CN119752995B - GhNFXL1基因在提高棉属植物耐盐性和/或耐冷性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体而言，涉及GhNFXL1基因在提高棉属植物耐盐性和/或耐冷性中的应用。本发明通过多方面试验发现GhNFXL1基因的沉默会降低植株的耐盐性和耐冷性；GhNFXL1基因的过表达增强植株的耐盐性和耐冷性，结果表明GhNFXL1在棉花耐盐性和耐冷性起到正调控作用。

Description

GhNFXL1基因在提高棉属植物耐盐性和/或耐冷性中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体而言，涉及GhNFXL1基因在提高棉属植物耐盐性和/或耐冷性中的应用。

背景技术

盐碱地在全球范围内广泛分布，尤其集中在中东、北非、南亚、中国西部和澳大利亚等干旱和半干旱地区。这些盐碱地对作物的生长造成了严重危害，主要表现为抑制种子发芽、根系生长受限以及生理功能障碍，导致作物产量和品质下降。对于棉花而言，盐碱地的影响尤为显著，棉花在高盐环境中不仅发芽率和出苗率降低，根系发育不良，还可能导致叶片黄化和生长缓慢，最终影响纤维的质量和产量。另外，棉花是喜温植物，低温会导致其生长缓慢，影响光合作用的效率，导致叶片黄化和脱落。尤其在开花和结铃期，低温的影响尤为明显，可能导致花蕾脱落和结铃率降低，最终造成棉花产量的显著下降。

NFXL(NuclearFactorX-Like)蛋白是一类转录因子，属于NFX家族。它们在多种生物过程中发挥重要作用，包括细胞增殖、分化和应答信号传导等。AtNFXL1在花中能够被热胁迫诱导上调，在22℃下，野生型与AtNFXL1突变体植株果荚长度无显著差别。而将处于生殖期的植株进行38℃处理后正常温度恢复，与野生型相比，AtNFXL1突变体植物对高温胁迫更加敏感，其果荚变短比例增多，育性降低。TaNFXL1基因会被禾谷镰刀菌诱导表达，沉默TaNFXL1基因后，小麦的抗病性降低。

为了提高棉花的耐盐性和耐冷性，使棉花在生长发育期免受低温胁迫影响，保证棉花的产量和质量，有利于棉花品种的推广和抗性品种的选育，对于适应不同种植区域、推动农业科技进步以及保障国家棉花安全等方面都具有重要意义。

发明内容

本发明涵盖如下技术方案：

根据本发明的一方面，涉及GhNFXL1基因所对应的核酸在提高棉属植物耐盐性和/或耐冷性中的应用。

根据本发明的再一方面，涉及一种生产具有提高的耐盐性和/或耐冷性的棉属植物的方法，包括将GhNFXL1基因所对应的核酸引入棉属植物。

根据本发明的又一方面，涉及一种如上所述方法产生的棉属植物用于产生棉花繁殖材料的用途，其中繁殖材料适宜于有性繁殖、植物性繁殖或可再生的细胞的组织培养。

根据本发明的又一方面，涉及一种耐盐性和/或耐冷性棉属植物的育种方法，包括：

使用检测剂检测棉属植物中的GhNFXL1基因的表达水平，并选择表达水平高的棉花植株或品种用于育种。

有益效果：

(1)本发明首次明确基因GhNFXL1在棉花耐盐性和耐冷性的功能作用，其为增强棉花耐盐性和耐冷性提供了靶基因。

(2)本发明通过多方面试验发现GhNFXL1基因的沉默会降低植株的耐盐性和耐冷性；GhNFXL1基因的过表达增强植株的耐盐性和耐冷性，结果表明GhNFXL1在棉花耐盐性和耐冷性起到正调控作用。

(3)本发明发现的基因GhNFXL1可应用于防治棉花冷害和盐害，具体可用于增强棉花耐盐性和耐冷性遗传改良或分子育种方面，如培育耐盐性和耐冷性棉花品种。

附图说明

图1：GhNFXL1基因盐胁迫和冷胁迫表达分析；

图2：GhNFXL1基因沉默降低棉花耐盐性和耐冷性；

图3：GhNFXL1基因沉默盐胁迫和冷胁迫生理指标检测；

图4：GhNFXL1基因过表达棉花增强耐盐性和耐冷性；

图5：GhNFXL1基因过表达棉花盐胁迫和冷胁迫生理指标检测。

具体实施方式

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

本发明中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。本发明中用端点表示的数值范围包括该范围内所包含的所有数值及分数，以及所引述的端点。

