CN1209116C - 木通皂苷d在制备防治骨病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了含木通皂苷D及含木通皂苷D的木通总皂苷与含木通皂苷D的续断总皂苷在制备防治骨质疏松和/或促进骨愈合药物中的用途，与对照组比可明显消炎、消肿、镇痛，可使骨折兔血清碱性磷酸酶、桡骨骨重系数、骨灰含量、骨磷含量、骨矿密度显著增加，可使维甲酸所致骨质疏松大鼠骨重系数、骨灰含量、骨矿密度、骨小梁宽度及骨磷含量明显增加。

Description

木通皂苷D在制备防治骨病药物中的应用

技术领域

本发明涉及木通皂苷D及含木通皂苷D的木通总皂苷与含木通皂苷D的续断总皂苷的新用途，尤其是木通皂苷D在制备防治骨病药物中的用途。

背景技术

木通种子为木通科植物白木通Akebia trifol iata(Thunb.)Koidz.Var.australis及三叶木通A.tri foliata(Thunb.)Koidz和木通A.quiuatu(Thunb.)Decne的种子。产地：产于四川、湖北、湖南、广西等地。主要成分：木通甙(Akebin)常春藤皂苷元、齐藤果酸钾盐等。性状鉴别：种子多数，扁长卵形，黄棕色或紫褐色。气微香，味苦。性味、归经、功用：性凉、味苦。舒肝理气，活血止痛，利尿，杀虫。用于脘肋胀痛，痛经闭经，小便不利，蛇虫咬伤。

川续断为川续断科植物川续断Dipsacus asper Wall.的干燥根。产地：主产于四川、湖北、云南、贵州等地。性状鉴别：呈长圆柱形，略扁或微弯曲，长5-15cm，直径0.5-2cm。外表灰褐色或黄褐色，全体有明显扭曲的纵皱及沟纹，可见到横裂的皮孔及少数须根痕。质软，久置干燥后变硬，易折断。断面不平坦，皮部外缘呈褐色，内呈黑绿色或棕色，木部黄色呈放射状花纹。气微香，味苦、微甜而后涩。以条粗、质软、断面带墨绿色者为佳。性味、归经、功用：味苦、甘、辛；性微温，补肝肾，强筋骨，续折伤。用于腰痛脚弱、遗精、崩漏、胎动欲堕、跌扑损伤、金疮、痈疽溃疡等症。

骨质疏松症是一种以低骨量和骨组织微结构破坏为特征，导致骨骼脆性增加和易发生骨折的全身性疾病。骨质疏松的发病率在慢性病中已跃居第七位。骨质疏松患者的三大症状1.临床表现以疼痛最为常见：多为腰背酸疼，其次为肩背、颈部或腕踝部，可因坐位、立位、卧位或翻身时疼痛，时好时坏。2.骨骼变形：脊柱骨变形，弯腰、驼背、身材变矮。3.骨折：常见骨折部位是脊椎骨(压缩性、楔型)、腕部(桡骨头)和髋骨(股骨颈)。骨折是骨质疏松症的并发症，股骨颈骨折10-20％在住院的第一年死亡，余下一半生活不能自理。诊断：主要依靠双能X线骨密度测量仪，中晚期可依靠X线片诊断。目前临床预防依靠晒太阳、运动、补钙。治疗用维生素D、二磷酸盐、降钙素、雌激素等。有报道骨碎补、肉苁蓉等补肾中药，有促进骨愈合的作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是从中国传统中药中提取分离防治骨病的有效部位和/或有效成份，以便制备疗效好、毒副作用小、服用方便、可长期使用的治疗骨病尤其是防治骨质疏松和/或促进骨愈合的药物。

为解决上述问题，本发明提供如下技术方案。

木通皂苷D及含木通皂苷D的木通总皂苷与含木通皂苷D的续断总皂苷在制备防治骨病药物中的用途。所述木通总皂苷含木通皂苷D≥5％；续断总皂苷含木通皂苷D≥5％。具体为木通总皂苷含木通皂苷D 5-95％；续断总皂苷含木通皂苷D 5-95％。

木通总皂苷除了含木通皂苷D以外，还含木通皂苷A、B等。

续断总皂苷除了含木通皂苷D以外，还含长春藤皂苷元为母核的系列皂苷。

前述防治骨病药物中的用途，其特征在于：防治骨病是指骨质疏松和/或促进骨损伤的愈合。所述骨损伤包括骨折、骨裂。

所述防治骨病药物中的用途，其药物为含治疗有效量的木通皂苷D和药学上可接受组分和/或载体；或者为含治疗有效量的含木通皂苷D的木通总皂苷和药学上可接受组分和/或载体；或者为含治疗有效量的含木通皂苷D的续断总皂苷和药学上可接受组分和/或载体。

所述木通皂苷在制备防治骨病药物中的用途，药学上可接受组分为可与木通皂苷D或含木通皂苷D的木通总皂苷或者含木通皂苷D的续断总皂苷与联合防治骨病的化合物或组合物。

所述木通皂苷在制备防治骨病药物中的用途，所述药物为含治疗有效量木通皂苷和药学上可接受组分和/或载体的口服制剂、胃肠外给药制剂或外用制剂。

可与木通皂苷或木通皂苷D混合制备各种口服制剂如片剂、硬胶囊剂、颗粒剂的辅料有：崩解剂如羟丙基淀粉、羟丙纤维素、羧甲基淀粉钠、羧甲基纤维素钙、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠等；填充剂如乳糖、蔗糖、甘露醇、微晶纤维素、糊精、淀粉、磷酸钙、磷酸氢钙、硫酸钙、碳酸钙、环糊精、微粉纤维素等；润湿剂和粘合剂如：预胶化淀粉、聚维酮、羧甲基纤维素钠、羟丙甲纤维素；润滑剂如滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸钙、微粉硅胶、氢化植物油、聚乙二醇4000和6000；润湿剂如：十二烷基硫酸钠、吐温80；骨架材料如羟丙甲纤维素、乙基纤维素等。可与本发明木通皂苷或木通皂苷D混合制备软胶囊的油相可以是大豆油、聚乙二醇400、棉籽油、花生油、麻油、玉米油、橄榄油等；亦可加增溶剂或潜溶剂及抗氧剂等，还可选用如下辅料：溶剂如聚乙二醇400、棉籽油、花生油、麻油、玉米油、橄榄油等；增溶剂或潜溶剂如：吐温80、聚氧乙烯醚蓖麻油、苯甲酸苄酯、乳酸乙酯等；抗氧剂如：没食子酸丙酯、特丁基苯酚(BHT)、维生素E等。胶壳中明胶、甘油与水的比例可适当调节，如明胶/甘油/水三者的比例在1∶0.3～0.4∶0.7～1.4为宜，胶壳中还可添加其他成分，如防腐剂对羟基苯甲酸甲、乙、丙、丁酯等；增塑剂如山梨醇等；稳定剂如阿拉伯胶等；遮光剂如二氧化钛、硫酸钡、沉降碳酸钙等。

