CN115772212A

CN115772212A - 紫花苜蓿叶绿体MsSAP22基因及在提高植物抗旱性中的应用

Info

Publication number: CN115772212A
Application number: CN202211396902.2A
Authority: CN
Inventors: 刘文献; 王秋霞; 魏娜; 马艺桐; 刘志鹏
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2022-11-09
Filing date: 2022-11-09
Publication date: 2023-03-10

Abstract

本发明公开了一种紫花苜蓿叶绿体MsSAP22基因及在提高植物抗旱性中的应用，所述MsSAP22基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明发现MsSAP22表达蛋白定位于叶绿体中。过表达MsSAP22基因能增强拟南芥的耐旱性，有利于从分子机制上阐明MsSAP22基因在抗渗透胁迫响应方面的作用，并且对苜蓿的定向遗传改良有重要意义。

Description

紫花苜蓿叶绿体MsSAP22基因及在提高植物抗旱性中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种紫花苜蓿叶绿体MsSAP22基因及在提高植物抗旱性中的应用。

背景技术

紫花苜蓿(Medicago sativa subsp.sativa)作为最重要的豆科牧草，在我国草牧业发展和生态经济建设中发挥着巨大作用(杨青川等，2016)。西北、华北干旱和半干旱地区是我国紫花苜蓿主产区，这些地区干旱少雨，水资源匮乏，已成为影响紫花苜蓿产量和地理分布的关键瓶颈(陈静等，2020)。另外，我国紫花苜蓿抗旱品种缺乏及对优质牧草的需求快速增加，导致苜蓿干草和种子长期依赖进口，成为影响我国草牧业发展的问题。因此，紫花苜蓿抗旱功能基因的挖掘及其响应干旱生理和分子机制的解析，对促进高抗旱紫花苜蓿遗传改良及我国草牧业发展具有重要的理论意义和实践价值。

现实研究中，由于紫花苜蓿具有多倍体遗传、近交衰退、异花授粉、自交不亲和等复杂特性，极大的阻碍了对其基因组的解析和新品种的培育。紫花苜蓿是我国西北、华北干旱和半干旱地区的主栽牧草，其虽具有一定的抗旱性，但耐旱能力较弱。随着水资源的日益匮乏，干旱胁迫已成为限制紫花苜蓿产量和品质的主要因素。近年来，研究人员从形态学、生理学、蛋白质组学及转录组学等不同领域对紫花苜蓿响应干旱胁迫开展了研究(Ma etal.，2017，Luo et al.，2019，Wang et al.，2020)，但相较于其它模式植物和重要农作物依然严重滞后。因此，迫切需要加强紫花苜蓿响应干旱胁迫基础研究，为提高紫花苜蓿耐旱能力及解决我国优质苜蓿严重依赖进口的问题奠定理论基础。

发明内容

本发明的目在于提供一种紫花苜蓿叶绿体MsSAP22基因及在提高植物抗旱性中的应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种紫花苜蓿叶绿体MsSAP22基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的核苷酸序列由366个碱基组成。

一种紫花苜蓿叶绿体MsSAP22蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。所述的序列由121个氨基酸残基组成。

包含上述紫花苜蓿叶绿体MsSAP22基因的过表达载体也落入本发明的保护范围，本发明所选用的过表达载体为农杆菌过表达载体。

本发明最重要的发明点在于通过抗渗透胁迫实验，发现该基因能够提高植物耐旱性。也就是说，该基因或蛋白或过表达载体在提高植物耐旱性方面具有重要的作用。

上述植物包括紫花苜蓿、烟草、拟南芥，但不限于此，凡是可以利用转基因技术将MsSAP22基因的过表达载体转入该植物中，均可以获得相同的技术效果。

本发明所述耐旱性表现包括：在抗渗透胁迫下，相对于野生型植株来讲，转基因植株的耐受性强于野生型。具体表现为：在含有300mM甘露醇和30μM ABA的1/2 MS培养基上，野生型和转基因株系的根系生长均受到抑制，但转基因株系的根长和侧根数显著高于野生型。还对转基因拟南芥在土壤中的抗旱性进行了评价。首先将Col-0和转基因株系在正常的1/2 MS培养基上萌发，再将萌发后的拟南芥幼苗移栽至土壤中，土壤的成分为草炭土和蛭石(3∶1)。幼苗生长约20天后，将花盆浇水至饱和后进行干旱处理，每个处理设置3次生物学重复，然后观察其表型，对野生型和转基因株系进行干旱处理12天后，转基因拟南芥开始出现萎蔫和干枯现象，但野生型拟南芥已经完全干枯。此时对所有拟南芥进行复水处理，结果表明复水后转基因拟南芥的存活率显著大于野生型，说明MsSAP22基因增强了转基因拟南芥的抗旱性。