本发明中，“棉属植物”是被子植物锦葵科的一属(Gossypium)，其优选的品种包括陆地棉(Gossypium hirsutum)、海岛棉(Gossypium barbadense)、树棉(Gossypiumarboreum)、草棉(Gossypium herbaceum)。

本发明中，“核酸”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”和“核酸片段”可互换使用并且是指单链或者双链的RNA和/或DNA的聚合物，其任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。-核苷酸(通常以其5′-单磷酸盐形式存在)通过如下的单字母代码指代：“A”表示腺苷酸或脱氧腺苷酸，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，并且“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，分别对应RNA或DNA；“U”表示尿苷酸；“T”表示脱氧胸苷酸；“R”表示嘌呤(A或G)；“Y”表示嘧啶(C或T)；“K”表示G或T；“H”表示A或C或T；“I”表示肌苷；并且“N”表示任一核苷酸。

“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可以包括如下修饰，包括但不限于：糖基化、脂质连接和硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、羟化和ADP-核糖基化。

“重组DNA构建体”是指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组DNA构建体可以包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或者源自相同来源、但是以不同于自然界中存在的方式排列的调控序列和编码序列。在一些具体的实施方式中，重组DNA构建体为质粒或病毒。在一些实施方式中，本发明所述重组DNA构建体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。

在本发明中，术语“基因的过表达”和“基因表达的抑制/降低”或它们的类似表述分别是指高于和低于野生型植物中表达的水平。

“杂交”两种亲本植物的交配。

“农学上优良的(性状)”，如本文使用的，指基因型，其具有许多可辨别性状的较佳或最佳表现，其允许生产者收获具有商业重要性的产品。包括但不限于种子产量、萌发势、营养势、抗病性、绿度、生长速率、总生物质或累积速率、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、谷粒收率、总植株氮含量、果实氮含量、种子氮含量、营养组织中的氮含量、总植株游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织中的游离氨基酸含量、总植株蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织中的蛋白质含量、耐旱性、氮吸收、根倒伏、收获指数、茎杆倒伏、植株高度、穗高、穗长、耐盐性、分蘖数、圆锥花序大小、早期幼苗活力以及低温胁迫下的出苗情况等。

在本发明提及的所有文献都在本发明中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本发明的发明目的和/或技术方案相冲突，否则，本发明涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。

方案描述

本发明的第一方面涉及GhNFXL1基因所对应的核酸在提高棉属植物耐盐性和/或耐冷性中的应用。

GhNFXL1基因是本领域所公知的，其NCBI Reference Sequence为XM_016812982.2(定义为序列1)。本发明所指GhNFXL1基因所对应的核酸还包含其功能等价体序列，例如其CDS序列(定义为序列2)，更为优选的核酸序列是XM_016812982.2的ORIGIN序列的第422位至第3661位核苷酸所对应序列(ATGAGCTTT……TTATGAATGA，定义为序列3)。当所述GhNFXL1基因所对应的核酸为具有如序列3所示的核苷酸序列时，应用于增强棉花耐盐性和耐冷性的效果较佳。

功能等价体序列还包括与序列1～3所示序列的任一项有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性，且能够表达具有类似或同样的NFXL转录因子活性的基因序列，可以从任何植物中分离获得。其中，序列同一性的百分比可以通过公知的生物信息学算法来获得，包括Myers和Miller算法(Bioinformatics，4(1)：11-17，1988)、Needleman-Wunsch全局比对法(J.Mol.Biol.，48(3)：443-53，1970)、Smith-Waterman局部比对法(J.Mol.Biol.，147：195-197，1981)、Pearson和Lipman相似性搜索法(PNAS，85(8)：2444-2448，1988)、Karlin和Altschul的算法(Altschul等，J.Mol.Biol.，215(3)：403-410，1990；PNAS，90：5873-5877，1993)。这对于本领域技术人员来说是熟悉的。

