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CN119604537A - 结合至人类pad4的抗体及其用途 - Google Patents

结合至人类pad4的抗体及其用途 Download PDF

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CN119604537A
CN119604537A CN202380055356.2A CN202380055356A CN119604537A CN 119604537 A CN119604537 A CN 119604537A CN 202380055356 A CN202380055356 A CN 202380055356A CN 119604537 A CN119604537 A CN 119604537A
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B·E·古尔布兹巴拉班
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王芸
肖清
R·昌德兰
S·杜德冈卡尔
M·L·多伊尔
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A·沙尔马
赵启洪
K·门萨
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Bristol Myers Squibb Co
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Abstract

本申请涉及特定抗PAD4(peptidyl arginine deiminase 4；肽基精氨酸脱亚胺酶4)抗体、编码所述抗体的核酸、包含所述核酸的载体及宿主细胞，以及制造及使用所述抗体的方法。

Description

结合至人类PAD4的抗体及其用途
相关申请的交互引用
本申请主张2022年7月22日申请的美国临时申请案第63/369,184号及2022及8月12日申请的美国临时申请案第63/397,698号的优先权权益，该两个临时申请案均以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本申请涉及特定抗PAD4(肽基精氨酸脱亚胺酶4)抗体、编码所述抗体的核酸、包含所述核酸的载体及宿主细胞，以及制造及使用所述抗体的方法。
背景技术
PAD4(肽基精氨酸脱亚胺酶4)为人类中五种PAD酶(PAD1、2、3、4及6)之一，并且存在于若干免疫细胞类型中且通过将精氨酸转化为瓜氨酸来发挥作用。(Chavanas等人，Gene330:19-27(2004))。此类瓜氨酸化是一种压力反应，并且可以作用于去除压力细胞的信号。(Brentville等人，Oncoimmunology 8:e1576490(2019))。在嗜中性粒细胞中，PAD4亦在称为NETosis的过程中起作用，透过该过程，嗜中性粒细胞挤出含有DNA支架、瓜氨酸化组蛋白及抗菌嗜中性粒细胞性颗粒的解浓缩染色质结构复合物。(Li等人.J.Exp.Med.207:1853-62(2010))。这些挤出的复合物被称为嗜中性粒细胞细胞外陷阱(neutrophilextracellular trap；NET)，且在NETosis期间，这些NET会捕捉且杀死入侵的微生物，作为先天性免疫反应的一部分。(Chamardani等人，Mol.Cell.Biochem.477:673-88(2022))。涉及单核球的类似过程被称为METosis且涉及单核球细胞外陷阱(monocyte extracellulartrap；MET)的形成。此外，经PAD4瓜氨酸化的蛋白质成为抗原底物，并且为细胞(亦即T细胞)及体液(亦即B细胞衍生的抗体)适应性免疫反应的标靶。(参见例如Curran等人.Nat.Rev.Rheumatol.16:301-15(2020)；Brentville等人.)因此，PAD4活性可导致抗瓜氨酸化蛋白质抗体(anti-citrullinated protein antibodies；ACPA)生成。
多种数据表明，PAD4在诸如类风湿性关节炎(RA)、狼疮(包括全身性红斑性狼疮症(SLE)、狼疮性肾炎、血管炎(包括抗嗜中性粒细胞性细胞质抗体(ANCA)相关血管炎、炎性肠病(IBD)(包括溃疡性结肠炎及克罗恩氏病(Crohn's disease))、血栓(例如静脉血栓)、抗磷脂抗体综合征、囊肿性纤维化及癌症的疾病中发挥作用。(参见例如Curran等人；Yadav等人，J.Cyst.Fibros.18:636-45(2018)；Wang等人，Front.Immunol.13:895216(2022)；Fresneda Alarcon等人Frong.Immunol.12:649693(2021)；Weeding等人，Clin.Immunol.196:110-116(2018)；Xu等人，Chinese J.Microbiology and Immunology12:115-121(2020)；Yoshida等人，Clin.Kidney J.6:308-12(2013)；O'Sullivan等人，Rheumatology,58(Suppl.2):kez061.024(2019)；Pan等人，Authorea Preprints,2021,DOI:10.22541/au.161590650.07168461/v1；D.Zhu等人，Pharmaceutics,8:14(11):2414(2022))。举例而言，类风湿性关节炎(RA)是一种涉及组织(亦即关节与非关节)及全身性发炎的主要自体免疫病症。RA的进展与自体抗体含量升高相关，且约70％ RA患者对抗瓜氨酸化蛋白质抗体(ACPA)呈阳性。ACPA例如出现在有RA风险的人的肺部及血液中，且高ACPA含量与严重RA症状(诸如骨侵蚀)及某些并发症(诸如心血管疾病)相关。另外，ACPA的存在使自发性关节炎的鼠类模型中的RA症状恶化。
ACPA识别新抗原，尤其是来自经PAD酶瓜氨酸化的蛋白质的新抗原。PAD4为滑膜组织中发现的主要PAD酶。举例而言，PAD4可介导对于RA及其他疾病的发病机制重要的ACPA依赖性及ACPA非依赖性功能。另外，约15％ RA患者具有活化PAD4的抗体。此类PAD4活化抗体的存在与严重关节糜烂性疾病相关。在基因层面上，编码PAD4的PADI4基因中的单核苷酸多型性(SNP)已被鉴别出有促于RA的易感性单倍型。(Suzuki等人，Nat.Genet.34:395-402(2003))。此外，与健康个体相比，PADI4启动子区的表观遗传学变化与RA患者甲基化较低的疾病活动有关。(Kolarz等人，Clin.Med.9(7):2049(2020))。发现携有PADI4易感性单倍型的RA患者比不携带该单倍型的RA患者具有更高力价的抗瓜氨酸肽抗体(ACPA)。(Reyes-Castillo等人，Clin.Exp.Immunol.182(2):119-31(2015))。
因此，阻断PAD4的活性可用于治疗RA，且治疗有发展RA以及其他炎性及自体免疫疾病或与NETosis、METosis、抗瓜氨酸化蛋白质抗体(ACPA)的存在、PAD4表达增加或PAD4活性增加(诸如多肽瓜氨酸化增加)相关的其他疾病风险的个体。
本发明提供抑制PAD4活性的抗PAD4抗体、编码所述抗体的核酸、包含所述抗体的载体及宿主细胞，及制造及使用所述抗体的方法。
发明内容
本发明涉及特定抗PAD4抗体、编码所述抗体的核酸、包含所述核酸的载体及宿主细胞，及制造及使用所述抗体的方法。举例而言，本发明的实施方案包括以下：
1.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：重链可变区(VH)，其含有包含SEQ ID NO:4或62的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)及包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR3；及轻链可变区(VL)，其含有包含SEQ IDNO:7的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)。
2.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：重链可变区(VH)，其含有包含SEQ ID NO:4或62的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR3；及轻链可变区(VL)，其含有包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LCDR3。
3.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:221或225的氨基酸序列及SEQ ID NO:222的氨基酸序列的重链可变区(VH)；及包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
4.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:221或225的氨基酸序列及SEQ ID NO:222的氨基酸序列的重链可变区(VH)；及包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列的轻链可变区(VL)，且另外其中该抗体包含有包含SEQ ID NO:224或235的氨基酸序列的轻链恒定区。
5.如实施方案1至4中任一例的经分离抗体，其中该抗体包含与SEQ ID NO:10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58或68中任一者的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％、或至少99％一致的VH；且其中该抗体包含与SEQ ID NO:12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60或70中任一者的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％、或至少99％一致的VL。
6.如实施方案1至4中任一例的经分离抗体，其中该抗体包含VH，其包含经1至10个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58或68中任一者的氨基酸序列；且其中该抗体包含VL，其包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60或70中任一者的氨基酸序列。
7.如实施方案1至6中任一例的经分离抗体，其中该重链可变区包含Kabat位置94处的甘氨酸，该位置对应于SEQ ID NO:10的位置98。
8.如实施方案1至7中任一例的经分离抗体，其中该抗体包含VH，其包含SEQ IDNO:10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58或68中任一者的氨基酸序列。
9.如实施方案1至8中任一例的经分离抗体，其中该抗体包含VL，其包含SEQ IDNO:12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60或70中任一者的氨基酸序列。
10.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VL。
11.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL。
12.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VL。
13.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL。
14.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VL。
15.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL。
16.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VL。
17.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VL。
18.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的VL。
19.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的VL。
20.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的VL。
21.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的VL。
22.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的VL。
23.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL。
24.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:233的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:234的氨基酸序列的VL。
25.如实施方案1至23中任一例的经分离抗体，其中该抗体结合至包含SEQ ID NO:217及SEQ ID NO:218的PAD4上的表位。
26.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：重链可变区(VH)，其含有包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HCDR3；及轻链可变区(VL)，其含有包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的LCDR3。
27.如实施方案26的经分离抗体，其中该抗体包含与SEQ ID NO:78、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、122、126、130或134中任一者的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％、或至少99％一致的VH；且其中该抗体包含与SEQ ID NO:80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、124、128、132或136中任一者的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％、或至少99％一致的VL。
28.如实施方案26的经分离抗体，其中该抗体包含VH，其包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:78、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、122、126、130或134中任一者的氨基酸序列；且其中该抗体包含VL，其包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、124、128、132或136中任一者的氨基酸序列。
29.如实施方案25、26或27的经分离抗体，其中该抗体包含VH，其包含SEQ ID NO:78、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、122、126、130或134中任一者的氨基酸序列。
30.如实施方案26至29中任一例的经分离抗体，其中该抗体包含VL，其包含SEQ IDNO:80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、124、128、132或136中任一者的氨基酸序列。
31.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的VL。
32.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VL。
33.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VL。
34.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的VL。
35.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的VL。
36.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的VL。
37.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的VL。
38.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的VL。
39.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的VL。
40.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VL。
41.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的VL。
42.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列的VL。
43.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列的VL。
44.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的VL。
45.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的VL。
46.如实施方案26至45中任一例的经分离抗体，其中该抗体结合至包含SEQ IDNO:219及SEQ ID NO:220的PAD4上的表位。
47.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含重链可变区(VH)，其包含重链互补决定区1(HCDR1)，该HCDR1包含以下氨基酸序列：
SEQ ID NO:138的位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO:138的位置50至66的氨基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO:138的位置99至108的氨基酸序列；
SEQ ID NO:140的位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO:140的位置50至66的氨基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO:140的位置99至108的氨基酸序列；
SEQ ID NO:142的位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO:142的位置50至66的氨基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO:142的位置99至108的氨基酸序列；
SEQ ID NO:144的位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO:144的位置50至66的氨基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO:144的位置99至108的氨基酸序列；
SEQ ID NO:146的位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO:146的位置50至66的氨基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO:146的位置99至108的氨基酸序列；
SEQ ID NO:148的位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO:148的位置50至66的氨基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO:148的位置99至108的氨基酸序列；
SEQ ID NO:150的位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO:150的位置50至66的氨基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO:150的位置99至108的氨基酸序列；
SEQ ID NO:152的位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO:152的位置50至66的氨基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO:152的位置99至108的氨基酸序列；
SEQ ID NO:154的位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO:154的位置50至66的氨基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO:154的位置99至108的氨基酸序列；
SEQ ID NO:156的位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO:156的位置50至66的氨基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO:156的位置99至108的氨基酸序列；
SEQ ID NO:158的位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO:158的位置50至66的氨基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO:158的位置99至108的氨基酸序列；
SEQ ID NO:160的位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO:160的位置50至66的氨基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO:160的位置99至108的氨基酸序列；
SEQ ID NO:162的位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO:162的位置50至66的氨基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO:162的位置99至108的氨基酸序列；
SEQ ID NO:164的位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO:164的位置50至66的氨基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO:164的位置99至108的氨基酸序列；
SEQ ID NO:166的位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO:166的位置50至66的氨基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO:166的位置99至108的氨基酸序列；
SEQ ID NO:168的位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO:168的位置50至66的氨基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO:168的位置99至108的氨基酸序列；或
SEQ ID NO:170的位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO:170的位置50至66的氨基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO:170的位置99至108的氨基酸序列；及
其中该抗体包含轻链可变区(VL)，其包含：包含SEQ ID NO:170的残基24至38的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:170的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:170的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3。
48.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含重链可变区(VH)，其包含重链互补决定区1(HCDR1)，该HCDR1包含以下氨基酸序列：
SEQ ID NO:138的位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO:138的位置50至66的氨基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO:138的位置99至108的氨基酸序列；
SEQ ID NO:140的位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO:140的位置50至66的氨基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO:140的位置99至108的氨基酸序列；
SEQ ID NO:142的位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO:142的位置50至66的氨基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO:142的位置99至108的氨基酸序列；
SEQ ID NO:144的位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO:144的位置50至66的氨基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO:144的位置99至108的氨基酸序列；
SEQ ID NO:146的位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO:146的位置50至66的氨基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO:146的位置99至108的氨基酸序列；
SEQ ID NO:148的位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO:148的位置50至66的氨基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO:148的位置99至108的氨基酸序列；
SEQ ID NO:150的位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO:150的位置50至66的氨基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO:150的位置99至108的氨基酸序列；
SEQ ID NO:152的位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO:152的位置50至66的氨基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO:152的位置99至108的氨基酸序列；
SEQ ID NO:154的位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO:154的位置50至66的氨基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO:154的位置99至108的氨基酸序列；
SEQ ID NO:156的位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO:156的位置50至66的氨基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO:156的位置99至108的氨基酸序列；
SEQ ID NO:158的位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO:158的位置50至66的氨基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO:158的位置99至108的氨基酸序列；
SEQ ID NO:160的位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO:160的位置50至66的氨基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO:160的位置99至108的氨基酸序列；
SEQ ID NO:162的位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO:162的位置50至66的氨基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO:162的位置99至108的氨基酸序列；
SEQ ID NO:164的位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO:164的位置50至66的氨基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO:164的位置99至108的氨基酸序列；
SEQ ID NO:166的位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO:166的位置50至66的氨基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO:166的位置99至108的氨基酸序列；或
SEQ ID NO:168的位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO:168的位置50至66的氨基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO:168的位置99至108的氨基酸序列；及
其中该抗体包含轻链可变区(VL)，其包含：包含SEQ ID NO:172的残基24至38的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:172的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:172的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3。
49.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含重链可变区(VH)，其包含：包含SEQ ID NO:168的残基26至35的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:168的残基50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ IDNO:168的残基99至108的氨基酸序列的HCDR；且其中该抗体包含轻链可变区(VL)，其包含：包含SEQ ID NO:172的残基24至38的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、包含SEQ IDNO:172的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:172的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3。
50.如实施方案49的经分离抗体，其中与包含有包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL的抗体相比，该抗体在pH 6.0下以较低亲和力结合至PAD4。
51.如实施方案1至50中任一例的经分离抗体，其为IgA、IgG或IgM抗体。
52.如实施方案1至50中任一例的经分离抗体，其为IgG抗体，诸如人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体或鼠类IgG1或IgG2抗体。
53.如实施方案52的经分离抗体，其中该抗体包含野生型、人类IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区。
54.如实施方案1至50中任一例的经分离抗体，其中该抗体包含人类IgG1或IgG2重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列；和/或其中该抗体包含轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列。
55.如实施方案1至50中任一例的经分离抗体，其中该抗体包含人类IgG1或IgG2重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列，和/或包含轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列。
56.如实施方案1至55中任一例的经分离抗体，其中该抗体包含人类IgG1或IgG2重链恒定区，其包含SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列。
57.如实施方案1至56中任一例的经分离抗体，其中该抗体包含轻链恒定区，其包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列。
58.如实施方案1至57中任一例的经分离抗体，其为全长抗体。
59.如实施方案1至57中任一例的经分离抗体，其为在重链恒定区中缺乏C端赖氨酸的IgG抗体。
60.如实施方案1至50中任一例的经分离抗体，其为抗体片段，诸如Fv、单链Fv(scFv)、Fab、Fab'或(Fab')2。
61.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列、然后是SEQ ID NO:178的氨基酸序列的重链(HC)；及包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列、然后是SEQ ID NO:194的氨基酸序列的轻链(LC)。
62.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列、然后是SEQ ID NO:180的氨基酸序列的重链(HC)；及包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列、然后是SEQ ID NO:194的氨基酸序列的轻链(LC)。
63.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列的HC及包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列的轻链。
64.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:198的氨基酸序列的HC及包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列的轻链。
65.如实施方案1至64中任一例的经分离抗体，其为双特异性或多特异性抗体，或其与至少一个其他分子共价或非共价结合。
66.如实施方案65的经分离抗体，其中该抗体与至少一个其他分子共价或非共价结合，其中该至少一个其他分子包含检测标记和/或药物。
67.一种特异性结合至鼠类蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含重链可变区(VH)，其包含：包含SEQ ID NO:208的位置31至35的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:208的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQID NO:208的位置99至107的氨基酸序列的HCDR3；且其中该抗体包含轻链可变区(VL)，其包含：包含SEQ ID NO:210的残基24至38的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、包含SEQID NO:210的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:210的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3。
68.如实施方案67的经分离抗体，其中该抗体包含人类IgG1重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:208的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列；和/或其中该抗体包含轻链可变区(VL)，其包含与SEQ ID NO:210的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列。
69.如实施方案67的经分离抗体，其中该抗体包含与SEQ ID NO:208的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的VH氨基酸序列；和/或其中该抗体包含与SEQ ID NO:210的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的VL氨基酸序列。
70.如实施方案67至69中任一例经分离的抗体，其中该抗体包含SEQ ID NO:208的VH氨基酸序列和/或SEQ ID NO:210的VL氨基酸序列。
71.如实施方案67至70中任一例的经分离抗体，其中该抗体包含：包含与SEQ IDNO:210的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列的重链，和/或其中该抗体包含：包含与SEQ ID NO:212的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列的轻链。
72.如实施方案67至71中任一例的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的重链，和/或其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列的轻链。
73.如实施方案1至66中任一项的经分离抗体，其中该抗体不结合至人类蛋白质精氨酸脱亚胺酶2(PAD2)。
74.如实施方案1至66或73中任一例的经分离抗体，其中该抗体以10至200nM、50至200nM、10至100nM、20至100nM或50至100nM的IC50抑制PAD4将肽底物TSTGGRQGSHH(SEQ IDNO:216)中的精氨酸转化为瓜氨酸。
75.如实施方案1至66、73或74中任一例的经分离抗体，其中该抗体任选以剂量依赖性方式以0.1至10nM(诸如0.2至5nM)的IC50抑制PAD4将肽底物中的精氨酸转化为瓜氨酸，其中PAD4浓度为1至8μg/mL。
76.如实施方案1至66或73至75中任一例的经分离抗体，其中该抗体抑制PAD4对Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯盐酸盐(BAEE)的脱胺作用。
77.如实施方案1至66或73至76中任一例的经分离抗体，其中该抗体以小于5nM、小于3nM、小于1nM、小于0.5nM、小于0.1nM、0.01nM至5nM、0.01nM至1nM、0.05nM至1nM、0.1nM至1nM、0.1nM至0.5nM、0.05nM至0.5nM、0.05nM至0.1nM、或0.5nM至1nM的KD特异性结合至PAD4。
78.如实施方案77的经分离抗体，其中该抗体以小于5nM、小于3nM、小于1nM、小于0.5nM、小于0.1nM、0.01nM至5nM、0.01nM至1nM、0.05nM至1nM、0.1nM至1nM、0.1nM至0.5nM、0.05nM至0.5nM、0.05nM至0.1nM、或0.5nM至1nM的KD特异性结合至PAD4，其为(a)在37℃、在1至2mM氯化钙(例如1mM氯化钙)的存在下和/或(b)在37℃、在不存在额外Ca2+及存在2mMEDTA的情况下通过表面等离子共振(surface plasmon resonance；SPR)所测定。
79.如实施方案1至66或73至78中任一例的经分离抗体，其中该抗体在ECM分析中的ECM评分小于50、小于30、小于10、小于5、为1至30、1至20、1至10、1至5、1至3、1、2、3、4或5。
80.如实施方案1至66或73至79中任一例的经分离抗体，其中通过计算机仿真免疫原性分析(in silico immunogenicity assay)所测量，该抗体的免疫原性小于以下中之一者、两者或全部三者：(阿伦单抗(alemtuzumab))、(利妥昔单抗(rituximab))、(达利珠单抗(daclizumab))。
81.如实施方案1至66或73至80中任一例的经分离抗体，其中与同型对照抗体相比，该抗体减少LPS刺激的人类血液单核球中细胞外瓜氨酸化组蛋白H3的量和/或减少GM-CSF的分泌和/或GM-CSF的基因表达。
82.如实施方案1至66或73至81中任一例的经分离抗体，其中该抗体能够被LPS刺激的人类血液单核球内化。
83.如实施方案1至82中任一例的经分离抗体，其中该抗体抑制PAD4在发炎肺部的功能，例如通过经肺部所收集的支气管肺泡灌洗液(broncheoalveolar lavage fluid；BALF)中的(例如H3)的瓜氨酸化减少证明。
84.如实施方案1至83中任一例的经分离抗体，其中该抗体抑制PAD4在发炎关节的功能，例如通过经关节组织中ITIH4和/或PRG4的瓜氨酸化减少证明。
85.如实施方案1至84中任一例的经分离抗体，其中与同型对照抗体相比，该抗体减少嗜中性粒细胞、单核球、M1巨噬细胞和/或M2巨噬细胞中(例如H3)的瓜氨酸化。
86.如实施方案1至66或73至85中任一例的经分离抗体，其中与同型对照抗体相比，该抗体减少在人类PAD4基因敲入小鼠的LPS诱导的急性肺部发炎模型中的BALF中的细胞外瓜氨酸化(例如H3和/或ITIH4瓜氨酸化)的量，任选其中瓜氨酸化H3的量减少至少15％、至少30％、至少40％、至少50％或至少60％，和/或其中瓜氨酸化ITIH4的量减少至少50％、至少70％或至少80％。
87.如实施方案1至66或73至86中任一例的经分离抗体，其中与同型对照抗体相比，该抗体减少在人类PAD4基因敲入小鼠的LPS诱导的急性关节损伤模型中的小鼠髌骨中细胞外瓜氨酸化(例如PRG4和/或ITIH4瓜氨酸化)的量，任选其中减少瓜氨酸化ITIH4和/或瓜氨酸化PRG4的EC50为2nM或更低、1nM或更低、0.1nM或更低、0.05至2nM、或0.1至1nM。
88.一种药物组合物，其包含如实施方案1至87中任一例的抗体及药学上可接受的载剂。
89.一种经分离核酸或两种或更多种核酸的集合，该(等)核酸编码如实施方案1至87中任一例的抗体。
90.一种经分离载体，其包含一种或多种编码如实施方案1至87中任一例的抗体的重链及轻链的核酸。
91.一种经分离宿主细胞，其包含如实施方案89的核酸或如实施方案90的载体。
92.一种产生特异性结合至PAD4的抗体的方法，其包含在适于表达该抗体的条件下培养如实施方案91的宿主细胞。
93.如实施方案92的方法，其进一步包含自该宿主细胞回收该抗体。
94.一种抗体，其通过如实施方案92或93的方法产生。
95.如实施方案1至87中任一例的抗体或如实施方案88的药物组合物在制备用于治疗自体免疫病症的药物中的用途。
96.如实施方案95的用途，其中该自体免疫病症为类风湿性关节炎、狼疮(例如全身性红斑性狼疮症(SLE))、狼疮性肾炎、血管炎(例如ANCA相关血管炎)、血栓(例如静脉血栓)、炎性肠病(IBD)(例如溃疡性结肠炎、克罗恩氏病)或本文所描述的另一种自体免疫病症。
97.如实施方案1至87中任一例的经分离抗体或如实施方案88的药物组合物，其用于治疗自体免疫病症。
98.如实施方案97所使用的用途，其中该自体免疫病症为类风湿性关节炎、狼疮(例如全身性红斑性狼疮症(SLE))、狼疮性肾炎、血管炎(例如ANCA相关血管炎)、血栓(例如静脉血栓)、炎性肠病(IBD)(例如溃疡性结肠炎、克罗恩氏病)或本文所描述的另一种自体免疫病症。
99.一种治疗有需要个体的自体免疫病症的方法，其包含向该个体施用有效量的如实施方案1至87中任一例的经分离抗体或如实施方案88的药物组合物。
100.如实施方案99的方法，其中该自体免疫病症为类风湿性关节炎、狼疮(例如全身性红斑性狼疮症(SLE))、狼疮性肾炎、血管炎(例如ANCA相关血管炎)、血栓(例如静脉血栓)、炎性肠病(IBD)(例如溃疡性结肠炎、克罗恩氏病)或本文所描述的另一种自体免疫病症。
101.如实施方案95至100中任一例的用途、所使用的抗体或方法，其中该方法或用途包含施用至少一种其他治疗剂，任选其中该至少一种其他治疗剂为以下中之一或多者：甲胺喋呤(methotrexate)、阿达木单抗(adalimumab)、依那西普(etanercept)、英利昔单抗(infliximab)、羟基氯喹(hydroxychloroquine)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、来氟米特(leflunomide)、阿巴西普(abatacept)、阿那白滞素(anakinra)、赛妥珠单抗(certolizumab)、戈利木单抗(golimumab)、利妥昔单抗、沙利姆单抗(sarilumab)、托珠单抗(tocilizumab)、巴瑞替尼(baricitinib)、托法替尼(tofacitinib)或优帕替尼(upadacitinib)。
其他例示性实施方案包括如实施方案1至87中任一例的抗体，其包含氨基酸序列的至少一个翻译后修饰。在一些实施方案中，该修饰为将N端Glu或Gln修饰为焦谷氨酸盐。在一些此类实施方案中，轻链N端Glu或Gln经修饰为焦谷氨酸盐。
本文中的公开内容亦包含：如以上实施方案1至87中任一例的抗体或如以上实施方案88的药物组合物的用途，其用于制备用于治疗有发展RA风险的个体的药物；及如以上实施方案1至87中任一例的经分离抗体或如以上实施方案88的药物组合物，其用于治疗有发展RA风险的个体。本发明亦涵盖一种治疗有发展RA风险的个体的方法，其包含向该个体施用有效量的如以上实施方案1至87中任一例的经分离抗体或如实施方案88的药物组合物。在某些情况下，个体有以下一种或多种状况：(a)至少一名患有RA的一等亲(例如父母或兄弟姐妹)；(b)血清中存在抗瓜氨酸化蛋白质抗体(ACPA)；(c)血清中存在类风湿因子(rheumatoid factor；RF)；(d)至少一个关节出现关节痛；(e)通过超音波或磁共振成像(magnetic resonance imaging；MRI)观测到至少一个关节发炎；(f)未分化关节炎。在一些情况下，个体处于缓解期。在一些情况下，该方法或用途包含施用至少一种其他治疗剂，任选其中该至少一种其他治疗剂为以下中之一或多者：甲胺喋呤、阿达木单抗、依那西普、英利昔单抗、羟基氯喹、柳氮磺胺吡啶、来氟米特、阿巴西普、阿那白滞素、赛妥珠单抗、戈利木单抗、利妥昔单抗、沙利姆单抗、托珠单抗、巴瑞替尼、托法替尼或优帕替尼。
在其他实施方案中，如实施方案1至87中任一者的抗体或如实施方案88的药物组合物可用于制备用于抑制个体的NETosis或METosis的药物。在一些实施方案中，个体为患有自体免疫病症(诸如类风湿性关节炎、狼疮(例如全身性红斑狼疮症(SLE))、狼疮性肾炎、血管炎(例如ANCA相关血管炎)、血栓(例如静脉血栓)、炎性肠病(IBD)(例如溃疡性结肠炎、克罗恩氏病))的个体，或是有发展自体免疫疾病(例如类风湿性关节炎)风险的个体。其他实施方案包括如实施方案1至87中任一例的经分离抗体或根据权利要求88的药物组合物，其用于抑制个体的NETosis或METosis。在一些实施方案中，个体为患有自体免疫病症(诸如类风湿性关节炎、狼疮、狼疮性肾炎、血管炎或血栓(例如静脉血栓)、炎性肠病(IBD)(例如溃疡性结肠炎、克罗恩氏病))或本文所公开的另一种自体免疫病症的个体。在一些实施方案中，个体是有发展自体免疫病症(例如类风湿性关节炎)风险的个体。其他实施方案亦包括一种抑制个体中NETosis或METosis的方法，该方法包含向该个体施用有效量的如实施方案1至87中任一例的抗体或如实施方案88的药物组合物。在一些实施方案中，个体为患有自体免疫病症(诸如类风湿性关节炎、狼疮(例如全身性红斑狼疮症(SLE))、狼疮性肾炎、血管炎(例如ANCA相关血管炎)、血栓(例如静脉血栓)、炎性肠病(IBD)(例如溃疡性结肠炎、克罗恩氏病))或本文所公开的另一种自体免疫病症的个体。在一些实施方案中，个体是有发展自体免疫病症(例如类风湿性关节炎)风险的个体。在一些情况下，该方法或用途包含施用至少一种其他治疗剂，任选其中该至少一种其他治疗剂为以下中之一或多者：甲胺喋呤、阿达木单抗、依那西普、英利昔单抗、羟基氯喹、柳氮磺胺吡啶、来氟米特、阿巴西普、阿那白滞素、赛妥珠单抗、戈利木单抗、利妥昔单抗、沙利姆单抗、托珠单抗、巴瑞替尼、托法替尼或优帕替尼。本文中的公开内容亦涵盖在体外抑制生物样本中NETosis或METosis的方法，其包含向该生物样本施用有效量的如实施方案1至87中任一例的经分离抗体或如实施方案88的药物组合物。本文中的方法及用途亦包含抑制个体中瓜氨酸化的方法，其包含向该个体施用有效量的如实施方案1至87中任一例的经分离抗体，或如实施方案1至87中任一例的经分离抗体用于抑制个体中瓜氨酸化的用途，或如实施方案1至87中任一例的经分离抗体用于制备用于抑制个体中瓜氨酸化的药物的用途。本发明亦包括在体外抑制生物样本中瓜氨酸化的方法，其包含向该生物样本施用有效量的如实施方案1至87中任一例的经分离抗体。
在其他实施方案中，如实施方案1至87中任一例的抗体或如实施方案88的药物组合物可用于制备预防自体免疫病症(诸如类风湿性关节炎、狼疮(例如全身性红斑性狼疮症(SLE))、狼疮性肾炎、血管炎(例如ANCA相关血管炎)、血栓(例如静脉血栓)、炎性肠病(IBD)(溃疡性结肠炎、克罗恩氏病))或本文所公开的另一种自体免疫病症发作或复发的药物，或如实施方案1至87中任一例的经分离抗体或根据权利要求88的药物组合物可用于预防自体免疫性病症(诸如类风湿性关节炎、狼疮(例如全身性红斑性狼疮症(SLE))、狼疮性肾炎、血管炎(例如ANCA相关血管炎)、血栓(例如静脉血栓)、炎性肠病(IBD)(例如溃疡性结肠炎、克罗恩氏病))或本文所公开的另一种自体免疫性病症的发作或复发。又其他实施方案包括一种预防有需要个体的自体免疫病症(诸如类风湿性关节炎、狼疮、狼疮性肾炎、血管炎、血栓(例如静脉血栓)、炎性肠病(IBD)、结肠炎、溃疡性结肠炎)或本文所公开的另一种自体免疫病症发作或复发的方法，其包含向该个体施用有效量的如实施方案1至87中任一例的经分离抗体或如实施方案88的药物组合物。在一些实施方案中，已确定个体易发作或复发病症。在本文中的一些此类用途及方法中，将抗体与另一种治疗剂一起向个体施用。
在另外的实施方案中，如实施方案1至87中任一例的经分离抗体或如实施方案88的药物组合物可用于制备治疗癌症的药物，或该经分离抗体或药物组合物可用于治疗癌症。其他实施方案亦包括一种治疗有需要个体的癌症的方法，其包含向该个体施用有效量的如实施方案1至87中任一例的经分离抗体或如实施方案88的药物组合物。在一些情况下，此类方法或用途包含向个体施用至少一种其他治疗剂，诸如免疫检查点抑制剂、化学治疗剂、抗血管生成剂或抗肿瘤剂，或另一种疗法，诸如放射线疗法、激素疗法或手术治疗。
在其他实施方案中，如实施方案1至87中任一例的抗体或如实施方案88的药物组合物可用于制备治疗传染病的药物，或如实施方案1至87中任一例的经分离抗体或如实施方案88的药物组合物可用于治疗传染病。其他实施方案包括一种治疗有需要个体的传染病的方法，其包含施用有效量的本文的抗体。在本文中的一些此类用途及方法中，将抗体与另一种治疗剂一起施用。
应理解，前文一般描述及以下详细描述两者仅为例示性及解释性的，且并不限定权利要求书。本文所引用的所有参考文献均以全文引用的方式并入本文中。
附图说明
图1A至图1D显示例示性鼠类抗人类PAD4抗体(Ab)殖株的活性。图1A及图1B显示基于精氨酸向瓜氨酸的转化，抗体克隆对PAD4活性的影响，其中图1A显示PAD4活性百分比且图1B显示在抗体克隆存在下的瓜氨酸浓度。图1C及图1D显示抗体以剂量依赖性方式抑制PAD4。图1C显示抗体殖株13的剂量反应曲线。图1D显示抗体殖株20的剂量反应曲线。
图1E至图1H显示克隆13的VH及VL氨基酸序列(VH＝图1E；VL＝图1F)及克隆20的VH及VL氨基酸序列(VH＝图1G；VL＝图1H)。在图1E至1H中所示的序列中，(1)HCDR1、HCDR2及HCDR3序列分别位于氨基酸位置26至35、50至65及95至102；及(2)LCDR1、LCDR2及LCDR3序列分别位于氨基酸位置24至34、50至56及89至97。在图1E及图1G中，根据CDR的AbM定义，HCDR1显示于氨基酸位置26至35处(图1E及图1G)(Abhinandan及Martin,Mol.Immunol.45:3832-3839(2008)；Swindells等人，J.Mol.Biol.429:356-364(2017))。根据Kabat编号方案，HCDR1实际上位于氨基酸位置31至35处(未显示)。其余CDR(HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3；图1E至图1H)为根据Kabat编号方案编号。
图2显示，PAD4抗体对PAD4具有特异性且实质上不抑制PAD2活性。
图3A至图3X显示抗体稳定性，其通过尺寸排阻色谱法(SEC)及肽定位评估。图3A显示20种例示性人源化(hz)克隆13及20抗体的SEC结果。图3B显示例示性hz克隆20抗体的肽定位结果。图3C至图3D显示例示性hz克隆13抗体的肽定位结果。图3E及图3F分别显示hz13-12及hz13-5的SEC结果。图3G至图3J显示hz13-12的肽定位结果。图3K至图3N显示hz13-5的肽定位结果。图3O及图3P分别显示hz13-12 D31E及hz13-5 D31E的SEC结果。图3Q及图3R分别显示hz13-12 D31E及hz13-5 D31E的肽定位结果。图3S显示hz13-5的SEC结果。图3T显示hz13-5 D31E的SEC结果。图3U及图3V分别显示高浓度hz13-5及hz13-5D31E的肽定位结果。图3W及图3X分别显示hz13-5 D31E的SEC结果及肽定位结果。
图4A至图4B显示通过HDX-MS测定的克隆13(图4A)及克隆20(图4B)的表位。hPAD4中Fab结合后HDX显著减少的区域被加框(黑线框表示一级表位；灰线框表示二级表位)。对于每种抗体而言，一级表位以相应黑线框上方带下划线的黑色文字显示，二级表位以相应灰线框上方较小的文字显示。
图5A至图5B显示通过FPOP、GEE及DEPC标记确定的克隆13(图5A)及克隆20(图5B)的结合残基。受保护的残基，在hPAD4与hPAD4/Fab之间的标记％差异具有统计显著性(基于司徒顿T-测试，p值<0.01)，并以星号标记。所得的MS/MS片段不足，无法区分对H644及C645的保护；此两个残基均被认为为克隆20的结合残基。
图6显示克隆13及克隆20的表位概述。通过HDX-MS确定的表位区带框。通过FPOP、GEE及DEPC标记确定的结合残基加下划线且以粗体突出显示。
图7A至图7B显示胃蛋白酶对克隆13(HC；图7A)及克隆13轻链(LC；图7B)的序列覆盖。各条形表示胃蛋白酶肽。互补决定区(CDR)带框。
图8A至图8B显示在与hPAD4结合后克隆13Fab HC(图8A)及克隆13Fab LC(图8B)中HDX显著减少的区域。克隆13的互补位区域带框。
图9A至图9B显示PAD4.克隆13Fab复合物的低温电子显微术(Cryo-EM)结构。图9A显示PAD4.克隆13Fab单体。PAD4残基为以三个字母码编号。圆圈内为催化位点的大致位置。图9B显示PAD4.Fab13二聚体。
图10显示克隆13的残基D31及在PAD4与克隆13Fab的重链的界面处的相互作用。Fab残基为以单一残基码编号，而PAD4残基为以三字母码编号。
图11显示人类PAD4的底物结合位点(PDB码2DEW)。显示赖氨酸环及催化螺旋(赖氨酸环包括LYS-519及ILE-526，且催化螺旋包括ILE-630及ILE-638)。共晶体底物肽的精氨酸残基为以棒状表达形式显示。2DEW结构中的Ca2+离子显示为球体。
图12显示来自2DEW及PAD.克隆13Fab cryoEM结构的PAD4链的叠加。2DEW为以浅灰色阴影的卡通表达形式显示，而来自PAD4.克隆13Fab cryoEM结构的PAD4为以黑色卡通显示。克隆13Fab的重链及轻链显示为细带。PAD4残基为以三字母码编号，而克隆13Fab残基为以单字母码编号。赖氨酸环的移动及其对催化螺旋的影响已由黑色箭头显示。2DEW结构中的Ca2+离子显示为球体。
图13A至图13N显示来自pH依赖性抗PAD4抗体研究的热图(图13A至图13L)及SPR(图13M至图13N)测量值。在图13A至图13L所示的热图中，(1)ER值小于1表明取代将削弱与PAD4的结合，(2)数值大于1.00表明氨基酸取代将导致与PAD4更强的结合，并且(3)1.00表明氨基酸取代不会导致结合变化(亦即，结合不会因为突变而更强或更弱)。在pH 7(图13A、图13C、图13E、图13G、图13I及图13K)及pH 6(图13B、图13D、图13F、图13H、图13J及图13L)下测试pH依赖性抗PAD4抗体。图13A显示在pH 7下克隆13(mAb13)的HCDR1。图13B显示在pH 6下克隆13(mAb13)的HCDR1。图13C显示在pH 7下克隆13(mAb13)的HCDR2。图13D显示在pH 6下克隆13(mAb13)的HCDR2。图13E显示在pH 7下克隆(mAb13)的HCDR3。图13F显示在pH 6下克隆13(mAb13)的HCDR3。图13G显示在pH7下克隆13(mAb13)的LCDR1。图13H显示在pH 6下克隆13(mAb13)的LCDR1。图13I显示在pH 7克隆13(mAb13)的LCDR2。图13J显示在pH 6下克隆13(mAb13)的LCDR2。图13K显示在pH 7下克隆13(mAb13)的HCDR3。图13L显示在pH 6下克隆13(mAb13)的LCDR3。图13M至图13N显示例示性抗PAD4抗体hz13-5在pH 7.6(图13M)和pH6.0(图13N)下记录的SPR测量值。pH依赖性变体*为hz13-5 VH_D31H::Vk_I30H。在pH 6.0下观测到解离阶段信号略微增加，其可能为由于PAD4在pH 6.0下稳定性较低从而可能导致PAD4在表面上发生一些聚集引起。
图14显示在自体抗原脉冲的单核球衍生的DC与抗体Avastin、IL-21R mAb(ATR-107)、基于克隆13的hz13-12抗体、基于克隆20的hz20-7、基于克隆13的hz13-5及基于克隆13的hz13-5 D31E一起培育7天之后具有阳性CD4+增殖反应的健康志愿者人类供体(n＝40)的百分比。
图15显示在范围自13.5nM(1μg/mL)至108nM(8μg/mL)的四种浓度的重组人PAD4(rhPAD4)下用抗体hz13-5D31E对人PAD4的剂量依赖性抑制。
图16A至图16F显示用指定浓度的所示克隆13(C13)或克隆20(C20)抗体变体或用同型对照抗体处理的脂多糖(LPS)刺激的人类CD14+单核球中细胞外瓜氨酸化组蛋白3减少。图16A显示与hz13-5一起培育的单核球中的瓜氨酸化组蛋白3含量。图16B显示与hz13-5D31E一起培育的单核球中的瓜氨酸化组蛋白3含量。图16C显示与hz20-2一起培育的单核球中的瓜氨酸化组蛋白3含量。图16D显示与hz20 -7一起培育的单核球中的瓜氨酸化组蛋白3含量。图16E显示与hz13-3一起培育的单核球中的瓜氨酸化组蛋白3含量。图16F显示与hz13-12一起培育的单核球中的瓜氨酸化组蛋白3含量。
图17A至图17F显示用指定浓度的所示克隆13(C13)或克隆20(C20)抗体变体或用同型对照抗体处理的LPS刺激的人类CD14+单核球中GM-CSF(ng/mL)的减少。图17A显示与hz13-5一起培育的单核球中GM-CSF的检测。图17B显示与hz13-5 D31E一起培育的单核球中GM-CSF的含量。图17C显示与hz13-3一起培育的单核球中GM-CSF的含量。图17D显示与hz13-12一起培育的单核球中GM-CSF的含量。图17E显示与hz20-2一起培育的单核球中GM-CSF的含量。图17F显示与hz20 -7一起培育的单核球中GM-CSF的含量。
图18A至图18B显示用指定浓度的所示克隆13(C13)抗体变体处理的LPS刺激的人类CD14+单核球中的GM-CSF基因表达降低(倍数诱导，基于2,-deltadeltaCT计算))。图18A显示与hz13-5一起培育的单核球中GM-CSF的倍数诱导。图18B显示与hz13-5 D31E一起培育的单核球中GM-CSF的倍数诱导。通过自PPIA中减去Ct值以产生DCt，将GM-CSF基因Ct值以管家基因肽基脯氨酰基顺反异构酶A(PPIA)标准化。使用下式计算各样本对管家基因的相对数量(RQ)值(倍数诱导)：RQ＝2-DCt。
图19A至图19B显示酸性细胞区室中抗PAD4抗体hz13-5D31E的检测。图19A显示在48h时在各指定条件下(中侧图＝50μg/mL hz13-5 D31E；右侧图＝50μg/mL同型对照)Fabfluor-pH红色染色的供体GAC-077(左侧图)以及FabFluor-pH与Cytotox绿色染色的重叠(中侧图及右侧图；共染色呈现黄色)的影像。图19B显示在2个供体GAC-077及GAC-045的条件下使用FAbFluor-pH染色测量的抗体内化面积(μm2/影像)。
图20显示例示性抗PAD4抗体、抗鼠类PAD4 mAb、mumAb在脂多糖(LPS)诱导的急性肺部发炎药效学(ALIPD)模型中的体内功效。与同型对照(100mpk)条件相比，30mpk及100mpk处理分别导致对细胞外瓜氨酸化H3的74％及83％抑制。“Mpk”＝mg/Kg。“IC”＝同型对照抗体。“未处理”＝未经LPS诱导。
图21A至图21B显示急性关节发炎(AJI)及慢性关节发炎(CJI)研究的实验设计。图21A显示施用治疗(皮下抗PAD4抗体或同型对照)、施用LPS以诱导发炎、结果评估的时间表。图21B显示诱导及评估结果的程序。
图22A至图22B显示在LPS诱导的急性关节发炎(AJI)药效学(PD)模型中通过抗鼠类PAD4 mAb(mumAb)减少细胞外瓜氨酸化蛋白。图22A显示Cit-ITIH4结果。图22B显示Cit-PRG4结果。以与关于图20所描述类似的方式计算抑制百分比。“Mpk”＝mg/kg。“同型”＝同型对照抗体(IC)。“未处理”＝未注射LPS。
图23A至图23B显示在LPS诱导的慢性关节发炎(CJI)药效学(PD)模型中通过抗鼠类PAD4 mAb(mumAb)减少细胞外瓜氨酸化蛋白。图23A显示Cit-ITIH4结果。图23B显示Cit-PRG4结果。以与关于图20所描述类似的方式计算抑制百分比。“Mpk”＝mg/kg。“同型”＝同型对照抗体(IC)。“未处理”＝未注射LPS。“PBS”＝未处理小鼠假性注射磷酸盐缓冲盐水(PBS))代替LPS。