图面说明

图1、兔子桡骨抗折力试验装置

图2、兔子桡骨弯距图

具体实施方式

药材.预知子(木通种子)与川续断为市售。经检验分别符合药典相关项下各项标准。

木通种子的植物来源及其学名：木通种子为木通科植物白木通Akebia trifoliata(Thunb.)Koidz.Var.australis及三叶木通A.tri foliata(Thunb.)Koidz和木通A.quiuatu(Thunb.)Decne的种子。川续断为川续断科植物川续断Dipsacus asper Wall.的干燥根。

实施例1

木通皂苷D及含木通皂苷D的木通总皂苷的提取分离

取白木通种子100g，粉碎成粗粉，以石油醚脱脂，挥干石油醚后，以用85％乙醇回流提取三次，每次2小时，每次加6倍量乙醇，提取液过滤，合并滤液，减压回收乙醇近干，加水形成混悬液，用正丁醇萃取三次，合并正丁醇萃取液，减压回收正丁醇至干，得正丁醇提取物，加水100ml，通过D-101大孔树脂柱，以水洗至无糖反应为止，再用70％的乙醇洗脱，得洗脱物即木通总皂苷(约含木通皂苷D 5％)(简称样品1)。将样品1进行硅胶柱层析，以氯仿-甲醇(1∶1)洗脱，得样品2(约含木通皂苷D 55％)；将样品2再次进行硅胶柱层析，以氯仿-甲醇(1∶1)洗脱，得样品3(约含木通皂苷D 95％)，即得木通皂苷D 1克。

实施例2

木通皂苷D及含木通皂苷D的续断总皂苷的提取分离

取川续断药材100克，粉碎成粗颗粒(黄豆大)，用85％乙醇回流提取三次，每次2小时，每次加6倍量乙醇，提取液过滤，合并滤液，减压回收乙醇近干，加水形成混悬液，用正丁醇萃取三次，合并正丁醇萃取液，减压回收正丁醇至干，残渣用水溶解后，用石油醚反复脱脂，脱脂后的水溶液，浓缩，析出沉淀物，沉淀物用少许水洗涤，干燥后，得续断总皂苷粗品，即样品4(约含木通皂苷D 5％)；将样品4用甲醇重结晶，得样品5(约含木通皂苷D 55％)；将样品5用甲醇反复重结晶，得样品6即木通皂苷D 4克(木通皂苷D含量约为95％)。

木通皂苷D学名为3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖-常春藤皂苷元28-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖酯甙。

分子式：C₄₇H₇₆O₁₈，M＝952(M+Na⁺)

理化常数：mp为207-210℃(甲醇重结晶)[α]_D ^1a+14.9℃(C0.25，MeOH)，易溶于甲醇。

木通皂苷D：白色粉末(甲醇)。mp207-210.5℃。[α]D19+14.9℃(C 0.25，MeOH)。

参见：张永文，薛智川续断的化学成分研究药学学报，1991；26(9)：676～681；Phytochemistry.1989；28：644；杨尚军，吴知行，等川续断中三萜皂苷的研究II中国药科大学学报，1993；24(5)：276～280。

实施例3

木通皂苷D及含木通皂苷D的木通总皂苷与含木通皂苷D的续断总皂苷的药效学研究

实际上，随着木通总皂苷中木通皂苷D的含量增加，当其含95％木通皂苷D时，本技术领域一般就认为是较纯的木通皂苷D。

参见：王一涛、王家葵、杨奎等，木通的药理学研究，中药药理与临床，1996(3)：20-23；柴本浦，汤雪明，实验性骨折愈合的超微结构研究，中华骨科杂志，1982，2(2)：117；周铜水，刘晓东，周荣汉，骨碎补对大鼠实验性骨损伤愈合的影响，中草药，1994，25(5)：249-250；刘毓顺，周金水，林葆凯等，接骨散对家兔骨折的实验研究，福建中医药，1994，25(3)：19。

申请人研究了木通总皂苷(含5-95％木通皂苷D)的主要药效作用，虽然在如下描述中仅仅选择了含5、55和95％木通皂苷D的木通总皂苷的药效数据，这不应该对本发明技术方案产生限制。

实验动物：昆明种小鼠，体重18-22g；青紫兰兔，体重1.8-2.5kg；SD雄性大鼠，体重170-220g，由中国药科大学动物室提供，合格证号，苏动质97004。

药物名称：木通总皂苷样品1(含木通皂苷D5％)，木通总皂苷样品2(含木通皂苷D55％)，木通总皂苷样品3(含木通皂苷D95％)，提供单位：浙江迪耳药业有限公司提供，批号：980813

