CN1207395A

CN1207395A - 抗-fas抗体

Info

Publication number: CN1207395A
Application number: CN98108265A
Authority: CN
Inventors: 芹泽伸记; 大昌彦; 市川公久; 春山英幸; 大隅润; 高桥亘; 好田宏子; 白石明郎; 米原伸
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1997-04-01
Filing date: 1998-04-01
Publication date: 1999-02-10
Also published as: CZ294340B6; AR010139A1; AU5970198A; CA2233783A1; RU2212412C2; PL325667A1; AU734758B2; CZ98598A3; HUP9800744A2; EP0909816A1; TR199800604A3; KR19980080993A; TW526205B; HUP9800744A3; IL123888A0; NO981454D0; ID20117A; NO981454L; NZ330095A; TR199800604A2

Abstract

本发明公开了能与小鼠和人Fas交叉反应的抗－人Fas抗体,所述抗体可用于治疗因Fas/Fas配体系统异常引起的疾病。

Description

抗-FAS抗体

本发明涉及识别Fas抗原的抗体及其片段，尤其涉及识别Fas抗原的人源化抗体，本发明还涉及编码这种抗体的全部或部分的DNA，并涉及含有这种抗体的药剂，所述药剂可预防和/或治疗因Fas/Fas配体系统异常引起的疾病。

已知按照事情的自然发展活生物体中细胞的生理学死亡为细胞程序死亡，它与细胞的病理学死亡，即坏死有所不同[Kerr等人，(1972)，Br.J.Cancer，26，239以及下列等等]。细胞程序死亡是一例编程性细胞死亡，即按照事情的自然发展活生物体中某些细胞在某些地方预先已被编程死亡，如当有问题的细胞已行使完预定的功能时即编程性死亡。其它细胞中的细胞程序死亡的特征在于成曲线的细胞表面，凝聚的核染色质和染色体DNA的片段化这种形态学变化。

细胞程序死亡通过消除识别自身抗原的细胞在淋巴细胞(T细胞和B细胞)的分化中起作用。在此方面，已阐明在T淋巴细胞的成熟过程中胸腺消除了95％，或甚至更多的如与自身抗原反应的那些细胞的细胞[Shigekazu Nagata，Tanpakushitsu Kakusan Koso，(1993)，38，2208-2218]。当这些细胞不能被细胞程序死亡消除时，那么据信这是由于系统中成熟的，自身-反应的淋巴细胞的存在而引起的自身免疫病[Nakayama等人，(1995)，Mebio，12(10)，79-86]。

已鉴定出多种涉及细胞程序死亡的分子，包括：Fas[Yonehara，S等人，(1989)，实验医学杂志，169，1747-1756]；肿瘤坏死因子受体[Loetscher，H等人，(1990)，细胞，61，351-359]；CD40[Tsubata，T等人，(1993)，自然，364，645-648]；和穿孔素/粒酶A[Jenne，D.E等人，(1988)，Immunol.Rev.103，53-71]。

Fas是存在于细胞表面的跨膜蛋白，其胞外域与其它细胞表面表达的一般已知为“Fas配体”的蛋白质结合能诱导表达Fas之细胞的细胞程序死亡。Fas/Fas配体系统的异常由于不能消除对稳态可能有害的细胞而会导致多种障碍，通过细胞程序死亡，或者也可以通过在没有被安排消除的细胞中诱导细胞程序死亡应该已将所述有害细胞消除，这样做可能对维持稳态是必要的。这种障碍在本文指的是那些因Fas/Fas配体系统的异常造成的疾病。

在因Fas/Fas配体异常造成的疾病的发展或进程中，通常的情况是表达Fas但不被消除的异常细胞或者进攻正常的组织或细胞，或者异常地增殖从而在组织或细胞中导致障碍，所述障碍依次导致各个疾病症状。在有些情况中，在异常细胞上表达Fas，从而在正常组织或细胞中刺激细胞程序死亡可引起或加重这些障碍。

因Fas/Fas配体系统的异常造成的疾病的特殊例子如下所述：自身免疫病

多种人自身免疫病(Hashimoto病，全身性红斑狼疮，Sj_gren综合征，恶性贫血，阿狄森病，赖胰岛素糖尿病，硬皮病，Goodpasture氏综合征，Crohn氏病，自身免疫溶血性贫血，不孕症，重症肌无力，多发性硬化，Basedow氏病，血小板减少性紫癜，类风湿性关节炎)和Fas/Fas配体系统异常之间的联系已经被报道多次。

已知小鼠Fas/Fas配体系统的多种基因异常，包括lpr(淋巴细胞增生)，gld(延及全身的淋巴细胞增生病)和lpr^cg(其中lpr基因和gld基因互补)突变。具有这种基因异常的小鼠都表现出多种自身免疫症状，并伴随着特征性的全身淋巴结肿大。

人自发性全身性红斑狼疮的小鼠模型MRL-lpr/lpr小鼠显示出淋巴结群的明显增加，并产生了自身抗体，所述抗体由于能形成免疫复合物而导致肾炎。据推测此小鼠之所以表现出这种病理学是由于Fas基因突变，导致了因Fas不能在周围系统中诱导细胞程序死亡，以及活化的自身反应性T细胞的长期积累而造成的对自身抗原缺乏免疫学耐受[Strasser，A.，自然，373，385(1995)]。

对于人而言，已报道了几个病例，包括两个涉及淋巴结肿大，γ血球蛋白过多和CD4^-CD8^-T细胞显著增加的儿科病例[Sneller，MC等人，(1992)，J.Clin.Invest.，90，334]。据报道这些病例是以Fas基因异常为基础的[Fisher，G.H等人，(1995)，细胞，81，935；和Rieux-Laucat，F等人，(1995)，科学，268，1347]，它们被称为自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)。根据这些发现，可以认为由Fas介导的诱导细胞程序死亡的系统在很大程度上涉及小鼠和人的自身耐受的建立和维持，此系统的障碍诱导多种自身免疫疾病。

另外还已知类风湿性关节炎具有自身免疫因子，依据的事实是绝大多数T细胞侵入类风湿性关节炎患者的感染区，并导致组织破坏Fas的表达[Hoa，T.T.M等人，(1996)，J.Rheumatol.，23，1332-1337]。

很多赖胰岛素糖尿病的病例是由于胰腺β细胞被自身反应性T细胞破坏而使胰岛素的分泌受到致命性的缩减造成的。因此，在彻底治疗某些形式的赖胰岛素糖尿病时，消除自身反应性T细胞是至关重要的。

在如骨髓移植后出现的移植物抗宿主疾病中，感染器官中Fas的表达有所增加，Fas表达增加的水平和靶器官的损害之间有直接的联系[Chu，J.L等人，(1995)，实验医学杂志，181，393]。因此，预防或治疗这种疾病的目的在于封闭靶器官细胞中的细胞程序死亡，并减少进攻靶器官的细胞数目。变应性疾病

涉及变应性疾病的炎性细胞正常地被激活并侵入损害部位。炎性细胞局部积累于损害部位，由于它们的寿命因细胞程序死亡受抑制而得以延长，因此它们能持续地长期行使功能。在可诱导呼吸道嗜酸性炎症的小鼠实验模型中，已阐明通过呼吸道施用具有诱导-细胞程序死亡之活性的抗-Fas抗体，可导致吸入变应原后在粘膜下正常可见的嗜酸性细胞侵害的消失[Tsuyuki，S等人，(1995)，J.Clin.Invest.，96，2924]。因此，通过在炎性细胞中诱导细胞程序死亡可以减轻变应性炎症的症状。类风湿性关节炎

除了类风湿性关节炎的上述自身免疫方面外，已知损害部位的异常增殖的滑膜细胞可表达Fas[Hoa，T.T.M等人，(1996)，J.Rheumatol.，23，1332]。通过用具有诱导-细胞程序死亡之活性的抗-Fas抗体刺激得自这种损害部位的滑膜细胞可诱导细胞程序死亡[Nakajima，T等人，(1995)，Arthr.Rheum.，38，485]。换句话说，Fas/Fas配体系统在类风湿性关节炎患者的病灶处不能适当地行使功能，尽管自身反应性T细胞和异常增殖的滑膜细胞都表达Fas，但它们都未被消灭。动脉硬化

尽管动脉硬化损害中心的细胞死亡最终被诊断为坏死，但已报道了细胞程序死亡涉及演化和退化的过程[Kenji Harada(1997)，Gendai Iryou，29，109]。动脉硬化的电镜术显示出光滑肌细胞的细胞程序死亡，其特征在于核凝聚[Isner，J.M等人，(1995)，Circulation，91，2703]。另外，已报道了泡沫(foam)细胞可表达Fas，并由于自然产生的可诱导细胞程序死亡的抗-Fas抗体而导致遭受细胞程序死亡，所述泡沫细胞是集中于动脉内层，并掺入早期动脉硬化损害的脂质中的巨噬细胞[Richardson，B.C等人，(1994)，欧洲免疫学杂志，24，2640]。动脉硬化损害常常与淋巴细胞浸润相关，这暗示了如下的可能性，即T细胞的Fas配体以及巨噬细胞的Fas配体负责控制动脉硬化[Kenji Harada(1997)，Gendai Iryou，29，109]。心肌炎和心肌病

Fas/Fas配体系统可能涉及自身免疫性心脏病的发病机制，所述心脏病如局部缺血性心脏病，病毒性心脏病，扩张性心肌病和慢性心肌病。心肌炎是心脏肌肉的炎症，据认为主要是由如柯萨奇病毒等的病毒引起的，其特征在于类似感冒的症状之后的胸疼，心律不齐，心力衰竭或休克。尽管心肌病的病因也被认为可能是病毒感染的结果，但心肌病仍被定义为“不明原因的心脏肌肉疾病”。在患有心力衰竭的小鼠心肌炎模型的研究中，接种病毒后在小鼠心脏中观察到编程性死亡的细胞(由核的凝聚和/或片段化证实)。在小鼠心脏中也观察到Fas表达的增加，由此可推测这种状况是得自浸润炎性细胞(主要为淋巴细胞)的Fas配体诱导的细胞程序死亡的结果[Takehiko Yamada等人，GendaiIryou，(1997)，29，119]。已知在经培养的大鼠心肌细胞中诱导了细胞程序死亡，所述细胞局部缺血，并同时伴有细胞中编码Fas的mRNA增加[Tanaka M等人，(1994)，Circ.Res.75，426]。肾病

在很多慢性肾病中，肾小球内组织的重建导致了肾小球内细胞外物质的积累，从而促使肾小球的硬化，导致过滤功能的病理学损失，并最终导致慢性肾衰竭。在进行性的肾小球硬化症模型中，观察到在电镜术水平下显示出典型的编程性死亡征象的硬化区域，以及肾小球中细胞程序死亡的增加，这与与硬化进程相关的肾小球细胞数目的降低一致[SugiyamaH等人，(1996)，Kidney Int.，49，103]。在急性肾小球肾炎中，已知通过编程性减少异常增殖的肾小球膜细胞的数目可以缓解此病[ShimizuA等人，(1995)，Kidney Int.，47，114和Baker A.J等人，(1994)，J.Clin. Invest，94，2105]。已报道在如紫癜样肾炎和狼疮样肾炎等的疾病中，肾小球中表达Fas的细胞显著减少[Takemura T等人，(1995)，Kidney Int.，48，1886]。再生不良性贫血

在再生不良性贫血患者的造血前体细胞表面，Fas表达比正常个体中的有显著提高，这暗示着Fas与这些患者的造血干细胞的减少有关[Maciejewski，J.P等人，(1995)，Br.J.Haematol.，91，245]。肝炎

已知暴发性肝炎中很多肝细胞中都诱导了细胞程序死亡。通过给小鼠腹膜内施用抗-Fas抗体Jo2观察到大面积的肝细胞死亡，这与在暴发性肝炎中观察到的相似。因此，可以认为暴发性肝炎的发病机制涉及由Fas诱导的肝细胞的细胞程序死亡[Kamogawa，Y等人，(1996)，Molecular Medicine，33，1284；和Ogasawara，J等人，(1993)，自然，364，806]。在免疫组化研究中，在显示出高水平肝细胞坏死的区域的肝细胞细胞质中观察到增强的Fas表达，所述区域如慢性肝炎的损害内和如脂肪肝的肝病损害的肝细胞的细胞膜上[Hiramatsu，N等人，(1994)，Hepatology，19，1354和Takatani，M等人，(1996)，InternationalHepatology Commun.，4，334]。

另外，慢性持续性丙型肝炎和慢性活动性肝炎的损害中表达了Fas，这两种病都显示出被浸润淋巴细胞包围的肝细胞的分散染色，所述淋巴细胞显然是细胞毒T细胞[Mita，E等人，(1994)，Biochem.Biophys.Res.Commun.，204，468]。细胞毒T细胞通过在其表面表达的Fas配体而具有在感染细胞中诱导细胞程序死亡的功能。类似地，它们可诱导位于附近的正常细胞的细胞程序死亡。这种被称为旁观者障碍的对局部的正常细胞的影响是由下述事实引起的，即体内的很多细胞在它们自身感染之后或相邻细胞感染之后都表达Fas。在施用干扰素后得自丙型肝炎病毒的RNA大幅度降低的慢性肝炎病例中，肝组织中Fas的表达显著减少。

急性肝衰竭患者的肝细胞的细胞表面Fas的量有所增加，当暴露于可诱导细胞程序死亡的抗-Fas抗体时，所述细胞遭遇细胞程序死亡。另外，在酒精性肝炎中，Fas配体在假小叶内的肝细胞自身上表达[Galle，P.R等人，(1995)，实验医学杂志，182，1223]。在涉及原位杂交的Fas配体基因表达研究中，在急性肝衰竭病例的肝浸润淋巴细胞和酒精性肝硬变病例的假小叶内的肝细胞自身(如上所述)都发现了表达。因此，可推测病毒性肝硬变和酒精性肝硬变中诱导细胞程序死亡的机制不同，但这两种病例中Fas/Fas配体系统都异常。在肝炎的小鼠模型中，已知通过施用能抑制Fas配体与Fas的结合的物质即可抑制肝障碍[Kondo，T等人，(1997)，Nature Medicine，3，409]。获得性免疫缺损综合征

被人免疫缺损病毒(HIV)感染的病人的免疫缺损至少部分是由于大量未被HIV感染的免疫细胞的编程性细胞死亡引起的。T辅助细胞与HIV接触后死亡。由于T辅助细胞产生的生长因子是抑制细胞毒T细胞的细胞程序死亡所必需的，T辅助细胞的耗尽导致细胞毒T细胞的细胞程序死亡。根据被HIV感染之患者的外周血淋巴细胞的Fas表达与疾病的病理学进程有很好的相关性这一观察结果，也可以认为所述患者的免疫细胞的细胞程序死亡是由于Fas/Fas配体系统的异常[Dhein，J等人，(1995)，Behring Inst.Mitt.，96，13和McCloskey，T.W等人，(1995)，Cytometry，22，111]。得自未被感染之个体的Fas-阳性外周血淋巴细胞不易于遭受因Fas刺激造成的细胞程序死亡，而得自被感染之患者的外周血淋巴细胞在短期内遭受Fas诱导的细胞程序死亡[Owen-Schaub，L.B等人，(1992)，细胞免疫学，140，197]。器官移植后的排斥

器官移植后的排斥与自身免疫病有某些类似性，不同之处在于被移植的器官受到供体的细胞毒T细胞的进攻。因此，如果细胞毒T细胞的功能被抑制，则症状有望被缓解。

对于上述所列疾病而言，治疗它们的有效方式是通过消除异常细胞(例如，自身免疫病中的自身反应性T细胞，动脉硬化中的泡沫细胞，急性肾小球肾炎中的肾小球膜细胞，病毒感染中的被感染细胞，类风湿性关节炎中的滑膜细胞)和/或通过对正常组织或细胞的保护作用。

问题是仅仅能够诱导Fas-介导的细胞程序死亡的试剂尽管能消除异常细胞，但很可能导致正常组织的障碍。另一方面，仅仅能够抑制Fas-介导的细胞程序死亡的试剂尽管能保护正常细胞，但不能消除异常细胞。例如，抗-小鼠Fas单克隆抗体Jo2具有诱导细胞程序死亡的活性，但能导致小鼠的暴发性肝炎[Ogasawara，J等人，(1993)，自然，364，806-809]。

迄今为止，仍不知道能用于治疗和/或预防上述任何疾病，但不会产生任何不适的副作用的抗-Fas抗体。

免疫球蛋白G(IgG)由两个轻多肽链(L链)和两个重多肽链(H链)组成，每条轻链的分子量约为23,000KD，每条重链的分子量约为50,000KD。H和L链都由保守氨基酸的重复区域组成，所述保守的氨基酸由约110个残基组成。本文将此区域称为“结构域”，此结构域构成IgG基本的三维结构单位，H和L链分别由4和2个连串的结构域组成。

当比较抗体氨基酸序列时，发现H和L链的氨基-末端结构域比其他结构域更加可变，因此，将它称之为‘可变’域(V域)。H和L链的V域通过它们的互补特性互相结合以在IgG分子的氨基-末端形成可变区，其他域结合形成恒定区。对于特定种而言，恒定区序列是特征性的，例如，小鼠IgG的恒定区与人IgG的有所不同，人免疫系统将小鼠IgG分子识别为外源蛋白质。给人受试者施用小鼠IgG分子导致产生人抗-小鼠抗体(下文称之为“HAMA”)反应[Schroff等人，(1985)，Cancer Res.，45，879-885]，因此，小鼠抗体不能被重复地施用于人。为了能有效地施用抗体，必须修饰抗体以避免诱导HAMA反应而同时能维持抗体的特异性。

X-射线晶体学分析的资料表明免疫球蛋白折叠一般形成长圆筒结构，所述结构含有两层反平行β折叠片，每层由三或四个β-链组成。在可变区内，得自H和L链每个V域的三个环聚集成簇以形成抗原-结合位点。这些环中的每一个被称为互补决定区(CDR)。CDR的氨基酸序列有最高度的可变性，可变区中不是CDR的一部分的部分被称之为“构架区”(“FR”区)，它一般对于维持CDR的结构起作用。

Kabat及其同事比较了大量H和L链可变区的一级序列，并根据序列的保守性鉴定出推断的CDR或构架区(E.A.Kabat等人，Sequences ofimmunological interest，5th edition，NIH Publication，No.91-3242)。另外，他们将构架区分成享有共同的氨基酸序列的几个亚型。他们还鉴定出小鼠和人序列之间相对应的构架区。

有关IgG分子结构特征的研究已导致制备人源化抗体的方法的发展，所述抗体如上所述不会诱发HAMA反应。

最初的建议是针对通过将小鼠抗体的可变区与来源于人的抗体的恒定区连接来制备嵌合抗体[Morrison，S.L等人，(1984)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，p6851-6855]。然而，这种嵌合抗体仍然含有很多非-人氨基酸残基，因此能导致HAMA反应，尤其是当长期使用时更是如此[Begent等人，(1990)，Br.J.Cancer，62，p487以及下列等等]。

后来建议仅将CDR区段移植到人抗体中以进一步降低导致HAMA反应的非-人氨基酸序列的数目[Jones，P.T.等人，(1986)，自然，321，522-525]。然而，一般发现仅移植CDR的一部分不足以维持免疫球蛋白抗抗原的活性。

根据X-射线晶体学的资料，Chothia及其同事[Chothia等人，(1987)，分子生物学杂志，196，901-917]测定：1)CDR具有涉及抗原结合的区域和涉及维持CDR自身结构的区域。CDR可能的三维结构可以被分成具有特征模式(规范结构)的几类；和2)不仅通过CDR序列还要通过构架区特定位置处的氨基酸的特性来测定规范结构的类。

结果，已暗示CDR-移植技术应该也包括将构架区的某些氨基酸残基移植到人抗体骨架中[Queen等人，国际专利申请号WO90/07861]。

在上文中，从中得到供移植的CDR的非-人哺乳动物的抗体在下文中被称为‘供体’分子。CDR将被移植入其中的人抗体在下文中被称为‘受体’分子。

在进行CDR-移植时，理想的CDR区结构应该是保守的，免疫球蛋白分子的活性应该能被维持。因此，下列因素可能是相关的：1)受体的亚型；和2)从供体构架区转移出的氨基酸残基的特性。

Queen等人[国际专利申请号WO90/07861]提出了决定供体FR的氨基酸残基是否与CDR序列一起被移植的方法。根据此方法，FR区的氨基酸残基与CDR序列一起被移植到受体上的条件是残基至少符合下列规则中的一项：1)受体的人构架区中的氨基酸很少被发现于受体的那个位置，而供体中的相应氨基酸被普遍发现于受体的那个位置2)氨基酸的位置靠近一个CDR；和3)通过免疫球蛋白的三维模型判断，在CDR的约3埃内，氨基酸具有侧链原子，并潜在地能与抗原或人源化抗体的CDR相互作用。

然而，没有人已成功地得到具有能诱导细胞程序死亡之活性的人源化的，抗-Fas的IgG型抗体。

本发明的目的是提供能在人的与Fas相关之疾病的动物模型中评价的抗-Fas抗体或类似分子。

本发明的另一个目的是提供可用于治疗和/或预防因Fas/Fas配体系统异常造成的疾病的人源化抗-Fas抗体或类似分子。

因此，第一方面本发明提供了具有针对Fas表位的结合区的分子，所述表位在灵长类动物和非-灵长类动物之间是保守的。

第二方面本发明提供了具有针对哺乳动物共有的Fas表位的结合区的分子。

本发明进一步提供了由保藏号为FERM BP-5828的杂交瘤HFE7A产生的抗体，以及具有至少6个针对人Fas的抗体的CDR的分子，其中的CDR与由保藏号为FERM BP-5828的杂交瘤HFE7A产生的抗体的CDR具有同一性。

在下文中本发明的其他主题，目的，方面和实施方案将是显而易见的。

图1图解表示了phFas-AIC2的构建。

图2图解表示了pME-H和pME-L的构建。

图3显示了测定由HFE7A抗体识别之表位的ELISA结果。

图4显示了测定由HFE7A抗体识别之表位的竞争性试验的结果。

图5显示了HFE7A毒性检测的结果。

图6显示了用暴发性肝炎模型检测的结果。

图7显示了预防胶原-诱导的关节炎的检测结果。

图8是产生VHH-DNA的第一步PCR的简图。

图9是产生VHH-DNA的第二步PCR的简图。

图10是产生VHH-DNA的第三步PCR的简图。

图11是携有VHH-DNA片段之表达质粒的构建简图。

图12是产生VHM-DNA的第一步PCR的简图。

图13是产生VHM-DNA的第二步PCR的简图。

图14是携有VHM-DNA片段之表达质粒的构建简图。

图15是产生VMM-DNA的第一步PCR的简图。

图16是产生VMM-DNA的第二步PCR的简图。

图17是产生VMM-DNA的第三步PCR的简图。

图18是携有VMM-DNA片段之表达质粒的构建简图。

图19显示了轻链测序引物结合的位置。

图20是产生VD-DNA的第一步PCR的简图。

图21是产生VD-DNA的第二步PCR的简图。

图22是产生VD-DNA的第三步PCR的简图。

图23是携有VD-DNA片段之表达质粒的构建简图。

图24是含有人IgG1的CH1区和内含子的DNA(IG5’-DNA)片段的构建简图。

图25是含有绞链区，H2区，CH3区和人IgG1的内含子的基因组DNA(IG3’-DNA)片段的构建简图。

图26是表达质粒pEg7AH-H的构建简图。

图27显示了重链测序引物结合的位置。

图28图解表示了人源化抗-Fas抗体对人Fas融合蛋白的结合活性。

图29显示了HFE7A和人源化抗-Fas抗体对人Fas融合蛋白的竞争性抑制。

图30显示了人源化HFE7A对WR19L12a的细胞毒性。

图31显示了制备LPDHH-DNA的第一阶段PCR的简图。

图32显示了制备LPDHH-DNA的第二阶段PCR的简图。

图33显示了制备LPDHH-DNA的第三阶段PCR的简图。

图34是携有LPDHH-DNA片段之表达质粒的构建简图。

图35显示了制备LPDHM-DNA的第一阶段PCR的简图。

图36显示了制备LPDHM-DNA的第二阶段PCR的简图。

图37显示了制备LPDHM-DNA的第三阶段PCR的简图。

图38是携有LPDHM-DNA片段之表达质粒的构建简图。

图39显示了制备HPD1.2-DNA的第一阶段PCR的简图。

图40显示了制备HPD1.2-DNA的第二阶段PCR的简图。

图41是携有HPD1.2-DNA片段之表达质粒的构建简图。

图42显示了pEgPDHV3-21测序引物结合的位置。

图43显示了人源化轻链高水平的表达载体的构建。

图44显示了人源化重链高水平的表达载体的构建。

图45显示了人Fas融合蛋白对实施例12的上清液的结合活性。

图46显示了实施例12的上清液对HFE7A抗体的竞争性抑制的结果。

图47显示了通过培养实施例12的上清液诱导T细胞的细胞程序死亡的结果。

本发明的HFE7A抗体令人惊奇的优点是不仅能在表达Fas的异常细胞中诱导细胞程序死亡，还能抑制正常细胞中的细胞程序死亡。这一优点一般能延伸到本发明的人源化抗-Fas抗体。

已知的能结合人Fas并具有诱导细胞程序死亡之活性的单克隆抗体不能结合小鼠的Fas。能与小鼠Fas结合的单克隆抗体是已知的，但它们中没有一个能与人Fas结合。因此，在疾病的小鼠模型中不能评价已知的抗-Fas抗体。与之形成对照的是在疾病的小鼠模型中能评价HFE7A抗体，从而大体上既提供了确证药效的方法，又建立了研究Fas的作用的模型。

据信本发明的抗体的优点是由它们识别Fas抗原上保守表位的能力产生的。Fas是共有的分子，但在种与种之间有所不同。不必受理论的束缚，可相信Fas的至少一个保守区是所有哺乳动物共有的，并且是Fas诱导细胞程序死亡之功能所必需的。本发明的分子识别保守的Fas表位，在此方面，例如当比较鼠和人Fas时，只要分子的表位结合区能识别这两者，两个分子中有问题的表位不必必需绝对相同。然而，一般来说，表位会完全相同。

针对Fas的很多抗体是已知的，包括那些能诱导细胞程序死亡的抗体，但以前没有得到一个能与任何种类的共有序列结合的抗体。本发明的抗体与之相反能与共有序列结合。因此，作为此理论的延伸，本发明的抗体不是仅仅通过与Fas一般性地结合起到使之失去功能或干扰的作用，这样做可能有危险的和不可预测的效果，如Jo2在小鼠中能引起暴发性肝炎(出处同上)，本发明的抗体实际上在Fas的活性位点起作用，从而模仿天然的配体，而不是仅仅非特异性地结合Fas抗原。

如果用人Fas免疫正常的实验室小鼠，如BALB/c小鼠，那么在消除自身反应性抗体的平常过程中，能产生既能与人Fas结合又能与小鼠Fas结合之抗体的细胞将在胸腺中被消除。因此，为了得到针对人和小鼠之间保守的表位，从而既能与人Fas结合又能与小鼠Fas结合的小鼠单克隆抗体，必须使用其中这种消除已经部分或完全失去作用的小鼠。

已经推测出Fas/Fas配体系统涉及胸腺中自身反应性细胞的消除过程[ShinYonehara(1994)Nikkei Science Bessatsu，110，66-77]。因此，通过免疫Fas/Fas配体系统具有突变的小鼠(这种小鼠在下文中被称之为“Fas失效小鼠”或“Fas/Fas配体缺陷小鼠”)，例如，不能表达编码Fas之基因的小鼠，即可得到能结合小鼠Fas和人Fas的抗体。

因此，进一步提供了得到本发明的抗体或分子的方法，包括给非人动物施用免疫原有效量的物质，然后从动物中选择抗体，所述动物中自身反应性T细胞的编程性消除至少部分有缺陷，所述物质含有异源Fas的免疫原性表位。

携有Fas表位的物质可以是Fas自身，或者也可以是另一个适当的物质，如融合蛋白。

适当抗体的选择是本领域技术人员熟知的，在下文中将举例说明。具体地说，优选使用用本发明的方法免疫的小鼠以得到至少一个单克隆抗体，使用本领域技术人员熟知的方法可容易地得到所述抗体。

应懂得为了简化操作，优选非人动物是小鼠，也可以使用如兔等的其它啮齿类动物和一般情况下如山羊和猕猴等的其它哺乳动物，尽管这种系统的特征鉴定没有小鼠完备。优选用于施用的Fas是人Fas，尽管如有必要，本发明的抗体也可以为利于其它哺乳动物而得到。然而，一般可以想象由于享有共同的表位，本发明的抗体可以通用。

使用上述方法制备杂交瘤，所述杂交瘤能产生新的抗-Fas单克隆抗体，该抗体能与人Fas和小鼠Fas结合。用人Fas免疫Fas失效小鼠，然后将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，再从培养物上清液中纯化单克隆抗体。

已证实如此回收的新的抗-Fas单克隆抗体可有效缓解自身免疫病小鼠模型的严重症状，而且，已阐明这种抗-Fas单克隆抗体不会诱导以前一直是难题的肝障碍。

为了得到CDR的氨基酸序列，还克隆和测序了新抗体两条链的各个基因。为了产生重组的抗-Fas抗体，构建了含有重链和轻链各个基因的表达载体。经阐明得自用这些载体共-转染的动物细胞的培养物上清液中的这种重组抗体能与Fas反应。

由此得到的抗-Fas抗体，及其重组抗体克隆能保护肝免受Fas-诱导的暴发性肝炎，也可以有效地预防和治疗类风湿性关节炎。

因此，现在已阐明可以容易地提供这样一种抗体，所述抗体能通过Fas在异常细胞中诱导细胞程序死亡，又能在正常细胞中抑制Fas诱导的细胞程序死亡，因此可以有效地防止，治疗和/或预防因Fas/Fas配体系统异常引起的疾病。

得自小鼠的抗-Fas单克隆抗体的CDR氨基酸序列被移植到人抗体中，成功地得到了对人受试者没有免疫原性，但仍然具有Fas-结合活性的重组抗体。

本发明可以构建诱导HAMA反应的风险最小，同时仍具有有效的抗体效应物功能的人源化抗体。

本文所用的与抗体有关的术语“人”和“人源化”涉及希望在人受试者中引发很少的，或不引发免疫原性反应的任何抗体，有问题的受试者是个体或群。

一般情况下，应懂得为了保持Fas表位的结合区，或本文中通常所指的表位结合区，优选将给定抗体的所有CDR移植到受体抗体中。然而，本发明也预计到在少数情况下，少于总量的CDR被移植到供体内是合适的或合乎需要的。也应理解移植一般必需用一个氨基酸或区域对另一个氨基酸或区域进行残基对残基的取代。然而，少数情况下，尤其是区域转移时，如有必要可以加入或删除一个或多个残基，这种删除和插入以及适当的取代和倒位是本领域技术人员熟知的。

本发明的表位结合区是对应于抗体的表位结合位点的分子区域。表位结合区不需要直接得自任何特殊的抗体，或抗体对，可以不与任何特殊的表位结合区类似。仅有的要求是表位结合区类似于抗体的识别位点，在此范围内它能结合抗原，本发明中所述抗原为Fas表位。尽管使用已知抗体的CDR可以设计表位结合区，但如果接着将它们移植到人抗体中，所得表位结合区可以不必类似于已知抗体的表位结合区，尽管从维持结合特异性的角度出发，需要有很大程度的相似性。

特别地优选得自非人抗体的所有CDR被移植到人抗体中，另外，还优选将构架区的某些区域掺入受体抗体(本文中也称为人抗体)中以维持非人结合位点的三维结构。构架区的这种区域典型地含有按照下文中的指示，因其重要性而被选择的单个氨基酸残基(有效残基)。具体地说，对于人而言是罕见的，但却是相关的非人抗体所共用的那些残基，和很有可能与表位或识别位点直接相互作用的那些残基优选与CDR一起被移植。

当将CDR移植到人抗体中时，正常的情况是非人的CDR整个取代了相关的人CDR，尤其在两者长度相同之处更是如此。然而，也存在这种情况，即仅有部分人CDR被取代，或仅有部分非人CDR被移植，这两者是并进的。

应懂得一般应该使用非人抗体的CDR取代人抗体的相应CDR。在使用仅具有CDR插入的位置，否则的话实际上具有CDR的人轻链或重链骨架的情况下，也要作类似的考虑。

也应理解人重链和轻链不必必须来自相同的人抗体，甚至不必来自相同的类。重要的是选定供体的序列尽可能地与非人抗体的序列密切匹配。两条链(轻链/轻链或重链/重链)匹配的重要性在于所得抗体应该具有与原始的非人抗体尽可能密切相似的表位结合区以确保最佳的结合。因此，本发明也设想了使用不是最有可能的匹配的可能性，有一个合理的希望，即所得重组抗体会对所需要的目的有用。

尽管不是必需，但本发明的分子优选为抗体，条件是表位结合区与Fas表位结合。因此，例如分离的和稳定化的结合位点可结合到亲和纯化柱支持物上，或施用方法可包括佐剂载体分子，例如以结合本发明的表位结合区。为了简化审查的范围，本发明的分子在本文中一般被称为抗体，但除非另有说明，这种范围包含本发明的所有分子。

当本发明的分子是抗体时，应懂得任何适当的抗体类型都可以被仿效或使用，如IgG，IgA，IgE和IgM，一般优选IgG。

当在本文中讨论分子和抗体时，也应理解类似的考虑在细节上已作必要的修正，以在适当时应用于编码它们的任何核苷酸序列。

本发明的某些优选的实施方案如下所述。

优选本发明的抗体与含有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序列的肽结合。

抗体优选为IgG，更优选抗体含有的轻链多肽蛋白质各选自序列表中SEQID No.50的氨基酸序列1-218，SEQ ID No.52的氨基酸序列1-218，SEQID No.54的氨基酸序列1-218，SEQ ID No.107的氨基酸序列1-218，SEQID No.109的氨基酸序列1-218，其中重链多肽蛋白质优选含有序列表中SEQID No.89的氨基酸序列1-451或SEQ ID No.117的氨基酸序列1-451。

在优选的实施方案中，本发明的抗体具有轻链和重链，重链具有下列通式(I)：

-FRH₁-CDRH₁-FRH₂-CDRH₂-FRH₃-CDRH₃-FRH₄- (I)

其中FRH₁表示由18-30个氨基酸组成的任何氨基酸序列，CDRH₁表示序列表中SEQ ID No.2定义的序列，FRH₂表示由14个氨基酸组成的任何氨基酸序列，CDRH₂表示序列表中SEQ ID No.3定义的序列，FRH₃表示由32个氨基酸组成的任何氨基酸序列，CDRH₃表示序列表中SEQ ID No.4定义的序列，FRH₄表示由11个氨基酸组成的任何氨基酸序列，每一个氨基酸通过肽键与另一个氨基酸结合，轻链具有下列通式(II)：

-FRL₁-CDRL₁-FRL₂-CDRL₂-FRL₃-CDRL₃-FRL₄- (II)

其中FRL₁表示由23个氨基酸组成的任何氨基酸序列，CDRL₁表示序列表中SEQ ID No.5定义的序列，FRL₂表示由15个氨基酸组成的任何氨基酸序列，CDRL₂表示序列表中SEQ ID No.6定义的序列，FRL₃表示由32个氨基酸组成的任何氨基酸序列，CDRL₃表示序列表中SEQ ID No.7定义的序列，FRL₄表示由10个氨基酸组成的任何氨基酸序列，每一个氨基酸通过肽键与另一个氨基酸结合。

本发明还提供了编码上述任何一个轻链或重链多肽蛋白质的DNA和RNA。更优选含有序列表中SEQ ID No.49的核苷酸序列100-753的DNA，含有SEQ ID No.51的核苷酸序列100-753的DNA，含有SEQ ID No.53的核苷酸序列100-753的DNA和/或含有SEQ ID No.88的核苷酸序列84-2042的DNA。

本发明进一步提供了含有如上定义的DNA的重组DNA载体，以及被这种载体转化的宿主细胞。尽管本发明也设想了仅被一个编码需表达的所有序列的表达载体转化的宿主，但优选宿主被各编码重链和轻链的分离的载体转化，因此宿主通常含有两个载体。优选这种宿主细胞为哺乳动物的细胞。

E.coli pHSGMM6 SANK73697(FERMBP-6071)，E.coli pHSGHM17SANK73597(FERM BP-6072)，E.coli pHSGHH7 SANK73497(FERMBP-6073)，E.coli pHSHM2SANK70198和E.coli pHSHH5SANK70398(FERMBP-6272)，E.coli pgHSL7A62(FERMBP-6274)SANK73397(FERMBP-6074)和E.coli pgHPDHV3 SANK 70298(FERMBP-6273)都是本发明的优选实施方案。

本发明也提供了产生人源化的抗-Fas抗体的方法，所述方法包括培养上述宿主细胞，再从培养物中回收人源化的抗-Fas抗体。

本发明进一步提供了含有本发明的抗体作为活性成分的试剂，所述试剂可预防或治疗因Fas/Fas配体系统异常引起的疾病，尤其是上文所定义的疾病。靶疾病是自身免疫病(全身性红斑狼疮，Hashimoto病，类风湿性关节炎，移植物抗宿主病，Sj_gren综合征，恶性贫血，阿狄森病，硬皮病，Goodpasture氏综合征，Crohn氏病，自身免疫溶血性贫血，不孕症，重症肌无力，多发性硬化，Basedow氏病，血小板减少性紫癜或赖胰岛素糖尿病)。也为下列疾病设想了分离的制品：变态反应；类风湿性关节炎；动脉硬化；心肌炎或心肌病；肾小球肾炎；再生不良性贫血；肝炎(暴发性肝炎，慢性肝炎，病毒性肝炎(丙肝，乙肝，丁肝)或酒精性肝炎)；和器官移植后的排斥。

FR存在于免疫球蛋白分子的H或L链亚单位的可变区。例如，FRH₁指的是位于H链亚单位可变区中最靠近N-末端位置处的构架区，FRH₄指的是从L链亚单位可变区N-末端起的第四个构架区。类似地，CDRH₁例如指的是存在于H链亚单位可变区中最靠近N-末端位置处的CDR，CDRH₃指的是从L链亚单位可变区N-末端起的第三个CDR。在任何轻链或重链中，FR位于CDR区的侧翼。

在一个实施方案中，通过培养适当的杂交瘤，换句话说通过用人Fas免疫Fas失效的小鼠，接着将所述小鼠的脾细胞与小鼠的骨髓瘤细胞融合可以得到抗-Fas的单克隆抗体，所述单克隆抗体适于制备本发明的人源化抗-Fas抗体。

单克隆抗体的制备典型地包括下列步骤：a)纯化生物大分子以用作免疫抗原；b)制备能产生抗体的细胞，首先用抗原注射免疫适当的动物，然后给动物取血并测定抗体的滴度以决定何时除去脾脏；c)制备骨髓瘤细胞；d)将能产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合；e)选择能产生目的抗体的杂交瘤；f)制备单细胞克隆(克隆)；g)非强制性地培养杂交瘤细胞，或饲养其中已移植了杂交瘤细胞的动物以大规模地制备单克隆抗体；和h)检测如此制备的单克隆抗体的生物学活性和特异性，或检测所述单克隆抗体标记物试剂的特性。

制备抗-Fas单克隆抗体所用的一般性步骤将在下文中按照上述步骤的顺序更详细地描述。然而，应懂得下述方法仅代表制备适当抗体的一个方法，必要时也可以用其它方法，例如使用产生抗体的细胞而不是脾细胞，使用其它细胞系而不是骨髓瘤细胞系。a)抗原的制备

用编码含有人Fas胞外域和小鼠白介素-3受体[IL3R-Nishimura，Y等人，(1995)，免疫学杂志，154，4395-4403]胞外域之融合蛋白的表达载体pME18S-mFas-AIC转染猴细胞系COS-1，并收集和部分纯化表达产物，可以得到能有效用作Fas抗原的重组蛋白(下文称之为“重组人Fas”)。通过将编码人Fas和小鼠IL3R融合蛋白的DNA插入动物细胞的表达载体pME18S构建了质粒phFas-AIC2。如上文所提及，所用材料，如编码Fas的DNA，载体和宿主并不局限于那些提到过的。

从经转化的COS-1细胞的培养物上清液中收集所得的在本文中被称之为重组人Fas的人Fas和IL3R融合蛋白，通过适当的方法，如使用Resource Q柱(商品名；Pharmacia)的离子交换层析部分纯化所述融合蛋白。

