性ALS模型试验

超表达突变的人SOD-1基因(G93A)的转基因小鼠用于此研究。动物购自Jackson Laboratory，USA。在鼠龄4周时该疾病的症状出现前，开始用式I的化合物处理。被测化合物每天用一次，口服，用3个剂量水平直到该试验结束。通过每周检查运动行为(伸缩反射、负载表格、旋转棒试验)、通过存活时间、在试验结束时(120天后)、并通过对运动神经元区域的组织学和生化检查，监控疾病的进展。

发现在转基因ALS动物中式I的化合物导致该反射出现、效应和肌力缺失的中度延迟。该作用显示出剂量依赖性。麻痹的出现和晚期疾病的出现也得到延迟。组织检查的结果证实了观察到的该治疗的临床作用。治疗组中运动神经元和黑质神经元的退化和损失比对照组的发展小。基于这些结果，可以预计式I的化合物在ALS疾病中具有有利的治疗作用。

对自身免疫性ALS模型的试验

在偶发ALS疾病中，在SOD-1基因中没有发现突变。该事实表明其它原因导致同样进程的疾病。在患有偶发ALS的多数患者中，可以检测到抗钙离子通道的抗体。此观察证实了对运动神经元和钙离子通道的自身免疫过程在偶发ALS病例的形成中起了至关重要的作用。在试验动物中，Engelhardt及其同事通过用运动神经元免疫，然后只用免疫血清诱发了显示了ALS特异性改变的疾病[Engelhardt，J.等，Synapse， 20，185-199(1995)]。此模型用于检测式I的化合物在偶发ALS疾病中的作用。

用匀化的牛前角脊髓免疫Hartley豚鼠。为了此免疫，将运动神经元悬浮于完全福氏佐剂(CFA)中。通过10次皮下或皮内注射，每次注射0.1ml悬浮液进行处理。1个月后，重复注射，但是用不完全福氏佐剂制备此悬浮液。第二次免疫后2周，在1-3天内，动物中出现严重的虚弱，特别是下肢。体重停止增加，运动性降低。在随后的2周内，动物的状态没有改变。然后，将动物放血致死。将收集到的血液离心得到用于引起小鼠ALS的血清。

试验在5只一组的雄性白化小鼠(CFLP，25-30g体重)中进行。将1ml上述血清给各动物腹膜内注射以破坏运动神经元。一组动物只用该血清处理，而其它动物组除了用该血清处理外，还用式I的被测化合物以100mg/kg的剂量腹膜内处理。另外一些动物组只用式I的被测化合物处理，不注射血清。

只用血清处理的动物的运动性变低，下肢只能困难地使用，然后它们变得麻痹。在用血清和式I的被测化合物处理的动物中，没有可检测的运动缺陷症状。只用式I的被测化合物处理的动物中情况相同。所有这些表明式I的化合物防止可以由免疫引起的运动紊乱的进展。

对帕金森氏病的试验模型的作用

帕金森氏病(PD)是普通的致残的原发性神经变性疾病，其特征是震颤、行动迟缓、僵化和平衡困难。这些运动异常是由脑多巴胺的缺失引起的，该缺失是由黑质背侧致密部和腹侧网状部中多巴胺能神经元的损失导致的。对具有选择性神经毒性的1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)进行分析，发现帕金森氏病的可能病理机制。MPTP在人和动物中都引起帕金森氏病运动征[Dexter，A.等，Ann.Neurol.，35，38-44(1994)]。MPTP处理还导致黑质背侧致密部和腹侧网状部中多巴胺能神经元的损失。在损伤的神经元中出现Lewy体样嗜酸性包含物，且在这些细胞中线粒体复合物I也减少。这些改变是氧化应激的特征[Shapira，A.，Adv.Neurol.， 69，16l-165(1996)]。MPTP的生物活性代谢物是MPP[1-甲基-4-苯基吡啶翁]。MPP直接抑制线粒体中的复合物I，导致超氧阴离子的产生增加。数据显示氧化应激在自然型和MPTP诱发型帕金森氏病的发病机理中，氧化应激扮演主要角色。PARP酶被氧化应激激活，而此酶似乎在帕金森氏病的病理中扮演有效的角色。PARP分离的小鼠显示了对MPTP诱导帕金森氏病作用的敏感性极大地降低[Mandir，A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96，5774-5779(1999)]。这些发现表明PARP抑制可能给帕金森氏病带来治疗作用。

在这些试验中使用的C57BI小鼠购自Charles River Hungary。重20g的小鼠用MPTP处理4次，每次20mg/kg的MPTP，以2小时的间隔腹膜内给药。在注射MPTP前30分钟口服被测化合物。对照动物以相同的速度接受载体治疗。注射MPTP七天后，将小鼠处死并快速摘除大脑。在冰冷的陪替氏培养皿是解剖黑质。将切除的组织立即冷冻并保存在-80℃下直到分析。在50体积的0.1M高氯酸中将组织样本进行超生处理，使其匀化。离心(14000xg，10min，4℃)后，将20μl的上清夜注射到反相儿茶酚胺柱(ESA，Bedford)中并检测多巴胺的含量。

最后一次MPTP处理后2小时，切除中脑和黑质并在蔗糖/DDT缓冲液中匀化，然后离心(14000xg，5min)。将沉淀颗粒再悬浮于此缓冲液中。测定蛋白浓度外，将等量的蛋白加到SDS/PAGE凝胶上。将蛋白从该凝胶转移至硝基纤维素膜上并进行免疫染色以检测聚(ADP核糖)聚合物。用化学发光观察特异性结合。

在此检测中，发现MPTP处理引起纹状体多巴胺含量的急剧降低(80％)。式I的被测化合物部分(20-40％)抑制MPTP引起的多巴胺损失。MPTP处理导致纹状体区域出现聚(ADP-核糖)聚合物加成物。用被测化合物进行的伴行处理造成了此过程的抑制(20-70％)。因此，可以预计式I的化合物对帕金森氏病具有治疗作用。

细胞保护作用的检测

长期使用或经常使用的一些药物可引起神经元损伤的副作用。在大量的引起此类辅因子的药物(氯霉素、氨苯砜、戒烟硫、dichloroacetate、乙硫异烟胺、苯乙哌啶酮、sodium aurothiomalate、肼苯哒嗪、异烟肼、甲硝唑、硝基呋喃妥英、氧化氮、顺铂、吡哆辛、长春新碱)中，最好的特征和最常讨论的问题是异烟肼、吡哆辛、长春新碱或顺铂引起的神经病。氯霉素可以引起此类神经病，但是在停止治疗后此副作用能够消失。但是，在几乎所有临床病例中，化疗的过早停止会妨碍治疗的成功并会引起疾病的复发。在抗癌化疗中由于副作用造成的治疗变化具有特别高的危险性。此事实给所谓的化疗保护或细胞保护剂赋予了极大的重要性，这些保护剂能够减小重要生命维持药物的有害副作用，而不使治疗效果有任何降低。

在接受顺铂治疗的癌症患者中，主要的副作用是外周神经的损伤(外周神经病)。此副作用的发作会妨碍顺铂治疗的进行，会危及治疗的成功，并伤害患者的生命质量。在临床和试验研究中，神经元损伤的出现和级别可以通过检测神经传导速度来确定。顺铂[顺-二氯二氨合铂]的神经毒性作用主要涉及大量的有髓鞘外周神经并表现为感觉神经元损伤(感觉神经病)。最近，一些报告提及了用顺铂治疗后出现自主神经病，及也会偶尔出现的运动神经病。通过直接损坏脊神经节和大量的感觉神经，顺铂常能引起感觉神经的功能紊乱。在大鼠中，长期顺铂治疗带来了感觉神经病，这反映在混合型坐骨神经的感觉神经传导速度的减慢。

基于上述作用的生化模式，主要通过防止自由基引起的损伤，相信式I的化合物具有细胞保护的潜能，并可防止抗肿瘤药物的器官毒副作用。因此，在大鼠试验中，以亚急性治疗的形式使用顺铂10周，剂量为1和2mg/kg腹膜内，并观察外周神经病的发展。此外，检测不同剂量的被测化合物是如何影响神经功能(神经传导速度)的损伤。