骨折挫伤散：中国佳木斯中药厂出品，黑卫药准字(1982)第301173号。

依膦：连云港正大天晴制药有限公司生产。

丹参片：上海中药制药三厂生产，ZZ-3885-沪卫药准字(1995)第042067号。

酮洛芬胶囊：中国苏中制药厂(江苏)生产，苏卫药准字(1987)和355202号。

配制方法：将木通总皂苷样品1、样品2、样品3颗粒及阳性药研成细粉，用0.5％CMC-Na配制成所需浓度的混悬液。

试剂：血清无机磷测定试剂盒：上海科欣生物技术研究所生产。碱性磷酸酶试剂：常州市医科所试剂站，批号：971104。维甲酸：上海第六制药厂生产。

仪器：双能x射线骨密测定仪，LUNAR DPX-L型美国LUNAR公司生产

1.木通总皂苷(含5-95％木通皂苷D)对小鼠自身皮下血肿的影响

参见：王楠，贾筠生，曹棣芳等，益气化瘀法治疗皮下和脑内血肿的实验性研究，上海中医药，1985，(1)：45-48。

取体重18-22g雄性小鼠140只，按体重随机分为14组，阴性对照组(给予0.5％CMC-Na0.4ml)；阳性对照组(给予丹参片0.3g/kg)；木通总皂苷样品1高(4.4g/kg)、低(2.2g/kg)2个剂量；木通总皂苷样品2高(0.8g/kg)、低(0.4g/kg)2个剂量；木通总皂苷样品3高(0.46g/kg)、低(0.23g/kg)2个剂量。续断总皂苷样品4高(4.4g/kg)、低(2.2g/kg)2个剂量；续断总皂苷样品5高(0.8g/kg)、低(0.4g/kg)2个剂量；续断总皂苷样品6高(0.46g/kg)、低(0.23g/kg)2个剂量。给药前造皮下血肿模型；每鼠一侧眼后静脉取血0.5ml，加入含青霉素10万单位的0.1M的CaCl2溶液0.1ml混匀，立即注入自身颈背部皮下，造成皮下血肿。造型后按上法连续给药7日，每天上午8:00-10:00给药一次。给药容积为0.4ml/20g。第8日处死，分离皮下血肿包块，电子天平称重，并对数据进行组间t检验比较，结果见表1。

表1木通总皂苷和续断总皂苷灌胃给药对小鼠自身皮下血肿的影响(X±S)(n＝10)

组别	剂量(g/kg)	皮下残留量血块重量(mg)
			阴性对照	-	76.55±20.44
丹参片	0.3	27.88±7.07***
			木通总皂苷样品1	4.4	26.89±5.01***
2.2	27.06±6.15***
		木通总皂苷样品2		0.8	20.34±3.56***

	0.4	26.63±6.02***
			木通总皂苷样品3	0.46	20.22±1.66***
0.23	25.97±3.13***
		续断总皂苷样品4		4.4	25.93±4.09***
2.2	26.78±4.12***
			续断总皂苷样品5	0.8	19.91±3.77***
0.4	25.71±5.92***
		续断总皂苷样品6		0.46	19.25±3.11***
0.23	24.79±4.12***

^***P＜0.01与阴性对照组比较

由表1可见，木通总皂苷样品1(含木通皂苷D5％)，木通总皂苷样品2(含木通皂苷D55％)，木通总皂苷样品3(含木通皂苷D95％)的高、低2个剂量组，续断总皂苷样品4(含木通皂苷D5％)，续断总皂苷样品5(含木通皂苷D55％)，续断总皂苷样品6(含木通皂苷D95％)的高、低2个剂量组及丹参片组能使小鼠自身皮下血肿块的重量明显减轻(P＜0.01)。

2、木通总皂苷(含5～95％木通皂苷D)对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响

取雄性小鼠80只，体重18-22g，按体重随机分为8组，阴性对照组(给予0.5％CMC-Na)；阳性对照组(给予酮洛芬0.18g/kg)；其余6组分别给予木通总皂苷样品1高(4.4g/kg)、低(2.2g/kg)2个剂量；木通总皂苷样品2高(0.8g/kg)、低(0.4g/kg)2个剂量；木通总皂苷样品3高(0.46g/kg)、低(0.23g/kg)2个剂量。按上述剂量连续给药7天，结果见表2。

表2木通总皂苷灌胃给药对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响(X±S)(n＝10)

组别	剂量(g/kg)	肿胀度(mg)
			阴性对照	-	20.6±4.24
酮洛芬	0.18	6.91±1.22***
			木通总皂苷样品1	4.4	13.69±1.75***
2.2	15.44±2.24***
		木通总皂苷样品2		0.8	8.64±2.40***

	0.4	14.09±2.49***
			木通总皂苷样品3	0.46	8.89±1.48***
0.23	13.84±2.01***

^***P＜0.01与阴性对照组比较

由表2可见，木通总皂苷样品1(含木通皂苷D5％)，木通总皂苷样品2(含木通皂苷D55％)，木通总皂苷样品3(含木通皂苷D95％)的高、低2个剂量组及酮洛芬组对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀有显著的抑制作用(P＜0.01)。

3、木通总皂苷(含5～95％木通皂苷D)对醋酸所致小鼠疼痛的影响。

取小鼠80只，体重18-22g，按体重随机分为8组，给药方式及剂量同2，结果见表3。

表3木通总皂苷灌胃给药对醋酸所致小鼠疼痛的影响(X±S)(n＝10)

组别	剂量(mg/kg)	扭体出现时间(S)	扭体次数(次)
				阴性对照	-	122.5±61.82	28.5±6.82
酮洛芬	0.18	254.3±97.32***	11.5±5.64***
				木通总皂苷样品1	4.4	237.3±62.1**	21.68±7.72**
2.2	209/5±52.9**	24.57±6.11**
			木通总皂苷样品2		0.8	302.4±80.38***	18.0±6.78***
0.4	202.4±59.73**	22.2±5.05**
				木通总皂苷样品3	0.46	314.1±47.6***	17.1±4.40***
0.23	208.7±67.9**	19.87±8.91***

^**P＜0.05 ^***P＜0.01  与阴性对照组比较

由表3可见，木通总皂苷样品1(含木通皂苷D5％)，木通总皂苷样品2(含木通皂苷D55％)，木通总皂苷样品3(含木通皂苷D95％)的高、低2个剂量组对醋酸所致小鼠疼痛有明显抑制作用(P＜0.01，P＜0.05)，小鼠扭体次数及首次扭体出现时间与阴性对照组比较有显著差异，酮洛芬组对此模型也有明显的镇痛作用(P＜0.01)。