图24A至图24B显示在姥鲛烷诱导的腹膜炎模型中通过抗鼠类PAD4 mAb抗PAD4mAb(mumAb)减少NETosis(图24A)和METosis(图24B)。N＝每个处理组6个。以利用Dunnett测试的单向ANOVA与同型对照相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。“Mpk”＝mg/kg。“ISO”＝同型对照抗体(IC)。“未处理”＝假注射PBS代替LPS。
图25A至图25B显示在姥鲛烷诱导的腹膜炎模型中通过抗鼠类PAD4 mAb(mumAb)减少嗜中性粒细胞及单核球中的Cit-H3。图25A显示细胞％且图25B显示细胞数目。N＝每个处理组6个。以利用Dunnett测试的单向ANOVA与同型对照相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。“Mpk”＝mg/kg。“ISO”＝同型对照抗体(IC)。“未处理”＝未接受姥鲛烷注射。
图26A至图26B显示在姥鲛烷诱导的腹膜炎模型中通过抗鼠类PAD4 mAb(mumAb)减少M1巨噬细胞(图26A)及M2巨噬细胞(图26B)中的Cit-H3。N＝每个处理组6个。以利用Dunnett测试的单向ANOVA与同型对照相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。“Mpk”＝mg/kg。“ISO”＝同型对照抗体(IC)。“未处理”＝未经姥鲛烷诱导。
图27A至图27B显示在姥鲛烷诱导的腹膜炎模型中通过抗鼠类PAD4 mAb(mumAb)减少腹膜液样本中的弹性蛋白酶(图27A)及MPO(图27B)。N＝每个处理组6个。以利用Dunnett测试的单向ANOVA与同型对照相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。“Mpk”＝mg/kg。“ISO”＝同型对照抗体(IC)。“未处理”＝未经姥鲛烷诱导。
图28A至图28B显示在姥鲛烷诱导的腹膜炎模型中通过抗鼠类PAD4 mAb(mumAb)减少趋化介素及细胞因子。图28A显示腹膜液中的GROβ/MIP-2α、GROα/KC、MCP 1及MIP 1β含量。图28B显示血浆中的IL-6及MIP 3a含量。N＝每个处理组6个。以利用Dunnett测试的单向ANOVA与同型对照相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。“Mpk”＝mg/kg。“ISO”＝同型对照抗体(IC)。“未处理”＝未经姥鲛烷诱导。
图29A至图29C显示胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)模型中预防性研究的结果。抗鼠类PAD4 mAb(mumAb)降低临床评分(图29A)，疾病发生率(图29B)及脚爪重量(图29C)。N＝每个处理组10至15个。以利用Dunnett测试的单向ANOVA与IC相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。“IC”＝同型对照抗体。“未处理”＝未经胶原蛋白诱导。
图30A至图30E显示CIA模型中预防性研究的结果。抗鼠类PAD4 mAb(mumAb)减少脚爪中的免疫细胞浸润。图30A：CD45+细胞。图30B：总骨髓细胞；CD11b+细胞。图30C：嗜中性粒细胞；CD11b+Ly6G+Ly6C-细胞。图30D：单核球；CD11b+Ly6G-Ly6C+细胞。图30E：巨噬细胞；F4/80+细胞。N＝每个处理组10至15个。N＝未处理组中5个。以利用Dunnett测试的单向ANOVA与IC相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。“Mpk”＝mg/kg。“ISO”＝同型对照抗体(IC)。“未处理”＝未经胶原蛋白诱导。
图31A至图31B显示CIA模型中预防性研究的结果。抗鼠类PAD4 mAb(mumAb)减少小鼠脚爪中的NETosis(图31A)及METosis(图31B，其中左图显示单核球数目，且右图显示巨噬细胞数目)。N＝每个处理组10至15个。N＝未处理组中5个。以利用Dunnett测试的单向ANOVA与IC相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。“Mpk”＝mg/kg。“ISO”＝同型对照抗体(IC)。“未处理”＝未经胶原蛋白诱导。
图32A至图32C显示CIA模型中预防性研究的结果。抗鼠类PAD4 mAb(mumAb)减少小鼠脚爪中嗜中性粒细胞(图32A)、单核球(图32B)及M2巨噬细胞(图32C)中的总Cit-H3。N＝每个处理组10至15个。N＝未处理组中5个。以利用Dunnett测试的单向ANOVA与IC相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。“Mpk”＝mg/kg。“ISO”＝同型对照抗体(IC)。
图33A至图33C显示CIA模型中预防性研究的结果。抗鼠类PAD4 mAb(mumAb)减少小鼠脚爪中的PAD4(图33A)、MPO(图33B)及嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(图33C)。N＝每个处理组10至15个。N＝未处理组中5个。以利用Dunnett测试的单向ANOVA与媒剂相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。“Mpk”＝mg/kg。“未处理”＝未经胶原蛋白诱导。
图34A至图34B显示CIA模型中预防性研究的结果。抗鼠类PAD4 mAb(mumAb)减少脚爪及血清中的抗瓜氨酸化肽抗体(ACPA；图34A)，并且亦降低血清抗CII抗体力价(图34B)。N＝每个处理组10至15个。N＝未处理组中5个。以利用Dunnett测试的单向ANOVA与IC相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。“Mpk”＝mg/kg。“未处理”＝未经胶原蛋白诱导。
图35显示CIA模型中的预防性研究的结果。抗鼠类PAD4 mAb(mumAb)降低脚爪组织学评分(所提供的降低％与IC有关)。N＝每个处理组10至15个。以利用Dunnett测试的单向ANOVA与媒剂相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。“Mpk”＝mg/kg。“IC”＝同型对照抗体。
图36A至图36C显示CIA模型中半治疗性研究的结果。抗鼠类PAD4 mAb(mumAb)降低临床评分(图36A)，疾病发生率(图36B)及脚爪重量(图36C)。N＝每个处理组10至15个。以利用Dunnett测试的单向ANOVA与IC相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。“IC”＝同型对照抗体。
图37A至图37E显示CIA模型中半治疗性研究的结果。抗鼠类PAD4 mAb(mumAb)减少脚爪中的免疫细胞浸润。图37A：总细胞浸润；CD45+细胞。图37B：总骨髓细胞；CD11b+细胞。图37C：嗜中性粒细胞；CD11b+Ly6G+Ly6C-细胞。图37D：单核球；Ly6C+细胞。图37E：巨噬细胞；F4/80+细胞。N＝每个处理组10至15个。N＝未处理组中5个。以利用Dunnett测试的单向ANOVA与IC相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。“Mpk”＝mg/kg。“ISO”＝同型对照抗体(IC)。“未处理”＝未经胶原蛋白诱导。
图38A至图38B显示CIA模型中半治疗性研究的结果。抗鼠类PAD4 mAb(mumAb)减少小鼠脚爪中的NETosis(图38A)及METosis(图38B)。N＝每个处理组10至15个。N＝未处理组中5个。以利用Dunnett测试的单向ANOVA与IC相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。“Mpk”＝mg/kg。“ISO”＝同型对照抗体(IC)。“未处理”＝未经胶原蛋白诱导。
图39A至图39C显示CIA模型中半治疗性研究的结果。抗鼠类PAD4 mAb(mumAb)减少小鼠脚爪中嗜中性粒细胞(图39A)、单核球(图39B)及M2巨噬细胞(图39C)中的总Cit-H3。N＝每个处理组10至15个。N＝未处理组中5个。以利用Dunnett测试的单向ANOVA与媒剂相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。“Mpk”＝mg/kg。“ISO”＝同型对照抗体(IC)。“未处理”＝未经胶原蛋白诱导。
图40A至图40C显示CIA模型中半治疗性研究的结果。抗鼠类PAD4 mAb(mumAb)减少小鼠脚爪中的PAD4(图40A)、MPO(图40B)及嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(图40C)。N＝每个处理组10至15个。N＝未处理组中5个。以利用Dunnett测试的单向ANOVA与媒剂相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。“Mpk”＝mg/kg。“未处理”＝未经胶原蛋白诱导。
图41A至图41B显示CIA模型中半治疗性研究的结果。抗鼠类PAD4 mAb(mumAb)降低脚爪及血清中的ACPA(图41A，分别为右侧图及左侧图)及血清抗CII抗体力价(图41B)。N＝每个处理组10至15个。N＝未处理组中5个。以利用Dunnett测试的单向ANOVA与媒剂相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。“Mpk”＝mg/kg。
图42显示CIA模型中半治疗性研究的结果。抗鼠类PAD4 mAb(mumAb)降低脚爪组织学评分。N＝每个处理组10至15个。以利用Dunnett测试的单向ANOVA与媒剂相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。“Mpk”＝mg/kg。“IC”＝同型对照抗体。
图43A至图43E显示抗人类PAD4 mAb克隆20及人源化衍生物在LPS ALIPD模型中的功效。图43A、图43B及图43C分别显示所示剂量下的克隆20、人源化基于克隆20的hz20-2抗体及人源化基于克隆20的hz20-7抗体对相对于总细胞外H3的细胞外瓜氨酸化H3的影响；减少百分比表示相对于同型对照条件的减少。图43D及图43E分别显示所示剂量下的基于克隆20的hz20-2抗体及基于克隆20的hz20-7抗体对相对于总细胞外ITIH4的细胞外瓜氨酸化ITIH4的影响；减少百分比表示相对于同型对照条件的减少。“Mpk”＝mg/kg。“IC”＝同型对照抗体。“未处理”＝未用LPS雾化。
图44A至图44E显示抗人类PAD4 mAb克隆13及人源化衍生物在LPS ALIPD模型中的功效。图44A、图44B及图44C分别显示所示剂量下的克隆13、人源化基于克隆13的hz13-12抗体及人源化基于克隆13的hz13-5抗体对相对于总细胞外H3的细胞外瓜氨酸化H3的影响；减少百分比表示相对于同型对照条件的减少。图44D及图44E分别显示所示剂量下的基于克隆13的hz13-12抗体及基于克隆13的hz13-5抗体对相对于总细胞外ITIH4的细胞外瓜氨酸化ITIH4的影响；减少百分比表示相对于同型对照条件的减少。“Mpk”＝mg/kg。“IC”＝同型对照抗体。“未处理”＝未用LPS雾化。
图45A至图45E显示使用Hu-PAD4基因敲入小鼠的LPS AJIPD研究的实验设计及人类PAD4终点。图45A显示研究时间表。图45B显示实验程序的概述，包括在膝关节处的治疗和自外植组织提取瓜氨酸化蛋白。显示髌骨外植体上清液的细胞外Cit-PRG4(图45C)、细胞外Cit-ITIH4(图45D)及人类PAD4(图45E)。
图46A至图46C显示抗人类PAD4抗体在LPS AJIPD研究中的功效。显示所示剂量下的基于克隆13的hz13-12抗体(图46A)、基于克隆13的hz13-5抗体(图46B)及基于克隆20的hz20-2抗体(图46C)对相对于总细胞外ITIH4的细胞外瓜氨酸化ITIH4的影响；减少百分比表示相对于同型对照条件的减少。“Mpk”＝mg/kg。“IC”＝同型对照抗体。“未处理”＝未注射姥鲛烷。“PBS”＝未经处理，注射磷酸盐缓冲盐水代替LPS。
图47A至图47C显示抗人类PAD4抗体在LPS AJIPD研究中的功效。显示髌骨外植体上清液的细胞外Cit-PRG4。显示所示剂量下的基于克隆13的hz13-12抗体(图47A)、基于克隆13的hz13-5抗体(图47B)及基于克隆20的hz20-2抗体(图47C)对相对于总细胞外PRG4的细胞外瓜氨酸化PRG4的影响；减少百分比表示相对于同型对照条件的减少。“Mpk”＝mg/kg。“IC”＝同型对照抗体。“PBS”＝磷酸盐缓冲盐水。“未处理”＝未注射LPS。
图48A至图48B显示抗人类PAD4抗体hz13-5及hz13-5D31E在LPS AJI研究中的功效。这些抗体抑制ITIH4(图48A)及PRG4(图48B)的瓜氨酸化；结果表明hz13-5 D31E抗体具有剂量依赖性抑制作用。“Mpk”＝mg/kg。“IC”＝同型对照抗体。“未处理”＝未注射LPS。
图49A至图49B显示hz13-5D31E抗体在来自RA患者的内源性PAD4抗体存在下保持效力。图49A显示通过ELISA中的OD450自21名RA患者及10名健康对照个体(NHV)的血清样本的纯化IgG测量的PAD4自体抗体。图49B显示在来自RA(实心方块)或NHV(空心方块)血清的纯化IgG存在下hz13-5D31E对H3瓜氨酸化的抑制。虚线表示在来自RA供体(下线)及NHV供体(上线)的纯化IgG的存在下且在不存在hz13-5 D31E的情况下PAD4对H3的瓜氨酸化。
具体实施方式
I.定义
除非另有定义，否则结合本发明使用的科学与技术术语将具有一般本领域技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。
在本申请中，除非另有陈述，否则“或”的使用意谓“和/或”。在多个从属项的上下文中，使用“或”仅以择一方式重新提及超过一个前述独立项或从属项。此外，除非另有具体说明，否则诸如“元素”或“组分”的术语涵盖包含一个单位的元素及组分及包含多于一个次单位的元素及组分两者。
与重组DNA、寡核苷酸合成、组织培养及转型(例如电穿孔、脂质体转染)、酶促反应及纯化技术结合使用的例示性技术描述于例如Sambrook等人Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.(1989))等处。
如本文所使用，术语“约”是指数值，包括例如整数、分数及百分比，无论是否明确指示。术语“约”通常是指一般本领域技术人员将认为等于所列举值(例如，具有相同功能或结果)的数值的范围(例如，所列举范围的+/-5-10％)。当诸如至少及约的术语出现在数值或范围清单之前时，所述术语将修改清单中提供的所有值或范围。在一些情况下，术语约可包括经舍入至最接近有效数字的数值。
术语“多肽”是指氨基酸残基的聚合物，且不限于最小长度。“蛋白质”可包含一个或多个多肽。此类氨基酸残基的聚合物可含有天然或非天然氨基酸残基，且包括(但不限于)肽、寡肽、氨基酸残基的二聚体、三聚体及多聚体。定义涵盖全长蛋白与其片段。所述术语亦包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化及其类似修饰。此外，出于本发明的目的，“多肽”或“蛋白质”是指分别包括天然序列的诸如缺失、添加及取代(一般在性质上为保守取代)的修饰的多肽或蛋白质，只要该蛋白质维持所需活性即可。这些修饰可是有意的，如经由定点突变诱发，或可为偶然的，诸如经由产生蛋白质的宿主的突变或因PCR扩增所致的错误。蛋白质可包含两个或更多个多肽。
如本文所用，除非另有明确说明(亦即，鼠类PAD4、猕猴PAD4或类似者)，否则“PAD4”或“蛋白质精氨酸脱亚胺酶4”或“肽基精氨酸脱亚胺酶4”是指人类PAD4(huPAD4；UniProtID:Q9UM07)。例示性人类PAD4氨基酸序列显示于SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2以及SEQ ID NO:3中。
本文中的术语“抗体”是指包含重链的至少互补决定区(CDR)1、CDR2及CDR3及轻链的至少CDR1、CDR2及CDR3的分子，其中该分子能够结合至抗原。术语为以最广泛意义使用且涵盖各种抗体结构，包括(但不限于)单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体、双功能抗体等)、全长抗体、单链抗体、抗体结合物及抗体片段，只要其展现所需PAD4特异性结合活性即可。
“经分离(isolated)”抗体为已与其天然环境的组分分离的抗体。在一些方面中，通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细电泳法)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)所测定，抗体经纯化至大于95％或99％的纯度。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
“抗原”是指抗体标靶，亦即抗体所特异性结合的分子。术语“表位”表示抗体所结合的蛋白质或非蛋白质抗原上的位点。蛋白质上的表位可以由连续的氨基酸延伸段(线性表位)形成，或包含例如由于抗原的折叠(亦即，通过蛋白质抗原的三级折叠)而在空间上接近的非连续氨基酸(构象表位)。线性表位通常在蛋白质抗原暴露于变性剂之后仍与抗体结合，而构象表位通常在用变性剂处理之后遭到破坏。
“抗PAD4抗体”或“PAD4抗体”或“特异性结合至PAD4的抗体”或“结合至PAD4的抗体”及类似词组是指如本文所定义的特异性结合至PAD4的抗体。
术语“重链”是指包含至少一重链可变区、具有或不具有前导序列的多肽。在一些实施方案中，重链包含重链恒定区的至少一部分。术语“全长重链”是指包含重链可变区及重链恒定区、具有或不具有前导序列的多肽。
术语“轻链”是指包含至少一轻链可变区、具有或不具有前导序列的多肽。在一些实施方案中，轻链包含轻链恒定区的至少一部分。术语“全长轻链”是指包含轻链可变区及轻链恒定区、具有或不具有前导序列的多肽。
如本文所用，术语“互补决定区”(“CDR”)是指抗体可变区中序列高度可变且决定抗原结合特异性的各区域。大体而言，抗体包含六个CDR：三个位于VH中(CDR-H1或重链CDR1、CDR-H2、CDR-H3)，且三个位于VL中(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。除非另外指明，否则根据本文中的序列表确定CDR。
“构架”或“FR”是指可变区残基中不属于互补决定区(CDR)的一部分的残基。可变区的FR一般由四个FR组成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，CDR及FR序列通常按以下顺序出现在VH(或VL)中:FR1-CDR-H1(CDR-L1)-FR2-CDR-H2(CDR-L2)-FR3-CDR-H3(CDR-L3)-FR4。
术语“可变区”或“可变域”是指涉及抗体与抗原的结合的抗体重链或轻链域。天然抗体的重链及轻链的可变域(分别为VH及VL)一般具有相似的结构，各域包含四个保守构架区(FR)及三个互补决定区(CDR)。参见例如Kindt等人Kuby Immunology,第6版，W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。可变域可包含重链(HC)CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3，具有或没有全部或一部分FR1和/或FR4；及轻链(LC)CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3，具有或没有全部或一部分FR1和/或FR4。亦即，可变域可缺乏FR1和/或FR4的一部分，只要其保留抗原结合活性即可。单个VH或VL域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可使用VH或VL域自结合抗原的抗体分离结合特定抗原的抗体，以分别筛选互补的VL或VH域的集合库。参见例如Portolano等人，J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人，Nature352:624-628(1991)。
抗体的轻链及重链“恒定区”是指FR及CDR以及可变区之外的其他序列部分。某些抗体片段可缺乏全部或一些恒定区。各重链自N端至C端具有可变域(VH)(也称为可变重链域或重链可变区)，接着为三个恒定重链域(CH1、CH2及CH3)。类似地，各轻链自N端至C端具有可变域(VL)(也称为可变轻链域或轻链可变区)，接着为恒定轻链(CL)域。
本文中的术语“Fc区”用于定义含有至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链的C端区。该术语包括天然序列Fc区及变异Fc区。在一个方面中，人类IgG重链Fc区自Cys226或自Pro230延伸至重链的羧基端的Gly446及Lys447(EU编号)。宿主细胞所产生的抗体可在重链C端经历一个或多个(尤其是一或两个)氨基酸的翻译后分裂。因此，通过表达编码全长重链的特定核酸分子由宿主细胞所产生的抗体可包括全长重链，或其可包括全长重链的分裂变体。其可能是重链的最后两个C端氨基酸分别为甘氨酸及赖氨酸的情况。因此，Fc区的C端赖氨酸或C端甘氨酸及赖氨酸可以存在或可以不存在。因此，“全长重链恒定区”或“全长抗体”，例如为人类IgGl抗体，包括具有C端甘氨酸及赖氨酸两者，但不含C端赖氨酸或不含C端甘氨酸及赖氨酸两者的IgG1。除非本文另有说明，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基为根据EU编号系统”也称为EU索引)编号，如Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991中所描述。
“效应功能”是指可归因于抗体的Fc区的那些生物活性，其随抗体同型变化。抗体效应功能的例子包括：C1q结合及补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；及B细胞活化。
抗体“类别”是指其重链所具有的恒定域或恒定区的类型。存在五个主要类别的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且这些抗体中的若干个可进一步分成子类(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ及μ。抗体的轻链可基于其恒定域的氨基酸序列归为两种类型中之一种，称为卡帕(kappa)(κ)及拉姆达(lambda)(λ)。
“抗体片段”是指并非完整抗体的分子，其包含完整抗体中与完整抗体所结合的抗原(亦即PAD4)进行结合的部分。抗体片段的例子包括(但不限于)Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双功能抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv及scFab)；单域抗体(dAb)；及由抗体片段形成的多特异性抗体。对于某些抗体片段的综述而言，参见Holliger及Hudson,Nature Biotechnology 23:1126-1136(2005)。
术语“全长抗体”、“完整抗体”及“全抗体”在本文中可互换使用，是指具有实质上与天然抗体结构类似的结构，或在IgG抗体的情况下具有含有如上文所定义的Fc区的重链的抗体。
术语“嵌合”抗体是指其中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而该重链和/或轻链的剩余部分来源于不同来源或物种的抗体。
“人源化”抗体是指包含来自非人类CDR的氨基酸残基及来自人类FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些方面中，人源化抗体将包含实质上全部至少一个且通常两个可变域，其中全部或实质上全部CDR对应于非人类抗体的CDR，且全部或实质上全部FR对应于人类抗体的FR。人源化抗体任选可包含来源于人类抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人类抗体)的“人源化形式”是指已进行人源化的抗体。
如本文所使用，术语“单克隆抗体”是指自实质上均质的抗体群体获得的抗体，亦即，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂制备期间产生的可能变体抗体外，构成该群体的个别抗体为相同的和/或结合相同表位，所述变体一般少量存在。与典型地包括针对不同决定子(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂形成对比，单克隆抗体制剂中的各单克隆抗体为针对抗原上的单一决定子。因此，修饰语“单克隆”表示获自实质上均质抗体群体的抗体特性，且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。
“多特异性”抗体为特异性结合至超过一个目标抗原的抗体，而“双特异性”抗体为特异性结合至两个抗原的抗体。“抗体结合物”为与一种或多种异源分子(包括但不限于治疗剂或标记)结合的抗体。
抗体可以作为某些宿主细胞生产过程的一部分或透过体内代谢进行修饰。本文中的抗体或抗体区氨基酸序列意欲不仅涵盖特定氨基酸序列，而且涵盖翻译后修饰的序列，例如包括侧链修饰及裂解。此类翻译后修饰可例如由于在宿主细胞中产生抗体和/或由于动物(例如人类)的体内翻译后修饰而发生。
在一些实施方案中，本文所公开的抗体包含翻译后修饰(例如一个或多个翻译后修饰)。翻译后修饰可包括例如泛素化、磷酸化、乙酰化、羟基化、甲基化、糖基化、单磷酸腺苷酸化、异戊烯化、去酰胺化、消除(elimylation)、瓜氨酸化及胺甲酰化。在一些实施方案中，抗体未经翻译后修饰。
如上文所指出，抗体可经历一个或多个，尤其是一个或两个来自重链的C端的氨基酸(通常为Gly-Lys)的翻译后裂解。此裂解可例如由于在宿主细胞中产生抗体的过程而发生。通过表达编码全长重链的特定核酸分子产生的抗体可包括全长重链，或其可包括全长重链的裂解变体，诸如缺乏C端Lys或C端Lys的重链。
其他类型的翻译后修饰可在抗体产生期间发生或以其他方式在体内发生，诸如氨基酸侧链的修饰。举例而言，抗体链上的N端Glu或Gln残基可经翻译后修饰为N端焦谷氨酸盐(也称为吡咯烷甲酸盐；缩写为pE)。
关于肽、多肽或抗体序列的“氨基酸序列一致性百分比(％)”及“同源性”被定义为在比对序列且必要时引入空位以实现最大序列一致性百分比之后，候选序列中的氨基酸残基与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基一致的百分比。出于测定氨基酸序列一致性百分比的目的的比对可以在此项技术的技能范围内的各种方式达成，例如使用公开可用的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件来达成。本领域技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较序列的全长内达成最大比对所需的任何算法。
术语“信号序列”或“前导序列”是指位于多肽N端，有助于自哺乳动物细胞分泌多肽的氨基酸残基序列。前导序列可在自哺乳动物细胞输出多肽时裂解形成成熟蛋白。前导序列可为天然或合成的，且可与其所连接的蛋白质异源或同源。非限制性例示性前导序列亦包括来自异源蛋白之前导序列。在一些实施方案中，抗体缺乏前导序列。在一些实施方案中，抗体包含至少一个前导序列，其可选自天然抗体前导序列及异源前导序列。
术语“核酸分子”或“多核苷酸”包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。各核苷酸由碱基，具体而言嘌呤或嘧啶碱基(亦即胞嘧啶I、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(亦即脱氧核糖或核糖)及磷酸酯基构成。通常，核酸分子为由碱基序列描述，其中所述碱基表示核酸分子之一级结构(线性结构)。该碱基序列通常以自5'至3'表示。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)，包括例如互补DNA(cDNA)及基因组DNA；核糖核酸(RNA)，尤其是信使RNA(mRNA)；合成形式的DNA或RNA；及包含两个或更多个这些分子的混合聚合物。核酸分子可呈线性或环状。另外，术语核酸分子包括有义股及反义股两者，以及单股及双股形式。此外，本文所描述的核酸分子可含有天然存在或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的例子包括具有衍生糖或磷酸酯主链键或经化学修饰的残基的经修饰核苷酸碱基。核酸分子亦涵盖DNA及RNA分子，其适用作体外和/或体内，例如在宿主或患者中直接表达本发明的抗体的载体。此类DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA、环状RNA)载体可未经修饰或经修饰。
“经分离”核酸是指已与其天然环境的组分分离的核酸分子。经分离核酸包括通常含有核酸分子的细胞中所含的核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置处。
“编码抗PAD4抗体的经分离核酸”是指编码抗PAD4抗体重链及轻链(或其片段)的一个或多个核酸分子，包括单一载体或不同载体中的此类核酸分子，及存在于宿主细胞中一个或多个位置处的此类核酸分子。
如本文所使用，术语“载体”是指能够传播与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括呈自我复制核酸结构的载体以及并入其所引入的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够导引其以操作方式连接的核酸的表达。这些载体在本文中称为“表达载体”。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞株”及“宿主细胞培养物”可互换使用且是指已引入有外源核酸的细胞，包括所述细胞的后代。
在本发明中，当提及例如蛋白质及其配位体或抗体及其抗原标靶或一些其他结合对时，“结合(binds/binding”或“特异性结合(specific binding)”及类似术语意谓结合对成员之间的结合亲和力足够强，以至于相互作用无法归因于随机分子缔合(亦即“非特异性结合”)。此类结合通常需要1μM或更小的解离常数(KD)，且通常可涉及100nM或更小的KD。
“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合搭配物(例如抗原)之间的非共价相互作用力的总和。除非另有指示，否则如本文所使用，“结合亲和力”是指反映结合对(例如，抗体与抗原)成员之间1:1相互作用的固有结合亲和力。亲和力通常可由解离常数(KD)表示。抗体对抗原的亲和力可通过本领域已知的常见方法，诸如表面等离子共振(SPR)测量。
如本文所使用，术语“激动剂”是指使与其结合的分子的至少一种活性或功能增加、或以其他方式活化或帮助活化该分子的物质，例如抗体。如本文所使用，术语“拮抗剂”或“抑制剂”是指使与其结合的分子的至少一种活性或功能减少、或以其他方式阻断或抑制该分子的至少一种活性或功能的物质，例如抗体。
术语“抑制(inhibition/inhibit)”更一般而言是指减少或停止任何事件(诸如蛋白质配位体结合)，或减少或停止任何表型特征，或减少或停止该特征的发生率、程度或可能性。“降低(reduce)”或“抑制(inhibit)”是指与参考相比减少、降低或遏制活性、功能和/或量。抑制或降低不一定为完全的。举例而言，在某些实施方案中，“降低”或“抑制”意谓能够整体减少20％或更多。在另一实施方案中，“降低”或“抑制”意谓能够整体减少50％或更多。在另一实施方案中，“降低”或“抑制”意谓能够整体减少75％、85％、90％、95％或更多。
如本文所使用，“治疗”涵盖人类疾病治疗剂的任何施用或施用，且包括抑制疾病或疾病的进展或一种或多种疾病症状，抑制或减缓疾病或其进展或其一种或多种症状，遏制其发展，部分或完全减轻疾病或其一种或多种症状，或预防疾病的一种或多种症状复发。
术语“个体”及“患者”在本文中可互换使用以指人类，除非另有明确指示(亦即，鼠类个体或其类似者)。
如本文所使用，“自体免疫疾病”或“自体免疫疾病”涵盖特征在于个体免疫系统攻击其自身正常细胞及组织的疾病，并且亦涵盖特征可在于或可不在于存在自体抗体的免疫介导性疾病。本发明通篇提供自体免疫疾病的许多非限制性实施例。自体免疫疾病的一些非限制性实施例包括类风湿性关节炎(RA)、狼疮(例如全身性红斑狼疮症(SLE))、狼疮性肾炎、血管炎(例如ANCA相关血管炎)、血栓(例如静脉血栓)及炎性肠病(IBD)(例如溃疡性结肠炎、克罗恩氏病)。术语“疾病”与“病症”在本文中可互换使用。在一些实施方案中，自体免疫疾病的特征在于存在自体抗体。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指有效治疗个体的疾病或病症以便部分或完全减轻一种或多种症状的药物的量。在一些实施方案中，有效量是指在所需剂量及时间段下有效达成所需治疗或预防结果的量。
如本文所使用的“生物样本”是指自个体或自动物获取的样本。生物样本的例子包括组织样本及液体生物样本，诸如全血、血清、血浆、血液上清液或滑液。生物样本可以直接取自个体，或者可以在使用之前首先以某种方式进行化学或物理修饰，例如，以便帮助分析样本。
II.例示性抗PAD4抗体
本文提供特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的抗体。在一些实施方案中，抗体抑制PAD4的活性，诸如精氨酸的瓜氨酸化。
克隆13及相关抗体
举例而言，本文中的公开内容涉及基于被称作“克隆13”的鼠类抗人类抗体之一组抗体，例如如下文实施例1中进一步描述。例如，克隆13为以其原始的鼠类抗人类形式制备，然后进行人源化以产生一系列称为hz13-1至hz13-12的抗体，其中hz13-5及hz13-12在位置D31至D31E处进一步得以修饰(抗体hz13-5 D31E及hz13-12 D31E)，如本文实施例中所描述。进行克隆13Fab与PAD4结合的低温EM研究，并进行互补位定位以鉴别克隆13可变区及其直接接触PAD4的人源化变体的部分，提供关于克隆13可变区部分及其决定PAD4结合的相关人源化抗体的其他结构信息。(参见以下实施例12至13)。亦进一步修饰抗体hz13-5，以鉴别以pH依赖性方式结合至PAD4的抗体。(参见以下子章节及实施例14)。
举例而言，在一些实施方案中，本发明涉及一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：重链可变区(VH)，其含有包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR3；及轻链可变区(VL)，其含有包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ IDNO:9的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，本发明涉及一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含重链可变区(VH)，其含有包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列的HCDR3；及轻链可变区(VL)，其含有包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，本发明涉及一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：重链可变区(VH)，其含有包含SEQ ID NO:4或62的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)及包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR3；及轻链可变区(VL)，其含有包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)。详言之，对包含以上重链及轻链CDR集合的抗体的互补位定位及结构分析揭露，与PAD4接触的为HCDR1、HCDR3及LCDR1。(参见图8A至图8B)。因此，在一些实施方案中，本文中的抗体包含上述这些三个CDR的集合。在一些实施方案中，抗体包含VH及VL，该VH包含：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR1及包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR3；该VL包含：包含SEQ IDNO:7的氨基酸序列的LCDR1。在其他实施方案中，抗体包含VH及VL，该VH包含：包含SEQ IDNO:62的氨基酸序列的HCDR1及包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR3；该VL包含：包含SEQID NO:7的氨基酸序列的LCDR1。
在一些实施方案中，抗体包含重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:221或225的氨基酸序列及SEQ ID NO:222的氨基酸序列；及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列。这些互补位区中的各者均被鉴别为接触PAD4，如实施例及图8A至图8B中所描述。在一些实施方案中，该抗体进一步包含：包含SEQ ID NO:224的氨基酸序列的轻链恒定区。
在一些实施方案中，抗体包含VH，其包含Kabat位置94处的甘氨酸(Gly94)。(参见图1E)。因此，举例而言，最初鉴别的小鼠抗人类的子胡13抗体包含Kabat位置94处的甘氨酸，但若干人类构架区不包含甘氨酸。因此，在某些人源化抗体中，需要进行回复突变才能在Kabat位置94获得甘氨酸。Gly94为与VH CDR3相邻的环(亦即，VH CDR3环)中的氨基酸残基。在一些实施方案中，Gly94与VH CDR3环的灵活性和/或几何结构有关。在一些实施方案中，Gly94可与VH CDR3相互作用。在一些实施方案中，Gly94与抗PAD4抗体的活性有关。在一些实施方案中，Gly94突变为不同的氨基酸(诸如苏氨酸)导致VH CDR3环的灵活性降低、VHCDR3环的几何结构改变、位置94处的氨基酸与VH CDR3环之间的相互作用降低、抗PAD4抗体与PAD4的结合减少、抗PAD4抗体的活性降低、抗PAD4抗体与细胞外基质(ECM)蛋白的结合增加、抗PAD4抗体二级结构的改变、抗PAD4抗体稳定性的降低、或其任何组合。因此，在一些实施方案中，抗体的VH包含Kabat位置94(SEQ ID NO:10的位置98)处的甘氨酸。(参见图1E，其描绘刚好位于HCDR3之前的此残基位置)。
在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58或68中任一者的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60或70中任一者的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：与SEQ ID NO:10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58或68中任一者的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQ IDNO:12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60或70中任一者的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含VH，其包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58或68中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含VL，其包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60或70中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：VH，其包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58或68中任一者的氨基酸序列；及VL，其包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60或70中任一者的氨基酸序列。在一些此类情况下：该抗体VH及VL进一步包含：(a)包含SEQ ID NO:4或62的氨基酸序列的HCDR1，及包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR3，以及包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR1；(b)包含SEQ ID NO:4或62的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HCDR2、包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR3、包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LCDR2、包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LCDR3；或(c)VH中SEQ ID NO:221或225的氨基酸序列及VL中SEQ ID NO:222的氨基酸序列，进一步任选地，轻链恒定区包含SEQ ID NO:224的氨基酸序列。因此，在此类情况下，VH及VL与上文所列的序列识别编号相比的变异位于这些特定CDR或互补位序列之外的区域。在一些实施方案中，抗体包含VH，其包含SEQ ID NO:10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58或68中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含VL，其包含SEQ ID NO:12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60或70中任一者的氨基酸序列。
在又其他实施方案中，抗体包含以下两者：VH，其包含SEQ ID NO:10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58或68中任一者的氨基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO:12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60或70中任一者的氨基酸序列。因此，举例而言，以下例示性抗体在本发明的范畴内：
一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VL；
一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL；
一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VL；
一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL；
一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VL；
一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL；
一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VL；
一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VL；
一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的VL；
一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的VL；
一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的VL；
一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的VL；
一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的VL；
一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL。
在以上抗体中任一者中，在一些情况下，抗体结合至包含SEQ ID NO:217及SEQ IDNO:218的PAD4上的表位。
在本文的一些实施方案中，抗体为IgA、IgG或IgM抗体。在一些情况下，抗体为IgG抗体，诸如人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体，或鼠类IgG1或IgG2抗体。在一些情况下，抗体包含野生型、人类IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区。在一些实施方案中，抗体包含全长重链和/或全长轻链。在其他情况下，抗体在重链恒定区末端缺乏C端赖氨酸。在又其他情况下，抗体在重链恒定区末端缺乏C端甘氨酸-赖氨酸。在一些情况下，抗体为抗体片段，诸如Fv、单链Fv(scFv)、Fab、Fab'或(Fab')2。
在一些实施方案中，抗体为双特异性或多特异性抗体，或其与至少一个其他分子共价或非共价结合。在一些实施方案中，抗体与至少一个其他分子共价或非共价结合，其中该至少一个其他分子包含检测标记和/或药物。
在一些实施方案中，抗体包含人类IgG1重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：人类IgG1重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列；及轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列。在一些情况下，抗体包含重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列。在一些情况下，抗体包含轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列。在一些情况下，抗体包含以下两者：重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列；及轻链恒定区，其包含与SEQ IDNO:194的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含人类IgG1重链恒定区，其包含SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含轻链恒定区，其包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：人类IgG1重链恒定区，其包含SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列；及轻链恒定区，其包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列。
克隆20及相关抗体
本发明进一步涉及第二小鼠抗人类抗体、克隆20及其变化形式变体hz20-1至hz20-14，如以下实施例中所描述。因此，在一些实施方案中，本发明涉及一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：重链可变区(VH)，其含有包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HCDR3；及轻链可变区(VL)，其含有包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:78、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、122、126、130或134中任一者的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、124、128、132或136中任一者的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，该抗体包含VH，其包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:78、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、122、126、130或134中任一者的氨基酸序列，且其中该抗体包含VL，其包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、124、128、132或136中任一者的氨基酸序列。在一些此类情况下，抗体VH进一步包含：包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的HCDR2或包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HCDR3。在一些情况下，抗体VL进一步包含：包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的LCDR2或包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗体包含VH，其包含SEQ ID NO:78、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、122、126、130或134中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含VL，其包含SEQ ID NO:80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、124、128、132或136中任一者的氨基酸序列。
在又其他实施方案中，抗体包含VH，其包含SEQ ID NO:78、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、122、126、130或134中任一者的氨基酸序列；且包含VL，其包含SEQ IDNO:80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、124、128、132或136中任一者的氨基酸序列。因此，举例而言，以下例示性抗体在本发明的范畴内：
一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的VL；
一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VL；
一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VL；
一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的VL；
一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的VL；
一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的VL；
一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的VL；
一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的VL；
一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的VL；
一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VL；
一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的VL；
一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列的VL；
一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列的VL；
一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的VL；
一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的VL。
在以上抗体中任一者中，在一些情况下，抗体结合至包含SEQ ID NO:219及SEQ IDNO:220的PAD4上的表位。
在本文的一些实施方案中，抗体为IgA、IgG或IgM抗体。在一些情况下，抗体为IgG抗体，诸如人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体，或鼠类IgG1或IgG2抗体。在一些情况下，抗体包含野生型、人类IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区。在某些方面中，抗体属于人类IgG1同型。在某些方面中，抗体属于人类IgG1同型，其具有P329G、L234A及L235A突变(LALAPG；EU编号)以减弱Fc区效应功能。在其他方面中，抗体属于人类IgG2同型。在某些方面中，抗体属于IgG4同型，其中铰链区中具有S228P突变(EU编号)以改良IgG4抗体的稳定性。在一些方面中，抗体(例如非人源化抗体)可具有非人类IgG恒定区，且可为例如鼠类IgG2a抗体，诸如鼠类IgG2a LAPG抗体。在一些实施方案中，抗体包含全长重链和/或全长轻链。在其他情况下，抗体在重链恒定区末端缺乏C端赖氨酸。在又其他情况下，抗体在重链恒定区末端缺乏C端甘氨酸-赖氨酸。在一些情况下，抗体为抗体片段，诸如Fv、单链Fv(scFv)、Fab、Fab'或(Fab')2。
在一些实施方案中，抗体为双特异性或多特异性抗体，或其与至少一个其他分子共价或非共价结合。在一些实施方案中，抗体与至少一个其他分子共价或非共价结合，其中该至少一个其他分子包含检测标记和/或药物。
在一些实施方案中，抗体包含人类IgG1重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：人类IgG1重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列；及轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列。在一些情况下，抗体包含重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列。在一些情况下，抗体包含轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列。在一些情况下，抗体包含以下两者：重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列；及轻链恒定区，其包含与SEQ IDNO:194的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含人类IgG1重链恒定区，其包含SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含轻链恒定区，其包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：人类IgG1重链恒定区，其包含SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列；及轻链恒定区，其包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列。
pH依赖性克隆13相关抗体
在一些实施方案中，本发明涉及亲本抗体克隆13或hz13-5的一种或多种抗体变体，其中特定残基如以下实施例14中所描述进行修饰。在某些情况下，但并非在所有情况下，这些修饰均显示影响PAD4结合的pH依赖性，如实施例14中所描述。
在一些实施方案中，本发明涉及一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含VH，其包含：包含位置26至35的氨基酸序列的HCDR1；包含位置50至66的氨基酸序列的HCDR2；及包含SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140、SEQ IDNO:142、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162、SEQ IDNO:164、SEQ ID NO:166或SEQ ID NO:168的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3。在以上一些实施方案中，抗体进一步包含VL，其包含：包含SEQ ID NO:170的残基24至38的氨基酸序列的LCDR1；包含SEQ ID NO:170的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2；及包含SEQ ID NO:170的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3。在以上其他实施方案中，抗体进一步包含VL，其包含：包含SEQ ID NO:172的残基24至38的氨基酸序列的LCDR1；包含SEQ ID NO:172的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2；及包含SEQ ID NO:172的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，该抗体包含：
-VH，其包含：包含SEQ ID NO:138的位置26至35的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:138的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:138的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO:170的残基24至38的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:170的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:170的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3；
-VH，其包含：包含SEQ ID NO:140的位置26至35的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:140的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:140的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO:170的残基24至38的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:170的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:170的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3；
-VH，其包含：包含SEQ ID NO:142的位置26至35的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:142的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:142的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO:170的残基24至38的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:170的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:170的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3；
-VH，其包含：包含SEQ ID NO:144的位置26至35的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:144的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:144的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO:170的残基24至38的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:170的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:170的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3；
-VH，其包含：包含SEQ ID NO:146的位置26至35的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:146的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:146的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO:170的残基24至38的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:170的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:170的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3；
-VH，其包含：包含SEQ ID NO:148的位置26至35的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:148的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:148的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO:170的残基24至38的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:170的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:170的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3；
-VH，其包含：包含SEQ ID NO:150的位置26至35的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:150的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:150的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO:170的残基24至38的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:170的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:170的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3；