为了检测顺铂引起的感觉和运动神经损伤，按照Miyoshi的改良方法检测大鼠尾部的神经传导速度。改良包括检测室温下而不是37℃下的神经传导速度。在顺铂治疗前(对照)及治疗第5和第10周的检测感觉和运动神经传导速度。在检测期间，用乙醚浅层麻醉动物，并将两个电极针置于尾部神经上，彼此相距50mm。用超大刺激强度，记录传入(运动)和传出(运动)神经动作电位。通过将10个动作电位平均用下式离线确定神经传导速度：

NCV＝v/I[m/sec]

其中v＝触发点与记录电极对之间的距离(mm)，

I＝动作电位启动的潜伏时间(毫秒)，

NCV＝神经传导速度(m/sec)。

在这些试验中，发现与对照动物相比用1和2mg/kg顺铂腹膜内处理10周显著降低了接受处理的动物的体重。在用式I化合物处理的动物中也存在这种体重的降低。在接受处理和未处理动物之间或者用顺铂处理和用被测化合物处理的动物之间，在一般行为方面没有差异。在3个检测时间点中，对照组的感觉和运动神经的NCV方面没有差异。在用顺铂处理的动物中，1mg/kg顺铂处理在第5周和第10周，NCV一致和显著降低。用2mg/kg顺铂处理后，NCV更强烈地降低。在运动神经中也出现神经病。

在顺铂处理10周的过程中，在1和2mg/kg顺铂剂量组中，运动NCV都显著降低。此降低是剂量依赖性的。在用1mg/kg顺铂和式I化合物处理组中，与只用1mg/kg顺铂处理组相比，感觉神经传导速度的降低明显小，因此，联合治疗后神经元功能有所改善。损伤程度越强，改善的程度越高。在用2mg/kg顺铂和不同剂量的式I化合物处理组中，在第5周，感觉神经传导速度的降低与只用2mg/kg顺铂处理组的没有不同。但是，在第10周，只用2mg/kg顺铂处理的动物组进一步显著降低，而用顺铂和式I化合物处理的动物中，与只用2mg/kg顺铂处理动物细胞，该降低是剂量依赖性的。传入神经传导速度的降低在第10周末变小，特别是在也接受本发明化合物治疗的组别中。

总之，可以说，用式I化合物同时处理降低了顺铂处理引起的感觉和运动神经传导速度的损伤，并阻止了由第5周到第10周的损伤发展。在一些组中，此保护作用是剂量依赖性的。因此，式I化合物的神经保护作用可以在感觉和运动神经功能中显示出。

肉毒硷-棕榈酰基转移酶(CPTI)的生物作用

CPTI是调节脂肪酸代谢的关键酶。对于游离脂肪酸(FFA)的辅酶A酯(CoA)存在两种可能：

1)通过与甘油反应合成甘油三酯，或

2)氧化，其第一步是借助CPTI酶形成乙酰基肉毒硷[见McGarry，J.D.等，Diabetes， 5，271-284(1989)；McGarry，J.D.and Foster，D.，Ann.Rev.Biochem.， 49，395-420(1980)]。CPTI酶位于线粒体内膜的外部(或在外膜)并催化如下反应：

FFA-CoA+L-肉毒硷→FFA-肉毒硷+CoA

脂肪酸氧化的抑制导致葡萄糖裂解和氧化反应的增加。特别是在心肌局部缺血和糖尿病中，该过程极端显著和有利；这两种病理状态都具有高发病率和死亡率。在心肌局部缺血和在随后的再氧合中，升高的脂肪酸氧化是有害的，因为需要额外的氧并形成乙酰基肉毒硷的膜损伤作用[Busselen，P.等，J.Mol.Cell.Cardiol.， 20，905-916(1988)；Ford，D.A.等，Biochemistry， 35，7903-7909(1996)；Reeves，K.A.等，J.Pharm.Pharmacol.， 48，245-248(1995)]。基于若干试验数据，现在接受了这样的事实：就心肌机械功能的恢复和代谢(酶释放、脂过氧化)数据而言，葡萄糖代谢的激活及脂肪酸氧化的同时抑制具有有利的作用[Lopaschuk，G.D.等，Circ.Res.，66，546-553(1990)；Kennedy，J.A.等，Biochem.Pharmacol.， 52，273-280(1996)]。心肌的此底物选择，即，在葡萄糖和脂肪酸之间选择，也可以用CPTI抑制剂达到，因此葡萄糖的利用增加而心肌的能量学得到改善[Lopaschuk，G.D.等，Circ.Res.， 63，1036-1043(1988)；Carregal，M.等，Arch.Phys.Biochem.， 103，45-49(1995)；Lopaschuk，G.D.等， 65，378-387(1989)；Pauly，D.F.等，Circ.Res.， 68，1085-1094(1991)]。

我们的研究表明催化脂肪酸氧化的限速反应的酶，可以被亚毫摩尔浓度范围的式I化合物抑制。这些研究还指出被测化合物影响心脏和其它组织的底物选择，并通过改变底物的选择也影响这些组织的局部缺血后损害。

主要由bHLH转录因子调节的氧敏感基因的生物作用

防止低氧症的有害作用需要一系列有组织防御反应，包括在单个细胞水平和在整个机体水平。在诱导低氧症的基因表达的调节中，HIF-1/ARNT转录复合物扮演了重要的但不是唯一的角色。氧敏感性、共同调节的基因包括刺激红细胞生成的红细胞生成素[Wang，G.L.等，PNAS， 92，5510(1995)]、刺激血管生成的VEGF(血管内皮生长因子)[Goldberg，M.A.和Schneider，T.J.，J.Biol.Chem.， 269，4355(1994)]、乙醇酸酶如GAPDH，LDH(乳酸脱氢酶)[Rolfs，A.等，J.Biol.Chem.， 272，20055(1997)]以及葡萄糖转运蛋白Glut-1。

推测式I的化合物结合ARNT和/或HIF-1转录因子，因此，它们能够影响参与警报(低氧症敏感性)状态的基因的激活。相信通过此信号传导路径，本发明的化合物表达在警报状态中起重要作用的热激蛋白。

热激蛋白(HSP)的合成是由作用于细胞的多种应激引起的。热激蛋白有助于细胞在危险状态下存活并带来对任何损伤的修复[Cardiovascular Res.，578(1993)；Neurosci.Lett.， 163，135-137(1993)]。

在对低氧症、再氧合的适应中促进警报反应并恢复耗尽的适应反应的试剂，在疾病如梗塞、动脉硬化和糖尿病中能够减小低氧症(低氧症-再氧合)引起的组织损伤。

检测HSP-70

通过形成DNA杂交体的报道基因试验研究HSP-70的活性。将可以通过可很好检测的酶活性来检测的蛋白的基因，融合到编码热激蛋白的HSP-70启动子序列中。使用生物工程方法。用荧光素酶作为报道基因，其活性可以通过发光检测很好地确定。如果荧光素酶的基因的启动子被HSP-70基因的启动子代替，则荧光素酶的活性发生变化，即，HSP-70基因的转录频率变化与该基因在指定环境中进行的转录频率相关。此种方式中，如果物质或方法影响HSP-70基因的表达，则该作用可以通过荧光素酶活性的检测进行研究。在这样的试验系统中进行被测化合物对HSP-70表达的作用的研究。

构建双股DNA环状分子，即含有HSP-70报道基因的质粒，以进行检测。将接近600bp长的小鼠HSP-70基因启动子序列(该基因起始位点的5′端)融合到得自Photymus pyralis的荧光素酶基因的编码序列中。应用的启动子序列含有若干有利于HSP-70基因表达的蛋白结合位点。在可以选择新霉素的具有pBR的质粒载体中，构建HSP启动子-荧光素酶异种基因构建物。将此HSP-70-荧光素酶质粒转染到小鼠成纤维细胞L929细胞中。该试验进行如下：