本发明还保护一种植物育种方法，其特征在于，所述方法为(1)或(2)：

(1)通过增加目的植物中MsSAP22蛋白的活性，获得耐旱性强于目的植物的植株；

(2)通过促进目的植物中MsSAP22基因的表达，获得耐旱性强于目的植物的植株。

其中，目的植物(target plant)，本发明所述目的植物是拟南芥。

目的基因(target gene)，也称靶标基因，在基因工程设计和操作中，被用于基因重组、改变受体细胞性状和获得预期表达产物的基因。可以是生物体本身的，也可以是来自不同生物体的。

本发明中，对于适用于本发明的植物或目的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)：双子叶植物、单子叶植物或裸子植物。

作为一种优选方式，所述的“植物”包括但不限于：紫花苜蓿、烟草、拟南芥，凡是具有该基因或者与之同源的基因均适用。

本发明中所说的“植物”包括整株植物，其亲本和子代植株以及植物的不同部位，包括种子、果实、芽、茎、叶、根(包括块茎)、花、组织和器官，在这些不同的部分均有我们目的基因或者核酸。这里所提及的“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样，其中每种前述对象包含目的基因/核酸。

本发明包括任何植物细胞，或任何由其中的方法获得或可获得的植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本专利也包含由任何前述方法所获得的转染细胞、组织、器官或完整植物。唯一的要求是子代表现出相同的基因型或表型特征，使用本专利中的方法获得的子代特性相同。

本发明还扩展到如上所述的植物的可收获的部分，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根茎、块茎和球茎。同时进一步涉及植株收获后的其他衍生物，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。本发明还涉及由相关植物获得的食品或食品添加剂。

本发明的优点：

本发明首次公开了紫花苜蓿MsSAP22基因，并确定了该基因的氨基酸序列。并且发现MsSAP22表达蛋白定位于叶绿体中。

过表达MsSAP22能增强拟南芥的耐旱性，有利于从分子机制上阐明MsSAP22基因在抗渗透胁迫响应方面的作用，并且对苜蓿的定向遗传改良有重要意义

附图说明

图1是MsSAP22基因对干旱胁迫的响应；

图2是MsSAP22基因的克隆；

图3是PEG和ABA胁迫下转化酵母细胞生长情况；

图4是MsSAP22基因植物过表达载体的构建；

图5是MsSAP22蛋白的亚细胞定位；

图6是利用潮霉素抗性基因引物对MsSAP22基因过表达株系进行PCR检测；

图7是转基因拟南芥MsSAP22表达水平；

图8是甘露醇(Mannitol)和ABA胁迫下MsSAP22转基因拟南芥抗逆评价；

图9是MsSAP22转基因拟南芥土壤抗旱性评价。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但下述实施例中所涉及的具体实验方法如无特殊说明，均为常规方法或按照制造厂商说明书建议的条件实施。

若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以从市场中购买获得。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

除非另有说明，本发明的实施将使用本领域技术人员显而易见的植物学常规技术、微生物、组织培养、分子生物学、化学、生物化学、DNA重组及生物信息学技术。这些技术均在已经公开的文献中进行了充分解释，另外，本发明所采用的DNA提取、系统发育树的构建、基因编辑方法、基因编辑载体的构建、基因编辑植物获得等方法，除了下述实施例采用的方法外，采用现有文献中已经公开的方法均能实现。