-VH，其包含：包含SEQ ID NO:152的位置26至35的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:152的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:152的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO:170的残基24至38的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:170的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:170的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3；
-VH，其包含：包含SEQ ID NO:154的位置26至35的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:154的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:154的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO:170的残基24至38的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:170的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:170的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3；
-VH，其包含：包含SEQ ID NO:156的位置26至35的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:156的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:156的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO:170的残基24至38的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:170的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:170的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3；
-VH，其包含：包含SEQ ID NO:158的位置26至35的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:158的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:158的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO:170的残基24至38的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:170的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:170的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3；
-VH，其包含：包含SEQ ID NO:160的位置26至35的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:160的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:160的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO:170的残基24至38的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:170的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:170的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3；
-VH，其包含：包含SEQ ID NO:162的位置26至35的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:162的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:162的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO:170的残基24至38的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:170的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:170的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3；
-VH，其包含：包含SEQ ID NO:164的位置26至35的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:164的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:164的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO:170的残基24至38的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:170的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:170的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3；
-VH，其包含：包含SEQ ID NO:166的位置26至35的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:166的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:166的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO:170的残基24至38的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:170的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:170的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3；或
-VH，其包含：包含SEQ ID NO:168的位置26至35的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:168的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:168的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO:170的残基24至38的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:170的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:170的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，该抗体包含：
-VH，其包含：包含SEQ ID NO:138的位置26至35的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:138的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:138的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO:172的残基24至38的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:172的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:172的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3；
-VH，其包含：包含SEQ ID NO:140的位置26至35的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:140的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:140的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO:172的残基24至38的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:172的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:172的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3；
-VH，其包含：包含SEQ ID NO:142的位置26至35的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:142的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:142的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO:172的残基24至38的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:172的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:172的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3；
-VH，其包含：包含SEQ ID NO:144的位置26至35的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:144的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:144的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO:172的残基24至38的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:172的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:172的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3；
-VH，其包含：包含SEQ ID NO:146的位置26至35的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:146的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:146的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO:172的残基24至38的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:172的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:172的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3；
-VH，其包含：包含SEQ ID NO:148的位置26至35的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:148的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:148的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO:172的残基24至38的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:172的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:172的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3；
-VH，其包含：包含SEQ ID NO:150的位置26至35的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:150的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:150的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO:172的残基24至38的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:172的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:172的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3；
-VH，其包含：包含SEQ ID NO:152的位置26至35的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:152的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:152的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO:172的残基24至38的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:172的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:172的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3；
-VH，其包含：包含SEQ ID NO:154的位置26至35的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:154的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:154的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO:172的残基24至38的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:172的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:172的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3；
-VH，其包含：包含SEQ ID NO:156的位置26至35的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:156的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:156的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO:172的残基24至38的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:172的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:172的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3；
-VH，其包含：包含SEQ ID NO:158的位置26至35的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:158的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:158的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO:172的残基24至38的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:172的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:172的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3；
-VH，其包含：包含SEQ ID NO:160的位置26至35的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:160的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:160的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO:172的残基24至38的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:172的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:172的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3；
-VH，其包含：包含SEQ ID NO:162的位置26至35的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:162的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:162的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO:172的残基24至38的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:172的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:172的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3；
-VH，其包含：包含SEQ ID NO:164的位置26至35的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:164的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:164的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO:172的残基24至38的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:172的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:172的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3；
-VH，其包含：包含SEQ ID NO:166的位置26至35的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:166的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:166的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO:172的残基24至38的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:172的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:172的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3；或
-VH，其包含：包含SEQ ID NO:168的位置26至35的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:168的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:168的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO:172的残基24至38的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:172的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:172的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3。
在以上一些实施方案中，该抗体包含VH，其包含与SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:150、SEQID NO:152、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:166或SEQ ID NO:168的氨基酸序列至少90％一致、至少95％一致、或至少97％一致的氨基酸序列。在一些以上实施方案中，抗体包含有包含与SEQID NO:170的氨基酸序列至少90％一致、至少95％一致或至少97％一致的氨基酸序列的VL。在其他实施方案中，抗体包含有包含与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％一致、至少95％一致或至少97％一致的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，该抗体进一步包含如上文所提供的相应HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3。
在以上一些实施方案中，抗体包含VH，其包含SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140、SEQID NO:142、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162、SEQID NO:164、SEQ ID NO:166或SEQ ID NO:168的氨基酸序列。在以上一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ IDNO:172的氨基酸序列的VL。在以上一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:138、SEQ IDNO:140、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:160、SEQ IDNO:162、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:166或SEQ ID NO:168的氨基酸序列的VH；以及包含SEQID NO:170的氨基酸序列的VL。在以上一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:138、SEQID NO:140、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:160、SEQID NO:162、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:166或SEQ ID NO:168的氨基酸序列的VH；以及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，本发明涉及一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含重链可变区(VH)，其包含：包含SEQ ID NO:138的位置26至35的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:138的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:138的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及轻链可变区(VL)，其包含：包含SEQ ID NO:170的残基24至38的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:170的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:170的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:138的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：与SEQ ID NO:138的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：与SEQ ID NO:138的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VH；及与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:138的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VH；及与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:138的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，本发明涉及一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含重链可变区(VH)，其包含：包含SEQ ID NO:140的位置26至35的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:140的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:140的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及轻链可变区(VL)，其包含：包含SEQ ID NO:170的残基24至38的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:170的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:170的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:140的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:140的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:140的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ IDNO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:140的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：与SEQ ID NO:140的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:140的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:140的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的VH；及与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:140的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的VH；及与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:140的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，本发明涉及一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含重链可变区(VH)，其包含：包含SEQ ID NO:142的位置26至35的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:142的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:142的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及轻链可变区(VL)，其包含：包含SEQ ID NO:170的残基24至38的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:170的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:170的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:142的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:142的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:142的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ IDNO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:142的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：与SEQ ID NO:142的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:142的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:142的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的VH；及与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:142的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的VH；及与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:142的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，本发明涉及一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含重链可变区(VH)，其包含：包含SEQ ID NO:144的位置26至35的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:144的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:144的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及轻链可变区(VL)，其包含：包含SEQ ID NO:170的残基24至38的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:170的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:170的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:144的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:144的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:144的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ IDNO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:144的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ IDNO:144的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQID NO:144的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:144的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的VH；及与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:144的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的VH；及与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:144的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，本发明涉及一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含重链可变区(VH)，其包含：包含SEQ ID NO:146的位置26至35的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:146的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:146的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及轻链可变区(VL)，其包含：包含SEQ ID NO:170的残基24至38的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:170的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:170的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:146的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:146的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:146的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ IDNO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:146的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：与SEQ ID NO:146的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:146的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:146的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的VH；及与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:146的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的VH；及与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:146的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，本发明涉及一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含重链可变区(VH)，其包含：包含SEQ ID NO:148的位置26至35的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:148的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:148的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及轻链可变区(VL)，其包含：包含SEQ ID NO:170的残基24至38的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:170的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:170的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:148的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:148的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:148的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ IDNO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:148的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ IDNO:148的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQID NO:148的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:148的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的VH；及与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:148的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的VH；及与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:148的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，本发明涉及一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含重链可变区(VH)，其包含：包含SEQ ID NO:150的位置26至35的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:150的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:150的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及轻链可变区(VL)，其包含：包含SEQ ID NO:170的残基24至38的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:170的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:170的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:150的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：与SEQ ID NO:150的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:150的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:150的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:150的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:150的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:150的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列的VH；及与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:150的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列的VH；及与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:150的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，本发明涉及一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含重链可变区(VH)，其包含：包含SEQ ID NO:152的位置26至35的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:152的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:152的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及轻链可变区(VL)，其包含：包含SEQ ID NO:170的残基24至38的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:170的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:170的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:152的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:152的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:152的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ IDNO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:152的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：与SEQ ID NO:152的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:152的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:152的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列的VH；及与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:152的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列的VH；及与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:152的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，本发明涉及一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含重链可变区(VH)，其包含：包含SEQ ID NO:154的位置26至35的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:154的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:154的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及轻链可变区(VL)，其包含：包含SEQ ID NO:170的残基24至38的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:170的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:170的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:154的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:154的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:154的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ IDNO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:154的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：与SEQ ID NO:154的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:154的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:154的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列的VH；及与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:154的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列的VH；及与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:154的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，本发明涉及一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含重链可变区(VH)，其包含：包含SEQ ID NO:156的位置26至35的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:156的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:156的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及轻链可变区(VL)，其包含：包含SEQ ID NO:170的残基24至38的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:170的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:170的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:156的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：与SEQ ID NO:156的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:156的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:156的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：与SEQ ID NO:156的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:156的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:156的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列的VH；及与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:156的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列的VH；及与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:156的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，本发明涉及一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含重链可变区(VH)，其包含：包含SEQ ID NO:158的位置26至35的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:158的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:158的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及轻链可变区(VL)，其包含：包含SEQ ID NO:170的残基24至38的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:170的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:170的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ IDNO:158的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:158的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:158的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ IDNO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:158的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：与SEQ ID NO:158的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:158的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:158的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列的VH；及与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:158的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列的VH；及与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:158的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，本发明涉及一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含重链可变区(VH)，其包含：包含SEQ ID NO:160的位置26至35的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:160的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:160的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及轻链可变区(VL)，其包含：包含SEQ ID NO:170的残基24至38的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:170的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:170的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:160的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:160的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:160的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ IDNO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:160的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：与SEQ ID NO:160的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:160的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:160的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的VH；及与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:160的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的VH；及与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:160的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，本发明涉及一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含重链可变区(VH)，其包含：包含SEQ ID NO:162的位置26至35的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:162的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:162的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及轻链可变区(VL)，其包含：包含SEQ ID NO:170的残基24至38的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:170的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:170的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:162的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:162的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:162的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ IDNO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:162的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：与SEQ ID NO:162的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:162的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:162的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的VH；及与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:162的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的VH；及与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:162的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，本发明涉及一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含重链可变区(VH)，其包含：包含SEQ ID NO:164的位置26至35的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:164的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:164的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及轻链可变区(VL)，其包含：包含SEQ ID NO:170的残基24至38的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:170的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:170的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:164的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:164的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:164的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ IDNO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:164的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ IDNO:164的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQID NO:164的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:164的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的VH；及与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:164的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的VH；及与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:164的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，本发明涉及一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含重链可变区(VH)，其包含：包含SEQ ID NO:166的位置26至35的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:166的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:166的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及轻链可变区(VL)，其包含：包含SEQ ID NO:170的残基24至38的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:170的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:170的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:166的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：与SEQ ID NO:166的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:166的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:166的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：与SEQ ID NO:166的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与列SEQ ID NO:172的氨基酸序至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ IDNO:166的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:166的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的VH；及与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:166的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的VH；及与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:166的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，本发明涉及一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含重链可变区(VH)，其包含：包含SEQ ID NO:168的位置26至35的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:168的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:168的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及轻链可变区(VL)，其包含：包含SEQ ID NO:170的残基24至38的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:170的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:170的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，该抗体包含与SEQ ID NO:168的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH。在一些实施方案中，该抗体包含与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:168的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:168的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:168的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：与SEQ ID NO:168的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:168的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:168的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列的VH；及与SEQ ID NO:170的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:168的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列的VH；及与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:168的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。