功能等价体序列显然还包括与在严格条件下能够与上述序列的DNA杂交的DNA序列。本发明中使用的“严格条件”是公知的，包括诸如在含400mM NaCl、40mM PIPES(pH6.4)和1mM EDTA的杂交液中于60℃杂交12～16小时，然后在65℃下用含0.1％SDS、和0.1％SSC的洗涤液洗涤15～60分钟。

功能等价体序列显然还包括上述序列经过密码子优化或经过一般性核酸修饰的序列。

本发明的第二方面涉及生产具有提高的耐盐性和/或耐冷性的棉属植物的方法，包括将GhNFXL1基因所对应的核酸引入棉属植物。

该方法能够使得GhNFXL1基因在棉属植物中过表达。

在一些实施方式中，所述核酸以重组DNA构建体的形式引入棉属植物。

重组DNA构建体包含GhNFXL1基因所对应的核酸和其他核苷酸序列，例如编码用于蛋白纯化的标签、荧光蛋白标记物和DNA的结合位点等功能单元的核苷酸序列，或者编码对基因转录和表达具有调节作用的元件，包括但不限于启动子、强启动子、增强子或转录因子结合位点等。

本发明的方法还可直接将所述核酸/重组DNA构建体引入植物产生棉属植物，使用植物生物技术领域技术人员已知的转化方法制备。任何方法可被用于将重组DNA构建体转化进植物细胞中，以产生本发明的棉属植物。转化方法可包括直接和间接的转化方法。在一些实施方式中，所述重组DNA构建体通过基因枪介导转化法、花粉管通道法或脂质体转化法导入引入棉属植物。

本发明所提供的重组DNA构建体可被插入质粒、粘粒、酵母人工染色体、细菌人工染色体或其他适合转化进宿主细胞中的任何载体中。优选的宿主细胞是细菌细胞，尤其是用于克隆或储存多核苷酸、或用于转化植物细胞的细菌细胞，例如大肠杆菌、农杆菌、根瘤土壤杆菌和毛根土壤杆菌。在一些优选的实施方式中，所述重组DNA构建体通过农杆菌引入棉属植物。

在一些实施方式中，所述方法还包括：

将引入有GhNFXL1基因所对应的核酸的棉属植物与第二棉属植物植物杂交以产生子代植物；所述第二棉属植物为农学上优良的品种。

本发明的第三方面涉及如上所述方法产生的棉属植物用于产生棉花繁殖材料的用途，其中繁殖材料适宜于有性繁殖、植物性繁殖或可再生的细胞的组织培养。

在一些实施方式中，适宜于有性繁殖的所述繁殖材料选自小孢子、花粉、子房、胚珠、胚囊和卵细胞。

在一些实施方式中，适宜于可再生的细胞的组织培养的所述繁殖材料选自叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、分生组织细胞、根、花药、花、种子和茎。

本发明的第四方面涉及一种耐盐性和/或耐冷性棉属植物的育种方法，包括：

使用检测剂检测棉属植物中的GhNFXL1基因的表达水平，并选择表达水平高的棉花植株或品种用于育种。

在一些实施方式中，所述检测剂包括用于检测所述GhNFXL1基因所表达的mRNA变化的试剂，其适用于如下至少一种方法：测序、聚合酶链式反应(PCR)、等温扩增反应、共振光散射法、生物质谱法、电化学分析、凝胶电泳、毛细管电泳、微阵列、CRISPR-Cas检测系统。

其中，核酸测序可以是马克萨姆-吉尔伯特测序、链终止法、鸟枪法测序、桥式PCR、单分子实时测序、离子半导体(离子激流测序)、合成测序、连接测序(SOLiD测序)、链终止(桑格测序)、大规模平行标签测序(MPSS)、聚合酶克隆测序、454焦磷酸测序、Illumina(Solexa)测序、DNA纳米球测序、Heliscope单分子测序、单分子实时(SMRT)测序、纳米孔DNA测序、隧道电流DNA测序、杂交测序、质谱测序、微流体桑格测序、基于显微术的技术、RNAP测序和体外病毒高通量测序。