让含有HSP-70-luc质粒的L929细胞生长在添加了5％FCS(胎牛血清)的DMEM(Dulbecco改进的Eagle培养基)中。在24孔Costar细胞培养板的孔中，在1ml培养基中加入10⁴个细胞。以10^-2的浓度将被测物质溶解于PBS(磷酸盐缓冲盐水)中。细胞附着后(加入后3-4小时)，将10μl的该溶液加入到培养物中，并在二氧化碳恒温箱中在37℃下培养30分钟。然后更新培养基(不含被测物质)，并让细胞在37℃下再生1小时，然后用PBS洗涤一次。除去PBS后，向细胞中加入40μl的1X裂解缓冲液，并将样本在冰上保持30分钟。然后，将细胞转移到Eppendorf瓶中冰在4℃下以14000rpm离心20分钟。将5μl的上清夜加入到25μl的荧光素酶检测缓冲液中，并在发光计中检测样本的发光，检测时间为25秒。

荧光素酶检测缓冲液的组分：

20.00mM的N-三(羟甲基)甲基甘氨酸[N-/2-羟基-1，1-双(羟基甲基)乙基/甘氨酸]，pH7.8，

1.07mM的(MgCO₃)₄Mg(OH)₂·5H₂O，

2.67mM的MgSO₄，

0.10mM的EDTA[乙二氨基四乙酸]，

3.33mM的DTT，

270μM的辅酶A锂盐，

470μM的荧光素，

530μM的ATP[三磷酸腺苷]。

5X裂解缓冲液的组分：

125mM的Tris-H₃PO₄ pH7.8，

10mM的CDTA[反-1，2-二氨基环己烷-N，N，N′，N′-四乙酸]，

10mM的DTT，

50％的甘油，

5％的曲通X-100。

低氧症敏感性基因的研究

以mRNA和蛋白质水平研究式I化合物对生物异源物质和低氧症(1％氧气)引起的Hepa和HepG2细胞培养物基因表达的作用。观察到式I的化合物在Hepa细胞中将甲基-胆蒽引起的HSP-70表达升高了10倍。此外，在Hepa和HepG2细胞中出于对低氧症治疗的反应，作为本发明的化合物增加了低氧症敏感性基因入VEGF、GAPDH和LDH的表达。

在低氧症中，式I化合物增加了若干低氧症敏感性基因的表达。这表明被测化合物影响氧敏感性基因的调节中的普通路径。式I化合物有利于对低氧症和低氧症-再氧合引起的应激的适应，它们适于防止低氧症和低氧症-再氧合的有害作用。预计这些化合物在循环障碍、动脉狭窄和痉挛、动脉硬化、梗塞、栓塞、血栓形成、低血压、休克、烧伤、冻伤引起的组织损伤状态中会提供治疗效果。本发明的化合物在与变性和代谢疾病(早老性痴呆、糖尿病)有关的次低氧条件下，也会有效。

在接触低氧状态的HepG2细胞中对LDH酶水平的作用

HepG2细胞培养于37℃下在含5％二氧化碳的氧气中的DMEM培养基中，该培养基补充了10％的FCS。将10⁵个细胞加入到Costar 24孔培养板孔中的1ml培养基中。第二天，异30μg/ml的浓度用被测化合物处理细胞，然后让这些细胞接受低氧态处理(在氮气中存在1％氧气，5％二氧化碳)24小时。部分对照组用用作溶剂的说处理，另一部分不接触低氧状态。在低氧态处理结束时，除去培养基并用冷PBS将细胞洗涤两次。在含磷酸盐缓冲液(0.05M)的0.05％曲通X-100中制备细胞裂解液。离心(2分钟，20000×g)后，在丙酮酸钠底物的存在下基于NADH消耗量来检测上清夜的LDH活性。

应用的低氧态处理引起细胞中LDH含量增加3倍。处理治疗低氧症，式I的化合物以累积的方式提高了LDH水平。

抗病毒作用

逆转录病毒基因组组成单链RNA分钟，其通过双链DNA中间体进行复制。将此双链DNA插入宿主基因组中，这在病毒的生命周期中是关键的事件。插入的机理磷酸盐转座的机理。

逆转录酶使DNA复制病毒RNA。在受染细胞的细胞质中合成双链DNA。然后，将线性DNA转运到细胞核中，且一个或多个拷贝整合到宿主细胞的基因组中。此整合是由整合酶介导的。当原病毒DNA被整合时，其使用宿主细胞的酶来产生病毒RNA，该RNA用作mRNA并在包装到病毒颗粒中后作为基因组。

在病毒复制的过程中，逆转录酶的正常功能是必需的。因此，对逆转录酶的抑制提供了抑制逆转录病毒复制的有效途经。一部分现行的抗HIV药物通过抑制逆转录酶起作用。目前，最有效的抗HIV治疗是基于多种抗HIV药物的联合。这些联合中的一个或两个组分是逆转录酶抑制剂。逆转录酶抑制剂存在两种主要的类型。一个组成核苷类似物，此类中大家熟知的代表是叠氮基胸苷，即AZT。这些化合物通过结合核苷酸结合位点抑制该酶活性。非核苷类似物代表了其它类型的逆转录酶抑制剂。这些化合物也结合此酶，但是不结合核苷酸结合位点。此结合是特异性的、相对稳定并导致该酶活性位点的变形，这引起酶活性的显著损失。

对本发明化合物的逆转录酶抑制活性进行如下研究。这些化合物被分类为非核苷类似物逆转录酶抑制剂。对Moloney鼠白血病病毒逆转录酶进行试验，其是HIV逆转录酶的良好模型。试验过程如下：

该试验用聚脱氧腺苷(poly(dA))模板和低聚脱氧胸苷(oligo(dT))12-18引物检测掺入eDNA的(3H)dTTP的量。该反应以20μl的体积进行。

反应混合物的组成：

2μl的10X缓冲液，

20μl的模板引物，

5μM的dTTP，

2μCi的(3H)dTTP，

被测化合物：溶解于1X缓冲液。

通过加入5U的逆转录酶开始该反应。

10X逆转录酶缓冲液的组成：

500mM的Tris-HCl pH8.3，

80mM的MgCl₂，

300mM的KCl，

100mM的DTT。

在37℃下将反应混合物孵育40分钟。然后，将15μl的反应混合物加样到洗涤过的Whatman DE81滤板上，依次用5％磷酸氢二钠缓冲液、水和96％(v/v)乙醇洗涤。干燥后，将此滤板置于5ml的闪烁混合液(OptiPhase HiSafe 3，Wallac)中，并用Packard Tri-Carb2200CE闪烁计数器检测放射活性。

在试验中用抑制活性已知的两个化合物作为阳性对照：AZT是核苷类似物，而化合物奈韦拉平是非核苷型抑制剂。奈韦拉平结合该酶中所谓的苯并二氮杂环更三烯结合位点。

从试验结果中得出如下结论：本发明的化合物抑制Moloney鼠白血病逆转录酶。被测化合物以0.2-2.0μg/ml的浓度使用。基于剂量依赖性的逆转录酶抑制活性，可以说这些新化合物的抑制作用高于奈韦拉平，但是低于核苷类似物AZT的作用。由于所用酶被看做HIV逆转录酶的真实模型，故观察到的结果可以被看做是抗HIV作用。

最近的数据表明PARP是将病毒基因组整合到宿主细胞中所必需的，于是对PARP的抑制阻断了病毒基因组向宿主DNA中的整合。为此，无毒的PARP抑制剂可以抑制噁性逆转录病毒，并停止逆转录病毒如HIV和非甲型肝炎病毒的传播。

基于上述试验结果，可以确信本发明的化合物由于它们的逆转录酶和PARP抑制作用，也可以用作具有若干攻击点的抗病毒活性物质。

于是，这些新的丙烯羧酸偕胺肟衍生物可以用作药物组合物的活性组分。因此，本发明包括含有式I的不饱和羟肟酸衍生物或其N-氧化物或几何异构体(一种或多种)和/或旋光异构体(一种或多种)或药用酸加成盐和/或季铵盐衍生物作为活性组分以及一种或多种载体的药物组合物。