得自人细胞系细胞膜的纯化的Fas作为适当的替代物也可以用作抗原。另外，由于Fas的一级结构是已知的[Itoh，N等人，(1991)，细胞，66，233-243]，也可以通过任何适当的方法化学合成含有人Fas氨基酸序列的适当部分，如序列表中SEQ ID No.1的肽，并将此肽用作抗原。b)产生抗体的细胞的制备

将步骤a)产生的免疫原与如弗氏完全，或不完全佐剂和明矾等的佐剂适当混合，并用于免疫实验动物。在本发明中适当的实验动物是Fas失效小鼠，可通过Senju等人的方法[Senju，S等人，(1996)，Intemational Immunology，8，423]生产此动物。

免疫小鼠的适当施药途径包括皮下，腹膜内，静脉内，皮内和肌内注射途径，优选皮下和腹膜内注射。

可以单剂量或，更优选以适当的间隔(优选1-5周)以几次重复剂量施药。监测被免疫小鼠的血清中抗-Fas抗体的活性，选择具有足够高抗体滴度的动物作为产生抗体之细胞的来源。选择具有高抗体滴度的动物使得随后的方法更加有效。通常从最终免疫后3-5天的动物中收获供随后融合的细胞。

检测抗体滴度的方法包括多种熟知的技术，如放射性免疫测定(RIA)，固相酶免疫测定(ELISA)，荧光抗体试验和被动血凝试验，因检测敏感性，快速性，准确性和自动化潜力的需要，优选RIA和ELISA。

可以通过例如ELISA按下述进行抗体滴度的测定。首先，将纯化或部分纯化的Fas吸附到如96-孔ELISA板的固相表面，接着用与抗原无关的蛋白质，如牛血清白蛋白(BSA)封闭未结合Fas的任何剩余表面。洗涤后，使孔表面与欲检测的抗体制品(如小鼠血清)的系列稀释样品接触，以使样品中的抗-Fas抗体能与抗原结合。将酶-标记的，抗-小鼠抗体作为第二抗体加入以结合小鼠抗体。洗涤后，加入酶底物，然后通过测定适当的变化，如因颜色显现而造成的吸光度的变化来测定抗-Fas的结合活性。c)制备骨髓瘤细胞

一般情况下，得自己建立的小鼠细胞系的细胞可用作骨髓瘤细胞的来源，适当的细胞系包括：8-氮鸟嘌呤抗性小鼠(衍生自BALB/c)骨髓瘤系，P3X63Ag8U.1(P3-U1)[Yelton，D.E等人，Current Topics in Microbiology andImmunology，81，1-7，(1978)]，P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1)[Kohler，G等人，欧洲免疫学杂志，6，511-519(1976)]，Sp2/O-Ag14(SP-2)[Shulman，M等人，自然，276，269-270(1978)]，P3X63Ag8.653(653)[Keamey，J.F等人，免疫学杂志，123，1548-1550(1979)]和P3X63Ag8(X63)[Horibata，K.和Harris，A.W.，自然，256，495-497(1975)]。将选定的细胞系系列转移到适当的培养基中，如8-氮鸟嘌呤培养基[添加有谷氨酰胺，2-巯基乙醇，庆大霉素，胎牛血清(FCS)和8-氮鸟嘌呤的RPMI-1640培养基]，Iscove改进的Dulbecco培养基(IMDM)或Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)。然后在融合前3-4天将细胞转移到如含有10％w/vFCS的ASF104培养基(Ajinomoto，K.K.)的正常培养基中，以确保在融合的那一天至少有2×10⁷个细胞可以使用。d)细胞融合

用于融合的产生抗体的细胞是浆细胞和它们的前体细胞淋巴细胞，所述细胞可取自动物任何适当的部分。典型的区域是脾脏，淋巴结，外周血或其任何适当的联合，最常使用的是脾细胞。

最后一次加强免疫注射后，从具有预定抗体滴度的小鼠体内取出存在产生抗体之细胞的组织，如脾脏以制备产生抗体的细胞。本发明使用的融合脾细胞和步骤c)制备的骨髓瘤细胞的技术使用了聚乙二醇，此试剂对细胞的毒性相对较低，而且使用它的融合过程简单易行。此技术的一个例子如下所述。

用无血清的培养基(如RPMI1640)或磷酸盐缓冲的盐水(PBS)充分洗涤脾细胞和骨髓瘤细胞，然后混合以使脾细胞对骨髓瘤细胞的数目之比大约为5∶1和10∶1，然后离心。弃去上清液之后，使沉淀的细胞碎片充分松散，边混合边逐滴加入适当量的(一般为1ml)含有50％(w/v)聚乙二醇(m.w.1,000-4,000)的无血清培养基。随后缓慢加入10ml无血清培养基，然后离心混合物。再弃上清，将沉淀的细胞碎片悬浮于适当量的HAT培养基[次黄嘌呤，氨基喋呤和胸苷(这三种化合物合在一起被称为“HAT”)以及小鼠白介素-2(IL-2)的溶液]中。然后将悬浮液分到培养板(本文中简称为“板”)的孔中，于37℃在5％v/v CO₂的存在下保温约2周，适当时，添加HAT培养基。e)选择杂交瘤

当所用骨髓瘤系抗8-氮鸟嘌呤时，即次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)有缺陷时，任何未融合的骨髓瘤细胞和任何骨髓瘤细胞-骨髓瘤细胞的融合都不能在HAT培养基中存活。另一方面，产生抗体之细胞的相互之间的融合以及产生抗体之细胞与骨髓瘤细胞的杂交瘤可以存活，前者仅具有有限的存活期。因此，在HAT中连续地保温导致仅选择合乎需要的杂交瘤。

在缺乏氨基喋呤的HAT培养基(HT培养基)中使所得的杂交瘤长成集落，然后取出培养物上清液的等分试样以通过例如ELISA测定抗-Fas抗体的滴度。当使用上述重组的人Fas融合蛋白作为ELISA抗原时，还必需消除产生的抗体能特异性结合小鼠IL3受体之胞外域的克隆。通过例如使用小鼠IL3受体或其胞外域作为抗原的ELISA可以证实这种克隆的存在与否。

尽管使用8-氮鸟嘌呤抗性细胞系举例说明了上述的选择过程，但应懂得其它细胞系和适当的选择标记物与对所用培养基的适当修饰也可以使用。f)克隆

使用类似于步骤c)中描述的方法测定抗体滴度，将显示出可产生抗-Fas特异性抗体的杂交瘤转移到另一个板上克隆。适当的克隆方法包括：有限稀释法，其中杂交瘤被稀释成板的每个孔含有1个细胞，然后培养；软琼脂法，其中在软琼脂培养基中培养过后回收集落；使用微量操作器从培养物中分离单个细胞；和“分选-一个-克隆”，其中通过细胞分选器分离单个细胞。有限稀释一般最简单和常用。

对阐明抗体滴度的每个孔重复2-4次选定的无论何种克隆方法，选择具有稳定的抗体滴度的克隆作为产生抗-Fas单克隆抗体的杂交瘤。通过类似的方法选择产生抗-小鼠Fas抗体的杂交瘤以得到产生抗-Fas单克隆抗体的细胞系。用于此目的的适当的小鼠Fas是例如由经培养的被表达载体pME18S-mFas-AIC转染的动物细胞表达的融合蛋白。此质粒具有编码含有小鼠Fas胞外区和小鼠IL3受体胞外区之融合蛋白的DNA[Nishimura，Y等人，(1995)，免疫学杂志，154，4395-4403，列入本文参考文献]。鼠Fas的其它来源包括纯化的小鼠Fas和在其表面表达小鼠Fas的细胞。

通过上述方法选择小鼠-小鼠杂交瘤HFE7A，其特异性的制备描述于所附实施例中。HFE7A是产生抗-Fas单克隆抗体的细胞系，适于作为制备本发明的人源化抗-Fas抗体的基础。根据有关微生物保藏的布达佩斯条约于1997年2月19日将之保藏于Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo GijutsuKenkyujo，保藏号为FERMBP-5828。因此，当使用小鼠-小鼠杂交瘤HFE7A制备抗体时，可从下列步骤g)开始进行制备，而省略上述的步骤a)-f)。g)培养杂交瘤以制备单克隆抗体

然后在正常培养基，而不是HT培养基中培养通过上述步骤得到的杂交瘤。通过使用大培养瓶的摇瓶培养或通过自旋培养进行大规模的培养。然后收集大规模培养物的上清液，并通过适当的方法，如本领域技术人员所熟知的凝胶过滤纯化以得到抗-Fas单克隆抗体。也可以在如BALB/c小鼠或Nu/Nu小鼠的同系小鼠的腹膜内培养杂交瘤，以得到含有大量抗-Fas单克隆抗体的腹水液。可以方便地使用商购的单克隆抗体纯化试剂盒(例如MAbTrap GII试剂盒；Pharmacia)来纯化收集到的抗体。

按上述方法制备的，已被选择出对人和小鼠Fas有特异性的单克隆抗体对人和小鼠Fas具有高特异性。h)单克隆抗体的测定

可按下述测定所得单克隆抗体的同种型和亚类。适当的鉴定方法包括Ouchterlony法，ELISA和RIA。Ouchterlony法简单，但是当单克隆抗体的浓度低时，需要浓缩所用溶液。与之形成对照的是当使用ELISA或RIA时，培养物上清液可以直接与吸附于固相上的抗原和对于多种免疫球蛋白同种型和亚类具有特异性的第二抗体反应以鉴定单克隆抗体的同种型和亚类。然而，一般而言，优选使用商购试剂盒来鉴定，如Mouse Typer试剂盒(商品名；BioRad)。

通过例如FolinLowry法，或通过以280nm下的吸光度为基础计算[1.4(OD₂₈₀)＝1mg免疫球蛋白/ml]可进行蛋白质的定量。

按下述进行单克隆抗体所识别的Fas表位的鉴定。首先，制备多种部分的Fas结构，可以合成制备部分结构，如通过寡肽合成，或在活体内通过使用适当的如E.coli的宿主，所述宿主已被掺入了编码所需片断之DNA的适当载体转化。这两种方法常常被联合使用以鉴定由表位结合区识别的表位。例如，通过本领域技术人员熟知的基因工程技术可制备长度适当缩短的，从抗原蛋白质的C-或N-端起工作的一系列多肽。通过确定哪一个片断与抗体反应可得到表位位点的大致区域。

通过合成多种对应于肽的一部分或肽突变体，或由抗体识别的肽的较小寡肽可以更准确地鉴定表位。一般使用寡肽合成来制备这些较小的片断，然后通过结合研究或通过例如在ELISA中使用重组人Fas融合蛋白的竞争性抑制研究建立表位的鉴定。可方便地使用如SPOTs试剂盒(Genosys Biotechnologies，Inc.)的商购试剂盒，和一系列基于multipin合成法的multipin肽合成试剂盒(Chiron Corp.)以得到很多种寡肽。

由产生抗-Fas单克隆抗体的杂交瘤细胞制备mRNA，通过逆转录将mRNA变成cDNA，再分离编码抗体重链和或轻链的DNA，从而分别得到编码上文制备的抗-Fas单克隆抗体之重链和轻链的DNA。然后使用此DNA来产生本发明的人源化抗-Fas抗体。

通过例如硫氰酸胍-热酚法或硫氰酸胍-盐酸胍法，但优选通过硫氰酸胍-氯化铯法进行mRNA的提取。一般通过首先制备总RNA，然后使用如寡(dT)纤维素和寡(dT)乳胶珠的poly(A)⁺RNA纯化基质从总RNA中纯化mRNA，即可从细胞中制备mRNA。或者，可使用这种基质直接从细胞裂解物中制备mRNA。制备总RNA的方法包括：碱性蔗糖密度梯度离心[Dougherty，W.G.和Hiebert，E.，(1980)，病毒学，101，466-471]；硫氰酸胍-酚法；硫氰酸胍-三氟铯法；和酚-SDS法。本发明中优选的方法使用硫氰酸胍和氯化铯[Chirgwin，J.M等人，(1979)，生物化学，18，5294-5299]。

所得的poly(A)⁺RNA可用作逆转录酶反应的模板以制备单链cDNA[(ss)cDNA]。如上所述通过使用逆转录酶得到的(ss)cDNA可转变成双链(ds)cDNA。得到ds cDNA的适当方法包括S1核酸酶法[Efstratiadis，A等人，(1976)，细胞，7，279-288]，Gubler-Hoffman法[Gubler，U.和Hoffman，B.J.，(1983)，基因，25，263-269]和Okayama-Berg法[Okayama，H.和Berg，P.，(1982)，Mol.Cell.Biol.，2，161-170]。然而，本发明优选的方法包括使用单链cDNA作为模板的聚合酶链反应[PCR-Saiki，R.K等人，(1988)，科学，239，487-491，列入本文参考文献]。由于优选的方法涉及逆转录和PCR，因此被称为“RT-PCR”。

然后可将上文所得的ds cDNA整合到克隆载体上，使用所得的重组载体转化适当的微生物，如E.coli。使用标准的方法选择转化子，所述方法如通过由重组载体编码的四环素抗性或氨苄青霉素抗性来选择。如果使用E.coli，通过Hanahan法可以有效地转化[Hanahan，D.，(1983)，分子生物学杂志，166，557-580，列入本文参考文献]。或者，通过共同-暴露于氯化钙和氯化镁或氯化铷可将重组载体导入感受态细胞。如果质粒被用作载体，很需要质粒携有如上所述的药物-抗性基因以便于选择。也可以凭蛮力选择，但不优选这么做。尽管已经讨论了质粒，但应懂得也可以使用其它克隆载体，如λ噬菌体。

可以使用如下文所述的多种方法选择携有编码想要的抗-人Fas抗体之亚单位的cDNA的那些转化子。当通过RT-PCR特异性扩增想要的cDNA时，这些步骤可以省略。(1)通过聚合酶链反应筛选

如果所需蛋白质氨基酸序列的全部或部分已被阐明，则可以合成对应于氨基酸序列分离的非-邻接部分的有义和反义寡核苷酸引物。这些引物可被用于聚合酶链反应技术[Saiki，R.K等人，(1988)，科学，239，487-491]以扩增编码小鼠抗-人Fas单克隆抗体亚单位的所需DNA片断。PCR中所用的模板DNA可以是例如通过逆转录由产生抗-人Fas单克隆抗体HFE7A(FERM BP-5828)之杂交瘤的mRNA合成的cDNA。

通过例如使用商购的试剂盒，可将由此合成的DNA片断直接整合到质粒载体上，或者也可以用例如³²P，³⁵S或生物素来标记所述DNA片断，然后将此片断用作集落杂交或噬斑杂交的探针以得到所需的克隆。

通过众所周知的技术从上文所得的适当转化子中收获编码抗-人Fas单克隆抗体的每个亚单位的DNA，所述技术如Maniatis，T等人所述[“分子克隆-实验室手册”，冷泉港实验室，纽约，(1982)，列入本文参考文献]。例如，从已被测定出具有必需的质粒的转化子中分离对应于载体DNA的组分后，从质粒DNA上切下编码所需亚单位的DNA区域。(2)使用合成的寡核苷酸探针筛选

如果所需蛋白质氨基酸序列的全部或部分已被阐明，可以使用也代表所需蛋白质的短的邻接序列构建寡核苷酸探针。此探针编码氨基酸序列，但由于遗传密码的简并性，使得可以制备出大量探针。因此，正常情况下会选择仅由有限数目的寡核苷酸编码的氨基酸序列。通过使用四个正常碱基中的任何一个取代肌苷可进一步减少生产所必需的寡核苷酸的数目。然后用如³²P，³⁵S或生物素适当标记探针，使所述探针与得自固定于硝酸纤维素滤膜的转化子的变性的经转化的DNA杂交。通过检测探针上的标记物显示出阳性株。

适当时可通过本领域中众所周知的多种方法测定DNA的序列，所述方法包括例如Maxam-Gilbert化学修饰技术[Maxam，A.M.和Gilbert，W.(1980)，“酶学方法”65，499-276]和使用M13噬菌体的双脱氧链终止法[Messing，J.和Vieira，J.(1982)，基因，19，269-276]。最近几年来，测定DNA序列的另外的方法已经被广泛接受，所述方法包括使用荧光染料来取代双脱氧法中的常规放射性同位素。整个过程受计算机的控制，包括电泳后读出核苷酸序列。用于此过程的适当的仪器的例子是Perkin-Elmer测序机器人“CATALYST 800”和Perkin-Elmer 373A型DNA测序仪。此技术的使用使得DNA核苷酸序列的测定既有效又安全。

通过使用如上所述的技术，可既有效又安全地进行DNA序列的测定。根据由此测定的本发明DNA的各个核苷酸序列和重链及轻链的各个N-末端的氨基酸序列的资料，可测定本发明单克隆抗体的重链和轻链的整个氨基酸序列。

例如，本发明的HFE7A单克隆抗体适于提供移植到本发明人源化抗体中的CDR，HFE7A是免疫球蛋白G1(IgG1)分子，因此是由γ1重链和κ轻链亚单位组成的复合物。优选的测定各个亚单位的部分氨基酸序列的方法包括例如通过如电泳或柱层析的适当技术分离各个亚单位，然后使用例如自动化的蛋白质测序仪(例如PPSQ-10，Shimadzu Seisakusyo，K.K.)分析各个亚单位的N-末端氨基酸序列。

免疫球蛋白的重链和轻链各由可变区和恒定区组成，每条链的可变区又由三个CDR和四个侧翼于CDR的构架区组成。

不论其识别的抗原如何，任何给定亚类中的恒定区的氨基酸序列是恒定的。另一方面，每个抗体的可变区(至少针对CDR而言)的氨基酸序列是特异性的。然而，通过使用多种抗体氨基酸序列的有关资料的比较性研究已确证了在属于相同亚群的抗体亚单位中，CDR的位置和构架序列的长度大致类似[Kabat，E.A等人，(1991)，“Sequence of Protein of Immunological Interest Vol.II，”，美国健康和人类服务部，列入本文参考文献]。因此，通过例如将抗-Fas单克隆抗体HFE7A的重链和轻链的氨基酸序列与已知的氨基酸序列资料进行比较，可确定上文测定的每个氨基酸序列中的CDR，和构架区以及恒定区的位置。

偶然地发现最靠近重链构架区N-末端FRH₁的长度比正常的长度短30个氨基酸。例如，与HFE7A为同一亚型的小鼠IgG1中最短的已知FRH₁仅为18个氨基酸[Kabat等人，ibid.]。因此，应懂得在本发明的抗体中，只要必需的Fas结合活性不丧失，对应于FRH₁的全长分子的一部分的长度可以是适当的长度，典型地为18-30个氨基酸，但优选约30个氨基酸。

主要通过可变区的序列，借助于恒定区序列提供的支持可测定Fas结合区的三维结构。构架区为CDR提供结构，CDR化学和结构成形以与抗原相互作用。因此，根据上述指示，可选择和修饰识别除Fas以外的抗原的现存抗体或其部分以通过CDR的适当变化识别Fas(例见美国专利申请5,331,573)。为了尽可能多地保留结合活性，一般优选选择与供体链具有最大相似性的受体链。如此修饰的肽可用于本发明，如预防或治疗因Fas/Fas配体系统异常引起的疾病。

通过例如盒式诱变可构建其中氨基酸序列缺失一个或多个氨基酸的突变体(Toshimitsu Kishimoto，“Shin-Seikagaku Jikken Kouza 2：Kakusan IIIKumikae DNA Gijutsu，”242-251)。

通过任何适当的方法可制备DNA序列，其中很多方法是已知的。对较短序列而言尤其适合的方法是使用常规方法的化学合成，如亚磷酸三酯法[Hunkapiller，M等人，(1984)，自然，310，105-111]。任何氨基酸中密码子的选择可以是对应于所需氨基酸的任何被识别的密码子，这种选择可以是任意的，或者也可以考虑宿主中给定密码子的频率，因为适当的选择在不改变氨基酸序列的情况下，可能会产生限制性位点。通过常规技术，即位点特异性诱变可实现核苷酸序列的部分修饰，所述诱变使用编码所需修饰的合成的寡核苷酸引物[Mark，D.F等人，(1984)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，5662-5666]。

通过例如随机引物法[Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.(1983)，Anal.Biochem.，132，6-13]或通过切口平移法[Maniatis，T等人，(1982)，“分子克隆-实验室手册”，冷泉港实验室，纽约]，使用被(α-³²P)dCTP标记的本发明DNA的适当片断作为探针，可以测定DNA与编码本发明抗-Fas单克隆抗体的重链或轻链的DNA的杂交。适当的技术如下所述。

首先将有潜力杂交的DNA吸附到纤维素膜或尼龙膜上，如有必要可先将所述膜经碱性处理，然后通过加热或UV照射将所述DNA固定。在优选的方法中，再将膜浸入预杂交溶液中并在55℃保温4小时或更长的时间，所述溶液含有6×SSC(1×SSC是0.15MNaCl和0.015M柠檬酸钠的水溶液)，5％v/v Denhardt溶液和0.1％v/v十二烷基磺酸钠(SDS)。然后将预先制备的探针溶解于类似的预杂交溶液中至最终的比活性为1×10⁶cpm/ml，接着在60℃下保温过夜。通过在室温下用6×SSC重复洗涤5分钟，再用2×SSC洗涤20分钟来洗涤膜，然后进行放射性自显影。

通过使用这种方法，可从任何cDNA文库或基因组文库中分离出能与编码抗-Fas单克隆抗体的重链或轻链的DNA杂交的DNA，分离出的DNA可用作本发明人源化的抗-Fas抗体的基础[Maniatis，T等人，(1982)，“分子克隆-实验室手册”，冷泉港实验室，纽约]。这种DNA包含在本发明的范围内，杂交的必要特征是6×SSC和55℃，优选60℃，更优选70℃。

所得的本发明的DNA整合到表达载体中即可转化原核或真核宿主细胞。这种表达载体典型地含有涉及基因表达的适当的启动子，复制位点和序列，从而使得DNA能在宿主细胞中表达。

适当的原核宿主细胞包括例如大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。为了在这种宿主细胞中表达目的基因，这些宿主细胞可以被质粒载体所转化，所述载体含有得自能与宿主相容的种的复制子，典型地具有复制起点和启动子序列，如lac UV5。优选这些载体具有能赋予经转化的细胞选择性表型的序列。

E.coli的适当菌株是衍生自E.coli K12的菌株JM109。适当的载体包括pBR322和pUC系列的质粒。适当的启动子包括乳糖启动子(lac)，色氨酸乳糖启动子(trc)，色氨酸启动子(trp)，脂蛋白启动子(lpp)，得自λ噬菌体的(λ)PL启动子和多肽链延伸因子Tu(tufB)启动子。一般情况下应懂得本发明并不局限于使用本文举例的这种宿主，载体，启动子等，如有必要可使用任何适当的系统。

适当优选的枯草芽胞杆菌菌株是207-25，优选的载体是pTUB228[Ohmura，K等人，(1984)，生物化学杂志，95，87-93]。适当的启动子是枯草芽胞杆菌α-淀粉酶基因的调控序列。如有必要，可将编码α-淀粉酶信号肽序列的DNA序列与本发明的DNA连接以实现胞外分泌。

真核宿主包括得自脊椎动物和酵母种的细胞宿主。所用脊椎动物细胞的例子是猴COS-1细胞系[Gluzman，Y.，(1981)，细胞，23，175-182]。适当的酵母细胞宿主包括面包酵母(酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae)，甲基营养酵母(巴斯德毕赤氏酵母Pichia pastoris)和裂殖酵母(粟酒裂殖糖酵母Schizo-saccharomyces pombe)。应懂得必要时也可使用其它宿主。

一般而言，脊椎动物细胞适当的表达载体必需含有：通常位于需表达的基因上游的启动子；RNA剪接位点；聚腺苷酸化位点；和转录终止序列，以及所需的任何其它功能区，如复制起点。适当的质粒是含有SV40早期启动子的pSV2dhfr[Subramani，S等人，(1981)，Mol.Cell.Biol.，1，854-884]，但是本领域的技术人员已知很多其它的质粒。

适当的真核微生物是酵母，如酿酒酵母，酵母的适当表达载体包括pAH301，pAH82和YEp51。适当的载体含有例如乙醇脱氢酶基因的启动子[Bennetzen，J.L.和Hall，B.D.，(1982)，生物化学杂志，257，3018-3025]或羧肽酶Y GAL10启动子[Ichikawa，K等人，(1993)，Biosci.Biotech.Biochem.，57，1686-1690]。如有必要，可将编码羧肽酶Y信号肽序列的DNA序列与要表达的DNA连接以实现胞外分泌。

当COS细胞用作宿主时，载体可适当含有允许自我复制的SV40复制起点，转录启动子，转录终止信号和RNA剪接位点。可通过任何适当的方法将表达载体用于转化细胞，所述方法如DEAE-葡聚糖法[Luthman，H，和Magnusson，G.(1983)，核苷酸研究，11，1295-1308]，磷酸钙-DNA共沉淀法[Graham，F.L.和Van der Eb，A.J.，(1973)，病毒学，52，456-457]和电脉冲电穿孔法[Neumann，E等人，(1982)，EMBO J.，1，841-845]。

在优选的实施方案中，COS细胞与两个各自分开的表达载体共转染，其中一个载体所含的DNA编码的蛋白质至少含有HFE7A抗体重链可变区，优选作为整个人源化重链的一部分，一个载体所含的DNA编码的蛋白质至少含有HFE7A抗体轻链可变区，优选作为整个人源化轻链的一部分，这些载体被同时表达以产生人源化的重组抗-人Fas抗体。

所需的蛋白质在转化子的细胞内或外被表达，可使用常规方法培养本发明的转化子。适当的培养基包括多种常用的培养基，一般根据所选择的宿主选择培养基。例如，COS细胞适当的培养基包括RPMI-1640和Dulbecco改进的Eagle极限必需培养基(DMEM)，如有必要可添加胎牛血清(FBS)。

培养温度可以是不会显著抑制细胞合成蛋白质之能力的任何适当的温度，优选的温度范围是32-42℃，最优选37℃，特别是对于哺乳动物而言更是如此。如有必要，培养可在含有1-10％(v/v)二氧化碳的空气中进行。

转化子菌株E.coli pME-H和E.coli pME-L各被重组的DNA载体转化，所述载体分别可用于在动物细胞中表达编码抗-Fas单克隆抗体重链和轻链的DNA，所述单克隆抗体对于制备本发明的人源化抗-Fas抗体有用。根据布达佩斯条约于1997年3月12日将这两个转化子菌株保藏于Kogyo GijutsuinSeimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo，保藏号分别为FERM BP-5868和BP-5867。因此，通过用分离自被保藏菌株的重组载体转化经培养的动物细胞，如COS-1，并培养转化子细胞，可在培养物中产生重组的抗-Fas抗体。

根据蛋白质在细胞内表达还是在细胞外表达，并取决于蛋白质的物理和化学特性，通过多种众所周知的分离方法可分离和纯化由本发明的转化子表达的蛋白质。分离的适当特异性方法包括：用常用的蛋白质沉淀剂处理；如超滤，分子筛层析(凝胶过滤)，吸附层析，离子交换层析，亲和层析和高效液相层析(HPLC)的多种层析方法；透析；及其联合。

通过使用上述方法，可轻易得到高产量和高纯度的所需蛋白质。

为了使小鼠抗-Fas单克隆抗体最大程度地人源化，优选至少将可变区移植到人抗体中以使每个CDR都能全部掺入人抗体中，也优选使FR序列的重要残基移植到人抗体中以尽可能多地维持结合位点的结构。通过下列三个方法中的任何一个都可实现这一目的：1)使用来自相同的已知的人抗体的重链和轻链；或2)使用来自不同的人抗体的重链和轻链，它们与供体链具有高的序列同源性，或享有共有序列，而同时维持受体链亚型的组合；或3)不管亚型的组合如何，从人抗体的一级序列文库中选择与供体重链和轻链FR具有最高同源性的重链和轻链的FR。

仅根据序列同源性而没有其它限制的这种选择方法使得供体和受体FR部分的氨基酸至少70％相同成为可能。与已知方法相比，采用这种方法可以减少从供体移植的氨基酸的数目，从而使对HAMA反应的诱导最小化。

本文所用的术语‘氨基酸序列同源性’指的是两个不同的多肽或蛋白质之间氨基酸序列的相似性。通过大量常涉及用计算机研究序列数据库的方法中的任何一种可评价氨基酸序列的同源性。这些方法是本领域技术人员熟知的方法。优选覆盖构架区的长度评价同源性。

应懂得由于由抗体分子的一级序列推测其三维结构的技术(下文称之为“制作分子模型”)的准确度有限，因此不能完全确定供体亚型中很少出现的氨基酸残基的作用。如Queen及其同事的方法(Queen等人，出处同上)的已知方法不能表明此时该选择供体的氨基酸序列还是受体的氨基酸序列。仅根据序列同源性选择受体分子可显著降低作出这种类型的选择的需要。

另外，我们通过提供另外的选择方法对此方法进行了进一步的推敲，设计出的方法可鉴定供体FR的氨基酸，所述FR对于维持供体CDR区的结构和功能是至关重要的。

一旦对于给定的链选择了人受体分子，可按下述选择由供体FR移植出的氨基酸残基。

排列供体和受体的氨基酸序列，如果FR被排列的氨基酸残基在任何位置都不相同，必需决定应选择哪个残基。选择出的残基应该对得自供体的CDR的三维结构没什么干扰，或仅有最小的影响。

Queen等人[国际专利申请号WO90/07861，列入本文参考文献]建议的方法可决定供体FR的氨基酸残基是否与CDR序列一起被移植。根据此方法，FR区的氨基酸残基与CDR序列一起被移植到受体中，条件是残基符合下列规则中的至少一项：1)受体的人构架区中的氨基酸很少被发现于受体的那个位置，而供体的相应氨基酸常被发现于受体的那个位置；2)氨基酸的位置靠近一个CDR；和3)通过免疫球蛋白的三维模型判断，在CDR的约3埃内，氨基酸具有侧链原子，并潜在地能与抗原或人源化抗体的CDR相互作用。

由上述规则(2)鉴定的残基经常显示出规则(3)的特征，因此，本发明中省略了规则(2)并引入了两个新规则。因此本发明中将供体FR的氨基酸残基与CDR一起移植，条件是残基符合下列规则中的至少一项：a)受体的人构架区中的氨基酸很少被发现于受体的那个位置，而供体的相应氨基酸常被发现于受体的那个位置；b)通过免疫球蛋白的三维模型判断，在CDR的约3埃内，氨基酸具有侧链原子，并潜在地能与抗原或人源化抗体的CDR相互作用；c)在涉及决定典型的一类CDR的结构的位置处发现的氨基酸；d)在重链和轻链的接触表面发现的氨基酸的位置。

关于规则(a)，当发现有90％或更多的相同亚类的抗体位于那个位置时，氨基酸被定义为“共有”[Kabat等人，出处同上]。当发现有低于10％的相同亚类的抗体位于那个位置时，氨基酸被定义为“少有”。

关于规则(c)，根据Chothia及其同事提供的信息[Chothia等人，出处同上]可以确定典型类的决定簇残基。

关于规则(b)和(d)，必需提前建立抗体可变区的分子模型。尽管可以使用任何商购的建立分子模型的软件，但我们优选使用AbM软件[OxfordMolecular Limited，Inc.]。

通过建立分子模型所作的预测的准确性受到限制，因此，在本发明中将通过建立分子模型所得的结构预测与多种抗体可变区的X-射线晶体学资料比较可评价前者。

当使用通过建立分子模型(如AbM软件)产生的结构模型时，如果两个原子之间的距离小于它们的范德华半径加0.5埃的总和，意味着两个原子通过范德华力相互接触。当如主链和侧链的酰胺氮和羰基氧的极性原子之间的距离小于2.9埃(氢键的平均长度)加0.5埃时，意味着存在氢键。另外，当两个带相反电荷的原子之间的距离小于2.85埃加0.5埃时，意味着它们形成了离子对。

根据多种抗体可变区的X-射线晶体学资料，鉴定出常与CDR接触的FR的氨基酸的位置。不顾亚型如何，测定这些位置。对于轻链而言，这些位置是位置1，2，3，4，5，23，35，36，46，48，49，58，69，71和88，和对于重链而言，为位置2，4，27，28，29，30，36，38，46，47，48，49，66，67，69，71，73，78，92，93，94和103。上述氨基酸的计数遵照的是Kabat等人的定义，下文中也遵照此计数系统。当通过建立分子模型分析相同的资料时，这些位置处的氨基酸残基显示出与三分之二被检查的抗体可变区的CDR的氨基酸残基接触。

使用这些发现定义上述规则(b)，具体地说，如果FR中的氨基酸位置通过建立分子模型被预测出既与CDR接触，又经常在实验过程中通过X-射线晶体学分析被发现与CDR接触，那么供体氨基酸残基的移植具有优选权。在任何其它情况下，不必考虑规则(b)。

类似地，关于规则(d)，多种抗体可变区的X-射线晶体学资料表明轻链中位置36，38，43，44，46，49，87和98的氨基酸残基和重链中位置37，39，45，47，91，103和104的氨基酸残基经常涉及重链和轻链之间的接触。如果通过建立分子模型预测出这些氨基酸中的任何一个都涉及轻链和重链的接触，那么供体氨基酸残基的移植具有优选权。在任何其它情况下，不必考虑规则(d)。

可以用很多方法制备编码本发明人源化的抗-人Fas抗体的重链和轻链可变区的DNA。

在一个方法中，可合成长度为60-70个核苷酸的多核苷酸片断，所述片断代表所需DNA的部分核苷酸序列。设计合成方法以使有义链的片断末端与反义链的片断末端相互交替。使所得的多核苷酸片断相互退火，并通过DNA连接酶连接。用此方法可得到编码本发明人源化的抗-人Fas抗体的重链和轻链可变区的所需DNA片断。

或者可以从人淋巴细胞中分离编码受体的整个可变区的DNA。例如也可使用定点诱变在编码供体CDR的区域导入限制性位点。然后使用相关的限制性酶从受体切下CDR，再合成编码供体CDR的DNA，并使用DNA连接酶将它连接到受体分子中。

我们优选通过重叠延伸PCR技术[Horton，等人，(1989)，基因，77，61-68，列入本文参考文献]得到编码所需的人源化的抗-人Fas抗体的重链和轻链可变区的DNA。

重叠延伸PCR允许连接各编码所需氨基酸序列的两个DNA片断。为了举例，将本文的两个片断称为(A)和(B)，合成与(A)5’区退火的20-40个核苷酸长的有义引物(C)，以及与(B)3’区退火的20-40个核苷酸长的反义引物(D)。还需要两个引物，首先是嵌合有义引物(E)，它含有与(B)5’区的20-30个核苷酸连接的(A)3’区的20-30个核苷酸，第二还需要与有义引物互补的反义引物(F)。

使用引物(C)和(F)，与含有片断A的DNA模板联合进行PCR反应。所述PCR产生的DNA产物含有与(A)3’末端连接的(B)5’区的20-30个核苷酸，此片断被称为片断(G)。

类似地，使用引物(D)和(E)，与含有片断B的DNA模板联合进行PCR反应。所述PCR产生的DNA产物含有与(B)5’末端连接的(A)3’区的20-30个核苷酸，此片断被称为片断(H)。

(G)和(H)片断分别携有(G)3’区的40-60个核苷酸和(H)5’区的40-60个核苷酸的互补序列。可使用(G)和(H)片断的混合物作为模板进行PCR反应。在第一个变性步骤中，DNA变成单链，在随后的退火步骤中，大多数DNA回复到最初的形式。然而，由于(G)和(H)片断在序列重叠区退火，部分DNA形成异源DNA双螺旋。在随后的延伸步骤中，突出的单链部分得以修复，产生了表示(A)和(B)连接的嵌合DNA。下文中将此DNA片断称为(I)。使用引物(C)和引物(D)可扩增片断(I)。

在本发明的实施方案中，片断(A)和(B)表示编码小鼠人源化抗-人Fas单克隆抗体重链和轻链CDR区的DNA，编码人IgGFR区的DNA或编码人IgG分泌信号的DNA。

已知所需氨基酸所对应的密码子。当设计生产蛋白质的DNA序列时，可选择任何适当的密码子。例如，可根据宿主所用的密码子选择密码子。可通过例如定点诱变的标准技术对核苷酸序列进行部分修饰，所述技术使用编码所需修饰的合成的寡核苷酸引物[Mark，D.F等人，(1984)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，5662-5666]。通过使用选定的引物导入特异性点突变或突变，可得到编码任何所需的人源化的抗-人Fas抗体的重链和轻链可变区的DNA。

由此得到的本发明的DNA整合到表达载体中允许转化原核或真核宿主细胞。这种表达载体典型地含有适当的启动子，复制位点和涉及基因表达的序列，使得DNA能在宿主细胞中表达。

根据布达佩斯条约，于1997年8月22日将携有编码本发明人源化抗-Fas抗体的轻链可变区的DNA的5个转化子菌株，即E.coli pHSGMM6 SANK73697，E.coli pHSGHM17 SANK 73597，E.coli pHSGHH7 SANK 73497，E.coli pHSHM2 SANK 70198和E.colip HSHH5 SANK 70398以及携有编码本发明人源化抗-Fas抗体的重链可变区的DNA的2个转化子菌株，即E.colipgHSL7A62 SANK 73397和E.coli pgHPDHV3 SANK 70298保藏于KogyoGijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo，保藏号分别为FERM BP-6071，FERMBP-6072，FERMBP-6073，FERMBP-6272和FERMBP-6274(轻链)，和FERMBP-6074和FERMBP-6273(重链)。因此，通过例如从这些被保藏的菌株中分离质粒，或通过使用被保藏菌株的提取物作为模板进行PCR可得到编码人源化抗-Fas抗体蛋白质的每个亚单位的DNA。

通过上述方法学可以高产量轻易得到高纯度的重组抗-Fas抗体。

为了检查上文制备的特异性结合Fas的重组抗-Fas抗体，可用与上文类似的方法进行ELISA以评价被免疫的小鼠中抗体的滴度。

本发明的人源化抗-Fas抗体HFE7A抗体具有下述的多种功能特性a)-F)，每一个功能都可以通过例如下述的方法来证实。在表达Fas的T细胞中诱导细胞程序死亡。

通过从已给出本发明人源化抗-Fas抗体(下文中也称为“抗体”)的小鼠体内摘除胸腺，使胸腺破碎，将所得细胞与T细胞和针对小鼠Fas的抗体接触，并通过流式细胞术测量结合两种抗体的细胞部分，即可测定表达Fas的T细胞中诱导细胞程序死亡的活性。改善MRL gld/gld小鼠自身免疫症状。

给MRL gld/gld小鼠腹膜内施用抗体，这些小鼠的编码Fas配体的基因中携有突变，并表现出类似于自身免疫病的症状[Shin Yonehara(1994)，NikkeiScience Bessatsu，110，66-77]。在很多场合下，抗体能预防或至少能改善肢体的肿胀，肢体肿胀是一种自身免疫病-样症状。不会诱导肝障碍

从已给出抗体的BALB/c小鼠中取外周血，并使用自动化的分析仪(例如7250型；Hitachi Seisakusyo，K.K.)以及分析试剂(例如转氨酶-HRII；WakoPure Chemical Industries，Ltd.)测量谷草转氨酶(GOT)和谷丙转氨酶(GPT)的抗体和血液水平。不会导致血液GOT和GPT水平升高表明体内施用抗体不会诱导肝障碍。对暴发性肝炎的治疗或预防效果。

在通过给小鼠施用抗-小鼠Fas单克隆抗体Jo2来诱导暴发性肝炎的实验系统中，可检查在施用Jo2的同时或施用Jo2之后施用上述抗体的效果。本发明的抗体可在很大程度上防止Jo2对小鼠的所有影响，从而表明对肝脏的保护作用。对胶原-诱导的关节炎的攻击的预防作用。

通过给小鼠施用含有胶原和弗氏完全佐剂的乳剂产生风湿性关节炎的模型，检查给所述模型施用抗体的效果，抗体具有预防特性。在风湿性关节炎患者的滑膜细胞中诱导细胞程序死亡。

培养得自风湿性关节炎患者的感染区的滑膜细胞，检查当培养基中含有上述抗体时细胞的生存力。令人惊奇地发现滑膜细胞的增殖受到抑制。

因此，本发明抗体与先前已知的抗-Fas单克隆抗体不同的是不仅能保护正常的细胞，也能杀死异常细胞。因此它们能用作因Fas/Fas配体系统异常而引起的疾病的预防和治疗剂。