其中，PCR优选qRT-PCR和数字PCR。

其中，广义的等温技术可以被再分成以下方法：依赖于引物的置换以起始重复的模板拷贝(以下举例说明，HDA(解旋酶依赖性扩增)，核酸外切酶依赖性扩增(EP1866434)，重组酶聚合酶扩增(RPA)、重组酶介导扩增法(RAA)、环介导的扩增(LAMP)、滚环扩增技术(RCA)、多重置换扩增(MDA)、交叉引物扩增技术(CPA))的方法和依赖于单引物分子的持续再使用或从头合成，SDA(链置换扩增和基于核酸的扩增(NASBA和TMA))的方法。

其中，依据检测核酸分子类型，CRISPR/Cas技术核酸检测可分为DNA(CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas12识别DNA序列)和RNA(CRISPR/Cas13识别RNA序列)检测。

在一些实施方式中，所述检测剂包括用于检测所述GhNFXL1基因所表达的蛋白变化的试剂，其适用于如下至少一种检测方法：免疫测定法、生物质谱法、基于凝集素的检测方法以及基于核酸适配体的检测方法。

作为免疫测定法，没有特别限定，可以举出各种的酶免疫测定法、放射免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、双单克隆抗体夹心免疫测定、单克隆多克隆抗体夹心免疫测定、免疫染色法、免疫荧光法、蛋白质印迹法、生物素-亲和素法、免疫沉淀法、胶体金凝集法、免疫色谱法、胶乳凝集法(LA)和免疫比浊法(TIA)等。

作为在免疫测定法中使用的试剂，可以使用已在销售的抗GhNFXL1的抗体，也可以基于公知的GhNFXL1的氨基酸序列通过常规方法制备抗体。

作为质谱法，没有特别限定，可以利用将使用电喷雾电离法(ESI)、基质辅助激光解吸电离法(MALDI)、表面增强激光解吸电离法(SELDI)等的离子源与飞行时间型分析仪(TOF)、离子阱型分析仪(IT)、傅立叶变换型分析仪(FT)等进行组合的质谱仪。可以使用将质谱仪与高速液相色谱(HPLC)或毛细管电泳(CE)等分离装置连接而成的LC-MS和CE-MS等。此外，作为质谱数据的获得方法，可举出：数据非依赖性分析(DIA)、数据依赖性分析(DDA)、多反应监测方法(MRM)等。质谱中还包括对试样进行iTRAQ试剂(SCIEX公司)等的稳定同位素标记的情况。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以参考本领域已知的其它实验方法，或者按照制造厂商所建议的条件。

下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。

本实施例所使用的转基因棉花受体材料为陆地棉(Gossypium hirsutum)“ZM113”。

本实施例使用的载体如下：pTRV2：沉默基因载体，用于沉默材料转化；pCambia2300-GFP：过表达载体，用于过表达材料转化。

本实施例使用的菌株如下：大肠杆菌感受态DH5α，农杆菌感受态GV3101。

其余材料或试剂，如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。

实施例1棉花种植与处理

棉花种植：挑选籽粒饱满的ZM13种子，用无菌水清洗干净后浸泡到容器中，置于28℃人工气候培养箱中过夜培养促进萌发。待种子露白后，移栽到湿润的营养土中，盖上地膜，于28℃人工气候培养箱中，自然光照16h/黑暗8h交替。

棉花冷处理：待棉花幼苗生长至两叶一心时，处理组的棉花置于4℃人工气候培养箱中，对照组置于28℃人工气候培养箱中，自然光照16h/黑暗8h交替。

棉花盐处理：待棉花幼苗生长至两叶一心时，处理组的棉花加入200mM NaCl溶液，对照组加入等体积的H₂O，将处理组和对照组置于人工气候培养箱中，自然光照16h/黑暗8h交替。

