TW202423992A - 結合至人類pad4之抗體及其用途 - Google Patents
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Abstract
本申請案係關於特定抗PAD4 (peptidyl arginine deiminase 4；肽基精胺酸脫亞胺酶4)抗體、編碼該等抗體之核酸、包含該等核酸之載體及宿主細胞，以及製造及使用該等抗體之方法。
Description
本申請案係關於特定抗PAD4 (肽基精胺酸脫亞胺酶4)抗體、編碼該等抗體之核酸、包含該等核酸之載體及宿主細胞，以及製造及使用該等抗體之方法。
PAD4 (肽基精胺酸脫亞胺酶4)為人類中五種PAD酶(PAD1、2、3、4及6)之一，並且存在於若干免疫細胞類型中且藉由將精胺酸轉化為瓜胺酸來發揮作用。(Chavanas等人，Gene 330: 19-27 (2004))。此類瓜胺酸化係一種壓力反應，並且可以作為用於去除壓力細胞的信號。(Brentville等人，Oncoimmunology 8: e1576490 (2019))。在嗜中性球中，PAD4亦在稱為NETosis之過程中起作用，透過該過程，嗜中性球擠出含有DNA支架、瓜胺酸化組蛋白及抗菌嗜中性球性顆粒之解濃縮染色質結構複合物。(Li等人. J. Exp. Med. 207: 1853-62 (2010))。此等擠出的複合物被稱為嗜中性球細胞外陷阱(neutrophil extracellular trap；NET)，且在NETosis期間，此等NET會捕捉且殺死入侵的微生物，作為先天性免疫反應之一部分。(Chamardani等人，Mol. Cell. Biochem. 477: 673-88 (2022))。涉及單核球之類似過程被稱為METosis且涉及單核球細胞外陷阱(monocyte extracellular trap；MET)之形成。此外，經PAD4瓜胺酸化之蛋白質成為抗原受質，並且係細胞(亦即T細胞)及體液(亦即B細胞衍生之抗體)適應性免疫反應的標靶。(參見例如Curran等人. Nat. Rev. Rheumatol. 16: 301-15 (2020); Brentville等人.) 因此，PAD4活性可導致抗瓜胺酸化蛋白質抗體(anti-citrullinated protein antibodies；ACPA)生成。
多種資料表明，PAD4在諸如類風濕性關節炎(RA)、狼瘡(包括全身性紅斑性狼瘡症(SLE)、狼瘡性腎炎、血管炎(包括抗嗜中性球性細胞質抗體(ANCA)相關血管炎、發炎性腸病(IBD) (包括潰瘍性結腸炎及克羅恩氏病(Crohn's disease))、血栓(例如靜脈血栓)、抗磷脂抗體症候群、囊腫性纖維化及癌症之疾病中發揮作用。(參見例如Curran等人；Yadav等人，J. Cyst. Fibros. 18: 636-45 (2018)；Wang等人，Front. Immunol. 13: 895216 (2022)；Fresneda Alarcon等人Frong. Immunol. 12: 649693 (2021)；Weeding等人，Clin. Immunol. 196: 110-116 (2018)；Xu等人，Chinese J. Microbiology and Immunology 12: 115-121 (2020)；Yoshida等人，Clin. Kidney J. 6: 308-12 (2013)；O'Sullivan等人，Rheumatology, 58(Suppl. 2): kez061.024 (2019); Pan等人，Authorea Preprints, 2021, DOI: 10.22541/au.161590650.07168461/v1；D. Zhu等人，Pharmaceutics, 8: 14(11): 2414 (2022))。舉例而言，類風濕性關節炎(RA)係一種涉及組織(亦即關節與非關節)及全身性發炎之主要自體免疫病症。RA之進展與自體抗體含量升高相關，且約70% RA患者對抗瓜胺酸化蛋白質抗體(ACPA)呈陽性。ACPA例如出現在有RA風險的人的肺部及血液中，且高ACPA含量與嚴重RA症狀(諸如骨侵蝕)及某些併發症(諸如心血管疾病)相關。另外，ACPA之存在使自發性關節炎之鼠類模型中的RA症狀惡化。
ACPA識別新抗原，尤其是來自經PAD酶瓜胺酸化之蛋白質的新抗原。PAD4係滑膜組織中發現的主要PAD酶。舉例而言，PAD4可介導對於RA及其他疾病之發病機制重要的ACPA依賴性及ACPA非依賴性功能。另外，約15% RA患者具有活化PAD4之抗體。此類PAD4活化抗體之存在與嚴重關節糜爛性疾病相關。在基因層面上，編碼PAD4之PADI4基因中之單核苷酸多型性(SNP)已被鑑別出有促於RA之易感性單倍型。(Suzuki等人，Nat. Genet. 34: 395-402 (2003))。此外，與健康個體相比，
PADI4啟動子區的表觀遺傳學變化與RA患者甲基化較低的疾病活動有關。(Kolarz等人，Clin. Med. 9(7): 2049 (2020))。發現攜有PADI4易感性單倍型之RA患者比不攜帶該單倍型之RA患者具有更高力價的抗瓜胺酸肽抗體(ACPA)。(Reyes-Castillo等人，Clin. Exp. Immunol. 182(2): 119-31 (2015))。
因此，阻斷PAD4之活性可用於治療RA，且治療有發展RA以及其他發炎性及自體免疫疾病或與NETosis、METosis、抗瓜胺酸化蛋白質抗體(ACPA)之存在、PAD4表現增加或PAD4活性增加(諸如多肽瓜胺酸化增加)相關的其他疾病風險的個體。
本發明提供抑制PAD4活性之抗PAD4抗體、編碼該等抗體之核酸、包含該等抗體之載體及宿主細胞，及製造及使用該等抗體之方法。
本發明係關於特定抗PAD4抗體、編碼該等抗體之核酸、包含該等核酸之載體及宿主細胞，及製造及使用該等抗體之方法。舉例而言，本發明之實施例包括以下：
1. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：重鏈可變區(VH)，其包含有包含SEQ ID NO: 4或62之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)及包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的HCDR3；及輕鏈可變區(VL)，其包含有包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)。
2. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：重鏈可變區(VH)，其包含有包含SEQ ID NO: 4或62之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的HCDR3；及輕鏈可變區(VL)，其包含有包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的LCDR3。
3. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 221或225之胺基酸序列及SEQ ID NO: 222之胺基酸序列的重鏈可變區(VH)；及包含SEQ ID NO: 223之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)。
4. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 221或225之胺基酸序列及SEQ ID NO: 222之胺基酸序列的重鏈可變區(VH)；及包含SEQ ID NO: 223之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)，且另外其中該抗體包含有包含SEQ ID NO: 224或235之胺基酸序列的輕鏈恆定區。
5. 如實施例1至4中任一例之經分離抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO: 10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58或68中任一者之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%、或至少99%一致的VH；且其中該抗體包含與SEQ ID NO: 12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60或70中任一者之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%、或至少99%一致的VL。
6. 如實施例1至4中任一例之經分離抗體，其中該抗體包含VH，其包含經1至10個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58或68中任一者之胺基酸序列；且其中該抗體包含VL，其包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60或70中任一者之胺基酸序列。
7. 如實施例1至6中任一例之經分離抗體，其中該重鏈可變區包含Kabat位置94處之甘胺酸，該位置對應於SEQ ID NO: 10之位置98。
8. 如實施例1至7中任一例之經分離抗體，其中該抗體包含VH，其包含SEQ ID NO: 10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58或68中任一者之胺基酸序列。
9. 如實施例1至8中任一例之經分離抗體，其中該抗體包含VL，其包含SEQ ID NO: 12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60或70中任一者之胺基酸序列。
10. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列的VL。
11. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列的VL。
12. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列的VL。
13. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列的VL。
14. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列的VL。
15. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列的VL。
16. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 36之胺基酸序列的VL。
17. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 38之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列的VL。
18. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 44之胺基酸序列的VL。
19. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的VL。
20. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 52之胺基酸序列的VL。
21. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 54之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 56之胺基酸序列的VL。
22. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 58之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列的VL。
23. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 70之胺基酸序列的VL。
24. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 233之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 234之胺基酸序列的VL。
25. 如實施例1至23中任一例之經分離抗體，其中該抗體結合至包含SEQ ID NO: 217及SEQ ID NO: 218之PAD4上的表位。
26. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：重鏈可變區(VH)，其包含有包含SEQ ID NO: 72之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 74之胺基酸序列的HCDR3；及輕鏈可變區(VL)，其包含有包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 76之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 77之胺基酸序列的LCDR3。
27. 如實施例26之經分離抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO: 78、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、122、126、130或134中任一者之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%、或至少99%一致的VH；且其中該抗體包含與SEQ ID NO: 80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、124、128、132或136中任一者之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%、或至少99%一致的VL。
28. 如實施例26之經分離抗體，其中該抗體包含VH，其包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 78、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、122、126、130或134中任一者之胺基酸序列；且其中該抗體包含VL，其包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、124、128、132或136中任一者之胺基酸序列。
29. 如實施例25、26或27之經分離抗體，其中該抗體包含VH，其包含SEQ ID NO: 78、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、122、126、130或134中任一者之胺基酸序列。
30. 如實施例26至29中任一例之經分離抗體，其中該抗體包含VL，其包含SEQ ID NO: 80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、124、128、132或136中任一者之胺基酸序列。
31. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 78之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 80之胺基酸序列的VL。
32. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 82之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 84之胺基酸序列的VL。
33. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 86之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 88之胺基酸序列的VL。
34. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 90之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 92之胺基酸序列的VL。
35. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 94之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 96之胺基酸序列的VL。
36. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 98之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 100之胺基酸序列的VL。
37. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 102之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 104之胺基酸序列的VL。
38. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 106之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 108之胺基酸序列的VL。
39. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 110之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 112之胺基酸序列的VL。
40. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 114之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 116之胺基酸序列的VL。
41. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 118之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 120之胺基酸序列的VL。
42. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 122之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 124之胺基酸序列的VL。
43. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 126之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 128之胺基酸序列的VL。
44. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 130之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 132之胺基酸序列的VL。
45. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 134之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 136之胺基酸序列的VL。
46. 如實施例26至45中任一例之經分離抗體，其中該抗體結合至包含SEQ ID NO: 219及SEQ ID NO: 220之PAD4上的表位。
47. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)，其包含重鏈互補決定區1 (HCDR1)，該HCDR1包含以下胺基酸序列：
a. SEQ ID NO: 138之位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 138之位置50至66之胺基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 138之位置99至108之胺基酸序列；
b. SEQ ID NO: 140之位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 140之位置50至66之胺基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 140之位置99至108之胺基酸序列；
c. SEQ ID NO: 142之位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 142之位置50至66之胺基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 142之位置99至108之胺基酸序列；
d. SEQ ID NO: 144之位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 144之位置50至66之胺基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 144之位置99至108之胺基酸序列；
e. SEQ ID NO: 146之位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 146之位置50至66之胺基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 146之位置99至108之胺基酸序列；
f. SEQ ID NO: 148之位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 148之位置50至66之胺基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 148之位置99至108之胺基酸序列；
g. SEQ ID NO: 150之位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 150之位置50至66之胺基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 150之位置99至108之胺基酸序列；