通过例如在已加入或将要加入检测样品的培养基中培养如人淋巴细胞的细胞系HPB-ALL[Morikawa，S等人，(1978)，Int.J.Cancer，21，166-170]或Jurkat(美国典型培养物保藏中心，No.TIB-1520)的细胞可确定本发明的蛋白质诱导细胞程序死亡的能力。通过例如MTT测定法[Green，L.M等人，(1984)，免疫学方法杂志，70，257-268]可测定存活率。

本发明的抗体可用于多种药物制品，所述药物针对的是如上文所列的与Fas/Fas配体系统异常相关的多种疾病。

可以以多种形式中的任何一种施用这种预防或治疗剂。适当的施用模式包括口服，如片剂，胶囊，颗粒，粉末和糖浆，或非肠道施用，如通过包括静脉内，肌内和真皮内的任何适当形式的注射，以及灌注和栓剂。因此，本发明还提供了治疗上述疾病的方法和治疗组合物，这种组合物典型地含有与药物可接受的载体混合的治疗有效量的本发明的蛋白质，可以以任何适当的方式施用这种组合物，所述方法如非肠道，静脉内，皮下或局部施用。

具体地说，当所治疗的疾病为局部疾病时，优选在尽可能与位点接近的位置处施用蛋白质。例如，严重的关节疼痛可能发生于大关节处，可将蛋白质施用于这种位置。

特别优选以无热原的，治疗可接受的，尤其是非肠道可接受的水溶液的形式全身施用本发明的蛋白质。与如pH，等渗性，稳定性等等方面有关的这种药物可接受的蛋白质溶液制品是本领域技术人员所熟知的。另外，本发明的组合物可含有据认为是适当的另外的成分，如细胞生长抑止剂和其它药剂。

应懂得可根据如患者的病情，年龄和体重等的因素改变剂量，但成人的口服剂量通常是每天约0.1mg-1,000mg，可以单剂量施用或分几次剂量施用。非肠道施用的剂量典型地为0.1mg-1,000mg，可通过皮下，肌内或静脉内注射施用。

本发明人源化的抗-Fas抗体的适当口服施用形式是无菌溶液或水或药物可接受的溶液中的无菌悬浮液的安瓿。或者，可将无菌粉末(优选通过冻干人源化的抗-Fas抗体来制备)填入安瓿，然后用药物可接受的溶液稀释以供使用。

由于用于治疗人的本发明的抗体已经人源化，因此毒性非常低。

下列实施例将更详细地阐明本发明，实施例是为了阐明而不是限制本发明。实施例表示本发明的特殊实施方案。

未特别定义的任何方法，制品，溶液等等可在‘分子克隆-实验室手册’(出处同上，已列入本文参考文献)中找到。除非另有说明，所有溶液都是水溶液，并在无菌的去离子水中制备。

参考实施例1

制备Fas抗原

为了得到一种可溶形式的缺少跨膜结构域的人Fas，构建了表达载体。将该载体设计成为编码一种包括人Fas的胞外域的融合蛋白(“Fas融合蛋白”)，所述人Fas的胞外域已融合到小鼠白介素3(IL3)受体的胞外域中[Gorman，D.M等人，(1990)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 87，5459-5463]。通过PCR从上述载体制备出编码人Fas融合蛋白的DNA。如下构建载体并制备DNA。a) 模板

用于PCR构建编码融合蛋白的插入片段的模板为两种质粒。第一种质粒pME18S-mFas-AIC[Nishimura，Y.等人，(1995)，免疫学杂志，154，4395-4403]为编码包括小鼠Fas的胞外域和小鼠IL3受体的胞外域的融合蛋白的DNA表达质粒载体。第二种质粒pCEV4[Itoh，N.等人，(1991)，细胞，66，233-243]携有编码人Fas的cDNA。b) PCR引物

合成了以下的寡核苷酸引物：

5′-GGGGAATTCC AGTACGGAGT TGGGGAAGCT CTTT-3′(N1；序列表的SEQ ID No.12)；

5′-GTTTCTTCTG CCTCTGTCAC CAAGTTAGAT CTGGA-3′(C3N：序列表的SEQ ID No.13)；

5′-TCCAGATCTA ACTTGGTGAC AGAGGCAGAA GAAAC-3′(N3N：序列表的SEQ ID No.14)；以及

5′-CCCTCTAGAC GCGTCACGTG GGCATCAC-3′(CTN2：序列表的SEQ ID No.15)。

除非另有说明，按照手册[Matteucci，M.D.和Caruthers，M.H.，(1981)，J.Am.Chem.Soc.，103，3185-3191]所提供的说明使用自动DNA合成仪(380B型；Perkin Elmer Japan，Applied Biosystems Division)来合成该实施例中所有的寡核苷酸。在合成后，从支持体上除去每种寡核苷酸(引物)并进行脱保护，把得到的溶液冻干以得到粉末。然后把该粉末溶解在蒸馏水中并在-20℃下储存待用。c) PCR的第一阶段i)如下制备出命名为HFAS并且编码人Fas的胞外域的DNA片段。使用LA(Long and Accurate)PCR试剂盒(Takara Shuzo有限公司，日本)来进行PCR反应。PCR反应溶液的组成：模板pCEV4DNA，20ng；引物N1，0.5μg；引物C3N，0.5μg；10×浓缩的LAPCR缓冲液(由试剂盒提供)，25μl；dNTP(由试剂盒提供)，25μl；以及LATaq聚合酶(由试剂盒提供)，12.5单位。

向该溶液中加入无菌蒸馏水至总体积为250μl。除非另有说明，所提供的dNTP为dATP，dCTP，dGTP和dTTP的等摩尔的混合物。

如下进行PCR反应。首先将溶液在94℃下加热2分钟，之后重复94℃下1分钟、55℃下1分钟以及72℃下2分钟的加热循环30次。在完成这一步骤后，在72℃下加热反应溶液10分钟(在参考实施例中所述的所有的PCR反应中，使用GeneAmp PCR系统9600来调节温度；Perkin Elmer，日本)。

ii)如下制备出命名为MAIC并且编码小鼠IL3受体的胞外域的DNA片段。PCR反应溶液的组成：模板pME18S-mFas-AIC DNA，20ng；引物N3N，0.5μg；引物CTN2，0.5μg；浓缩了10倍的LAPCR缓冲液，25μl；dNTP，25μl；LA Taq聚合酶，12.5单位；以及无菌蒸馏水至总体积为250μl。如上进行PCR反应。首先，分别对如上得到的扩增的HFAS和MAIC DNA片段进行苯酚提取、然后进行乙醇沉淀[上述两个步骤在下面的实施例2(2)3)a)中进行了定义，之后在5％w/v的聚丙烯酰胺凝胶上电泳经纯化的片段。用1μg/ml的溴化乙锭给凝胶染色以便在紫外光下显示出DNA。用剃刀刀片切下经测定含有所需的DNA片段的带，并且使用配备有离心管式超滤设备Centricon-10(Amicon)的Amicon Centriruter从带中电洗脱上述DNA。在电洗脱后，弃去含有洗脱液的Centricon-10单位并在7,500×g下离心大约1小时以浓缩DNA。用乙醇沉淀该DNA，然后将其溶解在20μl的蒸馏水中。d) PCR的第二阶段

如下制备出编码人Fas融合蛋白(人Fas/小鼠IL3受体)的FASAIC DNA片段。PCR反应溶液的组成：模板DNA溶液HFAS，20μl；模板DNA溶液MAIC，20μl；引物N1，0.5μg；引物CTN2，0.5μg；浓缩了10倍的LAPCR缓冲液，25μl；dNTP，25μl；LA Taq聚合酶，12.5单位；以及无菌蒸馏水至总体积为250μl。如上述c)中进行PCR反应。

首先，用苯酚提取如上得到的扩增的FASAIC DNA片段、然后用乙醇进行沉淀，在1％w/v的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。用1μg/ml的溴化乙锭给凝胶染色以便在紫外光下显示出DNA。用剃刀刀片切下经测定含有所需的DNA片段的带，并且使用配备有如上所述的Centricon-10设备的AmiconCentriruter从带中电洗脱上述DNA。在电洗脱后，除去含有洗脱液的Centricon-10单位并在7,500×g下离心大约1小时以浓缩DNA，然后用乙醇沉淀该DNA，最终将其溶解在50μl的蒸馏水中。e) 构建载体

用限制酶EcoRI和XbaI消化以上d)中得到的整个的FASAIC DNA，然后用苯酚/氯仿混合物(50％用水饱和的v/v苯酚，48％v/v氯仿，2％v/v异戊醇)提取，用乙醇沉淀，将所得沉淀物悬浮于2μl无菌的去离子水中。

用限制酶EcoRI和XbaI消化2μg质粒pME18S-mFas-AIC并去磷酸化[去磷酸化的方法定义于下文实施例2(2)3)a)中]。然后使用连接试剂盒(TakaraShuzo有限公司)将所得的DNA片断连接到上文所得的经限制酶消化的FASAIC DNA中。再按照Hanahan[Hanahan，D.，(1983)，分子生物学杂志，166，557-580]所述的方法使用连接产物转化E.coli菌株DH5α(GibcoBRL)。通过碱-SDS法从经转化的E.coli中得到质粒[Maniatis，T等人，(1989)，分子克隆：实验室手册(第二版)，冷泉港实验室，纽约]。所得质粒被称为phFas-AIC2。

接着使用大规模质粒制备试剂盒(MaxiPrep DNA纯化系统，Promega)进一步纯化质粒。用乙醇沉淀20μg经纯化的质粒DNA，将沉淀物溶解于20μl无菌的Dulbecco氏PBS(-)培养基中[下文称之为PBS；Nissui Pharmaceutical有限公司]。f) 表达

在37℃、5％v/vCO₂下，在含有添加了10％v/v胎牛血清(FCS；Gibco)的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM；Nissui Pharmaceutical有限公司Japan)的培养瓶中将COS-1细胞(美国典型培养物保藏中心No.CRL-1650)培养为半-汇合，弃去生长培养基，在培养瓶中加入3ml5g/l胰蛋白酶和2g/l乙二胺四乙酸的水溶液(胰蛋白酶-EDTA溶液；Sigma Chemicals，Co.)，然后在37℃下保温3分钟以使细胞从培养瓶上脱附下来。

将收获的细胞悬浮于PBS中，用PBS洗涤两次，并用PBS调整至6×10⁷个细胞/ml。将20μl所得的细胞悬浮液(1.2×10⁶个细胞)与20μl上文制备的质粒溶液相混合，混合物被导入电极间隔为2mm的室(ShimadzuSeisakusyo，K.K.)中。再将室放入基因转染装置(GTE-1；ShimadzuSeisakusyo，K.K.)，以1秒为间隔两次使用600V的脉冲，每次使用30μ秒。将室中的细胞-DNA混合物导入10ml添加有10％v/vFCS的DMEM中，并在37℃、7.5％v/vCO₂下于培养瓶中(培养面积：75cm²)温育24小时。然后弃去培养物上清液，用无血清的DMEM洗涤细胞，在经洗涤的细胞中加入10ml无血清的DMEM，在37℃、7.5％v/vCO₂下将混合物进一步温育24小时，并回收上清液。

在透析管(排阻分子量12,000-14,000；Gibco BRL)中逆着10mMTris-HCl(pH8.0)透析回收的上清液，然后在下列条件下，使用Pharmacia的FPLC装置进一步部分纯化人Fas融合蛋白：柱：ResourceQ柱(商标；φ6.4×30mm；Pharmacia)；洗脱液：10mM Tris-HCl(pH8.0)；流速：5ml/min；洗脱：NaCl 0.1M-0.3M的线性梯度，30分钟。

以5ml的组分收集洗出液，如上所述通过ELISA(酶联免疫吸附测定)检测洗出液中的Fas基因表达产物。首先，将100μl各个组分分开置于96-孔微量板(Costar)的孔中，并在37℃保温1小时。然后吸出孔中的溶液，用100μl/孔含有0.1％v/vTween20的PBS(PBS-Tween)将板洗涤3次，洗涤后，以100μl/孔的量加入含有2％w/v牛血清白蛋白(“BSA”)的PBS，并将板在37℃保温1小时。

用100μl/孔的PBS-Tween将孔再洗涤3次，以100μl/孔的量在每个孔中加入用PBS-Tween稀释100倍的抗-小鼠IL-3受体β亚单位单克隆抗体HC的溶液(1mg/ml；Igaku Seibutsugaku Kenkyujo，K.K.)，再将板在37℃保温1小时。用100μl/孔的PBS-Tween将孔再洗涤3次，以100μl/孔的量在每个孔中加入用PBS-Tween稀释2000倍的经辣根过氧化物酶标记的抗-小鼠免疫球蛋白抗体(Amersham)，再将板在37℃保温1小时，然后用100μl的PBS-Tween将每个孔再洗涤3次。以100μl/孔的量加入辣根过氧化物酶底物(BioRad)并放置5分钟。用微量板读数器(450型；BioRad)测量415nm下的吸光度，收集在此波长下有高吸光度值的第19-第23组分，以制备粗的人Fas融合蛋白样品。

参考实施例2

免疫小鼠并制备杂交瘤(2-1) 免疫

从上述参考实施例1所得的粗的人Fas融合蛋白溶液中(总蛋白；100μg)取出1ml样品，在其中加入25μl 2N HCl，250μl9％w/v钾矾(终浓度：1.1％w/v)和25μl 2N的NaOH。通过加入约120μl 10％(w/v)碳酸氢钠的水溶液将所得混合物的pH调节至约6.5-7.0，并在室温下放置约30分钟。然后在混合物中加入200μl灭活的百日咳博德特氏杆菌(Bordetellapertussis)(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.；1.2×10¹¹个细胞/ml)以激活T细胞，给Fas失效小鼠腹膜内施用混合物。根据Senju等人所述的方法[Senju，S.等人，(1996)，International Immunology，8，423]制备所用的小鼠，两周后，仅用粗的人Fas融合蛋白腹膜内注射小鼠以加强免疫(20μg蛋白质/小鼠)。(2-2) 细胞融合

加强注射后第3天，从小鼠体内摘除脾脏，并放入10ml无血清的RPMI1640培养基(10.4g/l RPMI1640“Nussui”1；Nussui Pharmaceutical有限公司)中，所述培养基含有20mM HEPES缓冲液(pH7.3)，350mg/ml碳酸氢钠，0.05mMβ-巯基乙醇，50单位/ml青霉素，50μg/ml链霉素和300μg/mlL-谷氨酸，使用调药刀，通过使器官穿过筛(Cell Strainer；Falcon)破碎脾细胞。离心所得的细胞悬浮液以沉淀脾细胞，然后用无血清的RPMI培养基将细胞洗涤两次，将洗涤过的细胞悬浮于无血清的RPMI培养基中并计数。

与此同时，已在37℃、5％v/vCO₂下，在含有10％v/vFCS(GibcoBRL)的ASF104培养基(Ajinomoto，K.K.)(“含血清的ASF培养基”)中将骨髓瘤NS1细胞(美国典型培养物保藏中心No.TIB-18)培养至细胞密度不超过1×10⁸个细胞/ml，按与上述类似的方式将细胞破碎，洗涤，悬浮和计数。

将经计数含有3×10⁷个细胞的NS1细胞悬浮液的量与将经计数含有3×10⁸个细胞的脾细胞悬浮液的量相混合，离心所得混合物并弃去上清液。细胞融合接下去的步骤的整个过程中，将含有沉淀物的塑料试管放在37℃的温水烧杯中进行。

然后在试管中缓慢加入1ml 50％(w/v)的聚乙二醇1500(BoehringerManheim)，同时使用移液管的滴头搅拌沉淀物，分两部分缓慢加入1ml预温至37℃的无血清的RPMI培养基，接着再加入7ml无血清的RPMI培养基。离心所得的混合物，弃去上清液，用移液管的滴头缓慢搅拌的同时加入10ml含有10％v/vFCS的次黄嘌呤，氨基喋呤和胸苷培养基(“HAT培养基”；Boehringer Manheim)。再加入20ml含有10％v/v FCS的HAT培养基，将悬浮液以100μl/孔分散于96-孔细胞培养微量板中，并在37℃、5％v/vCO₂下温育。7或8天后，用100μl/孔新鲜的HAT培养基取代任何显示出黄色的孔中的培养基，通过下述的有限稀释从这些细胞中筛选融合细胞。(2-3) 有限稀释

从4-10周龄的雌性BALB/c小鼠(得自日本SLC，Inc.)体内摘除胸腺，如上所述通过筛(Cell Strainer；Falcon)破碎细胞，用含有10％v/vFCS的次黄嘌呤胸苷培养基(“HT培养基”；Boehringer Manheim)将破碎的细胞洗涤两次，将相当于一个小鼠胸腺细胞的量悬浮于30ml含有10％v/v FCS的HT培养基中以产生饲养细胞悬浮液。用此饲养细胞悬浮液将(2-2)中所得的融合细胞制品稀释10-100倍，用饲养细胞悬浮液进一步地系列稀释以使悬浮液中融合细胞的密度为5，1和0.5个细胞/ml。将如此制备的样品以100μl/孔分散于96-孔细胞培养微量板中，并在37℃、5％v/vCO₂下温育5天。(2-4) 筛选

通过在37℃、5％v/vCO₂下，在含有10％v/vFCS的RPMI1640培养基中温育使WR19L12a细胞[Itoh，N.等人，(1991)，细胞，66，233-243]增殖。WR19L12a细胞衍生自小鼠T淋巴瘤WR19L细胞(美国典型培养物保藏中心No.TIB-52)，已被修饰成可表达编码人Fas的基因。将经增殖的WR19L12a细胞的悬浮液调整为细胞密度为1×10⁷个细胞/ml，将50μl/孔的等分试样分散于96-孔微量板的孔中，所述孔具有U-形底(Nunc)，离心板(90×g，4℃，10分钟)，弃去上清液，在孔中边混合边加入50μl/孔得自上文2-3中培养的融合细胞的培养物上清液。

将所得的混合物置于冰上放1小时，然后离心(90×g，4℃，10分钟)，移去上清液。用100μl/孔流式细胞术缓冲液[含有5％v/vFCS和0.04％(w/v)叠氮钠的PBS]将每个沉淀物洗涤两次。在经洗涤的细胞中加入第二抗体[50μl稀释了500倍的被荧光素-5-异硫氰酸(FITC)标记的山羊抗-小鼠IgG抗体的IgG组分(Organon Technika)]，将混合物置于冰上放1小时，然后离心(90×g，4℃，10分钟)，移去上清液。用100μl/孔流式细胞术缓冲液将沉淀物洗涤两次，通过加入50μl 3.7％v/v甲醛溶液固定细胞，并在冰上放10分钟，离心(90×g，4℃，10分钟)后，移去上清液，再用100μl/孔流式细胞术缓冲液洗涤沉淀物，并悬浮于100μl/孔流式细胞术缓冲液中以产生流式细胞术样品。

用流式细胞仪(Epics Elite；Coulter；激发波长：488nm；检测波长：530nm)测量每个样品中细胞FITC荧光的强度，从样品中选择FITC荧光强度比未加入融合细胞上清液的WR19L12a对照细胞(其FITC荧光强度约为0.3)显然要高的融合细胞(其FITC荧光强度约为100-1,000)。(2-5) 克隆

对(2-4)中选出的细胞重复5次上文(2-3)和(2-4)中所述的步骤，从而选择出几个杂交瘤克隆，所述克隆各产生与WR19L12a结合但不与WR19L结合的单个抗体。通过使用与(2-4)中所述方法类似的测定法，但使用L5178YA1细胞检测这些抗体与小鼠Fas的结合。L5178YA1细胞系表达鼠Fas，L5178YA1是通过用小鼠Fas表达载体转染L5178Y细胞产生的细胞系，L5178Y细胞(美国典型培养物保藏中心No.CRL-1722)几乎不表达Fas。

选择步骤的结果得到了被称为HFE7A的小鼠-小鼠杂交瘤，所述杂交瘤可产生与L5178YA1细胞结合而不与L5178Y细胞结合的抗体。根据有关微生物保藏的布达佩斯条约，于1997年2月20日将此杂交瘤HFE7A保藏于KogyoGijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo，保藏号为FERM BP-5828。

用单克隆抗体同种型确定试剂盒(Pierce)检测后，阐明由小鼠-小鼠杂交瘤HFE7A(下文简称为“HFE7A”)产生的抗体的亚类是IgG1，κ。

参考实施例3

纯化HFE7A单克隆抗体

通过在37℃、5％v/vCO₂下，在含有10％v/vFCS的11ASF培养基中进行温育，将在参考实施例2中得到的小鼠-小鼠杂交瘤HFE7A(FERMBP-5828)培养至细胞密度为1×10⁶细胞/ml，离心(1,000r.p.m.，2分钟)该培养物并弃去上清液，用不含血清的ASF培养基洗涤细胞碎片一次，将其悬浮于1l不含血清的ASF培养基中并在37℃、5％v/vCO₂下温育48小时，离心(1,000r.p.m.，2分钟)该培养物以回收上清液，把该上清液放置在透析管中(排阻分子量：12,000-14,000；Gibco BRL)并且逆着10体积的10mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)进行透析。在下述条件下使用高效液相层析装置(FPLC系统；Pharmacia)实现了来自内部溶液的IgG的部分纯化：柱：DEAE-Sepharose CL-6B柱(柱的尺寸为10ml；Pharmacia)；洗脱液：10mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)；流速：1ml/分钟；洗脱：1M NaCl(0至50％，180分钟)的线性梯度。

按5ml一个组分来收集洗出液，并且使用以上制备的人Fas融合蛋白通过ELISA来测定每个组分中抗-Fas抗体的滴度。

首先，把在参考实施例1中制备的100μl/孔的粗的人Fas融合蛋白溶液导入一个96孔的ELISA微量板的孔中，在37℃下保温1小时后弃去溶液并用100μl/孔的PBS-Tween洗涤每个孔3次。然后加入含有2％BSA的100μl/孔的PBS并在37℃下保温1小时。用100μl/孔的PBS-Tween洗涤细胞3次，将100μl待测组分的样品加入孔中并在37℃下保温该板1小时。在用100μl/孔的PBS-Tween洗涤每个孔3次之后加入用PBS-Tween稀释了2000倍的经辣根过氧化物酶标记的100μl/孔的抗-小鼠免疫球蛋白抗体(Amersham)并使其在37℃下反应1小时。此后用100μl/孔的PBS-Tween洗涤每个孔3次。以100μl/孔的量加入辣根过氧化物酶的底物(BioRad)，保留5分钟，然后在415nm下用微量板读数器读取每个孔的吸光度。

收集具有高吸光度的宽范围的第21至第30组分并将其加入两个抗体亲和纯化柱中(HighTrap蛋白G柱，柱体积为5ml；Pharmacia)。在用平衡缓冲液[20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)，25ml/柱]洗涤柱后，用每柱15ml的洗脱缓冲液[0.1M甘氨酸-HCl(pH2.7)]来洗脱抗体。在每个含有1.125ml的1M Tris-HCl(pH 9.0)的试管中收集洗出液，并且在洗脱后立即在离心管型超滤设备(CentriPrep 10；Grace Japan，K.K.)的顶部、在4℃下、于3,000×g下离心2小时。弃去在设备底部回收的滤液，向顶部加入15ml的PBS并再一次在4℃、3,000×g下离心该制品2小时。重复上述同样的步骤共5次。当残留在顶部的溶液体积达到0.5ml时停止第5次离心并且保留该溶液作为HFE7A样品。

参考实施例4

cDNA 克隆(4-1) 制备poly(A) ⁺ RNA

在37℃、5％v/v CO₂下，在补充有10％v/v FCS的1l ASF培养基中将在参考实施例2中得到的小鼠-小鼠杂交瘤HFE7A(FERM BP-5828)的细胞培养至细胞密度为1×10⁶细胞/ml。通过离心收获这些细胞，在硫氰酸胍溶液[4M硫氰酸胍，1％v/v十二烷基肌氨酸钠，20mMEDTA，25mM柠檬酸钠(pH7.0)，100mM 2-巯基乙醇，0.1％v/v消泡A]中裂解并回收裂解物。基本上如在“分子克隆-实验室手册”[Maniatis，T.，等人(1982)，pp.196-198]中所述的进行poly(A)⁺RNA的分离。更具体地讲，上述步骤如下。

将回收的细胞裂解物吸入装配有21号针头的10ml注射器中并从中排出该裂解物，如此操作几次。在用于RPS-40T转子(Hitachi Seisakusyo，K.K.)的室(bucket)的同质异晶聚合物离心管中使细胞裂解物在3ml 5.7M氯化铯水溶液、0.1 MEDTA溶液(pH7.5)上成层。然后在30,000r.p.m.、20℃下离心该裂解物18小时，将得到的沉淀物溶解在400μl蒸馏水中并进行乙醇沉淀。把得到的沉淀物再次溶解在400μl蒸馏水中并与等体积的氯仿和1-丁醇(4∶1，v/v)的混合物混合，随后在5000r.p.m.下离心10分钟后回收水层。再次用乙醇沉淀该水层并将沉淀物溶解在600μl蒸馏水中。保留得到的溶液作为总RNA样品。

通过寡(dT)纤维素层析从上面得到的600μg(干重)总RNA样品中纯化出poly(A)⁺RNA。

更具体地讲，把总RNA溶解在200μl的吸附缓冲液[0.5M NaCl，20mMTris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA，0.1％v/v十二烷基硫酸钠(SDS)]中，然后在65℃下加热5分钟并将其加入已装填有吸附缓冲液的寡(dT)纤维素的柱(类型7；Pharmacia)中。使用洗脱缓冲液[10mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA，0.05％v/v SDS]从柱中洗脱并回收poly(A)⁺RNA。通过该步骤得到了总共为100μg的poly(A)⁺RNA组分。(4-2) 测定HFE7A的重链和轻链的N-末端氨基酸序列

使用12％w/v的凝胶浓度、100V恒定电压使在参考实施例3中得到的含有抗-人Fas抗体HFE7A的10μl溶液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(“SDS-PAGE”)120分钟。电泳后，在转移缓冲液[25mM Tris-HCl(pH9.5)，20％甲醇，0.02％v/v SDS]中浸泡该凝胶5分钟。此后，把该凝胶的蛋白质内含物转移至聚偏氟乙烯膜(“PVDF膜”；孔径0.45微米；Millipore，日本)上，在10V恒定电压、4℃的条件下使用印迹装置(KS-8451；Marysol)在转移缓冲液中预浸泡14小时。

此后用洗涤缓冲液[25mM NaCl，10mM硼酸钠缓冲液(pH 8.0)]洗涤该PVDF膜，然后在染色液(50％v/v甲醇，20％v/v乙酸与0.05％w/v考马斯亮蓝)中染色5分钟以定位蛋白质带。然后用90％v/v的甲醇水溶液给PVDF膜脱色，并且切去事先已定位于PVDF膜上的对应于重链的带(具有较低迁移率的带)和对应于轻链的带(具有较高迁移率的带)并用去离子水进行洗涤。

现在可以通过Edman自动方法[Edman，P.，等人(1967)，欧洲生物化学杂志，1，80]使用气相蛋白质测序仪(PPSQ-10；Shimadzu Seisakusyo，K.K.)来测定重链和轻链的N-末端氨基酸序列。

测定到的对应于重链的带的N-末端氨基酸序列为：Gln-Xaa-Gln-Leu-Gln-Gln-Pro-Gly-Ala-Glu-Leu(序列表的SEQ ID No.16)；并且测定到的对应于轻链的带的N-末端氨基酸序列为：

Asp-Ile-Val-Leu-Thr-Gln-Ser-Pro-Ala-Ser-Leu-Ala-Val-Ser-Leu-Gly-Gln-

Arg-Ala-Thr-Ile-Ser (序列表的SEQ ID No.17)。

上述氨基酸序列与由Kabat等人[Kabat E.A.，等人，(1991)，在“Sequencesof Protein of Immunological Interest Vol.II”美国健康与人类服务部]所生产抗体的氨基酸序列数据库的比较表明HFE7A的重链(γ1链)和轻链(κ链)分别属于2b和3亚型。基于上述发现，合成了预期可与属于这些小鼠的亚型的基因的部分5’-未翻译区以及3’-翻译区的所需末端(very ends)杂交的寡核苷酸引物[Kabat等人，出处同上；Matti Kartinen等人，(1988)，25，859-865；以及Heinrich，G.，等人，(1984)，实验医学杂志，159，417-435]：

5′-GACCTCACCA TGGGATGGA-3′ (H1：序列表的SEQ ID No.18)；

5′-TTTACCAGGA GAGTGGGAGA-3′ (H2：序列表的SEQ ID No.19)；

5′-AAGAAGCATC CTCTCATCTA-3′ (L1：序列表的SEQ ID No.20)；

5′-ACACTCATTC CTGTTGAAGC-3′ (L2：序列表的SEQ ID No.21)。(4-3) cDNA克隆

通过联合逆转录与PCR(“RT-PCR”)来克隆编码小鼠的抗-人Fas单克隆抗体HFE7A的重链和轻链的cDNA。在从如上(4-1)所述生产HFE7A的杂交瘤细胞得到的poly(A)⁺RNA组分上进行扩增。使用RNA PCR试剂盒(AMV)第2代(TakaraShuzo有限公司)进行RT-PCR反应。a) 逆转录酶的反应

使用在以上(4-2)中合成的寡核苷酸引物套(5’-末端和3’-末端引物)作为用于重链和轻链的RT-PCR反应的引物套。反应溶液的组成：

poly(A)⁺RNA(如所需的重链或轻链)，1μg；

3’-引物(H2或L2)，0.3μg；

Tris-HCl(pH8.3)，10mM；

氯化钾，50mM；

dNTP，1mM；

氯化镁，5mM；

RNA酶抑制剂(由试剂盒提供)，0.5单位；

逆转录酶(由试剂盒提供)，0.25单位；以及

双蒸水至总体积达20μl。

该反应溶液在55℃下保温30分钟，在99℃下保温5分钟，然后在5℃下保温5分钟。之后在接下来的PCR步骤中使用如上处理的RT溶液。b) PCRPCR反应溶液的组成：

逆转录酶反应溶液，20μl；

浓缩了10倍的RNAPCR缓冲液(由试剂盒提供)，10μl；

氯化镁溶液(由试剂盒提供)，10μl；

Taq聚合酶(由试剂盒提供)，2.5单位；

5’-引物(H1或L1)，最终浓度为0.2μM；以及

无菌去离子水至总体积为100μl。

该PCR反应溶液在94℃下加热2分钟，随后紧接着94℃下30秒钟、60℃下30秒钟以及72℃下1.5分钟的循环，该循环重复28次。

在PCR反应后，在1.5％w/v的琼脂糖凝胶上电泳反应溶液的等分试样。分别使用针对重链和轻链的引物，发现约为1.4kbp和约为0.7kbp的带在该反应溶液中已经扩增。这证实了正如所料编码重链和轻链的cDNA已被扩增。因此，可以在接下来使用TA克隆试剂盒(Invitrogen)克隆扩增的cDNA的步骤中使用扩增的PCR反应溶液。该步骤如下进行。

向已加入4单位T4DNA连接酶(1μl)的1μl10×连接酶反应缓冲液[6mMTris-HCl(pH7.5)，6mM氯化镁，5mM氯化钠，7mMβ-基乙醇，0.1mMATP，2mM DTF，1mM亚精胺与0.1mg/ml牛血清白蛋白]中加入有关的PCR反应溶液以及50ng的pCRII载体(由TA克隆试剂盒提供)。用无菌去离子水调整该混合物的总体积至10μl并在14℃下保温得到的连接酶溶液15小时。

此后向已加入2μl0.5Mβ-巯基乙醇的50μl的感受态大肠杆菌菌株TOP10F’(该菌株由TA克隆试剂盒提供并且根据试剂盒的说明书使其处于感受态)中加入2μl的连接酶反应溶液，得到的混合物在冰上放置30分钟、然后在42℃下放置30秒钟、再在冰上放置5分钟。接下来，向该培养物中加入500μl的SOC培养基(2％v/v胰化蛋白胨，0.5％w/v酵母提取物，0.05％w/v氯化钠，2.5mM氯化钾，1mM氯化镁与20mM葡萄糖)，在37℃下振荡温育混合物1小时。

此后把该培养物涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的L-肉汤琼脂平板[1％v/v胰化蛋白胨，0.5％w/v酵母提取物，0.5％w/v氯化钠，0.1％w/v葡萄糖与0.6％w/v细菌培养用琼脂(Difco)]上并在37℃下温育过夜。选出在平板上出现的单个氨苄青霉素的抗性菌落并用铂金接种环刮去该菌落，于37℃、200r.p.m.的振荡下在含有100μg/ml氨苄青霉素的L-肉汤培养基中培养过夜。温育后，经离心收获细胞，通过碱法从该细胞中制备质粒DNA。将如此得到的质粒命名为质粒pCR-H(携带编码HFE7A重链的cDNA的质粒)或pCR-L(携带编码HFE7A轻链的cDNA的质粒)。(4-4) 核苷酸序列的分析

采用基因序列分析仪(310型基因分析仪；Perkin Elmer，日本)通过双脱氧法[Sanger，F.S.，等人，(1977)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74：5463-5467]来测定编码由以上(4-3)得到的质粒pCR-H和pCR-L携带的HFE7A的重链(1.4kbp)及HFE7A的轻链(0.7kbp)的两种cDNA的核苷酸序列。

在序列表中分别给出经上述测定的HFE7A的重链和轻链的cDNA核苷酸序列为SEQ ID Nos.8和10。序列表的SEQ ID Nos.9和11分别给出由cDNA编码的HFE7A重链和轻链的相伴随的完整氨基酸序列。除了一个不确定的残基以外，以上(4-1)确定的HFE7A重链的N-末端氨基酸序列(序列表的SEQ ID No.16)与SEQ ID No.9的氨基酸序列Nos.1至11完全匹配。HFE7A轻链的N-末端氨基酸序列(序列表的SEQ ID No.17)与SEQ ID No.11的氨基酸序列Nos.1至22精确地匹配。因此表明HFE7A成熟的重链和轻链蛋白质的N-末端分别为SEQ ID Nos.9和11中的氨基酸Nos.1至11和Nos.1至22。

另外，当把重链和轻链的氨基酸序列与抗体的氨基酸序列的数据库[KabatE.A.，等人，(1991)，在“Sequences of Protein of Immunological Interest Vol.II”美国健康与人类服务部]进行比较时，应当明确的是对于重链而言SEQIDNo.9的氨基酸Nos.1至121构成了可变区，而氨基酸Nos.122至445构成了恒定区。对于轻链而言，SEQ ID No.11的氨基酸Nos.1至111构成了可变区，而氨基酸Nos.112至218构成了恒定区。

通过与抗体的氨基酸序列的同一数据库[Kabat E.A.，等人，(1991)，出处同上]的同源性进行比较也阐明了在如上测定的HFE7A的重链和轻链的可变区的氨基酸序列中CDR的位置和序列。从该公开内容可以明确的是可变区中构架区的长度基本相同并且在同一亚型的不同抗体之间氨基酸序列享有同样的特性。CDR是位于构架区之间特有的序列。因此，通过对HFE7A的重链和轻链的氨基酸序列与Kabat的研究中同一亚型的那些氨基酸序列进行比较便可能鉴别出HFE7A的CDR。

因此应当明确的是在HFE7A的重链(序列表中的SEQ ID No.9)中氨基酸Nos.31至35形成了CDRH₁，氨基酸Nos.50至66形成了CDRH₂并且氨基酸Nos.99至110形成了CDRH₃。将HFE7A轻链(序列表中的SEQ ID No.11)中的CDR鉴定为氨基酸Nos.24至38(CDRL₁)，氨基酸Nos.54至60(CDRL₂)以及氨基酸Nos.93至101(CDRL₃)。

参考实施例5

制备重组抗体(5-1) 构建表达质粒

通过把编码HFE7A的重链和轻链的cDNA(在参考实施例4中克隆)插入表达载体pMS18S[Hara，T等人，(1992)，EMBOJ.，11，1875]中来构建用于动物细胞的重组表达载体。这一步骤操作如下。

首先合成寡核苷酸引物：

5′-GGGGAATTCG ACCTCACCAT GGGATGGA-3 ′(H3：序列表的SEQIDNo.22)和

5′-GGGTCTAGAC TATTTACCAG GAGAGTGGGA GA-3′(H4：序列表的SEQ ID No.23)。这些引物用来引入限制酶EcoRI的识别位点、限制酶XbaI的识别位点以及分别位于由质粒pCR-H携带的重链cDNA的5’-末端和3’-末端上的终止密码子。

另外也合成寡核苷酸引物：

5′-GGGGAATTCA AGAAGCATCC TCTCATCTA-3′(L3：序列表的SEQ IDNo.24)和

5′-GGGGCGGCCG CTTACTAACA CTCATTCCTG TTGAAGC-3′(L4：序列表的SEQ ID No.25)。这些引物用来引入限制酶EcoRI的识别位点、限制酶NotI的识别位点以及分别位于由质粒pCR-L携带的轻链cDNA的5’-末端和3’-末端上的终止密码子。

使用上述用于重链和轻链的各自的引物，如下进行PCR。反应溶液的组成：

模板(pCR-H或pCR-L)，1μg；

5’-引物(H3或L3)，40pmol；

3’-引物(H4或L4)，40pmol；

Tris-HCl(pH8.0)，20mM；

氯化钾，10mM；

硫酸铵，6mM；

氯化镁，2mM；

TritonX-100，0.1％；

牛血清白蛋白，不含核酸酶，10μg/ml；

dNTP，0.25mM；

天然的PfuDNA聚合酶(Stratagen)，5单位；以及

无菌蒸馏水至总体积为100μl。PCR的加热条件：

开始时将反应溶液在94℃下加热2分钟，之后重复94℃下30秒钟、60℃下30秒钟以及75℃下1.5分钟的热循环共28次。

用限制酶EcoRI和XbaI(用于重链)或者EcoRI和NotI(用于轻链)消化得到的扩增的DNA，然后将该DNA与或者已用限制酶EcoRI和XbaI(用于重链)消化或者已用EcoRI和NotI(用于轻链)消化并用CIP去磷酸化的[如以下实施例2(2)3)c)中所述]动物细胞表达质粒pME18S[Hara，T等人，(1992)，EMBOJ.，11，1875]混合。把1μl4单位的T4 DNA连接酶加入8μl得到的混合物中，然后再向该混合物中加入1μl的10×连接酶反应缓冲液[6mM Tris-HCl(pH7.5)，6mM氯化镁，5mM氯化钠，7mM β-基乙醇，0.1mMATP，2mM DTT，1mM亚精胺与0.1mg/ml牛血清白蛋白]，之后在14℃下保温15小时。

此后将2μl经保温的连接酶反应溶液与细胞密度为1-2×10⁹细胞/ml的50μl感受态大肠杆菌菌株JM109(Takara Shuzo有限公司)混合，在冰上放置该混合物30分钟、然后在42℃下放置30秒钟、再在冰上放置5分钟。然后向该混合物中加入500μl的SOC培养基(2％v/v胰化蛋白胨，0.5％w/v酵母提取物，0.05％w/v氯化钠，2.5mM氯化钾，1mM氯化镁与20mM葡萄糖)，在振荡下再温育1小时。然后分离出转化菌株并按照参考实施例4(4-3)中所述的方法从该菌株中制备质粒DNA。

得到的质粒命名为pME-H(携带编码HFE7A的重链的cDNA的表达质粒载体)和pME-L(携带编码HFE7A的轻链的cDNA的表达质粒载体)。含有上述质粒的转化的大肠杆菌菌株分别命名为大肠杆菌pME-H和大肠杆菌pME-L，它们已按照有关微生物保藏的布达佩斯条约于1997年3月12日保藏在Kogyo Gijutsuin Seimei-kogaku Gijutsu Kenkyujo，保藏号为FERM BP-5868及FERMBP-5867。(5-2) 在COS-7细胞中表达

采用基因转染装置(ECM600；BTX)通过电穿孔用以上(5-1)中得到的表达质粒pME-H及pME-L来转染COS-7细胞。

在含有补充了10％v/v FCS的DMEM的培养瓶(培养面积：225cm²；Sumitomo Bakelite，K.K.)中培养COS-7细胞(美国典型培养物保藏中心No.CRL-1651)至半-汇合。随后弃去培养基并向细胞中加入3ml的胰蛋白酶-EDTA溶液(Sigma化学公司)，接下来在37℃下保温3分钟。收获经该步骤分离的细胞，用PBS洗涤细胞2次，然后用PBS调整细胞密度至5×10⁶细胞/ml。