一般来说，本发明的药物组合物含有0.1-95％重量，优选1-50％重量，适宜地5-30％重量的活性组分，且其适于治疗基于氧和能量缺乏状态、PARP抑制的疾病，特别是自身免疫性或神经变性和/或病毒疾病，还适于预防中毒。

就本发明而言，术语“活性组分”包括式I的化合物或其N-氧化物，或者式I化合物或N-氧化物、式I化合物或N-氧化物的药用酸加成盐和/或季铵盐的一种或多种几何异构体和/或旋光异构体，或者式I化合物或N-氧化物的异构体(一种或多种)的药用酸加成盐和/或季铵盐。

本发明的药物组合物适于经口、非肠道或直肠给药，或者用于局部治疗，并可以是固体或液体。

适于口服给药的固体药物组合物可以是散剂、胶囊、片剂、膜包衣片剂、微囊等，并可以含有如下物质作为载体：粘合剂如明胶、山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮等；填充剂如乳糖、葡萄糖、淀粉、磷酸钙等；压片用辅剂如硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇、二氧化硅等；湿润剂如十二烷基硫酸钠等。

适于口服给药的液体药物组合物可以是溶液剂、混悬剂或乳剂，并可以含有如下物质作为载体：例如，助悬剂如明胶、羧甲基纤维素等；乳化剂如脱水山梨醇单油酸酯等；溶剂如水、油、甘油、丙二醇、乙醇等；防腐剂如对羟基苯甲酸甲酯等。

适于非肠道给药的药物组合物一般由活性物质的灭菌溶液组成。

上述剂型以及其它剂型是本领域技术人员已知的，例如，见Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack PublishingCo.，Easton，USA(1990)。

药物组合物一般含有单位剂型。对于成人患者来说典型的剂量以1千克体重计为0.1至1000mg的式I化合物或其N-氧化物或药用酸加成盐和/或季铵衍生物。每天的剂量可以一次或分多次给药。实际的剂量依赖于很多因素并由医生来确定。

通过将活性组分于一种或多种载体混合，并以本领域已知的方法将此混合物转变为药物组合物，制备药物组合物。可以利用的方法是文献中已知的，例如，上述Remington′s Pharmaceutical Sciences。

优选的本发明的药物组合物含有式Ia的丙烯-羧酸偕胺肟衍生物，其中R、R′、R₃、R₄和R₅定义如式Ia，或者其N-氧化物或几何异构体(一种或多种)和/或旋光异构体(一种或多种)或者药用酸加成盐和/或季铵盐作为活性组分。

本发明另一组优选的药物组合物含有式Ib的丙烯-羧酸偕胺肟衍生物，其中R、R′、R₃、R₄、R₅和X定义如式Ib，或者其N-氧化物或者几何异构体(一种或多种)和/或旋光异构体(一种或多种)或者药用酸加成盐和/或季铵盐作为活性组分。

本发明的另一组优选的药物组合物含有式Ic的丙烯-羧酸偕胺肟衍生物，其中R、R′、R₄和R₅定义如式Ic，或者其几何异构体(一种或多种)和/或旋光异构体(一种或多种)或者药用酸加成盐和/或季铵盐作为活性组分。

本发明包括治疗方法，其中用无毒剂量的式I的丙烯羧酸偕胺肟衍生物或者其N-氧化物或几何异构体和/或旋光异构体或者药用酸加成盐和/或季铵盐治疗患有如下疾病的患者：特别是与氧缺乏和/或能量缺乏有关的病症，或者患有基于PARP抑制的疾病，特别是自身免疫性或神经变性疾病，和/或病毒疾病，和/或中毒作用引起的疾病。

此外，本发明包括式I的丙烯羧酸偕胺肟衍生物或者其N-氧化物或几何异构体和/或旋光异构体或者药用酸加成盐和/或季铵盐在制备适于治疗与氧缺乏和/或能量缺乏有关的病症，或者患有基于PARP抑制的疾病，特别是自身免疫性或神经变性疾病，和/或病毒疾病，和/或中毒作用引起的疾病的药物组合物中的用途。

本发明通过下列实施例做进一步的说明。

实施例

实施例1

3-苯乙烯基-4-(3-(1-哌啶基)丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮(1，2，4-oxadiazol-5(4H)-one，等同于Δ²-1，2，4-噁唑啉-5-酮)盐酸盐

将0.94g(0.005mol)的3-苯乙烯基-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮溶解于6ml的丙酮，向所得溶液中，加入1.19g(0.006mol)的1-氯-3-(1-哌啶基)丙烷盐酸盐、0.76g(0.0055mol)的无水碳酸钾，1ml的甲醇和0.05g的碘化钾。将反应混合物加热回流20小时，过滤出无机盐，并将此溶液减压下蒸发。将残余的油状粗品溶解于异丙醇，所得溶液通过加入存在于异丙醇中的氯化氢进行酸化，反应混合物在冰箱中放置一夜，并过滤出沉淀的结晶。于是获得了1.05g的标题化合物。M.p.：203-205℃。

IR(KBr)v＝2550-2650(NH⁺)，1768(CO)，1639(C＝N)cm^-1。

¹H-NMR(DMSO-d₆)δ＝1.3-1.85(6H，m，哌啶-3，4，5-CH₂)，2.11(2H，m，丙基-CH₂)，2.82(2H，m，哌啶-CH₂)，3.09(2H，m，-CH₂-N)，3.36(2H，m，哌啶-CH₂)，3.87(2H，m，-0-CH₂)，7.12(1H，d，Ar-CH＝CH-)，7.4-7.5(3H，m，Ar-H)，7.60(1H，d，Ar-CH＝CH)，7.8(2H，m，ArH)，10.3(1H，br，⁺NH)。

实施例2

3-苯乙烯基-4-(3-(1-哌啶基)-2-羟基丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮盐酸盐

A)将2.25g(0.008mol)的3-苯乙烯基-4-(3-氯-2-羟基丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮溶解于10ml的乙醇，向所得溶液中，加入0.68g(0.008mol)的哌啶，将此混合物加热至50℃，并在搅拌下滴加0.32g(0.008mol)的氢氧化钠在2ml水中的溶液。反应混合物在50-55℃下再搅拌2小时，过滤出沉淀的结晶，干燥，然后加热下溶解于乙醇，并将所得溶液通过加入存在于异丙醇中的氯化氢进行酸化。反应混合物在冰箱中放置一夜，过滤出沉淀的结晶并干燥。于是获得了1.09g的标题化合物。M.p.：234-235℃。

用作起始物的(3-苯乙烯基-4-(3-氯-2-羟基丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮通过3-苯乙烯基-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮和环氧氯丙烷按照文献[Chem.Ber.， 108，1911(1975)]中描述的方法制备。

¹H-NMR(DMSO-d₆)δ＝1.3-1.9(6H，m，哌啶-3，4，5-CH₂)，2.9-3.6(6H，m，3CH₂)，3.8(2H，m，丙基-1-CH₂)，4.35(1H，m，CH-OH)，6.3(1H，br，OH)，7.19(1H，d，Ar-CH＝CH)，7.37-7.47(3H，m，Ar-H)，7.57(1H，d，Ar-CH＝CH-)，7.84(2H，m，Ar-H)，10.25(1H，br，⁺NH)。

B)将0.65g(0.0027mol)的3-苯乙烯基-4-(2，3-环氧丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮溶解于2ml的甲醇，并向所得溶液中，加入0.24g(0.0028mol)的哌啶。让变暖的反应混合物放置1小时。过滤出沉淀的结晶，然后溶解于异丙醇。将此溶液通过加入存在于异丙醇中的氯化氢进行酸化。于是获得了0.38g的标题产物结晶，其与步骤A中获得的化合物相同。M.p.：234-235℃。

用作起始物的(3-苯乙烯基-4-(2，3-环氧丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮制备如下：将1.5g(0.0053mol)的3-苯乙烯基-4-(3-氯-2-羟基丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮溶解于5ml的丙酮，向所得溶液中，加入0.73g的无水碳酸钾，反应混合物加热回流16小时，然后过滤并减压下蒸发。于是获得了1.41g的3-苯乙烯基-4-(2，3-环氧丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮，为油状物。