此处使用的“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多聚核苷酸”术语意思是指包括分离的DNA分子(例如，cDNA或者基因组DNA)，RNA分子(例如，信使RNA)，自然类型，突变类型，合成的DNA或RNA分子，核苷酸类似物组成的DNA或RNA分子，单链或是双链结构。这些核酸或多聚核苷酸包括基因编码序列、反义序列及非编码区的调控序列，但不仅限于此。这些术语包括一个基因。“基因”或“基因序列”广泛用来指一有功能的DNA核酸序列。因此，基因可能包括基因组序列中的内含子和外显子，和/或包括cDNA中的编码序列，和/或包括cDNA及其调控序列。在特殊实施方案中，例如有关分离的核酸序列，优先默认其为cDNA。

“表达载体”，Expression vectors，是指在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。

“农杆菌介导转化法”，Agrobacterium-mediated transformation，指将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株的技术。

实施例1实时荧光定量验证

利用Primer 5.0软件设计MsSAP22基因特异性引物，引物序列如表1所示。实验所用仪器为Bio-Rad CFX Maestro实时荧光定量PCR系统，使用生工2×SG Fast qPCR MasterMix试剂盒，每个样本3个重复。PCR反应体系为10μL，包括5μL 2×SG Fast qPCR MasterMix，1μL DNF Buffer，正反向引物各0.4μL；1μL模板cDNA，2.2μL Sterilized ddH₂O。PCR反应条件为：95℃预变性3min，接下来的40个循环包括95℃变性15s，60℃退火延伸30s。用FC＝2^-ΔΔCT法，以MsActin作为内参基因计算基因的相对表达量(图1)。

表1 qRT-PCR分析引物列表

实施例2基因的克隆

(1)引物设计

依据基因组参考序列设计带有酶切位点的特异性引物(表2)，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；

表2用于克隆MsSAP22的特异引物信息

注：粗体标示的为保护碱基，下划线标示的为酶切位点。

(2)目的片段克隆

PCR扩增反应体系如下表(表3)：

表3 MsSAP22克隆PCR反应体系

PCR扩增反应程序为：

取2μL PCR反应产物上样于2％琼脂糖凝胶泳道中，电压135V，电流400mA电泳18min后在凝胶成像仪下检测目的条带。将带有目的片段的PCR反应产物收集于1.5mL离心管中，按照生工生物工程(上海)股份有限公司SanPrep柱式PCR产物纯化说明书进行PCR产物的纯化。纯化完成后，使用NanoDrop ND 8000超微量风光光度计测定纯化产物浓度和质量，用于后续载体构建(图2)。

(3)线性片段的获得

将纯化后片段和pYES2载体进行双酶切反应，酶切体系为：1μL Kpn I限制性酶、1μL Xho I限制性酶、2μL 10×M buffer、1μg质粒模板量、加入ddH₂O定容至20μL。PCR反应程序为37℃，3h；

(4)载体片段的胶回收

将双酶切获得的线性载体片段进行胶回收，凝胶回收步骤参考SanPrep柱式DNA胶回收(上海生工)说明书；

(5)目的片段的连接

在无菌PCR管中配置MsSAP22-pYES2质粒重组体系，后将混合物置于PCR仪16℃反应30min。重组体系为：1μL T4 DNA连接缓冲液、4μL目的片段DNA、2μL线性化表达载体、0.5μL T4 DNA连接酶、2.5μL ddH₂O；

将连接产物转化到大肠杆菌感受态DH5α，过夜培养后挑选单克隆进行PCR检测，检测合适的抽提质粒备用。

实施例3酵母异源表达功能验证

1.酵母感受态细胞的制备

采用PEG/LiAc法转化酵母细胞，具体步骤如下：

(1)将保存于-80℃的酵母菌株划线于YPDA固体培养基上，2-3天后挑取单克隆至10mLYPDA液体培养基中(加入10μL Kan)，28℃过夜震荡培养，使得OD₆₀₀＝0.4；