在一些情况下，抗体为IgG抗体，诸如人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体，或鼠类IgG1或IgG2抗体。在一些情况下，抗体包含野生型、人类IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区。在一些实施方案中，抗体包含全长重链和/或全长轻链。在其他情况下，抗体在重链恒定区末端缺乏C端赖氨酸。在又其他情况下，抗体在重链恒定区末端缺乏C端甘氨酸-赖氨酸。在一些情况下，抗体为抗体片段，诸如Fv、单链Fv(scFv)、Fab、Fab'或(Fab')2。
在一些实施方案中，抗体为双特异性或多特异性抗体，或其与至少一个其他分子共价或非共价结合。在一些实施方案中，抗体与至少一个其他分子共价或非共价结合，其中该至少一个其他分子包含检测标记和/或药物。
在一些实施方案中，抗体包含人类IgG1重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：人类IgG1重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列；及轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列。在一些情况下，抗体包含重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列。在一些情况下，抗体包含轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列。在一些情况下，抗体包含以下两者：重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列；及轻链恒定区，其包含与SEQ IDNO:194的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含人类IgG1重链恒定区，其包含SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含轻链恒定区，其包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：人类IgG1重链恒定区，其包含SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列；及轻链恒定区，其包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列。
鼠类抗体
在一些实施方案中，本发明涉及一种特异性结合至鼠类蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含VH，其包含：包含SEQ ID NO:208的位置31至35的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:208的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ IDNO:208的位置99至107的氨基酸序列的HCDR3；且其中该抗体包含轻链可变区(VL)，其包含：包含SEQ ID NO:210的残基24至38的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、包含SEQ IDNO:210的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:210的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:208的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:210的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：与SEQ ID NO:208的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQ ID NO:210的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:208的氨基酸的VH。在一些实施方案中，抗体包含有包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:210中任一者的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:208的氨基酸的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:210中任一者的氨基酸序列的VL。在一些此类情况下，该抗体进一步包含：包含SEQ ID NO:208的位置31至35的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:208的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:208的位置99至107的氨基酸序列的HCDR3；包含SEQ ID NO:210的残基24至38的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:210的残基54至60的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:210的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:208的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:210的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:208的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:210的氨基酸序列的VL。
在本文的一些实施方案中，抗体为IgA、IgG或IgM抗体。在一些情况下，抗体为鼠类IgG1或IgG2抗体。在一些实施方案中，抗体包含全长重链和/或全长轻链。在其他情况下，抗体在重链恒定区末端缺乏C端赖氨酸。在又其他情况下，抗体在重链恒定区末端缺乏C端甘氨酸-赖氨酸。在一些情况下，抗体为抗体片段，诸如Fv、单链Fv(scFv)、Fab、Fab'或(Fab')2。
在一些实施方案中，抗体为双特异性或多特异性抗体，或其与至少一个其他分子共价或非共价结合。在一些实施方案中，抗体与至少一个其他分子共价或非共价结合，其中该至少一个其他分子包含检测标记和/或药物。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的HC。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列的LC。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的HC；包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列的LC。
III.例示性抗体变体、片段及恒定区
在许多实施方案中，特异性结合至PAD4的抗体可单独或以组合形式进一步合并任一特征，如以下部分中所描述。
A.抗体片段
在某些实施方案中，本文所提供的抗体为抗体片段。抗体片段包括(但不限于)Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv及scFv片段，及下文所描述的其他片段。关于某些抗体片段的综述，Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Pluckthün，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg及Moore编,(Springer-Verlag,New York),第269至315页(1994)；亦参见WO 93/16185；及美国专利案第5,571,894号及第5,'87,458号。关于包含救助受体结合表位残基及具有增加的体内半衰期的Fab及F(ab')2片段的论述，参见美国专利第5,869,046号。
双功能抗体为其中两个抗原结合位点可为二价或双特异性的抗体片段。参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三功能抗体及四功能抗体亦描述于等人，Nat.Med.9:129-134(2003)中。
单域抗体为包含抗体的重链可变域的全部或一部分或轻链可变域的全部或一部分的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体为人类单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利第6,248,516号)。
抗体片段可通过如本文中所描述的各种技术制得，包括(但不限于)蛋白水解消化完整抗体以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生。
B.双特异性或多特异性抗体
在某些实施方案中，本文所提供的抗体为多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体为对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一为针对TREM2且另一者为针对任何其他抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可结合至TREM2的两个不同表位。双特异性抗体亦可用于定位诸如细胞毒性剂的药物或定位检测标记至表达TREM2的细胞。在一些实施方案中，多特异性抗体(例如双特异性抗体)包含含有如本文所描述的CDR或可变区的第一可变域。双特异性抗体可制备为全长抗体或抗体片段。
用于制造多特异性抗体的技术包括(但不限于)具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein及Cuello,Nature 305:537(1983))、WO 93/08829,及Traunecker等人，EMBO J.10:3655(1991))及“杵臼”工程改造(参见例如美国专利第5,731,168号)。多特异性抗体亦可如下制得：用于制造抗体Fc-杂二聚分子的工程改造静电导向效应(WO 2009/089004A1)；使两种或更多种抗体或片段交联(参见例如美国专利第4,676,980号及Brennan等人，Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见例如Kostelny等人，J.Immunol.,18(5):1547-1553(1992))；使用用于制得双特异性抗体片段的“双功能抗体”技术(参见例如Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等人，J.Immunol.,152:5368(1994))；及如例如Tutt等人，J.Immunol.147:60(1991)中所描述制备三特异性抗体。
本文中亦包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程改造抗体，包括“章鱼抗体”(参见例如US2006/0025576)。
C.嵌合抗体及人源化抗体
在某些实施方案中，本文中所提供的抗体为嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如美国专利第4,816,567号；以及Morrison等人的Proc.Natl.Acad.Sci.USA(81:6851-6855(1984))中。在一个实施例中，嵌合抗体包含非人类可变区(例如，衍生自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人类灵长类动物(诸如猴)的可变区)及人类恒定区。在另一实施例中，嵌合抗体为“类别转换”抗体，其中类别或子类已自亲本抗体的类别或子类别变化。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体为人源化抗体。通常，对非人类抗体进行人源化以降低对人类的免疫原性，同时保留亲本非人类抗体的特异性及亲和力。一般而言，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR，例如CDR(或其一部分)，来源于非人类抗体，且FR(或其一部分)来源于人类抗体序列。人源化抗体任选亦将包含人类恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基经来自非人类抗体(例如HVR残基所来源的抗体)的相应残基取代以例如恢复或提高抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制造方法评述于例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中，且进一步描述于例如Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利第5,821,337号、第7,527,791号、第6,982,321号及第7,087,409号；Kashmiri等人，Methods 36:25-34(2005)(描述特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面再塑”)；Dall'Acqua等人，Methods 36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；及Osbourn等人，Methods 36:61-68(2005)及Klimka等人，Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述FR改组的“导引选择”方法)。
可以用于人源化的人类构架区包括(但不限于)：使用“最佳拟合”方法选择的构架区(参见例如Sims等人J.Immunol.151:2296(1993))；来源于轻链或重链可变区的特定子组的人类抗体的共同序列的构架区(参见例如Carte r等人Pro c.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；及Presta等人J.Immunol.,151:2623(1993))；人类成熟(体细胞突变)构架区或人类生殖系构架区(参见例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；及来源于筛选FR集合库的构架区(参见例如Baca等人，J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)及Rosok等人，J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
在一些实施方案中，人源化抗体可以包含人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区。
D.糖基化及聚乙二醇化变体
在某些实施方案中，抗体的糖基化经修改。举例而言，可产生非糖基化抗体(亦即，抗体缺乏糖基化)。可改变糖基化以例如增加抗体对抗原的亲和力。此类碳水化合物修饰可通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。举例而言，可进行一个或多个氨基酸取代，从而消除一个或多个可变区构架糖基化位点，以由此消除该位点的糖基化。此类非糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。此类方法进一步详细描述于Co等人的美国专利第5,714,350号及第6,350,861号中。
可通过使N297残基突变为另一残基(例如N297A)，和/或通过使相邻氨基酸(例如298)突变来阻止N297上恒定区的糖基化，由此降低N297上的糖基化。
另外或替代地，可产生糖基化类型改变的抗体，诸如岩藻糖基残基量降低的低岩藻糖基化抗体或等分GlcNac结构增加的抗体。已证明此类改变的糖基化模式会提高抗体的ADCC能力。此类碳水化合物修饰可通过例如在糖基化机制改变的宿主细胞中表达抗体来实现。糖基化机制改变的细胞已描述于本领域，且可用作表达本文中所描述的重组抗体以由此产生糖基化改变的抗体的宿主细胞。举例而言，Hanai等人的EP 1,176,195描述一种细胞株，其中编码岩藻糖基转移酶的FUT8基因在功能上被破坏，使得此细胞株中所表达的抗体展现低岩藻糖基化。Presta的PCT公开案WO 03/035835描述一种变异CHO细胞株Led 3细胞，其使岩藻糖连接至Asn(297)所连接碳水化合物的能力降低，亦导致该宿主细胞中所表达的抗体发生低岩藻糖基化(亦参见Shields,R.L.等人，2002J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等人的PCT公开案WO 99/54342描述一种细胞株，其经工程改造以表达糖蛋白修饰的糖基转移酶{例如β(1,4)-N-乙酰葡萄糖氨基转移酶III(GnTIII))，使得在经工程改造的细胞株中表达的抗体展现增加的等分GlcNac结构，引起抗体的ADCC活性增加(亦参见Umana等人(1999)Nat.Biotech.17:176-180)。
本文所描述的抗体的另一修饰为聚乙二醇化。抗体可经聚乙二醇化以例如延长抗体的生物(例如血清)半衰期。为使抗体发生聚乙二醇化，通常使抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)(诸如PEG的反应性酯或醛衍生物)在使一个或多个PEG基团连接至抗体或抗体片段的条件下反应。在一些实施方案中，聚乙二醇化为经由与反应性PEG分子(或类似反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行。如本文所用，术语“聚乙二醇”意欲涵盖已用于衍生其他蛋白质的任何PEG形式，诸如单(CI-CIO)烷氧基或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-顺丁烯二酰亚胺。在某些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体为非糖基化抗体。蛋白质聚乙二醇化方法为本领域已知且可应用于本文所描述的抗体。参见例如Nishimura等人的EP 0 154316及Ishikawa等人的EP 0 401 384。
E.恒定区
在一些实施方案中，本文所描述的抗体包含一个或多个人类恒定区。在一些实施方案中，人类重链恒定区属于选自IgA、IgG及IgD的同型。在一些实施方案中，人类轻链恒定区属于选自κ及λ的同型。在一些实施方案中，本文所描述的抗体包含人类IgG恒定区，诸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方案中，本文所描述的抗体包含人类IgG4重链恒定区。在一些此类实施方案中，本文所描述的抗体包含人类IgG4恒定区中的S241P突变。在一些实施方案中，本文所描述的抗体包含人类IgG4恒定区及人类κ轻链。
重链恒定区的选择可决定抗体是否将具有体内效应功能。在一些实施方案中，此类效应功能包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，且可导致杀死抗体所结合的细胞。在一些治疗方法中，包括治疗一些癌症的方法中，例如当抗体结合于支持肿瘤维持或生长的细胞时，可能需要杀死细胞。可支持肿瘤维持或生长的例示性细胞包括(但不限于)肿瘤细胞本身、帮助将血管募集至肿瘤的细胞及提供支持或促进肿瘤生长或肿瘤存活的配体、生长因子或反受体的细胞。在一些实施方案中，当需要效应功能时，选择包含人类IgG1重链或人类IgG3重链的抗体。
在某些实施方案中，改变本文所提供的抗体以增加或减少抗体糖基化的程度。在抗体上添加糖基化位点或使抗体缺失糖基化位点可通过改变氨基酸序列以便产生或移除一个或多个糖基化位点来便利地实现。
在抗体包含Fc区的情况下，可改变连接于其上的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分支链双触角寡糖，其通常通过N键连接至Fc区的CH2域的Asn297。参见例如Wright等人，TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及连接至双触寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可对本发明抗体中的寡糖进行修饰以便形成具有某些改良特性的抗体。举例而言，在一些实施方案中，抗体可例如通过使通常经含有岩藻糖的糖基化或经由其他手段糖基化的诸如Asn297的残基突变来去岩藻糖基化。在一些实施方案中，本文中的抗体可包含去岩藻糖基化人类IgG1恒定区。
抗体进一步具备等分寡糖，例如其中连接至抗体的Fc区的双触寡糖由GlcNAc等分。此类抗体可具有减少的岩藻糖基化和/或改良的ADCC功能。此类抗体的例子描述于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利第6,602,684号(Umana等人)；及US2005/0123546(Umana等人)中。亦提供寡糖中的至少一个半乳糖残基与Fc区连接的抗体。此类抗体可具有改良的CDC功能。此类抗体描述于例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
亦提供具有氨基端前导序列延伸部分的抗体。举例而言，氨基端前导序列的一个或多个氨基酸残基存在于抗体的任何一个或多个重链或轻链的氨基端。例示性氨基端前导序列延伸部分包含三个氨基酸残基VHS或由其组成，该三个氨基酸残基存在于抗体的一个或两个轻链上。
可例如在施用具有变异Fc区的多肽的转殖基因小鼠、人类或非人类灵长类动物中分析人类FcRn高亲和力结合多肽的体内或血清半衰期。亦参见例如Petkova等人International Immunology 18(12):1759-1769(2006)。
在本发明的一些实施方案中，与包含岩藻糖的亲本抗体相比，去岩藻糖基化抗体在人类效应细胞存在下更有效介导ADCC，通常，ADCC活性可使用如本文中公开的体外ADCC分析测定，但涵盖例如在动物模型等中测定ADCC活性的其他分析或方法。
在某些实施方案中，Fc区通过用不同氨基酸残基置换至少一个氨基酸残基来改变，以改变抗体的效应功能。举例而言，一个或多个选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320、322、330和/或331(EU编号)的氨基酸可经不同氨基酸残基置换，以使得抗体对效应子配体的亲和力改变，但保留亲本抗体的抗原结合能力。亲和力改变的效应子配体可为例如Fc受体或补体的C1组分。此方法进一步详细描述于Winter等人的美国专利第5,624,821号及第5,648,260号中。
在一些实施例中，一个或多个选自氨基酸残基329、331及322的氨基酸可经不同氨基酸残基置换，以使得抗体具有改变的C1q结合和/或降低或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。此方法进一步详细描述于Idusogie等人的美国专利第6,194,551号中。
在一些实施例中，改变氨基酸位置231及239内的一个或多个氨基酸残基，由此改变抗体固定补体的能力。此方法进一步描述于例如Bodmer等人的PCT公开案WO 94/29351中。在一些实施例中，Fc区可通过修饰以下位置的一个或多个氨基酸而经修饰以减小抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或减小与Fcγ受体的亲和力：234、235、236、238、239、240、241、243、244、245、247、248、249、252、254、255、256、258、262、263、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、299、301、303、305、307、309、312、313、315、320、322、324、325、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、433、434、435、436、437、438或439(EU编号)。例示性取代包括236A、239D、239E、268D、267E、268E、268F、324T、332D及332E。例示性变体包括239D/332E、236A/332E、236A/239D/332E、268F/324T、267E/268F、267E/324T及267E/268F/324T(EU编号)。可针对Fcs进行的其他Fc修饰为降低或消除与FcγR和/或补体蛋白的结合的那些修饰，由此降低或消除Fc介导的效应功能，诸如ADCC、ADCP及CDC。例示性修饰包括(但不限于)位置234、235、236、237、267、269、325、328、330和/或331(例如330及331)处的取代、插入及缺失，其中编号根据EU索引进行。例示性取代包括(但不限于)234A、235E、236R、237A、267R、269R、325L、328R、330S及331S(例如330S及331S)，其中编号根据EU索引进行。Fc变体可包含236R/328R。用于减少FcγR与补体相互作用的其他修饰包括取代297A、234A、235A、237A、318A、228P、236E、268Q、309L、330S、331S、220S、226S、229S、238S、233P及234V，以及位置297的糖基化通过突变或酶方式移除或通过在不使蛋白质糖基化的生物体(诸如细菌)中产生来移除。这些及其他修饰综述于Strohl,2009,Current Opinion in Biotechnology 20:685-691中。举例而言，人类IgG1.3 Fc恒定区含有L234A、L235E及G237A取代。IgG1fa.P238K(或IgG1.P238K)含有P238K取代。IgG1.1f包含L234A、L235E、G237A、A330S及P331S取代。(所有编号均在EU索引下)。
亦可使用增强对抑制性受体FcγRIIb的亲和力的Fc变体。此类变体可提供具有与FcγRIIb细胞，包括例如B细胞及单核球相关的免疫调节活性的Fc融合蛋白。在一个实施方案中，Fc变体提供相对于一种或多种活化受体，选择性增强的对FcγRIIb的亲和力。用于改变与FcγRIIb的结合的修饰包括在选自由以下组成的群的位置处的一个或多个修饰：根据EU索引的234、235、236、237、239、266、267、268、325、326、327、328、330、331及332。用于增强FcγRllb亲和力的例示性取代包括(但不限于)234A、234D、234E、234F、234W、235D、235E、235F、235R、235Y、236D、236N、237A、237D、237N、239D、239E、266M、267D、267E、268D、268E、327D、327E、328F、328W、328Y、330S、331S及332E。例示性取代包括235Y、236D、239D、266M、267E、268D、268E、328F、328W及328Y。用于增强与FcγRIIb的结合的其他Fc变体包括235Y/267E、236D/267E、239D/268D、239D/267E、267E/268D、267E/268E及267E/328F。(所有编号均在EU索引下)。
用于增强FcγR与补体相互作用的其他修饰包括(但不限于)取代298A、333A、334A、326A、2471、339D、339Q、280H、290S、298D、298V、243L、292P、300L、396L、3051及396L。这些及其他修饰综述于Strohl,2009,Current Opinion in Biotechnology 20:685-691中。增加与Fcγ受体的结合的Fc修饰包括在Fc区的以下氨基酸位置中的任一者或多者处的氨基酸修饰：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、279、280、283、285、298、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、312、315、324、327、329、330、335、337、338、340、360、373、376、379、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439，其中Fc区中的残基的编号为如专利公开案第WO 00/42072号中的EU索引的编号。
任选地Fc区可包含本领域技术人员已知的额外和/或替代位置处的非天然存在的氨基酸残基(参见例如美国专利第5,624,821号、第6,277,375号、第6,737,056号、第6,194,551号、第7,317,091号、第8,101,720号；PCX专利公开案WO 00/42072、WO 01/58957、WO 02/06919、WO 04/016750、WO 04/029207、WO 04/035752、WO 04/074455、WO 04/099249、WO 04/063351、WO 05/070963、WO 05/040217、WO 05/092925及WO 06/020114)。
Fc区对其配体的亲和力及结合特性可通过本领域已知的多种体外分析方法(基于生物化学或免疫的分析)测定，所述方法包括(但不限于)平衡方法(例如酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA))或动力学(例如BIACORE分析)及其他方法，诸如间接结合分析、竞争性抑制分析、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳及色谱(例如凝胶过滤)。这些及其他方法可利用所检验的组分中之一或多者上的标记和/或采用多种检测方法，包括(但不限于)显色、荧光、发光或同位素标记。结合亲和力及动力学的详细描述可见于Paul,W.E.编,Fundamental Immunology,第4版,Lippincott-Raven,Philadelphia(1999)，其聚焦于抗体-免疫原相互作用。
在某些实施方案中，抗体经修饰以延长其生物半衰期。各种方法皆可行。举例而言，此举可通过增加Fc区对FcRn的结合亲和力实现，例如，以下残基中之一或多者可发生突变：252、254、256、433、435、436，如美国专利第6,277,375号中所描述。特定例示性取代包括以下中之一或多者：T252L、T254S和/或T256F。或者，为了延长生物半衰期，抗体可在CH1或CL区内改变以含有获自IgG的Fc区的CH2域的两个环的救助受体结合表位，如Presta等人的美国专利第5,869,046号及第6,121,022号中所描述。增加与FcRn的结合和/或改良药物动力学特性的其他例示性变体包括位置259、308、428及434处的取代，包括例如2591、308F、428L、428M、434S、4341 1.434F、434Y及434X1。增加Fc与FcRn的结合的其他变体包括：250E、250Q、428L、428F、250Q/428L(Hinton等人2004,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216，Hinton等人2006Journal of Immunology 176:346-356)、256A、272A、286A、305A、307A、307Q、31 1A、312A、376A、378Q、380A、382A、434A(Shields等人，Journal of Biological Chemistry,2001,276(9):6591-6604)、252F、252T、252Y、252W、254T、256S、256R、256Q、256E、256D、256T、309P、31 1S、433R、433S、4331、433P、433Q、434H、434F、434Y、252Y/254T/256E、433K/434F/436H、308T/309P/311S(Dall'Acqua等人Journal of Immunology,2002,169:5171-5180，Dal'Acqua等人，2006,Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524)。用于调节FcRn结合的其他修饰描述于Yeung等人，2010,J Immunol,182:7663-7671中。
在某些实施方案中，可使用具有特定生物学特征的杂交IgG同型。举例而言，IgG1/IgG3杂交变体可通过用来自两种同型不同的位置处的IgG3的氨基酸取代CH2和/或CH3区中的IgG1位置来构筑。因此，可构筑包含一个或多个取代，例如274Q、276K、300F、339T、356E、358M、384S、392N、397M、4221、435R及436F的杂交变异IgG抗体。在本文所描述的一些实施方案中，IgG1/IgG2杂交变体可通过用来自两种同型不同的位置处的IgG1的氨基酸取代CH2和/或CH3区中的IgG2位置来构筑。因此，可构筑包含一个或多个取代，例如以下氨基酸取代中之一或多者的杂交变异IgG抗体：233E、234L、235L、+236G(是指在位置236处插入甘氨酸)及327A。
此外，人类IgG1上的针对FcγRI、FcγRII、FcγRIII及FcRn的结合位点已经定位且具有改良的结合的变体已有描述(参见Shields,R.L.等人(2001),J.Biol.Chem.276:6591-6604)。显示位置256、290、298、333、334及339的特异性突变改良与FcγRIII的结合。另外，显示以下组合突变体改良FcγRIII结合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A及S298A/E333A/K334A，已显示其展现增强的FcγRIIIa结合及ADCC活性(Shields等人，2001)。已鉴别强烈增强与FcγRIIIa的结合的其他IgG1变体，包括具有S239D/I332E及S239D/I332E/A330L突变的变体，其显示对FcγRIIIa的亲和力的最大增加、FcγRIIb结合的减小及在食蟹猕猴中的强烈细胞毒性活性(Lazar等人，2006)。将三重突变引入至诸如阿仑单抗(alemtuzumab)(CD52特异性)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(HER2/neu特异性)、利妥昔单抗(rituximab)(CD20特异性)及西妥昔单抗(cetuximab)(EGFR特异性)的抗体中转化成体外ADCC活性大大增强，且S239D/I332E变体显示在猴中耗乏B细胞的能力增强(Lazar等人，2006)。另外，已鉴别在B细胞恶性肿瘤及乳腺癌的模型中在表达人类FcγRIIIa的转殖基因小鼠中的含有L235V、F243L、R292P、Y300L及P396L突变的IgG1突变体，其展现与FcγRIIIa的增强结合及伴随的增强ADCC活性(Stavenhagen等人,2007；Nordstrom等人，2011)。可使用的其他Fc突变体包括：S298A/E333A/L334A、S239D/I332E、S239D/I332E/A330L、L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L及M428L/N434S。
在某些实施方案中，选择与FcγRs的结合减少的Fc。具有减少的FcγR结合的例示性Fc，例如IgG1 Fc包含以下三个氨基酸取代：L234A、L235E及G237A。
在某些实施方案中，选择补体结合减少的Fc。具有减少的补体结合的例示性Fc，例如IgG1 Fc具有以下两个氨基酸取代：A330S及P331S。
在某些实施方案中，选择基本上不具有效应功能的Fc，亦即其与FcγR的结合减少且补体结合减少。无效应的例示性Fc，例如IgG1 Fc包含以下五个突变：L234A、L235E、G237A、A330S及P331S。
当使用IgG4恒定域时，其可包括取代S228P，其模拟IgG1中的铰链序列且由此使IgG4分子稳定。
亦可使用WO 2017/087678或WO2016081746中所描述的Fc修饰。
在某些实施方案中，抗体的糖基化经修改。举例而言，可产生非糖基化抗体(亦即，抗体缺乏糖基化)。可改变糖基化以例如增加抗体对抗原的亲和力。此类碳水化合物修饰可通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。举例而言，可进行一个或多个氨基酸取代，从而消除一个或多个可变区构架糖基化位点，以由此消除彼位点的糖基化。此类非糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。此方法进一步详细描述于Co等人的美国专利第5,714,350号及第6,350,861号中。
可通过使N297残基突变为另一残基(例如N297A)，和/或通过使相邻氨基酸(例如298)突变来阻止N297上恒定区的糖基化，由此降低N297上的糖基化。
另外地或替代地，可产生糖基化类型改变的抗体，诸如岩藻糖基残基量降低的低岩藻糖基化抗体或等分GlcNac结构增加的抗体。已证明此类改变的糖基化模式会提高抗体的ADCC能力。此类碳水化合物修饰可通过例如在糖基化机制改变的宿主细胞中表达抗体来实现。糖基化机制改变的细胞已描述于本领域，且可用作表达本文所描述的重组抗体以由此产生糖基化改变的抗体的宿主细胞。举例而言，Hanai等人的EP 1,176,195描述一种细胞株，其中编码岩藻糖基转移酶的FUT8基因在功能上被破坏，使得此细胞株中所表达的抗体展现低岩藻糖基化。Presta的PCT公开案WO 03/035835描述一种变异CHO细胞株Led 3细胞，其使岩藻糖连接至Asn(297)所连接碳水化合物的能力降低，亦导致该宿主细胞中所表达的抗体发生低岩藻糖基化(亦参见Shields,R.L.等人，2002J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等人的PCT公开案WO 99/54342描述一种细胞株，其经工程改造以表达糖蛋白修饰的糖基转移酶{例如β(1,4)-N-乙酰葡萄糖氨基转移酶III(GnTIII))，使得在经工程改造的细胞株中表达的抗体展现增加的等分GlcNac结构，引起抗体的ADCC活性增加(亦参见Umana等人(1999)Nat.Biotech.17:176-180)。
本文所描述的抗体的另一修饰为聚乙二醇化。抗体可经聚乙二醇化以例如延长抗体的生物(例如血清)半衰期。为使抗体发生聚乙二醇化，通常使抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)(诸如PEG的反应性酯或醛衍生物)在使一个或多个PEG基团连接至抗体或抗体片段的条件下反应。在一些实施方案中，聚乙二醇化经由与反应性PEG分子(或类似反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行。如本文所用，术语“聚乙二醇”意欲涵盖已用于衍生得到其他蛋白质的任一种PEG形式，诸如单(CI-CIO)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-顺丁烯二酰亚胺。在某些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体为非糖基化抗体。蛋白质聚乙二醇化方法为本领域已知且可应用于本文所描述的抗体。参见例如Nishimura等人的EP0 154 316及Ishikawa等人的EP 0 401 384。
IV.特定抗PAD4抗体的例示性特性
在许多实施方案中，特异性结合至PAD4的抗体可单独或以组合形式包含以下特性中的任一者。
在一些情况下，抗体与诸如PAD4的配位体的结合可通过表面等离子共振(SPR)测定。在一些实施方案中，抗体在SPR分析中以小于5nM、小于1nM、小于0.5nM、小于0.1nM、0.01nM至5nM、0.01nM至1nM、0.05nM至1nM、0.1nM至1nM、0.1nM至0.5nM、0.05nM至0.5nM、0.05nM至0.1nM或0.5nM至1nM的KD特异性结合至PAD4。举例而言，此KD可通过SPR分析获得。在一些实施方案中，抗体在SPR分析中为在1至2mM氯化钙的存在下(例如在1mM氯化钙的存在下)以小于5nM、小于1nM、小于0.5nM、小于0.1nM、0.01nM至5nM、0.01nM至1nM、0.05nM至1nM、0.1nM至1nM、0.1nM至0.5nM、0.05nM至0.5nM、0.05nM至0.1nM或0.5nM至1nM的KD特异性结合至PAD4。在一些实施方案中，透过SPR，抗体为在存在1至2mM氯化钙(例如在1mM氯化钙)及不存在钙离子的两种情况下(由于不存在额外的钙盐以及存在EDTA，诸如1mM或2mMEDTA)以如下KD特异性结合至PAD4：小于5nM、小于1nM、小于0.5nM、小于0.1nM、0.01nM至5nM、0.01nM至1nM、0.05nM至1nM、0.1nM至1nM、0.1nM至0.5nM、0.05nM至0.5nM、0.05nM至0.1nM或0.5nM至1nM。因此，在此情况下，抗体在钙离子(诸如氯化钙)存在及不存在的情况下均特异性结合至PAD4。举例而言，参见本文中关于实施例的表2及表3。
在一些实施方案中，抗PAD4抗体不结合至人类蛋白质精氨酸脱亚胺酶2(PAD2)。因此，在诸如透过SPR的结合分析中，检测到与PAD2的结合太弱。在一些情况下，抗体例如如上文刚刚所描述特异性结合至人类PAD4，但不结合至鼠类PAD4(亦即在SPR或类似分析中未检测到与鼠类PAD4的结合)。在一些情况下，抗体例如如上文刚刚所描述特异性结合于人类PAD4，但不结合至猕猴PAD4(亦即在SPR分析中未检测到与猕猴PAD4的结合)，而在其他情况下，抗体在SPR分析中特异性结合至人类及猕猴PAD4。在一些情况下，透过SPR，抗体特异性结合至人类及食蟹猕猴PAD4，但不结合至鼠类PAD4。在其他情况下，通过SPR所测定，抗体特异性结合至人类PAD4，但不结合至猕猴或鼠类PAD4。
在一些实施方案中，抗体在ECM分析中的ECM评分小于50、小于30、小于10、小于5、为1至30、1至20、1至10、1至5、1至3、1、2、3、4或5。(参见例如表5)。如以下实施例5中所描述，ECM评分指示抗体非特异性结合至细胞外基质(ECM)的程度。可使用预涂ECM培养盘(诸如市售96孔盘)进行分析。在将抗体用ECM涂布的盘培育1小时，随后与HRP结合的检测抗体一起培育且与TMB底物反应，然后将450nm处测量的吸亮度值除以未添加抗体的对照孔的吸亮度值之后，即可测定ECM评分。(参见以下实施例5)。
在一些实施方案中，在Agilent 1260Infinity II HPLC系统上，使用移动相A(0.1M磷酸钠，pH 7.0，2M硫酸铵)及移动相B(0.1M磷酸钠溶液，pH 7.0)的线性梯度20min，在1.0ml/min的流动速率下，在25℃柱温度下，本文中的抗体在TSKgel Butyl-NPR柱(4.6mm×3.5cm，2.5μm粒度，Tosoh P/N 14947)上的疏水性相互作用色谱(HIC)保留时间为9至11分钟。(参见以下实施例6)。在一些实施方案中，通过固有荧光所测量，抗体在pH 6.0及pH8.3两者下具有60与70℃之间的熔融温度(Tm)。在一些实施方案中，通过静态光散射所测量，抗体的聚集温度(Tagg)在pH 6.0下在64℃与75℃之间且在pH 8.3下在60℃至70℃之间。(参见实施例7)。
在一些实施方案中，使用免疫原性测试测量，抗体具有相对较低的免疫原性。商业计算机仿真免疫原性风险评估算法对8种人类HLA DRB1等位基因超类型中的肽MHC II类结合进行排名，以覆盖人群中存在的>90％的变异性(De Groot及Martin,Clin Immunol,2009,131(2):第189至201页)。(参见实施例15)。举例而言，药物(阿伦单抗(alemtuzumab))、(利妥昔单抗(rituximab))、(达利珠单抗(daclizumab))、(CDP-571)、(吉妥珠单抗(gemtuzumab))及(贝伐珠单抗(bevacizumab))的计算机仿真免疫原性评分在0％至45％范围内，如下表10中所示，其中(阿伦单抗)、(利妥昔单抗)、(达利珠单抗)及(CDP-571)各自分别在45％至7％范围内。相比之下，在一些实施方案中，本文中的抗体在相同分析中的免疫原性评分在0至5％范围内，诸如0至2％或0至1％。本文中的某些抗体的免疫原性评分为0％。(参见表10)。因此，在某些情况下，以计算机仿真免疫原性分析所测量，抗体的免疫原性低于(阿伦单抗)、(利妥昔单抗)及(达利珠单抗)中之一者、两者或全部三者。
在一些实施方案中，抗体在体外抑制PAD4的酶促活性。举例而言，在一些情况下，抗体以10至200nM、50至200nM、10至100nM、20至100nM或50至100nM的IC50在体外抑制PAD4将肽底物TSTGGRQGSHH(SEQ ID NO:216)中的精氨酸转化为瓜氨酸。(参见实施例4，表4)。举例而言，在一些情况下，抗体在体外抑制PAD4将肽底物中的精氨酸转化为瓜氨酸。举例而言，在一些情况下，任选以剂量依赖性方式以0.1至10nM(诸如0.2至5nM)的IC50进行抑制，其中PAD4浓度为1至8μg/mL。(参见例如以下实施例16)。
在一些实施方案中，在来自人类个体(例如患有疾病(例如本文所公开的疾病，例如炎性或自体免疫疾病，例如类风湿性关节炎)的患者)的内源性抗PAD4抗体(例如内源性抗PAD4抗体的多克隆混合物)存在下，抗体在体外抑制PAD4的酶促活性。内源性抗PAD4抗体可包括或可为例如PAD4抑制抗体和/或PAD4活化抗体。在一些实施方案中，抗体在体外抑制在结合及活化人类PAD4的内源抗体(活化抗体)存在下PAD4的酶促活性。在一些实施方案中，活化抗体为来源于患有类风湿性关节炎的患者的抗体。在一些实施方案中，活化抗体为与人类PAD3及人类PAD4有交叉反应的抗体。
在一些情况下，与同型对照抗体相比，该抗体减少LPS刺激的人类血液单核体中细胞外瓜氨酸化组蛋白H3的量。在一些情况下，与同型对照抗体相比，抗体减少LPS刺激的人类血液单核球中GM-CSF的分泌。在一些情况下，与同型对照抗体相比，抗体减少LPS刺激的人类血液单核球中GM-CSF的基因表达。在一些情况下，抗体具有这些三种特性中的两种。在一些情况下，抗体具有这些特性中的全部三种。在一些实施方案中，LPS刺激的人类血液单核球为自新鲜人类PBMC分离的CD14+CD16-单核球。(参见本文中的例子17)。在一些实施方案中，抗体能够被LPS刺激的人类血液单核球内化。举例而言，抗体可用染料标记以检测单核球内化。在一些情况下，抗体可通过LPS刺激的CD14+人类单核球内化。(参见实施例18)。此类结果表明，本文中的抗PAD4抗体可以在单核球内在细胞内发挥作用，且在一些实施方案中可以在细胞外与细胞内阻断PAD4功能。
在一些实施方案中，抗体抑制PAD4在发炎肺部中起作用。举例而言，此可通过自肺部收集的支气管肺泡灌洗液(BALF)中组蛋白H3或ITIH4的瓜氨酸化的减少证明，如本文实施例20或25中所描述。举例而言，可自患有急性或慢性肺部发炎的小鼠收集BALF且在抗体存在下及在野生型对照存在下分析瓜氨酸化H3或ITIH4蛋白质的量。在一些实施方案中，小鼠为人类PAD4基因敲入小鼠。在一些情况下，与同型对照(IC)抗体相比，在存在抗体的情况下，人类PAD4基因敲入小鼠中瓜氨酸化H3的量减少至少15％、至少30％、至少40％、至少50％或至少60％，和/或瓜氨酸化ITIH4的量减少至少50％、至少70％或至少80％，例如通过下式所计算：其中测量未治疗小鼠、接受IC的小鼠及接受抗PAD4抗体的小鼠的瓜氨酸化H3或ITIH4的量。
在一些实施方案中，抗体抑制PAD4在发炎关节中起作用，例如如实施例21、22和/或26中所描述。此可例如通过患有急性或慢性关节发炎(诸如关节注射LPS诱导的发炎)的小鼠模型中的关节组织中ITIH4和/或PRG4的瓜氨酸化减少来证明。在一些情况下，小鼠可为人类PAD4基因敲入小鼠。在一些情况下，与同型对照抗体相比，在人类PAD4基因敲入小鼠的LPS诱导的急性关节损伤模型中，该抗体减少小鼠髌骨中的细胞外瓜氨酸化PRG4和/或瓜氨酸化ITIH4的量。在一些情况下，使瓜氨酸化ITIH4和/或瓜氨酸化PRG4减少的EC50为2nM或更低、1nM或更低、0.1nM或更低、0.05至2nM或0.1至1nM。
在一些实施方案中，本文中的抗体可减少姥鲛烷(pristane)诱导的细胞外陷阱形成嗜中性粒细胞(NETosis)和/或细胞外陷阱形成单核球(METosis)。(参见实施例23)。METosis为自单核球或巨噬细胞释放由散布着组蛋白及细胞蛋白的细胞DNA组成的细胞外陷阱的过程。此种由METosis或NETosis(嗜中性粒细胞起源)形成的网状物质对于防御微生物很重要，而且亦为自体免疫病理学及无菌发炎的主要驱动因素。例如，可以在用本文的抗体或用同型对照抗体处理后向小鼠(诸如人类PAD4基因敲入小鼠)腹膜内注射姥鲛烷。在一些情况下，在此类姥鲛烷诱导的小鼠模型中，与同型对照抗体相比，本文中的抗体可以减少腹膜液中的嗜中性粒细胞、单核球、M1巨噬细胞和/或M2巨噬细胞中H3的瓜氨酸化。在另外的情况下，抗体亦可以减少小鼠腹膜液中嗜中性粒细胞及单核球/巨噬细胞的可溶性标记物的量，诸如弹性蛋白酶、MPO、MIP-2α、GROα/KC、MCP1、MIP1β、IL6及MIP3α。(参见实施例23)。
在一些实施方案中，在胶原蛋白诱发的关节炎小鼠模型中，本文中的抗体可抑制PAD4依赖性反应。(参见实施例24)。例如，在一些实施方案中，根据以下量表，与同型对照相比，本文中的抗体显著降低关节炎模型中小鼠的关节炎临床评分：(1)正常；(2)轻度，踝部或腕部有清晰红肿，或仅限于个别足趾明显红肿，不论受影响的足趾有多少；(3)踝部或腕部中度红肿；(4)包括足趾在内的整个脚爪严重红肿；(5)肢体发炎最严重，涉及多个关节。例如，在一些情况下，本文中的抗体亦分别减少通过SG+MPO+嗜中性粒细胞及SG+MPO+单核球/巨噬细胞评估的NETosis及METosis，和/或减少单核球/巨噬细胞的可溶性标记物，诸如弹性蛋白酶及MPO，和/或降低嗜中性粒细胞、单核球和/或巨噬细胞中H3蛋白瓜氨酸化的比例。(参见实施例24)。
在一些实施方案中，在存在及不存在疾病相关抗PAD4抗体的两种情况下，该抗体抑制血清中蛋白多糖4(PRG4)、血纤维蛋白原A(FGA)、间α-胰蛋白酶抑制剂重链H4(ITIH4)、α-1-微球蛋白/比库宁前驱体(AMBP)及凝溶胶蛋白(GSN)中之一或多者的瓜氨酸化，例如，如实施例27中所描述。在一些此类情况下，来自RA患者的样本中存在疾病相关抗PAD4抗体不会显著影响抗体的抑制活性，亦即，与来自正常健康个体的样本中的抗体的抑制活性相比。在一些实施方案中，诸如在实施例28中所描述的分析中，当在体外以1至5μg/mL与人体组织样本一起培育时，抗体不会与正常人体组织发生交叉反应，并且不结合至正常人体组织细胞膜。在一些实施方案中，例如(诸如)在实施例29中所描述的分析中，在培育、然后与经过调理的结合大肠杆菌颗粒一起培育后，抗体不会诱导全血中嗜中性粒细胞的吞噬作用。在一些实施方案中，诸如在实施例29中所描述的分析中，抗体在高达400μg/mL的浓度下不会诱导嗜中性粒细胞的呼吸爆发(respiratory burst)。
V.例示性抗PAD4抗体
A.抗体hz13-5 D31E
在一些实施方案中，本发明涉及特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：(i)重链可变区(VH)，其含有包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)及包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR3；及(ii)轻链可变区(VL)，其含有包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)。在一些实施方案中，VH包含有包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HCDR2，且VL包含有包含SSEQ ID NO:8的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:68的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:70的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：与SEQ ID NO:68的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQ ID NO:70的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，VH与SEQ ID NO:68的氨基酸序列至少90％一致且VL与SEQ ID NO:70的氨基酸序列至少90％一致。在一些实施方案中，VH与SEQ ID NO:68的氨基酸序列至少95％一致且VL与SEQ ID NO:70的氨基酸序列至少95％一致。在一些实施方案中，VH与SEQ ID NO:68的氨基酸序列至少97％一致且VL与SEQID NO:70的氨基酸序列至少97％一致。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体的VH包含Kabat位置94处的甘氨酸，该位置对应于SEQ ID NO:10的位置98。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VH；及与SEQ ID NO:70的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:68的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VH及包含SEQID NO:70的氨基酸序列的VL。
在一些情况下，抗体为IgG抗体，诸如人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。在一些实施方案中，抗体包含人类IgG1重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：人类IgG1重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列；及轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列。在一些情况下，抗体包含重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列。在一些情况下，抗体包含轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列。在一些情况下，抗体包含以下两者：重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列；及轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含人类IgG1重链恒定区，其包含SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含轻链恒定区，其包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：人类IgG1重链恒定区，其包含SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列；及轻链恒定区，其包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列。
在一些情况下，抗体包含：包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，然后是SEQ ID NO:178的氨基酸序列的重链(HC)；及包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列，然后是SEQ ID NO:194的氨基酸序列的轻链(LC)。在一些情况下，抗体包含：包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，然后是SEQ ID NO:180的氨基酸序列的重链(HC)；及包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列，然后是SEQ ID NO:194的氨基酸序列的轻链(LC)。在一些情况下，抗体包含：包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列的HC；及包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列的轻链。在一些情况下，该抗体包含：包含SEQ ID NO:198的氨基酸序列的HC；及包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列的轻链。在一些情况下，抗体包含由SEQ ID NO:196的氨基酸序列组成的HC及由SEQ ID NO:200的氨基酸序列组成的轻链。在一些情况下，抗体包含由SEQ ID NO:198的氨基酸序列组成的HC及由SEQ ID NO:200的氨基酸序列组成的轻链。
在一些情况下，抗体结合至包含SEQ ID NO:217及SEQ ID NO:218的PAD4上的表位。
在一些实施方案中，抗体在SPR分析中为例如在存在1至2mM氯化钙(例如在1mM氯化钙)及不存在钙离子的两种情况下(由于不存在额外的钙盐以及存在EDTA，诸如1mM或2mMEDTA)以如下KD特异性结合至PAD4：0.05nM至1nM、0.1nM至1nM、0.1nM至0.5nM、0.05nM至0.5nM、或0.05nM至0.1nM、或0.09nM、0.1nM、或0.2nM。参见表2及表3。在一些实施方案中，透过SPR，抗体特异性结合至人类PAD4，但不结合至猕猴或鼠类PAD4。
在一些实施方案中，使用免疫原性测试测量，抗体的免疫原性评分为0至1％、0至0.5％或0％、0.5％或1％。在一些情况下，抗体评分为0％。(参见表10)。在一些情况下，通过计算机仿真免疫原性分析所测量，抗体的免疫原性小于以下中之一者、两者或全部三者：(阿伦单抗)、(利妥昔单抗)及(达利珠单抗)。
在一些实施方案中，抗体任选以剂量依赖性方式以0.1至10nM(诸如0.2至5nM)的IC50在体外抑制PAD4将肽底物中的精氨酸转化为瓜氨酸，其中PAD4浓度为1至8μg/mL。(参见例如以下实施例16)。
在一些实施方案中，抗体在体外抑制在结合及活化人类PAD4的抗体(活化抗体)存在下PAD4的酶促活性。在一些实施方案中，活化抗体为来源于患有类风湿性关节炎的患者的抗体。在一些实施方案中，活化抗体为与人类PAD3及人类PAD4有交叉反应的抗体。
在一些情况下，与同型对照抗体相比，该抗体减少LPS刺激的人类血液单核体中细胞外瓜氨酸化组蛋白H3的量。在一些实施方案中，LPS刺激的人类血液单核球为自新鲜人类PBMC分离的CD14+CD16-单核球。(参见本文中的例子17)。在一些实施方案中，抗体能够被LPS刺激的人类血液单核球内化，诸如被LPS刺激的CD14+人类单核球内化。(参见实施例18)。
在一些实施方案中，抗体抑制PAD4在发炎肺部中起作用。举例而言，此可通过自肺部收集的支气管肺泡灌洗液(BALF)中组蛋白H3或ITIH4的瓜氨酸化的减少证明，如本文实施例25中所描述。举例而言，可自患有急性或慢性肺部发炎的小鼠收集BALF且在抗体存在下及在野生型对照存在下分析瓜氨酸化H3或ITIH4蛋白质的量。在一些实施方案中，小鼠为人类PAD4基因敲入小鼠。在一些情况下，与同型对照(IC)抗体相比，在存在抗体的情况下，人类PAD4基因敲入小鼠中瓜氨酸化H3的量减少至少15％、至少30％、至少40％、至少50％或至少60％，和/或瓜氨酸化ITIH4的量减少至少50％、至少70％或至少80％，例如通过下式所计算：其中测量未治疗小鼠、接受IC的小鼠及接受抗PAD4抗体的小鼠的瓜氨酸化H3或ITIH4的量。
在一些实施方案中，抗体抑制PAD4在发炎关节中起作用，如实施例26中所描述。此可例如通过患有急性或慢性关节发炎(诸如关节注射LPS诱导的发炎)的小鼠模型中的关节组织中ITIH4和/或PRG4的瓜氨酸化减少来证明。在一些情况下，小鼠可为人类PAD4基因敲入小鼠。在一些情况下，与同型对照抗体相比，在人类PAD4基因敲入小鼠的LPS诱导的急性关节损伤模型中，该抗体减少小鼠髌骨中的细胞外瓜氨酸化PRG4和/或瓜氨酸化ITIH4的量。在一些情况下，使瓜氨酸化ITIH4和/或瓜氨酸化PRG4减少的EC50为2nM或更低、1nM或更低、0.1nM或更低、0.05至2nM或0.1至1nM。
在一些实施方案中，抗体可适用于在个体中或在体外(诸如在生物样本中)抑制蛋白质的瓜氨酸化。举例而言，在一些实施方案中，在存在及不存在疾病相关抗PAD4抗体的两种情况下，该抗体抑制血清中蛋白多糖4(PRG4)、血纤维蛋白原A(FGA)、间α-胰蛋白酶抑制剂重链H4(ITIH4)、α-1-微球蛋白/比库宁前驱体(AMBP)及凝溶胶蛋白(GSN)中之一或多者的瓜氨酸化，例如，如实施例27中所描述。在一些此类情况下，例如，与来自正常健康个体的样本中的抗体的抑制活性相比，来自RA患者的样本中存在疾病相关抗PAD4抗体不会显著影响抗体的抑制活性。在一些实施方案中，诸如在实施例28中所描述的分析中，当在体外以1至5μg/mL与人体组织样本一起培育时，抗体不会与正常人体组织发生交叉反应，并且不结合至正常人体组织细胞膜。在一些实施方案中，例如(诸如)在实施例29中所描述的分析中，在培育、然后与经过调理的结合大肠杆菌颗粒一起培育后，抗体不会诱导全血中嗜中性粒细胞的吞噬作用。在一些实施方案中，诸如在实施例29中所描述的分析中，抗体在高达400μg/mL的浓度下不会诱导嗜中性粒细胞的呼吸爆发。
B.抗体hz13-5