实施例2GhNFXL1基因在盐胁迫和冷胁迫下的表达分析

4℃胁迫处理后0h，1h，3h，6h，12h的陆地棉ZM113根组织进行取样，并利用RT-qPCR对GhNFXL1基因进行表达分析，内参基因为GhUBQ7基因。

RT-qPCR反应体系如下所示：

RT-qPCR反应程序如下所示：

RT-qPCR所用引物如下所示：

数据分析利用2^-ΔΔCT方法，三次平行重复，t-test，**表示P<0.01。结果显示，随着盐胁迫时间的增加，GhNFXL1基因的表达量显著升高(图1中A)。在0-3h期间，GhNFXL1基因的表达量持续升高，并在3h达到顶峰。6-24h时，GhNFXL1基因的表达量开始下降，这些结果证明GhNFXL1基因响应盐胁迫。随着冷胁迫时间的增加，GhNFXL1基因的表达量显著升高(图1中B)。在0-12h期间，GhNFXL1基因的表达量持续升高，并在12h达到顶峰。24h时，GhNFXL1基因的表达量开始下降，这些结果证明GhNFXL1基因响应冷胁迫。

实施例3GhNFXL1基因表达载体构建

1、目的片段和线性化载体的回收

(1)表达载体线性化：将基因沉默载体pTRV2和过表达载体pCambia2300-GFP按以下反应体系在37℃下孵育1h双酶切以获得线性化载体：

(2)目的片段的获得：以棉花cDNA为模板，利用诺唯赞公司的高保真酶2×PhantaMax MasterMix(Dye Plus)扩增序列，PCR反应体系如下：

PCR扩增体系如下：

引物信息

(3)将上述PCR产物和线性化表达载体通过北京全式金生物公司的胶回收试剂盒EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收纯化，具体步骤如下：

(a)在紫外灯下迅速切下含有目的条带的琼脂糖凝胶，避免长时间暴露在紫外线下对DNA造成损伤，尽量将凝胶块切碎，装至1.5mL干净离心管中，用于后续溶胶。

(b)使用电子天平称量凝胶重量，按100mg等于100μL体积，加入3倍体积BufferGDP，55℃水浴15min，期间颠倒混匀2-3次，使胶块完全溶解。

(c)将FastPure DNAMini Columns-G吸附柱置于2mL收集管中，将其冷却至室温的溶胶液体小心转移至吸附柱中，12000rpm离心1min。

(d)弃滤液，后将吸附柱放回至收集管。向吸附柱中加入300μLBuffer GDP，室温静置3min，再12000rpm离心1min。

(e)弃滤液，后将吸附柱放回收集管中。加入700μLBuffer GW，12000rpm离心1min。

(f)重复步骤(5)。

(g)弃滤液后把吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2min。

(h)将吸附柱放置于灭过菌的1.5ml离心管中，向吸附柱中央加入40μL ElutionBuffer(水浴预热至55℃)，室温放置5min。12000rpm离心1min洗脱DNA，保存于-20℃备用。

2、载体的构建和大肠杆菌的转化：用南京诺唯赞公司的UltraOne Step Cloning Kit将线性化载体和目的片段进行同源重组，构建载体，于冰上配制以下液体体系：

50℃反应10min，立即置于冰上冷却。然后将重组产物转化进大肠杆菌感受态中。

(1)将全部10μL的重组连接产物加入到100μL的刚刚融化的DH5α感受态中，冰上静置30min。

(2)42℃水浴热激45s，立即置于冰上2min。

(3)加入500μL不添加抗生素的LB液体培养基，置于37℃摇床摇1h。

(4)5,000r/min离心2min，在超净工作台中弃400μL上清液，留下100μL菌液涂布于含有相应抗生素的LB固体培养基上，吹干后倒置于37℃培养箱中过夜培养。

(5)第二天挑取平板上的单克隆于500μL的含有相应抗生素的LB液体培养基中摇至菌液浑浊，做菌液PCR，将阳性克隆送至上海生工公司进行测序，将公司返回的测序结果与目的序列进行比对，比对结果完全正确的进行保菌。