C)将0.3g(0.0016mol)的3-苯乙烯基-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮溶解于3ml的丙酮，向所得溶液中，加入0.41g(0.0019mol)的3-(1-哌啶基)-2-羟基-1-氯丙烷盐酸盐、0.48g的无水碳酸钾、1ml的甲醇和0.05g的碘化钾。反应混合物加热回流40小时，然后过滤，并减压下蒸馏掉溶剂。将此残余物溶解于5％盐酸，将此溶液过滤并通过加入10％氢氧化钠水溶液将此滤液变为碱性。沉淀的产物用氯仿萃取，将此溶液用无水硫酸钠干燥，减压下蒸发溶剂。将此残余物溶解于异丙醇，并将所得溶液通过加入存在于异丙醇中的氯化氢进行酸化。得到0.18g的产物结晶，其与步骤A制备的标题产物相同。M.p.：234-235℃。

实施例3

3-苯乙烯基-4-(3-吡咯烷子基-2-羟基丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮-盐酸盐

将8.4g(0.03mol)的3-苯乙烯基-4-(3-氯-2-羟基丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮溶解于30ml的乙醇，向所得溶液中，加入2.55g(0.036mol)的吡咯烷，然后在60℃下，搅拌下滴加存在于8ml水中的1.2g(0.03mol)的氢氧化钠。将此反应混合物在60℃下再搅拌1小时，然后减压下蒸馏掉乙醇。加入浓盐酸酸化此残余物，将此溶液用炭处理，过滤，并通过加入2N氢氧化钠水溶液变为碱性。沉淀的油状物用氯仿萃取，有机溶液用无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。将此残余物溶解于异丙醇，所得溶液通过加入存在于异丙醇中的氯化氢进行酸化。将结晶过滤并干燥。于是获得了1.8g的标题化合物。M.p.：188-189℃。

¹H-NMR(DMSO-d₆)δ＝1.8-2.0(4H，m，吡咯烷-3，4-CH₂)，3.06-3.55(6H，m，3CH₂)，3.82(2H，d，丙基-1-CH₂)，4.21(1H，m，-CH-OH)，6.25(1H，d，-OH)，7.14(1H，d，Ar-CH＝CH-)，7.4-7.5(3H，m，Ar-H)，7.58(1H，d，Ar-CH＝CH-)，7.82(2H，m，ArH)，10.3(1H，br，⁺NH)。

实施例4

3-苯乙烯基-4-(3-六亚甲基亚氨基-2-羟基丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮盐酸盐

按照实施例3的描述，2.8g(0.01mol)的3-苯乙烯基-4-(3-氯-2-羟基丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮与1.19g(0.012mol)的六亚甲基亚胺反应。通过加入存在于异丙醇中的氯化氢在异丙醇溶液这沉淀此盐酸盐。于是获得了1.0g的标题化合物。

M.p.：202-203℃。

¹H-NMR(CDCl₃+DMSO-d₆)δ＝1.6-2.0(8H，m，六亚甲基亚胺-3，4，5，6-CH₂)，3.1-3.6(6H，m，3CH₂)，3.8(2H，m，丙基-1-CH₂)，4.35(1H，m，-CH-OH)，6.21(1H，d，OH)，7.11(1H，d，Ar-CH＝CH-)，7.4(3H，m，Ar-H)，7.57(1H，d，Ar-CH＝CH-)，7.77(2H，m，Ar-H)，10.0(1H，br，⁺NH)。

实施例5

3-苯乙烯基-4-(3-(4-吗啉基)-2-羟基丙基)-1，2，4-噁二唑5-酮盐酸盐

4.2g(0.015mol)的3-苯乙烯基-4-(3-氯-2-羟基丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮与1.6g(0.018mol)的吗啉按照实施例3描述的方法进行反应。通过加入存在于异丙醇中的氯化氢在乙醇溶液中沉淀此盐酸盐。于是获得了0.67g的标题化合物。M.p.：232-234℃。

¹H-NMR(DMSO-d₆)δ＝3.1-3.55(6H，m，吗啉-3，5-CH₂，丙基-3-CH₂)，3.8-4.0(6H，m，吗啉-2，6-CH₂，丙基-1-CH₂)，4.37(1H，m，-CH-OH)，6.3(1H，br，OH)，7.12(1H，d，Ar-CH＝CH-)，7.4(3H，m，ArH)，7.6(1H，d，Ar-CH＝CH-)，7.8(2H，m，ArH)，10.6(1H，br，⁺NH)。

实施例6

3-苯乙烯基-4-[3-(叔丁基氨基)-2-羟基丙基]-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮盐酸盐

6.6g(0.024mol)的3-苯乙烯基-4-(3-氯-2-羟基丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮与2.63g(0.036mol)的叔丁基胺按照实施例3描述的方法进行反应。通过加入存在于异丙醇中的氯化氢溶液在异丙醇溶液中沉淀此盐酸盐。于是获得了1.8g的标题化合物。

M.p.：244-246℃。

¹H-NMR(DMSO-d₆)δ＝1.3(9H，s，叔丁基)，2.9-3.15(2H，m，丙基-3-CH₂)，3.85(2H，m，丙基-1-CH₂)，4.15(1H，m，CH-OH)，6.08(1H，d，OH)，7.12(1H，d，Ar-CH＝CH-)，7.40(3H，m，Ar-H)，7.55(1H，d，Ar-CH＝CH)，7.8(2H，m，Ar-H)，8.55(1H，br，NH)，8.85(1H，br，NH)。

实施例7

3-苯乙烯基-4-[3-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-羟基丙基]-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮二盐酸盐

8.4g(0.03mol)的3-苯乙烯基-4-(3-氯-2-羟基丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮与3.6g(0.036mol)的N-甲基哌嗪按照实施例3描述的方法进行反应。通过加入存在于异丙醇中的氯化氢溶液在异丙醇溶液中沉淀此盐酸盐。于是获得了2.08g的标题化合物。

M.p.：206-208℃。

¹H-NMR(DMSO-d₆)δ＝2.77(3H，s，CH₃)，3.0-3.1(2H，m，丙基-3-CH₂)，3.6(8H，m，哌嗪-CH₂)，3.8(2H，m，丙基-1-CH₂)，4.23(1H，m，-CH-OH)，6.2(1H，br，OH)，7.03(1H，d，Ar-CH＝CH-)，7.4(3H，m，Ar-H)，7.58(1H，d，Ar-CH＝CH-)，7.77(2H，m，ArH)，11.8(2H，br，2x ⁺NH)。

实施例8

3-苯乙烯基-4-[3-(1，2，3，4-四氢-2-异喹啉基)-2-羟基-丙基]-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮盐酸盐

2.8g(0.01mol)的3-苯乙烯基-4-(3-氯-2-羟基丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮与1.6g(0.012mol)的1，2，3，4-四氢异喹啉按照实施例3描述的方法进行反应。通过加入存在于异丙醇中的氯化氢溶液在异丙醇溶液中沉淀此盐酸盐。于是获得了0.83g的标题化合物。

M.p.：208-210℃。

¹H-NMR(DMSO-d₆)δ＝3.0-3.6(8H，m，异喹啉-CH₂，丙基-3-CH₂)，3.84(2H，m，丙基-1-CH₂)，4.4(1H，m，-CH-OH)，6.3(1H，br，OH)，7.13(1H，d，Ar-CH-CH-)，7.2-7.5(7H，m，ArH)，7.60(1H，d，Ar-CH＝CH-)，7.8(2H，m，Ar-H)，10.6(1H，br，⁺NH)。

实施例9

3-苯乙烯基-4-[3-(2，6-二甲基苯氨基)-2-羟基丙基]-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮盐酸盐

8.4g(0.03mol)的3-苯乙烯基-4-(3-氯-2-羟基丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮与4.36g(0.036mol)的2，6-二甲基苯胺，用50ml的甲醇代替乙醇，按照实施例3描述的方法进行反应。通过加入存在于异丙醇中的氯化氢在异丙醇溶液中沉淀此盐酸盐，然后用1体积的异丙醇和1体积的乙醇的混合物重结晶。于是获得了1.62g的标题化合物。