(2)将过夜培养后的酵母细胞在50mL培养基中稀释至OD₆₀₀＝0.25；

(3)将酵母细胞在30℃孵育约4-5h，直至OD₆₀₀＝1.0；

(4)将酵母细胞2,500rpm离心5min，去上清，再用40mL 1×TE重悬酵母细胞；

(5)将悬浮液以2,500rpm再次离心5min，去上清，将细胞重悬于2mL 1×LiAc/0.5×TE缓冲液中；

(6)28℃复苏细胞10min。

2.全酵母转化体的诱导

(1)每个转化加入1μg质粒DNA，100μg鲑精DNA(10mg/mL)和100μL重悬酵母细胞，轻弹混匀；

(2)再次加入700μL 1×LiAc/40％PEG-3350/1×TE，轻微颠倒混匀；

(3)放置于28℃培养箱内孵育30min；

(4)加入88μL二甲基亚砜(DMSO)，颠倒混匀，42℃热激7min；

(5)2500rpm高速离心15s，去除上清液；

(6)1mL 1×TE缓冲液重悬酵母细胞，高速离心去上清；

(7)重复步骤6一次；

(8)再次用1mL 1×TE缓冲液重悬酵母细胞；

(9)吸取50μL重悬液涂板于SC-U-葡萄糖培养基上；

(10)置于28℃培养箱中培养1-2天，对单克隆进行PCR检测。

3.酵母异源表达功能验证

(1)选择一个含有目的基因的阳性单克隆和一个只含pYES2空载体的单克隆，接种于10mL带有Amp抗性的SC-u/2％(w/v)葡萄糖液体培养基，28℃200rpm摇床孵育20小时；

(2)测定菌液的OD₆₀₀，将菌液接种到10mL SC-u/2％(w/v)半乳糖液体培养基中，使得新菌液的OD₆₀₀＝0.4，28℃摇床震荡培养36h以促进外源基因表达；

(3)吸取200μL菌液，将OD₆₀₀调节至1，1000rpm瞬时离心10sec，弃上清，模拟干旱和ABA胁迫的组分别加入等量的灭菌30％(w/v)PEG-6000溶液，250μM ABA溶液，无菌水(对照)，在28℃摇床震荡培养36h。

(4)将处理后的菌液10倍梯度稀释(1，10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6)，吸取2μL稀释液接种于SC-u/2％(w/v)葡萄糖平板上，在28℃培养箱倒扣培养3-4天，观察菌落生长情况并拍照记录(图3)。

为了进一步证实MsSAP22基因在干旱胁迫下可能发挥的作用和功能，我们以空载体pYES2作为对照，对MsSAP22-pYES2转化的酵母菌株INVSc1进行了独立的抗胁迫试验。研究了过表达MsSAP22对酵母细胞在30％PEG和250μM ABA培养基中存活的影响。如图3所示，在非胁迫条件下，转MsSAP22基因与空载体对照酵母细胞的生长情况基本没有差异，而在30％PEG和250μM ABA的作用下，MsSAP22转化系存活较好，对照组空载转化系酵母细胞受到强烈的抑制。这些结果表明，MsSAP22提高了酵母细胞的胁迫耐受性，可能在紫花苜蓿对非生物胁迫的响应上具有较强的作用。

实施例4基因位置和功能鉴定

1.植物表达载体构建

(1)引物设计

(2)目的基因克隆体系如下表(表4)：

表4 pHG：：MsSAP22 PCR克隆体系

PCR扩增反应程序为：

电泳及纯化方法同实施例2；

(3)线性片段的获得

将纯化后基因片段和pHG质粒进行双酶切反应，体系为：1μL Pst I限制性酶、1μLHind III限制性酶、2μL 10×M buffer、1μg质粒模板、ddH₂O定容至20μL(图4)。