4、木通总皂苷(含5～95％木通皂苷D)对家兔桡骨骨折的治疗作用

取体重1.8-2.5kg家兔128只，雌雄各半，实验开始先制备骨折模型，用1.5％戊巴比妥钠2ml/kg(30mg/kg)进行兔耳缘静脉麻醉，在无菌条件下，于旋前圆肌止点远端用特制钢锯造成双侧桡骨骨质完全缺损3mm宽的标准性横断骨折，手术切口部位滴入0.1ml(4万u)青霉素和0.1ml(120mg)链霉素，然后缝合皮肤。阴性对照组给予普通饲料，阳性对照组给予骨折挫伤散0.3g/kg，另外6组分别给予木通总皂苷样品1高(2.2g/kg)、低(1.1g/kg)2个剂量；木通总皂苷样品2高(0.2g/kg)、低(0.1g/kg)2个剂量；木通总皂苷样品3高(0.116g/kg)、低(0.058g/kg)2个剂量。每天给药1次，于给药21天和35天分批放血处死动物，取血和解剖分离双侧桡骨检测以下几项指标：

4.1血清碱性磷酸酶的测定

股静脉插管放血测定血清碱性磷酸酶，结果见表4。

表4木通总皂苷对骨折兔血清碱性磷酸酶的影响(X±S)(n＝8)

组别	剂量(mg/kg)	血清碱性磷酸酶(U/L)
				21天	35天
		阴性对照	-			96.7±35.3	100.5±13.1
骨折挫伤散	0.3			134.3±17.8**	133.4±4.9***
		木通总皂苷样品1	2.2			137.1±13.1**	137.0±15.5***
1.1	130.9±16.8**			130.1±17.1***
			木通总皂苷样品2		0.2	136.9±15.8**	137.4±8.4***
0.1	131.7±10.4**	131.0±6.2***
				木通总皂苷样品3	0.116	136.4±11.7**	136.8±7.5***
0.058	132.9±16.3**	133.0±8.1***

^**P＜0.05 ^***P＜0.01  与阴性对照组比较

由表4可见，木通总皂苷样品1(含木通皂苷D5％)，木通总皂苷样品2(含木通皂苷D55％)，木通总皂苷样品3(含木通皂苷D95％)的高、低剂量组及骨折挫伤散组于给药后21天和35天对骨折兔血清碱性磷酸酶浓度有明显升高作用(P＜0.01，P＜0.05)。

4.2骨重系数及骨灰含量的测定

取左侧桡骨，称重测定骨重系数，g/100g体重表示；取左侧桡骨干燥并炭化后置于800℃马福炉中灰化8小时制成骨灰，测定骨灰含量，以g/g骨重表示，结果见表5。

表5木通总皂苷对骨折兔桡骨骨重系数和骨灰含量的影响(X±S)(n＝8)

组别	剂量g/kg	骨重系数(g/100g体重)		骨灰含量(g/g骨重)
						21天	35天	21天	35天
		阴性对照	-	0.072±0.004	0.073±0.011					0.354±0.032	0.357±0.015
骨折挫伤散	0.3					0.092±0.021**	0.097±0.016***	0.410±0.036***	0.418±0.026***
		木通总皂苷样品1	2.2	0.092±0.012***	0.099±0.010***					0.418±0.031***	0.429±0.019***
1.1	0.086±0.016**					0.091±0.020***	0.407±0.029***	0.410±0.041***
			木通总皂苷样品2	0.2	0.092±0.013***				0.100±0.016***	0.426±0.036***	0.430±0.015***
0.1	0.088±0.015**	0.097±0.011***				0.410±0.020***	0.411±0.021***
				木通总皂苷样品3	0.116			0.092±0.019***	0.101±0.016***	0.427±0.027***	0.431±0.022***
0.058	0.087±0.014**	0.096±0.014***	0.412±0.024***			0.413±0.029***

^**P＜0.05 ^***P＜0.01  与相应时期阴性对照组比较

由表5可见，木通总皂苷样品1(含木通皂苷D5％)，木通总皂苷样品2(含木通皂苷D55％)，木通总皂苷样品3(含木通皂苷D95％)的高、低剂量组和骨折挫伤散组于给药21天和35天可使骨重系数和骨灰含量明显升高(P＜0.01，P＜0.05)。

4.3骨矿密度的测定

取左侧桡骨，用双能X射线骨密度测定仪测量骨折部位骨矿密度，结果见表6。

表6木通总皂苷对骨折兔桡骨骨矿密度影响(X±S)(n＝8)

组别	剂量(g/kg)	骨矿密度(g/cm2)
				21天	35天
		阴性对照	-			0.109±0.066	0.088±0.060
骨折挫伤散	0.3			0.196±0.072**	0.151±0.055**
		木通总皂苷样品1	2.2			0.255±0.043***	0.168±0.054**
1.1	0.166±0.072**			0.152±0.041**
			木通总皂苷样品2		0.2	0.277±0.062***	0.163±0.066**
0.1	0.178±0.056**	0.156±0.049**
				木通总皂苷样品3	0.116	0.265±0.047***	0.164±0.021**
0.058	0.171±0.053**	0.158±0.063**

^**P＜0.05 ^***P＜0.01  与相应时期阴性对照组比较

由表6可见，木通总皂苷样品1(含木通皂苷D5％)，木通总皂苷样品2(含木通皂苷D55％)，木通总皂苷样品3(含木通皂苷D95％)的高、低剂量组和骨折挫伤散组于给药后21天和35天可使兔桡骨骨折部位骨矿密度明显增加(P＜0.01，P＜0.05)。

4.4 X线片测定

取左侧桡骨进行X线片测定，包括3个指标：①骨折断端边缘模糊出现情况(出现模糊动物例数)，并对结果进行X2检验；②骨膜反应：即测量外骨膜厚度，方法是在骨折断端两侧外骨膜反应最明显处任选3点，测量其厚宽，取平均值；③骨痂密度：采用3级分法，阴影浅淡模糊，勉强可辨认者为I；阴影较浅，明显可见者为II级；阴影较深，甚至有明显钙化者为III级，所得结果用Riddit分析(参见：柴本浦，汤雪明，实验性骨折愈合的超微结构研究，中华骨科杂志，1982，2(2)：117)。上述三项结果分别见表7、表8和表9。