M.p.：182-184℃。

¹H-NMR(DMSO-d₆)δ＝2.44(6H，s，CH₃)，3.16-3.53(2H，m，丙基-3-CH₂)，3.86(2H，m，丙基-1-CH₂)，4.21(1H，m，CH-OH)，6.0(1H，br，OH)，7.10(1H，d，Ar-CH＝CH-)，7.14(3H，m，ArH)，7.4-7.5(3H，m，ArH)，7.59(1H，d，Ar-CH＝CH-)，7.78(2H，m，ArH)，9.0(2H，br，⁺NH₂)。

实施例10

3-(3，4-二甲氧基苯乙烯基)-4-(3-(1-哌啶基)-2-羟基丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮盐酸盐

3.4g(0.01mol)的3-(3，4-二甲氧基苯乙烯基)-4-(3-氯-2-羟基丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮与1.02g(0.012mol)的哌啶按照实施例3描述的方法进行反应。通过加入存在于异丙醇中的氯化氢在乙醇溶液中沉淀此盐酸盐。于是获得了1.8g的标题化合物。

M.p.：187-188℃。

¹H-NMR(CDCl₃+DMSO-d₆)δ＝1.4-2.0(6H，m，哌啶3，4，5-CH₂)，3.18-3.31(6H，m，哌啶-2，6-CH₂，丙基-3-CH₂)，3.85-3.92(2H，m，丙基-1-CH₂)，3.89(3H，s，-OCH₃)，3.96(3H，s，-OCH₃)，4.45(1H，m，CH-OH)，6.27(1H，br，OH)，6.93(1H，m，ArH)，6.98(1H，d，Ar-CH＝CH-)，7.21(1H，m，ArH)，7.42(1H，m，ArH)，7.48(1H，d，Ar-CH＝CH-)，9.8(1H，br，⁺NH)。

用作起始物的3-(3，4-二甲氧基苯乙烯基)-4-(3-氯-2-羟基丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮由3-(3，4-二甲氧基苯乙烯基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮与环氧氯丙烷按照文献[Chem.Ber.， 108，1911(1975)]中已知的方法制备。

实施例11

3-苯乙烯基-4-[3-(1-甲基-4-哌嗪基)-2-羟基丙基]-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮二盐酸盐

2.0g(0.0059mol)的3-(3，4-二甲氧基苯乙烯基)-4-(3-氯-2-羟基丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮与0.71g(0.0071mol)的N-甲基哌嗪按照实施例3描述的方法进行反应。通过加入存在于异丙醇中的氯化氢溶液在异丙醇溶液中沉淀此盐酸盐。于是获得了0.8g的标题化合物。M.p.：192-193℃。

¹H-NMR(DMSO-d₆)δ＝2.8(3H，s，N-CH₃)，3.2-3.8(10H，m，哌嗪-CH₂，丙基-3-CH₂)，3.80(3H，s，甲氧基)，3.83(2H，m，丙基-1-CH₂)，3.86(3H，s，OCH₃)，4.31(1H，m，-CH-OH)，6.3(1H，br，OH)，7.0(1H，m，ArH)，7.03(1H，d，Ar-CH＝CH-)，7.30(1H，m，ArH)，7.50(1H，m，ArH)，7.51(1H，d，Ar-CH＝CH-)，11.8(2H，br，2x⁺NH)。

实施例12

N-(3-(1-哌啶基)-2-羟基丙基)肉桂酸偕胺肟

向按照实施例2所述方法制备的1.91g(0.006mol)的3-苯乙烯基-4-(3-(1-哌啶基)-2-羟基丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮中，加入10ml乙醇和10ml的10％氢氧化钠水溶液，并将反应混合物加热回流2小时。将乙醇减压下蒸发，通过加入氢氯酸将残余物的pH调节至8。从部分固体产物中倾析出液相，并将残余物溶解于甲醇。用水稀释时，结晶出0.79g的标题化合物。M.p.：114-115℃。

¹H-NMR(DMSO-d₆)δ＝1.7-1.9(6H，m，哌啶-3，4，5-CH₂)，2.1-2.3(6H，m，哌啶-2，6-CH₂，丙基-3-CH₂)，3.2-3.33(2H，m，丙基-1-CH₂)，3.83(1H，m，CH-OH)，5.6(1H，br，OH)，6.55(1H，d，Ar-CH＝CH-)，7.15(1H，d，Ar-CH＝CH-)，7.8-7.32(3H，m，ArH)，7.44(2H，m，ArH)。

实施例13

N-(3-(4-吗啉基)-2-羟基丙基)肉桂酸偕胺肟二氢马来酸盐

向按照实施例5所述方法制备的2.76g(0.0075mol)的3-苯乙烯基-4-(3-(4-吗啉基)-2-羟基-丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮中，加入10ml的乙醇和10ml的10％氢氧化钠溶液，并将反应混合物加热回流2小时。将乙醇减压下蒸发，通过加入氢氯酸将残余物的pH调节至8。将沉淀的油状产物用二氯甲烷萃取，有机溶液用无水硫酸钠干燥，蒸发溶剂。通过加入马来酸在丙酮溶液中沉淀马来酸盐。于是获得了1.1g的标题化合物。M.p.：128-130℃。

¹H-NMR(CDCl₃+DMSO-d₆)δ＝2.8-3.2(6H，吗啉-3，5-CH₂，丙基-3-CH₂-)，3.3-3.8(6H，m，吗啉-2，6-CH₂，丙基-1-CH₂)，4.10(1H，m，CH-OH)，6.05(4H，s，马来酸CH)，6.75(1H，d，Ar-CH＝CH-)，7.30(1H，d，Ar-CH＝CH-)，7.3(3H，m，ArH)，7.50(2H，m，ArH)。

实施例14

N-[3-(1-甲基-4-哌嗪基)-2-羟基丙基]肉桂酸偕胺肟三氢马来酸盐

按照实施例7所述方法制备的1.17g(0.0025mol)的3-苯乙烯基-4-[3-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-羟基丙基]-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮与氢氧化钠按照实施例13描述的方法进行反应。通过加入马来酸在丙酮中沉淀马来酸盐。于是获得了0.63g的标题化合物。M.p.：142-143℃。

¹H-NMR(DMSO-d₆)δ＝2.7(3H，s，CH₃)，2.5-3.2(10H，m，哌嗪-CH₂，丙基-3-CH₂)，3.31-3.42(2H，m，丙基-1-CH₂)，3.81(1H，m，CH-OH)，6.14(6H，s，马来酸CH)，6.90(1H，d，Ar-CH＝CH-)，7.28(1H，d，Ar-CH＝CH)，7.4(3H，m，ArH)，7.65(2H，m，ArH)。

实施例15

N-(3-(4-吗啉基)-2-羟基丙基)-3，4-二甲氧基肉桂酸偕胺肟

3.91g(0.01mol)的3-(3，4-二甲氧基苯乙烯基)-4-(3-(4-吗啉基)-2-羟基丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮与氢氧化钠按照实施例13描述的方法进行反应。于是获得了1.2g的标题化合物，为油状物。

¹H-NMR(DMSO-d₆)δ＝3.18-3.35(6H，吗啉-3，5-CH₂，丙基-3-CH₂)，3.60(2H，m，丙基-1-CH₂)，3.82(3H，s，OCH₃)，3.86(3H，s，OCH₃)，3.92(4H，m，吗啉-2，6-CH₂)，4.34(1H，m，-CH-OH)，6.3(1H，br，-CH-OH)，6.98(1H，d，Ar-CH＝CH-)，7.02(1H，m，Ar-3H)，7.24(1H，m，Ar-2H)，7.35(1H，d，Ar-CH＝CH-)，7.40(1H，m，Ar-6H)。