与此同时，用乙醇单独沉淀使用大规模质粒制备试剂盒(MaxiPrep DNA纯化系统；Promega)制得的各20μg的质粒pME-H和pME-L，并将上述质粒溶解在各20μl的无菌PBS中。当用两种质粒共转染COS-7细胞时，使用各20μg的质粒并将它们一起溶解在20μl的无菌PBS中。

混合由以上制得的20μl的细胞悬浮液(1.2×10⁶细胞)和20μl相应的质粒溶液并将其转移至具有相距2mm的电极组的室(BTX)中。然后把该室装备到基因转染装置中并在150V下向该室提供10msec的单个脉冲以保证总电荷为900μF。把该室中的细胞-DNA混合物加入40ml补充有10％v/vFCS的DMEM中并在37℃、5％v/v CO₂下在塑料细胞培养盘中温育24小时。此后，弃去培养物上清液并用不含血清的DMEM培养基洗涤细胞。之后，向每个塑料盘中加入40ml不含血清的DMEM，并且在37℃、5％v/vCO₂下再培养细胞72小时后回收上清液。

采用上面的方法得到了或用一种质粒或用两种质粒转染的COS-7细胞(如下所示)并回收到了每种转化子的上清液：

(A)：仅为pME-H；

(B)：仅为pME-L；以及

(C)：pME-H和pME-L的共转染。(5-3) 测定转化子培养物上清液中的抗-Fas抗体

按照参考实施例3中所述的类似方法并使用人Fas融合蛋白作抗原、通过ELISA来测定在以上(5-2)中得到的培养物上清液中抗-Fas抗体的表达。应当明确的是与培养物上清液中的人Fas抗原融合蛋白反应的抗体的生产仅仅发生在pME-H和pME-L均被用于共转染COS-7细胞的时候[5-2(C)]。

参考实施例6

表位的测定(6-1) ELISA

使用自动肽合成仪(430A型；Perkin Elmer，日本，Applied BiosystemsDivision)通过Fmoc固相合成(Carpino，L.A.和Han，G.Y.，(1970)，J.Am.Chem.Soc.，92，5748-5749)来合成下述肽：Arg-Leu-Ser-Ser-Lys-Ser-Val-Asn-Ala-Gln-Val-Thr-Asp-Ile-Asn-Ser-Lys-Gly-Leu (P1：序列表的SEQ ID No.26)；Val-Thr-Asp-Ile-Asn-Ser-Lys-Gly-Leu-Glu-Leu-Arg-Lys-Thr-Val-Thr-Thr-Val-Glu (P2：序列表的SEQ ID No.27)；Glu-Leu-Arg-Lys-Thr-Val-Thr-Thr-Val-Glu-Thr-Gln-Asn-Leu-Glu-Gly-Leu-His-His-Asp (P3：序列表的SEQ ID No.28)；Thr-Gln-Asn-Leu-Glu-Gly-Leu-His-His-Asp-Gly-Gln-Phe-Cys-His-Lys-Pro-Cys-Pro-Pro (P4：序列表的SEQ ID No.29)；Gly-Gln-Phe-Cys-His-Lys-Pro-Cys-Pro-Pro-Gly-Glu-Arg-Lys-Ala-Arg-Asp-Cys-Thr-Val (P5：序列表的SEQ ID No.30)；Gly-Glu-Arg-Lys-Ala-Arg-Asp-Cys-Thr-Val-Asn-Gly-Asp-Glu-Pro-Asp-Cys-Val-Pro-Cys-Gln (P6：序列表的SEQ ID No.31)；Asn-Gly-Asp-Glu-Pro-Asp-Cys-Val-Pro-Cys-Gln-Glu-Gly-Lys-Glu-Tyr-Thr-Asp-Lys-Ala (P7：序列表的SEQ ID No.32)；Glu-Gly-Lys-Glu-Tyr-Thr-Asp-Lys-Ala-His-Phe-Ser-Ser-Lys-Cys-Arg-Arg-Cys-Arg (P8：序列表的SEQ ID No.33)；His-Phe-Ser-Ser-Lys-Cys-Arg-Arg-Cys-Arg-Leu-Cys-Asp-Glu-Gly-His-Gly-Leu-Glu-Val (P9：序列表的SEQ ID No.34)；Leu-Cys-Asp-Glu-Gly-His-Gly-Leu-Glu-Val-Glu-Ile-Asn-Cys-Thr-Arg-Thr-Gln-Asn-Thr (P10：序列表的SEQ ID No.35)；Glu-Ile-Asn-Cys-Thr-Arg-Thr-Gln-Asn-Thr-Lys-Cys-Arg-Cys-Lys-Pro-Asn-Phe-Phe-Cys (P11：序列表的SEQ ID No.36)；Lys-Cys-Arg-Cys-Lys-Pro-Asn-Phe-Phe-Cys-Asn-Ser-Thr-Val-Cys-Glu-His-Cys-Asp-Pro (P12：序列表的SEQ ID No.37)；Asn-Ser-Thr-Val-Cys-Glu-His-Cys-Asp-Pro-Cys-Thr-Lys-Cys-Glu-His-Gly-Ile-Ile-Lys (P13：序列表的SEQ ID No.38)；Cys-Thr-Lys-Cys-Glu-His-Gly-Ile-Ile-Lys-Glu-Cys-Th—Leu-Thr-Ser-Asn-Thr-Lys-Cys (P14：序列表的SEQ ID No.39)；Ser-Ser-Gly-Lys-Tyr-Glu-Gly-Gly-Asn-Ile-Tyr-Thr-Lys-Lys-Glu-Ala-Phe-Asn-Val-Glu (P15：序列表的SEQ ID No.40)；Glu-Cys-Thr-Leu-Thr-Ser-Asn-Thr-Lys-Cys-Lys-Glu-Glu-Gly-Ser-Arg-Ser-Asn (P16：序列表的SEQ ID No.41)；

P1至P15为人Fas胞外域的Nos.1至157氨基酸序列的部分序列，其中在第9和11个氨基酸残基之间彼此重叠。P16为与人Fas之间没有同源性的阴性对照。

把P1至P16分别完全溶解在48μl的二甲亚砜(DMSO)中，然后通过加入752μl含有1mM β-巯基乙醇的PBS来调节每种溶液的最终体积为0.8ml。

除在C-末端添加了一个羧基外，上述每种肽均对应于人Fas分子的胞外域的一部分。用含有10mM 2-巯基乙醇的0.05M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)来稀释每种肽至50μg/ml并把50μl的每种肽引入96-孔ELISA微量板(Nunc)的孔中。在4℃下保持该板放置过夜以便使所说的肽吸附到孔的表面上。

此后，弃去孔中的溶液并用PBS-Tween洗涤每个孔4次。然后向每个孔中加入100μl含有1％(w/v)牛血清白蛋白(A3803；Sigma化学公司)的PBS并在37℃下保温板1小时。然后再用PBS-Tween洗涤孔4次，并向每个孔中加入50μl在PBS中调节至5μg/ml的HFE7A或CH11。然后在37℃下保温板1小时并且再用PBS-Tween洗涤孔4次。洗涤后，在每个孔中加入50μl已用PBS稀释了1000倍的经辣根过氧化物酶标记的山羊抗-小鼠免疫球蛋白抗体(Amersham)，并且再在37℃下保温板1小时，之后用PBS-Tween洗涤孔4次。然后以100μl孔的量加入辣根过氧化物酶的底物(BioRad)，使板在室温下放置15分钟，然后使用微量板读数器(Corona)在415nm下读取每个孔的吸光度。作为阳性对照，使用在参考实施例1中制得的人Fas融合蛋白来代替合成肽。

使用上述方法，应当明确的是只有具有吸附的P11的孔显示出高的吸光度，这表明HFE7A特异性地结合了包含在P11中的氨基酸序列(图3)。(6-2) 通过竞争性测定来鉴别由P11中的HFE7A识别的表位

合成下列肽：

His-Gly-Leu-Glu-Val-Glu-Ile-Asn-Cys-Thr

(P95：序列表的SEQ ID No.42)；

Glu-Ile-Asn-Cys-Thr-Arg-Thr-Gln-Asn-Thr

(P100：序列表的SEQ ID No.43)；

Arg-Thr-Gln-Asn-Thr-Lys-Cys-Arg-Cys-Lys

(P105：序列表的SEQ ID No.1)；

Lys-Cys-Arg-Cys-Lys-Pro-Asn-Phe-Phe-Cys

(P110：序列表的SEQ ID No.44)；

Pro-Asn-Phe-Phe-Cys-Asn-Ser-Thr-Val-Cys-Glu-His-Cys-Asp

(P115L：序列表的SEQ ID No.45)；以及

Gly-Lys-Ile-Ala-Ser-Cys-Leu-Asn-Asp-Asn

(D355-364：序列表的SEQ ID No.46)。

P95，P100，P105及P110为与人Fas的胞外域中的P11对应的氨基酸序列侧翼区的每10个残基的部分序列(对应于人Fas的胞外域的95至128个氨基酸)，其中每种肽与接下来的肽具有5个重叠的氨基酸残基。

想要的肽P115 Pro-Asn-Phe-Phe-Lys-Asn-Ser-Thr-Val-Lys(P115：序列表的SEQ ID No.45的氨基酸Nos.1至10)与10-残基的肽P110之间具有5个残基的重叠区，但是预计到上述肽的溶解性较低，所以在P115的C-末端添加了4个额外的残基以生成P115L。

使用D355-364作阴性对照，该肽与人Fas间没有同源性。

除P115L以外，把每种肽均完全溶解在16μl的DMSO中，然后通过加入784μl含有1 mM 2-巯基乙醇的PBS来调节每种肽的最终体积为0.8ml。把P115L完全溶解在48μl的DMSO中，然后通过加入752μl含有1mM 2-巯基乙醇的PBS来调节最终体积为0.8ml。

将每种上述肽的溶液(对应于200μg的肽)与微管(microtube)中的0.25μg的HFE7A混合并用含有1mM 2-巯基乙醇的PBS调节总体积至100μl。于37℃、在10至20r.p.m.的搅拌下保温该混合物2小时，接下来通过加入FCS至最终浓度为5％、从而生产出肽-抗体混合物。

通过类似于参考实施例2中所述的方法培养WR19L12a细胞。然后通过离心回收细胞并用不含血清的RPMI培养基调整细胞密度为1×10⁷细胞/ml。将细胞悬浮液以100μl/孔的量分配到具有U-型底的96-孔板中，并且在4℃、1,000r.p.m.下使用用于微量板的摆动转子(swing rotor)离心3分钟，然后弃去上清液。接下来，向每个沉淀物中加入100μl的肽-抗体混合物并如上所述用吸管吸取几次加以混合。然后使该板在4℃下放置30分钟，随后离心并弃去上清液。用流式细胞术缓冲液洗涤沉淀物3次，然后在每个孔中加入50μl用流式细胞术缓冲液稀释了250倍的经FITC-标记的山羊抗-小鼠IgG抗体(Kappel)，随后通过轻轻地用吸管吸取以混合孔中的内含物。

在4℃下、于黑暗中将该板放置30分钟，然后离心并弃去上清液。用含有用于组织固定的10％v/v中性缓冲甲醛溶液(Wako纯化工有限公司)的流式细胞术缓冲液洗涤沉淀物3次，该溶液用PBS稀释10倍并在每个孔中加入50μl，用吸管轻轻地吸取进行混合。接下来，在4℃下、将板置于黑暗中至少12小时以固定细胞。

此后，在100μl/孔的流式细胞术缓冲液中悬浮细胞并离心以除去上清液。用流式细胞术缓冲液洗涤沉淀物3次并悬浮在500μl/孔的流式细胞术缓冲液中，用流式细胞仪(Cytoace-150；Nippon Bunko，K.K.-激发波长：488nm；检测波长：530nm)分析得到的悬浮液以计算每个细胞的FITC荧光的平均强度。通过把不含肽-抗体混合物的值取为0％并把含有D355-364的样品的值取为100％来计算针对每个样品的FITC荧光的平均强度。

通过上述步骤，应当明确的是P105能够强烈地抑制HFE7A与WR19L12a细胞的结合，并且与P105的氨基酸序列各重叠了50％的P100和P110对HFE7A与WR19L12a细胞之间结合的抑制分别约为50％和60％。对P95与P115L中的任何一个均观察不到有抑制作用，而且两者也没有与P105共有的重叠区段(图4)。从上述结果应当明确的是P105代表着能够抑制HFE7A与人Fas结合的氨基酸序列，因此必须把针对HFE7A的表位定位在P105中复制的氨基酸序列中。该表位的氨基酸序列为在人Fas与小鼠Fas间保守的区域。

参考实施例7

HFE7A与猴Fas的结合

进行下面的检测以确定HFE7A是否能够结合来自不同灵长类种的Fas抗原。

首先从黑猩猩(Sanwa Kagaku Kenkyujo Kumamoto灵长类公园，40ml)中取外周血样，从日本猴(Macaca fuscata)或从食蟹(crab-eating)猴(Macaca irus)中取上述血样20ml，从(Hapalid属的)绒猴中取样3ml。这些血样中已加入了1ml肝素(Novoheparin；Novo)，然后使样品缓慢地在等体积的菲可帕克溶液[(Pharmacia)比重：食蟹猴的比重为1.072，除此以外的所有灵长类的比重为1.077]上成层，在1,700r.p.m.下离心30分钟以便于获得外周血液的单核细胞的组分。用Hanks’平衡盐溶液洗涤单核细胞组分两次，然后用10％v/vFCS将该组分悬浮在RPMI 1640培养基中至细胞密度为1×10⁶细胞/ml。向得到的悬浮液中加入植物凝集素-P(Sigma化学公司)至最终浓度为5μg/ml，并且在37℃、5％v/v CO₂下温育样品24小时。此后经离心回收细胞，洗涤细胞并将其重新悬浮在含有10％v/v FCS的RPMI 1640培养基中。之后为了激活回收的细胞，向悬浮液中加入白介素-2至最终浓度为10单位/ml，并且在37℃、5％v/vCO₂下温育该悬浮液72小时。

把根据计算含有1×10⁶个活化淋巴细胞的一定量的活化制品放置在试管中，将该制品或者悬浮在50μl溶于PBS的20μg/mlHFE7A中或只悬浮在50μlPBS中。使得到的悬浮液在冰上放置1小时，用500μlPBS的等分试样洗涤细胞3次，再把细胞悬浮在50μl溶于PBS的20μg/ml经FITC-标记的抗-小鼠IgG抗体(Bioresource)中。然后使该悬浮液在冰上放置30分钟并用500μlPBS的等分试样洗涤3次。以悬浮在500μlPBS中的细胞作对照，采用流式细胞仪(Cytoace；Nippon Bunko，K.K.)测量荧光的强度。

得到了根据荧光强度的细胞数目的分布，并且计算出染色细胞的数目与总细胞数目的比值。结果在没有HFE7A的样品中，对所有的物种而言染色细胞的组成均小于3％。但是在用HFE7A处理的样品中至少有17％的细胞被染色，最大值为82％。因此，HFE7A能够结合宽范围的包括人类的灵长类动物的Fas，其中HFE7A最初是从人中制备的。

参考实施例8

在体内鼠T细胞上HFE7A的诱导细胞程序死亡的活性

或仅以500μl的PBS或以0.05或0.1mg的HFE7A单克隆抗体(溶于500μl的PBS中)从腹膜内向由三只6周龄的雌性C3H/HeJ小鼠(来自日本Clea)组成的小组中的成员给药。给药42小时后，用乙醚麻醉这些小鼠，并且摘除其胸腺。用含有10％v/v FCS的RPMI培养基洗涤上述胸腺，随后使用位于筛网(Cell strainer；Falcon)上的刮刀进行破碎。用含有10％v/v FCS的RPMI 1640培养基洗涤破碎的细胞(已通过筛网)两次。

当多于1次的洗涤涉及到本文中的任意一个实施例时，应当了解到除非另有需要的以外，在每次洗涤中用新鲜的进行洗涤的培养基来代替原来的上述培养基。

对如上得到的经洗涤的细胞计数并将其在50μl含有10％v/v FCS的RPMI 1640培养基中调整至1×10⁶个细胞。把每种得到的悬浮液分配到具有U-型底(Nunc)的96-孔微量板的孔中，然后离心(90×g，4℃，10分钟)该板。

弃去上清液，然后把以下两种溶于PBS的荧光-标记的抗体溶液中的一种(a)或(b)加入每个孔中：(a)10μl 0.5mg/ml的经FITC-标记的抗-小鼠CD95(Fas)抗体(Jo2；PharMingen)以及10μl0.5mg/ml的经藻红蛋白(PE)标记的抗-小鼠CD90抗体(Thy-1.2；Cedarlane；CD90为一种仅在T细胞上表达的细胞表面抗原)；(b)10μl 0.5mg/ml的经FITC-标记的抗-小鼠CD4抗体(L3T4；PharMingen)以及10μl 0.2mg/ml的经PE-标记的抗-小鼠CD8抗体(Ly-2；PharMingen)。

在加入抗体混合物以后，振荡板以混合孔中的内含物，然后在离心(90×g，4℃，10分钟)前在冰上放置1小时。在弃去上清液并用100μl/孔的流式细胞术缓冲液洗涤孔两次后，通过加入50μl/孔的3.7％v/v甲醛溶液来固定细胞，然后在冰上使该细胞放置10分钟。在进一步离心(90×g，4℃，10分钟)以除去上清液后，细胞沉淀物再一次用100μl/孔的流式细胞术缓冲液洗涤并悬浮在100μl/孔的流式细胞术缓冲液中。采用如此从每个孔得到的细胞悬浮液作样品，在如下条件下使用流式细胞仪(Epics Elite；Coulter)来测量1×10⁴个细胞的样品的荧光：激发波长：488nm；检测波长：530nm(FITC)或600nm(PE)。

然后可以制备出针对每个样品的细胞群的FITC和PE的荧光分布。对于加入了抗体混合物(a)的样品而言，计算出对Fas和CD90呈阳性(下文称作“Fas⁺CD90⁺”)的细胞数与总细胞数的比值。类似地，对于加入了抗体混合物(b)的样品而言，计算出对CD4和CD8呈阳性(下文称作“CD4⁺CD8⁺”)或者对CD4呈阳性但对CD8呈阴性(下文称作“CD4⁺CD8^-”)的细胞数与总细胞数的比值。

该结果以百分比显示在下面的表1中。

表1

细胞	Fas⁺CD90⁺	CD4⁺CD8⁺	CD4⁺CD8^-
细胞	Fas⁺CD90⁺	CD4⁺CD8⁺	CD4⁺CD8^-	仅有PBS	76.2	62.6	11.7
HFE7A 0.05mg	2.3	1.9	1.2	仅有PBS	76.2	62.6	11.7
HFE7A 0.05mg	2.3	1.9	1.2	HFE7A 0.1mg	1.7	2.8	0.7

与仅施用PBS的小组相比，在来自施用HFE7A的小组的小鼠胸腺细胞中表达Fas的T细胞(Fas⁺CD90⁺)的比值在两种剂量下显著下降。此外，与仅施用PBS的小组相比，在施用HFE7A后已知用于基本的Fas表达的CD4⁺CD8⁺和CD4⁺CD8^-的细胞群在数量上也有显著的下降。

由此推导出抗-Fas单克隆抗体HFE7A对于表达Fas的T细胞具有体内的诱导细胞程序死亡的活性。

参考实施例9

HFE7A对自身免疫疾病模型的作用

使用MRL gld/gld小鼠来检测施用抗-Fas单克隆抗体HFE7A对自身免疫疾病症状的作用。上述小鼠携带了Fas配体基因的突变体并且充当了类似于全身性红斑狼疮这样的自身免疫疾病的动物模型。

用单一剂量的在参考实施例3中制备的0.2或0.5mg的HFE7A单克隆抗体(溶于500μlPBS中)或仅用500μl的PBS经腹膜内处理18周龄的MRLgld/gld小鼠(来自日本SLC，K.K.)。

通过以脚踝的肿胀作为自身免疫疾病的症状来监测每只测试小鼠。计算并且记录下每个小组随时间的肿胀程度[c.f.Shin Yonehara，(1994)，Nikkei ScienceBessatsu，110，66-77]。用HFE7A给药后观察到了脚踝肿胀程度的显著下降。

从测试小鼠中摘除胸腺，并通过在以上参考实施例8中所述的方法测定胸腺中表达Fas的T细胞的比例。上述结果表明根据参考实施例8的结果在施用HFE7A后胸腺中表达Fas的T细胞的数目明显减少。

参考实施例10

肝脏毒性测试

将单一剂量的下述物质之一腹膜内施用给BALB/c小鼠：

i)溶于500μlPBS的0.2mgHFE7A；

ii)溶于500μlPBS的0.5mgHFE7A；

iii)溶于500μlPBS的0.1mgJo2(PharMingen)；以及

iv)仅500μl的PBS。

在上述物质中，Jo2是一种具有诱导细胞程序死亡活性的已知的抗-小鼠Fas抗体。在给药后的8小时、24小时或72小时从小鼠的后主动脉中抽取血液。对于经Jo2处理的小鼠而言，当它们仍存活时在给药后的3小时抽取血液。所有的血液均是在轻度乙醚麻醉的情况下抽取的。使用自动分析仪(7250型；Hitachi Seisakusyo，K.K.)以及用于该分析仪的合适的试剂(转氨酶-HRII；Wako纯化工有限公司)来对每个血样测量谷草转氨酶(GOT)及谷丙转氨酶(GPT)的血液含量。结果，经Jo2处理的小组表明在3小时后GOT和GPT值迅速上升，而用HFE7A处理的小组的相应值变化很小，类似于仅用PBS处理的小组(图5)。从上述结果可以明确的是HFE7A没有诱导急性肝障碍

参考实施例11

对暴发性肝炎模型的作用

已知在腹膜内施用抗-小鼠Fas抗体Jo2时，小鼠将发展为暴发性肝炎并在几个小时内死亡[Ogasawara，J.，等人，(1993)，自然，364，806]。因此，为了评价HFE7A对由Jo2引起的肝病的影响，通过与施用Jo2的同时或者之后施用HFE7A来测试小鼠的生存力。

雌性6周龄的BALB/c小鼠(每组三只小鼠；来自日本SLC)接受如下的抗体制品的腹膜内给药：

(A)溶于0.5mlPBS的0.1mgJo2；

(B)溶于0.5mlPBS的0.01mgJo2；

(C)溶于0.5mlPBS的0.1mgJo2和0.5mgHFE7A(同时给药)；(D)溶于0.5mlPBS的0.1mgJo2和0.05mgHFE7A(同时给药)；以及(E)溶于0.2mlPBS的0.01mgJo2，接下来在20分钟后将溶于0.2mlPBS的0.1mg的HFE7A给药；然后随时间观察上述小鼠。结果示于图6中。

当单独施用Jo2时，所有的小鼠在9小时内全部死亡，不管是施用0.1mg或0.01mgJo2/小鼠时，即上面的小组(A)和(B)的小鼠在给药的9小时内全部死亡。与此相反，当同时施用HFE7A与Jo2时(0.5mg/小鼠以及0.05mg/小鼠)、即上面的小组(C)和(D)，这些小鼠甚至在给药后几周内也未表现出紊乱，这表明施用HFE7A可以阻断暴发性肝炎的发展。而且，即使当在施用Jo2后20分钟施用HFE7A时，小鼠仍保持正常且没有明显症状的发展。

因此，HFE7A对涉及在肝脏及其它器官中由Fas/Fas配体系统介导的正常组织发生紊乱的多种疾病具有预防和治疗作用。

参考实施例12

对类风湿关节炎的作用1) 对胶原引起的关节炎发展的预防作用

把由雌性BALB/c小鼠和雄性DBA/1J小鼠交配得到的F1小鼠(CD1F1小鼠，6周龄，雌性，来自日本CharlesRiver，K.K.)驯养1周。此后用胶原处理该小鼠以引发关节炎。

更具体地讲，该方法是基于文献[c.f.Phadke，K.，(1985)，免疫药物学，10，51-60]中描述的一种方法。在该方法中，再用50mM醋酸将0.3％w/v的II型牛胶原溶液(Collgen Gijutsu Kensyukai，在50mM醋酸溶液中提供)稀释至0.2％(2mg/ml)，然后用等体积的弗氏完全佐剂(Difco)进行乳化。然后在靠近尾巴的部位以100μl的量(对应于100μg的II型牛胶原)经皮内施用该乳剂，其中使用装有结核菌素针头的1ml塑料注射器在用于静脉注射的固定设备中进行这一操作。在初次攻击后1周，在类似的条件下施用相同的加强剂量。

在加强注射的同时，腹膜内注射100μg的HFE7A或作为对照的溶于0.5mlPBS的小鼠IgG(每组6只小鼠)。在初次攻击后的起始5周内通过肉眼监测肢体的肿胀。基于Wood，F.D.等人的方法[Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.，(1969)，35，456-467]来计算肢体关节肿胀程度的得分。因此，在计算每种肢体的得分中使用以下的标准：得分

0：无症状；

1：仅有一处小关节(例如脚趾)的肿胀和发红；有2或多个小关节或者一个相对大的关节(例如脚踝)的肿胀和发红；以及

3：肢体完全的肿胀和发红。

因此，对于一种动物而言的最高得分为当四肢全部肿胀的时候，其得分为12。把对四肢而言得分至少为1的动物命名为“染病鼠”。结果示于图7中。

在施用了非特异性的小鼠IgG的对照组中，到初次攻击后第7周时所有的小鼠全部染病，而在施用HFE7A的组中，直至第8周时仍有半数的小鼠表现出没有任何关节发红(图7A)。另外，与对照组相比，经HFE7A处理的小组平均得分较低(图73)。2) 在来自类风湿病人的滑膜细胞中诱导细胞程序死亡

评价了HFE7A对来自患有类风湿的病人中滑膜细胞的生存力的影响。该方法如下所述，使用线粒体的减数分裂能力作指征。

用剪刀在补充有10％v/v FCS(Summit)的Dulbecco改进的Eagle培养基(Gibco)中把从患有类风湿关节炎的病人的染病区得到的滑膜组织剪成小片。除去脂肪，然后加入胶原酶(Sigma化学公司)至最终浓度为5μg/ml，在37℃、5％v/vCO₂下保温该混合物90分钟。然后将所得到的经保温的细胞用作其余实验的滑膜细胞。

通过在37℃下用0.05％w/v的胰蛋白酶水溶液处理上述得到的滑膜细胞2分钟，从而将其分散为单个细胞，然后将该细胞悬浮在含有10％v/v FCS的Dulbecco改进的Eagle培养基中至细胞密度为1×10⁵/ml。然后以每孔2×10⁴细胞/200μl的量将上述细胞悬浮液分配到96-孔板的孔中，并在37℃、5％v/vCO₂下温育6天。弃去培养物上清液并用Hank’s缓冲液(Gibco)洗涤细胞3次。在洗涤后，向每个孔中加入200μl含有10％v/v FCS的Dulbecco改进的Eagle培养基以及介于10和1,000ng/ml之间的HFE7A(连续10倍地稀释)，并且再在37℃、5％v/vCO₂下温育该板20小时。接下来，向每个孔中加入50μl 1mg/mlXTT(2，3-双[2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基]-2H-四唑-5-carboxanilide内盐；Sigma化学公司)的水溶液以及25μM的PMS(吩嗪N-甲硫酸盐(phenazine methosulfate)；Sigma化学公司)(最终浓度：250μg/mlXTT和5μM PMS)。再在37℃、5％v/v CO₂下保温4小时后，在450nm下读取每个孔的吸光度。

根据下式计算每个孔中细胞的生存力：

生存力(％)＝100×(a-b)/(c-b)，其中“a”为测试孔的吸光度，“b”为没有细胞的孔的吸光度，“c”为没有加入抗体的孔的吸光度。

结果示于表2中。HFE7A以依赖剂量的方式抑制来自类风湿病人的滑膜细胞的生存。

表2

HFE7A的浓度(ng/ml)	平均生存力(％)
HFE7A的浓度(ng/ml)	平均生存力(％)	0	100
10	91	0	100
10	91	100	77
1000	42	100	77

实施例1

设计人源化型式(version)的HFE7A抗体(1) 建立HFE7A的可变区的分子模型

通过通常称作同源性模型建立的方法[酶学方法，203，121-153，(1991)]来建立HFE7A的可变区的分子模型。

将已进行了X-射线晶体学检验并在蛋白质数据库(下文称作“PDB”；化学部，555大楼，Brookhaven国家实验室，邮政信箱5000，Upton，NY11973-5000，美国)中登过记的人免疫球蛋白的可变区的一级序列与以上测定的HFE7A的构架区进行比较。结果对于轻链和重链而言，分别挑选出1GGI和2HFL，因为它们具有最高同源性的构架区三维结构。通过联合1GGI和2HFL的性质并且如下所述通过计算HFE7A的该区域的性质便产生出构架区的三维结构，从而得到了“构架模型”。

采用由Chothia等人所述的分类法，可以把HFE7A的CDR分类如下：CDRL₂，CDRL₃及CDRH₁均属于规范类别1，而CDRL₁，CDRH₂及CDRH₃目前看来不属于任何具体的规范类别。把CDRL₂，CDRL₃及CDRH₁的CDR环归因为其各自的规范类别所固有的构象，然后将其整合到构架模式中。按照Thornton等人[分子生物学杂志，263，800-815，(1996)]的分类法，将CDRL₁指定为15B簇(cluster)的构象。对于CDRH₂及CDRH₃而言，从PDB中选出具有高同源性的序列的构象，然后将上述构象与能量计算的结果相结合。然后取出具有最大可能性的CDR环的构象并将其结合到构架模型之中。

最后，进行能量计算以减少就能量而言属于不恰当的原子之间不希望有的接触，从而得到HFE7A的完整的分子模型。尽管可以使用其它任意的合适的系统，本发明使用了可以商购的普通的建立分子模型系统AbM(牛津分子有限公司)来进行上面的步骤。

对于得到的分子模型而言，使用软件PROCHECK[应用晶体学杂志，(1993)；6，283-291]进一步评价结构的准确性，并且计算每个残基的表面暴露的程度来确定哪个表面原子和基团可与之发生反应。(2) 选择受体

通过与人抗体各自亚型的共有序列进行比较，HFE7A的轻链和重链的亚型与亚型κIV之间分别享有79％的同一性，并且与亚型I之间也有79％的同一性。但是没有联合了κIV轻链及亚型I重链的人抗体。因此把具有亚型κIII的轻链和亚型I的重链(与HFE7A的轻链和重链间分别有72％和77％的序列同一性)的8E10’CL选为单一的人抗体，其中该人抗体的轻链和重链与HFE7A的轻链和重链间均有大于70％的同一性。(3) 选择待移植到受体上的供体残基

采用软件Cameleon(牛津分子有限公司)，将HFE7A的轻链和重链的每条链的氨基酸序列与8E10’CL的相应链的氨基酸序列进行序列比较，并且根据上面a)至e)中设定的一般路线通过如在以下的实施例中所述的方法来制备可变区的人源化序列。构建了可以起到重组载体作用的质粒，该质粒包括编码人源化的抗-人Fas抗体的DNA核苷酸序列。

实施例2

制备编码人源化的轻链的DNA(1) 克隆编码全长的人的轻链(κ链)的cDNA

在使小鼠的抗-人Fas抗体HFE7A的轻链氨基酸序列人源化之前，先进行包括恒定区的人免疫球蛋白的轻链的cDNA克隆。

1) 合成引物

通过PCR制备编码人的轻链的cDNA。针对PCR，合成了以下两个引物：

5′-GCGAATTCTG CCTTGACTGA TCAGAGTTTC CTCA-3′(HVKII5-4：序列表的SEQIDNo.47)；和

5′-GCTCTAGATG AGGTGAAAGA TGAGCTGGAGGA-3′(HKCL3-3：序列表的SEQ ID No.48)。

2) 构建含有人免疫球蛋白轻链cDNA的质粒

通过PCR制备编码全长的人免疫球蛋白轻链的cDNA，把该cDNA插入质粒并克隆到大肠杆菌中。

在下述条件下制备编码全长的人免疫球蛋白轻链的HL-DNA片段：PCR反应溶液的组成：人淋巴细胞的cDNA文库(Life Technologies)，25ng；寡核苷酸引物HVKII5-4，50pmol；寡核苷酸引物HKCL3-3，50pmol；25mMdNTP混合物，10μl；100mMTris-HCl缓冲液(pH8.5)，10μl；1M氯化钾[KCl]，5μl；25mM氯化镁[MgCl₂]，10μl；Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer日本)，1单位；双蒸水至总体积为100μl。

该PCR反应如下进行。首先将溶液在94℃下加热2分钟，之后重复94℃下1分钟、55℃下1分钟以及72℃下2分钟的加热循环30次。在完成这一步骤后，在72℃下加热反应溶液10分钟。

按照厂家的方案使用真核生物TA克隆试剂盒(Invitrogen)把以上制备的HL-DNA(人的轻链DNA)片段插入质粒pCR3DNA中，并且按照试剂盒中的说明将上述片段导入包含在该试剂盒中的处于感受态的大肠杆菌TOP10F’中。因而便得到了携带HL-DNA片段(即针对人免疫球蛋白轻链的cDNA)的质粒pHL15-27。(2) 构建HFE7A抗体的人源化型式的轻链的表达载体

1) 构建人源化的HFE7A轻链的表达质粒载体

小鼠的抗-人Fas抗体HFE7A的轻链氨基酸序列的人源化必须要用丙氨酸和精氨酸分别置换从该轻链氨基酸序列的N-末端(下文称作“I区”)算起的第47位氨基酸(脯氨酸)及第49位氨基酸(赖氨酸)。丙氨酸(47)和精氨酸(49)在人的轻链(κ链)中是保守的。也可以进行进一步的人源化，并且该操作必须用丝氨酸、精氨酸、亮氨酸、脯氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸(因为这些氨基酸在人的轻链(κ链)中也是保守的)分别置换第80位氨基酸(组氨酸)、第81位氨基酸(脯氨酸)、第82位氨基酸(缬氨酸)、第84位氨基酸(谷氨酸)、第85位氨基酸(谷氨酸)、第87位氨基酸(丙氨酸)以及第89位氨基酸(苏氨酸)(下文称作“II区”)。

当I区和II区均被人源化后，该序列便命名为“HH型”。

当仅有I区被人源化时，该序列命名为“HM型”。

当两个区域均未被人源化时，该序列命名为“MM型”。

分别携带了来自抗-人Fas抗体HFE7A的上述3种人源化的轻链氨基酸序列的表达质粒构建如下。

(2) 合成用于制备人源化HFE7A的轻链的可变区和恒定区的引物

使用PCR来构建下面的DNA序列，其中每个序列都包括上述HH、HM或MM序列中的一种以及人免疫球蛋白轻链(κ链)的恒定区：编码HH型多肽链(序列表的SEQ ID No.50)的DNA(序列表的SEQ IDNo.49)；编码HM型多肽链(序列表的SEQ ID No.52)的DNA(序列表的SEQ IDNo.51)；和编码MM型多肽链(序列表的SEQ ID No.54)的DNA(序列表的SEQ IDNo.53)。

合成了以下13种寡核苷酸的PCR引物：5′-CCCAAGCTTA AGAAGCATCC TCTCATCTAG TTCT-3′(7AL1P； SEQ ID No.55)；5′-GAGAGGGTGG CCCTCTCCCC TGGAGACAGA GACAAAGTAC CTGG-3′(7AL1N；SEQ ID No.56)；5′-CCAGGTACTT TGTCTCTGTC TCCAGGGGAG AGGGCCACCC TCTC-3′(7AL2P；SEQ ID No.57)；5′-GATTCGAGAT TGGATGCAGC ATAGATGAGG AGTCTGGGTG CCTG-3′(7AL2N；SEQ ID No.58)；5′-GCTGCATCCA ATCTCGAATC TGGGATCCCA GACAGGTTTA GTGGC-3′(7AL3PA；SEQ ID No.59)；5′-AAATCCGCC GGCTCCAGAC GAGAGATGGT GAGGGTGAAG TCTGTCCCAG AC-3′(7AL3N；SEQ ID No.60)；5′-CTCGTCTGGA GCCGGCGGAT TTTGCAGTCT ATTACTGTCA GCAAAGTAAT GAGGATCC-3′(7AL4P；SEQ ID No.61)；5′-TGAAGACAGA TGGTGCAGCC ACAGTCCGTT TGATTTCCAG CCTGGTGCCT TGACC-3′(7AL4N；SEQ ID No.62)；5′-GGTCAAGGCA CCAGGCTGGA AATCAAACGG ACTGTGGCTG CACCATCTGT CTTCA-3′(7ALCP；SEQ ID No.63)；5′-CCCGAATTCT TACTAACACT CTCCCCTGTT GAAGCTCTTT GTGAC-3′(7ALCN；SEQ ID No.64)；5′-TCTGTCCCAG ACCCACTGCC ACTAAACCTG TCTGGGATCC CAGATTCGAG ATTGG-3′(M7AL2N；SEQ ID No.65)；5′-GTTTAGTGGC AGTGGGTCTG GGACAGACTT CACCTCTACC ATCCATCCTG TGGAG-3′(M7AL3PA；SEQ ID No.66)； and5′-ATGGTGCAGC CACAGTCCGT TTGATTTCCA GCCTGGTGCC TTGACCGAAC GTCCG-3′(7AL4NA；SEQ ID No.67).3) 构建质粒p7AL-HH(人源化的HH型HFE7A的轻链的表达质粒)

通过进行三步PCR来制备编码序列表的SEQ ID No.50的氨基酸序列的VHH-DNA片段(序列表的SEQ ID No.49)，然后将该片段插入质粒载体并克隆到大肠杆菌中。

a)第一步PCR

在图8中显示出用于制备VHH-DNA的第一步PCR的示意图。

如下制备出已被改造为在5’-末端含有一个Hind III限制酶切位点的编码一个分泌信号序列以及一部分FRL₁区的L7A1-DNA片段。PCR反应溶液的组成：质粒pME-LDNA，200ng；寡核苷酸引物7AL1P，80pmol；寡核苷酸引物7AL1N，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶(Stratagen)，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

如下进行PCR反应。首先将溶液在94℃下加热2分钟，之后重复94℃下1分钟、55℃下1分钟以及72℃下2分钟的加热循环30次。在完成这一步骤后，在72℃下加热反应溶液10分钟。

如下制备出编码一部分FRL₁、CDRL₁、FRL₂以及一部分CDRL₂区的L7A2-DNA片段。PCR反应溶液的组成：质粒pME-LDNA，200ng；寡核苷酸引物7AL2P，80pmol；寡核苷酸引物7AL2N，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

如下制备出编码CDRL₂以及一部分FRL₃的L7A3-DNA片段。PCR反应溶液的组成：质粒pME-LDNA，200ng；寡核苷酸引物7AL3PA，80pmol；寡核苷酸引物7AL3N，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

如下制备出编码一部分FRL₃、CDRL₃、FRL₄以及一部分恒定区的L7A4-DNA片段。PCR反应溶液的组成：质粒pME-LDNA，200ng；寡核苷酸引物7AL4P，80pmol；寡核苷酸引物7AL4N，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

如下制备出已被改造为在3’-末端具有一个EcoRI限制酶切位点的编码一部分FRL₄以及恒定区的L7A5-DNA片段。PCR反应溶液的组成：质粒pHL15-27DNA，200ng；寡核苷酸引物7ALCP，80pmol；寡核苷酸引物7ALCN，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

向200μl的各种PCR产物中加入等体积的苯酚-氯仿(用水饱和的50％v/v苯酚，48％v/v氯仿，2％v/v异戊醇)并用力混合1分钟。此后，在10,000×g下离心混合物，回收水层并与等体积的氯仿-异戊醇(96％v/v氯仿和4％v/v异戊醇)混合，再次用力混合1分钟。在10,000×g下离心得到的混合物，并回收水层(在该段中引用的一系列步骤在本文中称作“苯酚提取”)。

然后对回收的水层进行乙醇沉淀。正如本文所使用及命名的那样，“乙醇沉淀”由在混合下向待处理的溶液中加入1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和2.5体积的100％乙醇以及使用干冰冷冻该混合物所组成。然后在10,000×g下离心得到的混合物以回收沉淀物DNA。