                 表7木通总皂苷对兔骨折断端边缘模糊出现影响

组别	剂量(g/kg)	动物数(只)	骨折断端模糊的例数(只)
					21天	35天
			阴性对照	-			8	1	1
骨折挫伤散	0.3	8			6**	8***
			木通总皂苷样品1	2.2			8	6**	8***
1.1	8	5**			7***
				木通总皂苷样品2		0.2	8	6**	8***
0.1	8	5**	7***
					木通总皂苷样品3	0.116	8	7***	8***
0.0.58	8	5**	8***

^**P＜0.05 ^***P＜0.01  与相应时期阴性对照组比较

           表8木通总皂苷对兔骨折骨骨膜厚度的影响(X±S)(n＝8)

组别	剂量(g/kg)	骨膜厚度
				21天	35天
		阴性对照	-			1.63±1.09	2.35±1.04
骨折挫伤散	0.3			1.74±1.55	0.98±1.25**
		木通总皂苷样品1	2.2			2.77±1.01**	0.79±1.01**△△△
1.1	2.63±1.38**			0.92±0.87**△△
			木通总皂苷样品2		0.2	2.85±1.32**	0.77±0.99**△△△
0.1	2.66±1.39**	0.94±1.06**△△
				木通总皂苷样品3	0.116	2.87±1.42**	0.76±0.83**△△△
0.058	2.70±1.21**	0.91±1.03**△△

^**P＜0.05与相应时期阴性对照组比较，^△△P＜0.05，^△△△P＜0.01，与同组21天比较。

^**P＜0.05 ^***P＜0.01  与相应时期阴性对照组比较

                      表9木通总皂苷对骨折兔骨痂密度的影响

组别	剂量(g/kg)	动物数(只)	骨痂密度各级动物数(只)
									21天			35天
			I	II	III	I	II	III
									阴性对照	-	8	8	0	0***	5	3	0
骨折挫伤散	0.3	8	0	4	4***	0	2	6***
									木通总皂苷样品1	2.2	8	0	4	4***	0	0	8***
1.1	8	0	5	3***	0	2	6***
								木通总皂苷样品2		0.2	8	0	4	4***	0	0	8***
0.1	8	0	5	3***	0	2	6***
									木通总皂苷样品3	0.116	8	0	3	5***	0	0	8***
0.058	8	0	4	4***	0	1	7***

^***P＜0.01与阴性对照组比较

由表7、8和9可见，木通总皂苷样品1(含木通皂苷D5％)，木通总皂苷样品2(含木通皂苷D55％)，木通总皂苷样品3(含木通皂苷D95％)的高、低剂量组及骨折挫散组于给药后21天和35天时骨折断端模糊的例数明显多于阴性对照组(P＜0.01，P＜0.05)，给药后21天各给药组的骨膜厚度较阳性对照组厚，但与后者比较无显著性差异，给药35天各给药组的骨膜厚度明显薄于阴性对照组(P＜0.05)，并且木通总皂苷给药后35天的骨膜厚度明显薄于给药后21天的骨膜厚度，表明给药组骨痂已被吸收，骨折已基本修复；另外，各给药组的骨痂密度明显大于阴性对照组(P＜0.01)。上述X线片结果显示，各给药组骨折愈合速度明显快于阴性对照组。

4.5抗折力试验

按文献(邱桐，林维启，王慎，“接骨一粒丹”对家兔尺骨骨折X线片表现的影响，甘肃中医学院学报，1992，6，9(2)：35-36)方法设计抗折力试验装置。如图1所示，兔子桡骨做受力破坏试验时，试验装置可近似着作受集中载荷的简支架，且兔子桡骨的重量可以忽略不计。图1为兔子桡骨抗折力试验装置，其中：1为兔子桡骨长1；p为载荷(试验中用挂砝码的方法逐渐加载)；a为载荷p距兔子桡骨左端点的距离；b为载荷p距兔子桡骨右端点距离；B为载荷p作用点，也是兔子桡骨折断处；A、C为桡骨两端支撑点。建立坐标，则兔子桡骨弯距如图2。由图2弯距图可知，最大弯距处即兔子桡骨折断处的变距。

$M_{\max }=\frac{\mathrm{Pab}}{t}=\mathrm{Pa}(1-\frac{a}{t})$

我们分别于给药后21天和35天进行测定，结果见表10。

表10木通总皂苷对兔骨折骨骨抗折力的影响(X±S)(n＝8)

组别	剂量(g/kg)	骨折最大弯距(N·m)
				21天	35天
		阴性对照	-			0.197±0.021	0.240±0.021
骨折挫伤散	0.3			0.371±0.051***	0.478±0.032***△△△
		木通总皂苷样品1	2.2			0.476±0.054***	0.609±0.017***△△△
1.1	0.407±0.048***			0.581±0.041***△△△
			木通总皂苷样品2		0.2	0.488±0.044***	0.611±0.094***△△△
0.1	0.404±0.032***	0.586±0.054***△△△
				木通总皂苷样品3	0.116	0.491±0.047***	0.616±0.042***△△△
0.058	0.412±0.056***	0.579±0.023***△△△

^***P＜0.01与相应时期阴性对照组比较，^△△△P＜0.05，^△△△P＜0.01，与同组21天比较。

由表10可见，给药21天时木通总皂苷样品1(含木通皂苷D5％)，木通总皂苷样品2(含木通皂苷D55％)，木通总皂苷样品3(含木通皂苷D95％)的高、低剂量组及骨折挫伤散组的骨折骨最大弯距明显大于阴性对照组(P＜0.01)。给药35天时各给药组骨折骨的最大弯距明显大于阴性对照组(P＜0.01)。另外，给药35天的各给药组的骨折骨抗折力作用显著强于同组21天(P＜0.01，P＜0.05)。

4.6骨钙、骨磷的测定

按6-4.2方法制成骨灰，取定量骨灰用岛津AA-670火焰原子吸收光谱测定骨钙含量；另将一定量骨灰溶于6NHCL，用血清无机磷测定试验盒测定骨磷。将所得结果折算成每克骨重含多少毫克骨钙或骨磷，然后对其进行组间t检验，结果见表11。