在一些实施方案中，本发明涉及特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含(i)重链可变区(VH)，其含有包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)及包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR3；及(ii)轻链可变区(VL)，其含有包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)。在一些实施方案中，VH包含有包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HCDR2，且VL包含有包含SSEQ ID NO:8的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:30的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：与SEQ ID NO:30的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，VH与SEQ ID NO:30的氨基酸序列至少90％一致且VL与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少90％一致。在一些实施方案中，VH与SEQ ID NO:30的氨基酸序列至少95％一致且VL与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少95％一致。在一些实施方案中，VH与SEQ ID NO:30的氨基酸序列至少97％一致且VL与SEQID NO:32的氨基酸序列至少97％一致。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体的VH包含Kabat位置94处的甘氨酸，该位置对应于SEQ ID NO:10的位置98。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH；及与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:30的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH及包含SEQID NO:32的氨基酸序列的VL。
在一些情况下，抗体为IgG抗体，诸如人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。在一些实施方案中，抗体包含人类IgG1重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：人类IgG1重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列；及轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列。在一些情况下，抗体包含重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列。在一些情况下，抗体包含轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列。在一些情况下，抗体包含以下两者：重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列；及轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含人类IgG1重链恒定区，其包含SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含轻链恒定区，其包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：人类IgG1重链恒定区，其包含SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列；及轻链恒定区，其包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列。
在一些情况下，抗体包含：包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，然后是SEQ ID NO:178的氨基酸序列的重链(HC)；及包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，然后是SEQ ID NO:194的氨基酸序列的轻链(LC)。在一些情况下，抗体包含：包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，然后是SEQ ID NO:180的氨基酸序列的重链(HC)；及包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，然后是SEQ ID NO:194的氨基酸序列的轻链(LC)。
在一些情况下，抗体结合至包含SEQ ID NO:217及SEQ ID NO:218的PAD4上的表位。
在一些实施方案中，抗体在SPR分析中为例如在存在1至2mM氯化钙(例如在1mM氯化钙)及不存在钙离子的两种情况下(由于不存在额外的钙盐以及存在EDTA，诸如1mM或2mMEDTA)以如下KD特异性结合至PAD4：0.05nM至1nM、0.1nM至1nM、0.1nM至0.5nM、0.05nM至0.5nM、或0.05nM至0.1nM、或0.09nM、0.1nM、或0.2nM。参见表2及表3。在一些实施方案中，透过SPR，抗体特异性结合至人类PAD4，但不结合至猕猴或鼠类PAD4。
在一些实施方案中，抗体的ECM评分小于10、小于5、为1至5、1至2或1。(参见例如表5)。
在一些实施方案中，使用免疫原性测试测量，抗体的免疫原性评分为0至1％、0至0.5％、或0％、0.5％或1％。(参见表10)。在一些情况下，通过计算机仿真免疫原性分析所测量，抗体的免疫原性小于以下中之一者、两者或全部三者：(阿伦单抗)、(利妥昔单抗)及(达利珠单抗)。
在一些实施方案中，例如在如以下实施例4中所示的分析中，抗体以25至100nM、或30至60nM、或40至60nM的IC50在体外抑制PAD4将肽底物(TSTGGRQGSHH；SEQ ID NO:216)中的精氨酸转化为瓜氨酸。
在一些实施方案中，抗体在体外抑制在结合及活化人类PAD4的抗体(活化抗体)存在下PAD4的酶促活性。在一些实施方案中，活化抗体为来源于患有类风湿性关节炎的患者的抗体。在一些实施方案中，活化抗体为与人类PAD3及人类PAD4有交叉反应的抗体。
在一些情况下，与同型对照抗体相比，该抗体减少LPS刺激的人类血液单核体中细胞外瓜氨酸化组蛋白H3的量。在一些实施方案中，LPS刺激的人类血液单核球为自新鲜人类PBMC分离的CD14+CD16-单核球。(参见本文中的例子17)。在一些实施方案中，抗体能够被LPS刺激的人类血液单核球内化，诸如被LPS刺激的CD14+人类单核球内化。(参见实施例18)。
在一些实施方案中，抗体抑制PAD4在发炎肺部中起作用。举例而言，此可通过自肺部收集的支气管肺泡灌洗液(BALF)中组蛋白H3或ITIH4的瓜氨酸化的减少证明，如本文实施例25中所描述。举例而言，可自患有急性或慢性肺部发炎的小鼠收集BALF且在抗体存在下及在野生型对照存在下分析瓜氨酸化H3或ITIH4蛋白质的量。在一些实施方案中，小鼠为人类PAD4基因敲入小鼠。在一些情况下，与同型对照(IC)抗体相比，在存在抗体的情况下，人类PAD4基因敲入小鼠中瓜氨酸化H3的量减少至少15％、至少30％、至少40％、至少50％或至少60％，和/或瓜氨酸化ITIH4的量减少至少50％、至少70％或至少80％，例如通过下式所计算：其中测量未治疗小鼠、接受IC的小鼠及接受抗PAD4抗体的小鼠的瓜氨酸化H3或ITIH4的量。
在一些实施方案中，抗体抑制PAD4在发炎关节中起作用，如实施例26中所描述。此可例如通过减少患有急性或慢性关节发炎(诸如关节注射LPS诱导的发炎)的小鼠模型中的关节组织中ITIH4和/或PRG4的瓜氨酸化来证明。在一些情况下，小鼠可为人类PAD4基因敲入小鼠。在一些情况下，与同型对照抗体相比，在人类PAD4基因敲入小鼠的LPS诱导的急性关节损伤模型中，该抗体减少小鼠髌骨中的细胞外瓜氨酸化PRG4和/或瓜氨酸化ITIH4的量。在一些情况下，使瓜氨酸化ITIH4和/或瓜氨酸化PRG4减少的EC50为2nM或更低、1nM或更低、0.1nM或更低、0.05至2nM或0.1至1nM。
C.抗体hz13-12
在一些实施方案中，本发明涉及一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含(i)重链可变区(VH)，其含有包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)及包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR3；及(ii)轻链可变区(VL)，其含有包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)。在一些实施方案中，VH包含有包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HCDR2，且VL包含有包含SSEQ IDNO:8的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:58的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:60的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：与SEQ ID NO:58的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQ ID NO:60的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，VH与SEQ IDNO:58的氨基酸序列至少90％一致且VL与SEQ ID NO:60的氨基酸序列至少90％一致。在一些实施方案中，VH与SEQ ID NO:58的氨基酸序列至少95％一致且VL与SEQ ID NO:60的氨基酸序列至少95％一致。在一些实施方案中，VH与SEQ ID NO:58的氨基酸序列至少97％一致且VL与SEQ ID NO:60的氨基酸序列至少97％一致。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:60的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQID NO:58的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:60的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体的VH包含Kabat位置94处的甘氨酸，该位置对应于SEQ ID NO:10的位置98。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH，及与SEQ ID NO:60的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含有与SEQ ID NO:58的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH，及包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的VL。
在一些情况下，抗体为IgG抗体，诸如人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。在一些实施方案中，抗体包含人类IgG1重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：人类IgG1重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列；及轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列。在一些情况下，抗体包含重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列。在一些情况下，抗体包含轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列。在一些情况下，抗体包含以下两者：重链恒定区，包含其与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列；及轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含人类IgG1重链恒定区，其包含SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含轻链恒定区，其包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：人类IgG1重链恒定区，其包含SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列；及轻链恒定区，其包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列。
在一些情况下，抗体包含：包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列，然后是SEQ ID NO:178的氨基酸序列的重链(HC)；及包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，然后是SEQ ID NO:194的氨基酸序列的轻链(LC)。在一些情况下，抗体包含：包含SEQ ID NO:58氨基酸序列，然后是SEQ ID NO:180的氨基酸序列的重链(HC)；及包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，然后是SEQ ID NO:194的氨基酸序列的轻链(LC)。
在一些情况下，抗体结合至包含SEQ ID NO:217及SEQ ID NO:218的PAD4上的表位。
在一些实施方案中，抗体在SPR分析中为例如在存在1至2mM氯化钙(例如在1mM氯化钙)及不存在钙离子的两种情况下(由于不存在额外的钙盐以及存在EDTA，诸如1mM或2mMEDTA)以如下KD特异性结合至PAD4：0.05nM至1nM、0.1nM至1nM、0.1nM至0.5nM、0.05nM至0.5nM、或0.05nM至0.1nM、或0.09nM、0.1nM、或0.2nM。参见表2及表3。在一些实施方案中，透过SPR，抗体特异性结合至人类PAD4，但不结合至猕猴或鼠类PAD4。
在一些实施方案中，抗体的ECM评分小于10、小于5、为1至5、1至2或1。(参见例如表5)。
在一些实施方案中，使用免疫原性测试测量，抗体的免疫原性评分为0至1％、0至0.5％、或0％、0.5％或1％。在一些情况下，抗体评分为0％。(参见表10)。在一些情况下，通过计算机仿真免疫原性分析所测量，抗体的免疫原性小于以下中之一者、两者或全部三者：(阿伦单抗)、(利妥昔单抗)及(达利珠单抗)。
在一些实施方案中，例如在如以下实施例4中所示的分析中，抗体以25至100nM、或30至60nM、或40至60nM的IC50在体外抑制PAD4将肽底物(TSTGGRQGSHH；SEQ ID NO:216)中的精氨酸转化为瓜氨酸。
在一些实施方案中，抗体在体外抑制在结合及活化人类PAD4的抗体(活化抗体)存在下PAD4的酶促活性。在一些实施方案中，活化抗体为来源于患有类风湿性关节炎的患者的抗体。在一些实施方案中，活化抗体为与人类PAD3及人类PAD4有交叉反应的抗体。
在一些情况下，与同型对照抗体相比，该抗体减少LPS刺激的人类血液单核体中细胞外瓜氨酸化组蛋白H3的量。在一些实施方案中，LPS刺激的人类血液单核球为自新鲜人类PBMC分离的CD14+CD16-单核球。(参见本文中的例子17)。在一些实施方案中，抗体能够被LPS刺激的人类血液单核球内化，诸如被LPS刺激的CD14+人类单核球内化。(参见实施例18)。
在一些实施方案中，抗体抑制PAD4在发炎肺部中起作用。举例而言，此可通过自肺部收集的支气管肺泡灌洗液(BALF)中组蛋白H3或ITIH4的瓜氨酸化的减少证明，如本文实施例25中所描述。举例而言，可自患有急性或慢性肺部发炎的小鼠收集BALF且在抗体存在下及在野生型对照存在下分析瓜氨酸化H3或ITIH4蛋白质的量。在一些实施方案中，小鼠为人类PAD4基因敲入小鼠。在一些情况下，与同型对照(IC)抗体相比，在存在抗体的情况下，人类PAD4基因敲入小鼠中瓜氨酸化H3的量减少至少15％、至少30％、至少40％、至少50％或至少60％，和/或瓜氨酸化ITIH4的量减少至少50％、至少70％或至少80％，例如通过下式所计算：其中测量未治疗小鼠、接受IC的小鼠及接受抗PAD4抗体的小鼠的瓜氨酸化H3或ITIH4的量。
在一些实施方案中，抗体抑制PAD4在发炎关节中起作用，如实施例26中所描述。此可例如通过减少患有急性或慢性关节发炎(诸如关节注射LPS诱导的发炎)的小鼠模型中的关节组织中ITIH4和/或PRG4的瓜氨酸化来证明。在一些情况下，小鼠可为人类PAD4基因敲入小鼠。在一些情况下，与同型对照抗体相比，在人类PAD4基因敲入小鼠的LPS诱导的急性关节损伤模型中，该抗体减少小鼠髌骨中的细胞外瓜氨酸化PRG4和/或瓜氨酸化ITIH4的量。在一些情况下，使瓜氨酸化ITIH4和/或瓜氨酸化PRG4减少的EC50为2nM或更低、1nM或更低、0.1nM或更低、0.05至2nM或0.1至1nM。
D.抗体hz20-2
在一些实施方案中，本发明涉及一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含重链可变区(VH)，其含有包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQID NO:74的氨基酸序列的HCDR3；及轻链可变区(VL)，其含有包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ IDNO:77的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:86的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH。在一些实施方案中，抗体包含与SEQID NO:88的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:86的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH，及与SEQ ID NO:88的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，VH与SEQ ID NO:86的氨基酸序列至少90％一致且VL与SEQ ID NO:88的氨基酸序列至少90％一致。在一些实施方案中，VH与SEQ ID NO:86的氨基酸序列至少95％一致且VL与SEQ ID NO:88的氨基酸序列至少95％一致。在一些实施方案中，VH与SEQID NO:86的氨基酸序列至少97％一致且VL与SEQ ID NO:88的氨基酸序列至少97％一致。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:86的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:86的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的VH，及与SEQ ID NO:88的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:86的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH，及包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VL。
在一些情况下，抗体为IgG抗体，诸如人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。在一些实施方案中，抗体包含人类IgG1重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：人类IgG1重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列；及轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列。在一些情况下，抗体包含重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列。在一些情况下，抗体包含轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列。在一些情况下，抗体包含以下两者：重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列；及轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含人类IgG1重链恒定区，其包含SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含轻链恒定区，其包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：人类IgG1重链恒定区，其包含SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列；及轻链恒定区，其包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列。
在一些情况下，抗体包含：包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列，然后是SEQ ID NO:178的氨基酸序列的重链(HC)；及包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列，然后是SEQ ID NO:194的氨基酸序列的轻链(LC)。在一些情况下，抗体包含：包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列，然后是SEQ ID NO:180的氨基酸序列的重链(HC)；及包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列，然后是SEQ ID NO:194的氨基酸序列的轻链(LC)。
在一些情况下，抗体结合至包含SEQ ID NO:219及SEQ ID NO:220的PAD4上的表位。
在一些实施方案中，抗体在SPR分析中为例如在存在1至2mM氯化钙(例如在1mM氯化钙)及不存在钙离子的两种情况下(由于不存在额外的钙盐以及存在EDTA，诸如1mM或2mMEDTA)以如下KD特异性结合至PAD4：0.05nM至1nM、0.1nM至1nM、0.1nM至0.5nM、0.05nM至0.5nM、或0.05nM至0.1nM、或0.09nM、0.1nM、或0.2nM。参见表2及表3。在一些实施方案中，使用SPR进行测定，抗体特异性结合至人类PAD4，但不结合至鼠类PAD4。在一些实施方案中，使用SPR进行测定，抗体特异性结合至人类PAD4，但不结合至猕猴PAD4。
在一些实施方案中，抗体的ECM评分小于20、小于10、为4至10、4至8或5至7。(参见例如表5)。
在一些实施方案中，使用免疫原性测试测量，抗体的免疫原性评分为0至5％、0至3％、或1至2％。(参见表10)。在一些情况下，通过计算机仿真免疫原性分析所测量，抗体的免疫原性小于以下中之一者、两者或全部三者：(阿伦单抗)、(利妥昔单抗)及(达利珠单抗)。
在一些实施方案中，例如在如以下实施例4中所示的分析中，抗体以50至100nM、或50至80nM、或60至80nM的IC50在体外抑制PAD4将肽底物(TSTGGRQGSHH；SEQ ID NO:216)中的精氨酸转化为瓜氨酸。
在一些实施方案中，抗体在体外抑制在结合及活化人类PAD4的抗体(活化抗体)存在下PAD4的酶促活性。在一些实施方案中，活化抗体为来源于患有类风湿性关节炎的患者的抗体。在一些实施方案中，活化抗体为与人类PAD3及人类PAD4有交叉反应的抗体。
在一些情况下，与同型对照抗体相比，该抗体减少LPS刺激的人类血液单核体中细胞外瓜氨酸化组蛋白H3的量。在一些实施方案中，LPS刺激的人类血液单核球为自新鲜人类PBMC分离的CD14+CD16-单核球。(参见本文中的例子17)。在一些实施方案中，抗体能够被LPS刺激的人类血液单核球内化，诸如被LPS刺激的CD14+人类单核球内化。(参见实施例18)。
在一些实施方案中，抗体抑制PAD4在发炎肺部中起作用。举例而言，此可通过自肺部收集的支气管肺泡灌洗液(BALF)中组蛋白H3或ITIH4的瓜氨酸化的减少证明，如本文实施例25中所描述。举例而言，可自患有急性或慢性肺部发炎的小鼠收集BALF且在抗体存在下及在野生型对照存在下分析瓜氨酸化H3或ITIH4蛋白质的量。在一些实施方案中，小鼠为人类PAD4基因敲入小鼠。在一些情况下，与同型对照(IC)抗体相比，在存在抗体的情况下，人类PAD4基因敲入小鼠中瓜氨酸化H3的量减少至少10％或至少15％，和/或瓜氨酸化ITIH4的量减少至少50％、至少70％或至少80％，例如通过下式所计算： 其中测量未治疗小鼠、接受IC的小鼠及接受抗PAD4抗体的小鼠的瓜氨酸化H3或ITIH4的量。
在一些实施方案中，抗体抑制PAD4在发炎关节中起作用，如实施例26中所描述。此可例如通过减少患有急性或慢性关节发炎(诸如关节注射LPS诱导的发炎)的小鼠模型中的关节组织中ITIH4和/或PRG4的瓜氨酸化来证明。在一些情况下，小鼠可为人类PAD4基因敲入小鼠。在一些情况下，与同型对照抗体相比，在人类PAD4基因敲入小鼠的LPS诱导的急性关节损伤模型中，该抗体减少小鼠髌骨中的细胞外瓜氨酸化PRG4和/或瓜氨酸化ITIH4的量。在一些情况下，使瓜氨酸化ITIH4和/或瓜氨酸化PRG4减少的EC50为2nM或更低、1nM或更低、或0.5至1.5nM。
E.抗体hz20-7
在一些实施方案中，本发明涉及一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含重链可变区(VH)，其含有包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQID NO:74的氨基酸序列的HCDR3；及轻链可变区(VL)，其含有包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ IDNO:77的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:106的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH。在一些实施方案中，抗体包含与SEQID NO:108的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:106的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH，及与SEQ ID NO:108的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，VH与SEQ ID NO:106的氨基酸序列至少90％一致且VL与SEQ ID NO:108的氨基酸序列至少90％一致。在一些实施方案中，VH与SEQ ID NO:106的氨基酸序列至少95％一致且VL与SEQ ID NO:108的氨基酸序列至少95％一致。在一些实施方案中，VH与SEQ ID NO:106的氨基酸序列至少97％一致且VL与SEQ ID NO:108的氨基酸序列至少97％一致。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:106的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ IDNO:108的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:106的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:108的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的VH及与SEQ ID NO:108的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:106的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH及包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的VL。
在一些情况下，抗体为IgG抗体，诸如人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。在一些实施方案中，抗体包含人类IgG1重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：人类IgG1重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列；及轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列。在一些情况下，抗体包含重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列。在一些情况下，抗体包含轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列。在一些情况下，抗体包含以下两者：重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列；及轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含人类IgG1重链恒定区，其包含SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含轻链恒定区，其包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：人类IgG1重链恒定区，其包含SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列；及轻链恒定区，其包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列。
在一些情况下，抗体包含：包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列，然后是SEQ ID NO:178的氨基酸序列的重链(HC)；及包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列，然后是SEQ ID NO:194的氨基酸序列的轻链(LC)。在一些情况下，抗体包含：包含SEQ ID NO:106氨基酸序列，然后是SEQ ID NO:180的氨基酸序列的重链(HC)；及包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列，然后是SEQ ID NO:194的氨基酸序列的轻链(LC)。
在一些情况下，抗体结合至包含SEQ ID NO:219及SEQ ID NO:220的PAD4上的表位。
在一些实施方案中，抗体在SPR分析中为例如在存在1至2mM氯化钙(例如在1mM氯化钙)及不存在钙离子的两种情况下(由于不存在额外的钙盐以及存在EDTA，诸如1mM或2mMEDTA)以如下KD特异性结合至PAD4：0.1nM至1nM、或0.3nM至1nM。参见表2及表3。在一些实施方案中，使用SPR进行测定，抗体特异性结合至人类PAD4，但不结合至鼠类PAD4。在一些实施方案中，使用SPR进行测定，抗体特异性结合至人类PAD4，但不结合至猕猴PAD4。
在一些实施方案中，抗体的ECM评分小于20、小于10、为2至10、4至8或4至7。(参见例如表5)。
在一些实施方案中，使用免疫原性测试测量，抗体的免疫原性评分为0至5％、0至3％、或0至2％。在一些情况下，抗体评分为0.5至1％。(参见表10)。在一些情况下，通过计算机仿真免疫原性分析所测量，抗体的免疫原性小于以下中之一者、两者或全部三者：(阿伦单抗)、(利妥昔单抗)及(达利珠单抗)。
在一些实施方案中，例如在如以下实施例4中所示的分析中，抗体以50至100nM、或50至80nM、或60至80nM的IC50在体外抑制PAD4将肽底物(TSTGGRQGSHH；SEQ ID NO:216)中的精氨酸转化为瓜氨酸。
在一些实施方案中，抗体在体外抑制在结合及活化人类PAD4的抗体(活化抗体)存在下PAD4的酶促活性。在一些实施方案中，活化抗体为来源于患有类风湿性关节炎的患者的抗体。在一些实施方案中，活化抗体为与人类PAD3及人类PAD4有交叉反应的抗体。
在一些情况下，与同型对照抗体相比，该抗体减少LPS刺激的人类血液单核体中细胞外瓜氨酸化组蛋白H3的量。在一些实施方案中，LPS刺激的人类血液单核球为自新鲜人类PBMC分离的CD14+CD16-单核球。(参见本文中的例子17)。在一些实施方案中，抗体能够被LPS刺激的人类血液单核球内化，诸如被LPS刺激的CD14+人类单核球内化。(参见实施例18)。
在一些实施方案中，抗体抑制PAD4在发炎肺部中起作用。举例而言，此可通过自肺部收集的支气管肺泡灌洗液(BALF)中组蛋白H3或ITIH4的瓜氨酸化的减少证明，如本文实施例25中所描述。举例而言，可自患有急性或慢性肺部发炎的小鼠收集BALF且在抗体存在下及在野生型对照存在下分析瓜氨酸化H3或ITIH4蛋白质的量。在一些实施方案中，小鼠为人类PAD4基因敲入小鼠。在一些情况下，与同型对照(IC)抗体相比，在存在抗体的情况下，人类PAD4基因敲入小鼠中瓜氨酸化H3的量减少至少10％或至少15％，和/或瓜氨酸化ITIH4的量减少至少50％、至少70％或至少80％，例如通过下式所计算： 其中测量未治疗小鼠、接受IC的小鼠及接受抗PAD4抗体的小鼠的瓜氨酸化H3或ITIH4的量。
F.pH依赖性抗体hz13-5 VH_D31H:Vk_I30H
在一些实施方案中，本发明涉及一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含重链可变区(VH)，其包含：包含SEQ ID NO:168的位置26至35的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:168的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:168的位置99至108的氨基酸序列的HCDR3；及轻链可变区(VL)，其包含：包含SEQ ID NO:172的残基24至38的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:172的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:172的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:168的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：与SEQ ID NO:168的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：与SEQ ID NO:168的氨基酸序列至少90％一致的VH；及与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：与SEQ ID NO:168的氨基酸序列至少95％一致的VH；及与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少95％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：与SEQ ID NO:168的氨基酸序列至少97％一致的VH；及与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少97％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:168的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ IDNO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:168的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体的VH包含Kabat位置94(SEQ ID NO:10的位置98)处的甘氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列的VH，及与SEQ ID NO:172的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:168的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH，及包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL。
在一些情况下，抗体包含：包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列，然后是SEQ ID NO:178的氨基酸序列的重链(HC)；及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列，然后是SEQ ID NO:194的氨基酸序列的轻链(LC)。在一些情况下，抗体包含：包含SEQ ID NO:168氨基酸序列，然后是SEQ ID NO:180的氨基酸序列的重链(HC)；及包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列，然后是SEQ ID NO:194的氨基酸序列的轻链(LC)。
在一些情况下，抗体为IgG抗体，诸如人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。在一些实施方案中，抗体包含人类IgG1重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：人类IgG1重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列；及轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列。在一些情况下，抗体包含重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列。在一些情况下，抗体包含轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列。在一些情况下，该抗体包含以下两者：重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列；及轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含人类IgG1重链恒定区，其包含SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含轻链恒定区，其包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：人类IgG1重链恒定区，其包含SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列；及轻链恒定区，其包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列。
在抗体hz13-5 VH_D31H:Vk_I30H的情况下，观测到与人类PAD4的pH依赖性结合。此突变体在pH 7.6下的结合活性与(未突变)hz13-5同人类PAD4的结合相当(参见图13M)。尽管亲本hz13-5保持在pH 6.0下结合，但突变hz13-5 VH_D31H::Vk_I30HpH 6.0下展现出与人类PAD4的结合损失。参见图13N。
G.鼠类替代抗体mumAb
在一些实施方案中，本发明涉及一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含重链可变区(VH)，其包含：包含SEQ ID NO:208的位置31至35的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:208的位置50至66的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:208的位置99至107的氨基酸序列的HCDR3；及轻链可变区(VL)，其包含：包含SEQ ID NO:210的残基24至38的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:210的残基54至60的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:210的残基93至101的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:208的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:210的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：与SEQ ID NO:208的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及与SEQ ID NO:210的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：与SEQ ID NO:208的氨基酸序列至少90％一致的VH；及与SEQ ID NO:210的氨基酸序列至少90％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：与SEQ ID NO:208的氨基酸序列至少95％一致的VH；及与SEQ ID NO:210的氨基酸序列至少95％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：与SEQ ID NO:208的氨基酸序列至少97％一致的VH；及与SEQ ID NO:210的氨基酸序列至少97％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:208的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ IDNO:210的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含以下两者：包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:208的氨基酸序列的VH；及包含经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的SEQ ID NO:210的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:208的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:208的氨基酸序列的VH；及与SEQ ID NO:210的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VL。在一些实施方案中，抗体包含有包含SEQ ID NO:210的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：与SEQ ID NO:208的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的VH；及包含SEQ ID NO:210的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO:208的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:210的氨基酸序列的VL。
在一些情况下，抗体包含：包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的重链(HC)及包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列的轻链(LC)。
本发明亦涵盖例如一种或多种编码如上文所描述的抗鼠类PAD4抗体的核酸分子、包含一种或多种编码抗鼠类PAD4抗体的核酸分子的载体，及表达抗鼠类PAD4抗体的宿主细胞或动物模型(亦即，包含编码抗鼠类PAD4抗体的核酸或载体的宿主细胞或动物模型)。此类核酸分子、载体或宿主细胞可如本文以下部分中所描述。例示性载体包括DNA载体、RNA载体(例如mRNA及环状RNA、自扩增RNA载体等)、噬菌体载体、病毒载体(例如痘病毒载体、痘疮病毒载体、腺病毒载体、经修饰痘疮病毒安卡拉(MVA)载体等)、反转录病毒载体等。例示性动物模型包括例如鼠类模型，其中向小鼠施用如上文所描述的抗鼠类PAD4抗体、或一种或多种编码此类抗鼠类PAD4抗体的核酸分子、载体或宿主细胞。
观测到鼠类替代抗体mumAb具有若干种与本文所描述的其他抗体(诸如人源化克隆13或克隆20衍生物)的体外及体内特性类似的体外及体内特性。举例而言，在一些情况下，抗体抑制PAD4在发炎肺部中起作用。举例而言，此可通过自肺部收集的支气管肺泡灌洗液(BALF)中组蛋白H3或ITIH4的瓜氨酸化的减少证明，如本文实施例20中所描述。举例而言，可以自具有正常鼠类PAD4的具有急性或慢性肺部发炎的小鼠收集BALF且在抗体存在下及在野生型对照存在下分析瓜氨酸化H3或ITIH4蛋白质的量。在一些情况下，与同型对照(IC)抗体相比，在存在抗体的情况下，小鼠中瓜氨酸化H3的量减少至少15％、至少30％、至少40％、至少50％或至少60％，和/或瓜氨酸化ITIH4的量减少至少50％、至少70％或至少80％，例如通过下式所计算： 其中测量未处理小鼠、接受IC的小鼠及接受抗PAD4抗体的小鼠的瓜氨酸化H3或ITIH4的量。
在一些实施方案中，抗体抑制PAD4在发炎关节中起作用，例如如实施例21及22中所例示及描述。此可例如通过减少具有正常鼠类PAD4的患有急性或慢性关节发炎(诸如关节注射LPS诱导的发炎)的小鼠模型中的关节组织中ITIH4和/或PRG4的瓜氨酸化来证明。在一些情况下，与同型对照抗体相比，在人类PAD4基因敲入小鼠的LPS诱导的急性关节损伤模型中，该抗体减少小鼠髌骨中的细胞外瓜氨酸化PRG4和/或瓜氨酸化ITIH4的量。
在一些实施方案中，本文中的抗体可减少姥鲛烷诱导的细胞外陷阱形成嗜中性粒细胞(NETosis)和/或细胞外陷阱形成单核球(METosis)。(参见实施例23)。例如，在用本文中的抗体或用同型对照抗体处理后，可以经腹膜内向小鼠注射姥鲛烷。在一些情况下，在此类姥鲛烷诱导的小鼠模型中，与同型对照抗体相比，该抗体减少腹膜液中的嗜中性粒细胞、单核球、M1巨噬细胞和/或M2巨噬细胞中H3的瓜氨酸化。在另外的情况下，抗体减少小鼠腹膜液中嗜中性粒细胞及单核球/巨噬细胞的可溶性标记物的量，诸如弹性蛋白酶、MPO、MIP-2α、GROα/KC、MCP1、MIP1β、IL6及MIP3α。(参见实施例23)。
在一些实施方案中，在胶原蛋白诱发的关节炎小鼠模型中，该抗体抑制PAD4依赖性反应。(参见实施例24)。例如，在一些实施方案中，根据以下量表，与同型对照相比，本文中的抗体显著降低关节炎模型中小鼠的关节炎临床评分：(1)正常；(2)轻度，踝部或腕部有清晰红肿，或仅限于个别足趾明显红肿，不论受影响的足趾有多少；(3)踝部或腕部中度红肿；(4)包括足趾在内的整个脚爪严重红肿；(5)肢体发炎最严重，涉及多个关节。例如，在一些情况下，该抗体亦分别减少通过SG+MPO+嗜中性粒细胞及SG+MPO+单核球/巨噬细胞评估的NETosis及METosis，和/或减少单核球/巨噬细胞的可溶性标记物，诸如弹性蛋白酶及MPO，和/或降低嗜中性粒细胞、单核球和/或巨噬细胞中H3蛋白瓜氨酸化的比例。(参见实施例24)。
VI.编码抗PAD4抗体的核酸分子
提供核酸分子，其包含编码抗PAD4抗体的一个或多个链的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸分子包含编码抗PAD4抗体的重链或轻链的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸分子包含编码抗PAD4抗体的重链的多核苷酸及编码抗PAD4抗体的轻链的多核苷酸两者。在一些实施方案中，第一核酸分子包含编码重链的第一多核苷酸且第二核酸分子包含编码轻链的第二多核苷酸。
编码重链及轻链多肽(诸如本文中抗体的VH、VL、HC或LC)的多核苷酸的适当实施例提供于以下序列表中，或包括与所提供的序列简并的那些序列的变体，亦即，与所提供的序列相比，含有一个或多个密码子交换。举例而言，鉴于遗传密码为冗余的，因为在许多情况下，多于一个密码子可以编码单一氨基酸残基，在某些情况下，诸如由于用于表达抗体的特定宿主细胞的密码子偏好，一个密码子可以交换为编码相同氨基酸残基的另一个密码子。
在一些此类实施方案中，重链及轻链由一个核酸分子表达，或由两个独立核酸分子以两个独立多肽形式表达。在一些实施方案中，诸如当抗体为scFv时，单一多核苷酸编码包含连接在一起的重链及轻链的单一多肽。
在一些实施方案中，编码抗PAD4抗体的重链或轻链的多核苷酸包含编码前导序列的核苷酸序列，该前导序列在翻译时位于重链或轻链的N端。前导序列可为天然重链或轻链前导序列，或可为另一异源前导序列。
核酸分子可使用本领域常规的重组DNA技术构筑。在一些实施方案中，核酸分子为适于在所选宿主细胞中表达的表达载体。
VII.抗PAD4抗体表达及产生
A.载体
提供包含编码抗PAD4重链和/或反PAD4轻链的多核苷酸的载体。亦提供包含编码抗PAD4重链和/或抗PAD4轻链的多核苷酸的载体。此类载体包括(但不限于)DNA载体、RNA载体(例如mRNA及环状RNA、自扩增RNA载体等)、噬菌体载体、病毒载体(例如痘病毒载体、痘疮病毒载体、腺病毒载体、经修饰痘疮病毒安卡拉(MVA)载体等)、反转录病毒载体等。在一些实施方案中，载体包含编码重链的第一多核苷酸序列及编码轻链的第二多核苷酸序列。在一些实施方案中，重链及轻链为以两个独立多肽形式自载体表达。在一些实施方案中，重链及轻链为作为单一多肽的一部分表达，诸如当抗体为scFv时。
在一些实施方案中，第一载体包含编码重链的多核苷酸且第二载体包含编码轻链的多核苷酸。在一些实施方案中，第一载体及第二载体以类似量(诸如类似摩尔量或类似质量)转染至宿主细胞中。在一些实施方案中，将5:1与1:5之间的摩尔比或质量比的第一载体及第二载体转染至宿主细胞中。在一些实施方案中，使用1:1与1:5之间的质量比的编码重链的载体及编码轻链的载体。在一些具体例中，使用1:2的质量比的编码重链的载体及编码轻链的载体。
在一些实施方案中，选择为了在CHO或CHO衍生的细胞或NSO细胞中表达多肽而优化的载体。例示性的此类载体描述于例如Running Deer等人，Biotechnol.Prog.20:880-889(2004)中。
在一些实施方案中，选择用于在动物(包括人类)中体内表达抗PAD4重链和/或抗PAD4轻链的载体。在一些此类实施方案中，在以组织特异性方式起作用的启动子控制下表达多肽。举例而言，肝脏特异性启动子描述于例如PCT公开案第WO 2006/076288号中。
B.宿主细胞
在各种实施方案中，抗PAD4重链和/或抗PAD4轻链可表达于原核细胞中，诸如细菌细胞；或表达于真核细胞中，诸如真菌细胞(诸如酵母)、植物细胞、昆虫细胞及哺乳动物细胞。此类表达可例如根据本领域已知的程序来进行。可用于表达多肽的例示性真核细胞包括(但不限于)COS细胞，包括COS 7细胞；293细胞，包括293-6E细胞；CHO细胞，包括CHO-S及DG44细胞；细胞(Crucell)；及NSO细胞。在一些实施方案中，抗PAD4重链和/或抗PAD4轻链可表达于酵母中。参见例如美国公开案第US2006/0270045 A1号。在一些实施方案中，特定真核宿主细胞系根据其对抗PAD4重链和/或抗PAD4轻链进行所需翻译后修饰的能力加以选择。举例而言，在一些实施方案中，CHO细胞产生多肽，所述多肽的唾液酸化含量高于在293细胞中所产生的相同多肽。
向所需宿主细胞中引入一种或多种核酸可通过任何方法实现，包括但不限于磷酸钙转染、DEAE-聚葡萄糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染等。非限制性例示性方法描述于例如Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)中。核酸可根据任何适合方法短暂或稳定转染于所需宿主细胞中。
在一些实施方案中，可根据任何适合方法在已使用一种或多种编码多肽的核酸分子工程改造的动物中体内产生一种或多种多肽。
C.抗PAD4抗体的纯化
抗PAD4抗体可通过任何适合方法纯化。此类方法包括(但不限于)使用亲和力基质或疏水性相互作用色谱法或尺寸排阻色谱法。(关于人源化抗体的纯化的描述，参见例如实施例2)。
D.抗PAD4抗体的游离产生
在一些实施方案中，在游离系统中产生抗PAD4抗体。非限制性例示性游离系统描述于例如Sitaraman等人，Methods Mol.Biol.498:229-44(2009)；Spirin,TrendsBiotechnol.22:538-45(2004)；Endo等人，Biotechnol.Adv.21:695-713(2003)中。
VIII.治疗组合物及方法
A.使用抗PAD4抗体治疗疾病的方法
提供本发明抗体及包含本发明抗体的组合物以供用于治疗个体(例如人类或其他动物)的疾病或病症的方法中。亦提供治疗疾病的方法，其包含施用抗PAD4抗体。术语“疾病”及“病症”在本文中在待治疗的适应症的上下文中可互换使用。
在一些实施方案中，病症为癌症或自体免疫病症或传染病。在一些实施方案中，病症为与NETosis、METosis、抗瓜氨酸化蛋白质抗体(ACPA)的存在、PAD4表达增加或PAD4活性增加(诸如多肽(诸如组蛋白H3)的瓜氨酸化增加)相关的病症。
举例而言，经PAD4进行瓜氨酸为化一种压力反应，并且可以作用于去除压力细胞的信号。(Brentville等人，Oncoimmunology 8:e1576490(2019))。经PAD4瓜氨酸化的蛋白质成为抗原底物，并且为细胞(亦即T细胞)及体液(亦即B细胞衍生的抗体)适应性免疫反应的标靶。(参见例如Curran等人Nat.Rev.Rheumatol.16:301-15(2020)；Brentville等人)。因此，PAD4活性可导致抗瓜氨酸化蛋白质抗体(ACPA)生成。在嗜中性粒细胞中，PAD4亦在称为NETosis的过程中发挥作用，透过该过程，嗜中性粒细胞挤出含有DNA支架、瓜氨酸化组蛋白及抗菌嗜中性粒细胞性颗粒的解浓缩染色质结构复合物。(Li等人J.Exp.Med.207:1853-62(2010))。这些挤出的复合物被称为嗜中性粒细胞细胞外陷阱(NET)，且在NETosis期间，这些NET会捕捉且杀死入侵的微生物，作为先天性免疫反应的一部分。(Chamardani等人，Mol.Cell.Biochem.477:673-88(2022))。涉及单核球的类似过程被称为METosis且涉及单核球细胞外陷阱(MET)的形成。
某些疾病及病症与NETosis、METosis、抗瓜氨酸化蛋白质抗体(ACPA)的存在、PAD4表达增加或PAD4活性增加(诸如多肽(诸如组蛋白H3)的瓜氨酸化增加)相关。本文中的公开内容亦涵盖本文中的抗体用于治疗此类疾病及病症的用途。本文中的公开内容亦涵盖本文中的抗体用于抑制个体的NETosis或METosis的用途。本文的公开内容进一步涵盖本文中的抗体用于抑制个体中的瓜氨酸化的用途。抑制瓜氨酸化可包含在血清、全血、血浆、血液上清液或滑液中或其他体液或组织中发现的一种或多种蛋白质处的瓜氨酸。实施例包括例如蛋白多糖4(PRG4)、血纤维蛋白原A(FGA)、间α-胰蛋白酶抑制剂重链H4(ITIH4)、α-1-微球蛋白/比库宁前驱体(AMBP)及凝溶胶蛋白(GSN)中之一或多者。在一些情况下，抗PAD4抗体可用于抑制患有例如自体免疫疾病或本文所公开的另一病状的个体中的METosis或METosis。在一些情况下，抗PAD4抗体可用于抑制患有例如自体免疫疾病或本文所公开的另一病状的个体中的瓜氨酸化。
在一些情况下，本文中的抗体可用于“预防病症发作或复发”，诸如自体免疫病症，或与NETosis或METosis、抗瓜氨酸蛋白质抗体(ACPA)的存在、PAD4表达增加或PAD4活性增加(诸如多肽(诸如组蛋白H3)瓜氨酸化增加)相关的病症。如本文所使用，“预防发作或复发”意指例如由于用其他疗法进行治疗而抑制个体中与病症相关的至少一种症状的发作或复发(例如，抑制RA个体中关节发炎的发作，或抑制RA个体中关节发炎的复发)，该个体诸如为确定易患症状的个体或处于缓解中或其先前症状已减轻的个体。如本文所使用，“预防发作或复发”亦涵盖抑制诸如在其症状已减轻至低水平的个体中该病症的至少一种症状的增加(例如，RA个体中关节发炎的明显增加)。因此，在此类情况下，可以将本文中的抗体提供给目前未表达出病症症状的个体，以停止或减缓症状的发作，或者可以将抗体提供给处于缓解期的个体，以停止或减缓该病症的新症状的发作或相关病症的发作。例如，个体可具有病症的亚临床迹象，诸如ACPA的存在、类风湿因子(RF)的存在、或PAD4表达增加、或多肽瓜氨酸化增加中之一或多者，例如在生物样本(诸如全血、血浆、血清、血液上清液或滑液)中所检测到的，但个体可能尚未显示出病症的症状。
在一些实施方案中，病症为自体免疫病症。举例而言，多种数据表明，PAD4在诸如类风湿性关节炎(RA)、狼疮(包括全身性红斑性狼疮症(SLE)、狼疮性肾炎、血管炎(包括抗嗜中性粒细胞性细胞质抗体(ANCA)相关血管炎、炎性肠病(IBD)(包括溃疡性结肠炎及克罗恩氏病)、血栓(例如静脉血栓)、抗磷脂抗体综合征及囊肿性纤维化的自体免疫疾病中发挥作用。(参见例如Curran等人；Yadav等人，J.Cyst.Fibros.18:636-45(2018)；Wang等人，Front.Immunol.13:895216(2022)；Fresneda Alarcon等人Frong.Immunol.12:649693(2021)；Weeding等人，Clin.Immunol.196:110-116(2018)；Xu等人，ChineseJ.Microbiology and Immunology 12:115-121(2020)；Yoshida等人，Clin.Kidney J.6:308-12(2013)；O'Sullivan等人，Rheumatology,58(Suppl.2):kez061.024(2019)；Pan等人，Authorea Preprints,2021,DOI:10.22541/au.161590650.07168461/v1)。
在一些实施方案中，自体免疫病症包含或为类风湿性关节炎(RA)。在一些实施方案中，病症为RA，或待治疗的个体已诊断患有RA。在一些实施方案中，个体被认是有发展RA的风险。在一些实施方案中，RA为幼发型RA、幼年型特发性关节炎(JIA)或幼年型类风湿性关节炎(JRA)。在一些实施方案中，个体患有类风湿滑膜炎或继发于RA的显著全身性涉及(包括但不限于血管炎、肺纤维化或费尔蒂氏综合征(Felty's syndrome))。在一些实施方案中，个体的抗瓜氨酸化蛋白质抗体(ACPA)呈阳性。在一些实施方案中，个体的抗PAD4自体抗体呈阳性。典型地，此类抗PAD4自体抗体活化PAD4。
类风湿性关节炎(RA)为一种严重的自体免疫疾病，其病理学通常包括存在自体抗体，包括抗瓜氨酸化蛋白质抗体(ACPA)。PAD4为一种翻译后修饰酶，其可将蛋白质瓜氨酸化成为新自体抗原。这些新自体抗原在被呈现时会导致ACPA的产生，并被ACPA识别以形成免疫复合物，由此导致疾病的发生及进展。PAD4以ACPA非依赖性方式在RA发病机制中的作用例如为综述于Curran AM、Naik P、Giles JT、Darrah E.Nat Rev Rheumatol.2020年6月；16(6):301-315中。PAD4在RA中的重要性已得到多条证据的进一步支持。举例而言，PADI基因被鉴别为RA的风险基因座，如Curran AM、Naik P、Giles JT、Darrah E.Nat RevRheumatol.2020年6月；16(6):301-315中所综述。例如，编码PAD4的PADI4基因中的单核苷酸多型性已被鉴别出有促于RA的易感性单倍型。(Susuki等人，Nat.Genet.34:395-402(2003))。PADI4启动子区域的表观遗传变化亦被发现与RA疾病活动度以及RA个体的ACPA含量相关。(Kolarz等人，J.Clin.Med.9:2049(2020)；Reyes-Castillo等人，Clin.Exp.Immunol.182:119-31(2015))。在机制层面上，PAD4瓜氨酸化已知为ACPA标靶的各种蛋白质，所述抗体经由抗CCP测试用作个体的RA分类及诊断的一部分。除ACPA以外，抗PAD4抗体亦存在于一部分RA患者中，并且与肿胀关节计数增加及RA疾病严重程度显著相关。在RA个体中发现的这些抗PAD4抗体中有活化RA个体中的PAD4的抗体。(Halvorsen等人，Ann.Rheum.Dis.68:249-52(2009)；Zhao等人，J.Rheumatol.35:969-74(2008)；Darrah等人，Sci.Transl.Med.5:186ra65(2013))。正如Curran等人回顾，在高达45％的RA患者体内检测到抗PAD4自身抗体，并显示其与疾病活动度相关。在临床前已显示PAD4缺陷可以改善实验性发炎关节炎小鼠模型(Weri Y.等人，Sci Rep.2015Aug 21；5:13041.；Suzuki A等人，BMC Musculoskelet Disord.2016年5月5日；17:205；Fukui S.等人，ArthritisRheumatol.2022年2月15日.doi:10.1002/art.42093)。本文实施例中的数据进一步显示本文所提供的抗体在鼠类模型中的活性及功效，所述小鼠模型包括但不限于胶原蛋白诱导的关节炎、急性关节发炎及慢性关节发炎模型。在一些实施方案中，不仅可以使用本文中的抗体治疗RA个体，而且可以使用抗体治疗有发展RA的风险的个体。例如，在一些实施方案中，有发展RA风险的个体具有患有RA的一等亲(亦即，父母或兄弟姐妹)，和/或血清中存在抗瓜氨酸化蛋白质抗体(ACPA)，和/或血清中存在类风湿因子(RF)。例如，可在一些情况下使用抗CCP测试(诸如ELISA测试)测定抗瓜氨酸化蛋白质抗体的存在。例如，在340名不符合RA分类标准但仍进行抗CCP测试(诸如由于关节疼痛或肺病)的个体中，有46％的个体发现抗CCP抗体测试呈阳性(亦即存在ACPA)。那些46％的人在后续5年内继续符合RA分类。(Ford等人，Rheum.Dis.Clin North Am 45:101-112(2019)。在一些情况下，此类抗CCP测试结果一直在RA症状发作之前10年均可呈阳性。(参见例如Jones等人，Curr.Op.Drug Discov.Dev.,12(5):616-627(2009))。PAD4已在RA个体的滑液及滑膜生检体中与瓜氨酸化蛋白质一起被发现，并且亦在RA个体的嗜中性粒细胞产生的NET中被发现。据认为，这些目标蛋白(诸如血纤维蛋白原、波形蛋白及组蛋白)的瓜氨酸化在RA发展的亚临床阶段得到促进，并且可能由诸如吸烟(已知吸烟会增加肺组织中的PAD表达)及牙周病(经由口腔微生物牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)的PAD活性)等因素触发。(Curran等人；Chang等人，Arthitis Res.Ther.7:R268(2005)；Smolen等人，Nat.Rev.Dis.Priers 4:18001(2018))。因此，在一些情况下，有发展RA风险的个体具有吸烟史(例如，香烟、雪茄)或使用烟草产品(例如，咀嚼烟草)的历史，和/或患有牙周病。