3、质粒提取：使用北京全式金Plasmid MiniPrep Kit进行大肠杆菌质粒的提取，具体步骤如下：

(1)取37℃摇床过夜培养的大肠杆菌菌液5mL于10mL离心管中，12,000r/min离心5min，弃去上清。

(2)加入300μL无色溶液RB(含RNaseA)，涡旋仪剧烈震荡使细菌沉淀悬浮，不应留有小菌块。

(3)加入300μL蓝色溶液LB，温和上下翻转混合6-8次，充分裂解菌体，直至溶液颜色变为透亮蓝色，表示裂解完全，操作应在5min内完成。

(4)加入450μL黄色溶液NB，温和上下翻转混合6-8次，直至溶液颜色由蓝色变为黄色，形成紧实的黄色凝集块，表示中和完全，室温静置2min。

(5)12,000r/min离心10min后，吸取上清液于离心柱中，一次800μL，12,000r/min离心1min，弃去收集管中液体。

(6)加入700μL漂洗液WB，12,000r/min离心1min，弃去收集管中液体，空管12,000r/min离心2min，并置于超净工作台吹干5min，去除残留的漂洗液。

(7)将离心柱置于一个干净的1.5mL离心管中，往离心柱中央加入40μL 65℃预热的ElutionBuffer，室温静置2min后，12,000r/min离心2min洗脱质粒DNA。

(8)利用NanoDrop 2000测量质粒DNA浓度，获得的质粒于-20℃保存。

4、农杆菌转化:使用上海唯地生物公司的GV3101进行农杆菌转化，具体步骤如下：

(1)取质粒2μL加入到100μL冻融状态的农杆菌感受态细胞(融化5min最佳)，用手指轻柔波动管壁混匀。

(2)依次进行以下操作：冰上静置5min，液氮中5min，37℃水浴5min，冰上静置5min。

(3)在超净工作台中加入600μL的LB液体培养基，置于28℃下200rpm摇床复苏培养3h。

(4)3000rpm离心3min，收集菌体，在超净台中弃去部分上清液，留150μL菌体用移液枪吹打重悬，将菌液均匀涂在含有Kan和Rif抗性的LB固体培养基上。于28℃培养箱倒置培养2天。

(5)阳性克隆检测：挑选单克隆菌株于600μL含有Kan和Rif抗性LB液体培养基，在28℃下200rpm培养12h。

(6)以菌液作为模板进行PCR验证。

实施例4沉默表达GhNFXL1基因降低棉花的耐盐性和耐冷性

(1)选取实验室保存的自交龄的ZM113的种子，将种子放入无菌水浸泡，37℃过夜，挑选露白的种子，胚根朝下种入1:1混合的营养土和蛭石中，盖上透明的盖子，待子叶完全展开后进行农杆菌注射。

(2)取40mL过夜培养的含基因沉默载体的农杆菌菌液于50mL干净离心管中，4000rpm离心10min，富集菌体，去上清液。

(3)使用配制好的重悬液将菌体重悬，并调节OD600＝1.0。

(4)在黑暗条件下室温静置3h培养。

(5)用1mL无菌注射器的针头小心将棉花子叶背面轻轻划破(不可穿透叶片)，将菌液从伤口处注射进叶片至整片叶片浸透。

(6)在黑暗条件下室温静置24h后移入温室培养，长到两叶一心后，4℃处理或盐处理。

提取TRV：00和TRV：GhNFXL1植株叶片的RNA，反转录后进行荧光定量鉴定，结果发现TRV：GhNFXL1基因的表达显著降低(图2中A和C)。200mM NaCl溶液处理后，结果发现TRV：GhNFXL1植株的叶片萎蔫和茎秆倒伏(图2中B)。进一步检测MDA和POD含量，同样结果发现TRV：GhNFXL1植株的MDA含量高于TRV：00植株，TRV：GhNFXL1植株的POD含量低于TRV：00植株(图3中A和B)。这些结果表明沉默GhNFXL1基因后，棉花耐盐性降低。4℃处理3天后，结果发现TRV：GhNFXL1植株的叶片严重萎蔫(图2中D)。进一步检测MDA和POD含量，结果发现TRV：GhNFXL1植株的MDA含量高于TRV：00植株，TRV：GhNFXL1植株的POD含量低于TRV：00植株(图3中C和D)。这些结果表明沉默GhNFXL1基因后，棉花耐冷性降低。