表11木通总皂苷对骨折兔骨钙和骨磷的影响(X±S)(n＝8)

组别	剂量(g/kg)	骨钙(mg/g骨重)		骨磷(mg/g骨重)
						21天	35天	21天	35天
		阴性对照	-	112.5±11.9	128.9±8.4					1.406±0.028	1.41±0.014
骨折挫伤散	0.3					140.6±21.7***	148.5±12.6***	1.604±0.167**	1.640±0.073***
		木通总皂苷样品1	2.2	136.9±12.3***	148.2±8.0***					1.67±0.143***	1.727±0.091***
1.1	120.1±7.9					137.6±7.3	1.53±0.211**	1.688±0.028***
			木通总皂苷样品2	0.2	137.0±14.0***				148.9±6.4***	1.68±0.079***	1.725±0.078***
0.1	119.2±4.9	139.1±10.39				1.51±0.159**	1.675±0.100***
				木通总皂苷样品3	0.116			138.2±11.6***	150.1±11.8***	1.69±0.108***	1.766±0.126***
0.058	119.9±14.2	139.3±7.5	1.53±0.105**			1.689±0.098***

^**P＜0.05 ^***P＜0.01  与相应时期阴性对照组比较

由表11可见，木通总皂苷样品1(含木通皂苷D5％)，木通总皂苷样品2(含木通皂苷D55％)，木通总皂苷样品3(含木通皂苷D95％)的高、低剂量组及骨折挫伤散于给药后21天和35天对骨折骨骨磷含量具有显著升高作用(P＜0.01，P＜0.05)；本品高剂量组和骨折挫伤散组可使给药后21天和35天的骨折骨骨钙明显升高(P＜0.01)，低剂量组对其也有升高作用，但与阴性对照组比无显著差异。

4.7桡骨骨折部位病理组织学检查

耳右侧桡骨标本经10％甲醛溶液固定，脱钙，右蜡切片，HE染色，观察各组桡骨骨折部位病理组织改变。结果见表12。

表12木通总皂苷对兔骨折部位骨小梁宽度的影响(X±S)(n＝8)

组别	剂量(g/kg)	骨小梁宽度(mm)
				21天	35天
		阴性对照	-			0.017±0.002	0.019±0.004
骨折挫伤散	0.3			0.021±0.006**	0.021±0.006**
		木通总皂苷样品1	2.2			0.028±0.008***	0.029±0.004***
1.1	0.017±0.004			0.021±0.011**

木通总皂苷样品2	0.2	0.029±0.011***	0.029±0.012***
				0.1	0.018±0.008	0.020±0.004**
	木通总皂苷样品3	0.116	0.030±0.009***				0.031±0.006***
0.058				0.019±0.012	0.020±0.014**

^**P＜0.05，^***P＜0.01，与相应时期阴性对照组比较

由表12可见，木通总皂苷样品1(含木通皂苷D5％)，木通总皂苷样品2(含木通皂苷D55％)，木通总皂苷样品3(含木通皂苷D95％)的高剂量组及骨折挫伤散组于给药后21天可使骨折部位骨小梁宽度显著增加(P＜0.01，P＜0.05)；高剂量组于给药后35天也可使骨折部位骨小梁明显加宽(P＜0.05)，各给药组的骨小梁周围骨细胞增生活跃，并可见较多的成骨细胞，尤以高剂量组最为明显。病理检验报告表明，后者骨小梁不仅增宽而且排列的很密集。

5.木通总皂苷(含5～95％木通皂苷D)对维甲酸所致大鼠骨质疏松的影响

取大鼠210只，按体重随机分为21组，一组作为正常对照组，给予0.5％CMC-Na，其余20组大鼠均给予维甲酸70mg/kg，以制备骨质疏松模型，在这20组大鼠中，1组作为模型对照组给予0.5％CMC-Na，1组给予依膦作为阳性对照组(40mg/kg)，其余18组分别给予木通总皂苷样品1高(2.2g/kg)、中(1.1g/kg)、低(0.55g/kg)3个剂量；木通总皂苷样品2高(0.4g/kg)、中(0.2g/kg)、低(0.1g/kg)3个剂量；木通总皂苷样品3高(0.23g/kg)、中(0.115g/kg)、低(0.058g/kg)3个剂量和续断总皂苷样品4高(2.2g/kg)、中(1.1g/kg)、低(0.55g/kg)3个剂量；续断总皂苷样品5高(0.4g/kg)、中(0.2g/kg)、低(0.1g/kg)3个剂量；续断总皂苷样品6高(0.23g/kg)、中(0.115g/kg)、低(0.058g/kg)3个剂量。动物同时灌胃维甲酸及药物2周后，停服维甲酸，继续给药2周，于停药后第二天将大鼠处死，解剖双侧股骨，左侧股骨用于测定骨重系数、骨矿密度、骨灰含量和骨钙、骨磷，右侧股骨用于作病理组织学检测。各项指标测定方法同4，结果见表13-16。

表13木通总皂苷和续断总皂苷对骨质疏松大鼠骨重系数和骨灰含量的影响(X±S)(n＝10)

组别

剂量(g/kg)

骨重系数(g/100g体重)

骨灰含量(g/g骨重)

正常对照	-	0.346±0.037	0.276±0.012
				模型对照	-	0.272±0.018△△△	0.207±0.013△△△
依膦	0.04	0.336±0.026***	0.257±0.018***
				木通总皂苷样品1	2.2	0.343±0.015***	0.258±0.019***
1.1	0.335±0.031***	0.253±0.027***
			0.55		0.329±0.019***	0.243±0.030***
木通总皂苷样品2	0.4	0.342±0.025***					0.259±0.022***
			0.2	0.334±0.013***	0.252±0.018***
	0.1	0.329±0.021***				0.244±0.017***
			木通总皂苷样品3	0.232	0.346±0.037***		0.260±0.015***
0.116	0.336±0.031***	0.253±0.033***
				0.058	0.330±0.026***	0.244±0.011***
续断总皂苷样品4	2.2	0.341±0.022***					0.253±0.028***
			1.1	0.332±0.041***	0.254±0.017***
	0.55	0.327±0.021***				0.245±0.047***
			续断总皂苷样品5	0.4	0.347±0.013***		0.260±0.019***
0.2	0.339±0.045***	0.254±0.036***
				0.1	0.330±0.027***	0.242±0.052***
续断总皂苷样品6	0.232	0.344±0.071***					0.261±0.045***
			0.116	0.341±0.044***	0.257±0.016***
	0.058	0.336±0.021***				0.249±0.038***