在一些此类情况下，有发展RA风险的个体没有关节炎的临床症状。然而，在一些实施方案中，个体显示出关节炎的亚临床症状，诸如通过成像(诸如超音波或磁共振成像(MRI))可见的关节发炎、经由抗CCP测试发现存在ACPA、存在类风湿因子(RF)、或RA个体所特有的PADI4基因或其启动子区域中的SNP或其他遗传改变。在一些情况下，个体具有此类亚临床症状以及患有RA的一等亲及血清ACPA或血清类风湿因子(RF)中之一种或两种。在其他情况下，个体已诊断患有关节痛或未分化关节炎。举例而言，本文中的“关节痛”是指至少一个关节，例如踝部、脚趾、肩膀、肘部、腕部、膝部、髋部或手部、手指或脊椎中的一个多个关节的疼痛或酸痛的症状。患有关节痛的个体亦可能在一个或多个关节中有压痛、发红、发热、活动能力丧失、僵硬、虚弱、麻和/或刺痛。“未分化关节炎”是指个体的关节炎的诊断，其中关节炎的类型(诸如RA或骨关节炎)未指定或无法确定。在患有关节疼痛或未分化关节炎的个体的情况下，该个体亦可以具有以下中之一或多者：患有RA的一等亲、血清中有ACPA、血清中有RF及亚临床关节炎症(例如，透过超音波或MRI)。举例而言，在有发展RA风险的此类个体中，治疗可以包括例如减轻一种或多种出现的临床症状和/或一种或多种出现的亚临床症状的影响。在一些情况下，本文中的抗体可以通过预防有发展RA风险的个体中RA发作或复发的方法施用。
在一些实施方案中，RA个体或有发展RA风险的个体具有合并症(comorbidity)。在一些实施方案中，合并症为肺部病症，诸如间质性肺病(ILD)、肋膜积液、环杓关节炎(cricoarytenoiditis)、缩窄性或滤泡性细支气管炎支气管扩张、肺血管炎或肺高血压。(参见例如S.Kadura&G.Raghu,Eur.Respiratory Rev.30:210011(2021))。在一些情况下，肺部病症为实质肺病(例如肺炎)、气道疾病(例如环杓关节炎)或肋膜病(例如肋膜积液)。(S.Kadura及G.Raghu)。在一些实施方案中，合并症为一种以肺部发炎和/或瘢痕形成(纤维化)为特征的肺部疾病，例如间质性肺病(ILD)，也称为肺纤维化。举例而言，本文中的例子20及25使用急性肺部发炎模型，显示本文中的几种抗PAD4抗体抑制PAD4在发炎肺部中起作用，其通过自发炎肺部收集的支气管肺泡灌洗液(BALF)中组蛋白H3和/或ITIH4的瓜氨酸化减少所证明(参见例如表17)。
在其他实施方案中，个体尚未被诊断患有RA，但患有肺部病症，例如以肺部发炎和/或瘢痕形成为特征的病症，诸如间质性肺病(ILD)，也称为肺纤维化，或患有肺实质疾病(例如，肺炎)、气道疾病(例如，环杓关节炎)或肋膜疾病(例如，肋膜积液)，或患有间质性肺病(ILD)、肋膜积液、环杓关节炎、缩窄性或滤泡性细支气管炎支气管扩张、肺血管炎或肺高血压。例如，ILD亦可能与其他自体免疫疾病(诸如硬皮症、皮肌炎及多发性肌炎、混合结缔组织病、休格连氏综合征(Sjogren's syndrome)并存，亦可能为由某些传染病(诸如肺炎)或暴露于某些药物或有害物质(诸如石棉)引起，或可能由不受控制的胃食道逆流引起。
在一些实施方案中，自体免疫病症包含或为除RA以外的风湿性自体免疫疾病。举例而言，PAD4基因多型性不仅与RA相关，而且与狼疮(诸如全身性红斑狼疮症(SLE)、皮肤红斑狼疮及狼疮性肾炎)相关。举例而言，已发现Padi4-/-个体表达出自体抗体、I型FN反应、免疫细胞活化、血管功能障碍及NET免疫原性下降。人类T细胞表达PAD4及PAD2两者，且当暴露于PAD2或PAD4抑制剂时，显示Th1极化被消除。在狼疮性肾炎的情况下，例如，与野生型小鼠相比，Padi4基因敲除小鼠表达出蛋白尿进展的显著改善、肾脏嗜中性粒细胞浸润减少，以及p38 MAPK磷酸化减少及JNK相关亮氨酸拉链蛋白(JLP)(一种p38MAPK支架蛋白)表达降低。(参见例如Massarenti等人，Scand.J.Rheumatol.48(2):133-140(2019)；Y.Liu等人，JCI Insight 3(23):e124729；N.Hanata等人，Front.Immunol.11:1095(2020))。
NETosis与狼疮及其他自体免疫疾病以及肾病的病理生理学相关，包括例如全身性红斑性狼疮症、血管炎(例如ANCA相关血管炎)、抗磷脂抗体综合征、1型糖尿病及肾炎性疾病(丝球体肾炎，例如增生性丝球体肾炎和非增生性丝球体肾炎)，并且亦与癌症的病理生理学相关。(参见例如Li等人，Molecular Cancer Therapeutics,19:1530-38(2020),Teijeira等人Immunity:56,856-871(2020),Gupta,S.及Kaplan,M.J.Nat Rev Nephrol 12(7):402-413(2016))。NET为细胞外网状结构，由染色质骨架及各种肽与蛋白质组成，由嗜中性粒细胞在称为NETosis的过程中回应各种刺激而形成。已发现NETosis涉及组蛋白(诸如组蛋白H3)的瓜氨酸化，其需要PAD4活性。例如，在血管炎中，NETosis为疾病的关键驱动因素。(参见例如B.Arneth等人，Int.J.Med.Sci.18:1532-40(2021)；JM Berthelot等人，Joint Bone Spine 84(3):255-262(2017)；ZL Wang等人，Beijing Da Xue Xue Bao YiXue Ban 46(2):200-6(2014))。已发现本文所提供的PAD4抗体抑制NETosis及H3的瓜氨酸化(参见实施例)并且可用于治疗或预防NETosis相关疾病的发作或复发。在一些实施方案中，疾病为癌症(例如，本文所公开的癌症)；或自体免疫疾病，诸如狼疮(例如，全身性红斑性狼疮症)、血管炎(例如，ANCA相关血管炎)、抗磷脂抗体综合征、1型糖尿病、炎性肠病(IBD)(例如溃疡性结肠炎及克罗恩氏病)及囊肿性纤维化；或肾病，诸如肾炎性疾病(例如，增生性丝球体肾炎及非增生性丝球体肾炎)。因此，本文中的方法包括在个体中或在体外抑制NETosis或METosis的方法，其包含施用有效量的本文中的抗体。
此外，例如，在血栓中不存在PAD4或抑制PAD4已被证明可以消除肝素诱导的血栓形成。此外，体内注射重组人PAD4可诱导肠为膜微静脉中冯威里氏因子(von Willebrandfactor)血小板串的形成，其依赖PAD4酶促活性。注射了重组人类PAD4的野生型小鼠血浆中的内源性ADAMTS13活性亦降低。施用重组人类PAD4亦可以缩短血管闭塞时间并显著减少血栓栓塞。(参见例如J.Perdomo等人，Nature Commun.10(1):1322(2019)；N.Sorvillo等人，Circulation Res.125(5):507-519(2019))。
此外，已知PAD4活性异常与除RA以外的自体免疫疾病相关，诸如多发性硬化症(MS)、自体免疫性脑脊髓炎、阻塞性肾病变、阿尔茨海默症(Alzheimer's disease；AD)及炎性肠病(IBD)(例如，溃疡性结肠炎及克罗恩氏病)，以及僵直性脊椎炎、骨关节炎、青光眼、瘙痒病(Scrapie)及HIV/AIDS。例如，已在所有那些病状中均发现PAD酶和/或瓜氨酸化蛋白质的含量升高。(参见例如Chumanevich等人，Am.J.Physiol.Gastrointest.LiverPhysiol.300(6):G929-G938(2011)；Jones等人，Curr.Op.Drug Discov.Dev.,12(5):616-627(2009))。举例而言，在MS中，在患者模型或动物模型两者中均发现髓磷脂碱性蛋白异常去亚胺化，并且观测到PAD4含量升高；而在马堡MS(一种特别严重的MS形式)中，发现瓜氨酸化的髓磷脂碱性蛋白的含量非常高。(参见例如Jones等人，Curr.Op.Drug Discov.Dev.,12(5):616-627(2009))。此外，PAD底物的去胺作用被认为为响应于TNF-α信号传导而发生的，而抗TNF-α抗体已被用于治疗各种自体免疫疾病，诸如RA及IBD，表明PAD活性升高可为由于不受控制的TNF-α信号传导引起。(参见Chumanevich等人，见上文)。例如，Chumenevich及其同事发现结肠炎模型中PAD4含量升高，并表明小分子PAD抑制剂可用于治疗葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的鼠类结肠炎模型中的结肠炎。(Id)。因此，在一些实施方案中，自体免疫病症包含IBD。在一些实施方案中，自体免疫病症包含结肠炎，诸如溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、麸质敏感性肠病或惠普尔氏病(Whipple's disease)。
在一些实施方案中，自体免疫病症包含狼疮，诸如全身性红斑狼疮症、皮肤红斑狼疮或狼疮性肾炎。在一些实施方案中，自体免疫性病症包含血管炎。血管炎的例示性类型包括白塞氏症(Bechet's Disease)、博格氏症(Buerger's Disease((闭塞性血栓性脉管炎)、嗜酸球性肉芽肿性多血管炎(EGPA；以前称为查-施二氏病(Churg Strauss))、冷凝球蛋白血症、巨细胞动脉炎(颞动脉炎)、亨-舍二氏紫斑症(Henoch- purpura；HSP；IgA血管炎)、显微镜下多血管炎、结节性多动脉炎、风湿性多肌痛、类风湿性血管炎、高安氏动脉炎(Takayasu's arteritis)、肉芽肿性多血管炎(GPA；以前称为韦格纳氏病(Wegener's))、ANCA相关血管炎(诸如PR3-ANCA相关血管炎或MPO-ANCA相关血管炎)、过敏性血管炎、孤立性主动脉炎、中枢神经系统血管炎、中枢神经系统原发性血管炎(PACNS)、川崎病、荨麻疹性血管炎、药物诱导的血管炎、复发性多软骨炎(RP)。在一些实施方案中，自体免疫病症包含血栓。在一些情况下，该自体免疫疾病包含关节炎，诸如(例如)急性关节炎、慢性关节炎、痛风或痛风性关节炎、急性免疫性关节炎、慢性炎性关节炎、退化性关节炎、II型胶原蛋白诱发的关节炎、传染性关节炎、脓毒性关节炎、莱姆关节炎、增生性关节炎、牛皮癣性关节炎、斯蒂尔氏病(Still's disease)、脊椎关节炎、骨关节炎、慢性渐进性关节炎(arthritischronica progrediente)、变形性关节炎、原发性慢性多发性关节炎、反应性关节炎、更年期关节炎、雌激素耗竭性关节炎、僵直性脊椎炎或类风湿性脊椎炎。在一些情况下，自体免疫病症包含多发性硬化症(MS)，该多发性硬化症可包括：原发性进行性多发性硬化症(PPMS)、复发缓解型多发性硬化症(RRMS)、继发性进行性多发性硬化症(SPMS)及进行性复发性多发性硬化症(PRMS)。在一些情况下，自体免疫疾病包括全身性硬化症(硬皮症)、特发性炎性肌病(诸如(例如)皮肌炎、多发性肌炎、坏死性自体免疫性肌病或单发性包涵体肌炎)、休格连氏综合征、类肉瘤病、自体免疫溶血性贫血、免疫性全血球减少症、阵发性夜间血红素尿症(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria)、自体免疫性血小板减少症(autoimmune thrombocytopenia)(诸如(例如)特发性血小板减少性紫斑症、免疫介导性,血小板减少症、急性血小板减少性紫斑症、慢性血小板减少性紫斑症)、甲状腺炎(诸如(例如)格雷夫氏病(Grave's disease)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、幼年型淋巴球性甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎)、糖尿病、免疫介导性肾病(丝球体肾炎、肾小管间质性肾炎)、中枢和/或周边神经系统脱髓鞘疾病(诸如(例如)多发性硬化症、特发性脱髓鞘性多发性神经病变(idiopathic demyelinating polyneuropathy)或格-巴二氏综合征(Guillain-Barre syndrome)，或慢性发炎去髓鞘型多发性神经病变(chronicinflammatory demyelinating polyneuropathy))、肝胆疾病(诸如(例如)传染性肝炎(例如A型、B型、C型、D型、E型或其他非亲肝病毒型肝炎)、自体免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎或硬化性胆管炎)、炎性肠病(IBD)(诸如(例如)溃疡性结肠炎、克罗恩氏症、麸质敏感性肠病或惠普尔氏病)、自体免疫或免疫介导性皮肤病(诸如(例如)大疱性皮肤病、多形性红斑、接触性皮肤炎或牛皮癣)、过敏性疾病(诸如(例如)哮喘、过敏性鼻炎、异位性皮肤炎、食物过敏或荨麻疹)、肺部免疫疾病(诸如(例如)嗜酸球性肺炎、特发性肺纤维化或过敏性肺炎)、移植相关疾病(诸如(例如)移植物排斥或移植物抗宿主疾病)、纤维化(诸如(例如)肾纤维化或肝纤维化)、心血管疾病(包括动脉粥状硬化及冠状动脉疾病、与慢性肾病相关的心血管事件、心肌梗塞及充血性心脏衰竭)、糖尿病(包括II型糖尿病)、阻塞性细支气管炎伴随机化性肺炎(BOOP)，或吞噬血球综合征(hemophagocyticsyndrome)、巨噬细胞活化综合征、类肉瘤病或牙周炎。在一些情况下，自体免疫病症包含抗甲胺喋呤自体免疫病症，诸如抗甲胺喋呤RA、狼疮、血管炎、血栓、MS或其类似者。在一些情况下，自体免疫病症包含肾病，诸如肾炎性疾病，诸如肾纤维化、慢性肾病、增生性丝球体肾炎或非增生性丝球体肾炎。
在一些情况下，个体患有与以下中之一或多者相关的病症：NETosis、METosis、抗瓜氨酸化蛋白质抗体(ACPA)的存在、PAD4表达增加，或PAD4活性增加(诸如多肽的瓜氨酸化增加)。在一些情况下，该病症包含酸诱导的肺损伤、痤疮(PAPA)、急性淋巴球性白血病、急性呼吸窘迫综合征、阿迪森氏病(阿狄森氏病)、肾上腺增生(adrenal hyperplasia)、肾上腺皮质功能不全(adrenocortical insufficiency)、老化、AIDS、酒精性肝炎、酒精性肝病、过敏原诱导的哮喘、过敏性支气管肺病、曲菌病(aspergillosis)、过敏性结膜炎、秃发、阿尔茨海默症、淀粉样变性、肌萎缩侧索硬化症、体重减轻、心绞痛、血管性水肿、无汗性外胚层发育不全-ID、僵直性脊椎炎、眼前段发炎、抗磷脂综合征、口疮性口炎、阑尾炎、关节炎、哮喘、动脉粥状硬化、异位性皮肤炎、自体免疫疾病、自体免疫肝炎、蜂蜇诱发的发炎、贝塞氏症、贝塞氏综合征、伯耳氏瘫(Bells Palsy)、铍中毒、布劳综合征(Blau syndrome)、骨痛、支气管炎、细支气管炎、烧伤、滑囊炎、心脏肥大、腕隧道综合征、分解代谢障碍、白内障、脑动脉瘤、化学刺激诱发的发炎、脉络膜视网膜炎、慢性心脏衰竭、早产儿慢性肺病、慢性淋巴球性白血病、慢性阻塞性肺病、结肠炎、复杂区域疼痛综合征、结缔组织疾病、COPD、角膜溃疡、克罗恩氏病、隐热蛋白相关周期性综合征、周期性综合征、囊肿性纤维化、介白素-1-受体拮抗剂缺乏症(DIRA)、皮肤炎、皮肤炎内毒素血症、皮肌炎、弥漫型内因性脑桥神经胶质瘤、干眼症、子宫内膜异位症、内毒素血症、上髁炎、红血球母细胞减少症(erythroblastopenia)、家族性淀粉样变性多发性神经病变、家族性寒冷性荨麻疹、家族性地中海热、胎儿生长迟缓、青光眼、肾丝球疾病、肾丝球肾炎、痛风、痛风性关节炎、移植物抗宿主疾病、痛风疾病、头部损伤、头痛、听力损失、心脏病、溶血性贫血、亨-舍二氏紫斑症、肝炎、遗传性周期性发热综合征、带状疱疹及单纯疱疹、HIV-1、霍奇金氏病(Hodgkin'sdisease)、亨廷顿氏病(Huntington's disease)、透明膜病(hyaline membrane disease)、高氨血症(hyperammonemia)、高钙血症(hypercalcemia)、高胆固醇血症(hypercholesterolemia)，高免疫球蛋白血症D伴反复发热(hyperimmunoglobulinemia Dwith recurrent fever；HIDS)、发育不全及其他贫血、发育不全性贫血，特发性血小板减少性紫斑症，色素失调症(incontinentia pigmenti)、传染性单核白血球增多症、炎性肠病、炎性肺病、炎性神经病变、炎性疼痛、昆虫叮咬诱发的发炎、虹膜炎、刺激诱发的发炎、缺血/再灌注、幼年型类风湿性关节炎、角膜炎、肾脏疾病、寄生虫感染引起的肾脏损伤、寄生虫感染引起的肾脏损伤、肾脏移植排斥预防、钩端螺旋体病(leptospirosis)、路易氏体失智症(Lewy body dementia)、吕佛勒氏综合征(Loeffler'ssyndrome)、肺损伤、狼疮、狼疮性肾炎、脑膜炎、间皮瘤、混合结缔组织疾病、穆-韦二氏综合征(Muckle-Wells syndrome)(荨麻疹性耳聋性淀粉样变性)、多发性硬化症、多系统萎缩(multiple system atrophy)、肌肉消瘦(muscle wasting)、肌肉萎缩(muscular dystrophy)、重症肌无力、心肌炎、蕈样霉菌病(mycosis fungoides)、骨髓发育不全综合征(myelodysplastic syndrome)、肌炎、鼻窦炎、坏死性小肠结肠炎、新生儿发作型多系统发炎疾病(NOMID)、肾病综合征、神经炎、神经病理性疾病、非过敏原诱发的哮喘、肥胖、眼部过敏、视神经炎、器官移植、骨关节炎、中耳炎、佩吉特氏病(Paget's disease)、疼痛、胰脏炎、帕金森氏病(Parkinson's disease)、天疱疮、心包炎、周期性发热、牙周炎、腹膜子宫内膜异位症、百日咳、咽炎及腺炎(PFAPA综合征)、植物刺激诱发的发炎、肺炎、局限性肺炎(pneumonitis)、肺囊虫感染、毒葛或漆酚油诱发的发炎、结节性多动脉炎、多软骨炎、多囊性肾病、多发性肌炎、牛皮癣，社会心理应激病、肺病、肺高血压、肺纤维化、坏疽性脓皮症、化脓性无菌关节炎、肾病、视网膜疾病、风湿病心脏炎(rheumatic carditis)、风湿性疾病、类风湿性关节炎、类肉瘤病、皮脂溢(seborrhea)、败血症、剧痛、镰状细胞病、镰状细胞贫血、二氧化硅诱发的疾病、休格连氏综合征、皮肤病、睡眠呼吸暂停、脊髓损伤、脊椎炎、脊椎关节病、史-琼二氏综合征(Stevens-Johnsonsyndrome)、中风、蛛膜下出血、晒伤、颞动脉炎(temporal arteritis)、腱鞘炎(tenosynovitis)、血小板减少症(thrombocytopenia)、甲状腺炎、组织移植、TNF受体相关周期性综合征(TRAPS)、弓虫病(toxoplasmosis)、移植、创伤性脑损伤、肺结核(tuberculosis)、1型糖尿病、2型糖尿病、溃疡性结肠炎、荨麻疹性葡萄膜炎(包括非肉芽肿性葡萄膜炎及肉芽肿性葡萄膜炎)、创伤愈合、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener'sgranulomatosis)、间质性肺病、牛皮癣性关节炎、幼年型特发性关节炎、抗嗜中性粒细胞细胞质抗体(ANCA)相关血管炎、抗磷脂抗体综合征、深层静脉栓塞、纤维化、阿尔茨海默症、硬皮病或CREST综合征。
在一些实施方案中，该病症为癌症。例如，已在癌症中鉴别出嗜中性粒细胞发炎、嗜中性粒细胞细胞外陷阱(NET)和/或单核球细胞外陷阱(MET)，并且与较差的预后相关。(参见例如Li等人，Molecular Cancer Therapeutics,19:1530-38(2020))。在一些实施方案中，本文所描述的抗体可以减少形成细胞外陷阱形成嗜中性粒细胞，和/或抑制NETosis，减少细胞外陷阱形成单核球，和/或抑制METosis，和/或减弱癌症生长。举例而言，研究表明，PAD4催化的NET形成在多种肿瘤中上调，并且PAD4在多种癌症中过度表达。(H.Chen等人，Cell Mol.Biol.Lett 26:9(2021))。亦显示小分子PAD4抑制剂在癌症模型中抑制肿瘤生长且抑制组蛋白H3瓜氨酸化。(参见Id)。因此，在一些实施方案中，本文中的抗体抑制癌症个体中的NETosis和/或METosis。另外，已报导PAD4在癌症患者的某些肿瘤组织中及血液样本中高度表达。(参见例如Wang等人，Biomedicine&Pharmacotherapy 153:113289(2022))。亦已报导PAD4可促进癌细胞的放射抗性、存活、迁移及侵袭。(Chen等人Cell MolBiol Lett(2021)26:9)。在一些实施方案中，抗体可抑制患者中至少一种肿瘤的生长和/或减小患者中至少一种肿瘤的体积。在一些实施方案中，抗体提高肿瘤的放射敏感性或降低肿瘤的放射抗性。
在一些实施方案中，该癌症为一种通常对免疫疗法有反应的癌症。在一些实施方案中，该癌症为一种通常对免疫疗法没有反应的癌症。在一些实施方案中，该癌症包含实体肿瘤。在一些实施方案中，癌症包含血液恶性肿瘤(液体肿瘤)。
在一些实施方案中，癌症为癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤或白血病。在一些实施方案中，癌症为鳞状细胞癌、小细胞肺癌、垂体癌、食道癌、星形细胞瘤、软组织肉瘤、非小细胞肺癌(包括鳞状细胞非小细胞肺癌)、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、神经胶母细胞鳞状细胞癌、小细胞肺癌(small-cell lung cancer；SCLC)、非小细胞肺癌、鳞状非小细胞肺癌(squamous non-small cell lung cancer；NSCLC)、非鳞状NSCLC、神经胶质瘤、胃肠癌、肾癌(例如透明细胞肾癌)、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌(kidney cancer)(例如肾细胞癌(renal cell carcinoma；RCC))、前列腺癌(例如激素难治性前列腺癌(hormone refractory prostate adenocarcinoma))、甲状腺癌、神经母细胞瘤、胰腺癌、神经胶母细胞瘤(多形性神经胶母细胞瘤)、子宫颈癌、胃癌(stomach cancer)、膀胱癌、肝肿瘤(hepatoma)、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌、ER阳性乳腺癌、ER阴性乳腺癌、淋巴结阳性乳腺癌及淋巴结阴性乳腺癌)、结肠癌及头颈癌(或癌瘤)；胃癌(gastric cancer)、生殖细胞肿瘤、儿科肉瘤(pediatric sarcoma)、鼻腔鼻窦自然杀手(sinonasal natural killer)/T细胞淋巴瘤、黑色素瘤(例如转移性恶性黑色素瘤，诸如皮肤或眼内恶性黑素色瘤)、骨癌、皮肤癌、子宫癌、肛门区癌(cancer of the anal region)、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌瘤、阴道癌瘤、外阴癌瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、副甲状腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体肿瘤、尿管癌、肾盂癌瘤、中枢神经系统(CNS)赘瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成(tumor angiogenesis)、脊椎肿瘤(spinal axis tumor)、脑癌、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、表皮样癌(epidermoid cancer)、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括由石棉诱发的癌症)、病毒相关癌症或病毒源性癌症(例如人类乳头状瘤病毒(HPV相关或HPV源性肿瘤))、来源于两个主要血球谱为(亦即，骨髓细胞株(其产生颗粒球、红血球、凝血细胞、巨噬细胞及肥大细胞)或淋巴细胞株(其产生B、T、NK及浆细胞))中任一者的血液科恶性肿瘤，诸如(任何类型)的白血病、淋巴瘤或骨髓瘤，例如急性、慢性、淋巴球性和/或骨髓性白血病，诸如急性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)及慢性骨髓性白血病(CML)、未分化AML(MO)、骨髓母细胞白血病(myeloblasticleukemia；ML)、骨髓母细胞白血病(M2；细胞成熟)、前髓细胞性白血病(promyelocyticleukemia)(M3或M3变型[M3V])、骨髓单核球性白血病(myelomonocytic leukemia)(含嗜酸性球增多症(eosinophilia)的M4或M4变型[M4E])、单核球性白血病(M5)、红血球性白血病(erythroleukemia)(M6)、巨核母细胞白血病(megakaryoblastic leukemia)(M7)、孤立颗粒球性肉瘤及绿色瘤(chloroma)；淋巴瘤，诸如霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma；HL)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma；NHL)、B细胞血液科恶性肿瘤(例如B细胞淋巴瘤)、T细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤(lymphoplasmacytoid lymphoma)、单核球样B细胞淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤、多形性(例如Ki 1+)大细胞淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤/白血病、套细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(angio-immunoblastic T-cell lymphoma)、血管中心性淋巴瘤(angiocentric lymphoma)、肠道T细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(primary mediastinal B-cell lymphoma)、前驱T淋巴母细胞淋巴瘤(precursor T-lymphoblastic lymphoma)、T淋巴母细胞淋巴瘤；及淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)、周边T细胞淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤、移植后淋巴增生病、真性组织细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤(LBL)、淋巴谱为造血性肿瘤、急性淋巴母细胞白血病、弥漫性大型B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、滤泡性淋巴瘤、弥漫性组织细胞淋巴瘤(DHL)、免疫母细胞大细胞淋巴瘤、前驱B淋巴母细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTLC)(亦被称作蕈样霉菌病(mycosis fungoides)或塞扎莱综合征(Sezary syndrome))及淋巴浆细胞样淋巴瘤(LPL)伴瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)；骨髓瘤，诸如IgG骨髓瘤、轻链骨髓瘤(light chain myeloma)、非分泌性骨髓瘤(nonsecretorymyeloma)、和缓性骨髓瘤(smoldering myeloma)(亦被称作惰性骨髓瘤)、孤立性浆细胞瘤(solitary plasmocytoma)及多发性骨髓瘤、慢性淋巴球性白血病(CLL)、毛细胞淋巴瘤(hairy cell lymphoma)；骨髓谱为造血性肿瘤、间叶细胞源性肿瘤，包括纤维肉瘤及横纹肌肉瘤；精原细胞瘤、畸胎上皮癌(teratocarcinoma)、中心及周边神经肿瘤(诸如星形细胞瘤、神经鞘瘤)；间叶细胞源性肿瘤，诸如纤维肉瘤、横纹肌肉瘤及骨肉瘤；及其他肿瘤，包括黑色素瘤、着色性干皮病(xeroderma pigmentosum)、角化棘皮瘤(keratoacanthoma)、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌、畸胎上皮癌；淋巴谱为造血性肿瘤，例如T细胞及B细胞肿瘤，诸如T细胞病症，诸如T前淋巴球性白血病(T-PLL)，诸如属于小细胞及脑细胞类；T细胞类大颗粒淋巴球性白血病(large granular lymphocyte leukemia；LGL)；a/d T-NHL肝脾淋巴瘤；胸腺周边/胸腺后T细胞淋巴瘤(多形性及免疫母细胞亚型)；血管中心性(鼻部)T细胞淋巴瘤；头颈癌、肾癌、直肠癌、甲状腺癌；急性骨髓淋巴瘤；以及所述癌症的任何组合。本文所描述的方法亦可用于治疗转移性癌症、不可切除癌症、难治性癌症(例如难以用先前免疫疗法(例如抗CTLA-4或抗PD-1抗体)治疗的癌症)和/或复发性癌症。
在某些实施方案中，向患有展现出对先前的治疗(诸如标准照护治疗)的反应不充分或有进展的癌症的患者施用本文所描述的抗体，该先前治疗为例如使用免疫肿瘤学或免疫疗法药物的先前治疗。在一些实施方案中，癌症对先前的治疗具有难治性或抗药性，或本质上具有难治性或抗药性(例如，难以用诸如PD-1通路拮抗剂的免疫检查点抑制剂治疗)，或获得抗药性或难治状态举例而言，可将本文所描述的抗体单独地或与另一种疗法(例如抗PD-1路径拮抗剂疗法)组合施用给对第一疗法(诸如标准护理疗法)无反应或不充分反应的个体，或例如用化学疗法或用诸如PD-1路径拮抗剂的免疫检查点抑制剂治疗后具有疾病进展的个体。在其他实施方案中，向先前未接受(亦即，用免疫检查点抑制剂，例如PD-1路径拮抗剂治疗)的患者施用本文所描述的抗体。在一些实施方案中，抗PD1路径拮抗剂为小分子抗PD-1、抗PD-L1或抗CTLA4拮抗剂，或为抗PD-1、抗PD-L1或抗CTLA4抗体，诸如纳武利尤单抗(nivolumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、西米普利单抗(cemiplimab)、阿替利珠单抗(atezolizumab)、多塔利单抗(dostarlimab)、度伐鲁单抗(durvalumab)、阿维鲁单抗(avelumab)或伊匹单抗(ipilimumab)。
在一些实施方案中，本文中的抗体用于治疗传染病。举例而言，在各种感染中亦已发现NETosis的发生。(参见例如Li等人，Molecular Cancer Therapeutics,19:1530-38(2020))。
本文中可治疗的传染病包括例如病毒性疾病(包括AIDS(HIV感染)、肝炎(A、B、C、D及E型)及疱疹)、细菌感染、真菌感染、原虫感染及寄生虫感染。病原性感染的例子包括(但不限于)HIV、肝炎(A、B及C型)、流感、疱疹(例如，VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II、CMV、埃-巴二氏病毒(Epstein Barr virus))、梨形鞭毛虫(Giardia)、疟疾、利什曼原虫(Leishmania)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、腺病毒、流感病毒、黄病毒(flavivirus)、埃可病毒(echoviru)s、鼻病毒(rhinovirus)、科沙奇病毒(coxsackie virus)、冠状病毒、呼吸道融合细胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、德国麻疹病毒(rubella virus)、细小病毒(parvovirus)、痘疮病毒、HTLV病毒、登革热病毒(dengue virus)、乳突病毒(papillomavirus)、软疣病毒(molluscum virus)、脊髓灰白质炎病毒(poliovirus)、狂犬病病毒、JC病毒、虫媒病毒脑炎病毒(arboviral encephalitisvirus)、披衣菌(chlamydia)、立克次体细菌(rickettsial bacteria)、分枝杆菌(mycobacteria)、葡萄球菌(staphylococci)、链球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumonococci)、脑膜炎球菌(meningococci)及淋球菌(gonococci)、克雷伯氏菌(klebsiella)、变形杆菌(proteus)、沙雷氏菌(serratia)、假单胞菌(pseudomonas)、退伍军人症杆菌(legionella)、白喉杆菌(diphtheria)、沙门氏菌(salmonella)、杆菌(bacilli)、霍乱、破伤风、肉毒中毒、炭疽病、鼠疫、钩端螺旋体病、莱姆病菌、念珠菌(Candida)(白色念珠菌、克鲁斯念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌等)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、曲菌属(Aspergillus)(熏烟色曲菌(fumigatus)、黑色曲菌(niger)等)、毛霉目属(Genus Mucorales)(白霉菌(mucor)、洋四氯虫(absihlorambzopus))、申克氏孢子丝菌(Sporothrix schenkii)、皮肤炎芽孢菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)及荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、痢疾阿米巴原虫(Entamoeba histolytica)、大肠纤毛虫(Balantidium coli)、福氏耐格里阿米巴原虫(Naegleriafowleri)、棘阿米巴属(Acanthamoebasp.)、兰比亚梨形鞭毛虫(Giardialambia)、隐孢子虫属(Cryptosporidium sp.)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、微小巴贝虫(Babesia microti)、布氏锥虫(Trypanosomabrucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)及巴西日圆线虫(Nippostrongylus brasiliensis)。在一些情况下，传染病为由病毒病原体引起。在其他情况下，其为由细菌病原体引起。
在一些情况下，本文中的抗PAD4抗体可用于抑制个体或生物样本中的NETosis和/或METosis。可例如使用生物样本评估NETosis和/或METosis的抑制，该生物样本诸如为全血样本、血清样本、血浆样本、滑液样本、肺液样本、组织样本(例如关节组织样本、肺组织样本)、肿瘤样本，或含有易受NETosis或METosis的嗜中性粒细胞、单核球和/或巨噬细胞的其他生物样本。因此，本发明包括本文所公开的抗PAD4抗体的用途，其用于抑制个体中的NETosis和/或METosis，或用于制备抑制个体中的NETosis和/或METosis的药物，以及用于抑制个体中或在体外抑制生物样本中NETosis和/或METosis的方法中，该方法包含施用有效量的本文所描述的抗PAD4抗体。
在一些情况下，本文所公开的抗PAD4抗体可用于抑制个体或生物样本中的瓜氨酸华。可在体外评估对来自个体的生物样本中瓜氨酸化的抑制。生物样本可为例如全血、血清、血浆、血液上清液、滑液、组织(例如关节组织、肺组织)或肿瘤样本。因此，本发明包括本文所公开的抗PAD4抗体的用途，其用于抑制个体中的瓜氨酸化，或用于制备抑制个体中的瓜氨酸化的药物，以及用于抑制个体中的瓜氨酸化的方法，该方法包含向该个体施用有效量的本文所公开的抗PAD4抗体。在一些情况下，与在施用抗PAD4抗体之前个体中的瓜氨酸化相比，抑制个体中的瓜氨酸化(例如一种或多种蛋白质或蛋白质上的特定瓜氨酸位点的瓜氨酸化)。其可以通过将抗体施用给个体之后获得的个体生物样本中的瓜氨酸化与抗体施用之前获得的生物样本中的瓜氨酸化进行比较，或与对照生物样本进行比较来评估。本发明还涉及抑制生物样本的瓜氨酸华，其包含向该样本施用有效量的抗PAD4抗体。在一些情况下，与对照样本(例如，尚未暴露于抗PAD4抗体的对照样本，例如，未处理或处理前对照样本，或已暴露于对照抗个体基因型抗体的对照样本)相比，已暴露于抗PAD4抗体的生物样本中的瓜氨酸化(例如，一种或多种蛋白质或蛋白质上的特定瓜氨酸化位点的瓜氨酸化)受到抑制。
可例如通过评估生物样本中蛋白质或其肽片段的瓜氨酸化评估瓜氨酸化。在一些实施方案中，蛋白质为表20中所列的蛋白质。在一些实施方案中，肽为表20中所列的肽。在一些情况下，可评估超过一种蛋白质或肽片段(例如超过一种蛋白质和/或超过一种来自相同蛋白质的肽片段)。在一些情况下，表20中所列的一种或多种蛋白质或肽可用于确定瓜氨酸化。可在特定瓜氨酸位点，例如表20中鉴别的瓜氨酸化位点或对应位点处评估瓜氨酸化。如此处所使用，“对应位点”是指可例如使用序列比对确定的对应瓜氨酸化位点。举例而言，天然存在的蛋白质(例如表20中所列的蛋白质)变体或同功异型物可与表20中提及的蛋白质序列比对以鉴别对应于所鉴别的瓜氨酸化位点的瓜氨酸化位点。在一些实施方案中，使用质谱(例如使用LC/MS)评估瓜氨酸化。在一些实施方案中，可使用质谱测量瓜氨酸化蛋白质或肽的浓度及对应总蛋白质或肽的浓度(包括适用蛋白质的经修饰及未经修饰的形式)来评估瓜氨酸。这些浓度可例如使用质谱来测量。在一些实施方案中，这些浓度可以瓜氨酸化比率表示，其为瓜氨酸化蛋白质的浓度(或来自蛋白质的瓜氨酸化肽的浓度)与对应总蛋白质的浓度的比率。在一些实施方案中，通过对生物样本进行酶消化且评估样本中的瓜氨酸化肽(诸如本文中的表18或20中所列的肽)的浓度及样本中对应总蛋白质的浓度来评估瓜氨酸化。在一些实施方案中，通过测量来自蛋白质的特征肽的浓度来测量对应总蛋白质的浓度，该特征肽为未经修饰且因此表示对应蛋白质(包括任何经修饰及未经修饰形式的蛋白质)的总浓度的肽。在两个样本(例如预处理及处理后样本，或经处理样本及对照样本)中评估的瓜氨酸化比率的比较可用于评估抗PAD4抗体对瓜氨酸化的抑制。经受抗PAD4抗体处理的样本中(例如，来自经受抗PAD4抗体处理的个体的样本中)较低的瓜氨酸化率表明抗PAD4抗体对瓜氨酸化的抑制在一些情况下，可评估两种或更多种蛋白质或其肽片段(诸如本文中的表18或20中所提供的蛋白质或肽片段中的两者或更多者)的瓜氨酸化。
表20：可由PAD4瓜氨酸且由本文所公开的抗PAD4抗体抑制的蛋白质、肽及特异性瓜氨酸位化点
在一些实施方案中，本文所公开的抗PAD4抗体抑制以下中之一或多者的瓜氨酸化：蛋白多糖4(PRG4)、血纤维蛋白原α链(FGA)、补体C3(C3)、间α-胰蛋白酶抑制剂重链H4(ITIH4)、蛋白质AMBP(AMBP)、α-2巨球蛋白(A2M)、凝溶胶蛋白(GSN)、结合球蛋白(HP)或血清转铁蛋白(TF)。在一些实施方案中，抗体抑制表20或表18中所示的瓜氨酸化位点或对应位点处的瓜氨酸化。在一些实施方案中，抗体抑制表18中所示的至少一种蛋白质或肽的瓜氨酸化。在一些实施方案中，抗体例如抑制SEQ ID NO:216或SEQ ID NO:232中发现的精氨酸残基的瓜氨酸化。在一些实施方案中，抗体例如抑制在SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:232或SEQ ID NO:236至246中的任何一或多者中发现的精氨酸残基的瓜氨酸化。
B.施用途径及载剂
在各种实施方案中，抗PAD4抗体或抗PAD4抗体组合物可通过多种途径体内施用，包括(但不限于)经口、动脉内、非经肠、鼻内、肌肉内、心内、心室内、气管内、经颊、经直肠、腹膜内、皮内、局部、经皮及鞘内，或另外通过植入或吸入施用。本发明组合物可调配成制剂，诸如液体调配物或适于注射、吸入等的调配物。或者，在一些实施方案中，组合物可以冻干粉末形式提供，该冻干粉末可在添加适当液体或载剂(例如无菌水)时复原。适当调配物及施用途径可根据预期应用来选择。
在一些实施方案中，施用为静脉内或皮下施用。在一些实施方案中，施用为静脉内施用。在一些实施方案中，施用为皮下施用。
在各种实施方案中，包含抗PAD4抗体的组合物为以具有多种药学上可接受的载剂的调配物形式提供(参见例如Gennaro,Remington:The Science and Practice ofPharmacy with Facts and Comparisons:Drugfacts Plus,第20版(2003)；Ansel等人，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,第7版，LippencottWilliams and Wilkins(2004)；Kibbe等人，Handbook of Pharmaceutical Excipients,第3版，Pharmaceutical Press(2000))。可使用各种药学上可接受的载剂，包括媒剂、佐剂及稀释剂。此外，亦可使用各种药学上可接受的辅助物质，诸如pH调节及缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、湿润剂及其类似者。非限制性的例示性载剂包括生理盐水、缓冲生理盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其组合。在各种实施方案中，包含抗PAD4抗体的组合物可通过用适当载剂溶解、悬浮或乳化来调配以供注射，包括皮下施用。
在一些实施方案中，载剂为无菌水溶液，例如生理盐水(例如0.9％w/v氯化钠)或右旋糖水溶液(例如5％w/v右旋糖，也称为D5W)。在一个实施方案中，本文提供一种制造药物组合物(例如供注射，例如供静脉内或皮下注射)的方法，该方法包含将本文所公开的抗PAD4抗体的组合物与载剂组合以制造药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含至少0.25mg/ml抗体。在一些实施方案中，药物组合物包含0.25mg/ml至100mg/ml抗体，诸如0.25mg/ml至50mg/ml、1mg/ml至50mg/ml、或10mg/ml至50mg/ml。
药物组合物可以对治疗特定适应症有效的量施用。亦提供包含一个或多个容器的药物包装及试剂盒，其各自含有一或多次剂量的抗PAD4抗体。在一些实施方案中，提供一种单位剂量，其中该单位剂量含有预定量的包含抗PAD4抗体的组合物，其具有或不具有一种或多种另外的药物。
可视需要向个体施用抗PAD4抗体组合物。可由本领域技术人员，诸如主治医师，基于所治疗病状、所治疗个体的年龄、所治疗病状的严重程度、所治疗个体的一般健康状况及其类似因素的考虑因素来决定施用频率。在一些实施方案中，向个体施用有效剂量的抗PAD4抗体一或多次。举例而言，在一些实施方案中，抗PAD4抗体为每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次、每四周一次、每六周一次、每两个月一次、每八周一次、每三个月一次或每六个月一次施用。在一些此类情况下，抗PAD4抗体在此时间段经静脉内或皮下施用。在一些情况下，施用为静脉内施用。在一些情况下，向个体施用抗体持续至少六个月、或至少一年、或至少两年、或至少三年的时间，诸如以上述给药频率中之一者，诸如经静脉内或皮下施用。
在一些情况下，抗体为以0.5mg至1000mg的剂量经静脉内或皮下施用，诸如每两周一次、每三周一次、每月一次、每四周一次、每六周一次、每两个月一次、每八周一次、每三个月一次或每六个月一次。在一些此类情况下，抗体为以1mg至900mg、1mg至300mg、1mg至100mg、3mg至300mg、5mg至300mg的剂量施用。
C.组合疗法
抗PAD4抗体可单独或与其他治疗模式一起施用。此类其他治疗模式可在施用抗PAD4抗体之前、实质上同时或之后提供。在一些实施方案中，另一治疗模式包含针对患者所患疾病的标准护理治疗。本文所描述的抗体可与至少一种其他治疗剂在相同的组合物中施用，或可与至少一种其他治疗剂分开施用。在一些情况下，诸如在抗体-药物结合物内，本文所描述的抗体亦可化学连接至其他治疗剂。
对于类风湿性关节炎的治疗而言，例如，抗PAD4抗体可以与一种或多种其他治疗剂一起施用，例如疾病调修抗风湿药物(DMARD)，诸如甲胺喋呤(或)、阿达木单抗依那西普英利昔单抗羟基氯喹柳氮磺吡啶来氟米特阿巴西普阿那白滞素赛妥珠单抗戈利木单抗利妥昔单抗沙利姆单抗托珠单抗巴瑞替尼托法替尼优帕替尼及(阿巴西普)；非类固醇消炎药(NSAID)，诸如布洛芬(ibuprofen)(Advil、Motrin及双氯芬酸)及萘普生钠；COX-2抑制剂(塞内昔布(celecoxib)或依托昔布(etoricoxib))；类固醇，诸如普赖苏浓或普赖松。在一些情况下，抗PAD4抗体可与以下中之一或多者一起施用：抗TNF剂(例如抗TNF抗体)，诸如英利昔单抗阿达木单抗戈利木单抗赛妥珠单抗及依那西普糖皮质激素，诸如普赖松或甲基普赖苏浓；来氟米特硫唑嘌呤(或)；JAK抑制剂，诸如CP590690；SYK抑制剂，诸如R788；TYK2抑制剂，诸如氘可来昔替尼(deucravacitinib)抗IL-6抗体；抗IL-6R抗体；抗CD-20抗体；抗CD19抗体；抗GM-CSF抗体；及抗GM-CSF-R抗体。对于自身免疫病状的治疗而言，抗PAD4抗体可以与其他治疗剂一起施用，例如干扰素α；干扰素β；抗I型干扰素受体抗体，诸如阿尼鲁单抗(anifrolumab)普赖松；抗α4整合素抗体，诸如抗BAFF/BLyS抗体，诸如贝利尤单抗(belimumab)抗CD20抗体，诸如(利妥昔单抗)；钙调磷酸酶抑制剂，诸如环孢素(cyclosporin)或伏环孢素(voclosporin)补体抑制剂，诸如依库珠单抗(eculizumab)或阿伐可泮(avacopan)霉酚酸吗啉乙酯(mycophenolate mofetil)或霉酚酸酯钠环磷酰胺FTY720(芬戈莫德(fingolimod)，例如)；及(禄斯得停(Leustatin))。在一些情况下，抗PAD4抗体可与甲胺喋呤一起施用。在其他情况下，抗PAD4抗体为在另一种药物不存在的情况下施用。例如，抗PAD4抗体可以与被认为为自体免疫病症护理标准的其他治疗一起施用，或者可以添加至另一种治疗方案或可以遵循另一种治疗方案施用，例如，在治疗方案未能成功满足标准临床治疗目标或希望改善治疗方案的情况下。
关于狼疮的治疗，例如，抗PAD4抗体可以与一种或多种治疗剂一起施用，所述治疗剂诸如环孢灵、他克莫司(tacrolimus)、环磷酰胺、硫唑嘌呤霉酚酸酯利妥昔单抗及贝利尤单抗类固醇(例如普赖松或普赖苏浓)、降血压药(例如血管收缩素转化酶(ACE)抑制剂、血管收缩素II受体阻断剂(ARB))。
对于血管炎的治疗而言，例如，抗PAD4抗体可以与一种或多种其他治疗剂一起施用。治疗剂的非限制性实施例包括类固醇(例如普赖松、普赖苏浓、甲基普赖苏浓或地塞米松(dexamethasone))、甲胺喋呤硫唑嘌呤霉酚酸酯环磷酰胺、托珠单抗利妥昔单抗阿伐可泮、血浆置换术、霉酚酸吗啉乙酯(MMF)、硫唑嘌呤(AZA)、来氟米特(LEF)、贝利尤单抗、美泊利单抗(meprolizumab)及奥马珠单抗(omalizumab)。对于癌症的治疗而言，抗PAD4抗体可以与一种或多种其他抗癌剂一起施用，所述抗癌剂诸如免疫检查点抑制剂、化学治疗剂、生长抑制剂、放射毒性剂、免疫抑制剂、抗癌疫苗(诸如基因疗法疫苗)、抗血管生成剂和/或抗赘生性组合物。本文所描述的抗体可以与其他抗癌剂在相同的组合物中施用，或可与抗癌剂分开施用。在后一种情况(分开施用)下，抗体可在抗癌剂之前、之后或与其同时施用，或可与其他已知治疗剂共同施用。在一些实施方案中，所述组合可有效地与标准癌症治疗组合，诸如包括放射线、手术及激素剥夺。
免疫检查点抑制剂的例子包括抑制调节免疫系统的特定信号传导路径的分子。参见例如Weber(2010)Semin.Oncol.37:430；Pardoll(2012)Nat.Rev.Cancer 12:252。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂包含以下各者的拮抗剂：PD-1、PD-L1、CTLA4、LAG-3、半乳糖凝集素1、半乳糖凝集素9、CEACAM-1、BTLA、CD25、CD69、TIGIT、CD113、GPR56、VISTA、B7-H3、B7-H4、2B4、CD48、GARP、PD1H、LAIR1、TIM1、TIM3、TIM4、ILT4、IL-6、IL-10、TGFβ、VEGF、KIR、LAG-3、腺苷A2A受体、PI3Kδ或IDO。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂包含B7-1、B7-2、CD28、4-1BB(CD137)、4-1BBL、ICOS、ICOS-L、OX40、OX40L、GITR、GITRL、CD27、CD40、CD40L、DR3、CD28H、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、IFNα、STING的激动剂，或铎样受体激动剂，诸如TLR2/4激动剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂包含结合至膜结合蛋白质B7家族成员(诸如B7-1、B7-2、B7-H2(ICOS-L)、B7-H3、B7-H4、B7-H5(VISTA)及B7-H6)的药物。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂结合至TNF受体家族成员，或结合至与TNF受体家族成员结合的共刺激或共抑制分子，该TNF受体家族成员诸如为CD40、CD40L、OX40、OX40L、GITR、GITRL、CD70、CD27L、CD30、CD30L、4-1BBL、CD137(4-1BB)、TRAIL/Apo2-L、TRAILR1/DR4、TRAILR2/DR5、TRAILR3、TRAILR4、OPG、RANK、RANKL、TWEAKR/Fn14、TWEAK、BAFFR、EDAR、XEDAR、EDA1、EDA2、TACI、APRIL、BCMA、LTβR、LIGHT、DeR3、HVEM、VEGL/TL1A、TRAMP/DR3、TNFR1、TNFβ、TNFR2、TNFα、1β2、FAS、FASL、RELT、DR6、TROY或NGFβ。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂对抑制T细胞活化的细胞因子(诸如IL-6、IL-10、TGFβ、VEGF)进行拮抗或抑制。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂包含刺激T细胞活化的细胞因子(诸如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21及IFNα)的激动剂。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含趋化介素(诸如CXCR2、CXCR4、CCR2或CCR4)的拮抗剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂包含抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂包含疫苗，诸如间皮素靶向疫苗或减毒性李斯特菌(listeria)癌症疫苗，诸如CRS-207。
免疫检查点抑制剂目标的例示性非限制实施例为CTLA-4、PD-1及PD-L1。此类免疫检查点抑制剂的非限制性实施例包括抗CTLA4、抗PD-1及抗PD-L1抗体，诸如(例如)帕博利珠单抗伊匹单抗纳武利尤单抗阿替利珠单抗阿维鲁单抗多塔利单抗西米普利单抗及度伐鲁单抗
在一些实施方案中，本文中的抗体与至少一种化学治疗剂组合施用。可在本文中的方法中施用的化学治疗剂的非限制性实施例包括(但不限于)烷基化剂，诸如噻替派(thiotepa)及环磷酰胺；来那度胺(lenalidomide)硼替佐米(bortezomib)苯达莫司汀(bendamustine)利妥昔单抗阿伦单抗(alemtuzumab)奥法木单抗(ofatumumab)依维莫司(everolimus)卡非佐米(carfilzomib)(KyprolisTM)；异环磷酰胺(ifosamade)；地塞米松；磺酸烷基酯，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)及乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺及甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺、三乙烯磷酰胺、三乙烯硫代磷酰胺及三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物拓朴替康(topotecan))；苔藓虫素(bryostatin)；海洋抑素(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)及比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素(cryptophycin)(尤其是念珠藻素1及念珠藻素8)；海兔毒素(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189及CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑素(spongistatin)；氮芥，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamidee)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺、甲氮芥(mechlorethamine)、甲氮芥氧化物盐酸盐、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶芥(uracil mustard)；亚硝基脲，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，诸如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素(calicheamicin)，尤其是卡奇霉素γ1I及卡奇霉素ωIl(参见例如,Angew.Chem Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；双膦酸盐，诸如氯屈膦酸盐(clodronate)；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新抑癌蛋白发色团及相关色蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C、卡拉比辛(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycini)、放线菌素D(dactinomycin)、道诺霉素、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、(小红莓，包括啉基-小红莓、氰基啉基-小红莓、2-吡咯啉基-小红莓及脱氧小红莓)、表柔比星、依索比星(esorubicin)、埃达霉素(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)(诸如丝裂霉素C)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泼非霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、奎那霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他汀(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，诸如甲胺喋呤甲胺喋呤5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如迪诺特宁(denopterin)、甲胺喋呤、蝶罗呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)6-巯基嘌呤、噻咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(gemcitabine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷；雄激素，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯；抗肾上腺药，诸如胺鲁米特、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；乙酰葡醛酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；贝斯布西(bestrabucil)；氯亚布曲克(chlorambucaxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elfornithinee)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基尿素；磨菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；类美登素(maytansinoid)，诸如美登素(maytansine)及安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他汀(pentostatin)；苯来美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2”2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯(trichothecene)(尤其是T-2毒素、黏液霉素A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridinA)及蛇形菌素(anguidine))；尿烷；长春地辛(vindesine)；达喀尔巴嗪；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、不含十六醇聚氧乙烯醚的白蛋白工程改造的太平洋紫杉醇纳米颗粒调配物(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Illinois)及多烯紫杉醇(-Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤(mercaptopurine)、甲胺喋呤；铂类似物，诸如顺铂、奥沙利铂及卡铂；长春花碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱沙利度胺(thalidomide) 长春瑞滨(vinorelbine)；诺凡得龙(novantrone)；替尼泊甙(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素；氨基喋呤；截瘤达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(Camptosar,CPT-11)(包括伊立替康与5-FU及甲酰四氢叶酸的治疗方案)；拓朴异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄素，诸如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；康普瑞汀(combretastatin)；甲酰四氢叶酸(LV)；奥沙利铂(oxaliplatin)，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；减少细胞增殖的PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR(例如厄洛替尼erlotinib))及VEGFA的抑制剂，以及以上任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
可在本文中的方法中施用的其他非限制性例示性化学治疗剂包括用于调节或抑制激素对癌症的作用的抗激素剂，诸如抗雌激素及选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、曲洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen)、曲沃昔芬(trioxifene)、柯昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)及托瑞米芬(toremifene)；抑制芳香酶的芳香酶抑制剂，其调节肾上腺中雌激素的产生，诸如(例如)4(5)-咪唑、胺鲁米特、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、依西美坦(exemestane)、福美斯坦(formestanie)、法屈唑(fadrozole)、伏罗唑(vorozole)、来曲唑(letrozole)及阿那曲唑(anastrozole)；及抗雄激素，诸如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙立德(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧杂环戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，尤其抑是制异常细胞增殖中涉及的信号传导路径中的基因表达的那些反义寡核苷酸，诸如(例如)PKC-α、Ralf及H-Ras；核糖核酸酶，诸如VEGF表达抑制剂(例如核糖核酸酶)及HER2表达抑制剂；疫苗，诸如基因疗法疫苗，例如疫苗、疫苗及疫苗；rIL-2；拓朴异构酶1抑制剂；rmRH；及以上中任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
在一些实施方案中，抗血管生成剂可与本文所公开的抗体组合施用。抗血管生成剂的非限制性实施例可包括对血管生成剂的抗体或其他拮抗剂，例如VEGF-A的抗体(例如贝伐珠单抗)或VEGF-A受体(例如KDR受体或Flt-1受体)的抗体；抗PDGFR抑制剂，诸如(甲磺酸伊马替尼(Imatinib Mesylate))；阻断VEGF受体信号传导的小分子(例如PTK787/ZK2284、SU6668、/SU11248(苹果酸舒尼替尼(sunitinib malate))、AMG706或例如国际专利申请案WO 2004/113304中所描述的那些药剂)。抗血管生成剂亦包括天然血管生成抑制剂，例如血管生长抑素(angiostatin)、内皮生长抑素(endostatin)等。参见例如Klagsbrun及D'Amore(1991)Annu.Rev.Physiol.53:217-39；Streit及Detmar(2003)Oncogene 22:3172-3179(例如表3，其列出恶性黑色素瘤的抗血管生成疗法)；Ferrara及Alitalo(1999)Nature Medicine 5(12):1359-1364；Tonini等人(2003)Oncogene 22:6549-6556(例如表2，其列出已知抗血管生成因子)；及Sato(2003)Int.J.Clin.Oncol.8:200-206(例如表1，其列出临床试验中所用的抗血管生成剂)。
在一些实施方案中，肿瘤生长抑制剂可与本文所公开的抗体组合施用。生长抑制剂的非限制性实施例包括(但不限于)阻断细胞周期进程(在除S期以外的位置处)的试剂，诸如诱发G1阻滞及M期阻滞的试剂。经典M期阻断剂包括长春花(vincas)(长春新碱(vincristine)及长春花碱)、紫杉烷(taxane)及II型拓朴异构酶抑制剂(诸如小红莓(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、道诺霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)及博莱霉素(bleomycin))。阻滞G1的那些药剂亦深入到S期阻滞，例如DNA烷基化剂，诸如他莫西芬(tamoxifen)、普赖松(prednisone)、达喀尔巴嗪(dacarbazine)、甲氮芥(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲胺喋呤、5-氟尿嘧啶及ara-C。其他信息可见于Mendelsohn及Israel编,The Molecular Basis of Cancer,第1章,名称为“Cell cycleregulation,oncogenes,and antineoplastic drugs”,Murakami等人(W.B.Saunders,Philadelphia,1995),例如第13页。紫杉烷(太平洋紫杉醇及多烯紫杉醇)为来源于紫杉树的抗癌药物。来源于欧洲紫杉的多烯紫杉醇(Rhone-Poulenc Rorer)为太平洋紫杉醇(Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。太平洋紫杉醇及多烯紫杉醇促进微管自微管蛋白二聚物组装且通过防止解聚合稳定微管，其致使抑制细胞中的有丝分裂。