在苯酚提取及乙醇沉淀后，真空干燥得到的DNA沉淀，把该沉淀溶解在极少量的双蒸水中并通过5％w/v的聚丙烯酰胺凝胶电泳加以分离。在电泳后，用1μg/ml的溴化乙锭水溶液给凝胶染色以便于可以在紫外光下检测DNA。用剃刀刀片切下对应于L7A1-DNA、L7A2-DNA、L7A3-DNA、L7A4-DNA和L7A5-DNA的DNA带，并且如上所述使用Centriruter和Centricon-10从凝胶中进行洗脱。然后通过在7,500×g下离心来浓缩洗脱的DNA，接下来进行乙醇沉淀，最后将该DNA溶解在50μl的蒸馏水中。

b)第二步PCR

在图9中显示出用于生产VHH-DNA的第二步PCR的示意图。

如下制备出其中融合了上述L7A1-DNA和L7A2-DNA片段的L7A1.2-DNA。PCR反应溶液的组成：在第一步PCR中制备的L7A1-DNA溶液，10μl；在第一步PCR中制备的L7A2-DNA溶液，10μl；寡核苷酸引物7AL1P，80pmol；寡核苷酸引物7AL2N，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

如下制备出其中融合了上述L7A4-DNA和L7A5-DNA片段的L7A4.5-DNA。PCR反应溶液的组成：在第一步PCR中制备的L7A4-DNA溶液，10μl；在第一步PCR中制备的L7A5-DNA溶液，10μl；寡核苷酸引物7AL4P，80pmol；寡核苷酸引物7ALCN，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

首先，在PCR扩增的L7A1.2-DNA和L7A4.5-DNA片段上进行苯酚提取及随后的乙醇沉淀，然后通过5％w/v的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离上述片段。在电泳后，用1μg/ml的溴化乙锭给凝胶染色，用剃刀刀片切下在紫外光下检测的带，并且如上所述使用Centriruter和Centricon-10从凝胶中进行洗脱。先通过在7,500×g下离心来浓缩洗脱的DNA，随后进行乙醇沉淀，然后将该DNA溶解在50μl的蒸馏水中。

c)第三步PCR

在图10中显示出用于生产VHH-DNA的第三步PCR的示意图。

如下制备出其中融合了上述L7A1.2-DNA和L7A4.5-DNA片段以及L7A3-DNA的VHH-DNA片段。PCR反应溶液的组成：在第二步PCR中制备的L7A1.2-DNA溶液，10μl；在第二步PCR中制备的L7A4.5-DNA溶液，10μl；在第一步PCR中制备的L7A3-DNA溶液，10μl；寡核苷酸引物7AL1P，80pmol；寡核苷酸引物7ALCN，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

在5％w/v的聚丙烯酰胺电泳凝胶上进行分离之前，使PCR扩增的VHH-DNA片段先进行苯酚提取、然后进行乙醇沉淀。在电泳后，用1μg/ml的溴化乙锭给凝胶染色，用剃刀刀片切下在紫外光下检测的VHH-DNA带，并且如上所述使用Centriruter和Centricon-10从凝胶中进行洗脱。通过在7,500×g下离心来浓缩洗脱的DNA，然后进行乙醇沉淀，最后将该DNA溶解在50μl的蒸馏水中。

在图11中列出了构建携带有VHH-DNA片段的表达质粒的示意图。

通过苯酚提取以及随后的乙醇沉淀来进一步纯化上面得到的VHH-DNA片段，然后用限制酶Hind III和EcoRI消化该片段。

用限制酶Hind III和EcoRI消化1μg的克隆质粒pHSG399DNA(TakaraShuzo有限公司)，然后用碱性磷酸酶(从小牛小肠得到；下文简称为CIP)使该质粒DNA去磷酸化。采用厂家的方案使用2.0型DNA连接试剂盒(TakaraShuzo有限公司)来连接得到的去磷酸化质粒pHSG399 DNA和被消化的VHH-DNA片段。

通过乙醇沉淀回收连接的DNA，将该DNA溶解在5μl的双蒸水中，然后与大肠杆菌JM109 Electro-细胞(Takara Shuzo有限公司)混合。把该混合物转移到一个基因脉冲发生器/大肠杆菌脉冲发生器小室，0.1厘米(BioRad)中，然后通过厂家的方案(在该段中的一系列步骤在本文中称作“转化”)采用基因脉冲发生器II(BioRad)以连接混合物来转化大肠杆菌JM 109。

在转化后，将该细胞涂布在LB琼脂培养基上[细菌培养用胰化蛋白胨(Difco)10 g，细菌培养用酵母提取物(Difco)5g，NaCl 10g，细菌培养用琼脂(Difco)15g；溶解在蒸馏水中，足量至11]，其中该培养基含有最终浓度为1mM的IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷；Takara Shuzo有限公司)、0.1％w/v的X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷；Takara Shuzo有限公司)和50μg/ml的氯霉素，并在37℃下温育该平板过夜以得到大肠杆菌转化子。

在37℃下在2ml液体LB培养基中培养得到的任何白色的转化子过夜并通过碱性-SDS方法[Sambrook，J.，等人，(1989)，在“分子克隆：实验室手册(第2版)”，冷泉港实验室出版]从得到的培养物中提取质粒DNA。

用限制酶Hind III和EcoRI消化提取得到的质粒DNA，然后通过1％w/v琼脂糖凝胶电泳选出携带有VHH-DNA片段的克隆。

由此得到了携带有人源化HH型HFE7A轻链的可变区以及编码人免疫球蛋白κ链的恒定区的DNA的融合片段的质粒pHSGHH7。含有质粒pHSGHH7的转化子大肠杆菌pHSGHH7 SANK 73497已在1997年8月22日按照布达佩斯条约保藏在Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo中，保藏号为FERM BP-6073。

采用上述质粒pHSGHH7，那么就可能构建出携带有序列表SEQ ID No.49的DNA并编码序列表SEQ ID No.50的人源化的HH型HFE7A轻链多肽的表达载体质粒p7AL-HH。

用限制酶Hind III和EcoRI消化1μg的pEE.12.1 DNA(Lonza)，其中该DNA为一种用于哺乳动物细胞的表达载体，然后用CIP使该DNA去磷酸化。使用一种2.0型的DNA连接试剂盒(Takara Shuzo有限公司)将得到的经消化的去磷酸化质粒DNA(100ng)与10μg的已用Hind III和EcoRI消化的pHSGHH7 DNA片段连接起来。然后用该连接混合物转化大肠杆菌JM109(如上所述)，之后将该细胞涂布在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上。

在37℃下，在2ml含有50μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中培养由该方法得到的转化子过夜，随后通过碱性-SDS方法从得到的培养物中提取质粒DNA。

用Hind III和EcoRI消化提取到的质粒DNA，并使该质粒DNA进行1％w/v的琼脂糖凝胶电泳以证实是否存在感兴趣的插入片段。这样便可以分离出质粒p7AL-HH，其中该质粒含有具有人源化的HH型HFE7A轻链的可变区以及编码人免疫球蛋白κ链的恒定区的DNA的融合片段。人们发现该融合片段位于以正确取向的巨细胞病毒(CMV)启动子的下游。

4) 构建质粒p7AL-HM(人源化的HM型HFE7A的轻链的表达质粒)

通过进行三步PCR来生产编码序列表SEQ ID No.52的氨基酸序列的序列表SEQ ID No.51的VHM-DNA片段，将该片段插入质粒载体、然后克隆到大肠杆菌中。

a)第一步PCR

在图12中显示出用于制备VHM-DNA片段的第一步PCR的示意图。

在该方法中使用了在5’-末端添加有一个Hind III限制酶切位点的编码一个分泌信号序列和一部分FRL₁的L7A1-DNA片段，编码一部分FRL₁、CDRL₁、FRL₂和一部分CDRL₂的L7A2-DNA片段以及在3’-末端添加有一个EcoRI位点的编码一部分FRL₄和恒定区的L7A5-DNA片段，并且它们为在上述(2)的VHH-DNA片段的制备过程中得到的那些片段。

如下制备出编码CDRL₂、FRL₃、CDRL₃、FRL₄和一部分恒定区的ML7A3-DNA片段。PCR反应溶液的组成：质粒pME-LDNA，200ng；寡核苷酸引物7AL3PA，80pmol；寡核苷酸引物7AL4NA，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

首先，使该PCR产物进行苯酚提取及随后的乙醇沉淀，然后通过5％w/v的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。在电泳后，用1μg/ml的溴化乙锭给凝胶染色，用剃刀刀片切下在紫外光下检测的对应于ML7A3-DNA的DNA带，并且如上所述使用Centriruter和Centricon-10从凝胶中进行洗脱。先在7,500×g下离心来浓缩洗脱的DNA，随后进行乙醇沉淀，然后将该DNA溶解在50μl的蒸馏水中。

b)第二步PCR

在图13中显示出用于制备VHM-DNA的第二步PCR的示意图。

如下制备出包含上述L7A1.2-DNA，ML7A3-DNA以及L7A5-DNA片段的VHM-DNA融合片段。PCR反应溶液的组成：在第二步PCR中制备的L7A1.2-DNA溶液，10μl；在第一步PCR中制备的ML7A3-DNA溶液，10μl；在第一步PCR中制备的L7A5-DNA溶液，10μl；寡核苷酸引物7AL1P，80pmol；寡核苷酸引物7ALCN，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

首先，对得到的扩增的VHM-DNA片段进行苯酚提取及随后的乙醇沉淀，然后通过5％w/v的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。在电泳后，用1μg/ml的溴化乙锭给凝胶染色，用剃刀刀片切下如此检测到的VHM-DNA带，并且如上所述使用Centriruter和Centricon-10从凝胶中进行洗脱。在7,500×g下离心来浓缩洗脱的DNA，接下来进行乙醇沉淀，然后将该DNA溶解在50μl的蒸馏水中。

在图14中列出了构建携带有VHM-DNA片段的表达质粒的示意图。

通过苯酚提取以及随后的乙醇沉淀来进一步纯化上面得到的VHM-DNA，然后用限制酶Hind III和EcoRI进行消化。

用限制酶Hind III和EcoRI消化1μg的克隆质粒pHSG399DNA(TakaraShuzo有限公司)，然后用CIP使该质粒DNA去磷酸化。之后，使用2.0型DNA连接试剂盒(Takara Shuzo有限公司)把得到的去磷酸化的pHSG399DNA和已用Hind III和EcoRI消化的VHM-DNA连接起来。然后，用连接的DNA转化大肠杆菌JM109并将该细胞涂布在含有最终浓度为1mM IPTG、0.1％w/v X-Gal和50μg/ml氯霉素的LB琼脂培养基上。在37℃下在2ml含有50μg/ml氯霉素的液体LB培养基中培养得到的白色的转化子过夜，并且通过碱性-SDS方法从得到的培养物中提取质粒DNA。然后用Hind III和EcoRI消化提取到的质粒DNA，并采用1％w/v琼脂糖凝胶电泳选出携带有VHM-DNA片段的克隆。

因此得到了携带有人源化HM型HFE7A轻链的可变区以及编码人Igκ链的恒定区的DNA的融合片段的质粒pHSGHM17。含有质粒pHSGHM17的转化子大肠杆菌pHSGHM17 SANK 73597已在1997年8月22日按照布达佩斯条约保藏在Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo中，保藏号为FERMBP-6072。

采用上述质粒pHSGHM17，构建出携带有序列表SEQ ID No.51的DNA并编码序列表SEQ ID No.52的人源化的HM型HFE7A轻链多肽的表达载体质粒p7AL-HM。

用限制酶Hind III和EcoRI消化1μg的pEE.12.1 DNA(Lonza)，其中该DNA为一种用于哺乳动物细胞的表达载体，然后用CIP使该DNA去磷酸化。使用一种2.0型DNA连接试剂盒(Takara Shuzo有限公司)将得到的消化的去磷酸化质粒DNA(100ng)与10μg的已用Hind III和EcoRI消化的pHSGHM17-DNA片段连接起来。然后用该连接混合物转化大肠杆菌JM109(如上所述)，之后将该细胞涂布在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上。

用Hind III和EcoRI消化提取到的质粒DNA，并使该质粒DNA进行1％w/v的琼脂糖凝胶电泳以证实是否存在感兴趣的插入片段。这样便可以分离出质粒p7AL-HM，其中该质粒含有具有人源化的HM型HFE7A轻链的可变区以及编码人免疫球蛋白κ链的恒定区的DNA的融合片段。人们发现该融合片段位于以正确取向的巨细胞病毒(CMV)启动子的下游。

5) 构建质粒p7AL-MM(人源化的MM型HFE7A的轻链的表达质粒)

通过进行三步PCR来生产编码序列表SEQ ID No.54的氨基酸序列的序列表SEQ ID No.53的VMM-DNA片段，把该片段插入质粒载体、然后克隆到大肠杆菌中。

a)第一步PCR

在图15中显示出用于制备VMM-DNA的第一步PCR的示意图。

如在上述(2)制备VHH-DNA片段中所得到的编码一个分泌信号序列和一部分FRL₁并在5’-末端添加了一个Hind III限制酶切位点的L7A1-DNA片段，以及在3’-末端添加有一个EcoRI限制位点的编码一部分FRL₄和恒定区的L7A5-DNA片段。在构建VMM-DNA的第一步PCR中使用了上述片段。

如下制备出编码一部分FRL₁、CDRL₁、FRL₂、CDRL₂以及一部分FRL₃的ML7A2M-DNA片段。PCR反应溶液的组成：质粒pME-LDNA，200ng；寡核苷酸引物7AL2P，80pmol；寡核苷酸引物M7AL2N，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

如下制备出编码一部分FRL₃、CDRL₃、FRL₄以及一部分恒定区的ML7A3M-DNA片段。PCR反应溶液的组成：质粒pME-LDNA，200ng；寡核苷酸引物M7AL3PA，80pmol；寡核苷酸引物7AL4NA，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

首先，使该PCR产物进行苯酚提取及随后的乙醇沉淀，然后通过5％w/v的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。在电泳后，用1μg/ml的溴化乙锭给凝胶染色，用剃刀刀片切下由紫外光检测的对应于ML7A2M-DNA和ML7A3M-DNA的DNA带，并且如上所述使用Centriruter和Centricon-10从凝胶中进行洗脱。在7,500×g下离心来浓缩洗脱的DNA，接下来进行乙醇沉淀，然后将该DNA溶解在50μl的蒸馏水中。

b)第二步PCR

在图16中显示出用于制备VMM-DNA的第二步PCR的示意图。

如下制备出包括上述ML7A1-DNA和ML7A2M-DNA片段融合的ML7A1.2-DNA片段。PCR反应溶液的组成：在第一步PCR中制备的L7A1-DNA溶液，10μl；在第一步PCR中制备的ML7A2M-DNA溶液，10μl；寡核苷酸引物7AL1P，80pmol；寡核苷酸引物M7AL2N，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

首先，使得到的扩增的ML7A1.2-DNA片段进行苯酚提取及随后的乙醇沉淀，并且通过5％w/v的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。在电泳后，用1μg/ml的溴化乙锭给凝胶染色，用剃刀刀片切下如此检测到的融合-DNA带，并且如上所述使用Centriruter和Centricon-10从凝胶中进行洗脱。通过在7,500×g下离心来浓缩洗脱的DNA，随后进行乙醇沉淀，并且将该DNA溶解在50μl的蒸馏水中。

c)第三步PCR

在图17中显示出用于制备VMM-DNA的第三步PCR的示意图。

如下制备出包括上述ML7A1.2-DNA、ML7A3M-DNA以及L7A5-DNA片段融合的VMM-DNA片段。PCR反应溶液的组成：在第二步PCR中制备的ML7A1.2-DNA溶液，10μl；在第一步PCR中制备的ML7A3M-DNA溶液，10μl；在第一步PCR中制备的L7A5-DNA溶液，10μl；寡核苷酸引物7AL1P，80pmol；寡核苷酸引物7ALCN，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

首先，使得到的扩增的VMM-DNA片段进行苯酚提取及随后的乙醇沉淀，并且通过5％w/v的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。在电泳后，用1μg/ml的溴化乙锭给凝胶染色，用剃刀刀片切下如此检测到的VMM-DNA带，并且如上所述使用Centriruter和Centricon-10从凝胶中进行洗脱。通过在7,500×g下离心来浓缩洗脱的DNA，接下来进行乙醇沉淀，并且将该DNA溶解在50μl的蒸馏水中。

在图18中列出了构建携带有VMM-DNA片段的质粒的示意图。

通过苯酚提取以及随后的乙醇沉淀来进一步纯化上面得到的VMM-DNA片段，然后用限制酶Hind III和EcoRI消化该片段。

用限制酶Hind III和EcoRI消化1μg的克隆质粒pHSG399DNA(TakaraShuzo有限公司)，然后用CIP使该质粒DNA去磷酸化。之后，使用2.0型DNA连接试剂盒(Takara Shuzo有限公司)把得到的去磷酸化的pHSG399DNA和已用Hind III和EcoRI消化的VMM-DNA连接起来。然后，用连接的DNA转化大肠杆菌JM109并将该细胞涂布在含有最终浓度为1mM IPTG、0.1％w/v X-Gal和50μg/ml氯霉素的LB琼脂培养基上。在37℃下在2ml含有50μg/ml氯霉素的液体LB培养基中培养得到的白色的转化子过夜，并且通过碱性-SDS方法从得到的培养物中提取质粒DNA。然后用Hind III和EcoRI消化提取到的质粒DNA，并采用1％w/v琼脂糖凝胶电泳选出携带有VMM-DNA片段的克隆。

因此得到了携带有MM型HFE7A轻链的可变区以及编码人免疫球蛋白κ链的恒定区的DNA的融合片段的质粒pHSGMM6。含有质粒pHSGMM6的转化子大肠杆菌pHSGMM6 SANK 73697已在1997年8月22日按照布达佩斯条约保藏在Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo中，保藏号为FERMBP-6071。

采用上述质粒pHSGMM6构建出表达载体质粒p7AL-MM，该质粒携带有序列表SEQ ID No.53的DNA并且编码序列表SEQ ID No.54的MM型HFE7A轻链多肽。

用限制酶Hind III和EcoRI消化1μg的pEE.12.1 DNA(Lonza)，其中该DNA为一种用于哺乳动物细胞的表达载体，然后用CIP使该DNA去磷酸化。使用一种2.0型DNA连接试剂盒(Takara Shuzo有限公司)将得到的消化的去磷酸化质粒DNA(100ng)与10μg的已用Hind III和EcoRI消化的pHSGMM6-DNA片段连接起来。然后用该连接混合物转化大肠杆菌JM109(如上所述)，之后将该细胞涂布在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上。

用Hind III和EcoRI消化提取到的质粒DNA，并使该质粒DNA进行1％w/v的琼脂糖凝胶电泳以证实是否存在感兴趣的插入片段。这样便可以分离出质粒p7AL-MM，其中该质粒含有具有MM型HFE7A轻链的可变区以及编码人免疫球蛋白κ链的恒定区的DNA的融合片段。人们发现该融合片段位于以正确取向的巨细胞病毒(CMV)启动子的下游。

6) 检验核苷酸序列

为了检验质粒p7AL-HH、p7AL-HM和p7AL-MM的DNA插入片段具有所需的核苷酸序列，分析其DNA插入片段以测定核苷酸序列。为测定核苷酸的序列而制备的寡核苷酸引物如下：

5′-CCCAAGCTTA AGAAGCATCC-3′(SP1；SEQ IDNo.68)；

5′-ATCTATGCTG CATCCAATCT-3′(SP2；SEQ ID No.69)；

5′-GTTGTGTGCC TGCTGAATAA-3′(SP3；SEQ ID No.70)；

5′-CCCGAATTCT TACTAACACT-3′(SP4；SEQ ID No.71)；

5′-TTATTCAGCA GGCACACAAC-3′(SP5；SEQ ID No.72)；和

5′-AGATTGGATG CAGCATAGAT-3′(SP6；SEQ ID No.73).

在图19中显示出每种引物结合的位置。通过双脱氧核苷酸链终止法[Sanger，F.S.等人，(1977)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，5463]测定核苷酸的序列。使用的模板为通过碱性-SDS方法和氯化铯方法[这两种方法可参见：Sambrook，J.等人，(1989)，在“分子克隆：实验室手册(第2版)”，冷泉港实验室出版]纯化的各自的质粒DNA。

更具体地讲，把3μg纯化的质粒DNA溶解在13μl的双蒸水中，随后加入2mM EDTA和2N NaOH各2μl，然后使该混合物在室温下放置5分钟。接下来，加入4μl的10M醋酸铵溶液和100μl 100％的乙醇并加以混合，并在干冰上放置该混合物10分钟。此后，在15,000×g下离心该混合物并用80％v/v的含水乙醇洗涤得到的沉淀物，然后进行真空干燥。把得到的干燥的DNA溶解在7μl的双蒸水中并用于核苷酸的测序。

使用7-脱氮-测序酶、2.0型试剂盒(用于dCTP；Amersham)进行核苷酸测序反应。配制出由7μl的上述质粒溶液、1pmol事先已合成的引物和1μl反应缓冲液(由试剂盒提供)组成的混合物，然后在65℃下保温该混合物2分钟。随后，通过逐渐地冷却至室温用引物使DNA退火，然后用[α-³²P]dCTP(Amersham)标记上述DNA。在含有溶于1×TBE缓冲液(100mM Tris，100mM硼酸，1mMEDTA，pH8.3)的8M脲的5％w/v聚丙烯酰胺凝胶上使该反应产物进行凝胶电泳。在干燥后，通过放射自显影读取凝胶上的序列。正如本文所使用的，除非另作说明以外，所有核苷酸的测序均如上进行。

结果应当明确的是质粒p7AL-HH、p7AL-HM和p7AL-MM的DNA插入片段具有所期望的核苷酸序列，即：SEQ ID No.49编码SEQ ID No.50的多肽序列；SEQ ID No.51编码SEQ IDNo.52的多肽序列；以及SEQ ID No.53编码SEQ ID No.54的多肽序列；其中上述序列分别为序列表的序列。

实施例3

构建人源化型式的HFE7A抗体的重链的表达载体(1) 构建携带有人源化的HFE7A的重链可变区DNA的质粒

1) 合成用于制备人源化重链的可变区的引物

使用PCR的联合来合成DNA(序列表的SEQ ID No.74)，该DNA编码包括人源化的抗-Fas抗体HFE7A重链的可变区和位于IgG-CH1区(序列表的SEQ ID No.75)的N-末端处的5个氨基酸残基的多肽链。

如上所述合成了下面8种PCR引物：

5′-GGGAAGCTTG GCTTGACCTC ACCATGGGAT GGAGCTGTAT-3′

(7AH1P；SEQ ID No.76)；

5′-TGAAGCCCCA GGCTTCTTGA CCTCAGCCCC AGACTGCACC AGTTGGAC-3′

(7AH1NNEW；SEQ ID No.77)；

5′-TCCACTCAAG CCTCTGTCCA GGGGCCTGTT TTACCC-3′

(7AH2N；SEQ ID No.78)；

5′-GTCTGGGGCT GAGGTCAAGA AGCCTGGGGC TTCAGTGAAG GTGTCCTGCA AG-3′

(7AH2PNEW；SEQ ID No.79)；

5′-CAGGCCCCTG GACAGAGGCT TGAGTGGATG GGAGAGATT-3′

(7AH3P；SEQ ID No.80)；

5′-TCAGATCTCA GGCTGCTGAG CTCCATGTAG GCTGTGCTAG CGGATGTGTC-3′

(7AH3N；SEQ ID No.81)；

5′-TGGAGCTCAG CAGCCTGAGA TCTGAGGACA CGGCGGTCTA TTAC-3′

(7AH4P；SEQ ID No.82)；和

5′-GATGGGCCCT TGGTGGAGGC TGAGGAGACG GTGACCAGGG TCCCTTCGCC CCAGT-3′

(7AH4N；SEQ ID No.83).

2) 构建质粒pBL7A27

通过进行三步PCR来制备编码序列表SEQ ID No.75的氨基酸序列的VD-DNA片段(序列表的SEQ ID No.74)，然后将该片段插入质粒并克隆到大肠杆菌中。

a)第一步PCR

在图20中显示出用于制备VD-DNA的第一步PCR的示意图。

如下制备出H7A1-DNA片段，该片段编码一个分泌信号序列以及FRH₁的N-末端部分并且在5’-末端添加了一个Hind III限制酶切位点。PCR反应溶液的组成：质粒pME-HDNA，200ng；寡核苷酸引物7AH1P，80pmol；寡核苷酸引物7AH1NNEW，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

如下制备出编码一部分FRH₁、CDRH₁以及一部分FRH₂的H7A2-DNA片段。PCR反应溶液的组成：质粒pME-HDNA，200ng；寡核苷酸引物7AH2N，80pmol；寡核苷酸引物7AH2PNEW，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

如下制备出编码一部分FRH₂、CDRH₂以及一部分FRH₃的H7A3-DNA片段。PCR反应溶液的组成：质粒pME-HDNA，200ng；寡核苷酸引物7AH3P，80pmol；寡核苷酸引物7AH3N，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

如下制备出编码一部分FRH₃、CDRH₃、FRH₄以及CH1区的5个N-末端氨基酸残基的H7A4-DNA片段。PCR反应溶液的组成：质粒pME-HDNA，200ng；寡核苷酸引物7AH4P，80pmol；寡核苷酸引物7AH4N，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

首先，使每种PCR产物分别进行苯酚提取及随后的乙醇沉淀，然后通过5％w/v的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。在电泳后，用1μg/ml的溴化乙锭给凝胶染色，用剃刀刀片切下在紫外光下检测到的对应于H7A1-DNA、H7A2-DNA、H7A3-DNA和H7A4-DNA的DNA带，并且如上所述使用Centriruter和Centricon-10从凝胶中进行洗脱。通过在7,500×g下离心来浓缩洗脱的DNA，随后进行乙醇沉淀，并且将该DNA溶解在50μl的蒸馏水中。

b)第二步PCR

在图21中显示出用于制备VD-DNA的第二步PCR的示意图。

如下制备出其中融合了上述H7A1-DNA和H7A2-DNA片段的H7A1.2-DNA片段。PCR反应溶液的组成：在第一步PCR中制备的H7A1-DNA溶液，10μl；在第一步PCR中制备的H7A2-DNA溶液，10μl；寡核苷酸引物7AH1P，80pmol；寡核苷酸引物7AH2N，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

如下制备出其中融合了上述H7A3-DNA和H7A4-DNA片段的H7A3.4-DNA片段。PCR反应溶液的组成：在第一步PCR中制备的H7A3-DNA溶液，10μl；在第一步PCR中制备的H7A4-DNA溶液，10μl；寡核苷酸引物7AH3P，80pmol；寡核苷酸引物7AH4N，80 pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

首先，使得到的扩增的H7A1.2-DNA和H7A3.4-DNA片段进行苯酚提取及随后的乙醇沉淀，然后通过5％w/v的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。在电泳后，用1μg/ml的溴化乙锭给凝胶染色，用剃刀刀片切下如此检测到的相应的带，并且如上所述使用Centriruter和Centricon-10从凝胶中进行洗脱。通过在7,500×g下离心来浓缩洗脱的DNA，接下来进行乙醇沉淀，然后将该DNA溶解在50μl的蒸馏水中。

c)第三步PCR

在图22中显示出用于制备VD-DNA的第三步PCR的示意图。

如下制备出其中融合了上述H7A1.2-DNA和H7A3.4-DNA片段的VD-DNA片段。PCR反应溶液的组成：在第二步PCR中制备的H7A1.2-DNA溶液，10μl；在第二步PCR中制备的H7A3.4-DNA溶液，10μl；寡核苷酸引物7AH1P，80pmol；寡核苷酸引物7AH4N，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

首先，使得到的扩增的VD-DNA片段进行苯酚提取及随后的乙醇沉淀，然后通过5％w/v的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。在电泳后，用1μg/ml的溴化乙锭给凝胶染色，用剃刀刀片切下如此检测到的VD-DNA带，并且如上所述使用Centriruter和Centricon-10从凝胶中进行洗脱。通过在7,500×g下离心来浓缩洗脱的DNA，接下来进行乙醇沉淀，并且将该DNA溶解在50μl的蒸馏水中。

在图23中列出了构建携带有VD-DNA片段的质粒的示意图。

通过苯酚提取以及随后的乙醇沉淀来进一步纯化上面得到的VD-DNA片段，然后用限制酶Hind III和ApaI消化该片段。

用限制酶Hind III和ApaI消化1μg的质粒载体pBLUESCRIPT-IISK+DNA(Stratagene)，然后用CIP使该质粒DNA去磷酸化。使用2.0型DNA连接试剂盒(Takara Shuzo有限公司)来连接得到的去磷酸化的质粒DNA以及100ng的已用Hind III和ApaI消化的VD-DNA片段。然后，使用得到的连接混合物转化大肠杆菌JM109，随后将该细胞涂布在含有最终浓度为1 mM IPTG、0.1％w/vX-Gal和50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上。在37℃下在2ml含有50μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中培养任何得到的白色的转化子过夜，并且通过碱性-SDS方法从得到的培养物中提取质粒DNA。用Hind III和ApaI消化得到的质粒并使该质粒进行琼脂糖凝胶电泳以证实是否存在感兴趣的插入片段。因此便得到了具有VD-DNA插入片段的质粒pBL7A27。(2) 构建携带有人IgG1恒定区的基因组DNA的质粒

1) 合成用于制备5’-末端的人IgG1的基因组DNA片段的引物

通过PCR合成5’-末端的人IgG1的基因组DNA片段。为此，制备了以下2个寡核苷酸引物：

5′-GGGAAGCTTC CGCGGTCACA TGGCACCACC TCTCTTGCA-3′(5’Hind：序列表的SEQ ID No.84)；以及

5′-GCTCTGCAGA GAGAAGATTG GGAGTTACTG GAATC-3′(IGGCPSTN：序列表的SEQ ID No.85)。

2) 构建质粒pIG5’03

制备出含有人IgG1的CH1区以及位于Hind III切割序列之后的内含子的基因组DNA，使用人的基因组DNA作模板通过PCR进行扩增，然后将该DNA插入质粒pHSG399(Takara Shuzo有限公司)并克隆到大肠杆菌中。在图24中给出了制备该DNA(下文称作“IG5’-DNA”)的示意图。

如下制备出IG5’-DNA片段。PCR反应溶液的组成：人的基因组DNA(Clonetech)，2μg；寡核苷酸引物5’Hind，80pmol；寡核苷酸引物IGGCPSTN，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

首先，使得到的扩增的IG5’-DNA片段进行苯酚提取及随后的乙醇沉淀，并通过5％w/v的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。在电泳后，用1μg/ml的溴化乙锭给凝胶染色，用剃刀刀片切下如此检测到的IG5’-DNA的带，并且如上所述使用Centriruter和Centricon-10从凝胶中进行洗脱。通过在7,500×g下离心来浓缩洗脱的DNA，接下来进行乙醇沉淀，然后将该DNA溶解在50μl的蒸馏水中。

通过苯酚提取以及随后的乙醇沉淀来进一步纯化上面得到的IG5’-DNA片段，然后用限制酶Hind III和PstI消化该片段。

用限制酶Hind III和PstI消化1μg的质粒pHSG399 DNA(Takara Shuzo有限公司)，然后用CIP使该质粒DNA去磷酸化。使用2.0型DNA连接试剂盒(Takara Shuzo有限公司)来连接得到的去磷酸化的质粒DNA以及100ng的已用Hind III和Pst I消化的IG5’-DNA片段。然后，使用该连接混合物转化大肠杆菌JM109，随后将该细胞涂布在含有最终浓度为1 mM IPTG、0.1％w/v X-Gal和50μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上。在37℃下在2ml含有50μg/ml氯霉素的液体LB培养基中培养任何得到的白色的转化子过夜，并且通过碱性-SDS方法从得到的培养物中提取质粒DNA。用Hind III和PstI消化提取到的质粒DNA并使该质粒进行1％w/v的琼脂糖凝胶电泳以证实是否存在感兴趣的插入片段。因此便得到了含有IG5’-DNA插入片段的质粒pIG5’03。(3) 构建携带有人IgG1恒定区的基因组DNA的质粒

1) 合成用于制备3’-末端的人IgG1基因组DNA片段的引物

通过PCR合成3’-末端的人IgG1基因组DNA片段。为此，制备了以下2个引物：

5′-TCTCTGCAGAGCCCAAATCT TGTGACAAAA CTCAC-3′(IGGCPSTP：序列表的SEQ ID No.86)；以及

5′-GGGGAATTCG GGAGCGGGGC TTGCCGGCCG TCGCACTCA-3 ′(Eco3’：序列表的SEQ ID No.87)。

2) 构建质粒pIG3’08

分离出含有以下序列的DNA：来自人IgG1的内含子；绞链区；来自人IgG1的内含子；CH2区；来自人IgG1的内含子；CH3区；以及一个EcoRI切割序列。使用人的基因组DNA作模板通过PCR进行扩增，然后将该DNA插入质粒pHSG399(Takara Shuzo有限公司)并克隆到大肠杆菌中。在图25中给出了制备上述DNA(下文称作“IG3’-DNA”)的示意图。

如下制备出IG3’-DNA片段。PCR反应溶液的组成：人的基因组DNA(Clonetech)，2μg；寡核苷酸引物IGGCPSTP，80pmol；寡核苷酸引物Eco3’，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

首先，使得到的扩增的IG3’-DNA片段进行苯酚提取及随后的乙醇沉淀，并通过5％w/v的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。在电泳后，用1μg/ml的溴化乙锭给凝胶染色，用剃刀刀片切下如此检测到的IG3’-DNA的带，并且如上所述使用Centriruter和Centricon-10从凝胶中进行洗脱。通过在7,500×g下离心来浓缩洗脱的DNA，接下来进行乙醇沉淀，然后将该DNA溶解在50μl的蒸馏水中。

通过苯酚提取以及随后的乙醇沉淀来进一步纯化上面得到的IG3’-DNA片段，然后用限制酶EcoRI和PstI消化该片段。

用限制酶EcoRI和Pst I消化1μg的质粒pHSG399 DNA(Takara Shuzo有限公司)，然后用CIP使该质粒DNA去磷酸化。使用2.0型DNA连接试剂盒(Takara Shuzo有限公司)来连接得到的去磷酸化的质粒DNA以及100ng的已用EcoRI和Pst I消化的IG3’-DNA片段。然后，使用该连接混合物转化大肠杆菌JM109，随后将该细胞涂布在含有最终浓度为1mM IPTG、0.1％w/v X-Gal和50μg/ml氯霉素的LB琼脂培养基上。挑选出任何的白色的菌落并得到了含有IG3’-DNA插入片段的质粒pIG3’08。(4) 构建人源化的HFE7A重链的表达载体质粒

使用上述质粒pBL7A27、pIG5’03和pIG3’08来构建表达质粒载体pEg7AH-H，该表达质粒载体携带有序列表的SEQ ID No.88的DNA并且编码序列表SEQ ID No.89的人源化HFE7A的重链多肽。在图26中给出了该步骤的示意图。

用限制酶ApaI和KpnI消化10μg的含有人IgG1重链的CH1区以及内含子的质粒pIG5’03 DNA。另外，也用限制酶Apa I和Kpn I消化1μg的上述pBL7A27 DNA，然后用CIP使该质粒DNA去磷酸化。使用2.0型DNA连接试剂盒(Takara Shuzo有限公司)把得到的去磷酸化的pBL7A27 DNA(100ng)和10μg经过消化和去磷酸化的pIG5’03 DNA连接起来。然后，使用该连接混合物来转化大肠杆菌JM109，并把该细菌涂布在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上。在37℃下在2ml含有50μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中培养得到的转化子过夜，并且通过碱性-SDS方法从培养物中提取质粒DNA。用ApaI和KpnI或用Hind III和PstI消化该质粒，并通过1％w/v的琼脂糖凝胶电泳来证实是否存在感兴趣的插入片段。因而便得到了含有与IG5’-DNA片段连接的人源化HFE7A的VD-DNA片段的质粒pBL7AF184。

接下来，用限制酶Hind III和PstI消化10μg如上得到的质粒pBL7AF184，同样用Hind III和PstI消化1μg的上述质粒pIG3’08 DNA，并用CIP使之去磷酸化。使用2.0型DNA连接试剂盒(Takara Shuzo有限公司)把得到的去磷酸化的pIG3’08 DNA(100ng)和10μg经过消化的pBL7AF184 DNA连接起来。用该连接混合物来转化大肠杆菌JM109，并把该细菌涂布在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上。在37℃下在2ml含有50μg/ml氯霉素的液体LB培养基中培养任何得到的转化子过夜，并且通过碱性-SDS方法从培养物中提取质粒DNA。用Hind III和PstI或用Hind III和EcoRI消化该质粒，并通过1％w/v的琼脂糖凝胶电泳来证实是否存在感兴趣的插入片段。

因此得到了含有人源化HFE7A的VD-DNA片段的质粒pgHSL7A62，其中该VD-DNA片段被连接至一个编码人IgG1恒定区的基因组DNA片段上。含有质粒pgHSL7A62的转化子大肠杆菌pgHSL7A62 SANK 73397已在1997年8月22日按照布达佩斯条约保藏在Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku KogyoGijutsu Kenkyujo中，保藏号为FERM BP-6074。

用限制酶Hind III和EcoRI消化10μg如上得到的质粒pgHSL7A62 DNA，同样用Hind III和EcoRI消化1μg的表达质粒pEE.6.1 DNA，并用CIP使之去磷酸化。使用2.0型DNA连接试剂盒(Takara Shuzo有限公司)把得到的去磷酸化的pEE.6.1 DNA(100ng)和10μg经过消化的pgHSL7A62 DNA连接起来。用该连接混合物来转化大肠杆菌JM109，并把该细菌涂布在含有50μ/ml氨苄青霉素的LB培养基上。在37℃下在2ml含有50μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中培养任何得到的转化子过夜，并且通过碱性-SDS方法从培养物中提取质粒DNA。用Hind III和EcoRI消化该质粒，并通过1％w/v的琼脂糖凝胶电泳来证实是否存在感兴趣的插入片段。

得到的质粒pEg7AH-H含有包括人源化HFE7A的VD-DNA片段以及编码与之相连的人IgG1恒定区的基因组DNA片段的融合片段，并且该质粒插入到以正确取向的CMV启动子的下游。(5) 检验核苷酸序列

为了检验pEg7AH-H的DNA插入片段具有所期望的核苷酸序列，分析其DNA插入片段以测定该核苷酸序列。为此，合成了下面的引物：

5′-ACAGCCGGGA AGGTGTGCAC-3′(IG01：SEQ ID No.90)；

5′-AGACACCCTC CCTCCCTGTG-3′(IG02：SEQ ID No.91)；

5′-GTGCAGGGCC TGGGTTAGGG-3′(IG03：SEQ ID No.92)；

5′-GCACGGTGGG CATGTGTGAG-3′(IG04：SEQ ID No.93)；

5′-GTTTTGGGGG GAAGAGGAAG-3′(IG05：SEQ ID No.94)；

5′-CCAGTCCTGG TGCAGGACGG-3′(IG06：SEQ ID No.95)；

5′-CCTGTGGTTC TCGGGGCTGC-3′(IG07：SEQ ID No.96)；

5′-CGTGGTCTTG TAGTTGTTCT-3′(IG08：SEQ ID No.97)；

5′-CTTCCTCTTC CCCCCAAAAC-3′(IGP5：SEQ ID No.98)；

5′-CCGTCCTGCA CCAGGACTGG-3′(IGP6：SEQ ID No.99)；

5′-GCAGCCCCGA GAACCACAGG-3′(IGP7：SEQ ID No.100)；

5′-AGAACAACTA CAAGACCACG-3′(IGP8：SEQ ID No.101)；

5′-GCCTGACATC TGAGGACTC-3′(H5+：SEQ ID No.102)；

5′-GAGTCCTCAG ATGTCAGGC-3′(H5-：SEQ ID No.103)；

5′-GAGCAGTACT CGTTGCTGCC GCGCGCGCCA CCAG-3′

(PEEF：SEQ ID No.104)；和

5′-GGTATGGCTG ATTAATGATC AATG-3′(PEEB：SEQ ID No.105).