^△△△P＜0.01，与正常对照组比较，^***P＜0.01，与模型对照组比较

表14木通总皂苷和续断总皂苷对骨质疏松大鼠股骨密度的影响(X±S)(n＝10)

组别	剂量(g/kg)	骨矿密度(g/cm2)
						#1	#2	#3	#4
		正常对照	-	0.062±0.014	0.064±0.012					0.099±0.039	0.124±0.017
模型对照	-					0.031±0.012△△△	0.028±0.017△△△	0.046±0.027△△△	0.017±0.027△△△
		依膦	0.04	0.057±0.010***	0.055±0.017***					0.078±0.024**	0.114±0.024***
	2.2					0.061±0.015***	0.061±0.019***	0.085±0.037***	0.115±0.039***

木通总皂苷样品1	2.2	0.061±0.015***	0.061±0.019***	0.085±0.037***	0.115±0.039***
						0.55	0.069±0.029***	0,069±0.022***	0.085±0.025***	0.109±0.026***
	木通总皂苷样品2	0.4	0.062±0.025***	0.061±0.021***	0.087±0.028***						0.116±0.036***
0.2						0.062±0.024***	0.060±0.020***	0.080±0.012***	0.113±0.007***
		0.1	0.060±0.023***	0.053±0.020***	0.078±0.018***					0.106±0.028***
木通总皂苷样品3						0.232	0.063±0.017***	0.062±0.029***	0.08±0.036***		0.118±0.014***
	0.116	0.063±0.031***	0.061±0.030***	0.088±0.018***	0.115±0.025***
						0.058	0.061±0.026***	0.060±0.011***	0.083±0.034***	0.110±0.017***
	续断总皂苷样品4	2.2	0.059±0.023***	0.060±0.034***	0.086±0.029***						0.109±0.0179***
1.1						0.058±0.037***	0.059±0.044***	0.083±0.025***	0.110±0.051***
		0.55	0.057±0.032***	0.058±0.071***	0.080±0.041***					0.106±0.076***
续断总皂苷样品5						0.4	0.061±0.035***	0.060±0.028***	0.088±0.032***		0.117±0.028***
	0.2	0.060±0.011***	0.058±0.033***	0.083±0.041***	0.114±0.030***
						0.1	0.058±0.039***	0.055±0.024u	0.075±0.025***	0.101±0.020***
	续断总皂苷样品6	0.232	0.064±0.070***	0.063±0.044***	0.087±0.046***						0.117±0.023***
0.116						0.062±0.013***	0.062±0.022***	0.085±0.073***	0.116±0.018***
		0.058	0.060±0.025***	0.060±0.043***	0.081±0.051***					0.112±0.065***

^**P＜0.05，^***P＜0.01  与模型对照组比较；^△△△P＜0.01，与正常对照组比较

#注；1-股骨头部；2-大转子部；3-股骨颈部；4-转子间部

表15木通总皂苷和续断总皂苷对骨质疏松大鼠骨钙、骨磷的影响(X±S)(n＝10)

组别	剂量(g/kg)	骨钙(mg/g骨重)	骨磷(mg/g骨重)
				正常对照	-	94.0±4.5	2.54±0.13
模型对照	-	62.2±6.6△△△	2.16±0.16△△△
				依膦	0.04	82.6±7.3***	2.42±0.09***
木通总皂苷样品1	2.2	85.7±6.5***	2.43±0.12***
				1.1	75.9±4.9***	2.38±0.08***
	0.55	68.8±5.6***	2.37±0.12***
				木通总皂苷样品2	0.4	86.4±7.3***	2.44±0.10***
0.2	76.0±4.3***	2.38±0.11***
			0.1		67.0±5.3***	2.36±0.09***
木通总皂苷样品3	0.232	87.7±6.1***					2.46±0.07***
			0.116	77.4±4.8***	2.40±0.10***
	0.058	67.4±3.7***				2.37±0.09***
			续断总皂苷样品4	2.2	86.2±7.1***		2.47±0.34***
1.1	77.1±5.4***	2.41±0.29***
				0.55	69.4±6.1***	2.40±0.38***

续断总皂苷样品5	0.4	87.1±3.7***	2.48±0.36***
				0.2	77.9±2.4***	2.42±0.53***
	0.1	68.3±4.4***	2.40±0.35***
				续断总皂苷样品6	0.232	88.5±6.0***	2.51±0.18***
0.116	80.1±7.6***	2.46±0.24***
			0.058		73.5±2.1***	2.42±0.38**

^△△△P＜0.01，与正常对照组比较，^***P＜0.01，与模型对照组比较

表16木通总皂苷和续断总皂苷对骨质疏松大鼠股骨头的骨小梁宽度的影响(X±S)(n＝10)

组别	剂量(g/kg)	骨小梁宽度(mm)
			正常对照	-	0.018±0.005
模型对照	-	0.009±0.003△△△
			依膦	0.04	0.024±0.003***△△△
木通总皂苷样品1	2.2	0.023±0.006***△△△
			1.1	0.016±0.003***
	0.55	0.014±0.008**
			木通总皂苷样品2	0.4	0.025±0.007***△△△
0.2	0.016±0.005***
		0.1		0.015±0.004***
木通总皂苷样品3	0.232				0.025±0.005***△△△
		0.116	0.019±0.007***
	0.058			0.015±0.002***
		续断总皂苷样品4	2.2		0.021±0.009***△△△
1.1	0.015±0.004***
			0.55	0.014±0.007**
续断总皂苷样品5	0.4				0.024±0.004***△△△
		0.2	0.020±0.007***
	0.1			0.017±0.005***
		续断总皂苷样品6	0.232		0.020±0.006***
0.116	0.018±0.004***
			0.058	0.016±0.003***