对于炎性或自体免疫或传染病病状或癌症的治疗而言，在一些实施方案中，可将消炎药与本文所公开的抗体组合施用。消炎药可为例如类固醇或非类固醇消炎药(NSAID)。在需要结合使用本文所描述的抗PAD4抗体进行治疗时或在使用所述抗体进行治疗之前使异常增殖细胞休眠的情况下，亦可向患者施用激素及类固醇(包括合成类似物)，诸如17a-炔雌醇、己烯雌酚、睾固酮、普赖松、氟甲睾酮(Fluoxymesterone)、丙酸屈他雄酮(Dromostanolone propionate)、睾内酯(Testolactone)、乙酸甲地孕酮、甲基普赖苏浓(Methylprednisolone)、甲基-睾固酮(Methyl-testosterone)、普赖苏浓(Prednisolone)、曲安西龙(Triamcinolone)、氯三芳乙烯(Chlorotrianisene)、羟基孕酮(Hydroxyprogesterone)、胺鲁米特(Aminoglutethimide)、雌氮芥(Estramustine)、乙酸甲羟孕酮(Medroxyprogesteroneacetate)、亮丙立德、氟他胺、托瑞米芬或戈舍瑞林
本文所描述的抗PAD4抗体亦可与疫苗接种方案组合。已设计出针对传染病及肿瘤的许多实验性疫苗接种策略(参见Rosenberg,S.,2000,Development of CancerVaccines,ASCO Educational Book Spring:60-62；Logothetis,C,2000,ASCOEducational Book Spring:300-302；Khayat,D.2000,ASCO Educational Book Spring:414-428；Foon,K.2000,ASCO Educational Book Spring:730-738；亦参见Restifo,N.及Sznol,M.,Cancer Vaccines,第61章，第023-3043页，DeVita等人(编),1997,Cancer:Principles and Practice of Oncology,第五版)。因此，在一些实施方案中，例如，本文中的抗体或编码本文中的抗体的疫苗构建物可与传染病或抗癌疫苗一起施用，或者与采用基于细胞(诸如树突状细胞)的疗法或疫苗样颗粒(VLP)的疫苗接种方案一起施用。
在其他情况下，本文中的抗体可与其他疗法组合施用，诸如在肿瘤、手术干预或其类似者的情况下的放射线疗法。
实施例
实施例1.抗PAD4抗体的产生、表征及人源化
使用重组人类PAD4蛋白质(rhPAD4)将五种PAD-/-小鼠免疫，以产生针对人类PAD4抗体。在56天内施用四次免疫剂量的rhPAD4，并在第59至60天收集小鼠脾细胞用于杂交瘤融合及培养。通过ELISA分析杂交瘤融合体与rhPAD4的结合。将测试呈阳性的细胞分离、培养、克隆并储存为杂交瘤克隆，以用于生产抗PAD4单克隆抗体。
对于各杂交瘤抗体克隆而言，使用桑格定序方法及标准生物信息学方法测定抗体重链及轻链可变域VH及VL的序列及前导序列。再次通过ELISA分析杂交瘤抗体克隆与PAD4的结合，且选择通过ELISA结合于PAD4的抗体进行进一步测试。
A.纯化及抗体表征方法
纯化方法。在进一步分析之前，自各杂交瘤的60mL经培养上清液中纯化抗体。使用预填充的蛋白A柱(GE Healthcare)进行纯化。在通过蛋白质A柱之前，将含有IgG1的各培养基调节至高盐及高pH。装载后，洗涤柱直至在流出液中发现不可检测的蛋白质，并用100mM磷酸盐缓冲液、25mM Tris(pH 2.5)洗脱。对于IgG2抗体而言，将上清液在中性pH下装载，并用PBS(pH.7.2)与100mM柠檬酸盐(pH 3.0)的1:1混合液洗脱。浓缩洗出液的峰值洗脱份，无菌过滤，测量OD280且储存于-80℃。基于吸亮度确定浓度：1mg/mL的抗体在1cm光程光析槽中预计在280nm处的吸亮度约为1.36。
亲和力测试方法。使用BLITZ仪器(Forte Bio,Menlo Park,California)，使用生物传感器芯片(Anti-GST chip,Forte Bio,目录号18-5096)，通过生物层干涉术(BLI)测定各抗体殖株对GST-PAD4融合蛋白的亲和力。用柠檬酸盐缓冲液、PBS或PBS/Ca将生物传感器处理15秒；将重组人类GST-PAD4添加于滴架上持续80秒，以用PAD4启动生物传感器；然后将抗体添加于滴架上持续80秒，以允许抗体与PAD4之间的结合；将PBS/PBS-Ca添加于滴架上持续60秒以去除未结合抗体。使用1.2.0.49版BLITZ Pro软件测定缔合速率常数kon、解离速率常数koff及平衡解离常数KD。
活性测试方法。进行另一种分析以测定抗体克隆对通过重组人类PAD4(rhPAD4)及重组人类PAD2(rhPAD2)产生瓜氨酸的影响。为了确定rhPAD4及rhPAD2的生物化学活性是否被抗体克隆抑制，将100nM的各重组蛋白质与浓度渐增的抗体克隆一起在37℃、在100mMTris-HCl(pH 7.6)、1mM CaCl2、2mM DTT及50mM NaCl中培育15分钟。添加BAEE(Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯盐酸盐)底物(Sigma-Aldrich)(10mM)，并使反应在37℃下进行30分钟。用液氮淬灭反应物且使用COLDER分析定量瓜氨酸产生(Knipp及Vasak,Anal.Biochem.2000,286,257-2641；Kearney等人Biochemistry 2005,44,10570-10582)。为确定PAD4活性％，在存在及不存在抗体克隆的情况下测定瓜氨酸产生。
B.抗体表征结果
使用上述方法，发现十二种抗体克隆具有显著的抗PAD4活性，如表1中所示。
图1A显示PAD4活性％，且图1B显示在250nM抗体浓度下使用活性分析测定的瓜氨酸产生的绝对量。在瓜氨酸产生分析中，若干抗体克隆抑制PAD4的酶促活性。相比之下，克隆6PAD4显示瓜氨酸化增加5.7倍，表明其活化PAD4活性。
发现克隆13及20以剂量依赖性方式抑制PAD4(图1C及图1D)。对于克隆13而言，VH及VL氨基酸序列及其CDR分别显示于图1E及图1F中。对于克隆20而言，VH及VL氨基酸序列及其CDR显示于图1G及图1H中。抗体实质上不抑制重组人类PAD2的活性，如图2中所示。
如下文所描述对抗体克隆13及20进行人源化且测试。
C.抗体克隆13及20的人源化
抗体克隆13及20经计算机仿真人源化，且随后如本文所描述制得及测试所得人源化抗体以产生抗人PAD4抗体，其在人类中的抗原性较低并且具有与亲本鼠类抗体一样好或更好的特征(例如亲和力、抑制活性及本文所描述的其他性质及活性)。选择鼠类氨基酸残基移植至人类免疫球蛋白生殖系序列上，目的是保留或提高鼠类抗体对人类PAD4的亲和力。
本文所描述的计算机仿真人源化方案用于所有鼠类克隆(包括克隆13及20)的通用方案，本文讨论其用于这些两个克隆的人源化。使用克隆13及20的可变域的氨基酸序列，根据Kabat或Chothia公式鉴别克隆13及20的可变重链(VH)及可变轻链(VL)的互补决定区(CDR)(参见例如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)；Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；有关根据Kabat及Chothia公式及其他公式定义CDR残基的信息，亦另参见bioinf.org.uk/abs/info.html#kabatnum。使用克隆13及20的VH和VL序列自人类免疫球蛋白功能基因库中搜寻V及J人类生殖系数据库中的重链(HC)和轻链(κ链；KC)序列(imgt.org/genedb/；Giudicelli V.,Chaume D.and LefrancM.-P..Nucleic Acids Res.,33:D256-D261(2005),Lefranc及Lefranc,Biomedicines,8(9):319(2020))。鉴别出与克隆13及20的鼠类序列具有最接近一致性的人类生殖系序列。使用来自克隆13或20的鼠类CDR氨基酸序列置换人类生殖系序列内的对应人类CDR氨基酸序列。
将鼠类抗体的构架区的氨基酸序列(FR)与人类抗体的对应FR比对。此比对用于鉴别与对应人类抗体残基非同源的鼠类抗体FR残基，因为这些残基可能为如下文所论述的回复突变的候选物。
构筑克隆13及20抗体的三维模型，以确定在人源化过程中是否可以耐受将给定位置处的鼠类氨基酸残基突变为其人类生殖系类似物，特别是预期此类氨基酸取代是否会展现出以下一种或多种作用：(1)与抗原非共价结合；(2)与CDR相互作用；(3)参与VL-VH界面的相互作用；(4)使免疫球蛋白结构稳定；或(5)形成糖基化位点。此外，确定用人类抗体FR序列中的对应氨基酸残基取代鼠类结构中的任何氨基酸残基是否会破坏这些作用中任一者。其主要是通过计算与单点突变(ΔGmutation)相关的自由能变化来确定的。若认为可能具有破坏性(ΔGmutation>0)，则原始鼠类氨基酸保留在某些人源化序列中的该位置，亦即在该位置进行人源化序列至鼠类序列的“回复突变”。然而，应注意，ΔGmutation虽然为突变诱发时蛋白质的整体稳定性变化的有用量度，但通常并不是选择回复突变的唯一标准。在下文用特定实施例在克隆13人源化的情形下说明此点。在各种情况下，分别人源化鼠类VH链及VL链。对于各链而言，设计许多人源化构建物，其构架回复突变各不相同，但CDR为保守的。VH-VL序列配对为根据其在内部配对数据库中的频率进行优先选择(优先选择较高频率的配对)。此内部数据库并入有公共信息(基于蛋白质数据库(www.rcsb.org)中提供的免疫球蛋白结构及已知的临床抗体)以及来自先前研究的非公开讯息，证明某些配对的有利表达。
在克隆20的情况下，在人源化步骤之后使得抗体保留PAD4结合亲和力，但具有与细胞外基质(ECM)蛋白的高度非特异性结合。因此，在那些抗PAD4抗体的开发中进行其他方法及分析，如下文所描述。
1.克隆13的人源化
在对根据上述方法设计的克隆13的人源化抗体进行实验测试时，发现其不包含期望的抗原结合及生物物理特征。检查亲本抗体与序列一致性最接近亲本克隆的人类生殖系抗体的序列比对提供重要的见解，即与VH CDR3相邻的Gly94残基(图1E)不存在于所选人类生殖系序列中。实际上，人类生殖系在同等位置具有Thr。将鼠类克隆13VH亲本序列(SEQ IDNO:10)中位置94处的Gly(其为高度柔性的氨基酸残基)置换为柔性较低的Thr残基，可能导致所得人源化构建物中的VH CDR3环周围的刚性增加。基于能量考虑因素(ΔGmutation)，虽然Thr原本为该位置的优选残基，但将Gly保持在位置94实际上比Thr更有可能维持结合抗原所需的VH CDR3环的构象灵活性，其为人源化抗体设计中的关键考虑因素。事实上，CDR移植物中Thr94的存在导致活性丧失，正如基于几种人源化抗体的实验测试所观测到的(数据未显示)。为了解决此问题，Thr经回复突变为亲本序列的Gly。除其他之外，人源化抗PAD4抗体设计中的此额外步骤导致抗体与PAD4有效结合，尽管亲本抗体及构架区中选定的人类生殖系的序列一致性相对较低。此外，所得人源化抗体保持正确的二级结构，并且与ECM蛋白的结合较低。
2.克隆20的人源化
与克隆13不同，克隆20的人源化抗体表达出与PAD4的高亲和力结合以及与ECM蛋白的高非特异性结合。对VH-VL配对的检查表明，最初选择用于VH及VL人源化的人类生殖系在抗体中不常见配对在一起。因此，自内部数据库中选择不同且更有利的轻链(LC)生殖系序列，该序列允许选择有利的VH及VL序列配对。此配对产生人源化克隆20抗体，所述抗体与亲体克隆20相比保留高PAD4亲和力，并且展现出ECM蛋白的结合减少。
3.克隆13及20的IgG生殖系
利用上述方法，选择人类IgG生殖系用于鼠类VH及VL序列的人源化(参见序列表，其表明“描述”栏中使用的生殖系)。
认为两对人类可变生殖系(VH生殖系IGHV1-46*01与VL生殖系IGKV4-1*01配对以及VH生殖系IGHV1-18*01与VL生殖系IGKV1-39*01配对)同样适合于对克隆20人源化，并相应地制造涉及克隆20的两对生殖系的人源化构建物。
对于克隆13及20而言，除了CDR移植的人源化构建物之外，考虑到结构考虑因素，亦制得具有某些回复突变的构建物。基于克隆13的抗体在本文中表示为hz13-1至hz13-12，而鼠类抗人类克隆13抗体则表示为mAb13。类似地，基于克隆20的抗体表示为hz20-1至hz20-14，而鼠类抗人类抗体则表示为mAb20。人源化克隆13及克隆20抗体的特性描述于以下实施例中。
实施例2：人源化抗体的表达及纯化
表达方法。将PAD4 mAb重链(HC)及轻链(LC)的编码序列克隆至pTT22闸或pTT5载体中。扩增构建物并用于使用Expi293表达系统(Thermo Fisher Scientific，目录号A14635)短暂转染Expi293F细胞。每公升细胞培养物使用0.5mg DNA转染。首先，为了检查表达量，以3ml规模筛选PAD4单克隆抗体，其中HC:LC比率为1:1及1:2。短暂转染后第5天收集样本，并使用系统(Sartorius)分析其力价。
为了以1L规模生产各抗体，使用2L康宁烧瓶将900ml Expi293F细胞以2.8×10e6个细胞/mL接种在Expi293表达培养基中。将0.5mg DNA/L培养物添加至50ml预热的OPTIMEM培养基中并轻轻混合。取决于初步筛选结果，所使用的HC:LC比率为1:1或1:2。使用前通过轻轻上下移液来混合ExpiFectamineTM 293。将1.35mL Expifectamine293添加至50mL预热的OPTIMEM培养基中并轻轻混合。培育混合物5分钟。使用的DNA:ExpiFectamineTM293比率为1:2.7。将稀释的ExpiFectamineTM 293试剂添加至稀释的DNA中，并通过涡旋混合以产生ExpiFectamineTM 293-DNA复合物。在室温下培育复合物20分钟。随后，将100mL转染混合物添加至含有900mL细胞的摇瓶中且在添加期间轻轻涡旋该摇瓶。将细胞在37℃及8％ CO2下在湿润气氛中以125rpm摇动培育。转染后16至20小时，将5.0mL ExpiFectamineTM 293转染增进剂1及50mL ExpiFectamineTM 293转染增进剂2添加至各烧瓶中。第5天，以2000rpm的速度离心样本来收集抗体。保存各样本的上清液并透过0.2μm过滤器过滤，以便为抗体纯化做准备。
纯化方法。首先使用在AKTA Pure25系统上以DPBS(Corning)预平衡的rProteinASepharose FF(Cytiva)亲和柱捕捉自HEK 293表达系统收集的PAD4 mAb上清液。捕捉后，用DPBS清洗柱直至达到基线，然后用80mM NaAc(pH 2.8)将PAD4 mAb洗脱至含有约1/10V(总洗脱体积)1M Tris-HCl(pH 8.0)的收集瓶中，以在洗脱时立即中和PAD4 mAb。将PAD4mAb的rProtein A洗脱池浓缩至较小体积，并透过SEC在26/600Superdex-200上进一步精加工，以去除任何聚集体或多聚体。合并最终的S200 PAD4 mAb单体峰，使用Mustang-Q针筒过滤器(PALL Corp)降低内毒素，并使用0.2μm过滤器进行过滤灭菌。
实施例3：人源化克隆13及人源化克隆20抗体的结合亲和力
将克隆13及20的人源化构建物型式转换成IgG1.3抗体。通过表面等离子共振(SPR)测量其与人类PAD4的结合。使用8K、8K+或T200仪器(Cytiva)进行SPR测量。自这些SPR测量值确定抗体与PAD4的缔合速率常数kon、解离速率常数koff及平衡解离常数KD。
对于SPR测量而言，使用抗人类捕捉表面或蛋白质A表面(Cytiva目录#29127555)抗人类捕捉表面是通过依照制造商的胺偶合方案(Cytiva目录号#BR-1006-33)将抗人类捕捉抗体(Cytiva目录号#29234600)固定至CM5或CM4生物传感器的流通槽上制备的。在37℃下使用HBS-P(150mM NaCl、10mM HEPES(pH 7.6)、0.05％ Tween-20)(TEKNOVA目录号H8032)以及另外的150mM NaCl及1mM或2mM CaCl2(参见表2)或2mM EDTA(参见表3)作为操作缓冲液来进行SPR实验。将抗体在操作缓冲液中稀释至1.5μg/mL，且在活性生物传感器流通槽上以10μL/min捕捉15至30秒。使用操作缓冲液制备多种浓度的PAD4(例如，克隆13及其衍生物浓度为0.59nM至75nM、或1.56nM至50nM，克隆20及其衍生物浓度为2.34nM至300nM)，并以30μL/min注射至所捕捉的抗体上。测量抗体与PAD4的缔合及解离。注射一次30秒，然后注射一次15秒10mM甘氨酸(pH 1.5)，用于在分析周期之间再生蛋白质A捕捉表面。对于抗人类捕捉表面而言，用两次30秒的3M MgCl2注射进行再生。在2mM CaCl2的存在下进行mAb20及mAb13 SPR的SPR测量。在1mM CaCl2存在下测试其余抗体。
速率常数kon及koff为自参考流通槽及0nM空白减去的传感图谱导出，并且在3.0.12.15655版Insigh0评估软件中与1:1结合模型拟合。观测到与1:1结合模型的偏差，其可能为由于较高浓度下PAD4的二聚化增加所致。平衡解离常数KD计算为各PAD4抗体的速率常数比koff/kon。抗体的kon值、koff值及KD值呈现于表2及表3中。对于在多个SPR实验中测试的那些抗体而言，来自两个或三个单独实验的平均值及标准偏差列于表2及3中。
结果表明，无论钙存在(表2)或不存在(由于EDTA结合所致)(表3)，抗体均以类似的亲和力结合PAD4。
实施例4：人源化抗体的酶动力学
酶促阻断分析。测试抗体对针对底物TSTGGRQGSHH(SEQ ID NO：216)的PAD4活性的抑制。PAD4将肽底物TSTGGRQGSHH中的精氨酸转化为瓜氨酸。此反应可经由RapidFireTM质谱(Agilent)监测。使用TSTGGRQGSHH测试抗体，以确定其是否能够抑制PAD4的活性，从而减少瓜氨酸产物的形成。分析缓冲液如下：100mM HEPES pH 7.4、200mM NaCl、2mM CaCl2及5mMDTT。分析条件如下：35nM重组人类PAD4，500μMTSTGGRQSHH肽，及2μl抗体溶液。此分析中各反应的总体积为20×L。所使用的停止溶液为10％甲酸。
将抗体在分析缓冲液中以3倍间隔连续稀释。最高抗体浓度比剂量反应曲线中使用的储备浓度低至少10倍。
使用上述分析缓冲液及条件在微量滴定盘中制备反应混合物。每个孔中使用2μl每种抗体溶液。在室温下培育反应混合物30分钟。为了停止反应，接着将10μl每种反应混合物与40μl 10％甲酸混合。在RapidFireTM质谱分析之前，将盘储存于-80℃。
将解冻样本装载至Agilent RapidFireTM 300及Agilent“C”(C18)滤筒上，使用含有0.09％甲酸/0.01％三氟乙酸的水作为移动相，以1.5ml/min的流动速率进行3000ms脱盐。一旦样本经装载及洗涤，使用含有0.09％甲酸/0.01％三氟乙酸的乙腈作为移动相，以1.25ml/min的流动速率将样本直接洗脱至Sciex API4000三重四极质谱仪上持续3000ms。在正ESI模式下分别以m/z＝562.3/969.7及m/z＝562.8/541.3监测底物及产物的MRM转变。各转变的停留时间设定为100ms，且所使用的ESI电压为5500，源温度为650℃。使用RapidFireTM积分器软件对每次转变提取的离子峰进行积分。这些值用于计算抑制百分比，其中抑制百分比＝(1-样本反应/对照反应)*100。使用PrismTM中的四参数Logistic Hill方程式拟合数据以确定IC50。所得IC50数据显示于表4中。
实施例5：人源化抗体的细胞外基质(ECM)评分
为确定人源化抗体是否可能非特异性结合至细胞外基质蛋白质，进行以下测试。在室温下用300μL阻断缓冲液(10％ FCS/TBS，Alfa Aesar目录号#J61327)培育96孔Corning薄层基质凝胶基质预涂的细胞外基质(ECM)培养盘一小时。在培育之后，将100μL新鲜阻断缓冲液中1、0.2及0.04μM的抗体添加至各孔中。六个孔没有添加样本来计算背景及ECM评分。样本培育1小时后，取出样本并以PBS-T洗涤缓冲液洗涤盘3次。每孔添加100μl10ng/mL山羊抗人类IgG-HRP结合检测抗体(Jackson ImmunoResearch目录号109-035-008)。在室温再培育一小时之后，用PBS-T洗涤缓冲液洗涤各孔3次。洗涤后，将100μl TMB底物(Surmodics目录#TMBW-1000-01)添加至每个孔中并使其反应15分钟，然后添加100μl 1M磷酸停止溶液。然后在微量盘分析仪上读取450nm处的吸亮度并在620nm处进行参考。表5中呈现的ECM评分是通过将样本孔的吸亮度值除以未添加样本的孔的吸亮度来计算的。较低的ECM评分通常为合乎需要的，因为其表明与细胞外基质蛋白质的结合较少。所有人源化克隆13构建物均显示较低的ECM评分，而约一半的人源化克隆20构建物显示出较高的ECM评分(等级为6或更高；选择此截止值为因为使用相同方案测试的所有48种临床批准的单克隆抗体均显示ECM评分低于6)。
实施例6：抗体疏水性
通过疏水相互作用色谱法(HIC)评估各人源化抗体的表面疏水性。将各抗体样本10μg装载至Agilent 1260Infinity II HPLC系统的TSKgel Butyl-NPR柱(4.6mm×3.5cm，2.5μm粒度，Tosoh P/N 14947)上。移动相A(0.1M磷酸钠pH 7.0、2M硫酸铵)与移动相B(0.1M磷酸钠溶液pH 7.0)的线性梯度为在25℃柱温度下以1.0ml/min的流动速率使用20分钟。人源化抗体的HIC保留时间(RT)列于表6中。基于HIC结果，当使用一组48种临床批准的单克隆抗体作为参考时，所有人源化抗体均具有可接受的表面疏水性。(在使用相同实验方案测试的这些临床批准的单克隆抗体中大约75％显示RT低于11分钟)。
实施例7：人源化抗体的稳定性
在此实施例中所描述的实验中，评估人源化克隆13及人源化克隆20抗体(各自具有如本文所公开的序列，包括IgG1.3恒定区，如实施例2中所描述表达及纯化)的稳定性。
A.冷冻/融化稳定性
通过进行5次冷冻/融化循环来测定抗体的冷冻稳定性。将浓度为1mg/mL及500μL/瓶的各抗体添加至2mL螺旋盖透明小瓶(Agilent)中。将小瓶放入Biocision CoolCellTM中并在-80℃储存2小时。取出CoolCellTM并在室温(约23℃)下置放2小时。总共重复5次并对样本进行分析。与最初的起始样本相比，经历冻结/融化循环的抗体没有显示任何显著变化(数据未显示)。
B.通过熔融温度、聚集温度及流体动力体积评估的热稳定性
1.方法
使用生物制剂稳定性筛选平台(Unchained Labs,Pleasanton,CA)以使用静态光散射、使用固有荧光及聚集温度(Tagg)值来确定熔融温度(Tm)，并用于使用荧光在热熔融前后进行动态光散射(DLS)。将抗体以1mg/mL装载至(i)20mM组氨酸、260mM蔗糖、50μMDTPA、0.05％ PS80(pH 6.0条件)及(ii)20mM Tris、260mM蔗糖、50μM DTPA、0.05％PS80(pH8.3条件)。在20℃下对样本进行DLS，采集时间为5秒，总共采集4次。在90℃的温度下再次进行热升温后的DLS。执行阶梯式热升温以确定始于20℃且结束于90℃的Tm值及Tagg值，升温速率为1℃/分钟，阶梯保持时间为30秒。使用分析软件进行数据分析。Tm值为使用温度阶梯之间的差值来确定的。Tagg值为使用266nm处的静态光散射(SLS)确定的。
2.结果
测定人源化PAD4抗体的熔融温度Tm以评估其热稳定性。如上文所描述在pH 6.0及pH8.3下测定Tm值及Tagg值且结果显示于表7中。总体而言，抗体在pH 6.0下表达出比pH 8.3更高的热稳定性，但hz13-1及hz13-7在pH 6.0及pH 8.3下具有相同的稳定性。在pH 6.0下的Tm值在约64℃至约69℃范围内，其对于抗体而言为典型的。pH 8.3下的Tm值在约58℃至约67℃范围内，表明抗体在较高pH缓冲液中通常具有较低热稳定性。同样，与在pH 8.3(61℃至69℃)下相比，抗体在pH 6.0(64℃至76℃)下具有更高的Tagg值。动态光散射(DLS)在热升温开始时进行，且所有构建物的流体动力学直径均显示为约10nm(数据未显示)，其对于抗体而言为典型的。
C.通过尺寸排阻色谱法(SEC)及肽定位体积评估的化学稳定性
3.方法
抗体处理。将抗体在温度控制条件下在4℃或40℃下储存于Binder培育箱中。将20mM组氨酸、260mM蔗糖、50μM DTPA、0.05％ PS80的浓度为1mg/mL的调配物(pH 6.0，其中每种抗体1mL/小瓶)添加至2mL螺旋盖透明小瓶中(Agilent)，且将封口膜胶带固定在顶部周围，以确保截短稳定性研究的初始严密密封。将小瓶储存于适当培育箱中。在第2周及第4周自各小瓶中取出500μL样本进行分析。通过尺寸排阻色谱法及肽定位分析化学可靠性。
尺寸排阻色谱法(SEC)。SEC用于测定在储存2周后及4周后抗体的尺寸均匀性。将Agilent 1260InfinityTM系统与AdvancebioTM SEC 4.6×300mm、2.7μm柱联合使用。操作缓冲液为100mM磷酸钾、250mM氯化钠，pH 6.8。将量为25μg的样本注入柱中，并以0.5mL/分钟的速率运行15分钟。在280nm处分析色谱图，并使用峰面积来确定单体、高分子量物质及低分子量物质的百分比。在运行前后使用来自Bio-Rad实验室的凝胶过滤标准，以确保柱完整性。
LC-MS胰蛋白酶肽定位及分析。使抗体在0.2％ Rapigest表面活性剂(WatersCorp.)存在下变性，并用二硫苏糖醇(DTT)在80℃还原30分钟，用碘乙酰胺(IAM)在室温避光烷基化30分钟，并在37℃在Tris pH 7.4中经胰蛋白酶消化4小时，然后进行酸性淬灭。
在与Q-ExactiveTM Plus质谱仪(Thermo Scientific,San Jose,CA)联用的ACQUITY UPLC系统(Waters,Manchester,U.K.)上分析肽。使用60min LC梯度将肽自WatersBEH C18柱(130A 1.7μm 2.1×150mm，产品编号186002353)中洗脱，加热至50℃。梯度设定为在46min内0.2％至30％溶剂B，流动速率为0.2mL/min。溶剂A为含0.1％甲酸的水，且溶剂B为含0.1％甲酸的乙腈。质谱仪在正离子模式下操作，ESI电压为3.5kV，毛细管温度：250℃，扫描范围：320-1800，鞘气流速：45。
通过BiologicTM软件(Protein Metrics,Cupertino,CA)分析肽定位数据，前驱体质量容差为6ppm，且片段质量容差为10ppm。将胺甲酰胺基甲基化设定为固定修饰，且针对氧化及去酰胺搜寻可变修饰。MS/MS质谱及修饰含量均经过手动验证及计算。监测肽的氧化、去酰胺化及异构化含量。相对修饰％为根据经修饰肽的AUC/(经修饰肽的AUC+天然肽的AUC)*100计算。
4.结果
SEC。SEC结果显示于图3A中。在4℃及40℃下，抗体的单体峰通常下降不到5％。所有抗体在4℃均显示极小变化(若存在)，过程为4周。在40℃下，与起始时间点相比，其显示低分子量(LMW)片段化显著增加，且显示高分子量(HMW)聚集体数量稳定或略有增加。
肽定位。通过肽定位检验人源化克隆20抗体中的四者。结果表明，在40℃下储存长达4周后没有实质化学修饰(图3B)。
通过肽定位检验人源化克隆13抗体中的四者：hz13-5、hz13-10、hz13-11及hz13-12。结果显示，人源化克隆13抗体在重链CDR1的D31处具有高达74％的异构化倾向(图3C至图3D)。在D31下观测到的异构化在hz13-5中比在其他三种克隆13衍生的抗体中少得多。其他位置未展示实质性化学修饰(图3C)。D31异构化很明显，但当透过SPR检查异构化抗体时，异构化并不影响抗体的结合(数据未显示)。
实施例8：减轻D31处的异构化
进行后续研究以评估减轻在上述筛选中观测到的重链CDR1位置D31处的异构化的方法。此实施例中所用的抗体具有如本文所公开的序列，包括IgG1.3恒定区，且如实施例2中所述地表达及纯化。
A.pH对异构化的影响
1.方法
对克隆13衍生物hz13-5及hz13-12进行pH筛选。由于异构化为热及pH依赖性的，因此在受控温度条件(4℃或40℃)下，在pH 6、6.5、7.0、7.5及8.0下检查这些两种构建物。对于pH 6.0及pH 6.5而言，所用调配物缓冲液为20mM组氨酸、260mM蔗糖、50μM DTPA、0.05％PS80。对于pH 7.0、7.5及8.0而言，所用调配物缓冲液为20mM磷酸钠、260mM蔗糖、50μMDTPA、0.05％ PS80。以1mg/mL的浓度检查样本；将1mL/小瓶的各抗体添加至2mL螺旋帽透明小瓶(Agilent)中，且将封口膜胶带固定在顶部周围以确保用于截短稳定性研究的初始严密密封。将小瓶储存于适当培育箱中。在第2周及第4周自各小瓶中取出500μL样本进行分析。通过尺寸排阻色谱法及肽定位分析化学可靠性。使用如上文实施例7中所描述的方法进行SEC及肽定位。
2.结果
hz13-12及hz13-5随pH及时间变化的SEC结果分别显示于图3E及图3F中。通过肽定位观测到，随着pH增加，异构化量减少。在pH 8.0下，hz13-12(图3G至图3J)及hz13-5(图3K至图3N)的异构化程度为不可检测的。然而，在6.5或更高的pH水平下，观测到去酰胺化作用，且去酰胺化随着pH的增加而增加。
B.D31E点突变的作用
1.方法
所研究的减少或消除在重链CDR1的位置D31处观测到的异构化的另一种策略是用谷氨酸置换在重链CDR1的位置31处的天冬氨酸(D31E突变)。其会导致同类电荷取代，并且由于R基团上的碳链较长，异构化速率可能会降低；其已被实验证实。
制备两种此类突变体：hz13-5 D31E及hz3-12 D31E。这些突变体在HEK细胞中产生、纯化，并进行超过2个月的热稳定性测试，其中测试为在Binder培育箱中在T0(储存前)及在4℃、25℃及40℃的受控温度储存后2周、4周及2个月的时间点进行。样本浓度为50mg/mL，调配物为20mM组氨酸、260mM蔗糖、50μM DTPA、0.05％ PS80(pH 6.0)。将100μL/小瓶的各抗体添加至带有插入物的2mL螺旋盖透明小瓶(Agilent)中，并将封口膜胶带固定在顶部以确保严密密封。将小瓶储存于适当培育箱中。在2周、4周及2个月时自各小瓶中取出50μL样本，以通过尺寸排阻色谱法及肽定位进行分析。
2.结果
hz13-12 D31E及hz13-5 D31E的SEC结果分别显示于图3O及图3P中。在4℃培育的D31E突变抗体样本在两个月内保持稳定，几乎没有变化。在40℃培育的样本显示LMW片段化略有增加，在可接受的限度内。肽定位结果表明hz13-12D31E(图3Q)及hz13-5D31E(图3R)均显示出可接受的化学稳定性。在40℃的高温下，D52/55/56残基处的异构化及Ns/Qs残基处的去酰胺化有增加的趋势。在较低温度下未观测到实质性化学修饰。
3结论
增加pH以减轻位置D31处的异构化往往会导致LC-CDR1中更多的去酰胺化，而D31E点突变不会导致此权衡。D31E突变抗体具有可接受的化学稳定性。因此，D31E突变被认定为减轻D31处异构化的有利方法。
实施例9：高浓度调配物的稳定性
对于皮下施用而言，必须以高浓度配制抗体。进行两组高浓度筛选实验。
进行hz13-5亲本及hz13-5 D31E突变体的高浓度热稳定性筛选。热稳定性研究超过3个月，其中在Binder培育箱中时间点为T0(时间零，储存前)及在2周、4周、2个月及3个月时在4℃、25℃及40℃的受控温度储存之后。抗体表达于HEK或CHO细胞中，纯化且以150mg/ml的浓度配制于20mM组氨酸、260mM蔗糖、50μM DTPA、0.05％ PS80(pH 6.5)中。将100μL/小瓶的各抗体添加至带有插入物的2mL螺旋盖透明小瓶(Agilent)中，并将封口膜胶带固定在顶部以确保严密密封。将小瓶储存于适当培育箱中。在2周、4周、2个月及3个月时自各小瓶取出50μL样本进行分析。通过SEC及肽定位分析化学可靠性。使用如实施例7中所描述的方法进行SEC及肽定位。
使用SEC分析3个月内分子的聚集及片段化。Hz13-5在40℃下直至3个月才显示HMW或LMW的变化，其中发现小幅增加(图3S)。在25℃下，LMW在2周、4周及2个月时略有增加。3个月时，LMW及HMW均有所增加，但在可接受的限度内。在40℃下，LMW在2周及4周时略有增加，且在2个月及3个月时，LMW出现显著增加，HMW亦略有增加。这些均在可接受的限度内。在4℃下至少3个月内未观测到显著变化。hz13-5 D31E抗体亦出现相同的趋势(图3T)。
在2周及4周时在pH 6.5下进行hz13-5亲本的肽定位(结果显示于图3U中)。在储存条件(4℃)下，位置D31处的异构化减至最少。在三个月内分析hz13-5 D31E的肽定位(结果显示于图3V)。虽然在压力条件下化学修饰有所增加，但该抗体在4℃在3个月内表达出可接受的稳定性。
实施例10：Hz13-5 D31E的经纯化调配物的稳定性
Hz13-5 D31E产生于CHO细胞中，加以纯化，且在pH 6.0下以54.6mg/mL的浓度调配于20mM组氨酸、250mM蔗糖、50μM DTPA、0.05％ PS80中。将100μL/小瓶的各抗体添加至带有插入物的2mL螺旋盖透明小瓶(Agilent)中，并将封口膜胶带固定在顶部以确保严密密封。将小瓶储存于适当培育箱中。热稳定性研究超过3个月，其中在Binder培育箱中时间点为T0(时间零，储存前)及在2周、4周、2个月及3个月时在4℃、25℃及40℃的受控温度储存之后。在2周、4周、2个月及3个月时自各小瓶取出50μL样本进行分析。通过尺寸排阻色谱法(SEC)及肽定位分析化学可靠性。使用如实施例7中所描述的方法进行SEC及肽定位。
Hz13-5 D31E具有可接受的稳定性概况，因为该材料在SEC概况(图3W)及4℃下的化学稳定性(图3X)中表达出最小的变化。
实施例11：PAD4对人源化克隆13及克隆20抗体的表位定位
分析人类PAD4蛋白与克隆13及克隆20抗体相互作用后的结合表位。用于此分析的方法为氢/氘交换质谱法(HDX-MS)及正交共价标记足迹分析技术，尤其是蛋白质快速光化学氧化(FPOP)、甘氨酸乙酯标记(GEE)及焦碳酸二乙酯(DEPC)。
A.表位表征方法
氢/氘交换质谱分析(HDX-MS)方法。首先，进行非氘化实验以产生重组人类PAD4的常见肽清单，并且产生人类PAD4与克隆13的Fab(SEQ ID NO:226及228)或与克隆20的Fab(SEQ ID NO:229及231)的蛋白质复合物。抗体浓度为15μM，且蛋白质与配位体摩尔比为1:1摩尔比。在HDX-MS实验中，将各样本5μL稀释至55μL D2O缓冲液(10mM磷酸盐缓冲液，D2O，pD7.0)中以开始标记反应。反应进行不同的时间段：20秒、1min、10min及60min。在各标记反应时段结束时，通过添加淬灭缓冲液(具有4M GdnCl及0.4M TCEP的100mM磷酸盐缓冲液，pH2.5，1:1，v/v)来淬灭反应。将50μL经淬灭样本注射至Waters HDX-MS系统中进行分析。在不存在或存在抗体的情况下监测常见胃蛋白酶肽中的氘吸收量。
蛋白质快速光化学氧化(FPOP)方法。通过FPOP对重组人类PAD4、人类PAD4与克隆13Fab(SEQ ID NO:226及228)的蛋白质复合物及人类PAD4与克隆20Fab(SEQ ID NO:229及231)的蛋白质复合物进行表位定位(10μM，1:1摩尔比)。使用KrF准分子激光以通过光解H2O2产生羟基自由基。激励波长设定为248nm以防止蛋白质中的激光诱导的构象变化。紧接在标记之前，将5μL组氨酸及5μL H2O2添加至蛋白质样本。蛋白质溶液的最终体积为50μL，组氨酸的最终浓度为500μM，且H2O2的最终浓度为15mM。接着将样本注射至具有UV透明窗的熔融二氧化硅套管中。以7.4Hz的频率将激光调节至70毫焦/脉冲。FPOP及无激光对照实验均重复进行三次。在含有11μL淬灭溶液(包含50nM过氧化氢酶及20mM甲硫氨酸)的微量离心管中收集各复本。使样本变性、还原、烷基化且用胰蛋白酶消化，随后进行LC/MS/MS分析。在不存在/存在抗体的情况下监测肽的氧化水平。仅将hPAD4与hPAD4/Fab之间的标记％有统计学上显著差异(基于司徒顿T-测试，P值<0.01)的残基视为受保护的残基。
GEE标记方法。将各1mg/mL的10μL样本(人类PAD4、人类PAD4与克隆13Fab的蛋白质复合物，及人类PAD4与克隆20Fab的蛋白质复合物)与1μL 2M GEE及1μL 50mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)在室温下混合10min来起始GEE标记。通过向样本中添加10μL 1M乙酸铵来淬灭反应。使17.5μL各GEE标记样本经受酶促消化。使样本变性、还原、烷基化且用胰蛋白酶消化，随后进行LC/MS/MS分析。仅将hPAD4与hPAD4/Fab之间的标记％有统计学上显著差异(基于司徒顿T-测试，P值<0.01)的残基视为受保护的残基。
DEPC标记方法。通过以8:1的DEPC:蛋白质摩尔比将各15μL样本(人类PAD4、人类PAD4与克隆13的Fab的蛋白质复合物，及人类PAD4与克隆20的Fab的15μM蛋白质复合物)与DEPC混合来起始DEPC标记。标记在37℃下进行10min，接着以1:50的比率用咪唑淬灭。就DEPC:咪唑摩尔比而言，使DEPC标记的样本变性、还原、烷基化且用胰蛋白酶或GluC消化，随后进行LC/MS/MS分析。仅将hPAD4与hPAD4/Fab之间的标记％有统计学上显著差异(基于司徒顿T-测试，P值<0.01)的残基视为受保护的残基。
B.表位表征结果
使用上述方法定位克隆13及克隆20的表位。首先，使用HDX-MS，hPAD4的序列覆盖度达到>98％。HDX-MS数据分析表明，克隆13及克隆20在hPAD4中具有不同表位(图4A至图4B)。克隆13之一级HDX表位为515FEGIKKKKQQKIKNILSNKTLREHNSF541(图4A；SEQ ID NO:217)。克隆13的二级HDX表位：501FQEQQNEGHGEALL514(图4A；SEQ ID NO:218)。克隆20之一级HDX表位为630INDFFTYHIRHGEVHCGTN648(图4B；SEQ ID NO:219)。克隆20的二级HDX表位为337CPEEENMDDQW347(图4B；SEQ ID NO:220)。
FPOP、GEE及DEPC标记方法证明了不同的残基特异性反应性并提供hPAD4的100％序列的互补信息。这些标记方法中的每一者均为单独进行的，并且在hPAD4的整个序列上检查每种方法的标记百分比，重点是如上文所描述通过HDX-MS确定的表位区域。受保护的残基为基于在hPAD4与hPAD4/Fab之间的标记％差异具有统计显著性(基于司徒顿T-测试，p值<0.01)确定的。图5A至图5B显示获自FPOP、GEE及DEPC标记实验的分层图。所示氨基酸残基对应于克隆13及克隆20的HDX表位区中的标记残基。具有统计显著性的受保护残基经鉴别如下：(1)由克隆13保护的残基：F515、E516、K519、K520、K521及K522；及(2)由克隆20保护的残基∶D632、Y636及H644/C645。图6显示在hPAD4的对应蛋白质序列上克隆13及克隆20的表位(通过HDX-MS、FPOP、GEE及DEPC标记所测定)(图6)。
实施例12：鉴别抗PAD4克隆13抗体上的表位
此实施例描述抗人类PAD4克隆13亲本抗体(mAb13)在与人类PAD4相互作用时互补位的定位。
A.用于互补位定位的HDX方法
使用氢/氘交换质谱法(HDXMS)探测互补位(mAb13与人类PAD4的结合位点)。进行非氘化实验以产生mAb13的重组Fab及人类PAD4与mAb13的蛋白质复合物(15μM，1:1摩尔比)的常见肽清单。通用HDX方法如以上实施例11中所描述。在不存在或存在人类PAD4的情况下监测常见胃蛋白酶肽中的氘吸收量。
B.互补位定位结果
在定位mAb13的互补位的过程中，重链(HC)及轻链(LC)两者均达到序列覆盖度>98％。亦即，HC获得98.7％的序列覆盖率，具有4.75％的冗余度，LC获得100％的序列覆盖率，具有4.96％的冗余度(图7A至图7B)。基于HDX保护水平确定互补位区域且显示于图8A至图8B中。对于HC而言，所鉴别的第一互补位区为27FNIKDHF33(SEQ ID NO:221)，其与重链互补决定区1(HC-CDR1)重叠(图8A)。针对HC鉴别的第二互补位区为94FYCAGYGNYEGAMDY108(SEQID NO:222)，其与重链互补决定区3(HC-CDR3)重叠(图8A)。对于LC而言，所鉴别的第一互补位区为26SENVNNYGIGFM37(SEQ ID NO:223)，其与轻链互补决定区1(LC-CDR1)重叠(图8B)。所鉴别的其他LC互补位区为137VCFLNNFY144(图8B；SEQ ID NO:224)(其对应于例示性人类LC恒定区中的片段VCLLNNFY(SEQ ID NO:235))。通过HDX-MS鉴别的主要互补位区域为HC-CDR1、HC-CDR3及LC-CDR1。由于所有人源化克隆13抗体均具有与亲本克隆13相同的CDR，因此互补位定位数据适用于克隆13的所有人源化变体。
实施例13：PAD4.克隆13Fab复合物的低温电子显微术(Cryo-EM)结构
使用低温-电子显微术测定PAD4与克隆13Fab的复合物的结构。
A.用于纯化PAD4及克隆13Fab的方法及用于复合及表征PAD4.克隆13Fab复合物的方法
将人类PAD4(1-663)基因克隆于pET28a载体(Novagen)中。PAD4蛋白质(N-His-TVMV-PAD4)(SEQ ID NO:3)表达于Rosetta2(DE3)pLysS大肠杆菌细胞中。将细胞以0.5mMIPTG诱导且在18℃下生长过夜。通过Ni-NTA亲和色谱法纯化蛋白质，然后在缓冲液50mMTris(pH 8.5)、500mM NaCl、1mM DTT、1mM EDTA中进行尺寸排除色谱法。
将克隆13Fab重链(HC)及克隆13Fab轻链(LC)克隆于pTT5载体中，其中在HC中具有C端His标签(分别为SEQ ID NO：226及228)。克隆13Fab(包含HC及LC)短暂表达于Expi-293细胞中。通过Ni-NTA亲和色谱法，然后在PBS中进行尺寸排阻色谱法来纯化克隆13Fab。
为纯化PAD4.克隆13Fab复合物，将经纯化的克隆13Fab与PAD4以三摩尔过量混合且在4℃培育过夜。随后在最终缓冲液(25mM Tris pH 8.0、250mM NaCl、1mM DTT及1mMEDTA)中进行尺寸排除色谱法。
B.Cryo-EM方法
为了制备网格，将3μL 1mg/mL PAD4.克隆13Fab复合物应用于新辉光放电的Quantifoil0.6/1 300编织网，并使用Vitrobot Mark IV(FEI)在4℃、100％相对湿度下吸水持续4秒，然后在液体乙烷中急冻。然后将网格运送至犹他大学生物化学系贝克曼冷冻显微术中心，置于干燥杜瓦瓶中，冷却至液态氮温度，以便收集数据。
为了收集数据，在犹他大学使用配备GIF量子能量滤波器(Gatan)及K3 Summit直接电子探测器(Gatan)的300kV Titan Krios显微镜(Thermo Fisher Scientific)记录4999个高倍放大率影片讯框。使用EPU软件记录像片讯框，校准像素大小为总剂量约离焦范围为-0.7至-2.0μm。
对于数据处理而言，使用cryoSPARC封装。首先使用cryoSPARC的“Patch Motion”对记录的影片讯框进行剂量分割及光束诱导运动校正。使用cryoSPARC的“Patch CTF”模块计算所有经过运动校正、对准及平均的影片讯框的对比度传递函数(CTF)。然后根据CTF估计分辨率、冰厚度及运动校正期间的总运动选择4017个影像。使用cryoSPARC中实施的斑点拾取器及基于模板的拾取组合拾取564,384个颗粒。随后使所拾取的颗粒经受2D分类。在2D分类后选择229,914个颗粒。接着使用cryoSPARC的从头开始的重构筑程序将这些所选颗粒分成两个池。随后将具有194,891个颗粒的较大池细化至约分辨率。然后使用另一轮从头开始的重构筑将194,891个颗粒进一步分为两类。随后将具有131,529个颗粒的较大颗粒池细化至约所有分辨率估计值均为基于黄金标准傅立叶壳相关临限值标准0.143。
对于模型建立及细化而言，使用UCSF Chimera软件将PAD4及克隆13Fab模型拟合至cryoEM图谱中。然后使对接模型分别在Coot及Phoenix中进行叠代模型建构及真实空间细化。Coot及Pymol用于结构分析。
C.PAD4.克隆13Fab界面处的CDR
PAD4.克隆13Fab复合物(图9A)被视为2:2(二聚体)组装体(图9B)。无法解析重链及轻链恒定区，且远离PAD4界面的部分VH区及VL区的cryoEM密度亦无法得到很好的解析。然而，明确定义PAD4.克隆13Fab界面。
鉴别个别CDR的作用及相互作用。各CDR均对在克隆13与PAD4复合时掩埋的克隆13Fab的表面积有贡献。观测到来自重链的所有三个CDR(HC中的CDR1、CDR2及CDR3)与PAD4相互作用。相比之下，在LC中，仅CDR1与PAD4发生显著相互作用。就复合时掩埋面积而言，各个CDR对与PAD4相互作用的贡献在下表8中给出。LC CDR1主要与PAD4发生疏水性/凡得瓦尔相互作用，其中LC CDR1的Y28-羟基与PAD4的Gly603形成氢键。
D.克隆13Fab抑制PAD4的作用机制
此实施例中所描述的cryo-EM结构的分析提供似乎合理的作用抑制机制。在底物肽结合形式中，PAD4的赖氨酸环(PAD4的氨基酸510至526，其含有PAD4的氨基酸519至522处的四赖氨酸延伸段)充当由氨基酸630至638形成的螺旋的盖子。氨基酸630至638处的螺旋对于活性位点中底物的正确定位可能很重要，因此由赖氨酸环稳定。(图11；改编自蛋白质数据库ID 2DEW(已提交的人类肽基精氨酸脱亚胺酶4与包括Arg8的组蛋白H3 N端尾部复合的晶体结构；下文称为(“2DEW”)，如rcsb.org/structure/2DEW；files.rcsb.org/pub/pdb/validation_reports/de/2dew/2dew_full_validation.pdf及PNAS(2006)103,5291-5296处所提供)。
另外，在PAD4.克隆13Fab复合物的cryoEM结构中(图12)，抗体诱导PAD4赖氨酸环的重构型。详言之，HC CDR3使PAD4赖氨酸环发生移位并产生用于克隆13Fab结合的新表位表面。发生移位的赖氨酸环现在参与和抗体的直接相互作用，碰撞到630至638各催化螺旋并导致螺旋紊乱。此紊乱预计会使底物结合位点失去稳定性并抑制PAD4酶促活性。如在2DEW中，有序移动环630至643在空间上不与克隆13Fab结合相容。
这些cryoEM结构结果与上述实施例12中讨论的HDX互补位定位结果一致，其表明HC-CDR1、HC-CDR3及LC-CDR1为主要互补位。
E.pH依赖性抗PAD4抗体
亦分析此实施例中所描述的cryo-EM结构以了解抗PAD4抗体的pH依赖性的结构基础(参见以下实施例14)。
实施例14：基于亲本抗体hz13-5的pH依赖性抗PAD4抗体的设计及表征
制备抗体突变体以获得pH依赖性抗PAD4抗体，其在中性或生理pH(诸如pH 7.4)下保留与PAD4的结合，但在酸性pH(诸如pH 6.0)下与PAD4具有较弱的结合。此抗体预计会在诸如滑液的环境中保留与PAD4的结合及复合，但一旦内化至细胞中，预计会在胞内体的酸性区室中与PAD4解离，导致PAD4被溶酶体关闭而降解且使抗体经由与FcRn的结合而循环回到表面；因此，pH依赖性使得抗体的降解减少。
A.突变扫描文库方法
突变扫描库被设计成使得该文库的各成员仅含有抗体的互补决定区(CDR)内的单一突变。CDR内的每个位置均突变为20个可能的氨基酸残基中的任一者，并且文库被设计为以此方式扫描抗体的所有6个CDR。因此，总共产生1360个单突变抗体，即基于克隆13的亲本抗体hz13-5。使用重叠PCR将突变扫描文库建构为scFv(Xu L等人(2002)Chemistry&Biology 9:933；Roberts RW及JW Szostak(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:12297；Kurz等人(2000)Nucleic Acids Res.28(18):E83)。为了确保每个文库成员只有一个突变，产生两个突变扫描文库：一个用于HC，另一个用于LC。例如，若突变扫描位于HC CDR中，则LC序列保持不变。
使用mRNA显示进行突变扫描文库的体外选择，使用先前描述的方法将个别成员制成mRNA-蛋白质融合分子(Xu L等人(2002)Chemistry&Biology 9:933；Roberts RW and JWSzostak(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:12297；Kurz等人(2000)Nucleic AcidsRes.28(18):E83)。在选择之前，将各文库的融合分子的等分试样留出用于下游分析(“输入”)。然后选择文库在pH 7.4及pH 6下与1nM生经生物素标记的人类PAD4结合，并使用KOH自链霉抗生物素蛋白洗脱结合成员。最后，扩增洗脱份分子的cDNA部分以及输入洗脱份，以便通过次世代定序(NGS)进行分析。
利用配对末端2×300运行对重链或轻链文库进行定序。将正向与反向读段配对，修剪质量得分Q≥30，按个别样本及选择条件的条形码进行分组，过滤全长HC或LC序列，并过滤野生型或仅含有HC或LC的CDR内单一突变取代的变体。不符合上述标准的序列被排除在进一步分析之外。将洗脱份中各文库成员的频率除以输入洗脱份中各文库成员的频率，以得出富集比(ER)。该值进一步针对野生型序列的值进行标准化，以允许将各变体与亲本序列进行比较，以评估该位置处特定取代的耐受性。ER值接近或等于1(亦即0.5<ER<1.5)的变体具有中性突变，其中氨基酸取代耐受结合，而ER值小于0.5的变体具有会不利地影响结合的突变。将计算出的文库各个成员的ER比率以热图的形式表示，以便易于鉴别与野生型序列在pH 7.4下具有相当结合力的变体，相反，与野生型序列在pH 6下相比，结合力降低。
B.结果
基于热图分析(图13A至图13L)，选择一组变体以进一步表征为完全IgG。这些变体含有单一突变(其中ER在pH 6下显示较弱的结合)或此类突变的组合，选择此类突变的组合的目的为评估该组合是否会在pH 6下产生更大的结合损失。将所选突变放入基于克隆13的抗体hz13-5中。其产生下表9中列出的31种变体，并测试其与人类PAD4的pH依赖性结合。所列出的突变与基于克隆13的抗体hz13-5相关。以下序列表中提供这些31种变体的完全可变区序列。
在上述测试的变体中，仅一种变体hz13-5 VH_D31H::Vk_I30H表达出与人类PAD4的pH依赖性结合。此突变体在pH 7.6下的结合活性与(未突变)hz13-5同人类PAD4的结合相当(参见图13M)。尽管亲本hz13-5保持在pH 6.0下结合，但突变hz13-5 VH_D31H::Vk_I30HpH6.0下展现出与人类PAD4的结合损失。参见图13N。
分析克隆13Fab的cryoEM结构以了解hz13-5 VH_D31H::Vk_I30H的pH依赖性结合的结构基础。举例而言，观测到D31的侧链与相邻H32的侧链相互作用(参见图10)。D31亦与K30相邻。HC中的此K30-D31-H32区域接近赖氨酸环(PAD4的氨基酸510至526)的四赖氨酸延伸段(PAD4的氨基酸519至522)。在酸性条件下，包含D31H突变的例示性抗PAD4将带正电荷，并且K30-D31H-H32残基将彼此排斥。该排斥将使PAD4-抗体相互作用失去稳定。在克隆13Fab的LC中，I30存在于疏水环境中。I30H突变将引入极性残基于该疏水性环境中，其亦可使PAD4-抗体界面失去稳定。
实施例15：抗PAD4克隆13及克隆20抗体展现低免疫原性
因为施用给患者的治疗性蛋白质可以产生被患者的免疫系统识别为外来抗原的肽抗原，所以其可引发不期望的免疫反应，通常体现为抗药物抗体(ADA)的产生。此过程的第一步为抗原呈现细胞(APC)(例如树突细胞(DC))上的HLA II类分子与肽抗原结合。此肽主要组织兼容复合物(MHC)复合物可由CD4 T细胞识别，其最终将诱导B细胞分化成浆细胞且导致ADA产生。
使用以下方法来表征基于克隆13的hz13-12抗体及基于克隆20的hz20-7抗体的免疫原性。
A.计算机仿真HLA结合方法
使用计算机仿真人类白血球抗原(HLA)结合工具，以通过对覆盖人类群体内的遗传多样性的多个HLA等位基因上跨越抗体的重叠15聚体的结合按顺序排序来建模及预测抗原与MHC II类的结合(Wang等人，PLoS Comput Biol,2008,4(4):p.e1000048.)。
使用商业计算机仿真免疫原性风险评估算法(Epivax)对跨8个人类HLA DRB1等位基因超型的肽MHC II类结合进行排序，以涵盖人群中存在的>90％的变异性(De Groot及Martin,Clin Immunol,2009,131(2):p.189-201)。
B.体外DC-T细胞分析方法
在HLA II类分子结合肽抗原之后，产生针对治疗性抗体的免疫反应的下一个关键步骤为CD4+T细胞的活化。此T细胞活化为由于识别抗原呈现细胞(APC)上的同源肽-MHC复合物(HLA)而发生的。使用不同的供体组进行体外周边血单核球(PBMC)分析，以基于分子在体外刺激抗原特异性CD4+T细胞的能力来确定分子是否含有功能性T细胞表位(Joubert等人，2016,11(8):p.e0159328)。
使用hz20-7、hz13-12、hz13-5及hz13-5 D31E进行关于能够活化未处理T细胞的T细胞表位的体外树突状细胞/T细胞(DC:T细胞)增殖分析。简言之，通过Ficoll(GEHealthcare,Chicago,IL)梯度离心分离来自健康志愿者的PBMC，并使用聚合酶连锁反应(PCR)扩增及与寡核苷酸探针(ProImmune,Sarasota,FL)杂交进行HLA分型。使用由与世界人口频率非常匹配的HLA-DR II类等位基因构成之一组40个PBMC供体进行分析操作。
使用基于负向选择珠粒的方法(Miltenyi Biotec Inc,Bergisch Gladbach,Germany)自PBMC中分离单核球，并在含有介白素(IL-4)及颗粒球巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)的DC培养基(Lonza,Basel,Switzerland)中培养3天以产生未成熟的DC。将这些细胞用以下进行脉冲：(1)基于克隆13的hz13-12抗体；(2)基于克隆20的hz20-7抗体；(3)Avastin(抗VEGF单克隆抗体贝伐珠单抗)作为对照抗体，其展现低免疫原性(Hua等人，JClin Pharmacol,2014,54(1):p.14-22)；或(4)IL-21R mAb(AT-107，一种全人类抗IL-21R单克隆抗体)作为对照抗体，其展现出高免疫原性。过夜培养后，彻底洗涤细胞，并将细胞在含有TNF-α、IL-1β、IL-6及PGE2的培养基中培育过夜。
将2,000个经脉冲的成熟DC添加至用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)(Invitrogen，Carlsbad，CA)标记的200,000个自体PBMC中以监测增殖，并使用六个复本及含有笔式链球菌(pen-strep)的DC培养基(Gibco,Waltham,MA)铺于96孔盘中。在七天之后，洗掉培养基且用抗人类CD4+APC(BD Biosciences,San Jose,CA)单克隆抗体标记细胞。通过洗涤步骤移除未结合抗CD4单克隆抗体。以含3.7％福尔马林(Sigma,St.Louis,MO)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)固定细胞，并以流动式细胞测量术进行分析，以确定增殖抗原特异性CD4+T细胞的百分比。
C.免疫原性结果
计算机仿真免疫原性结果显示于表10中。这些结果表明人源化抗PAD4抗体具有低免疫原性风险。发现抗PAD4抗体的免疫原性低于各种商业抗体(参见表格底部的比较抗体)。
体外分析结果显示于图14中。这些结果类似地指示hz20-7及hz13-12表达出低免疫原性。
在使用一组不同的40个健康PBMC供体的体外DC-T细胞分析中，hz20-7、hz13-12、hz13-5及hz13-5 D31E抗体分别在7.5％、5％、18％及10％供体中显示CD4+T细胞增殖性反应。参见图14。hz20-7、hz13-12及hz13-5 D31E的结果与低对照单克隆抗体(Avastin，贝伐珠单抗)的3.5％相当，其已表明在临床上具有低免疫原性。hz13-5的18％反应速率虽然高于Avastin的历史范围(5至12.5％)，但仍属于低免疫原性风险范围(<20％)。(Hua,F.、Comer,G.M.、Stockert,L.等人Anti-IL21 receptor monoclonal antibody(ATR-107):Safety,pharmacokinetics,and pharmacodynamic evaluation in healthy volunteers:A phase I,first-in-human study.The Journal of Clinical Pharmacology,2014,54:14-22.doi:10.1002/jcph.158)。
高对照单克隆抗体(ATR-107)在41％的供体中显示CD4+增殖，并且在临床研究中已显示具有76％的高ADA速率。(Hua,F,Comer,G M,Stockert,L等人Anti-IL21 receptormonoclonal antibody(ATR-107):Safety,pharmacokinetics,and pharmacodynamicevaluation in healthy volunteers:A phase I,first-in-human study.The Journalof Clinical Pharmacology.2014,54:14-22)。
基于计算机仿真序列分析及体外DC:T细胞增殖分析，hz20-7、hz13-12、hz13-5及hz13-5D31E抗体在人类中引发针对抗体的不期望的免疫反应的风险被确定为低。
实施例16：抗PAD4抗体hz13-5及hz13-5 D31E在体外抑制PAD4活性
接下来测试抗体在体外抑制底物上PAD4的活性的能力。
A.ELISA方法
将微量滴定盘(96孔Nunc MaxiSorpTM ELISA盘；Thermo Fisher Scientific目录号44-2404-21)在PBS中用通过 合成的1μg/ml含有精氨酸的线性肽涂布，且在4℃下培育过夜。用ELSA洗涤缓冲液(Cayman目录号400062,目录号400035)洗涤培养盘三次。在含有50mM NaCl、2mM CaCl2、1mM DTT(Invitrogen，目录号P/N 46-2250)及25mM HEPES(Gibco目录号15630-080)的缓冲液中，以13.5nM(1μg/mL)、27nM、54nM及108nM(8μg/mL)的浓度预培育重组人类PAD4(rhPAD4)(Cayman Chemical#10500,Ann Arbor,MI)。然后将各预培育溶液与等体积的抗PAD4抗体hz13-5 D31E或同型对照抗体hIgG1.3f混合，在分析缓冲液中连续稀释以达到在0.13nM至66.7nM范围中的抗体浓度。将重组PAD4及抗体混合物在4℃培育60min。将100μl各反应物添加至肽涂布的微量滴定盘的各孔中。将培养盘在37℃培育过夜，且随后用洗涤缓冲液洗涤三次，且用阻断缓冲液(Invitrogen目录号DS98200)阻断1小时，然后用洗涤缓冲液进一步洗涤各孔，并与100μl辣根过氧化物酶(HRP)结合的抗瓜氨酸单克隆抗体克隆1D9(Caymanchemicals,目录号30773,1:2000于PBS-0.05％ -20中)一起在室温下培育1.5小时。随后，在洗涤缓冲液中洗涤培养盘三次且与过氧化酶底物(TMB)一起培育。30分钟后，通过添加2N硫酸(VWR目录号VW3500-1)停止色彩反应使用SpectraMaxTM 190在450nm处测量光密度(OD)。使用Soft Max ProTM 7.1获取数据。
按照制造商的方案，使用HRP结合试剂盒(Abcam目录号ab102890)制得HRP结合的抗瓜氨酸单克隆抗体克隆1D9。将10μl改质试剂添加至90μl抗瓜氨酸抗体中。将混合物直接添加至冻干HRP混合液上。将小瓶在室温下遮光静置3小时。培育之后，添加10μl淬灭试剂且轻轻混合溶液。结合物在30分钟之后不经进一步纯化即使用。
所有分析重复进行三次。所有数据均显示为重复三次测量的平均值及范围。抑制百分比为在减去背景OD之后通过OD值相比于单独的PAD4的指定浓度的降低百分比来计算的。结果呈现为IC50值，其为使用Prism 9.4.0(GraphPad Software,SanDiego,CA)计算。IC50是通过非线性回归曲线与One site-Fit logIC50拟合测定的。
B.hz13-5 D31E在体外抑制PAD4
通过瓜氨酸ELISA所测定，抗体hz13-5 D31E以剂量依赖性方式抑制PAD4活性。IC50随着rhPAD4的浓度增加而按比例增加。13.5nM(1μg/ml)及108nM(8μg/ml)rhPAD4的代表性曲线显示于图15中。对于13.5nM、27nM及54nM的rhPAD4浓度而言，同型对照抗体显示出对高达66.7nM的rhPAD4没有效果；且对于108nM的rhPAD4浓度而言，显示出对高达133nM的rhPAD4没有效果。重复该实验三次。表11显示实验各轮的IC50，随后是三轮操作的平均值及标准偏差，显示hz13-5 D31E抑制所测试肽中精氨酸的瓜氨酸化，其中取决于rhPAD4的浓度，IC50值约为0.5至5.0nM。
亦用hz13-5抗体(IC50为在13.5nM rhPAD4下0.70+/-0.34至在108nM rhPAD4下5.02+/-0.88)及用下文实施例19中描述的抗鼠类PAD4抗体进行类似的实验。
实施例17：基于克隆13的抗PAD4抗体减少瓜氨酸化组蛋白且减少细胞因子表达及分泌
在此实施例中，分析抗PAD4抗体减少细胞外瓜氨酸化H3及细胞因子在经脂多糖(LPS)刺激的人类血液单核球中分泌的能力。
A.LPS刺激的单核球分析方法
测试数种基于克隆13的抗体。正如在其他实施例中(除非另有具体描述)，否则用IgG1.3f恒定区(SEQ ID NO:178)转换抗体型式。抗体如下(1)hz13-5、(2)hz13-5 D31E、(3)hz13-3、(4)hz13-12、(5)hz20-2、(6)hz20-7、(7)同型对照hIgG1.3f。
通过免疫磁性负向选择，使用EasySepTM人类单核球分离试剂盒(StemCell,目录号19359)自新鲜人类PBMC分离人类单核球(CD14+CD16-)。洗涤经分离的人类CD14+单核球且在分析培养基IMDM(Gibco,目录号31980-030)及10％胎牛血清(FBS)中培养。
将7×104个人类CD14+单核球添加至96孔u形底聚苯乙烯培育盘的各孔中。将单核球与不同浓度的基于克隆13的IgG1.3f抗体或同型对照抗体及10μg/mL LPS一起培育。各孔中的培育体积为200μL。在37℃、5％ CO2下培育培养盘24小时。
收集上清液以通过ELISA试剂盒(Cayman Chemical,目录号501620)检测细胞外瓜氨酸化组蛋白H3(Cit-H3)且通过Alphalisa(Perkin Elmer,目录号AL216)检测所分泌GM-CSF及其他细胞因子。使用细胞裂解物分离mRNA，以通过qRT-PCR进行基因表达。使用Excel及GraphPad Prism软件分析数据。
B.功能性结果
基于克隆13的抗体以剂量依赖性方式减少细胞外Cit-H3的量(图16A至图16F)。抗体亦减少GM-CSF的分泌(图17A至图17F)及GM-CSF的基因表达(图18A至图18B)。抗体亦遏制诸如TNFα及IL-1β的其他细胞因子的分泌及基因表达(数据未示出)。
另外，初始成像研究亦显示，抗PAD4抗体可进入经LPS刺激的单核球(参见下文实施例18)。总体而言，所述结果表明这些抗体可以在细胞内发挥作用，从而抑制细胞因子的分泌及基因表达。
实施例18：通过单核球共内化抗PAD4抗体