在图27中显示出每个引物结合的位置。使用通过碱性-SDS方法和氯化铯方法(出处同上)纯化的各自的质粒作模板，通过双脱氧核苷酸链终止法(出处同上)测定核苷酸的序列。于是证实pEg7AH-H具有序列表SEQ ID No.88的核苷酸序列，它编码序列表SEQ ID No.89的多肽。

实施例4

在COS-1细胞中表达

使用人源化HFE7A重链的表达质粒以及如上得到的每种人源化HFE7A轻链的表达质粒来转染COS-1细胞(从猴的肾中得到)。采用基因转染装置GTE-1(Shimadzu Seisakusyo，K.K.)通过电穿孔来进行转染，其中的转染装置装备有电极相距2mm的FCT-13室(Shimadzu Seisakusyo，K.K.)。

在含有补充了10％v/v FCS(Moregate)的基本必需α培养基[“α(+)MEM”；Gibco BRL]的培养瓶(培养面积：225cm²，Sumitomo Bakelite)中培养COS-1细胞(美国典型培养物保藏中心No.CRL-1650)至半-汇合。随后弃去培养基并通过在37℃下用3ml的胰蛋白酶-EDTA溶液(Sigma化学公司)处理3分钟而从瓶中分离出COS-1细胞。然后，通过在800r.p.m.下离心2分钟来收获经分离的细胞，弃去上清液并用磷酸盐缓冲液(0.02％w/v氯化钾[KCl]，0.02％w/v磷酸二氢钾[KH₂PO₄]，0.8％w/v氯化钠[NaCl]，1.15％w/v磷酸氢二钠[Na₂HPO₄]；下文称作“PBS(-)缓冲液”；Nissui制药有限公司)洗涤2次。然后将洗涤后的COS-1细胞悬浮到PBS(-)缓冲液中至细胞密度为1×10⁸细胞/ml。

与此同时，把4μg的人源化HFE7A重链的表达质粒DNA和4μg的人源化HFE7A轻链的表达质粒DNA混合，其中每种质粒DNA均通过碱性-SDS方法和氯化铯密度梯度离心进行纯化。使得到的混合物进行乙醇沉淀，然后将其悬浮在20μl的PBS(-)缓冲液中。上述混合、沉淀和再悬浮步骤均在同一试管中进行。把得到的全部的质粒悬浮液(20μl)与20μl事先已制备好的COS-1细胞悬浮液(2×10⁶细胞)混合，并且把该混合物转移到电极组相距2mm的FCT-13电穿孔室(Shimadzu Seisakusyo，K.K.)中，然后将该电穿孔室装备到基因转染装置GTE-1(Shimadzu Seisakusyo，K.K.)中。每隔1秒钟施加600V、每次50μF的脉冲两次，以便于用质粒DNA来转化COS-1细胞。在电穿孔后，把室中的细胞-DNA混合物悬浮在20μl补充有10％v/vFCS的α(+)MEM中并将其转移到培养瓶(培养面积75cm²；Sumitomo Bakelite)中。在5％v/vCO₂、37℃下温育72小时后，回收培养物上清液，并且在上清液中进行分析以确定存在何种表达产物。

采用上面的方法但又适当地加以改进，用以下质粒的每一种或其联合分别转染COS-1细胞：

(A)：无质粒DNA

(B)：用pEg7AH-H和p7AL-MM共转染

(C)：用pEg7AH-H和p7AL-HM共转染

(D)：用pEg7AH-H和p7AL-HH共转染

实施例5

通过ELISA确定表达产物的量

使用抗-人IgG抗体通过ELISA来定性和定量地测定在实施例4中制得的培养物上清液流体中作为表达产物的人源化抗体的表达。

把对山羊抗-人IgG Fc具有特异性的多克隆抗体(Kappel)溶解在吸附缓冲液(0.05M碳酸氢钠，0.02％w/v叠氮化钠，pH9.6)中至最终浓度为1μg/ml，将100μl的等分试样加入到96-孔板(MaxiSorb，Nunc)的每个孔中，然后在37℃下保温该板2小时以促进抗体的吸附。接下来，用350μl的PBS-T[含有0.05％w/v Tween-20(BioRad)的PBS(-)]洗涤每个孔4次。在洗涤后，把用含有10％v/v FCS的α(+)MEM稀释的培养物上清液加入孔中，然后在37℃下进一步保温该板2小时。

此后，再用PBS-T洗涤孔4次，然后向每个孔中加入100μl用PBS-T稀释了5000倍的碱性磷酸酶标记的对山羊抗-人IgG Fc具有特异性的多克隆抗体(Caltag实验室)并在37℃下保温板2小时。然后再用PBS-T洗涤每个孔4次，并向每个孔中加入100μl在10％v/v二乙醇胺(pH9.8)中制备的1mg/mlp-磷酸硝基苯酯的底物溶液。随后在37℃下保温0.5至1小时后，在405nm下测量吸光度。

在该实验中，使用以含有10％v/v FCS的α(+)MEM稀释至某一所需浓度的人血浆IgG亚类1(IgG1；Biopure AG)作为包含在培养物上清液流体中的人源化HFE7A抗体的浓度对照样品。

正如所预料的那样，通过抗-人IgG抗体的检测明确了转化子(B)、(C)和(D)的每种上清液均表达人的抗体。阴性对照(A)表明不表达人的抗体。

实施例6

分析Fas-结合活性

通过如下的ELISA来分析实施例4中制备的细胞培养物上清液中的Fas-结合活性。

以每孔50μl的量把来自表达人Fas融合蛋白的COS-1细胞并如以上参考实施例1中得到的用吸附缓冲液稀释了5倍的培养物上清液分配到96-孔板(MaxiSorb；Nunc)的孔中，在4℃下保温该板过夜以便使人Fas融合蛋白吸附到孔的表面上。接下来，用350μl的PBS-T洗涤每个孔4次。在洗涤后，以每孔50μl的量向孔中加入含有5％v/vBSA(牛血清白蛋白；Wako纯化工有限公司)的PBS-T，并在37℃下保温该板1小时以封闭每个孔残留的表面。然后，再用PBS-T洗涤孔4次。

在含有10％v/v FCS的α(+)MEM中调节实施例4中得到的培养物上清液至目的产物的最终浓度为100ng/ml。由实施例5中所述的方法来计算浓度。然后通过以含有10％v/v FCS的α(+)MEM连续2倍地稀释每种得到的100ng/ml的溶液便生产出连续稀释液。接下来，向如上制备的孔中加入50μl的每种表达产物的每种得到的连续稀释液，并在37℃下保温该板2小时以便进行反应。

此后，再用PBS-T洗涤孔4次，然后把50μl用PBS-T稀释了10,000倍的碱性磷酸酶标记的对山羊抗-人IgG Fc具有特异性的多克隆抗体(Caltag实验室)分配到每个孔中，并在37℃下使反应进行2小时。

以从小鼠杂交瘤HFE7A中纯化的HFE7A作为对照(IgG1)，并采用以PBS-T稀释了5,000倍的碱性磷酸酶标记的山羊抗-小鼠IgG+IgA+IgM(Gibco BRL)代替碱性磷酸酶标记的对山羊抗-人IgG Fc具有特异性的多克隆抗体来检测上述HFE7A。

再用PBS-T洗涤孔4次，然后把50μl的底物溶液[溶于10％v/v二乙醇胺(pH 9.8)中的1mg/mlp-磷酸硝基苯酯溶液]分配到每个孔中，并在37℃下保温该板0.5至1小时。通过在405nm下读取每个孔的吸光度来计算包含在每种培养物上清液流体中的表达产物与人Fas融合蛋白的结合活性。

正如所预料的那样，对以上的上清液(B)、(C)和(D)而言均表现出对人Fas融合蛋白的结合活性(图28)。

实施例7

竞争性抑制HFE7A与Fas的结合

因为上述实施例的抗体是从HFE7A得到的，所以该实施例的人源化抗-Fas抗体应当抑制HFE7A与Fas的结合。因此，测定了实施例4中得到的表达产物竞争性地抑制HFE7A与人Fas融合蛋白结合的能力。

使用一种可商购的碱性磷酸酶标记试剂盒(Immumo-LinkAP及APL标记试剂盒；Genosis)并采用由该试剂盒提供的方案来标记参考实施例3中得到的1mg纯化的单克隆抗体HFE7A。得到的经标记的抗体在本文中也称作“AP-HFE7A”。

用吸附缓冲液将如在参考实施例1中得到的含有人Fas融合蛋白的COS-1细胞培养物上清液稀释5倍，并以每孔50μl的量将其分配至用于发光检测的96-孔板(发光固相分析平板，高结合特性；Costar)的孔中。然后在4℃下保温该板过夜，以便使人Fas融合蛋白吸附到孔的表面上。

此后，用350μl的PBS-T洗涤每个孔4次，然后把100μl含有5％v/vBSA的PBS-T加入每个孔中，并在37℃下保温该板1小时以封闭每个孔残留的表面。然后再用PBS-T洗涤孔4次。

通过实施例5的方法，在含有10％v/v FCS的α(+)MEM中调节实施例4中得到的培养物上清液至抗体的最终浓度为1μg/ml。通过以含有10％v/vFCS的α(+)MEM连续2倍地稀释每种表达产物的溶液便生产出连续稀释液。用含有10％v/v FCS的α(+)MEM将AP-HFE7A稀释至50ng/ml，并把25μl得到的溶液与等体积的每种制备好的连续稀释液进行混合。

再用PBS-T洗涤每个孔4次，然后向每个孔中加入50μl的每种得到的抗体混合物，并使该板在室温下放置过夜。随后，在再次用PBS-T洗涤每个孔4次之后，把100μl的CDP-星号(star)缓冲液(9.58ml二乙醇胺，0.2g氯化镁，0.25g叠氮化钠，pH8.5)分配到每个孔中，并使该板在室温下放置10分钟。此后，弃去该CDP-星号缓冲液并以每孔50μl的量加入CDP-星号底物[1.2ml蓝宝石II(Tropix)，200μlCDP-星号(Tropix)与CDP-星号缓冲液至12ml]，然后使板再在室温下放置40分钟。

通过用发光扫描(Titertech)测量发光的强度来评价实施例4的表达产物对HFE7A与人Fas融合蛋白的结合的竞争性抑制。

结果证实了实施例4中制备的表达产物特异性地抑制HFE7A与人Fas融合蛋白的结合(图29)。

实施例8

诱导细胞程序死亡的活性

使用WR19L12a细胞(Itoh，N.等人，出处同上)来检测实施例4的COS-1细胞培养物上清液的诱导细胞程序死亡的活性。

在37℃、5％v/v CO₂下，在含有10％v/v FCS(Gibco BRL)的RPMI1640培养基中培养WR19L12a细胞3天，然后把50μl(1×10⁵个细胞)得到的培养物分配到96-孔微量板(Sumitomo Bakelite)的每个孔中。在含有10％v/v FCS的RPMI1640培养基中调节实施例4中得到的培养物上清液至抗体的最终浓度为100ng/ml。通过实施例5的方法来计算浓度。通过以含有10％v/v FCS的RPMI1640连续2倍地稀释每种表达产物经调节的溶液便生产出连续稀释液。以每孔50μl的量向每个孔中加入每种表达产物溶液的每种稀释液，并在37℃下保温该板1小时。此后，用含有10％v/v FCS的RPMI1640洗涤每个孔中的细胞4次，然后将经洗涤的细胞悬浮在75μl的含有10％v/v FCS的RPMI1640的每个孔中。

随后，向每个孔中加入75μl1.25μg/ml的对山羊抗-人IgGFc具有特异性的多克隆抗体(Kappel)作为第二抗体，其中的多克隆抗体溶解在含有10％v/v FCS的RPMI 1640培养基中。使板在37℃下放置12小时，然后向每个孔中加入50μl含有1mg/mlXTT[2，3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-carboxyanilide内盐；Sigma化学公司]的25μM PMS(吩嗪N-甲硫酸盐；Sigma化学公司)，其中XTT的最终浓度为250μg/ml、PBS的最终浓度为5μM。然后在37℃下保温该板3小时，并测量每个孔在450nm下的吸光度以便于采用线粒体的减数分裂能力作为指征来计算细胞的生存力。

根据下式计算每个孔中细胞的生存力：

正如所预料的那样，实施例4的每种表达产物(B)、(C)和(D)均显示出诱导了在表达人Fas抗原的T细胞中的细胞程序死亡(图30)。

实施例9

制备编码人源化轻链的DNA(1) 构建HFE7A抗体的人源化形式的轻链的载体

为了使小鼠的抗-人Fas抗体HFE7A的轻链氨基酸序列人源化，分别用谷氨酸、谷氨酸和赖氨酸来置换从HH型轻链氨基酸序列的N-末端算起的第1位氨基酸(天冬氨酸)、第85位氨基酸(丙氨酸)以及第107位氨基酸(精氨酸)。这些置换的残基在人的轻链(κ链)中是保守的。所得到的序列命名为“PDHH型”。对于HM轻链序列而言，分别用保守的谷氨酸和赖氨酸残基来置换从上述氨基酸序列的N-末端算起的第1位氨基酸(天冬氨酸)和第107位氨基酸(精氨酸)。所得到的序列命名为“PDHM型”。

分别携带了这两种人源化轻链的氨基酸序列(PDHH和PDHM)的表达质粒构建如下。

1) 合成用于制备人源化HFE7A的轻链的可变区和恒定区的引物

通过PCR制备出编码PDHH型多肽链(序列表的SEQ ID No.107)的DNA(序列表的SEQ ID No.106)以及编码PDHM型多肽链(序列表的SEQ IDNo.109)的DNA(序列表的SEQ ID No.108)。上述每个序列均为人源化型式的HFE7A轻链的可变区与人Ig轻链(κ链)的恒定区的融合。

已经合成了[以上实施例2(2)2)]7AL1P(SEQ ID No.55)和7ALCN(SEQ ID No.64)，并且也合成了以下用于PCR的寡核苷酸引物：

5′-GGTGAGATTG TGCTCACCCA ATCTCCAGG-3′

(LPD1P；SEQ ID No.110)；

5′-CCTGGAGATT GGGTGAGCAC AATCTCACC-3′

(LPD1N；SEQ ID No.111)；

5′-CCATCTCTCG TCTGGAGCCG GAGGATTTTG C-3′

(LPD2P；SEQ ID No.112)；

5′-GCAAAATCCT CCGGCTCCAG ACGAGAGATG G-3′

(LPD2N；SEQ ID No.113)；

5′-CAAGGCACCA AGCTGGAAAT CAAACGGACT G-3′

(LPD3P；SEQ ID No.114)；and

5′-CAGTCCGTTT GATTTCCAGC TTGGTGCCTT G-3′

(LPD3N；SEQ ID No.115).

2) 构建质粒pLPDHH75(人源化的PDHH型HFE7A轻链的表达质粒)

通过进行3-步PCR来制备如在序列表SEQ ID No.106中定义的并且编码序列表SEQ ID No.107的氨基酸序列的LPDHH-DNA(与PDHHDNA融合的轻链的恒定区)，将该DNA插入质粒载体并克隆到大肠杆菌中。

a)第一步PCR

在图31中显示出用于制备LPDHH-DNA的第一步PCR的示意图。

如下制备出编码一个分泌信号序列以及一部分FRL₁、但在5’-末端具有一个添加的Hind III限制酶切位点的LPD1-DNA片段。PCR反应溶液的组成：质粒pHSGHH7DNA，200ng；寡核苷酸引物7AL1P，80pmol；寡核苷酸引物LPD1N，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶(Stratagen)，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

如下制备出编码一部分FRL₁、CDRL₁、FRL₂、CDRL₂以及一部分FRL₃区的LPDHH1-DNA片段。PCR反应溶液的组成：质粒pHSGHH7DNA，200ng；寡核苷酸引物LPD1P，80pmol；寡核苷酸引物LPD2N，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

如下制备出编码一部分FRL₃、CDRL₃以及FRL₄的LPDHH2-DNA片段。PCR反应溶液的组成：质粒pHSGHH7DNA，200ng；寡核苷酸引物LPD2P，80pmol；寡核苷酸引物LPD3N，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

如下制备出编码一部分FRL₄以及HFE7A轻链的恒定区、但在3’-末端具有一个添加的EcoRI限制酶切位点的LPDC-DNA片段。PCR反应溶液的组成：质粒pHSGHH7DNA，200ng；寡核苷酸引物LPD3P，80pmol；寡核苷酸引物7ALCN，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

在PCR后，首先使扩增的DNA片段进行苯酚提取及随后的乙醇沉淀，然后通过5％w/v的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。在电泳后，用1μg/ml的溴化乙锭给凝胶染色，用剃刀刀片切下在紫外光下检测的DNA带，并且如上所述使用Centriruter和Centricon-10从凝胶中进行洗脱。通过在7,500×g下离心来浓缩洗脱的DNA，接下来进行乙醇沉淀，最后将该DNA溶解在50μl的蒸馏水中。

b)第二步PCR

在图32中显示出用于生产LPDHH-DNA的第二步PCR的示意图。

如下制备出其中融合了上述LPD1-DNA、LPDHH1-DNA以及LPDHH2-DNA片段的LPDHH1.2-DNA。PCR反应溶液的组成：LPD1-DNA溶液(来自第一步PCR)，10μl；LPDHH1-DNA溶液(来自第一步PCR)，10μl；LPDHH2-DNA溶液(来自第一步PCR)，10μl；寡核苷酸引物7AL1P，80pmol；寡核苷酸引物LPD3N，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

在PCR后，首先使扩增的LPDHH1.2片段进行苯酚提取及随后的乙醇沉淀，然后通过5％w/v的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。在电泳后，用1μg/ml的溴化乙锭给凝胶染色，用剃刀刀片切下在紫外光下检测的融合DNA的带，并且如上所述使用Centriruter和Centricon-10从凝胶中进行洗脱。通过在7,500×g下离心来浓缩洗脱的DNA，接下来进行乙醇沉淀，最后将该DNA溶解在50μl的蒸馏水中。

c)第三步PCR

在图33中显示出用于生产LPDHH-DNA的第三步PCR的示意图。

如下制备出其中融合了上述LPDHH1.2-DNA和LPDC-DNA片段的LPDHH-DNA片段。PCR反应溶液的组成：LPDHH1.2-DNA溶液(来自第二步PCR)，10μl；LPDC-DNA溶液(来自第一步PCR)，10μl；寡核苷酸引物7AL1P，80pmol；寡核苷酸引物7ALCN，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

在PCR后，首先使扩增的LPDHH-DNA片段进行苯酚提取及随后的乙醇沉淀，然后通过5％w/v的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。在电泳后，用1μg/ml的溴化乙锭给凝胶染色，用剃刀刀片切下在紫外光下检测的DNA带，并且如上所述使用Centriruter和Centricon-10从凝胶中进行洗脱。通过在7,500×g下离心来浓缩洗脱的DNA，接下来进行乙醇沉淀，最后将该DNA溶解在50μl的蒸馏水中。

在图34中列出了构建携带有LPDHH-DNA片段的表达质粒的示意图。

通过苯酚提取以及随后的乙醇沉淀来进一步纯化上面得到的LPDHH-DNA片段，然后用限制酶Hind III和EcoRI消化该片段。

用限制酶Hind III和EcoRI消化1μg的克隆质粒pHSG399DNA，然后用CIP使该质粒DNA去磷酸化。然后，采用2.0型DNA连接试剂盒(Takara Shuzo有限公司)来连接得到的去磷酸化的pHSG399 DNA和事先已用Hind III和EcoRI消化的LPDHH-DNA片段。然后用该连接混合物转化大肠杆菌JM109并将该细胞涂布到含有最终浓度为1mM IPTG、0.1％w/vX-Gal和50μg/ml氯霉素的LB琼脂培养基上。在37℃下在2ml含有50μg/ml氯霉素的液体LB培养基中培养得到的任意的白色的转化子过夜，并且通过碱性-SDS方法从得到的培养物中提取质粒DNA。用Hind III和EcoRI消化提取到的质粒DNA，然后通过1％w/v琼脂糖凝胶电泳选出携带有LPDHH-DNA片段的克隆。

因此分离出携带有包含了人源化的LPDHH DNA的可变区以及编码人IgG的恒定区的DNA的融合插入片段的质粒pHSHH5。含有质粒pHSHH5的转化子大肠杆菌pHSHH5 SANK 70398已在1998年2月26日按照有关微生物保藏的布达佩斯条约保藏在Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo中，保藏号为FERM BP-6274。

然后采用质粒pHSHH5制备出携带有序列表SEQ ID No.106的DNA片段并编码序列表SEQ ID No.107的人源化的PDHH型HFE7A轻链多肽的表达载体质粒pLPDHH75。

用限制酶Hind III和EcoRI消化1μg的pEE.12.1 DNA(Lonza)，其中该DNA为一种用于哺乳动物细胞的表达载体，然后用CIP使该DNA去磷酸化。使用一种2.0型DNA连接试剂盒(Takara Shuzo有限公司)将得到的消化的去磷酸化质粒DNA(100ng)与10μg的已用Hind III和EcoRI消化的pHSHH5 DNA片段连接起来。然后用该连接混合物转化大肠杆菌JM109(如上所述)，之后将该细胞涂布在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上。

用Hind III和EcoRI消化提取到的质粒DNA，并使该质粒DNA进行1％w/v的琼脂糖凝胶电泳以证实是否存在感兴趣的插入片段。这样便可以分离出质粒pLPDHH75，其中该质粒含有具有人源化的PDHH型HFE7A轻链的可变区以及编码人免疫球蛋白κ链的恒定区的DNA的融合片段。人们发现该融合片段位于以正确取向的巨细胞病毒(CMV)启动子的下游。

3) 构建质粒pLPDHM32(人源化的PDHM型HFE7A轻链的表达质粒)

通过进行3-步PCR来生产LPDHM-DNA片段(序列表的SEQ IDNo.108，该片段编码编码序列表SEQ IDNo.109的氨基酸序列)，然后将该片段插入质粒载体并克隆到大肠杆菌中。

a)第一步PCR

在图35中显示出用于制备LPDHM-DNA的第一步PCR的示意图。

编码一个分泌信号序列和一部分FRL₁并在5’-末端具有一个添加的HindIII限制酶切位点的LPD1-DNA片段以及编码一部分FRL₄和恒定区并在3’-末端具有一个添加的EcoRI限制酶切位点的LPDC-DNA片段为在制备LPDHH-DNA片段中得到的片段[参见“2)构建质粒pLPDHH75(人源化的PDHH型HFE7A轻链的表达质粒)”与“a)第一步PCR”]。

如下制备出编码一部分CDRL₁、FRL₂、CDRL₂、FRL₃、CDRL₃以及FRL₄的LPDHM1-DNA片段。PCR反应溶液的组成：质粒pHSGHM17DNA，200ng；寡核苷酸引物LPD1P，80pmol；寡核苷酸引物LPD3N，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

在PCR后，首先使扩增的LPD1、LPDHM1和LPDC-DNA片段进行苯酚提取及随后的乙醇沉淀，然后通过5％w/v的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。在电泳后，用1μg/ml的溴化乙锭给凝胶染色，用剃刀刀片切下在紫外光下检测的融合DNA的带，并且如上所述使用Centriruter和Centricon-10从凝胶中进行洗脱。通过在7,500×g下离心来浓缩洗脱的DNA，接下来进行乙醇沉淀，最后将该DNA溶解在50μl的蒸馏水中。

b)第二步PCR

在图36中显示出用于生产PDHM-DNA的第二步PCR的示意图。

如下制备出其中融合了上述LPD1-DNA与LPDHM1-DNA片段的LPDHM1.2-DNA。PCR反应溶液的组成：LPD1-DNA溶液(来自第一步PCR)，10μl；LPDHM1-DNA溶液(来自第一步PCR)，10μl；LPDHH2-DNA溶液(来自第一步PCR)，10μl；寡核苷酸引物7AL1P，80pmol；寡核苷酸引物LPD3N，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

在PCR后，首先使扩增的LPDHM1.2-DNA片段进行苯酚提取及随后的乙醇沉淀，然后通过5％w/v的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。在电泳后，用1μg/ml的溴化乙锭给凝胶染色，用剃刀刀片切下在紫外光下检测的DNA带，并且如上所述使用Centriruter和Centricon-10从凝胶中进行洗脱。通过在7,500×g下离心来浓缩洗脱的DNA，接下来进行乙醇沉淀，最后将该DNA溶解在50μl的蒸馏水中。

c)第三步PCR

在图37中显示出用于生产LPDHM-DNA的第三步PCR的示意图。

如下制备出包括了以上LPDHM1.2-DNA和LPDC-DNA片段的融合的LPDHM-DNA片段。PCR反应溶液的组成：LPDHM1.2-DNA溶液(来自第二步PCR)，10μl；LPDC-DNA溶液(来自第一步PCR)，10μl；寡核苷酸引物7AL1P，80pmol；寡核苷酸引物7ALCN，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

在PCR后，首先使扩增的LPDHM-DNA片段进行苯酚提取及随后的乙醇沉淀，然后通过5％w/v的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。在电泳后，用1μg/ml的溴化乙锭给凝胶染色，用剃刀刀片切下在紫外光下检测的DNA带，并且如上所述使用Centriruter和Centricon-10从凝胶中进行洗脱。通过在7,500×g下离心来浓缩洗脱的DNA，接下来进行乙醇沉淀，最后将该DNA溶解在50μl的蒸馏水中。

在图38中列出了构建携带有LPDHM-DNA片段的质粒的示意图。

通过苯酚提取以及随后的乙醇沉淀来进一步纯化上面得到的LPDHM-DNA片段，然后用限制酶Hind III和EcoRI消化该片段。

用限制酶Hind III和EcoRI消化1μg的克隆质粒pHSG399DNA，然后用CIP使该质粒DNA去磷酸化。然后，采用2.0型DNA连接试剂盒(TakaraShuzo有限公司)来连接得到的去磷酸化的pHSG399 DNA和事先已用Hind III和EcoRI消化的LPDHM-DNA片段。然后用该连接混合物转化大肠杆菌JM109并将该细胞涂布到含有最终浓度为1mM IPTG、0.1％w/v X-Gal和50μg/ml氯霉素的LB琼脂培养基上。在37℃下在2ml含有50μg/ml氯霉素的液体LB培养基中培养得到的任意的白色的转化子过夜，并且通过碱性-SDS方法从得到的培养物中提取质粒DNA。用Hind III和EcoRI消化提取到的质粒DNA，然后通过1％w/v琼脂糖凝胶电泳选出携带有LPDHM-DNA片段的克隆。

作为上述步骤的结果便得到了携带有包含了人源化的PDMM型HFE7A轻链的可变区以及编码人Igκ链的恒定区的DNA的融合插入片段的质粒pHSHM2。含有质粒pHSHM2的转化子大肠杆菌pHSHM2 SANK 70198已在1998年2月26日按照有关微生物保藏的布达佩斯条约保藏在Kogyo GijutsuinSeimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo中，保藏号为FERM BP-6272。

然后采用以上得到的质粒pHSHM2构建出携带有序列表SEQ ID No.108的DNA片段并编码SEQ ID No.109的人源化的PDHM型HFE7A轻链多肽的表达载体质粒pLPDHM32。

用限制酶Hind III和EcoRI消化1μg的pEE.12.1 DNA(Lonza)，其中该DNA为一种用于哺乳动物细胞的表达载体，然后用CIP使该DNA去磷酸化。使用一种2.0型DNA连接试剂盒(Takara Shuzo有限公司)将得到的消化的去磷酸化质粒DNA(100ng)与10μg的已用Hind III和EcoRI消化的pHSHM2 DNA片段连接起来。然后用该连接混合物转化大肠杆菌JM109(如上所述)，之后将该细胞涂布在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上。

用Hind III和EcoRI消化提取到的质粒DNA，并使该质粒DNA进行1％w/v的琼脂糖凝胶电泳以证实是否存在感兴趣的插入片段。这样便可以分离出质粒pLPDHM32，其中该质粒含有具有人源化的PDHM型HFE7A轻链的可变区以及编码人免疫球蛋白κ链的恒定区的DNA的融合片段。人们发现该融合片段位于以正确取向的巨细胞病毒(CMV)启动子的下游。(4) 检验核苷酸序列

为了检验质粒pLPDHH75和pLPDHM32的DNA插入片段具有所期望的核苷酸序列，分析该DNA插入片段以测定其核苷酸序列。用于核苷酸测序的寡核苷酸引物为SP1(SEQ ID No.68)、SP2(SEQ ID No.69)、SP3(SEQID No.70)、SP4(SEQ ID No.71)、SP5(SEQ ID No.72)及SP6(SEQID No.73)。

在图19中显示出每个引物结合的位置。使用含有待测序列的质粒以及已经通过碱性-SDS方法和氯化铯方法纯化的质粒作模板，通过双脱氧核苷酸链终止法测定核苷酸的序列。正如所预料的那样，证实pLPDHH75具有序列表SEQID No.106的核苷酸序列并编码SEQ ID No.107的多肽，pLPDHM32具有序列表SEQ ID No.108的核苷酸序列并编码SEQ ID No.109的多肽。

实施例10

制备编码人源化重链的DNA(1) 构建人源化形式的HFE7A抗体的重链载体

为了进一步使序列表SEQ ID No.75的氨基酸序列人源化(小鼠的抗-人Fas抗体HFE7A的人源化的重链)，分别用甘氨酸和苏氨酸来置换SEQ IDNo.75的氨基酸序列中的第44位氨基酸(精氨酸)和第76位氨基酸(丙氨酸)，其中这些置换残基在人的重链中是保守的。所得到的序列命名为“HV型”。

如下构建出携带有抗-人Fas抗体HFE7A的HV型人源化重链氨基酸序列的表达质粒。

1) 合成用于制备人源化重链的可变区的引物

通过使用PCR步骤的联合来合成编码人源化的抗-Fas抗体HFE7A重链(序列表的SEQ ID No.117)的DNA(序列表的SEQ ID No.116)。

除去7AH1P(以上的SEQ ID No.76)以外，合成了以下3种用于PCR的引物：

5′-CAGGCCCCTG GACAGGGCCT TGAGTGGATG-3′

(HPD1P；SEQ ID No.118)；

5′-CATCCACTCA AGGCCCTGTC CAGGGGCCTG-3′

(HPD1N；SEQ ID No.119)；and

5′-GCTGAGCTCC ATGTAGGCTG TGCTAGTGGA TGTGTCTAC-3′

(HPD2N；SEQ ID No.120).

2) 构建质粒pgHPDHV3

通过进行2-步PCR来制备编码序列表SEQ ID No.117的第1-102位氨基酸的HPD1.2-DNA片段，将该DNA插入质粒、然后克隆到大肠杆菌中。

a)第一步PCR

在图39中显示出用于制备HPD1.2-DNA的第一步PCR的示意图。

如下制备出编码一个分泌信号序列和FRH₁、CDRH₁以及一部分FRH₂并且在5’-末端具有一个添加的Hind III限制酶切位点的HPD1-DNA片段。PCR反应溶液的组成：质粒pgHSL7A62DNA，200ng；寡核苷酸引物7AH1P，80pmol；寡核苷酸引物HPD1N，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

如下制备出编码一部分FRH₂、CDRH₃以及一部分FRH₃的HPD2-DNA片段。PCR反应溶液的组成：质粒pgHSL7A62DNA，200ng；寡核苷酸引物HPD1P，80pmol；寡核苷酸引物HPD2N，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

在PCR后，首先使扩增的HPD1和HPD2 DNA片段进行苯酚提取及随后的乙醇沉淀，然后通过5％w/v的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。在电泳后，用1μg/ml的溴化乙锭给凝胶染色，用剃刀刀片切下在紫外光下检测的DNA带，并且如上所述使用Centriruter和Centricon-10从凝胶中进行洗脱。通过在7,500×g下离心来浓缩洗脱的DNA，接下来进行乙醇沉淀，最后将该DNA溶解在50μl的蒸馏水中。

b)第二步PCR

在图40中显示出用于制备HPD1.2-DNA的第二步PCR的示意图。

如下制备出其中融合了上述HPD1-DNA和HPD2-DNA片段的HPD1.2-DNA片段。PCR反应溶液的组成：HPD1-DNA溶液(来自第一步PCR)，10μl；HPD2-DNA溶液(来自第一步PCR)，10μl；寡核苷酸引物7AH1P，80pmol；寡核苷酸引物HPD2N，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

在PCR后，首先使扩增的HPD1.2 DNA片段进行苯酚提取及随后的乙醇沉淀，然后通过5％w/v的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。在电泳后，用1μg/ml的溴化乙锭给凝胶染色，用剃刀刀片切下在紫外光下检测的DNA带，并且如上所述使用Centriruter和Centricon-10从凝胶中进行洗脱。通过在7,500×g下离心来浓缩洗脱的DNA，接下来进行乙醇沉淀，最后将该DNA溶解在50μl的蒸馏水中。

在图41中列出了构建携带有HPD1.2-DNA片段的质粒的示意图。

通过苯酚提取以及随后的乙醇沉淀来进一步纯化上面得到的HPD1.2-DNA片段，然后用限制酶Hind III和SacI消化该片段。

接下来，用限制酶Hind III和SacI消化10μg的质粒pgHSL7A62 DNA并用CIP使之去磷酸化。然后，采用2.0型DNA连接试剂盒(Takara Shuzo有限公司)来连接得到的去磷酸化的pgHSL7A62 DNA(100ng)和事先已用Hind III和SacI消化的10μg的HPD1.2-DNA，并且把该连接混合物克隆到大肠杆菌JM109中。在37℃下在2ml含有50μg/ml氯霉素的液体LB培养基中培养任意得到的转化子过夜，并通过碱性-SDS方法从培养物中提取质粒DNA。

然后用Hind III和SacI消化提取到的质粒，以便于通过1％w/v的琼脂糖凝胶电泳来证实是否存在感兴趣的插入片段。因此便得到了携带有包含了编码人源化的HV型HFE7A重链的可变区的DNA片段以及编码人IgG1重链的恒定区的基因组DNA片段的融合插入片段的质粒pgHPDHV3。含有质粒pgHPDHV3的转化子大肠杆菌pgHPDHV3 SANK 70298已在1998年2月26日按照有关微生物保藏的布达佩斯条约保藏在Kogyo Gijutsuin Seimei-KogakuKogyo Gijutsu Kenkyujo中，保藏号为FERM BP-6273。

用限制酶Hind III和EcoRI消化10μg如上得到的质粒pgHPDHV3 DNA。与此同时，用限制酶Hind III和EcoRI消化1μg的哺乳动物表达质粒pEE.6.1DNA，然后用CIP使该DNA去磷酸化。使用2.0型连接试剂盒(Takara Shuzo有限公司)将得到的去磷酸化的pEE.6.1 DNA(100ng)与10μg经消化的pgHPDHV3 DNA连接起来，并且克隆到大肠杆菌JM109中。在37℃下，在2ml含有50μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中培养任意得到的转化子过夜，并且通过碱性-SDS方法从该培养物中提取质粒DNA。用Hind III和EcoRI消化上述质粒，以便于通过1％w/v的琼脂糖凝胶电泳来证实是否存在感兴趣的插入片段。这样便得到了质粒pEgPDHV3-21，其中该质粒含有包括编码人源化的HV型HFE7A重链的可变区的DNA片段以及编码人IgG1重链的恒定区的基因组DNA片段的融合插入片段，并且该融合片段位于以正确取向的CMV启动子的下游。(3) 检验核苷酸序列

为了检验质粒pEgPDHV3-21的DNA插入片段具有所期望的核苷酸序列，分析该DNA插入片段以测定其核苷酸序列。为了进行测序，使用了引物PEEF(SEQ ID No.104)、HPD1P(SEQ ID No.118)、HPD1N(SEQ ID No.119)及HPD2N(SEQ ID No.120)。

在图42中显示出上述引物结合的位置。使用含有待测序列并且通过碱性-SDS方法和氯化铯方法纯化的质粒作模板，通过双脱氧核苷酸链终止法测定核苷酸序列。

正如所预料的那样，证实pEgPDHV3-21具有序列表SEQ ID No.116的核苷酸序列并编码SEQ ID No.117的多肽。

实施例11

构建针对COS-1细胞的优化的高水平的表达载体

使用上述载体p7AL-HH、p7AL-HM、p7AL-MM、pLPDHH75、pLPDHM32、pEg7AH-H和pEgPDHV3-21构建出针对COS-1细胞的优化的高水平的表达载体。(1) 人源化轻链的高水平的表达载体在图43中列出了构建人源化轻链的高水平的表达载体的示意图。1) 合成用于制备SRα启动子DNA片段的引物

使用PCR来合成用于插入到人源化轻链的表达载体的SRα启动子DNA片段。

合成了以下2种用于PCR的寡核苷酸引物：

5′-TGCACGCGTG GCTGTGGAAT GTGTGTCAGT TAG-3′

(MLUA：SEQ ID No.121)；and

5′-TCCGAAGCTT TTAGAGCAGA AGTAACACTT C-3′

(HINDB：SEQ ID No.122).

2) 构建质粒

在合成后，将SRα启动子DNA片段插入到载体p7AL-HH、p7AL-HM、p7AL-MM、pLPDHH75或pLPDHM32中，然后克隆到大肠杆菌中。

如下制备出包括SRα启动子并且在5’-末端具有一个添加的MulI限制酶切位点以及在3’-末端具有一个添加的HindIII限制酶切位点的LSRα-DNA片段。PCR反应溶液的组成：质粒pME18SDNA，200ng；寡核苷酸引物MLUA，80pmol；寡核苷酸引物HINDB，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

在PCR后，首先使扩增的LSRα-DNA片段进行苯酚提取及随后的乙醇沉淀，然后通过5％w/v的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。在电泳后，用1μg/ml的溴化乙锭给凝胶染色，用剃刀刀片切下在紫外光下检测的DNA带，并且如上所述使用Centriruter和Centricon-10从凝胶中进行洗脱。通过在7,500×g下离心来浓缩洗脱的DNA，接下来进行乙醇沉淀，最后将该DNA溶解在50μl的蒸馏水中。

用限制酶MulI和Hind III消化1μg的质粒p7AL-HH、p7AL-HM、p7AL-MM、pLPDHH75或pLPDHM32 DNA，然后用CIP使该质粒DNA去磷酸化。使用2.0型DNA连接试剂盒(Takara Shuzo有限公司)把得到的去磷酸化的质粒DNA(100ng)和事先已用MulI和Hind III消化的10μl含有LSRα-DNA片段的溶液连接起来。然后，用该连接混合物转化大肠杆菌JM109并将该细胞涂布在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上。在37℃下在2ml含有50μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中培养得到的转化子过夜，并且通过碱性-SDS方法从得到的培养物中提取质粒DNA。用MulI和Hind III消化提取到的质粒DNA，并采用1％w/v琼脂糖凝胶电泳选出携带有LSRα-DNA片段的克隆。

在上述步骤之后便得到了高水平的表达载体质粒pSRHH(HH型)、pSRHM(HM型)、pSRMM(MM型)、pSRPDHH(PDHH型)以及pSRPDHM(PDHM型)。(2) 人源化重链的高水平的表达载体

在图44中列出了构建人源化重链的高水平的表达载体的示意图。

1) 合成用于制备SRα启动子DNA片段的引物

使用PCR来合成用于插入到人源化重链的表达载体的SRα启动子DNA片段。

除HINDB(SEQ IDNo 122)以外，合成了以下用于PCR的寡核苷酸引物：

5′-AAAGCGGCCG CTGCTAGCTT GGCTGTGGAA TGTGTG-3′

(NOTA：SEQ ID No.123).