实施例5过表达GhNFXL1基因增强棉花耐盐性和耐冷性

(1)在超净工作台中，将无菌苗切成小段后装入含有GhNFXL1基因过表达载体的农杆菌侵染液的锥形瓶中侵染10min，侵染结束后，将下胚轴转移至灭过菌的大培养皿中，等待表面菌液吹干，随后将下胚轴转入共培培养基中避光培养40-46h，共培结束后，将其转移至含有cef的无菌水中浸泡20min，之后只用无菌水清洗5-6次至将残留物洗净，吹干表面水分，后将下胚轴均匀的铺于含特美汀和卡那霉素的下胚轴诱导培养基中，最后将下胚轴置于28±1℃的温室中培养。诱导出的愈伤组织转入含特美汀和卡那霉素的愈伤组织增殖培养基中培养，4周继代一次，取适量的愈伤组织转入含特美汀和卡那霉素的胚性愈伤组织诱导培养基中培养，每3周继代一次，直至出现胚性愈伤组织。

(2)将获得的胚性愈伤组织转入含特美汀和卡那霉素的胚性愈伤组织增殖培养基中扩大培养，每两周继代一次，当胚性愈伤组织增殖到一定量后，可用于后续分化成苗。

取过表达植株的叶子，提取DNA，设计特异性片段引物进行RT-qPCR扩增，结果发现GhNFXL1基因过表达株系的表达量远高于Mock(图4中A)，证明GhNFXL1基因过表达株系构建成功。选取Mock和T4代的棉花种子，水培至两叶一心后，移入含有200mM NaCl的水培液中，结果发现GhNFXL1基因过表达株系的叶片出现微弱萎蔫和茎秆稍微弯曲，而Mock植株出现更严重萎蔫现象和茎秆严重倒伏(图4中B)。进一步检测MDA和POD含量，同样结果发现GhNFXL1基因过表达植株的MDA含量低于Mock植株，GhNFXL1基因过表达植株的POD含量高于Mock植株(图5中A和B)。这些结果说明GhNFXL1基因可以提高棉花的耐盐性。另外，选取Mock和T4代的棉花种子，土培至两叶一心后，4℃处理2天后观察表型，结果发现GhNFXL1基因过表达株系的叶片出现微弱萎蔫，而Mock植株出现更严重萎蔫现象，证明GhNFXL1基因过表达株系耐冷性高于Mock植株(图4中C)。进一步检测MDA和POD含量，同样结果发现GhNFXL1基因过表达植株的MDA含量低于Mock植株，GhNFXL1基因过表达植株的POD含量高于Mock植株(图5中C和D)。这些结果说明GhNFXL1基因可以提高棉花的耐冷性。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.GhNFXL1基因所对应的核酸在提高棉属植物耐冷性中的应用；所述GhNFXL1基因所对应的NCBI RefSeq登录号是XM_016812982.2。

2.GhNFXL1基因所对应的核酸在同时提高棉属植物耐盐性和耐冷性中的应用；所述GhNFXL1基因所对应的NCBI RefSeq登录号是XM_016812982.2。

3.生产具有提高的耐冷性的棉属植物，或者具有同时提高的耐盐性和耐冷性的棉属植物的方法，包括将GhNFXL1基因所对应的核酸引入棉属植物；所述GhNFXL1基因所对应的NCBI RefSeq登录号是XM_016812982.2。

4.根据权利要求3所述的方法，所述核酸以重组DNA构建体的形式引入棉属植物。

5.根据权利要求4所述的方法，所述重组DNA构建体通过基因枪介导转化法、花粉管通道法或脂质体转化法引入棉属植物。

6.根据权利要求4所述的方法，所述重组DNA构建体通过农杆菌引入棉属植物。

7.根据权利要求3～6任一项所述的方法，其还包括：

将引入有GhNFXL1基因所对应的核酸的棉属植物与第二棉属植物杂交以产生子代植物；所述第二棉属植物为农学上优良的品种。

8.权利要求3～7任一项所述方法产生的棉属植物用于产生棉花繁殖材料的用途，其中繁殖材料适宜于有性繁殖、植物性繁殖或可再生的细胞的组织培养。

9.根据权利要求8所述的用途，适宜于有性繁殖的所述繁殖材料选自小孢子、花粉、子房、胚珠、胚囊和卵细胞。

10.根据权利要求8所述的用途，适宜于可再生的细胞的组织培养的所述繁殖材料选自叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、分生组织细胞、根、花药、花、种子和茎。