因为抗PAD4抗体阻断GM-CSF分泌及基因表达，故假设抗PAD4抗体必须进入细胞以结合PAD4。此实施例描述抗PAD4抗体hz13-5 D31E在单核球中的成像，其表明该抗体被单核球内化。
A.活细胞成像方法
使用活细胞分析(Sartorius)实时收集及分析活细胞影像。使用StemCell Technologies的EasySepTM单核球分离试剂盒(目录号19669)自含有EDTA的健康人类全血中分离CD14+单核球。
使用Fabfluor-pH抗体标记染料(目录号4812)标记抗体。将标记染料用100μL无菌水复水，并与抗PAD4 hz13-5 D31E抗体或同型对照抗体以1:3的比率在不含酚红的RPMI中于37℃一起培育15分钟。
将CD14+单核球悬浮于含有250nM Cytotox Green试剂(目录号#4633)的Gibco不含酚红的RPMI(目录号11835030)中，并以50mL细胞/孔铺于Imagelock培养盘(目录号4379)中。将标记的PAD4抗体、标记的同型对照或不含抗体的Fabflu染料添加至细胞中。在添加结合抗体后15分钟时，将LPS(最终浓度为10mM)或含有PBS的培养基添加至各孔中。将培养盘置于仪器中且每30分钟以20×放大率扫描持续48小时。使用软件进行分析。
B.活细胞成像结果
活细胞成像结果显示hz13-5 D31E抗体由单核球内化(图19A)。通过红色荧光-pH染料的出现随时间推移的增加所指示，在酸性细胞区室(pH范围为4.5至5.5；例如晚期胞内体)中检测到Hz13-5 D31E(图19A)。6小时后在单核球内检测到hz13-5 D31E抗体(图19B)。内化水平在培育24及48小时时逐渐增加(图19B)。在存在及不存在LPS刺激下发生抗体内化(图19B)。同型对照亦由单核球内化，但含量比PAD4抗体低(图19B)。
这些结果指示抗PAD4抗体的内化。此实施例及先前实施例中所提供的结果表明抗PAD4抗体可以在单核球中细胞内起作用，从而遏制细胞因子基因表达及分泌。这些研究结果表明抗PAD4抗体可以阻断PAD4(细胞外与细胞内)的功能。
实施例19：制备针对鼠类PAD4的抗体
用于产生抗鼠类PAD4抗体的小鼠杂交瘤方法
人类与小鼠PAD4(mPAD4)之间的同源性为73％，且本文所公开的抗人类PAD4 mAb(克隆20及其衍生物以及克隆13及其衍生物)未展现出与mPAD4的结合，由此需要单独操作以鉴别小鼠替代抗体。进行的最初的尝试为用昆虫细胞中产生的重组HIS-TVMV-mPAD4蛋白对Balb/C小鼠进行免疫。在未发现免疫反应之后，使用PAD4基因敲除C57bl/6小鼠。通过每周6至9次注射与RIPA佐剂混合的相同蛋白质免疫原对12只动物进行免疫。收集脾脏且均匀化以获得脾细胞。
通过与小鼠骨髓瘤融合搭配物SP2/0-Ag14(ATCC CRL-1581TM)电融合来产生杂交瘤。将融合细胞铺至选择性HAT培养基中的多孔盘中持续6至10天，且随后通过ELISA及HTRF筛选抗体分泌及与HIS-TVMV-mPAD4抗原的结合。这些融合产生467个特异性结合至小鼠PAD4(mPAD4)蛋白质的亲本杂交瘤。然后对选定的杂交瘤进行一轮次克隆并再评估抗原结合。扩增124个阳性杂交瘤次殖株，并纯化其抗体，以便通过SPR及功能性小鼠PAD4(mPAD4)酶阻断分析进一步表征。
抗鼠类PAD4抗体的表征方法
SPR方法。一般而言，SPR方法为如上实施例3中所描述，具有以下修改。使用的抗鼠类捕捉表面是通过按照制造商的胺偶合方案(Cytiva目录号BR-1006-33)将抗鼠类捕捉抗体(Cytiva目录号BR100838)固定至CM5生物传感器的流动槽上来制备的。SPR实验为在37℃下使用HBS-P(150mM NaCl、10mM HEPES，pH 7.6、0.05％ Tween-20)(TEKNOVA目录号H8032)以及额外的500mM NaCl及2mM CaCl2作为操作缓冲液进行。使用操作缓冲液制备自0.8nM至150nM的数种浓度的PAD4。测量抗体与PAD4的缔合及解离。两次90秒注射10mM甘氨酸(pH1.7)用于再生抗鼠类捕捉表面。
酶促抑制分析。在酶促阻断分析中测试抗体对于针对底物TSTGGRQGSHH(SEQ IDNO:216)的鼠类PAD4活性的抑制。PAD4将肽底物TSTGGRQGSHH中的精氨酸转化为瓜氨酸。使用TSTGGRQGSHH测试抗体，以确定其是否能够抑制PAD4的活性，从而减少瓜氨酸产物的形成。此反应可经由RapidFireTM质谱(Agilent)监测。一般而言，与此分析有关的材料及方法如以上实施例4中所描述，具有以下修改：(1)分析条件如下：50nM重组mPAD4(CaymanChemical,目录号28910)、500μM TSTGGRQGSHH肽及2μl抗体溶液；(2)在微量滴定盘中制备反应混合物之后，在室温下培育混合物90分钟。
结果
发现筛选获得的超过80种抗体具有100nM或更低的KD值，而这些所测试抗体中的56种显现出80％或更高的mPAD4抑制。自这些56种抗体中选择一种抗体mumAb以用于本文所描述的后续实验，并将型式转换为mIgG1-D265A。使用上述SPR及酶促阻断分析确定所选抗体的功能特征，并且结果提供于下表12中。
所选的小鼠抗mPAD4抗体具有如下序列表中列出的重链及轻链可变区序列以及CDR序列。
实施例20：抗鼠类PAD4鼠类抗体调节急性肺部发炎模型中的体内PAD4活性
使用LPS急性肺部发炎(ALI)药物动力学(PK)-药效学模型来测定所选抗mPAD4鼠类抗体mumAb(参见实施例19)在患有急性肺部发炎的野生型(WT)小鼠的体内活性。LPS诱导的肺部发炎及关节发炎模型有助于确定关节及非关节组织中mPAD4与hPAD4抗体的Pk/PD关系。
与鼠类ALI模型相关的方法
通过皮下(SC)注射抗PAD4抗体(n＝6)、同型对照抗体(IC)(n＝6)或媒剂(n＝6)来处理C57Bl/6WT小鼠(n＝总共24)(第-1天)。通过以30mg/kg或100mg/kg sc注射施用抗体。以100mg/kg施用IC。在施用抗体/媒剂一天后(亦即第0天)，用2mg/mL LPS(Sigma)对小鼠进行雾化。一组小鼠(n＝6)为以PBS代替LPS进行处理，并被指定为未处理小组。雾化后48小时，自肺部收集支气管肺泡灌洗液(BALF)。将BALF样本离心，并通过LC/MS测量上清液中的细胞外瓜氨酸化组蛋白3(Cit-H3)作为药效学(PD)读数。细胞外Cit-H3的抑制％是通过比较经mumAb处理的小鼠中的细胞外Cit-H3的量(表示为瓜氨酸化H3的量与总H3的比率，如图20中所示)与经IC处理的小鼠中的细胞外Cit-H3的量来确定。mumAb的功效是通过细胞外瓜氨酸化组蛋白-3(Cit-H3)的减少％(图20中的抑制％)反映。
抗鼠类PAD4鼠类抗体减少LPS ALI模型中的瓜氨酸化
测试抗鼠类PAD4 mAb mumAb在LPS ALI模型中抑制PAD4功能的能力，其为由在BALF中细胞外Cit-H3的减少反映(图20)当与用IC抗体处理的小鼠的BALF相比时，用30mg/kg mumAb处理的小鼠的BALF中Cit-H3减少约74％，且用100mg/kg mumAb处理的小鼠的BALF中Cit-H3减少约83％(图20)。在未处理小组中未测量到细胞外Cit-H3。
这些结果显示抗PAD4抗体减少BALF中H3的瓜氨酸化，并表明抗PAD4抗体抑制PAD4在发炎肺部中起作用。
实施例21：抗鼠类PAD4鼠类抗体调节急性关节发炎模型中的体内PAD4活性
使用LPS急性关节发炎(AJI)药效学(PD)模型来测定抗鼠类PAD4鼠类抗体(mumAb)在WT小鼠关节中的体内活性。
与鼠类AJIPD模型相关的方法
通过如以上实施例20中所述的皮下(SC)注射抗PAD4抗体或同型对照抗体(IC)处理C57Bl/6WT小鼠，且进行以下修改。
以1mg/kg、5mg/kg、220mg/kg或100mg/kg施用抗PAD4抗体。以100mg/kg施用IC。抗体/媒剂处理后的第二天(亦即第0天)，通过关节内注射(ia)向每只小鼠施用50μg LPS。48小时后，自髌骨及滑膜中提取细胞外蛋白质。自膝关节切下小鼠髌骨及滑膜，并在37℃用培养基外植3小时。这些方法步骤显示于图21A至图21B中。
制备髌骨外植体匀浆，并通过LC/MS测定这些匀浆的上清液的细胞外Cit-ITIH4和Cit-PRG4作为PD读数。将细胞外Cit-ITIH4及Cit-PRG4的减少％确定为经抗PAD4抗体处理的小鼠中细胞外Cit-ITIH4及Cit-PRG4(相对于相关蛋白质的总量表示)与经IC处理的小鼠中细胞外Cit-ITIH4及Cit-PRG4的百分比。
抗鼠类PAD4鼠类抗体减少LPS AJI模型中的瓜氨酸化
测试抗鼠类PAD4 mAb(mumAb)抑制PAD4在LPS AJI起作用的能力，其通过髌骨外植体上清液中细胞外Cit-ITIH4及Cit-PRG4的减少所反映(图22A至图22B)。用抗PAD4抗体处理的小鼠显示Cit-ITIH4减少高达70％(图22A)及Cit-PRG4减少高达97％(图22B)。
这些结果表明抗PAD4抗体显著降低髌骨外植体上清液中ITIH4及PRG4的瓜氨酸化，并指示抗PAD4抗体抑制PAD4在急性发炎关节中起作用。
实施例22：抗鼠类PAD4鼠类抗体调节慢性关节发炎模型中的体内PAD4活性
使用LPS慢性关节发炎(CJI)药效学(PD)模型来测定抗鼠类PAD4鼠类抗体(mumAb)在WT小鼠关节中的体内活性。
与鼠类CJIPD模型相关的方法
一般而言，此实施例中所用的方法如以上实施例21中所描述，具有以下修改。
与AJI模型不同，对小鼠进行三轮抗体及LPS注射处理，以模拟慢性关节发炎病状。在每一轮中，在LPS ia注射前一天通过SC注射施用抗PAD4抗体及IC(图21A)。在第-1、5及11天施用这些注射。在每次用抗PAD4抗体或IC处理后的第二天，通过ia注射施用50μgLPS(亦即，在第0、6及12天(图21A至图21B))。第三次LPS ia注射后48小时，制备髌骨外植体匀浆，并分析这些匀浆的上清液的细胞外Cit-ITIH4及Cit-PRG4。
抗鼠类PAD4鼠类抗体减少LPS CJIPD模型中的瓜氨酸化
测试抗PAD4抗体抑制PAD4在LPS CJI模型中起作用的能力，其通过髌骨外植体上清液中细胞外Cit-ITIH4及Cit-PRG4的减少所反映(图23A至图23B)。用抗PAD4抗体处理的小鼠显示Cit-ITIH4减少高达88％(图23A)及Cit-PRG4减少高达97％(图23B)。来自经1mg/kg或更多抗PAD4抗体处理的小鼠的样本显示Cit-PRG4减少94％或更多(图23B)。
这些结果表明抗PAD4抗体显著降低髌骨外植体上清液中ITIH4及PRG4的瓜氨酸化，并指示抗PAD4抗体抑制PAD4在慢性发炎关节中起作用。
实施例23：抗鼠类PAD4鼠类抗体调节姥鲛烷诱导的腹膜炎模型中的体内PAD4活性
测试抗鼠类PAD4 mumAb在短期药效学(PD)模型中抑制数种体内PAD4依赖性反应的能力。
用于小鼠处理及姥鲛烷攻击的材料及方法
在此实施例中所描述的研究中使用以下材料及仪器。(1)姥鲛烷；Sigma；目录号P2870-100ml。(2)雌性BALB/c小鼠，10至12周龄。(3)抗PAD4 ab mumAb。(4)同型对照抗体(IC)。(5)1×PBS，其含有4mM EDTA pH 7.4；Teknova；目录号P0203。(6)ACK裂解缓冲液；Gibco；目录号A10492-01 100ml。(7)MACS缓冲液；Macs Militenyi Biotec；目录号130-091-221。(8)标准FACS抗体。(9)Luna-II自动细胞计数器；Logos Biosystems。(10)96孔U形底培养盘。(11)胎牛血清(FCS)；Summit；目录号S-100-050；(12)DPBS；Gibco；目录号14190。(13)FACS管；BD Biosciences；目录号352063。(14)40-μM组织过滤器；BD Falcon；目录号352350。(15)GentleMACS C TUBES；Millitenyi；目录号130-096-334。(16)固定及渗透溶液；BD Biosciences；目录号554722。(17)Fc阻断物；ebiosciences；目录号14-0161-86。(17)多组织解离试剂盒；Miltenyi；目录号130-110-203。(19)AF647结合试剂盒；abcam；目录号AB269823。(19)AF488结合试剂盒；abcam。
使用10至12周龄的BALB/c雌性小鼠。基于体重将小鼠随机分为5个处理组，如下表13中所示。
分别以10mg/kg、30mg/kg及100mg/kg向第III组、第IV组及第V组中的小鼠施用mumAb。在第-1天，亦即在姥鲛烷攻击之前24小时施用治疗。在无菌PBS中制备mumAb。用100mg/kg IC处理第II组小鼠。所有治疗的给药体积为每公斤体重10mL。
经由腹膜内(ip)注射向小鼠施用姥鲛烷(亦即，姥鲛烷攻击)。在第0天，亦即在用mumAb处理后24小时向第II组至第V组的小鼠施用500μl姥鲛烷。第I组小鼠接受生理盐水的ip注射。
在姥鲛烷攻击之后16小时，麻醉小鼠，且收集血浆样本。亦使小鼠安乐死，且通过ip注射施用2mL PBS-EDTA溶液。对小鼠的腹部进行按摩持续20至30秒。接着，使用2mL注射器将2mL经注射PBS-EDTA溶液连同腹膜液及细胞一起抽吸。
将腹膜液和细胞转移至离心管中并保存在冰上直至处理。将腹膜液及细胞样本在1500rpm及4℃下离心5min。将样本的上清液储存在-80℃，直至通过ELISA进一步分析细胞外Cit-H3、细胞外PAD4、髓过氧化物酶(MPO)及嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)。使用分析测量血浆及腹膜液样本中的细胞因子及趋化介素含量。
在一些情况下，必要时用红血球(RBC)裂解缓冲液裂解腹膜细胞沉淀团，在MACS缓冲液中洗涤，并在4℃下以1500rpm离心5min。使用细胞计数器，诸如Luna-II自动细胞计数器记录腹膜细胞计数。在一些情况下，将腹膜细胞沉淀团再悬浮于MACS缓冲液中，并分成单独的集合(panel)，以进行NETois/METosis及瓜氨酸化染色。
NETosis/METosis及瓜氨酸化染色方案及材料
MEtosis为自单核球或巨噬细胞释放由散布着组蛋白及细胞蛋白的细胞DNA组成的细胞外陷阱的过程。此种由METosis或NETosis(嗜中性粒细胞起源)形成的网状物质对于防御微生物很重要，而且亦为自体免疫病理学及无菌发炎的主要驱动因素。通过SytoxGreenTM(SG)、髓过氧化酶(MPO)及嗜中性粒细胞评估NETosis。通过SG、MPO及单核球/巨噬细胞评估METosis。
SG/MPO的染色程序(集合1-表面集合-NETosis/METosis)如下。
将细胞与Fc阻断物一起在冰上培育15min(每个样本1μL小鼠Fc阻断物)且用50μL于MACS缓冲液中制备的表面染色抗体混合液在冰上染色15min。
Sytox GreenTM工作溶液通过将Sytox green储备溶液进行1:3000稀释以达到1.667μM的浓度来制备。
通过将100μL DMSO添加至ZombieTM aqua小瓶中来制备ZombieTM aqua混合液。此溶液用于细胞的活/死染色。
添加50μL SytoxTM green及50μL ZombieTM aqua混合液，且将混合物在冰上进一步培育15min。将染色样本在1500rpm及4℃下离心5min。用MACS缓冲液洗涤培养盘两次。
添加100μL经稀释的CytofixTM(1份CytofixTM及4份MACS缓冲液)，混合且在冰上培育15min。用MACS缓冲液洗涤细胞两次且在4℃储存于培养盘中过夜。
次日，用MACS缓冲液洗涤细胞。向各样本中添加100μL PE二级抗体(于MACS缓冲液中1:1000稀释)且在冰上培育样本30min。
用Cytofix缓冲液(亦即1份Cytofix及4份MACS缓冲液)洗涤样本两次。将细胞在200μLMACS缓冲液中复原。所有样本均使用FACSCantoTM流动式细胞测量术系统分析。
PAD4/柠Cit-H3的染色程序：集合2-细胞内集合-瓜氨酸化。
将细胞与Fc阻断物一起在冰上培育15min，且将细胞用50μL表面染色抗体混合液在冰上染色15min。添加50μL ZombieTM aqua混合液，且将样本在冰上进一步培育15min。将样本在1500rpm及4℃下洗涤两次持续5min。
向各样本中添加150μL CytofixTM/cytoperm。混合样本且在冰上培育20min。用MACS缓冲液洗涤细胞两次且在4℃储存于培养盘中过夜。
抗体结合方法。对于PAD4的结合而言，使用AF488结合试剂盒将含100μgPAD4-3D1蛋白质的DPBS与AF488结合。进行结合反应过夜。对于Cit-H3的结合而言，使用AF647结合试剂盒将含100μg DPBS中的Cit-H3与AF647结合。进行结合反应过夜。
将细胞用200μL来自AF488结合试剂盒的1×渗透缓冲液在冰上渗透20至30min。将细胞用含50μL细胞内调配混合物(含有PAD4-F488、Cit H3-AF647及CD206)的1×渗透缓冲液在冰上染色30min。
将样本用MACS缓冲液洗涤两次且在1500rpm及4℃下离心5min。将细胞在200μLMACS缓冲液中复原。
所有样本均使用FACSCantoTM流动式细胞测量术系统分析且使用v.10分析数据。
结果
如图24A至图24B中所示，抗PAD4 mAb显著减少姥鲛烷诱导的细胞外陷阱形成嗜中性粒细胞(NETosis)及细胞外陷阱形成单核球(METosis)。类似地，mumAb处理导致总Cit-H3+嗜中性粒细胞及单核球的比例显著降低(图25A)以及Cit-H3+嗜中性粒细胞及单核球的的数目显著减少(图25B)。在M1巨噬细胞及M2巨噬细胞中，mumAb减少总Cit-H3+细胞(图26A及图26B，左图)及CitH3的MFI(图26A及图26B，右图)；在M2巨噬细胞中观测到的作用更大(参见图26A(M1巨噬细胞结果)及图26B(M2巨噬细胞结果))。结果指示用抗PAD4mAb治疗减少发炎。
因为弹性蛋白酶用作嗜中性粒细胞NETosis的可溶性标记物并且MPO代表嗜中性粒细胞NETosis及单核球/巨噬细胞METosis两者的可溶性标记物，所以在腹膜液中评估mumAb对这些标记物的影响。使用不同剂量的mumAb处理小鼠显著降低自姥鲛烷处理的小鼠获得的腹膜液中的弹性蛋白酶(图27A)及MPO(图27B)。mumAb亦减少腹膜液样本中的趋化介素MIP-2α、GROα/KC、MCP1及MIP 1β，且MIP-2α的减少具有统计显著性。mumAb亦显著降低血浆样本中的细胞因子IL6(图28B，左图)及趋化介素MIP3α(图28B，右图)。
实施例24：抗鼠类PAD4鼠类抗体调节胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)模型中的体内PAD4活性
使用预防性及半治疗性剂量方案测试抗PAD4 mAb(mumAb)在胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)模型中抑制疾病严重程度及数种PAD4依赖性反应的能力。
用于小鼠处理的材料及方法
此实施例中所用的材料及仪器如以上实施例23中所描述，具有几种修改。在此实施例中，不使用姥鲛烷。另外，使用13至14周龄雄性DBA1小鼠(Envigo USA)代替BALB/c雌性小鼠。
胶原蛋白溶液制备如下。通过将30μL冰醋酸添加至9.97 mL冰冷的MilliQ水中来制备0.05 M乙酸。将2.5 mL 0.05 M乙酸添加至含有10 mg II型牛胶原蛋白(Chondrex；目录号20021)的小瓶中。将混合物在4℃储存过夜以用于溶解。
胶原蛋白乳液制备如下。将含有Sigma Adjuvant System(Sigma Aldrich；目录号S6322)及盐水溶液的小瓶在37℃至40℃下培育10至15 min。使用1.0 mL注射器经由隔膜将0.5 mL盐水添加至含有Sigma Adjuvant System的各小瓶中。将各小瓶充分涡旋至少2min。将小瓶在37℃至40℃下再培育15 min。将0.5 mL胶原蛋白溶液添加至各小瓶中且使混合物涡旋1至2 min。
将此研究中所用的雄性DBA1小鼠分成6个不同小组。在开始实验之前，使小鼠在暂留区域适应环境至少一周。
进行两个独立研究-(1)预防性研究及(2)半治疗性研究。两项研究共享同一初次免疫接种方案。在胶原蛋白免疫接种当天(第0天)，如上文所描述制备胶原蛋白乳液。使用异氟醚将DBA1小鼠麻醉。用70％异丙醇消毒各小鼠尾部，且在距尾底约1.0 cm至2.0 cm的2个区域中经由sc注射缓慢且坚决地施用100μL乳液。
对于预防性研究而言，在第0天处理小鼠。用II型牛胶原蛋白对小鼠免疫。第0天开始，用含10 mg/kg、30 mg/kg及100 mg/kg mumAb的无菌PBS处理小鼠。在第0天经由sc注射每周一次向第III组、第IV组及第V组施用不同mumAb剂量(表16)。通过皮下注射用IC(100mg/kg)处理第II组中的小鼠(表16)。通过ip注射一周两次施用CTLA4-Ig(表16)。在第21天施用II型牛胶原蛋白的加打剂量。每周测量临床评分及疾病发生率。
对于半治疗性研究而言，如以上预防性研究中所述处理小鼠，并具有以下修改。在第21天而非第0天开始，用10 mg/kg、30 mg/kg及100 mg/kg mumAb处理小鼠。
每日观测所有小鼠的任何异常行为。每周两次评估症状(亦即临床评分)以及体重。在不同时间点收集血浆和/或血清样本以确定预防性及半治疗性研究的mumAb浓度。
在第44天终止两项研究且将小鼠安乐死。捕捉第44天的临床评分及脚爪重量。将小鼠抽血以获得血浆和/或血清且储存在-80℃用于各种分析。收集组织样本(来自脚爪及髌骨)且立即处理以产生单细胞悬浮液以进行流动式细胞测量术。亦收集脚爪样本以用于组织学、ELISA及其他分析。
关节炎评分方法
根据以下量表对关节炎进行评分：(1)正常；(2)轻度，踝部或腕部有清晰红肿，或仅限于个别足趾明显红肿，不论受影响的足趾有多少；(3)踝部或腕部中度红肿；(4)包括足趾在内的整个脚爪严重红肿；(5)肢体发炎最严重，涉及多个关节。
处理脚爪样本以进行流动式细胞测量术的方法
在预防性及半治疗性研究结束时将小鼠安乐死。将发炎之后爪切断(自胫跗关节)，收集在RPMI中，并保存在冰上。自发炎之后爪样本去除皮肤。解剖胫腓骨、跗骨及跖骨的末端。将足趾排除在处理之外。将发炎的关节及肌肉组织分成碎片并收集在MACS C管中。根据制造商的方案，使用多组织解离试剂盒2(Miltenyi；目录号130-110-203)消化样本。每样本的总体积为5mL。
使用pMACS octo解离器在37℃下进行组织消化。使样本通过40μm筛且收集于50mL套管中。使用1×DPBS(Thermo Fisher；目录号14190235)将各样本的最终体积补足至25mL。将样本在1500rpm及4℃下离心5min。
将1mL的ACK缓冲液(Thermo Fisher；目录号A1049201)添加至各样本的沉淀团中，充分混合，在室温下培育1min以用于RBC裂解。用1×DPBS将各样本的体积补足至15mL。将样本再次在1500rpm及4℃下离心5min。
将各样本沉淀团在0.5mL MACS操作缓冲液(Miltenyi；目录号130-091-221)中复原。将来自沉淀团的细胞染色进行组织学分析且根据下文所述的NETois/METosis及瓜氨酸化染色方案处理。
NETosis/METosis及瓜氨酸化染色方案及材料
用于SG/MPO的染色程序：集合1-表面集合-NETosis/METosis为如上文实施例23中所描述。
PAD4/Cit-H3的染色程序：集合2-细胞内集合-瓜氨酸化为如上文实施例23中所描述。
抗体结合方法为如上文实施例23中所描述。
组织学染色方法
将脚爪样本用苏木精及伊红染色且进行组织学分析。
处理小鼠后爪/关节以用于定量抗环状瓜氨酸化肽抗体(ACPA)及ELISA的方法
在预防性及半治疗性研究结束时将小鼠安乐死。将发炎之后爪切断(自胫跗关节)，且收集在RPMI中，保存在冰上。用剪刀细分脚爪样本，并将细碎的组织样本收集在2mL管中。将1mL 1×RIPA缓冲液(Cell Signaling；目录号9806)添加至各2mL管中。每管亦添加一个金属球。将2mL样本置放于组织裂解器II(Qiagen)中以进行珠粒均匀化。
在均匀化之后，将样本在15000xg及4℃下离心20min。收集各样本上清液，且随后通过ELISA分析(1)抗环状瓜氨酸化肽抗体(ACPA；MyBioSource.com；目录号MBS2607007)、(2)PAD4(Cusabio；目录号CSBFL017379MO)、(3)MPO(R&D Systems；目录号DY3667)，及(4)嗜中性粒细胞弹性蛋白酶EA2(R&D Systems；目录号DY4517-05)。
预防性研究的结果
如图29A中所示，抗PAD4 mAb(mumAb)显著降低关节炎临床评分。疾病发生率及脚爪重量亦显著降低(图29B及图29C)。mumAb亦减少免疫细胞的浸润(图30A至图30E)。如图31A至图31B中所示，分别通过SG+MPO+嗜中性粒细胞及SG+MPO+单核球/巨噬细胞评估，mumAb显著减少NETosis及METosis。类似地，mumAb显示总Cit-H3+嗜中性粒细胞、单核球及巨噬细胞的比例显著降低(图32A至图32C)。
因为弹性蛋白酶及MPO代表嗜中性粒细胞及单核球/巨噬细胞的可溶性标记物，所以在脚爪匀浆中评估mumAb对这些标记物的影响。以不同剂量的mumAb处理小鼠显著降低MPO及弹性蛋白酶(图33B至图33C)。亦显著降低PAD4含量(图33A)。
另外，通过ELISA分析脚爪匀浆及血清样本以进行ACPA检测。mumAb显示脚爪匀浆及血清中的ACPA显著降低(图34A)。类似地，抗CII Ab的力价亦显著降低(图34B)。mumAb亦显示脚爪组织学评分显著降低(图35)。
半治疗性研究的结果
如图36A中所示，mumAb显著降低关节炎临床评分。疾病发生率及脚爪重量亦显著降低(图36B至图36C)。mumAb亦减少总免疫细胞及骨髓细胞的浸润(图37至图37E)。此外，通过SG+MPO+嗜中性粒细胞评估，mumAb显著减少NETosis(图38A)，并且通过单核球及巨噬细胞指示，亦显著减少METosis(图38B)。类似地，mumAb显著减少总Cit-H3+嗜中性粒细胞、单核球及M2巨噬细胞(分别为图39A至图39C)。
因为弹性蛋白酶及MPO代表嗜中性粒细胞及单核球/巨噬细胞的可溶性标记物，所以在脚爪匀浆中评估mumAb对这些标记物的影响。以不同剂量的mumAb处理小鼠显著降低MPO及弹性蛋白酶(图40B至图40C)。亦显著降低PAD4含量(图40A)。
另外，通过ELISA分析脚爪匀浆及血清样本以进行ACPA检测。mumAb显示脚爪匀浆及血清中的ACPA显著降低(图41A)。类似地，抗CII Ab的力价亦显著降低(图41B)。mumAb亦显示脚爪组织学评分显著降低(图42)。
实施例25：抗人类PAD4抗体在LPS诱导的急性肺部发炎模型中的活性
使用LPS ALIPD模型测定抗人类PAD4抗体(Ab)在人类PAD4基因敲入(HU-PAD4KI)小鼠中的体内活性。
与鼠类ALIPD模型相关的方法
此实施例中与鼠类ALIPD模型相关的方法如以上实施例20中所描述，并进行以下修改。使用C57Bl/6人类PAD4基因敲入(Hu-PAD4 KI)小鼠以及WT小鼠。这些小鼠均以下表17所示的0.24mg/kg、1.2mg/kg、6mg/kg、3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg和/或100mg/kg抗体处理。用100mg/kg的同型对照鼠类抗体(IC mAb)处理对照小鼠。
结果
测试抗人类PAD4 mAb克隆13(mAb13)及克隆20(mAb20)抑制PAD4在LPS ALIPD模型中起作用的能力。亦测试克隆13的人源化衍生物(1)hz13-5及(2)hz13-12及克隆20的人源化衍生物(1)hz20-2及(2)hz20-7。基于抗体对细胞外瓜氨酸化H3含量(相对于总细胞外H3)及细胞外瓜氨酸化ITIH4含量(相对于总细胞外ITIH4)的抑制来评估抗体的活性。与同型对照相比，所有这些抗体均在Hu-PAD4 KI小鼠中减少细胞外Cit-H3及细胞外Cit-ITIH4。
具体而言，mAb20在最低测试剂量(30mg/kg)下使Hu-PAD4 KI小鼠中的细胞外CitH3减少41％(图43A)。此活性对人类PAD4具有特异性，因为即使在100mg/kg的剂量下，mAb20亦不会减少WT小鼠的细胞外Cit-H3。mAb20的人源化衍生物hz20-2(图43B)及hz20-7(图43C)在30mg/kg下分别显示细胞外Cit-H3减少12％及16％，且hz20-2在100mg/kg下显示细胞外Cit-H3减少48％(图43B)。抗体hz20-2及hz20-7亦减少细胞外Cit-ITIH4。在30mg/kg下，hz20-2(图43D)及hz20-7(图43E)使细胞外Cit-ITIH4分别减少80％及75％。
此外，mAb13减少Hu-PAD4KI小鼠中的细胞外Cit-H3，但不减少WT小鼠中的细胞外Cit-H3(图44A)。mAb13在30mg/kg及100mg/kg下分别使细胞外Cit-H3减少65％及70％(图44A)。mAb13的第一种人源化衍生物hz13-12在减少细胞外Cit-H3方面同样有效，证明在10mg/kg下减少54％且在30mg/kg下减少58％(图44B)。通过表明在6mg/kg下减少86％及在30mg/kg下减少95％，mAb13的第二种人源化衍生物hz13-5对细胞外Cit-H3减少具有甚至更大的影响(图44C)。类似地，hz13-12及hz13-5在6mg/kg及更高的剂量下使细胞外Cit-ITIH4减少超过80％(图44D至图44E)。
结果显示抗人类PAD4 mAb调节临床前LPS ALI发炎模型中的PAD4功能。具体而言，抗体减少细胞外Cit-H3的含量。
表17概述细胞外Cit-H3及Cit-ITIH4的减少％，如图43A至图43E中及图44A至图44E中所示。
实施例26：抗人类PAD4抗体在LPS诱导的急性关节发炎模型中的活性
使用LPS诱导的AJI模型测定抗人类PAD4抗体(Ab)在人类PAD4基因敲入(HU-PAD4KI)小鼠的关节中的体内活性。
A.与LPS AJI模型相关的方法
与此实施例中的LPS诱导的AJI模型相关的方法(图45A至图45B)如以上实施例21中所描述，并进行以下修改：使用C57Bl/6人类PAD4基因敲入(Hu-PAD4 KI)小鼠以及WT小鼠。在ia注射后的多个时间点，取出小鼠髌骨并外植以提取细胞外蛋白(图45B)，并通过LC/MS测定Cit-PRG4、Cit-ITIH4及hPAD4表达(图45C至图45E)。
在第一个实验中，测试以下抗体：克隆13的人源化衍生物hz13-5及hz13-12，及克隆20的人源化衍生物hz20-2。经皮下用1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg或100mg/kg的这些Ab处理小鼠。用100mg/kg的同型对照鼠类抗体(IC mAb)处理对照小鼠。在第二个实验中，测试hz13-5 D31E，并以最低施用剂量测试hz13-5。经皮下用0.1mg/kg、1mg/kg或30mg/kg的hz13-5 D31E或用0.1mg/kg的hz13-5处理小鼠。
B.结果
首先，用不含抗体的LPS处理小鼠以确定测量瓜氨酸化蛋白表达量的理想时间范围。在注射LPS后第2至3天观测到Cit-PRG4、Cit-ITIH4及hPAD4的峰值表达量(图45C至图45E)。表达量在ia注射后第6天下降。因此，第2天被确定为测定Cit-PRG4及Cit-ITIH4蛋白表达的理想时间。
接下来，为了测试抗体抑制PAD4在LPS AJIPD模型中起作用的能力，如以上方法部分中所述且如图45A至图45B中所示施用抗体。基于克隆13的hz13-12抗体(图46A)、基于克隆13的hz13-5抗体(图46B)及基于克隆20的hz20-2抗体(图46C)以剂量依赖性方式降低Cit-ITIH4的相对含量。基于克隆13的hz13-5具有最强的效果，其在1mg/kg下减少81％且在30mg/kg下减少95％(图46B)。
在第一次实验中，基于克隆13的hz13-12抗体(图47A)、基于克隆13的hz13-5抗体(图47B)及基于克隆20的hz20-2抗体(图47C)亦以剂量依赖性方式降低Cit-PRG4的相对含量。基于克隆13的hz13-5具有最强的效果，其在1mg/kg下减少83％且在30mg/kg下减少100％(图47B)。
在第二次实验中，hz13-5 D31E及hz13-5两者均抑制ITIH4(图48A)及PRG4(图48B)的瓜氨酸化。抗体hz13-5 D31E显示对ITIH4及PRG4的瓜氨酸化的剂量依赖性抑制。
结果整体上指示抗人类PAD4 mAb抑制PAD4在此LPS诱导的AJI体内模型中起作用。
实施例27：治疗性PAD4抗体在来自类风湿性关节炎患者的内源性PAD4抗体的存在下仍保持效力
介绍
PAD4为透过嗜中性粒细胞活化、NETosis及细胞死亡在发炎关节中释放至细胞外。PAD酶催化将精氨酸修饰为瓜氨酸残基，并驱动瓜氨酸化新抗原的形成，所述抗原可被抗瓜氨酸化肽抗体(ACPA)识别，其为类风湿性关节炎的标志。ACPA与瓜氨酸化蛋白之间形成的免疫复合物被认为会导致组织损伤并使发炎持续存在。除ACPA以外，约25至35％的RA患者表达抗PAD4 IgG，其中约20至40％会在PAD3/PAD4之间发生交叉反应，并可能增强PAD4活性，导致糜烂性更严重的疾病。在此实施例中，在血清中或使用纯化的免疫球蛋白G(IgG)研究内源性抗PAD4抗体的存在对抗体hz13-5 D31E效力的影响。
材料及方法
血清样本
样本为来自已确诊疾病的类风湿性关节炎(RA)患者的血清样本。将健康对照(NHV)的血清收集在BD Vacutainer SST采血管(目录号367988)中。冷冻所有血清样本直至等分于培养盘中。
PAD4抗体ELISA
按照制造商方案，使用来自Cayman Chemicals的PAD4自体抗体ELISA试剂盒(500930)测量血清抗PAD4自体抗体。将血清样本以1:150稀释度在ELISA试剂盒中提供的分析缓冲液中进行测试。
IgG纯化
使用来自Thermo Scientific的MelonTM凝胶IgG自旋纯化试剂盒(45206)来纯化人类IgG。简言之，将500μl纯化凝胶装置至自旋柱且用300μl纯化缓冲液洗涤两次。用纯化缓冲液将80μl血清稀释5倍且添加至含有自旋柱的纯化凝胶中。将柱颠倒混合5分钟并离心以收集经纯化的IgG。使用来自Thermo Scientific的NanoDropTM One仪器测定经纯化IgG的浓度。
瓜氨酸化H3酶促分析
所有试剂均针对100μl最终反应进行计算。在42.5μl体积中，将重组PAD4(Cayman#10500)与经纯化IgG在冰上一起预培育45分钟。为了产生抑制曲线，将PBS或同型对照中的7.5μl hz13-5 D31E系列稀释液添加至PAD4/IgG混合物中且在冰上再培育45分钟。添加含有氯化钙的缓冲液中的组蛋白H3，且在培育箱中在37℃培育反应物(最终浓度：13.5nMPAD4，2mM CaCl2，10μg/ml H3，100μg/ml经纯化IgG)2小时。用10μl 0.5M EDTA停止H3瓜氨酸化反应。按照制造商方案，使用来自Cayman Chemicals的瓜氨酸化组蛋白H3(克隆11D3)ELISA试剂盒(501620)测量瓜氨酸化的组蛋白H3。将瓜氨酸化样本以1:100稀释度在ELISA试剂盒中提供的分析缓冲液中进行测试。
诱导血清中的瓜氨酸化
为了产生抑制曲线，将PBS或同型对照中的7.5μl hz13-5 D31E系列稀释液添加至培养盘中的80μl解冻血清中，混合，在CO2培养箱中于37℃下培育6h，然后在-80℃下储存过夜。将含有与抗体混合的血清的培养盘解冻，且添加12.2μl PAD4酶反应混合物(13.5nMPAD4、100mM Tris、2mM DTT最终)并在37℃下培育2h。用10μl 0.5M EDTA停止反应。将培养盘密封且储存于-80℃。
通过LC-MS测量瓜氨酸化肽
将十(10)μl血清解冻且用PBS稀释15倍。使用含有20μL CaptureSelectTM人类白蛋白亲和基质的CUSTOM PhyTip 200μL CaptureSelectTM人类白蛋白尖端(Biotage,SanJose,CA)，将六十(60)μl 15倍稀释血浆用于耗乏人类血清白蛋白。将五(5)μl白蛋白耗乏血清与45μlLYSE BCT缓冲液组合且在80℃加热20分钟。根据制造商方案，通过添加胰蛋白酶及LysC对样本进行酶促消化。使用preOmics BCT试剂盒(目录号P.O.00116)清除肽。
使用30分钟prm-PASEF方法，在Bruker timsTOF质谱仪上通过nanoLC-MS分析肽。使用Bruker NanoEluteTM LC在AURORA ELITE(AUR-15075C18-CSI)柱上进行色谱分离。数据依赖性采集(DDA)数据为针对具有高PAD4浓度的样本获取的，并且针对每种感兴趣的肽添加内标(重肽)。使用软件产生来自先前通过全球蛋白质体学实验鉴别的cit-蛋白质的cit-肽(瓜氨酸化肽)及未修饰肽序列的清单。接下来，中的文库为使用生成的msms.txt、mqpar.xml及modifications.xml档案产生的。在导入DDA数据且使用经导入数据以产生谱库之后产生离子迁移率文库。自导出每种分析物的三个参数，以在TimsTOF Control 3.0软件中建立prm-PASEF方法：保留时间(RT)；离子迁移率(IM)及前驱体m/z。使用工作流程分析数据。
IC50计算
IC50计算及统计为在Prism软件中进行。将瓜氨酸化H3或瓜氨酸化％针对抗体浓度的对数进行绘图，并进行非线性拟合(希尔斜率＝-1)。
结果
PAD4抗体状态
通过ELISA评估来自21名RA患者及10名健康对照(NHV)的血清样本中内源性PAD4自体抗体的存在。平均而言，RA中的OD显著高于NHV中的OD(RA中为1.3对比NHV中为0.38，p<0.0001，Mann Whitney T测试)。使用1作为阳性截止值，21份RA血清中有13份(62％)且没有NHV血清可被视为抗PAD4 IgG+。图49A显示21个RA及10个NHV纯化的IgG中通过ELISA透过OD450测量的血清抗PAD4自体抗体。
在经纯化IgG存在下的Hz13-5 D31E效力
评估在来自21种RA及6种NHV血清的100μg/ml经纯化IgG的存在下hz13-5D31E抑制H3瓜氨酸化的效力(3个盘各自含有7个RA及2个NHV供体)。hz13-5 D31E在经纯化的IgG的存在下抑制体外PAD4驱动的H3瓜氨酸化，并且无论经纯化的IgG来自RA抑或NHV血清，IC50没有差异(图49B，表18)，尽管事实上大部分RA IgG具有抗PAD4自体抗体。RA血清(n＝21)的平均IC50(nM)为8.2(标准偏差为1.3)，而NHV血清(n＝6)的平均IC50(nM)为9.0(标准偏差为2.5)。
RA患者血清中Hz13-5 D31E的效力
在添加或不添加不同剂量的hz13-5 D31E的情况下将21个RA及10个NHV供体的血清与13.5nM PAD4一起培育以诱导瓜氨酸化。蛋白多糖4(PRG4)、血纤维蛋白原A(FGA)、间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H4(ITIH4)、α-1-微球蛋白/比库宁前驱体(AMBP)及凝溶胶蛋白(GSN)中的5种所选肽的瓜氨酸化是通过LC-MS测量且报导为瓜氨酸化占总肽的百分比。在所有具有供体间变异性的样本中观测到这些肽的瓜氨酸化。z13-5 D31E以剂量依赖性方式抑制这些肽中各者的瓜氨酸化，并且在NHV与RA之间效力类似(表18，透过Mann Whitney测试，NHV与RA之间没有统计差异)。此外，通过ELISA进行测量(图49A)，任何IC50与抗PAD4自体抗体的存在(Spearman，未显示)之间不存在相关性，表明内源性PAD4抗体的存在不影响hz13-5 D31E的效力。表18显示hz13-5D31E对来自RA或NHV供体的5种血清肽的瓜氨酸化的IC50。SD是指标准偏差。表18中所示的序列自上而下分别为SEQ ID NO：236至240。
表18
透过两次独立的分析，在内源性抗PAD4自体抗体存在的情况下，在此一组21个RA血清样本中未观测到hz13-5D31E的效力变化。
实施例28：抗PAD4抗体hz13-5 D31E与各种人类组织的交叉反应性研究
使用荧光素化hz13-5 D31E(hz13-5 D31E FITC)评估hz13-5 D31E与一组正常人类组织的潜在交叉反应性。将Hz13-5 D31E FITC以1μg/mL及5μg/mL应用于每个组织至少3个供体(若可用)的正常人体组织的冷冻切片。在此两种浓度下，hz13-5 D31E FITC对人类周边血液中常见的单核及多形核白血球的细胞质及细胞核进行中度至强烈染色。实验表明，hz13-5 D31E FITC对大多数人类组织样本中的多形核白血球的细胞质及细胞核进行染色，对淋巴结(主要是窦巨噬细胞)及周边血液中的稀有单核白血球的细胞质进行染色，对脾中的网状内皮细胞的细胞质进行染色。这些结果大体上与所报导的PAD4在周边血液中颗粒球及单核球中的细胞质及细胞核中的表达一致。(Jones等人Curr.Opin.DrugDiscov.Devel.12(5):616-27(2009)；Vossenaar等人，Ann.Rheum.Dis.63(4):373-81；Zhou等人，Front.Immunol.8:1200(2017))。此外，在所检查的任何人类组织中均未观测到膜与hz13-5 D31EFITC的结合。这些结果表明hz13-5 D31E FITC不会与正常人类组织发生交叉反应。
实施例29：评估hz13-5 D31E抗体在人类全血中的体外呼吸爆发及吞噬作用
在体外人类全血分析中评估hz13-5D31E影响呼吸爆发及吞噬作用的可能性。
将嗜中性粒细胞与hz13-5 D31E或同型对照抗体(人类IgG1.3f抗体)一起培育，然后与经过调理的结合大肠杆菌生物颗粒在冰上一起培育不会诱导吞噬作用。在与hz13-5D31E、同型对照或培养基对照一起培育，然后在37℃下与大肠杆菌生物颗粒一起培育的全血样本的吞噬作用亦没有差异。
呼吸爆发阳性对照PMA诱导来自所有供体的全血样本中嗜中性粒细胞的呼吸爆发，其被呼吸爆发抑制剂山奈酚(Kaempferol)抑制。在测试浓度为0.128至400μg/mL的hz13-5D31E或同型对照抗体存在下，PMA不会诱导呼吸爆发。并且，hz13-5 D31E及同型对照抗体单独在400μg/mL浓度下不会诱导呼吸爆发，其为所测试的最高浓度，并且亦超过900mg人体剂量中hz13-5 D31E的预测Cmax的两倍。
这些结果表明，在此模型中测试的浓度下，hz13-5D31E对吞噬作用及呼吸爆发的先天免疫功能没有影响。
实施例30：PAD4抗体与检查点抑制剂组合抑制体内乳腺癌模型中的瓜氨酸化
使用4T1乳腺癌同基因型模型以在使用抗小鼠PAD4单克隆抗体(本文所描述的mumAb)或小分子PAD4抑制剂抑制或不抑制PAD4的情况下研究检查点抑制剂的抗肿瘤活性。4T1模型描述于Teijeira等人(2020)Immunity:56,856-871中。当原位引入乳房脂肪垫时，肿瘤不仅在原发部位生长，而且还转移至肝脏、肺脏及淋巴结。
将4T1细胞维持在含有10％ FBS的RPMI-1640培养基中。向6至8周龄Balb/c小鼠的乳房脂肪垫皮下注射50μL血清及无酚红培养基中的5×104个细胞。植入后第7天开始每周进行肿瘤测量3次，且将动物随机分为100mm3平均肿瘤体积的治疗组(预期肿瘤范围约70至150mm3)。
治疗方案提供于下表19中。此研究中所用的治疗包括：抗mPD-1抗体(aPD-1)，其为纳武利尤单抗的鼠源化等效物；抗mCTLA-4抗体(aCTLA-4)，其为伊匹单抗的鼠源化等效物；小分子PAD4抑制剂GSK484；及PAD4抗体抑制剂(mumAb)；以及对照(GSK484稀释液，mumAb同型对照)。表19中的第I组的小鼠接受针对KLH抗原(匙孔螺血蓝蛋白)的同型对照抗体。表19的第2至7组接受表中所列的治疗，其对应于各种抗肿瘤治疗组合。分别以第四行中所列的剂量及第五行中所列的频率施用第二行中所列的治疗。第1至3组及第6至7组被设计为在较早时间点(植入后第19天)收集n＝5个肿瘤以进行PD评估。监测所有小组中其余n＝15只小鼠的肿瘤生长。
1aPD-1及aCTLA-4经IP施用、mumAb经SC施用；KLH＝匙孔螺血蓝蛋白
使用结果量度(i)肿瘤大小及(ii)来自切除的肿瘤的瓜氨酸化DNA的免疫组织化学来评估治疗组之间的差异。与单独的检查点抑制剂治疗相比，包括PAD4抑制剂的组合未显示出改良的肿瘤生长抑制。值得注意的为，在aPD-1与aCTLA4的组合(该组合在此实施例中称为检查点抑制剂双联体或CPI双联体)的第3剂之后(植入后第24天)，抗药物抗体(ADA)的形成导致致命性全身性过敏反应。各组中用CPI双联体治疗的小鼠均死亡，表明ADA并不针对mumAb。直至第三剂CPI双联体为止，小鼠的周边暴露水平显示出高于预测有效范围的值。与对应的对照组(分别为第4组及第2组)相比，接受PAD4抑制剂mumAb(第5组、第6组及第7组)或GSK484(第3组)的小组并未显示出增强的肿瘤生长抑制。
在植入后第19天收集的小组中，观测到肿瘤组蛋白H3瓜氨酸化的趋势，与CPI双联体及同型对照(第4组)相比，第7组(100mg/kg的高剂量aPAD4 mumAb以及CPI双联体的组合)中有显著降低。此结果表明，施用足够剂量的PAD4抗体可以抑制肿瘤中的瓜氨酸化。
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下表提供本文中提及的某些序列的清单。在本文所公开的抗体可变区序列中，重链可变区(VH)CDR1、CDR2和CDR3序列分别位于包含氨基酸26至35、50至65及95至102的Kabat位置，如图1E中所示，所述位置对应于下表中SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:78的氨基酸位置26至35、50至66和99至108，且轻链可变区(VL)CDR1、CDR2和CDR3序列分别位于包含氨基酸24至34、50至56及89至97的Kabat位置，如图1F中所示，所述位置对应于下表中SEQ IDNO：12及SEQ ID NO：80的氨基酸位置24至38、54至60及93至101。在某些VH及VL序列中，CDR序列呈粗体字，在一些情况下亦带下划线。在某些人源化抗体VH及VL序列中，构架区中的带下划线的氨基酸指示构架经回复突变成小鼠氨基酸。在某些全长重链及轻链序列中，可变区呈斜体。在某些突变恒定区序列中，与对应野生型序列相比发生变化的恒定区残基为以粗体下划线显示。

Claims (73)

1.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(protein arginine deiminase 4；PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：重链可变区(VH)，其含有包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)及包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR3；及轻链可变区(VL)，其含有包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)。
2.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：重链可变区(VH)，其含有包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR3；及轻链可变区(VL)，其含有包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、包含SEQ IDNO:8的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LCDR3。
3.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:225的氨基酸序列及SEQ ID NO:222的氨基酸序列；及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列。
4.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：重链可变区(VH)，其含有包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)及包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR3；及轻链可变区(VL)，其含有包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，其中该抗体的该VH与SEQ ID NO:68的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致。
5.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：重链可变区(VH)，其含有包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR3；及轻链可变区(VL)，其含有包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)、包含SEQ IDNO:8的氨基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LCDR3，其中该抗体的该VH与SEQ ID NO:68的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致。
6.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:225的氨基酸序列及SEQ ID NO:222的氨基酸序列；及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列，其中该抗体的VH与SEQ ID NO:68的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致。
7.根据权利要求1至4中任一项的经分离抗体，其中该抗体的VL与SEQ ID NO:70的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致。
8.根据权利要求1至7中任一项的经分离抗体，其中该重链可变区包含Kabat位置94处的甘氨酸，该位置对应于SEQ ID NO:68的位置98。
9.根据权利要求1至8中任一项的经分离抗体，其中该抗体包含有包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VH。
10.根据权利要求1至8中任一项的经分离抗体，其中该抗体包含有包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL。
11.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL。
12.根据权利要求1至11中任一项的经分离抗体，其中该抗体结合至包含SEQ ID NO:217及任选存在的SEQ ID NO:218的PAD4上的表位。
13.根据权利要求1至12中任一项的经分离抗体，其为IgA、IgG或IgM抗体。
14.根据权利要求1至12中任一项的经分离抗体，其为IgG抗体，诸如人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
15.根据权利要求14的经分离抗体，其中该抗体包含野生型、人类IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区。
16.根据权利要求1至12中任一项的经分离抗体，其中该抗体包含人类IgG1或IgG2重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列。
17.根据权利要求1至12或16中任一项的经分离抗体，其中该抗体包含轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致的氨基酸序列。
18.根据权利要求1至12中任一项的经分离抗体，其中该抗体包含人类IgG1或IgG2重链恒定区，其包含与SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列。
19.根据权利要求1至12或18中任一项的经分离抗体，其中该抗体包含轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列相比经1至10个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代或1至3个氨基酸取代修饰的氨基酸序列。
20.根据权利要求1至19中任一项的经分离抗体，其中该抗体包含人类IgG1或IgG2重链恒定区，其包含SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者的氨基酸序列。
21.根据权利要求1至20中任一项的经分离抗体，其中该抗体包含有包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列的轻链恒定区。
22.根据权利要求1至21中任一项的经分离抗体，其为全长抗体。
23.根据权利要求1至21中任一项的经分离抗体，其为在重链恒定区中缺乏C端赖氨酸的IgG抗体。
24.根据权利要求1至12中任一项的经分离抗体，其为抗体片段，诸如Fv、单链Fv(scFv)、Fab、Fab'或(Fab')2。
25.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列、然后是SEQ ID NO:178的氨基酸序列的重链(HC)；及包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列、然后是SEQ ID NO:194的氨基酸序列的轻链(LC)。
26.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列、然后是SEQ ID NO:180的氨基酸序列的重链(HC)；及包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列、然后是SEQ ID NO:194的氨基酸序列的轻链(LC)。
27.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列的HC及包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列的轻链。
28.一种特异性结合至蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的经分离抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:198的氨基酸序列的HC及包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列的轻链。
29.根据权利要求1至28中任一项的经分离抗体，其为双特异性或多特异性抗体，或其与至少一个其他分子共价或非共价结合。
30.根据权利要求29的经分离抗体，其中该抗体与至少一个其他分子共价或非共价结合，其中该至少一个其他分子包含检测标记和/或药物。
31.根据权利要求1至30中任一项的经分离抗体，其中该抗体不结合至人类蛋白质精氨酸脱亚胺酶2(PAD2)。
32.根据权利要求1至31中任一项的经分离抗体，其中该抗体以10至200nM、50至200nM、10至100nM、20至100nM或50至100nM的IC50抑制PAD4将肽底物TSTGGRQGSHH(SEQ ID NO:216)中的精氨酸转化为瓜氨酸。
33.根据权利要求1至32中任一项的经分离抗体，其中该抗体任选以剂量依赖性方式以0.1至10nM(诸如0.2至5nM)的IC50抑制PAD4将肽底物(SHQESTRGKSKGKAAAAA；SEQ ID NO:232)中的精氨酸转化为瓜氨酸，其中PAD4浓度为1至8μg/mL。
34.根据权利要求1至33中任一项的经分离抗体，其中该抗体抑制PAD4对Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯盐酸盐(BAEE)的脱胺作用。
35.根据权利要求1至34中任一项的经分离抗体，其中该抗体以小于5nM的KD特异性结合至PAD4。
36.根据权利要求35的经分离抗体，其中该抗体以0.05nM至0.5nM的KD特异性结合至PAD4，其为(a)在37℃、在1mM氯化钙的存在下和/或(b)在37℃、在不存在额外Ca2+及存在2mMEDTA的情况下通过表面等离子共振(surface plasmon resonance；SPR)所测定。
37.根据权利要求1至36中任一项的经分离抗体，其中该抗体在ECM分析中的ECM评分小于50、小于30、小于10、小于5、为1至30、1至20、1至10、1至5、1至3、1、2、3、4或5。
38.根据权利要求1至37中任一项的经分离抗体，其中以计算机仿真免疫原性分析进行测量，该抗体的免疫原性小于以下中之一者、两者或全部三者：(阿伦单抗(alemtuzumab))、(利妥昔单抗(rituximab))、(达利珠单抗(daclizumab))。
39.根据权利要求1至38中任一项的经分离抗体，其中与同型对照抗体相比，该抗体减少LPS刺激的人类血液单核球中细胞外瓜氨酸化组蛋白H3的量和/或减少GM-CSF的分泌和/或GM-CSF的基因表达。
40.根据权利要求1至39中任一项的经分离抗体，其中该抗体能够被LPS刺激的人类血液单核球内化。
41.根据权利要求1至40中任一项的经分离抗体，其中该抗体抑制PAD4在发炎肺部的功能，例如通过经肺部所收集的支气管肺泡灌洗液(broncheoalveolar lavage fluid；BALF)中的H3的瓜氨酸化减少证明。
42.根据权利要求1至41中任一项的经分离抗体，其中该抗体抑制PAD4在发炎关节的功能，例如通过经关节组织中ITIH4和/或PRG4的瓜氨酸化减少证明。
43.根据权利要求1至42中任一项的经分离抗体，其中与同型对照抗体相比，该抗体减少嗜中性粒细胞、单核球、M1巨噬细胞和/或M2巨噬细胞中H3的瓜氨酸化。
44.根据权利要求1至43中任一项的经分离抗体，其中与同型对照抗体相比，该抗体减少在人类PAD4基因敲入小鼠的LPS诱导的急性肺部发炎模型中BALF中的细胞外瓜氨酸化H3和/或瓜氨酸化ITIH4的量，任选其中瓜氨酸化H3的量减少至少15％、至少30％、至少40％、至少50％或至少60％，且其中瓜氨酸化ITIH4的量减少至少50％、至少70％或至少80％。
45.根据权利要求1至44中任一项的经分离抗体，其中与同型对照抗体相比，该抗体减少在人类PAD4基因敲入小鼠的LPS诱导的急性关节损伤模型中的小鼠髌骨中细胞外瓜氨酸化PRG4和/或瓜氨酸化ITIH4的量，任选其中减少瓜氨酸化ITIH4和/或瓜氨酸化PRG4的EC50为2nM或更低、1nM或更低、0.1nM或更低、0.05至2nM、或0.1至1nM。
46.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至45中任一项的抗体及药学上可接受的载剂。
47.一种经分离核酸或两种或更多种核酸的集合，该(等)核酸编码根据权利要求1至45中任一项的抗体。
48.一种经分离载体，其包含一种或多种编码根据权利要求1至45中任一项的抗体的重链及轻链的核酸。
49.一种经分离宿主细胞，其包含根据权利要求47的核酸或根据权利要求48的载体。
50.一种产生特异性结合至PAD4的抗体的方法，其包含在适于表达该抗体的条件下培养根据权利要求49的宿主细胞。
51.根据权利要求50的方法，其进一步包含自该宿主细胞回收该抗体。
52.一种抗体，其通过根据权利要求50或51的方法产生。
53.根据权利要求1至45中任一项的抗体或根据权利要求46的药物组合物在制备用于治疗自体免疫病症的药物中的用途。
54.根据权利要求53的用途，其中该自体免疫病症为类风湿性关节炎、狼疮(例如全身性红斑狼疮(SLE))、狼疮性肾炎、血管炎(例如ANCA相关血管炎)、血栓(例如静脉血栓)或炎性肠病(IBD)(例如溃疡性结肠炎、克罗恩氏病(Crohn's disease))。
55.根据权利要求1至45中任一项的经分离抗体或根据权利要求46的药物组合物，其用于治疗自体免疫病症。
56.根据权利要求55所使用的抗体，其中该自体免疫病症为类风湿性关节炎、狼疮(例如全身性红斑狼疮(SLE))、狼疮性肾炎、血管炎(例如ANCA相关血管炎)、血栓(例如静脉血栓)或炎性肠病(IBD)(例如溃疡性结肠炎、克罗恩氏病)。
57.一种治疗有需要个体的自体免疫病症的方法，其包含向该个体施用有效量的根据权利要求1至45中任一项的经分离抗体或根据权利要求46的药物组合物。
58.根据权利要求57的方法，其中该自体免疫病症为类风湿性关节炎、狼疮(例如全身性红斑狼疮(SLE))、狼疮性肾炎、血管炎(例如ANCA相关血管炎)、血栓(例如静脉血栓)或炎性肠病(IBD)(例如溃疡性结肠炎、克罗恩氏病)。
59.根据权利要求53至58中任一项的用途、所用的抗体或方法，其中该方法或用途包含施用至少一种其他治疗剂，任选其中该至少一种其他治疗剂为以下中之一或多者：甲胺喋呤(methotrexate)、阿达木单抗(adalimumab)、依那西普(etanercept)、英利昔单抗(infliximab)、羟基氯喹(hydroxychloroquine)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、来氟米特(leflunomide)、阿巴西普(abatacept)、阿那白滞素(anakinra)、赛妥珠单抗(certolizumab)、戈利木单抗(golimumab)、利妥昔单抗(rituximab)、沙利姆单抗(sarilumab)、托珠单抗(tocilizumab)、巴瑞替尼(baricitinib)、托法替尼(tofacitinib)或优帕替尼(upadacitinib)。
60.根据权利要求1至45中任一项的抗体或根据权利要求46的药物组合物在制备用于治疗有发展RA风险的个体的药物中的用途。
61.根据权利要求1至45中任一项的经分离抗体或根据权利要求46的药物组合物，其用于治疗有发展RA风险的个体。
62.一种治疗有发展RA风险的个体的方法，其包含向该个体施用有效量的根据权利要求1至45中任一项的经分离抗体或根据权利要求46的药物组合物。
63.根据权利要求60至62中任一项的用途、经分离抗体或方法，其中该个体有以下一种或多种状况：
a.至少一名患有RA的一等亲(例如父母或兄弟姐妹)；
b.血清中存在抗瓜氨酸化蛋白质抗体(anti-citrullinated protein antibodies；ACPA)；
c.血清中存在类风湿因子(rheumatoid factor；RF)；
d.至少一个关节出现关节痛；
e.通过超音波或磁共振成像(magnetic resonance imaging；MRI)观测到至少一个关节发炎；或
f.未分化关节炎。
64.根据权利要求60至63中任一项的用途、经分离抗体或方法，其中该个体处于缓解期。
65.根据权利要求60至64中任一项的用途、经分离抗体或方法，其中该治疗用于延迟RA发作。
66.根据权利要求1至45中任一项的抗体或根据权利要求46的药物组合物在制备用于抑制个体中的NETosis或METosis的药物中的用途。
67.根据权利要求1至45中任一项的经分离抗体或根据权利要求46的药物组合物，其用于抑制个体中的NETosis或METosis。
68.一种抑制个体中NETosis或METosis的方法，其包含向该个体施用有效量的根据权利要求1至45中任一项的经分离抗体或根据权利要求46的药物组合物。
69.一种抑制个体中NETosis的方法，该方法包含向该个体施用有效量的根据权利要求1至45中任一项的经分离抗体或根据权利要求46的药物组合物。
70.一种抑制个体中METosis的方法，该方法包含向该个体施用有效量的根据权利要求1至45中任一项的经分离抗体或根据权利要求46的药物组合物。
71.一种在体外抑制生物样本中NETosis或METosis的方法，其包含向该生物样本施用有效量的根据权利要求1至45中任一项的经分离抗体或根据权利要求46的药物组合物。
72.一种抑制个体中瓜氨酸化的方法，该方法包含向该个体施用有效量的根据权利要求1至45中任一项的经分离抗体或根据权利要求46的药物组合物。
73.一种在体外抑制生物样本中瓜氨酸化的方法，该方法包含向该生物样本施用有效量的根据权利要求1至45中任一项的经分离抗体或根据权利要求46的药物组合物。
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