实施例16

3-苯乙烯基-6-(哌啶子基甲基)-4H-5，6-二氢-1，2，4-噁二嗪

向1.65g(0.0043mol)的3-苯乙烯基-4-(3-(1-哌啶基)-2-氯-丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮盐酸盐中，加入33ml的乙醇和33ml的2 N氢氧化钠水溶液的混合物，搅拌下将反应混合物加热回流30分钟，然后减压下蒸发，并将此残余物悬浮于10ml的水中。将结晶过滤，用水洗涤，并干燥。于是获得了1.06g的标题化合物。M.p.：147-149℃。

¹H-NMR(DMSO-d₆)δ＝1.3-1.7(6H，m，哌啶-3，4，5-CH₂)，2.3-2.7(6H，m，哌啶-2，6-CH₂，6-CH₂)，3.25-3.6(2H，m，噁二嗪-5-CH₂)，3.95(1H，m，噁二嗪-6-CH)，5.0(1H，br，噁二嗪-4-NH)，6.5(1H，d，Ar-CH＝CH-)，6.9(1H，d，Ar-CH＝CH-)，7.2-7.5(5H，m，ArH)。

用作起始物的3-苯乙烯基-4-(3-(1-哌啶基)-2-氯丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮盐酸盐由3-苯乙烯基-4-(3-(1-哌啶基)-2-羟基丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮盐酸盐(按照实施例2所述制备)与亚硫酰氯按照文献[Chem.Ber.， 108，1911(1975)]中已知的方法制备。

实施例17

3-苯乙烯基-6-(4-吗啉基)-甲基-4H-5，6-二氢-1，2，4-噁二嗪二氢马来酸盐

向1.5g(0.0039mol)的3-苯乙烯基-4-(3-(4-吗啉基)-2-氯-丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮盐酸盐中，加入9ml的乙醇和9ml的10％氢氧化钠水溶液，并将反应混合物加热回流半小时。将乙醇减压下蒸发，残余物用5％盐酸酸化。将所得溶液用炭处理，过滤，并通过加入10％氢氧化钠水溶液变为碱性。沉淀的油状物用氯仿萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发溶剂。将此残余物溶解于乙酸乙酯，并加入0.66g的马来酸的乙酸乙酯溶液。于是获得了1.0g的标题化合物。M.p.：137℃。

¹H-NMR(DMSO-d₆)δ＝3.1-3.44(8H，m，5-CH₂，6-CH₂，吗啉-3-和-5-CH₂)，3.83(4H，m，吗啉-2-和-6-CH₂)，4.08(1H，m，6-CH)，6.18(4H，s，马来酸CH)，6.43(1H，d，Ar-CH＝CH-)，7.25(1H，br，4H)，7.33-7.51(5H，m，5Ar-H)，13-14(br，马来酸OH)。

用作起始物的3-苯乙烯基-4-(3-(4-吗啉基)-2-氯丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮盐酸盐由3-苯乙烯基-4-(3-(4-吗啉基)-2-羟基丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮盐酸盐(按照实施例5制备)，通过将其与亚硫酰氯加热，然后蒸发反应混合物来制备。

实施例18

3-苯乙烯基-6-(1，2，3，4-四氢-2-异喹啉基)-甲基-4H-5，6-二氢-1，2，4-噁二嗪二氢马来酸盐

向1.1g(0.0025mol)的3-苯乙烯基-4-[3-(1，2，3，4-四氢-2-异喹啉基)-2-氯丙基-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮盐酸盐中，加入8ml的乙醇和8ml的10％氢氧化钠，并将反应混合物加热回流半小时。将乙醇减压下蒸发，并将此残余物溶解于5％盐酸中。将此溶液用炭处理，过滤，通过加入10％氢氧化钠水溶液变为碱性，并用乙酸乙酯萃取。合并的乙酸乙酯溶液用无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。将此残余物溶解于乙酸乙酯，并向所得溶液中加入0.36g的马来酸。于是获得了0.55g的标题化合物。M.p.：151-153℃。

¹H-NMR(DMSO-d₆)δ＝3.10(2H，m，异喹啉-4-CH₂)，3.15-3.50(2H，m，噁二嗪-5-CH₂)，3.28-3.39(2H，m，噁二嗪6-CH₂-N＝)，3.44-3.6(2H，m，异喹啉-3-CH₂)，4.2(1H，m，噁二嗪-6-C H)，4.4(2H，s，异喹啉-1-CH₂)，6.13(4H，s，马来酸CH)，6.44(1H，d，Ar-CH＝CH-)，7.15(1H，d，Ar-CH＝CH-)，7.2-7.33(4H，m，异喹啉Ar-H)，7.33-7.52(5H，m，苯基Ar-H)。

实施例19

3-(3，4-二甲氧基苯乙烯基)-4-[3-(叔丁基氨基)-2-羟基-丙基]-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮盐酸盐

将8.54g(0.025mol)的3-(3，4-二甲氧基苯乙烯基)-4-(3-氯-2-羟基丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮溶解于40ml的丙酮中，并向所得溶液中加入3.46g(0.025mol)的无水碳酸钾。将反应混合物加热回流6小时，然后冷却，过滤除去无机盐，减压下蒸发溶剂。用25ml甲醇研磨蒸发后的残余物诱发结晶。于是获得了6.5g的3-(3，4-二甲氧基苯乙烯基)-4-(2，3-环氧丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮。M.p.：113-115℃。

向3.04g(0.01mol)的3-(3，4-二甲氧基苯乙烯基)-4-(2，3-环氧丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮中，加入15ml的甲醇和0.73g(0.01mol)的叔丁基胺，将反应混合物加热回流4小时，然后减压下蒸发溶剂。将此残余物溶解于10ml的5％盐酸，并从不溶的残余物中倾析出溶液。此水溶液通过加入10％氢氧化钠水溶液变为碱性，将所形成的油状物溶解于二氯甲烷，将此溶液用无水硫酸钠干燥，过滤，并减压蒸发溶剂。得到1.7g的油状物，通过加入含氯化氢的异丙醇将此油状物从乙醇中沉淀。于是获得了1.0g的标题化合物。M.p.：225-227℃。

¹H-NMR(DMSO-d₆)δ＝1.3(9H，s，3xCH₃)，2.93-3.17(2H，m，丙基-3-CH₂)，3.80(3H，s，-OCH₃)，3.85(3H，s，-OCH₃)，3.9(2H，d，丙基-1-CH₂)，4.16(1H，m，-CH-OH)，6.12(1H，d，-OH)，7.03(1H，d，Ar-CH＝CH-)，7.51(1H，d，Ar-CH＝CH-)，7.00(1H，m，ArH)，7.29(1H，m，ArH)，7.49(1H，m，ArH)，8.58(1H，br，NH)，8.86(1H，br，NH)。

实施例20

3-(3，4-二甲氧基苯乙烯基)-4-(3-(4-吗啉基)-2-羟基丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮盐酸盐

3.04g(0.01mol)的3-(3，4-二甲氧基苯乙烯基)-4-(2，3-环氧丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮(按照实施例19所述制备)与0.96g(0.011mol)的吗啉以实施例19所述的方法进行反应。于是获得了0.8g的标题化合物。M.p.：228-230℃。

¹H-NMR(DMSO-d₆)δ＝3.2-3.34(6H，m，吗啉-3，5-CH₂，丙基-3-CH₂)，3.82(3H，s，-OCH₃)，3.86(2H，d，丙基-1-CH₂)，3.88(3H，s，-OCH₃)，3.90(4H，m，吗啉-2，6-CH₂)，4.43(1H，m，-CH-OH)，6.4(1H，br，-OH)，7.0(1H，d，ArH)，7.03(1H，d，Ar-CH＝CH-)，7.29(1H，m，ArH)，7.4 8(1H，m，ArH)，7.50(1H，d，Ar-CH＝CH-)，10.7(1H，br，⁺NH)。

实施例21

N-[3-(2，6-二甲基苯氨基)-2-羟基丙基]-肉桂酸偕胺肟

按照实施例12的方法，不同的是1.5g(0.004mol)的3-苯乙烯基-4-[3-(2，6二甲基苯氨基)-2-羟基丙基]-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮(按照实施例9制备)用作起始物。于是获得了0.55g的标题化合物。