2) 构建质粒

使用PCR合成SRα启动子DNA片段，将其插入到上述载体pEg7AH-H或pEgPDHV3-21中，然后克隆到大肠杆菌中。

如下制备出包括SRα启动子并且在5’-末端具有一个添加的NotI限制酶切位点以及在3’-末端具有一个添加的HindIII限制酶切位点的HSRα-DNA片段。PCR反应溶液的组成：质粒pME18SDNA，200ng；寡核苷酸引物NOTA，80pmol；寡核苷酸引物HINDB，80pmol；dNTP混合物，20μl；10×Pfu缓冲液，20μl；Pfu DNA聚合酶，10单位；以及双蒸水至最终体积为200μl。

在PCR后，首先使扩增的HSRα-DNA片段进行苯酚提取及随后的乙醇沉淀，然后通过5％w/v的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。在电泳后，用1μg/ml的溴化乙锭给凝胶染色，用剃刀刀片切下在紫外光下检测的DNA带，并且如上所述使用Centriruter和Centricon-10从凝胶中进行洗脱。通过在7,500×g下离心来浓缩洗脱的DNA，接下来进行乙醇沉淀，最后将该DNA溶解在50μl的蒸馏水中。

然后，用限制酶NotI和Hind III消化1μg的质粒pEg7AH-H或pEgPDHV3-21 DNA，然后用CIP使该质粒DNA去磷酸化。使用2.0型DNA连接试剂盒(Takara Shuzo有限公司)把得到的去磷酸化的质粒DNA(100ng)和事先已用NotI和Hind III消化的10μl含有HSRα-DNA片段的溶液连接起来。然后，用该连接混合物转化大肠杆菌JM109并将该细胞涂布在含有最终浓度为1mMIPTG、0.1％w/vX-Gal和50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上。在37℃下在2ml含有50μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中培养得到的白色的转化子过夜，并且通过碱性-SDS方法从得到的培养物中提取质粒DNA。用NotI和Hind III消化提取到的质粒DNA，然后通过1％w/v琼脂糖凝胶电泳选出携带有HSRα-DNA片段的克隆。

通过上述步骤便得到了高水平的表达载体质粒pSRg7AH和pSRgPDH(HV型)。

实施例12

在COS-1细胞中表达

按照类似于实施例4中所述的方式，通过电穿孔用以上得到的每种人源化HFE7A重链以及每种人源化HFE7A轻链的高水平的表达质粒对COS-1细胞进行转染。

在含有补充了10％v/v FCS的α(+)MEM的培养瓶(培养面积：225cm²)中培养COS-1细胞至半-汇合。接下来，弃去培养基并且通过在37℃下用3ml的胰蛋白酶-EDTA溶液(Sigma化学公司)处理3分钟来从瓶中分离出COS-1细胞。然后，通过在800r.p.m.下离心2分钟来收获经分离的细胞，之后用PBS(-)缓冲液洗涤两次。然后用PBS(-)缓冲液将洗涤后的COS-1细胞调节至1×10⁸细胞/ml以生成COS-1细胞悬浮液。

与此同时，把4μg的人源化HFE7A重链的表达质粒DNA和4μg的人源化HFE7A轻链的表达质粒DNA混合，其中每种质粒DNA均通过碱性-SDS方法和氯化铯密度梯度离心进行制备，然后在将该混合物悬浮在20μl的PBS(-)缓冲液中之前，用乙醇沉淀该混合物，其中上述完整的操作均在同一试管中进行。把得到的全部的质粒悬浮液(20μl)与20μl事先已制备好的COS-1细胞悬浮液(2×10⁶细胞)混合，并且把该混合物转移到电极组相距2mm的FCT-13(Shimadzu Seisakusyo，K.K.)室中。然后把该室装备到基因转染装置GTE-1(Shimadzu Seisakusyo，K.K.)中，并且每隔1秒钟施加每次600V、50μF的脉冲两次，以便于用感兴趣的质粒DNA来转化COS-1细胞。

在电穿孔后，把室中的细胞-DNA混合物悬浮在位于培养瓶(培养面积25cm²；Sumitomo Bakelite)中的5ml补充有10％v/v FCS的α(+)MEM中，并且在5％v/vCO₂、37℃下温育72小时。此后，收取该培养物上清液并分析其中的表达产物。

通过采用以上的方法，便得到了以每种下述质粒的联合来转染的COS-1细胞：

(A)：无质粒DNA；

(B)：用pSRgPDH和pSRPDHH共转染；

(C)：用pSRgPDH和pSRPDHM共转染；

(D)：用pSRg7AH和pSRHH共转染；

(E)：用pSRg7AH和pSRHM共转染；以及

(D)：用pSRg7AH和pSRMM共转染。

实施例13

分析Fas-结合活性

通过如下的ELISA来分析实施例12中制备的细胞培养物上清液流体中的Fas-结合活性。

以每孔50μl的量把来自表达人Fas融合蛋白的COS-1细胞并如以上参考实施例1中得到的用吸附缓冲液稀释了5倍的培养物上清液分配到96-孔板(MaxiSorb；Nunc)的孔中，在4℃下保温该板过夜以便使人Fas融合蛋白吸附到孔的表面上。接下来，用350μl的PBS-T洗涤每个孔4次。在洗涤后，以每孔50μl的量向孔中加入含有5％v/v BSA(牛血清白蛋白；Wako纯化工有限公司)的PBS-T，并在37℃下保温该板1小时以封闭每个孔残留的表面。然后，再用PBS-T洗涤孔4次。

此后，再用PBS-T洗涤孔四次，然后把50μl用PBS-T稀释了10,000倍的碱性磷酸酶标记的对山羊抗-人IgGFc具有特异性的多克隆抗体(Caltag实验室)分配到每个孔中，并在37℃下使反应进行2小时。

再用PBS-T洗涤孔四次，然后把50μl的底物溶液[溶于10％v/v二乙醇胺(pH 9.8)中的1mg/mlp-磷酸硝基苯醋溶液]分配到每个孔中，并在37℃下保温该板0.5至1小时。通过在405nm下读取每个孔的吸光度来计算包含在每种培养物上清液流体中的表达产物与人Fas融合蛋白的结合活性。

正如所预料的那样，对以上实施例12的(B)、(C)、(D)、(E) 和(F)组的上清液而言均表现出对人Fas融合蛋白的结合活性，其结果示于图45中。

实施例14

竞争性抑制HFE7A的Fas-结合活性

因为实施例12的抗体是从HFE7A得到的，所以在该实施例中得到的人源化抗-Fas抗体应当抑制HFE7A与Fas的结合。因此，测定了实施例12中得到的表达产物竞争性地抑制HFE7A与人Fas融合蛋白结合的能力。

用吸附缓冲液对如在参考实施例1中得到的含有人Fas融合蛋白的COS-1细胞培养物上清液稀释5倍，并以每孔50μl的量将其分配至用于发光检测的96-孔板(发光固相分析平板，高结合特性；Costar)的孔中。然后在4℃下保温该板过夜，以便使人Fas融合蛋白吸附到孔的表面上。

此后，用350μl的PBS-T洗涤每个孔4次，然后把100μl含有5％v/vBSA的PBS-T加入每个孔中，并在37℃下保温该板1小时以封闭每个孔残留的表面。然后再用PBS-T洗涤孔四次。

通过实施例5的方法，在含有10％v/v FCS的α(+)MEM中调节实施例12中得到的培养物上清液至抗体的最终浓度为1μg/ml。通过以含有10％v/vFCS的α(+)MEM连续2倍地稀释每种表达产物的溶液便生产出连续稀释液。用含有10％v/v FCS的α(+)MEM将AP-HFE7A稀释至50ng/ml，并把25μl得到的溶液与等体积的每种制备好的连续稀释液进行混合。

再用PBS-T洗涤每个孔四次，然后向每个孔中加入50μl的每种得到的抗体混合物，并使该板在室温下放置过夜。随后，在再次用PBS-T洗涤每个孔四次之后，把100μl的CDP-星号(star)缓冲液(9.58ml二乙醇胺，0.2g氯化镁，0.25g叠氮化钠，pH8.5)分配到每个孔中，并使该板在室温下放置10分钟。此后，弃去该CDP-星号缓冲液并以每孔50μl的量加入CDP-星号底物[1.2ml蓝宝石II(Tropix)，200μlCDP-星号(Tropix)与CDP-星号缓冲液至12ml]，然后使板再在室温下放置40分钟。

通过用发光扫描(Titertech)测量发光的强度来评价实施例12的表达产物对HFE7A与人Fas融合蛋白结合的竞争性抑制。

正如预料的那样，结果证实了上述实施例12中得到的上清液(B)、(C)、(D)、(E)和(F)的每种表达产物特异性地抑制HFE7A抗体与人Fas融合蛋白的结合。该结果示于图46。

实施例15

诱导细胞程序死亡的活性

通过类似于实施例8所述的方式来检测实施例12中得到的培养物上清液流体中表达产物的诱导细胞程序死亡的活性。

在37℃、5％v/v CO₂下，在含有10％v/v FCS(Gibco BRL)的RPMI1640培养基中培养WR19L12a细胞3天，然后把50μl(1×10⁵个细胞)得到的培养物分配到96-孔微量板(Sumitomo Bakelite)的每个孔中。在含有10％v/v FCS的RPMI1640培养基中调节实施例12中得到的培养物上清液至抗体的最终浓度为100ng/ml。通过实施例5的方法来计算浓度。通过以含有10％v/v FCS的RPMI1640连续2倍地稀释每种表达产物经调节的溶液便生产出连续稀释液。以每孔50μl的量向每个孔中加入每种表达产物溶液的每种稀释液，并在37℃下保温该板1小时。此后，用含有10％v/v FCS的RPMI1640洗涤每个孔中的细胞一次，然后将洗涤后的细胞悬浮在每孔100μl的0.5μg/ml对山羊抗-人IgGFc具有特异性的多克隆抗体(Kappel)的溶液中，其中该抗体溶解在含有10％v/v FCS的RPMI1640中。

使板在37℃下放置12小时，然后向每个孔中加入50μg含有1mg/mlXTT[2，3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-carboxyanilide内盐；Sigma化学公司]的25μMPMS(吩嗪N-甲硫酸盐；Sigma化学公司)，其中XTT的最终浓度为333μg/ml、PBS的最终浓度为8.3μM。然后在37℃下保温该板3小时，并测量每个孔在450nm下的吸光度以便于采用线粒体的减数分裂能力作为指征来计算细胞的生存力。

根据下式计算每个孔中细胞的生存力：

正如所预料的那样，以上实施例12中得到的培养物上清液流体(B)、(C)、(D)、(E)和(F)的每种表达产物均显示出诱导了在表达人Fas抗原的淋巴瘤细胞系的T细胞中的细胞程序死亡(图47)。

序列表SEQ ID No：1长度：10类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：肽序列描述：Arg Thr Gln Asn Thr Lys Cys Arg Cys Lys1 5 10SEQ ID No：2长度：5类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：蛋白框架类型：内部序列描述：Ser Tyr Trp Met Gln1 5SEQ ID No：3长度：17类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：蛋白框架类型：内部序列描述：Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys1 5 10 15GlySEQ ID No：4长度：12类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：蛋白框架类型：内部序列描述：Asn Arg Asp Tyr Ser Asn Asn Trp Tyr Phe Asp Val1 5 10SEQ ID No：5长度：15类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：蛋白框架类型：内部序列描述：Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn1 5 10 15SEQ ID No：6长度：7类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：蛋白框架类型：内部序列描述：Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser1 5SEQ ID No：7长度：9类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：蛋白框架类型：内部序列描述：Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Arg Thr1 5SEQ ID No：8长度：714类型：核酸链型：双链拓扑结构：线型分子类型：cDNA到mRNA假设：无反义：非来源：

生物体：鼠肌

细胞类型：杂交瘤

细胞系：HFE7A特性：

名称/关键词：CDS

位置：1..1392

鉴定方法：相似

名称/关键词：mat肽

位置：58..1392

鉴定方法：相似

名称/关键词：sig肽

位置：1..57

鉴定方法：相似ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT 48Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly-19 -15 -10 -5GTC CAT TCT CAG GTC CAA CTG CAG CAG CCT GGG GCT GAG CTT GTG AAG 96Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys

1 5 10CCT GGG GCT TCA GTG AAG CTG TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTC 144Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

15 20 25ACC AGC TAC TGG ATG CAG TGG GTA AAA CAG AGG CCT GGA CAG GGC CTT 192Thr Ser Tyr Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45GAG TGG ATC GGA GAG ATT GAT CCT TCT GAT AGC TAT ACT AAC TAC AAT 240Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn

50 55 60CAA AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA TTG ACT GTA GAC ACA TCC TCC AGC 288Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser SGr

65 70 75ACA GCC TAC ATG CAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCG GTC 336Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

80 85 90TAT TAC TGT GCA AGA AAT AGG GAC TAT AGT AAC AAC TGG TAC TTC GAT 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Arg Asp Tyr Ser Asn Asn Trp Tyr Phe Asp

95 100 105GTC TGG GGC ACA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GCC AAA ACG ACA 432Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr110 115 120 125CCC CCA TCT GTC TAT CCA CTG GCC CCT GGA TCT GCT GCC CAA ACT AAC 480Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn

130 135 140TCC ATG GTG ACC CTG GGA TGC CTG GTC AAG GGC TAT TTC CCT GAG CCA 528Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro

145 150 155GTG ACA GTG ACC TGG AAC TCT GGA TCC CTG TCC AGC GGT GTG CAC ACC 576Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr

160 165 170TTC CCA GCT GTC CTG CAG TCT GAC CTC TAC ACT CTG AGC AGC TCA GTG 624Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val

175 180 185ACT GTC CCC TCC AGC ACC TGG CCC AGC CAG ACC GTC ACC TGC AAC GTT 672Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val190 195 200 205GCC CAC CCG GCC AGC AGC ACC AAG GTG GAC AAG AAA ATT GTG CCC AGG 720Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg

210 215 220GAT TGT GGT TGT AAG CCT TGC ATA TGT ACA GTC CCA GAA GTA TCA TCT 768Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser

225 230 235GTC TTC ATC TTC CCC CCA AAG CCC AAG GAT GTG CTC ACC ATT ACT CTG 816Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu

240 245 250ACT CCT AAG GTC ACG TGT GTT GTG GTA GAC ATC AGC AAG GAT GAT CCC 864Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro

255 260 265GAG GTC CAG TTC AGC TGG TTT GTA GAT GAT GTG GAG GTG CAC ACA GCT 912Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala270 275 280 285CAG ACG CAA CCC CGG GAG GAG CAG TTC AAC AGC ACT TTC CGC TCA GTC 960Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val

290 295 300AGT GAA CTT CCC ATC ATG CAC CAG AAC TGG CTC AAT GGC AAG GAG TTC 1008Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asn Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe

305 310 315AAA TGC AGG GTC AAC AGT GCA GCT TTC CCT GCC CCC ATC GAG AAA ACC 1056Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

320 325 330ATC TCC AAA ACC AAA GGC AGA CCG AAG GCT CCA CAG GTG TAC ACC ATT 1104Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile

335 340 345CCA CCT CCC AAG GAG CAG ATG GCC AAG GAT AAA GTC AGT CTG ACC TGC 1152Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys350 355 360 365ATG ATA ACA GAC TTC TTC CCT GAA GAC ATT ACT GTG GAG TGG CAG TGG 1200Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp

370 375 380AAT GGG CAG CCA GCG GAG AAC TAC AAG AAC ACT CAG CCC ATC ATG AAC 1248Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn

385 390 395ACG AAT GGC TCT TAC TTC GTC TAC AGC AAG CTC AAT GTG CAG AAG AGC 1296Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser

400 405 410AAC TGG GAG GCA GGA AAT ACT TTC ACC TGC TCT GTG TTA CAT GAG GGC 1344Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly

415 420 425CTG CAC AAC CAC CAT ACT GAG AAG AGC CTC TCC CAC TCT CCT GGT AAA 1392Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys430 435 440 445SEQ ID No：9长度：464类型：氨基酸拓扑结构：线型分子类型：蛋白序列描述：Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly-19 -15 -10 -5Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys

1 5 10Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

15 20 25Thr Ser Tyr Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn

50 55 60Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser

65 70 75Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

80 85 90Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Arg Asp Tyr Ser Asn Asn Trp Tyr Phe Asp

95 100 105Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr110 115 120 125Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn

130 135 140Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro

145 150 155Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr

160 165 170Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val

175 180 185Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val190 195 200 205Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys LysIle Val Pro Arg

210 215 220Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser

225 230 235Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu

240 245 250Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro

255 260 265Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala270 275 280 285Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val

290 295 300Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asn Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe

305 310 315Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

320 325 330Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr ThrIle

335 340 345Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys350 355 360 365Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp

370 375 380Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn

385 390 395Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser

400 405 410Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly

415 420 425Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys430 435 440 445SEQ ID No：10长度：714类型：核酸链型：双链拓扑结构：线型分子类型：cDNA到mRNA假设：无反义：非来源：

生物体：鼠肌

细胞类型：杂交瘤

细胞系：HFE7A特性：

名称/关键词：CDS

位置：1..714

鉴定方法：相似

名称/关键词：mat肽

位置：61..714

鉴定方法：相似

名称/关键词：sig肽

位置：1..60

鉴定方法：相似序列描述：ATG GAG ACA GAC ACA ATC CTG CTA TGG GTG ATG ATG CTC TGG ATT CCA 48Met Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Met Met Leu Trp Ile Pro-20 -15 -10 -5GGC TCC ACT GGT GAC ATT GTG CTG ACC CAA TCT CCA GCT TCT TTG GCT 96Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala

1 5 10GTG TCT CTA GGG CAG AGG GCC ACC ATC TCC TGC AAG GCC AGC CAA AGT 144Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser

15 20 25GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG AAC TGG TAC CAA CAG AAA CCA 192Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

30 35 40GGA CAG CCA CCC AAA CTC CTC ATC TAT GCT GCA TCC AAT CTA GAA TCT 240Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser45 50 55 60GGG ATC CCA GCC AGG TTT AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC 288Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

65 70 75CTC AAC ATC CAT CCT GTG GAG GAG GAG GAT GCT GCA ACC TAT TAC TGT 336Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

80 85 90CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CGG ACG TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG 384Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

95 100 105GAA ATC AAA CGG GCT GAT GCT GCA CCA ACT GTA TCC ATC TTC CCA CCA 432Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro

110 115 120TCC AGT GAG CAG TTA ACA TCT GGA GGT GCC TCA GTC GTG TGC TTC TTG 480Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu125 130 135 140AAC AAC TTC TAC CCC AAA GAC ATC AAT GTC AAG TGG AAG ATT GAT GGC 528Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly

145 150 155AGT GAA CGA CAA AAT GGC GTC CTG AAC AGT TGG ACT GAT CAG GAC AGC 576Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser

160 165 170AAA GAC AGC ACC TAC AGC ATG AGC AGC ACC CTC ACG TTG ACC AAG GAC 624Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp

175 180 185GAG TAT GAA CGA CAT AAC AGC TAT ACC TGT GAG GCC ACTCAC AAG ACA 672Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr

190 195 200TCA ACT TCA CCC ATT GTC AAG AGC TTC AAC AGG AAT GAG TGT 714Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys205 210 215SEQ ID No：11长度：238类型：氨基酸拓扑结构：线型分子类型：蛋白序列描述：Met Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Met Met Leu Trp Ile Pro-20 -15 -10 -5Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala

1 5 10Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser

15 20 25Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

30 35 40Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser45 50 55 60Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

65 70 75Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

80 85 90Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

95 100 105Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro

110 115 120Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu125 130 135 140Asn Asn Phe Tyr Pro Lys AspIle Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly

145 150 155Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser

160 165 170Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp

175 180 185Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His LysThr

190 195 200Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys205 210 215SEQ ID No：12长度：34类型：核酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：其它核酸(合成的DNA)假设：无反义：非序列描述：GGGGAATTCC AGTACGGAGT TGGGGAAGCT CTTT 34SEQ ID No：13长度：35类型：核酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：其它核酸(合成的DNA)假设：无反义：非序列描述：GTTTCTTCTG CCTCTGTCAC CAAGTTAGAT CTGGA 35SEQ ID No：14长度：35类型：核酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：其它核酸(合成的DNA)假设：无反义：非序列描述：TCCAGATCTA ACTTGGTGAC AGAGGCAGAA GAAAC 35SEQ ID No：15长度：28类型：核酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：其它核酸(合成的DNA)假设：无反义：非序列描述：CCCTCTAGAC GCGTCACGTG GGCATCAC 28SEQ ID No：16长度：11类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：蛋白片段类型：N-末端序列描述：Gln Xaa Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu1 5 10SEQ ID No：17长度：22类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：蛋白片段类型：N-末端序列描述：Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 15Gln Arg Ala Thr Ile Ser

20SEQ ID No：18长度：19类型：核酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：其它核酸(合成的DNA)假设：无反义：非序列描述：GACCTCACCA TGGGATGGA 19SEQ ID No：19长度：20类型：核酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：其它核酸(合成的DNA)假设：无反义：非序列描述：TTTACCAGGA GAGTGGGAGA 20SEQ ID No：20长度：20类型：核酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：其它核酸(合成的DNA)假设：无反义：非序列描述：AAGAAGCATC CTCTCATCTA 20SEQ ID No：21长度：20类型：核酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：其它核酸(合成的DNA)假设：无反义：非序列描述：ACACTCATTC CTGTTGAAGC 20SEQ ID No：22长度：28类型：核酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：其它核酸(合成的DNA)假设：无反义：非序列描述：GGGGAATTCG ACCTCACCAT GGGATGGA 28SEQ ID No：23长度：32类型：核酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：其它核酸(合成的DNA)假设：无反义：非序列描述：GGGTCTAGAC TATTTACCAG GAGAGTGGGA GA 32SEQ ID No：24长度：29类型：核酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：其它核酸(合成的DNA)假设：无反义：非序列描述：GGGGAATTCA AGAAGCATCC TCTCATCTA 29SEQ ID No：25长度：37类型：核酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：其它核酸(合成的DNA)假设：无反义：非序列描述：GGGGCGGCCG CTTACTAACA CTCATTCCTG TTGAAGC 37SEQ ID No：26长度：19类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：肽序列描述：Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser1 5 10 15Lys Gly LeuSEQ ID No：27长度：19类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：肽序列描述：Val Thr Asp Ile Asn Ser Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr1 5 10 15Thr Val GluSEQ ID No：28长度：20类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：肽序列描述：Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn Leu Glu Gly1 5 10 15Leu His His Asp

20SEQ ID No：29长度：20类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：肽序列描述：Thr Gln Asn Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His Lys1 5 10 15Pro Cys Pro Pro

20SEQ ID No：30长度：20类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：肽序列描述：Gly Gln Phe Cys His Lys Pro Cys Pro Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg1 5 10 15Asp Cys Thr Val

20SEQ ID No：31长度：21类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：肽序列描述：Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro Asp1 5 10 15Cys Val Pro Cys Gln

20SEQ ID No：32长度：20类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：肽序列描述：Asn Gly Asp Glu Pro Asp Cys Val Pro Cys Gln Glu Gly Lys Glu Tyr1 5 10 15Thr Asp Lys Ala

20SEQ ID No：33长度：19类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：肽序列描述：Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His Phe Ser Ser Lys Cys Arg1 5 10 15Arg Cys ArgSEQ ID No：34长度：20类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：肽序列描述：His Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His1 5 10 15Gly Leu Glu Val

20SEQ ID No：35长度：20类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：肽序列描述：Leu Cys Asp Glu Gly His Gly Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg1 5 10 15Thr Gln Asn Thr

20SEQ ID No：36长度：20类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：肽序列描述：Glu Ile Asn Cys Thr Arg Thr Gln Asn Thr Lys Cys Arg Cys Lys Pro1 5 10 15Asn Phe Phe Cys

20SEQ ID No：37长度：20类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：肽序列描述：Lys Cys Arg Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu1 5 10 15His Cys Asp Pro

20SEQ ID No：38长度：20类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：肽序列描述：Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp Pro Cys Thr Lys Cys Glu His1 5 10 15Gly Ile Ile Lys

20SEQ ID No：39长度：20类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：肽序列描述：Cys Thr Lys Cys Glu His Gly Ile Ile Lys Glu Cys Thr Leu Thr Ser1 5 10 15Asn Thr Lys Cys

20SEQ ID No：40长度：18类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：肽序列描述：Glu Cys Thr Leu Thr Ser Asn Thr Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ser Arg1 5 10 15Ser AsnSEQ ID No：41长度：20类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：肽序列描述：Ser Ser Gly Lys Tyr Glu Gly Gly Asn Ile Tyr Thr Lys Lys Glu Ala1 5 10 15Phe Asn Val Glu

20SEQ ID No：42长度：10类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：肽序列描述：His Gly Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr1 5 10SEQ ID No：43长度：10类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：肽序列描述：Glu Ile Asn Cys Thr Arg Thr Gln Asn Thr1 5 10SEQ ID No：44长度：10类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：肽序列描述：Lys Cys Arg Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys1 5 10SEQ ID No：45长度：14类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：肽序列描述：Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp1 5 10SEQ ID No：46长度：10类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：肽序列描述：Gly Lys Ile Ala Ser Cys Leu Asn Asp Asn1 5 10SEQ ID No：47长度：34类型：核酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：其它核酸(合成的DNA)假设：无反义：非序列描述：GCGAATTCTG CCTTGACTGA TCAGAGTTTC CTCA 34SEQ ID No：48长度：32类型：核酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：其它核酸(合成的DNA)假设：无反义：非序列描述：GCTCTAGATG AGGTGAAAGA TGAGCTGGAG GA 32SEQ ID No：49长度：768类型：核酸链型：双链拓扑结构：线型分子类型：cDNA到mRNA假设：无反义：非特性：

名称/关键词：CDS

位置：40..753

名称/关键词：mat肽

位置：100..753

名称/关键词：sig肽

位置：40..99序列描述；CCCAAGCTTA AGAAGCATCC TCTCATCTAG TTCTCAGAG ATG GAG ACA GAC ACA 54

Met Glu Thr Asp Thr

-20ATC CTG CTA TGG GTG CTG CTG CTC TGG GTT CCA GGC TCC ACT GGT GAC 102Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Asp-15 -10 -5 1ATT GTG CTC ACC CAA TCT CCA GGT ACT TTG TCT CTG TCT CCA GGG GAG 150Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu

5 10 15AGG GCC ACC CTC TCC TGC AAG GCC AGC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT 198Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly

20 25 30GAT AGT TAT ATG AAC TGG TAC CAA CAG AAA CCA GGA CAG GCA CCC AGA 246Asp Ser Tyr MetAsn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg

35 40 45CTC CTC ATC TAT GCT GCA TCC AAT CTC GAA TCT GGG ATC CCA GAC AGG 294Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp Arg50 55 60 65TTT AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC CTC ACC ATC TCT CGT 342Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Th rIle Ser Arg

70 75 80CTG GAG CCG GCG GAT TTT GCA GTC TAT TAC TGT CAG CAA AGT AAT GAG 390Leu Glu Pro Ala Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu

85 90 95GAT CCT CGG ACG TTC GGT CAA GGC ACC AGG CTG GAA ATC AAA CGG ACT 438Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr

100 105 110GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAG TTG 486Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

115 120 125AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC 534Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro130 135 140 145AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAA GTG GAT AAC GCC CTC CAA TCG GGT 582Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

150 155 160AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC 630Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

165 170 175AGC CTC AGC AGC ACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC 678Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

180 185 190AAA GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC VAT CAG GGC CTG AGC TCG CCC GTC 726Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

195 200 205ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT TAGTAAGAAT TCGGG 768Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys210 215SEQ ID No：50长度：238类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：蛋白序列描述：Met Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro-20 -15 -10 -5Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser

1 5 10Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser

15 20 25Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

30 35 40Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser45 50 55 60Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

65 70 75Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Ala Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

80 85 90Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu

95 100 105Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

110 115 120Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu125 130 135 140Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

145 150 155Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

160 165 170Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

175 180 185Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

190 195 200Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys205 210 215SEQ ID No：51长度：768类型：核酸链型：双链拓扑结构：线型分子类型：cDNA到mRNA假设：无反义：非特性：

名称/关键词：CDS

位置：40..753

名称/关键词：mat肽

位置：100..753

名称/关键词：sig肽

位置：40..99序列描述：CCCAAGCTTA AGAAGCATCC TCTCATCTAG TTCTCAGAG ATG GAG ACA GAC ACA 54

Met Glu Thr Asp Thr

20 25 30GAT AGT TAT ATG AAC TGG TAC CAA CAG AAA CCA GGA CAG GCA CCC AGA 246Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg

35 40 45CTC CTC ATC TAT GCT GCA TCC AAT CTC GAA TCT GGG ATC CCA GAC AGG 294Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp Arg50 55 60 65TTT AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC CTC ACC ATC CAT CCT 342Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile His Pro

70 75 80GTG GAG GAG GAG GAT GCT GCA ACC TAT TAC TGT CAG CAA AGT AAT GAG 390Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu

180 185 190AAA GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT CAG GGC CTG AGC TCG CCC GTC 726Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

195 200 205ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT TAGTAAGAAT TCGGG 768Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys210 215SEQ ID No：52长度：238类型：氨基酸拓扑结构：线型分子类型：蛋白序列描述：Met Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro-20 -15 -10 -5Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser

1 5 10Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser

15 20 25Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

65 70 75Leu Thr Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

80 85 90Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu

95 100 105Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

145 150 155Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

160 165 170Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

175 180 185Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

190 195 200Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys205 210 215SEQ ID No：53长度：768类型：核酸链型：双链拓扑结构：线型分子类型：cDNA到mRNA假设：无反义：非特性：

名称/关键词：CDS

位置：40..753

名称/关键词：mat肽

位置：100..753

名称/关键词：sig肽

Met Glu Thr Asp Thr

20 25 30GAT AGT TAT ATG AAC TGG TAC CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC AAA 246Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys

115 120 125AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC 534Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro130 135 140 145AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAA GTG GAT AAC GCC CTC CAA TCG GGT 5 82Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

195 200 205ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT TAGTAAGAAT TCGGG 768Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys210 215SEQ ID No：54长度：238类型：氨基酸拓扑结构：线型分子类型：蛋白序列描述：Met Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro-20 -15 -10 -5Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser

1 5 10Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser

15 20 25Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

30 35 40Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser45 50 55 60Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

65 70 75Leu Thr Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

80 85 90Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu

95 100 105Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

145 150 155Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

160 165 170Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

175 180 185Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

190 195 200Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys205 210 215SEQ ID No：55长度：34类型：核酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：其它核酸(合成的DNA)假设：无反义：非序列描述：CCCAAGCTTA AGAAGCATCC TCTCATCTAG TTCT 34SEQ ID No：56长度：44类型：核酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：其它核酸(合成的DNA)假设：无反义：非序列描述：GAGAGGGTGG CCCTCTCCCC TGGAGACAGA GACAAAGTAC CTGG 44SEQ ID No：57长度：44类型：核酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：其它核酸(合成的DNA)假设：无反义：非序列描述：CCAGGTACTT TGTCTCTGTC TCCAGGGGAG AGGGCCACCC TCTC 44SEQ ID No：58长度：44类型：核酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：其它核酸(合成的DNA)假设：无反义：非序列描述：GATTCGAGAT TGGATGCAGC ATAGATGAGG AGTCTGGGTG CCTG 44SEQ ID No：59长度：45类型：核酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：其它核酸(合成的DNA)假设：无反义：非序列描述：GCTGCATCCA ATCTCGAATC TGGGATCCCA GACAGGTTTA GTGGC 45SEQ ID No：60长度：52类型：核酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：其它核酸(合成的DNA)假设：无反义：非序列描述：AAAATCCGCC GGCTCCAGAC GAGAGATGGT GAGGGTGAAG TCTGTCCCAG AC 52SEQ ID No：61长度：58类型：核酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：其它核酸(合成的DNA)假设：无反义：非序列描述：CTCGTCTGGA GCCGGCGGAT TTTGCAGTCT ATTACTGTCA GCAAAGTAAT GAGGATCC 58SEQ ID No：62长度：55类型：核酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：其它核酸(合成的DNA)假设：无反义：非序列描述：TGAAGACAGA TGGTGCAGCC ACAGTCCGTT TGATTTCCAG CCTGGTGCCT TGACC 55SEQ ID No：63长度：55类型：核酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：其它核酸(合成的DNA)假设：无反义：非序列描述：GGTCAAGGCA CCAGGCTGGA AATCAAACGG ACTGTGGCTG CACCATCTGT CTTCA 55SEQ ID No：64长度：45类型：核酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：其它核酸(合成的DNA)假设：无反义：非序列描述：

CCCGAATTCT TACTAACACT CTCCCCTGTT GAAGCTCTTT GTGAC 45

SEQ ID No：65

长度：55

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

TCTGTCCCAG ACCCACTGCC ACTAAACCTG TCTGGGATCC CAGATTCGAG ATTGG 55

SEQ ID No：66

长度：55

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

GTTTAGTGGC AGTGGGTCTG GGACAGACTT CACCTCTACC ATCCATCCTG TGGAG 55

SEQ ID No：67

长度：55

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

ATGGTGCAGC CACAGTCCGT TTGATTTCCA GCCTGGTGCC TTGACCGAAC GTCCG 55

SEQ ID No：68

长度：20

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

CCCAAGCTTA AGAAGCATCC 2O

SEQmNo：69

长度：20

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

ATCTATGCTG CATCCAATCT

20

SEQIDNo：70

长度：20

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

GTTGTGTGCC TGCTGAATAA 20

SEOIDNo：71

长度：20

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

CCCGAATTCT TACTAACACT 2O

SEQIDNo：72

长度：20

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

TTATTCAGCA GGCACACAAC 2O

SEQ ID N0：73

长度：20

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

AGATTGGAIrG CAGCATAGAT 20

SEO ID N0：74

长度：457

类型：核酸

链型：双链

拓扑结构：线型

分子类型：cDNA到mRNA

假设：无

反义：非

特性：

名称/关键词：CDS

位置：21..455

名称／关键词：mat肽

位置：78..455

名称，关键词：sig肽

位置：21..77

序列描述：

AAGCTTGGCT TGACCTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG 5O

Met G1y Trp Ser CYs I1e Ile Leu Phe Leu

-19 -15 -10

GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCr CAG GTC CAA CTG GTG CAG TCT 98

Val Ala Thr A1a Thr G1y Val His Ser G1n Va1 G1n Leu Val G1n Ser

-5 1 5

GGG GCT GAG GTC AAG AAG CCT GGG GCT TCA GTG AAG GTG TCC TGC AAG 146

G1y A]a G1u Val Lys Lys Pro G1y Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys

10 15 20

GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACC AGC TAC TGG ATG CAG TGG GTA AAA CAG 194

A1a ser G1y TVr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met G1n Trp Val Lys Gln

25 30 35

GCC CCT GGA CAG AGG Crr GAG TGG ATG GGA GAG ATT GAT CCT TCT GAT 242

A1a pro G1y G1n Arg Leu Glu Trp Met G1y G1u I1e Asp Pro Ser Asp

40 45 50 55

AGC TAT ACT AAC TAC AAT CAA AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA TTG ACT 290

Ser Tyr Thr Asn TYr Asn G1n Lys Phe Lys G1y Lys A1a Thr Leu Thr

60 65 70

GTA GAC ACA TCC GCT AGC ACA GCC TAC ATG GAG CTC AGC AGC CTG AGA 338

Val Asp Thr Ser Ala Set Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Set Leu Arg

TCT GAG GAC ACG GCG GTC TAT TAC TGT TAC TGT GCA AGA AAT AGG GAC TAT AGT 386

Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Arg Asp Tyr Ser

90 95 100

AAC AAC TGG TAC TTC GAT GTC TGG GGC GAA GGG ACC GTG GTC ACC GTC 434

Asn Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Glu Gly Thr Leu Val Thr Val

TCC TCA GCC TCC ACC AAG GGC CC 457

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Thr Leu Val Thr Val

120 125

SEQ ID No：75

长度：145

类型：氨基酸

拓扑结构：线型

分子类型：蛋白

序列描述：

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr G1y

Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Set Giy Ala Glu Val Lys Lys

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Set Cys Lys Ala Set GIy Tyr Thr Phe

Thr Set Tyr Trp Met Gin Trp Val Lys Sln Ala Pro G1y Gln Arg Leu

Glu Trp Met Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn

Gin Lys Phe Lys Giy Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Set Set Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

Tyr Tyr cys Ala Arg Asn Arg Asp Tyr Ser Ash Asn Trp Tyr Phe Asp

Val Trp Gly Glu Gly Thr Leu Val Thr Val Set Ser Ala Ser Thr Lys

长度：40

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

GGGAAGCTTG GCTTGACCTC ACCATGGGAT GGAGCTGTAT 4O

SEQIDNo：77

长度：48

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

TGDAAGCCCCA GGCTTCTTGA CCTCAGCCCC AGACTGCACC AGTTGGAC 48

SEQ ID No：78

长度：36

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

TCCACTCAAG CCTCTGTCCA GGGGCCTGTT TTACCC 36

SEQ ID No：79

长度：52

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

GTCTGGGGCT GAGGTCAAGA AGCCTGGGGC TTCAGTGAAG GTGTCCTGCA AG 52

SEQ ID No：80

长度：39

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

CAGGCCCCTG GACAGAGGCT TGAGTGGATG GGAGAGATT 39

SEQ ID No：81

长度：50

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

TCAGATCTCA GGCTGCTGAG CTCCATGTAG GCTGTGCTAG CGGATGTGTC 5O

SF．QIDNo：82

长度：44

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

TGGAGCTCAG CAGCCTGAGA TCTGAGGACA CGGCGGTCTA TTAC 44

SEQ ID No：83

长度：55

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

GATGGGCCCT TGGTGGAGGC TGAGGAGACG GTGACCAGGG TCCCTTCGCC CCAGT 55

SEQ ID No：84

长度：39

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

GGGAAGCTTC CGCGGTCACA TGGCACCACC TCTCTTGCA 39

SEQ ID No：85

长度：35

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

GCTCTGCAGA GAGAAGATTG GGAGTTACTG GAATC 35

SEQ ID No：86

长度：35

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

TCTCTGCAGA GCCCAAATCT TGTGACAAAA CTCAC 35

SEQ ID No：87

长度：39

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

GGGGAATTCG GGAGCGGGGC TTGCCGGCCG TCGCACTCA 39

SEQ ID No：88

长度：2077

类型：核酸

链型：双链

拓扑结构：线型

分子类型：DNA(基因组)

假设：无

反义：非

特性：

名称／关键词：sig肽

位置：27..83

名称/关键词：内含子

位置：741..1131

名称/关键词：内含子

位置：1177..1294

名称/关键词：内含子

位置：1625..31721

名称，关键词：外显子

位置：27..740

名称/关键词：外显子

位置：1132.上76

名称/关键词：外显子

位置：1295..1624

名称/关键词：外显子

位置：1722..2077

名称/关键词：mat肽

位置：连接(84..740，1132..1176，1295..1624，1722..2042)

名称/关键词：CDS

位置：连接(27..740，1132..76，1295..1624，1722..2042)

序列描述：

GGGCGAAAGC TTGGCTTGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC 53

Met G1y Trp Ser Cys I1e I1e Leu Phe

-19 -15

TTG GTA GCA ACA GCr ACA GGT GTC CAC TCT CAG GTC CAA C7G GTG CAG 101

Leu Val A1a Thr A1a Thr G1y Val His Ser Gln Val G1n Leu Val G1n

-10 -5 1 5

TCT GGG GCT GAG GTC AAG AAG CCT GGG GCT TCA GTG AAG GTG TCC TGC 149

Ser G1y A1a G1u Val Lys Lys Pro G1y Ala Ser Val Lys Val Ser CVs

10 15 20

AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACC AGC TAC TGG ATG CAG TGG GTA AAA 197

Lys Ala Ser G1y Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met G1n Trp Val Lys

25 30 35

CAG GCC CCT GGA CAG AGG CTT GAG TGG ATG GGA GAG ATT GAT CCT TCT 245

G1n A1a Pro G1y G1n Arg Leu G1u Trp Met G1y Glu工1e Asp pr0 Ser

40 45 50

GAT AGC TAT ACr AAC TAC AAT CAA AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA TTG 293

Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn G1n Lys Phe Lys G1y Lys Ala Thr Leu

55 60 65 70

ACT GTA GAC ACA TCC GCr AGC ACA GCC TAC ATG GAG CTC AGC AGC CTG 341

Thr Val Asp Thr Ser A1a Ser Thr Ala。Tyr Met G1u Leu Ser Ser Leu

75 80 85

AGA TCt GAG GAC ACG GCG GTC TAT TAC TGT GCA AGA AAT AGG GAC TAT 389

Arg Ser G1u Asp Thr A1a Val Tyr Tyr Cys A1a Arg Asn Arg Asp Tyr

90 95 100

AGT AAC AAC TGG TAC TTC GAT GTC TGG GGC GAA GGG ACC CTG GTC ACC 437

Ser Asn Asn Trp Tyr phe Asp Val Trp G1y G1u G1y Thr Leu Val Thr

105 110 115

GTC TCC TCA GCC TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCC CTG GCA CCC 485

Val Ser Ser A1a Ser Thr Lys G1y Pro Ser Val phe pro Leu A1a pro

120 125 130

TCC TCC AAG AGC ACC TCT GGG GGC ACA GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC 533

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly G1y Thr Ala Ala Leu G1y Cys Leu Val

135 140 145 150

AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC 581

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

155 160 165

CTG ACC AGC GGC GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC TCA GGA 629

Leu Thr Ser G1y Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser G1y

170 175 180

CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC 677

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val pro Ser Ser Ser Leu Glv

185 190 195

ACC CAG ACC TAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG 725

Thr G1n Thr Tyr I1e Cys Asn Val Asn His Lys pro Ser Asn Thr Lys

200 205 2lO

GTG GAC AAG AGA GTT GGTGAGAGGC CAGCACAGGG AGGGAGGGTG TCTGCTGGAA 780

Val Asp Lys Arg Val

215

GCCAGGCTCA GCGCTCCTGC CTGGACGCAT CCCGGCTATG CAGTCCCAGT CCAGGGCAGC 840

AAGGCAGGCC CCGTCTGCCT CTTCACCCGG AGGCCTCTGC CCGCCCCACT CATGCTCAGG 900

GAGAGGGTCT TCTGGCTTTT TCCCCAGGCT CTGGGCAGGC ACAGGCTAGG TGCCCCTAAC 960

CCAGGCCCTG CACACAAAGG GGCAGGTGCT GGGCTCAGAC CTGCCAAGAG CCATATCCGG 1020

GAGGACCCTG CCCCTGACCT AAGCCCACCC CAAAGGCCAA ACTCTCCACT CCCTCAGCTC 1080

GGACACCTTC TCTCCTCCCA GATTCCAGTA ACTCCCAATC TTCTCTCTGC A GAG CCC l137

G1u Pro

220

AAA TCT TGT GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG TGC CCA GGTAAGCCAG 1186