^***P＜0.05，^***P＜0.01与模型对照组比较，^△△△P＜0.01，与正常对照组比较

由表13-16可见，木通总皂苷样品1(含木通皂苷D5％)，木通总皂苷样品2(含木通皂苷D55％)，木通总皂苷样品3(含木通皂苷D95％)的高、中、低剂量组，续断总皂苷样品4(含木通皂苷D5％)，续断总皂苷样品5(含木通皂苷D55％)，续断总皂苷样品6(含木通皂苷D95％)的高、中、低剂量组及依膦组可使骨质疏松大鼠的骨重系数、骨灰含量、骨矿密度、骨小梁宽度、骨磷含量显著增加(P＜0.01，P＜0.05)，本品高、中、低剂量组及依膦组可使骨钙含量显著升高(P＜0.01)。各给药组均能使股骨内骨细胞及破坏细胞增生活跃。木通总皂苷(含5～95％木通皂苷D)对家兔双侧桡骨骨折有较强的促愈合作用，并可明显减轻维甲酸所致大鼠骨质疏松的病变程度。

6、木通皂苷D单体(从川续断中提得)对体外骨细胞生长的影响实验

表17、药物对成骨细胞分化和增殖的影响作用结果

组别	分子量	溶剂(ml)	药物原浓度(mol/L)	药物最终浓度(mol/L)	OD405nm(MTT结果)
						木通皂苷D	952	甲醇0.03MEM 0.5	2.526*10-3	2.52*10-52.52*10-62.52*10-7	0.943±0.070***0.952±0.067***0.910±0.224*
己烯雌酚	268.36	乙醇0.5	3.632*10-3	3.632*10-63.632*10-73.632*10-8	0.824±13333*0.981±0.164**0.819±0.070**
						依膦	249.99	H2O 0.5	3.064*10-2	3.064*10-53.064*10-63.064*10-7	1.008±0.104***0.945±0.239*0.969±0.176**
乙醇		-	1％	-	0.767±0.105
						培养基		-	-	-	0.756±0.050

^***P＜0.001，^**P＜0.01，^*P＜0.05 vs 对照

木通皂苷D单体(从川续断中提得)对体外骨细胞生长的具有显著的促进作用。

木通总皂苷(含5～95％木通皂苷D)和续断总皂苷(含5～95％木通皂苷D)的药效实验我们分为6个给药组进行，分别称为样品1、样品2、样品3、样品4、样品5、样品6。

各样品中的木通皂苷D含量：样品1和样品4、样品2和样品5、样品3和样品6中的木通皂苷D含量分别5％、55％、95％。

各样品不同动物的给药剂量：

家兔的给药剂量分别为：样品1和样品4高(2.2g/kg)、低(1.1g/kg)2个剂量；样品2和样品5高(0.2g/kg)、低(0.1g/kg)2个剂量；样品3和样品6高(0.116g/kg)、低(0.058g/kg)2个剂量；

大鼠的给药剂量为：样品1和样品4高(4.4g/kg)、中(2.2g/kg)、低(1.1g/kg)3个剂量；样品2和样品5高(0.4g/kg)、中(0.2g/kg)、低(0.1g/kg)3个剂量；样品3和样品6高(0.23g/kg)、中(0.115g/kg)、低(0.058g/kg)3个剂量；

小鼠的给药剂量为：样品1和样品4高(4.4g/kg)、低(2.2g/kg)2个剂量；样品2和样品5高(0.8g/kg)、低(0.4g/kg)2个剂量；样品3和样品6高(0.46g/kg)、低(0.23g/kg)2个剂量。

各给药组的计量按样品中木通皂苷D的含量计算后表示如下：家兔的给药剂量：样品1和样品4高(0.11g/kg)、低(0.055g/kg)2个剂量；样品2和样品5高(0.11g/kg)、低(0.055g/kg)2个剂量；样品3和样品6高(0.1102g/kg)、低(0.0551g/kg)2个剂量。

大鼠的给药剂量：样品1和样品4高(0.22g/kg)、中(0.11g/kg)、低(0.055g/kg)3个剂量；样品2和样品5高(0.22g/kg)、中(0.11g/kg)、低(0.055g/kg)3个剂量；样品3和样品6高(0.2185g/kg)、(0.1093g/kg)、低(0.0551g/kg)3个剂量。

小鼠的给药剂量：样品1和样品4高(0.22g/kg)、低(0.11g/kg)2个剂量；样品2和样品5高(0.44g/kg)、低(0.22g/kg)2个剂量；样品3和样品6高(0.437g/kg)、低(0.2185g/kg)2个剂量。

上述实验结果(5种实验模型，16项实验检测指标)显示：不同木通总皂苷样品和不同续断总皂苷样品(含木通皂苷D的百分量不同)药效实验结果与总皂苷量没有相关性，而与总皂苷样品中的木通皂苷D的含量具有量效相关性。木通皂苷D单体(从川续断中提得)对体外骨细胞生长的具有显著的促进作用。药效与木通皂苷D的含量具有量效相关性这一实验结果显示：治疗骨折和骨质疏松症的活性成分是木通皂苷D。

Claims (7)

1、木通皂苷D及含木通皂苷D≥5％的木通总皂苷在制备防治骨质疏松和/或促进骨损伤愈合药物中的用途。

2、权利要求1所述药物中的用途，其特征在于：木通总皂苷含木通皂苷D5-95％。

3、权利要求1所述药物中的用途，其特征在于：所述骨损伤包括骨折、骨裂。

4、权利要求1所述药物中的用途，其特征在于：所述药物为含治疗有效量的木通皂苷D和药学上可接受组分和/或载体。

5、权利要求1所述药物中的用途，其特征在于：所述药物为含治疗有效量的含木通皂苷D的木通总皂苷和药学上可接受组分和/或载体。

6、权利要求4或5所述药物中的用途，其特征在于：药学上可接受组分为可与木通皂苷D或含木通皂苷D的木通总皂苷联合防治骨病的化合物或组合物。

7、权利要求4或5所述药物中的用途，其特征在于：所述药物为含木通皂苷D或含木通皂苷D的木通总皂苷，和药学上可接受组分和/或载体的口服制剂、胃肠外给药制剂或外用制剂。