M.p.：143-144℃。

¹H-NMR(DMSO-d，)δ＝2.20(6H，s，2xCH₃)，2.82-3.03(2H，m，丙基-3-CHz)，3.15-3.27(2H，m，丙基-1-CH₂)，3.64(1H，m，-CH-OH)，3.80(1H，m，NH-苯胺)，5.15(1H，br，-CH-OH)，5.58(1H，br，NH-偕胺肟)，6.68(1H，d，Ar-CH＝CH-)，6.69(1H，m，ArH)，6.90(2H，m，ArH)，7.01(1H，d，Ar-CH＝CH-)，7.25-7.55(5H，m，ArH)，9.57(1H，S，＝N-OH)。

实施例22

N-(3-(1-吡咯烷基)-2-羟基丙基)-肉桂酸偕胺肟

按照实施例12的方法，不同的是1.23g(0.0035mol)的3-苯乙烯基-4-(3-吡咯烷-2-羟基丙基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮盐酸盐(按照实施例3制备)用作起始物。于是获得了0.65g的标题化合物。M.p.：139-141℃(由96％乙醇结晶)。

¹H-NMR(CDCl₃+DMSO-d₆)δ＝1.75(4H，m，吡咯烷-3，4-CH₂)，2.50-2.64(6H，m，吡咯烷-2，5-CH₂，丙基-3-CH₂)，3.2-3.35(2H，m，丙基-1-CH₂)，3.75(1H，m，CH-OH)，5.6(1H，t，NH)，6.58(1H，d，Ar-CH＝CH-)，7.08(1H，d，Ar-CH＝CH-)，7.25-7.45(5H，m，Ar-H)，9.0(1H，br，＝N-OH)。

Claims

1、下式的新的丙烯羧酸偕胺肟衍生物或其药用酸加成盐

其中

R表示苯基、一甲氧基苯基或二甲氧基苯基；

R′表示氢原子；

R₄表示C₄烷基，R₅表示氢原子；或

R₄和R₅与相邻的氮原子一起形成吡咯烷基、哌啶基、六亚甲基亚氨基、吗啉基、4-甲基哌嗪基、2，6-二甲基苯胺基或1，2，3，4-四氢异喹啉基；

R₁和R₂表示氢原子，而R₃表示羟基；

或

R₁与R₂一起形成羰基，其中的碳原子与比邻R₁的氧原子和比邻R₂的氮原子结合，而

R₃表示氢原子，或羟基，或

R₂是氢原子，而

2、权利要求1所述的下式的丙烯羧酸偕胺肟衍生物或其药用酸加成盐

其中

R₁和R₂表示氢原子，

R₃表示羟基，

R，R′，R₄和R₅定义如权利要求1。

3、权利要求1所述的下式的噁二唑啉衍生物或其药用酸加成盐

其中

R₁与R₂一起形成羰基，其中的碳原子与比邻R₁的氧原子和比邻R₂的氮原子结合，

R₃表示氢原子或羟基，

X表示氧原子或硫原子，

R，R′，R₄和R₅定义如权利要求1。

4、权利要求1所述的下式的噁二嗪衍生物或其药用酸加成盐

其中

R₂是氢原子，而

R₁与R₃一起在比邻R₁的氧原子和比邻R₃的碳原子之间形成一个价键，

R、R′、R₄和R₅定义如权利要求1。

5、式I的丙烯羧酸偕胺肟衍生物，或其可药用酸加成盐的制备方法，其中R、R′、R₁、R₂、R₃、R₄和R₅定义如权利要求1，其特征在于：

其中R和R′定义如上，与下式的氨基烷基卤化物反应

其中Z指卤原子，R₃、R₄和R₅定义如上；或

其中Z和Z1独立地表示卤原子，R₃定义如上，并将所得下式的Δ²-1，2，4-噁二唑啉基烷基卤化物

其中R、R′、R₃和Z定义如上，与下式的胺反应

其中R₄和R₅定义如上；或

其中R和R′定义如上，与式VII的胺反应，其中R₄和R₅定义如上；

或

j)为了制备下式的季铵盐衍生物

其中R₃、R₄、R₅、R₈和Y定义如上，Z表示卤原子；或

k)为了制备下式的N-氧化物

其中R₃、R₄和R₅定义如上，Z表示卤原子；且

所得式I的化合物任选地与无机酸或有机酸反应得到药用酸加成盐。

6、药物组合物，其中含有式I的丙烯羧酸偕胺肟衍生物或其药用酸加成盐作为活性组分，其中R、R′、R₁、R₂、R₃、R₄和R₅定义如权利要求1，还含有一种或多种常规载体。

7、权利要求6所述的药物组合物，其中含有式Ia的丙烯-羧酸偕胺肟衍生物或其药用酸加成盐作为活性组分，其中R、R′、R₃、R₄和R₅定义如权利要求2。

8、权利要求6所述的药物组合物，其中含有式Ib的噁二唑啉衍生物或其药用酸加成盐作为活性组分，其中R、R′、R₃、R₄、R₅和X定义如权利要求3。

9、权利要求6所述的药物组合物，其中含有式Ic的噁二嗪衍生物或其药用酸加成盐作为活性组分，其中R、R′、R₄和R₅定义如权利要求4。

10、式I的丙烯羧酸偕胺肟衍生物的药物用途，包括给患有与氧和/或能量缺乏有关的病症、或基于PARP抑制的疾病特别是自身免疫性或神经变性疾病和/或病毒疾病、和/或中毒引起的疾病的患者，使用无毒量的式I的丙烯羧酸偕胺肟衍生物，其中R、R′、R₁、R₂、R₃、R₄和R₅定义如权利要求1，或其药用酸加成盐。

11、式I的丙烯羧酸偕胺肟衍生物，其中R、R′、R₁、R₂、R₃、R₄和R₅定义如权利要求1，或其药用酸加成盐，在制备适于治疗与氧和/或能量缺乏有关的病症、或基于PARP抑制的疾病特别是自身免疫性或神经变性疾病和/或病毒疾病、和/或中毒引起的疾病的药物组合物中的用途。

12.3-苯乙烯基-4-(3-(1-哌啶基)-2-羟基丙基)-Δ²-1，2，4-噁二唑啉-5-酮及其可药用酸加成盐。

13.3-苯乙烯基-4-(3-吡咯烷子基-2-羟基丙基)-Δ²-1，2，4-噁二唑啉-5-酮及其可药用酸加成盐。

14.3-苯乙烯基-4-(3-六亚甲基亚氨基-2-羟基丙基)-Δ²-1，2，4-噁二唑啉-5-酮及其可药用酸加成盐。

15.3-苯乙烯基-4-(3-(4-吗啉基)-2-羟基丙基)-Δ²-1，2，4-噁二唑啉-5-酮及其可药用酸加成盐。

16.3-苯乙烯基-4-(3-(叔-丁氨基)-2-羟基丙基)-Δ²-1，2，4-噁二唑啉-5-酮及其可药用酸加成盐。

17.3-苯乙烯基-4-(3-(1，2，3，4-四氢-异喹啉基)-2-羟基丙基)-Δ²-1，2，4-噁二唑啉-5-酮及其可药用酸加成盐。

18.3-苯乙烯基-4-(3-(2，6-二甲基苯氨基)-2-羟基丙基)-Δ²-1，2，4-噁二唑啉-5-酮及其可药用酸加成盐。

19.3-(3，4-二甲氧基苯乙烯基)-4-(3-(1-哌啶基)-2-羟基丙基)-Δ²-1，2，4-噁二唑啉-5-酮及其可药用酸加成盐。

20.N-(3-(1-哌啶基)-2-羟丙基)肉桂酸偕胺肟及其可药用酸加成盐。

21.N-(3-(4-吗啉基)-2-羟丙基)肉桂酸偕胺肟及其可药用酸加成盐。

22.N-(3-(1-甲基-4-哌嗪基)-2-羟丙基)肉桂酸偕胺肟及其可药用酸加成盐。

23.3-苯乙烯基-6-((1-哌啶基)甲基)-4H-5，6-二氢-1，2，4-噁二嗪及其可药用酸加成盐。