2.烟草瞬时转化

(1)将检测阳性的农杆菌单克隆加入10mL带有Kan抗性的LB液体培养基28℃，200rpm过夜扩摇；

(2)取1.5mL菌液室温8,000rpm离心2min，弃上清，再加1mL渗透液悬浮菌体；

(3)重复步骤(2)一次；

(4)测定菌液OD₆₀₀值，在1.5mL离心管中重悬菌液，使得新菌液OD₆₀₀为0.4-0.6之间，室温放置2-3h，准备侵染；

(5)侵染前给烟草浇足够的水，并提前1h将烟草转移到白色荧光灯下，使烟草气孔充分张开有利于注射，每一株选择两个叶片(倒三叶和倒四叶)侵染同一种菌液；

(6)用1mL无针头注射器轻轻擦除叶片背面无主脉处的下表皮蜡质，形成注射点，标记待转区域；

(7)用无针头注射器吸取1mL悬浮液由注射点轻轻推入，注射液在叶背无法继续扩散时，停止注射；每个叶片注射四个点，基因及空载各注射五个植株。用记号笔标记侵染区域；

(8)注射完成后将叶片喷水，套黑色塑料袋，在培养箱中25℃暗培养12h后转移至光下正常培养。

3.用荧光显微镜观察目标蛋白表达情况

构建了在CaMV35S启动子控制下的MsSAP22-eGFP融合蛋白，并将其在本氏烟草表皮细胞中瞬时表达，以eGFP空载体作为阳性对照。侵染两天后的烟草叶片作为实验材料，在激光共聚焦显微镜下进行观察。共聚焦显微镜下，eGFP空载体均匀分布于细胞内(图5)。MsSAP22-eGFP融合蛋白的荧光信号呈点状分布，且能与叶绿体自发荧光信号重叠，表明MsSAP22表达蛋白定位于叶绿体中(图5)。

4.拟南芥转化筛选及阳性植株检测

为了检测遗传转化获得的转基因拟南芥植株是否为阳性植株，本研究对获得的16个转基因拟南芥株系提取总DNA，并使用潮霉素抗性基因(598bp)引物进行PCR检测，结果显示所有株系的DNA都能够扩增出特异性目的条带，总阳性率达到100％(图6)。经过纯合筛选后，本研究鉴定了五个转基因纯和株系MsSAP22基因的表达水平。结果表明，这五个纯和株系中MsSAP22基因的表达水平明显提升(图7)，挑选表达量最高的OE4，OE9，OE11进行后续的抗旱评价实验。

5.转基因拟南芥抗逆性评价

为了评价转基因拟南芥苗期的抗旱性，在无抗性1/2 MS培养基上萌发种子，将十日龄的拟南芥幼苗平铺在1/2 MS培养基及含有300mM甘露醇(Mannitol)和30μM ABA的1/2MS培养基上，设置3个生物学重复，标记其根长原始位置，竖直摆放培养，7天后观察拟南芥根系生长状况并测量和计算其相对根长以评价转基因拟南芥苗期抗旱性，结果如图8所示，在1/2 MS培养基上，野生型和转基因株系的生长无显著差异。在含有300mM甘露醇和30μMABA的1/2 MS培养基上，野生型和转基因株系的根系生长均受到抑制，但转基因株系的根长和侧根数显著高于野生型，说明MsSAP22基因能显著提高转基因拟南芥的抗渗透胁迫能力。

除在培养基上进行抗旱性评价外，本研究也对转基因拟南芥在土壤中的抗旱性进行了评价。首先将Col-0和转基因株系在正常的1/2 MS培养基上萌发，再将萌发后的拟南芥幼苗移栽至土壤中，土壤的成分为草炭土和蛭石(3∶1)。幼苗生长约20天后，将花盆浇水至饱和后进行干旱处理，每个处理设置3次生物学重复，然后观察其表型，结果如图9所示，对野生型和转基因株系进行干旱处理12天后，转基因拟南芥开始出现萎蔫和干枯现象，但野生型拟南芥已经完全干枯。此时对所有拟南芥进行复水处理，结果表明复水后转基因拟南芥的存活率显著大于野生型，说明MsSAP22增强了转基因拟南芥的抗旱性。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。

Claims

1.紫花苜蓿叶绿体MsSAP22基因，其特征在于，所述MsSAP22基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

2.一种编码权利要求1所述MsSAP22基因的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.包含权利要求1所述紫花苜蓿叶绿体MsSAP22基因的过表达载体。

4.权利要求1所述基因或权利要求2所述蛋白或权利要求3所述过表达载体在提高植物抗旱性中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物包括紫花苜蓿、烟草、拟南芥。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述耐旱下表现为：在抗渗透胁迫下，相对于野生型植株来讲，转基因植株的耐受性强于野生型。

7.一种植物育种方法，其特征在于，所述方法为(1)或(2)：

(1)通过增加目的植物中MsSAP22蛋白的活性，获得抗旱性强于目的植物的植株；

(2)通过促进目的植物中MsSAP22基因的表达，获得抗旱性强于目的植物的植株。

8.根据权利要求7所述的植物育种方法，其特征在于，所述目的植物包括紫花苜蓿、烟草、拟南芥。