Lys Ser Cys Asp Tys Thr His Thr cys Pro pro cys Pr0

225 230

CCCAGGCCTC GCCCTCCAGC TCAAGGCGGG ACAGGTGCCC TAGAGTAGCC TGCATCCAGG 1246

GACAGGCCCC AGCCGGGTGC TGACACGTCC ACCTCCATCT CTTCCTCA GCA CCT GAA 1303

A1a Pro G1u

235

CTC CTG GGG GGA CCG TCA GTC TTC CTC TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC 1351

Leu Leu G1y G1y Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lvs Pro Lys Asp

240 245 250

ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACA TGC GTG GTG GTG GAC 1399

Thr Leu Met I1e Ser Arg Thr Pro G1u Val Thr Cys Val Val val Asp

255 260 265

GTG AGC CAC GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC 1447

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys phe Asn Trp Tyr Val Asp G1y

270 275 280 285

GTG GAG GTG CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC AAC 1495

Val G1u Val His ASn A1a Lys Thr Lys Pro Arg G1u Glu Gln Tyr Asn

290 295 300

AGC ACG TAC CGT GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG 1543

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr val Leu His G1n Asp Trp

305 310 315

CTG AAT GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC CCA 1591

Leu Asn G1y Lys G1u Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys ALa Leu Pro

320 325 330

GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGTGGGACCC GTGGGGTGCG 1644

A1a Pro I1e G1u Lys Thr I1e Ser Lys Ala Lys

335 340

AGGGCCACAT GGACAGAGGC CGGCTCGGCC CACCCTCTGC CCTGAGAGTG ACCGCTGTAC 1704

CAACCTCTGT CCCTACA GGG CAG CCC CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC CTG 1754

Gly G1n pro Arg Glu Pro G1n Val Tyr Thr Leu

345 350 355

CCC CCA TCC CGG GAG GAG ATG ACC AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC 1802

Pro pro Ser Arg G1u G1u Met Thr Lys Asn G1n Val Ser Leu Thr Cys

360 365 370

CTG GTC AAA GGC TTC TAT CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC 1850

Leu Val Lys G1y Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val G1u Trp G1u Ser

375 380 385

AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC AAG ACC ACG CCT CCC GTG CTG GAC 1898

Asn G1y G1n Pro G1u Asn Asn Tyr Lys Thr Thr pro pro val Leu Asp

390 395 400

TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAT AGC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC 1946

Ser Asp G1y Ser phe phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

AGG TGG CAG CAG GGG AAC GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG GCT 1994

Arg Trp G1n G1n G1y Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His G1u A1a

420 425 430 435

CTG CAC AAC CAC TAC ACG CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCC CCG GGT AAA 2042

Leu His Asn His Tyr Thr G1n Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro G1y Lys

440 445 450

TGAGTGCGAC GGCCGGCAAG CCCCGCTCCC GAATT 2077

SEQ ID No：89

长度：470

类型：氨基酸

拓扑结构：线型

分子类型：蛋白

序列描述：

Met G1y TrD Ser Cys Ile I1e Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr G1v

-19 -15 -10

Val His Ser Gln val Gln Leu val G1n Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

1 5 10

Pro G1y Ala ser Val Lys Val Ser Cys Lys A1a Ser Gly Tyr Thr phe

15 20 25

Thr ser Tyr Trp Met Gln Trp Val Lys G1n A1a Pro G1y G1n Arg Leu

30 35 40 45

Glu Trp Met G1y Glu I1e Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn

50 55 60

G1n Lys phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser A1a Ser

65 70 75

Thr Ala Tyr Met G1u Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr A1a Val

80 85 90

Tyr Tyr A1a Arg Asn Arg Asp Tyr ser Asn Asn Trp Tyr phe Asp

Val Trp G1y G1u Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

110 115 l20 l25

G1y pro Ser Val Phe Pro Leu Ala prO Ser Ser Lys Ser Thr Ser G1y

130 135 140

Gly Thr Ala Ala Leu Gly cys Leu val Lys Asp Tyr phe Pr0 Glu pro

145 150 155

Val Thr Val Ser TrD Asn Ser G1y Ala Leu Thr Ser G1y Val His Thr

160 165 170

Phe Pro Ala Val Leu G1n Ser Ser G1y Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

175 180 l85

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu G1y Thr G1n Thr Tyr I1e Cys Asn

190 195 200 205

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val G1u pro

210 215 220

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235

Leu Leu G1y G1y Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys pro Lys Asp

240 245 250

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr CVs Val Val Val Asp

255 260 265

Val Ser His G1u Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

270 275 280 285

Val G1u Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg G1u Glu Gln Tyr Asn

290 295 300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His G1n Asp Trp

305 3lO 315

Leu Asn G1y Lys G1u Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

320 325 330

Ala Pro I1e G1u Lys Thr Ile Ser Lys A1a Lys G1y G1n Pro Arg G1u

335 340 345

Pro Gln Val Tyr Thr Leu pro pro Ser Arg G1u G1u Met Thr Lys Asn

350 355 360 365

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly phe Tyr Pro Ser Asp Ile

370 375 380

A1a Val G1u Trp G1u Ser Asn G1y G1n Pro G1u Asn Asn Tyr Lys Thr

385 390 395

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

400 405 410

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp G1n Gln G1y Asn Val Phe Ser Cys

415 420 425

Ser Val Met His G1u Ala Leu His Asn His Tyr Thr G1n Lys Ser Leu

430 435 440 445

Ser Leu Ser pro G1y Lys

450

SEQ ID No：90

长度：20

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

ACAGCCGGGA AGGTGTGCAC

20

SEQ ID N0：91

长度：20

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

AGACACCCTC CCTCCCTGTG 20

SEQ ID No：92

长度：20

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

GTGCAGGGCC TGGGTTAGGG

20

SEQ ID No：93

长度：20

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

GCACGGTGGG CATGTGTGAG 20

SEQ ID No：94

长度：20

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

GTTTTGGGGG GAAGAGGAAG 20

SEQ ID No：95

长度：20

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

CCAGTCCTGG TGCAGGACGG 2O

SEQ ID No：96

长度：20

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

CCTGTGGTTC TCGGGGCTGC 20

SEQIDNo：97

长度：20

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

CGTGGTCTTG TAGTTGTTCT 2O

SEQIDNo：98

长度：20

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

CTTCCTCTTC CCCCCAAAAC 20

SEQIDNo：99

长度：20

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

CCGTCCTGCA CCAGGACTGG 20

SEQ ID No：100

长度：20

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

GCAGCCCCGA GAACCACAGG 20

SEQIDNo：101

长度：20

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

AGAACAACTA CAAGACCACG 2O

SEQ ID No：102

长度：19

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

GCCTGACATC TGAGGACTC 19

SEQIDNo：103

长度：19

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

GAGTCCTCAG ATGTCAGGC 19

SEQ ID No：104

长度：34

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

GAGCAGTACT CGTTGCTGCC GCGCGCGCCA CCAG 34

SEQ ID No：105

长度：24

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸(合成的DNA)

假设：无

反义：非

序列描述：

GGTATGGCTG ATTAATGATc AATG

24

SEQ ID No：106

长度：768碱基对

类型：核酸

链型：双链

拓扑结构：线型

分子类型：cDNA到mRNA

假设：无

反义：非

特性：

名称/关键词：CDS

位置：40..753

名称/关键词：mat肽

名称/关键词：sig肽

位置：40..99

序列描述：

CCCAAGCTTA AGAAGCATCC TCTCATCTAG TTCTCAGAG ATG GAG ACA GAC ACA 54

Met Glu Thr Asp Thr

-20

ATC CTG CrA TGG GTG CrG CrG CTC TGG GTT CCA GGC TCC ACT GGT GAG 102

I1e Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro G1y Ser Thr G1y Glu

-15 -10 -5 1

ATT GTG CTC ACC CAA TCT CCA GGT ACT TTG TCT CTG TCT CCA GGG GAG 150

Ile Val Leu Thr G1n Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro G1y Glu

5 10 15

AGG GCC ACC CTC TCC TGC AAG GCC AGC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT 198

Arg A1a Thr Leu Ser cys Lys A1a Ser G1n Ser Val Asp Tyr Asp Gly

20 25 30

GAT AGT TAT ATG AAC TGG TAC CAA CAG AAA CCA GGA CAG GCA CCC AGA 246

Asp Ser Tyr Met ASn Trp Tyr G1n G1n Lys Pro G1y G1n A1a Pro Arg

35 40 45

CTC CTC ATC TAT GCT GCA TCC AAT CTC GAA TCT GGG ATC CCA GAC AGG 294

Leu Leu I1e Tyr Ala Ala Ser Asn Leu G1u Ser G1y Ile Pro Asp Arg

50 55 60 65

TTT AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC CTC ACC ATC TCT CGT 342

phe Ser G1y Ser G1y Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg

70 75 80

CTG GAG CCG GAG GAT TTT GCA GTC TAT TAC TGT CAG CAA AGT AAT GAG 390

Leu G1u Pro Glu Asp Phe A1a Val Tyr Tyr Cys G1n G1n Ser Asn Glu

85 90 95

GAT CCT CGG ACG TTC GGT CAA GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA CGG ACT 438

Asp Pro Arg Thr phe G1y G1n G1y Thr Lys Leu Glu I1e Lys Arg Thr

100 105 110

GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAG TTG 486

Val Ala A1a Pro Ser Val Phe I1e Phe Pro pro Ser Asp G1u G1n Leu

115 120 125

AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC 534

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val cys Leu Leu ASn Asn Phe Tyr pro

130 135 140 145

AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAA GTG GAT AAC GCC CTC CAA TCG GGT 582

Arg G1u A1a Lys Val G1n Trp Lys Val Asp Asn A1a Leu G1n Ser Gly

150 155 160

AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC 630

Asn Ser G1n G1u Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

165 170 175

AGC CTC AGC AGC ACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC 678

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys A1a Asp Tyr G1u Lys His

180 185 190

AAA GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT C．AG GGC CTG AGC TCG CCC GTC 726

Lys Val Tyr A1a cys G1u Val Thr His G1n G1y Leu Ser Ser Pro Val

195 200 205

ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT TAGTAAGAAT TCGGG 768

Thr Lys Ser Phe Asn Arg G1y G1u cys

210 215

SEQ ID N0：107

长度：238氨基酸

类型：氨基酸

拓扑结构：线型

分子类型：蛋白

序列描述：

Met G1u Thr Asp Thr I1e Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val pro

-20 -15 -10 -5

G1y Ser Thr G1y Glu I1e Val Leu Thr G1n Ser pro G1y Thr Leu Ser

1 5 10

Leu Ser Pro G1y G1u Arg A1a Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser

15 20 25

Val Asp Tyr Asp G1y Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr G1n G1n Lys Pro

30 35 40

G1y G1n A1a Pro Arg Leu Leu I1e Tyr Ala A1a Ser Asn Leu G1u Ser

45 50 55 60

G1y I1e Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser G1y Thr Asp phe Thr

65 70 75

Leu Thr I1e Ser Arg Leu G1u Pro G1u Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

80 85 90

G1n G1n Ser Asn G1u Asp Pro Arg Thr Phe Gly G1n G1y Thr Lys Leu

95 100 105

G1u I1e Lys Arg Thr Val A1a Ala Pro Ser Val Phe Ile phe pro Pro

110 115 120

Ser Asp G1u G1n Leu Lys Ser G1y Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

125 130 135 14O

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg G1u Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

145 150 155

A1a Leu Gln Ser G1y Asn Ser G1n Glu Ser Val Thr G1u G1n Asp Ser

160 165 170

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lyg Ala

175 180 185

Asp Tyr G1u Lys His Lys Val Tyr Ala Cys G1u Val Thr His G1n G1y

190 195 200

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg G1y G1u Cys

205 210 215

SEQ ID No：108

长度：768碱基对

类型：核酸

链型：双链

拓扑结构：线型

分子类型：cDNA到mRNA

假设：无

反义：非

特性：

名称，关键词：CDS

位置：40..753

名称／关键词：mat肽

位置：100..753

名称，关键词：sig肽

位置：40..99

序列描述：

CCCAAGCTTA AGAAGCATCC TCTCATCTAG TTCTCAGAG ATG GAG ACA GAC ACA 54

Met Glu Thr Asp Thr

-20

ATC CTG CTA TGG GTG CTG CTG CTC TGG GTT CCA GGC TCC ACT GGT GAG 102

I1e Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu TrD Val Pro G1y Ser Thr Gly G1u

-15 -10 -5 1

ATT GTG CTC ACC CAA TCT CCA GGT ACT TTG TCT CTG TCT CCA GGG GAG l50

I1e Val Leu Thr G1n Ser Pro G1y Thr Leu Ser Leu Ser Pr0 G1y G1u

5 10 15

AGG GCC ACC CTC TCC TGC AAG GCC AGC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT 198

Arg A1a Thr Leu Ser cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly

20 25 30

GAT AGT TAT ATG AAC TGG TAC CAA CAG AAA CCA GGA C_AG GCA CCC AGA 246

Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr G1n G1n Lys pro Gly Gln A1a Pro Arg

35 40 45

CTC CTC ATC TAT GCT GCA TCC AAT CTC GAA TCT GGG ATC CCA GAC AGG 294

Leu Leu I1e Tyr Ala Ala Ser Asn Leu G1u Ser G1y I1e Pro Asp Arg

50 55 60 65

TTT AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC CTC ACC ATC CAT CCT 342

Phe Ser G1y Ser G1y Ser G1y Thr Asp Phe Thr Leu Thr 11e His pro

70 75 80

GTG GAG GAG GAG GAT GCT GCA ACC TAT TAC TGT CAG C_AA AGT AAT GAG 390

Val G1u G1u G1u Asp A1a Ala Thr Tyr Tyr CFs G1n G1n Ser Asn Glu

85 90 95

GAT CCT CGG ACG TTC GGT CAA GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA CGG ACT 438

Asp Pr0 Arg Thr Phe G1y G1n G1y Thr Lys Leu Glu I1e Lys Arg Thr

100 105 110

GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAG TTG 486

Val Ala A1a Pro Ser Val Phe工1e Phe Pro Pro Ser Asp G1u Gln Leu

115 120 125

AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC 534

Lys Ser G1y Thr Ala Ser Val Val cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr pro

130 135 140 145

Arg G1u A1a Lys Val G1n Trp Lys Val Asp Asn A1a Leu G1n Ser G1y

AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC 630

Asn Ser Gln G1u Ser Val Thr G1u G1n Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

AGC：CTC AGC AGC ACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC 678

AAA GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT CAG GGC GTG AGC TCG CCC GTC 725

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser pro Val

195 200 205

ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT TAGTAAGAAT TCGGG 768

SEQ ID No：109

长度：238氨基酸

类型：氨基酸

拓扑结构：线型

分子类型：蛋白

序列描述：

Met Glu Thr Asp Thr Asp Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp val Pro

Gly ser Thr Gly G1u Ile Val Leu Thr Gln ser Pro Gly Thr Leu ser

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala ser Gln ser

Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

Gly Gln Ala pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala ser Asn Leu Glu ser

Gly Ile Pro Asp Arg Phe ser Gly ser Gly ser Gly Thr Asp phe Thr

Leu Thr Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

Gln Gln ser Asn G1u Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu

Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Pro Ser Val phe 11e phe Pro Pro

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

125 130 135 140

Ash Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val G1n TrD Lys Val AsD Asn

145 150 155

Ala Leu Gln Ser Gly Ash Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

160 165 170

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

175 180 185

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Glv

190 195 200

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

205 210 215

SEQ ID No：llO

长度：29碱基对

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸

假设：无

反义：非

序列描述：

GGTGAGATTG TGCTCACCCA ATCTCCAGG 29

SEQ ID No：111

长度：29碱基对

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸

假设：无

反义：非

序列描述：

CCTGGAGATT GGGTGAGCAC AATCTCACC 29

SEQ ID No：112

长度：3l碱基对

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸

假设：无

反义：非

序列描述：

CCATCTCTCG TCTGGAGCCG GAGGATTTTGC 31

SEQ ID No：113

长度：31碱基对

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸

假设：无

反义：非

序列描述：

GCAAAATCCT CCGGCTCCAG ACGAGAGATG G 3l

SEQ ID No：114

长度：3l碱基对

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸

假设：无

反义：非

序列描述：

CAAGGCACCA AGCTGGAAAT CAAACGGACT G 3l

SEQ ID No：115

长度：31碱基对

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸

假设：无

反义：非

序列描述：

CAGTCCGTTT GATTTCCAGC TTGGTGCCTT G 31

SEQ ID No：116

长度：2071碱基对

类型：核酸

链型：双链

拓扑结构：线型

分子类型：DNA(基因组)

假设：无

反义：非

特性：

名称/关键词：sig肽

位置：27..77

名称/关键词：内含子

位置：741.1131

名称，关键词：内含子

位置：1177..1294

名称/关键词：内含子

位置：1619..1715

名称/关键词：外显子

位置：2l-734

名称/关键词：外显子

位置：1126-1170

名称/关键词：外显子

位置：1289..1618

名称/关键词：外显子

位置：1716-2071

名称/关键词：mat肽

位置：连接(78-734，1126-1170，1289-1618，1716-2036)

名称/关键词：CDS

位置：连接(21-734，1126．1170，1289-1618，1716-2036)

序列描述：

AAGCTTGGCT TGACCTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG 5O

Met G1y Trp Ser Cys I1e I1e Leu phe Leu

-19 -15 -10

GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCT CAG GTC CAA CTG GTG CAG TCT 98

Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser G1n Val Gln Leu Val G1n Ser

-5 1 5

GGG GCT GAG GTC AAG AAG CCT GGG GCT TCA GTG AAG GTG TCC TGC AAG 146

G1y Ala G1u Val Lys Lys pro G1y A1a Ser Val Lys Val Ser Cys Lys

10 15 20

GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACC AGC TAC TGG ATG CAG TGG GTA AAA CAG 194

Ala Ser G1y Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Gln Trp Val Lys G1n

25 30 35

GCC CCT GGA CAG GGC CTT CAG TGG ATG GGA GAG ATT GAT CCT TCT GAT 242

Ala Pro G1y Gln G1y Leu G1u TrP Met Gly Glu I1e Asp Pro Ser Asp

40 45 50 55

AGC TAT ACT AAC TAC AAT CAA AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA TTG ACT 290

Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys G1y Lys Ala Thr Leu Thr

60 65 70

GTA GAC ACA TCC ACT AGC ACA GCC TAC ATG GAG CTC AGC AGC CrG AGA 338

Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg

75 80 85

TCT GAG GAC ACG GCG GTC TAT TAC TGT GCA AGA AAT AGG GAC TAT AGT 386

Ser G1u Asp Thr A1a Val Tyr Tyr Cys A1a Arg Asn Arq Asp Tyr Ser

90 95 100

AAC AAC TGG TAC TTC GAT GTC TGG GGC GAA GGG ACC CTG GTC ACC GTC 434

Asn Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp G1y G1u G1y Thr Leu Val Thr Val

105 110 115

TCC TCA GCC TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCC CTG GCA CCC TCC 482

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser

120 125 130 135

TCC AAG AGC ACC TCT GGG GGC ACA GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG 530

Ser Lys Ser Thr Ser G1y G1y Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

140 145 150

GAC TAC TTC CCC GAA CCG GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG 578

Asp Tyr Phe Pro G1u pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser G1y A1a Leu

155 160 165

ACC AGC GGC GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC TCA GGA CTC 626

hr Ser G1y Val His Thr Phe Pro A1a Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu

170 175 180

TAC TCC CTC AGC AGC GTG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACC 674

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu G1y Thr

185 190 195

CAG ACC TAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG 722

Gln Thr Tyr I1e Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val

200 205 210 215

GAC AAG AGA GTT GGTGAGAGGC CAGCACAGGG AGGGAGGGTG TCTGCTGGAA 774

Asp Lys Arg Val

GCCAGGCTCA GCGCTCCTGC CTGGACGCAT CCCGGCTATG CAGTCCC．AGT CCAGGGCAGC 834

AAGGCAGGCC CCGTCTGCCT CrTCACCCGG AGGCCTCTGC CCGCCCCACT CATGCTCAGG 894

GAGAGGGTCT TCTGGCTTTT TCCCCAGGCT CTGGGCAGGC ACAGGCTAGG TGCCCCTAAC 954

CC．AGGCCCTG CACAC．AAAGG GGCAGGTGCT GGGCTCAGAC CTGCC．AAGAG CC．ATATCCGG 1O14

GAGGACCCTG CCCCTGACCT AAGCCCACCC CAAAGGCCAA ACTCTCCACT CCCTCAGCTC 1O74

GGACACCTTC TCTCCTCCCA GATTCCAGTA ACTCCCAATC TTCTCTCTGC A GAG CCC ll31

Glu Pro

220

AAA TCT TGT GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG TGC CCA GGTAAGCCAG 1180

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr cys Pro Pro Cys Pro

225 230

CCCAGGCCTC GCCCTCGAGC TCAAGGCGGG ACAGGTGCCC TAGAGTAGCC TGCATCCAGG l240

GACAGGCCCC AGCCCGGTGC TGACACGTCC ACCTCCATCT CTTCCTCA GCA CCT GAA 1297

A1a pro Glu

235

CTC CTG GGG GGA CCG TCA GTC TTC CTC TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC 1345

Leu Leu G1y G1y Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro pro Lys Pro Lys Asp

240 245 250

ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACA TGC GTG GTG GTG GAC 1393

Thr Leu Met I1e Ser Arg Thr Pro G1u Val Thr Cys Val Val Val Asp

255 260 265

GTG AGC CAC GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC 1441

Val Ser His G1u Asp Pro G1u Val Lys phe Asn Trp Tyr Val Asp G1y

270 275 280 285

GTG GAG GTG CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC AAC 1489

Val G1u Val His Asn A1a Lys Thr Lys Pro Arg G1u G1u G1n Tyr Asn

290 295 300

AGC ACG TAC CGT GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG 1537

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His G1n Asp Trp

305 310 315

CTG AAT GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC CCA 1585

Leu Asn G1y Lys G1u Tyr Lys Cys Lys Val Ser ASn Lys A1a Letu pro

320 325 330

GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGTGGGGACCC GTGGGGTGCG 1638

Ala pro I1e G1u Lys Thr I1e Ser Lys A1a Lys

335 340

AGGC-CCACAT GGACAGAGGC CGGCTCGGCC CACCCTCTGC CCTGAGAGTG ACCGCTGTAC 1698

CAACCTCTGT CCCTACA GGG CAG CCC CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC CTG 1748

Gly G1n pro Arg G1u pro G1n Val Tyr Thr Leu

345 350 355

CCC CCA TCC CGG GAG GAG ATG ACC AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC 1796

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn G1n Val Ser Leu Thr Cys

360 365 370

CTG GTC AAA GGC TTC TAT CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC 1844

Leu Val Lys G1y phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val G1u Trp Glu Ser

375 380 385

AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC AAG ACC ACG CCT CCC GTG CTG GAC 1892

Asn G1y G1n Pro G1u Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro pro Val Lell Asp

390 395 400

TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAT AGC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC 1940

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

AGG TGG CAG CAG GGG AAC GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG GCT 1988

Arg Trp G1n G1n G1y Asn Val Phe Ser cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430 435

CTG CAC AAC CAC TAC ACG CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCC CCG GGT AAA 2036

Leu His Asn His Tyr Thr G1n Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro G1y Lys

440 445 450

TGAGTGCGAC GGCCGGCAAG CCCCGCTCCC GAATT 2O71

SEQ ID No：117

长度：470氨基酸

类型：氨基酸

拓扑结构：线型

分子类型：蛋白

序列描述：

Met G1y Trp ser cys I1e I1e Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr G1y

-19 -15 -10

Val His Ser G1n Va1 Gln Leu Val Gln Ser G1y Ala Glu Val Lys Lys

1 5 10

pro G1y Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser G1y Tyr Thr Phe

15 20 25

Thr Ser Tyr Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

30 35 40 45

Glu Trp Met G1y Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn

50 55 60

Gln Lys phe Lys Gly Lys A1a Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr ser

80 85 90

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

80 85 90

Tyr Tyr Cys A1a Arg Asn Arg Asp ryr Ser Asn Asn Trp Tyr Phe Asp

95 100 105

Val Trp Gly G1u G1y Thr Leu Val Thr Val Ser Ser A1a Ser Thr Lys

110 115 120 125

G1y pro Ser Val Phe pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser G1y

13O 135 140

G1y Thr Ala Ala Leu G1y Cys Leu Val Lys AsP Tyr Phe pro G1u pro

145 150 155

Va1 Thr Val Ser Trp Asn Ser G1y Ala Leu Thr Ser G1y Val His Thr

160 165 170

Phe Pro A1a Val Leu G1n Ser Ser G1y Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

175 180 185

Val Thr Val pro Ser Ser Ser Leu G1y Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

190 195 200 205

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val G1u Pro

210 215 220

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys pro Pro Cys Pro A1a Pro G1u

225 230 235

Leu Leu G1y Gly pro Ser Val phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro G1u Val Thr Cys Val Val Val Asp

255 260 265

Val Ser His Glu Asp pro Glu Val Lys phe Asn Trp Tyr Val Asp G1y

270 275 280 285

Val G1u Val His Asn A1a Lys Thr Lys pro Arg G1u Glu Gln Tyr Asn

290 295 300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His G1n Asp Trp

305 310 315

Leu Asn G1y Lys G1u Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys A1a Leu Pro

320 325 330

A1a Pro I1e G1u Lys Thr I1e Ser Lys Ala Lys G1y G1n Pro Arg Glu

335 340 345

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg G1u G1u Met Thr Lys Asn

350 355 360 365

G1n Val Ser Leu Thr cys Leu Val Lys G1y phe Tyr Pro Ser Asp I1e

370 375 380

A1a Val G1u Trp G1u Ser Asn G1y Gln Pro G1u Asn Asn Tyr Lys Thr

385 390 395

Thr pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser phe Phe Leu Tyr Ser Lys

400 405 410

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln G1n Gly Asn Val phe Ser Cys

415 420 425

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr G1n Lys Ser Leu

430 435 440 445

Ser Leu Ser pro G1y Lys

450

SEQ ID No：118

长度：30碱基对

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸

假设：无

反义：非

序列描述：

CAGGCCCCTG GACAGGGCCT TGAGTGGATG 3O

SEQ ID No：119

长度：30碱基对

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸

假设：无

反义：非

序列描述：

CATCCACTCA AGGCCCTGTC CAGGGGCCTG 30

SEQ ID No：120

长度：39碱基对

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸

假设：无

反义：非

序列描述：

GCTGAGCTCC ATGTAGGCTG TGCTAGTGGA TGTGTCTAC 39

SEQ ID No：121

长度：33碱基对

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸

假设：无

反义：非

序列描述：

TGCACGCGTG GCTGTGGAAT GTGTGTCAGT TAG 33

SEQ ID No：122

长度：31碱基对

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸

假设：无

反义：非

序列描述：

TCCGAAGCTT TTAGAGCAGA AGTAACACTT C 37

SEQ ID N0：123

长度：36碱基对

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线型

分子类型：其它核酸

假设：无

反义：非

序列描述：

AAAGCGGCCG CTGCTAGCTT GGCTGTGGAA TGTGTG 36

Claims

1.具有特异于Fas抗原表位的抗原结合区的分子，所述表位在灵长类和非灵长类动物之间是保守的。

2.权利要求1的分子，其中灵长类动物是人。

3.权利要求1的分子，其中非灵长类动物是啮齿类动物。

4.权利要求3的分子，其中啮齿类动物是小鼠。

5.权利要求1的分子，其中灵长类动物是人而非灵长类动物是小鼠。

6.具有特异于哺乳动物保守的Fas抗原表位的抗原结合区的分子。

7.由保藏号为FERM BP-5828的杂交瘤HFE7A产生的抗体。

8.具有至少6个抗体CDR的分子，所述抗体针对的是人Fas，其中所述CDR与由保藏号为FERM BP-5828的杂交瘤HFE7A产生的抗体的CDR具有同一性。

9.具有抗原结合区的分子，所述结合区对由保藏号为FERM BP-5828的杂交瘤HFE7A产生的抗体所识别的抗原决定簇具有特异性。

10.权利要求1的分子，该分子是抗体。

11.权利要求6的分子，该分子是抗体。

12.权利要求8的分子，该分子是抗体。

13.权利要求9的分子，该分子是抗体。

14.含有轻多肽链和重多肽链的分子，重链具有下列通式(I)：

-FRH₁-CDRH₁-FRH₂-CDRH₂-FRH₃-CDRH₃-FRH₄- (I)

其中FRH₁表示由18-30个氨基酸组成的任何氨基酸序列，CDRH₁表示序列表中SEQ ID No.2定义的序列，FRH₂表示由14个氨基酸组成的任何氨基酸序列，CDRH₂表示序列表中SEQ ID No.3定义的序列，FRH₃表示由32个氨基酸组成的任何氨基酸序列，CDRH₃表示序列表中SEQ ID No.4定义的序列，FRH₄表示由11个氨基酸组成的任何氨基酸序列，每一个氨基酸通过肽键与另一个氨基酸结合，

轻链具有下列通式(II)：

-FRL₁-CDRL₁-FRL₂-CDRL₂-FRL₃-CDRL₃-FRL₄- (II)

15.权利要求14的分子，该分子是抗体。

16.权利要求10，11，12，13和15中任一个的抗体，该抗体为免疫球蛋白G型。

17.权利要求1-9和14中任一个的分子，该分子是人源化的分子。

18.权利要求10，11，12，13和15中任一个的抗体，该抗体是人源化的抗体。

19.权利要求1的分子，该分子能在表达Fas的异常细胞中诱导细胞程序死亡，并能在正常细胞中抑制细胞程序死亡。

20.权利要求8的分子，该分子能在表达Fas的异常细胞中诱导细胞程序死亡，并能在正常细胞中抑制细胞程序死亡。

21.权利要求8的分子用于评价由Fas/Fas配体相互作用引起的人类疾病的疗法的用途，所述评价在这种疾病的动物模型中进行。

22.具有特异于在灵长类和非灵长类动物之间保守的Fas抗原之表位的抗原结合区的人源化分子，通过将特异于所述Fas抗原表位之抗体的各个CDR移植到至少一个人轻链或其片断和至少一个人重链或其片断的每一个中可以得到所述分子。

23.权利要求22的分子，从中可得到CDR的抗体具有含有所述CDR的可变区，其中所述人轻链和重链是根据它们中所含的可变区与所述抗体的可变区之间最接近的相似性来选择的。

24.权利要求22的分子，其中将从中可得到CDR的抗体的表位识别位点所含的构架区中重要的氨基酸也移植到所述重链和轻链中以维持表位识别位点的结构。

25.权利要求1，6，8和9中任一个的分子，该分子能与含有序列表中的SEQ ID No.1的氨基酸序列的肽结合。

26.权利要求1，6，8和9中任一个的分子，所含有的轻链多肽蛋白质各选自序列表中SEQ ID No.50的氨基酸序列1-218，SEQ ID No.52的氨基酸序列1-218，SEQ ID No.54的氨基酸序列1-218，SEQ ID No.107的氨基酸序列1-218和SEQIDNo.109的氨基酸序列1-218。

27.权利要求1，6，8和9中任一个的分子，所含有的重链多肽蛋白质各选自序列表中SEQ ID No.89的氨基酸序列1-451和SEQ ID No.117的氨基酸序列1-451。

28.权利要求1，6，8和9中任一个的分子，所含有的轻链多肽蛋白质具有序列表中SEQ ID No.50的氨基酸序列1-218，所含有的重链多肽蛋白质具有序列表中SEQ ID No.89的氨基酸序列1-451。

29.权利要求1，6，8和9中任一个的分子，所含有的轻链多肽蛋白质具有序列表中SEQ ID No.107的氨基酸序列1-218，所含有的重链多肽蛋白质具有序列表中SEQ ID No.117的氨基酸序列1-451。

30.编码权利要求1，6，8和9中任一个的分子的任何单个多肽部分的DNA。

31.含有选自序列表中SEQ ID No.49的核苷酸序列100-753，SEQ IDNo.51的核苷酸序列100-753，SEQ ID No.53的核苷酸序列100-753，SEQID No.106的核苷酸序列100-753和SEQ ID No.108的核苷酸序列100-753的核苷酸序列的DNA。

32.含有选自序列表中SEQ ID No.88的核苷酸序列84-2042和SEQ IDNo.116的核苷酸序列84-2042的核苷酸序列的DNA。

33.含有编码轻链多肽蛋白质之DNA的重组DNA载体，所述多肽蛋白质各选自序列表中SEQ ID No.50的氨基酸序列1-218，SEQ ID No.52的氨基酸序列1-218，SEQ ID No.54的氨基酸序列1-218，SEQ ID No.107的氨基酸序列1-218和SEQ ID No.109的氨基酸序列1-218。

34.含有编码重链多肽蛋白质之DNA的重组DNA载体，所述多肽蛋白质各选自序列表中SEQ ID No.89的氨基酸序列1-451和SEQ ID No.117的氨基酸序列1-451。

35.由含有编码轻链多肽蛋白质之DNA的重组DNA载体转化的宿主细胞，所述多肽蛋白质各选自序列表中SEQ ID No.50的氨基酸序列1-218，SEQ ID No.52的氨基酸序列1-218，SEQIDNo.54的氨基酸序列1-218，SEQ ID No.107的氨基酸序列1-218和SEQ ID No.109的氨基酸序列1-218。

36.由含有编码重链多肽蛋白质之DNA的重组DNA载体转化的宿主细胞，所述多肽蛋白质各选自序列表中SEQ ID No.89的氨基酸序列1-451和SEQ ID No.117的氨基酸序列1-451。

37.由至少一个含有编码轻链多肽蛋白质之DNA和编码重链多肽蛋白质之DNA的重组DNA载体转化的宿主细胞，所述的轻链多肽所含的序列选自序列表中SEQ ID No.50的氨基酸序列1-218，SEQ ID No.52的氨基酸序列1-218，SEQ ID No.54的氨基酸序列1-218，SEQ ID No.107的氨基酸序列1-218和SEQ ID No.109的氨基酸序列1-218，所述的重链多肽所含的序列选自序列表中SEQ ID No.89的氨基酸序列1-451和SEQ ID No.117的氨基酸序列1-451。

38.权利要求35，36或37的宿主细胞，该细胞是哺乳动物的细胞。

39.选自大肠杆菌pHSGMM6 SANK73697(FERM BP-6071)，大肠杆菌pHSGHM 17 SANK 73597(FERM BP-6072)，大肠杆菌pHSGHH 7 SANK73497(FERM BP-6073)，大肠杆菌pHSHM2 SANK 70198和大肠杆菌pHSHH5 SANK 70398(FERM BP-6272)，大肠杆菌pgHSL7A62(FERM BP-6274)SANK 73397(FERM BP-6074)和大肠杆菌pgHPDHV3 SANK70298(FERM BP-6273)的大肠杆菌。

40.生产人源化抗-Fas抗体的方法，包括培养权利要求37的宿主细胞，然后从培养物中回收人源化抗-Fas抗体。

41.含有权利要求1，6，8或9的分子作为活性成分的药剂，所述药剂可用于治疗或预防因Fas/Fas配体系统异常引起的疾病。

42.含有权利要求1，6，8或9的分子作为活性成分的药剂，所述药剂可用于治疗或预防因Fas/Fas配体系统异常引起的疾病，其中所述疾病选自自身免疫病，变态反应，特异反应性，动脉硬化，心肌炎，心肌病，肾小球肾炎，再生不良性贫血，肝炎，获得性免疫缺损综合征和器官移植后的排斥。

43.含有权利要求1，6，8或9的分子作为活性成分的药剂，所述药剂可用于治疗或预防因Fas/Fas配体系统异常引起的疾病，其中所述自身免疫病选自全身性红斑狼疮，Hashimoto病，类风湿性关节炎，移植物抗宿主病，Sj_gren综合征，恶性贫血，阿狄森病，硬皮病，Goodpasture氏综合征，Crohn氏病，自身免疫溶血性贫血，不孕症，重症肌无力，多发性硬化，Basedow氏病，血小板减少性紫癜或赖胰岛素糖尿病。

44.含有权利要求1，6，8或9的分子作为活性成分的药剂，所述药剂可用于治疗或预防因Fas/Fas配体系统异常引起的疾病，其中所述疾病为变态反应。

45.含有权利要求1，6，8或9的分子作为活性成分的药剂，所述药剂可用于治疗或预防因Fas/Fas配体系统异常引起的疾病，其中所述疾病为类风湿性关节炎。

46.含有权利要求1，6，8或9的分子作为活性成分的药剂，所述药剂可用于治疗或预防因Fas/Fas配体系统异常引起的疾病，其中所述疾病为动脉硬化。

47.含有权利要求1，6，8或9的分子作为活性成分的药剂，所述药剂可用于治疗或预防因Fas/Fas配体系统异常引起的疾病，其中所述疾病选自由心肌炎和心肌病组成的组。

48.含有权利要求1，6，8或9的分子作为活性成分的药剂，所述药剂可用于治疗或预防因Fas/Fas配体系统异常引起的疾病，其中所述疾病为肾小球肾炎。

49.含有权利要求1，6，8或9的分子作为活性成分的药剂，所述药剂可用于治疗或预防因Fas/Fas配体系统异常引起的疾病，其中所述疾病为再生不良性贫血。

50.含有权利要求1，6，8或9的分子作为活性成分的药剂，所述药剂可用于治疗或预防因Fas/Fas配体系统异常引起的疾病，其中所述疾病为肝炎。

51.含有权利要求1，6，8或9的分子作为活性成分的药剂，所述药剂可用于治疗或预防因Fas/Fas配体系统异常引起的疾病，其中所述疾病选自由暴发性肝炎，慢性肝炎，病毒性肝炎，丙型肝炎，乙型肝炎，丁型肝炎和酒精性肝炎组成的组。

52.含有权利要求1，6，8或9的分子作为活性成分的药剂，所述药剂可用于治疗或预防因Fas/Fas配体系统异常引起的疾病，其中所述疾病为器官移植后的排斥。

53.含有权利要求1，6，8或9的分子作为活性成分的药剂，所述药剂可用于治疗或预防因Fas/Fas配体系统异常引起的疾病，其中所述疾病为获得性免疫缺损综合征。

54.权利要求1，6，8或9的分子，该分子具有一种选自下列的特性：

在表达Fas的T细胞中诱导细胞程序死亡；

改善MRL gld/gld小鼠自身免疫的症状；

不会诱导肝障碍；

对暴发性肝炎的治疗或预防效果；

对胶原-诱导的关节炎的发作的预防作用；

在风湿性关节炎患者的滑膜细胞中诱导细胞程序死亡。

55.权利要求1，6，8或9的分子具有下列特性：

在表达Fas的T细胞中诱导细胞程序死亡；

改善MRL gld/gld小鼠自身免疫的症状；

不会诱导肝障碍；

对暴发性肝炎的治疗或预防效果；

对胶原-诱导的关节炎的发作的预防作用；

在风湿性关节炎患者的滑膜细胞中诱导细胞程序死亡。

56.治疗或预防因Fas/Fas配体系统异常引起的疾病方法，包括施用有效的，无毒剂量的权利要求1，6，8或9的分子。

57.治疗或预防因Fas/Fas配体系统异常引起的疾病方法，包括施用有效的，无毒剂量的权利要求1，6，8或9的分子，其中所述疾病选自由自身免疫病，变态反应，特异反应性，动脉硬化，心肌炎，心肌病，肾小球肾炎，再生不良性贫血，肝炎，获得性免疫缺损综合征和器官移植后的排斥组成的组。

58.保藏号为FERM BP-5828的杂交瘤HFE7A。

59.生产具有特异于Fas抗原表位之抗原结合区的抗体的方法，所述方法包括培养保藏号为FERM BP-5828的杂交瘤HFE7A，并收获被表达的抗体。

60.生产抗体的方法，所述方法包括培养保藏号为FERM BP-5828的杂交瘤HFE7A，并收获被表达的抗体。