h. SEQ ID NO: 152之位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 152之位置50至66之胺基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 152之位置99至108之胺基酸序列；
i. SEQ ID NO: 154之位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 154之位置50至66之胺基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 154之位置99至108之胺基酸序列；
j. SEQ ID NO: 156之位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 156之位置50至66之胺基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 156之位置99至108之胺基酸序列；
k. SEQ ID NO: 158之位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 158之位置50至66之胺基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 158之位置99至108之胺基酸序列；
l. SEQ ID NO: 160之位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 160之位置50至66之胺基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 160之位置99至108之胺基酸序列；
m. SEQ ID NO: 162之位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 162之位置50至66之胺基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 162之位置99至108之胺基酸序列；
n. SEQ ID NO: 164之位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 164之位置50至66之胺基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 164之位置99至108之胺基酸序列；
o. SEQ ID NO: 166之位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 166之位置50至66之胺基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 166之位置99至108之胺基酸序列；
p. SEQ ID NO: 168之位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 168之位置50至66之胺基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 168之位置99至108之胺基酸序列；或
q. SEQ ID NO: 170之位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 170之位置50至66之胺基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 170之位置99至108之胺基酸序列；及
其中該抗體包含輕鏈可變區(VL)，其包含：包含SEQ ID NO: 170之殘基24至38之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 170之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 170之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3。
48. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)，其包含重鏈互補決定區1 (HCDR1)，該HCDR1包含以下胺基酸序列：
a. SEQ ID NO: 138之位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 138之位置50至66之胺基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 138之位置99至108之胺基酸序列；
b. SEQ ID NO: 140之位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 140之位置50至66之胺基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 140之位置99至108之胺基酸序列；
c. SEQ ID NO: 142之位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 142之位置50至66之胺基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 142之位置99至108之胺基酸序列；
d. SEQ ID NO: 144之位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 144之位置50至66之胺基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 144之位置99至108之胺基酸序列；
e. SEQ ID NO: 146之位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 146之位置50至66之胺基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 146之位置99至108之胺基酸序列；
f. SEQ ID NO: 148之位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 148之位置50至66之胺基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 148之位置99至108之胺基酸序列；
g. SEQ ID NO: 150之位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 150之位置50至66之胺基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 150之位置99至108之胺基酸序列；
h. SEQ ID NO: 152之位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 152之位置50至66之胺基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 152之位置99至108之胺基酸序列；
i. SEQ ID NO: 154之位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 154之位置50至66之胺基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 154之位置99至108之胺基酸序列；
j. SEQ ID NO: 156之位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 156之位置50至66之胺基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 156之位置99至108之胺基酸序列；
k. SEQ ID NO: 158之位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 158之位置50至66之胺基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 158之位置99至108之胺基酸序列；
l. SEQ ID NO: 160之位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 160之位置50至66之胺基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 160之位置99至108之胺基酸序列；
m. SEQ ID NO: 162之位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 162之位置50至66之胺基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 162之位置99至108之胺基酸序列；
n. SEQ ID NO: 164之位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 164之位置50至66之胺基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 164之位置99至108之胺基酸序列；
o. SEQ ID NO: 166之位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 166之位置50至66之胺基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 166之位置99至108之胺基酸序列；或
p. SEQ ID NO: 168之位置26至35；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 168之位置50至66之胺基酸序列；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 168之位置99至108之胺基酸序列；及
其中該抗體包含輕鏈可變區(VL)，其包含：包含SEQ ID NO: 172之殘基24至38之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 172之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 172之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3。
49. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)，其包含：包含SEQ ID NO: 168之殘基26至35之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、包含SEQ ID NO: 168之殘基50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 168之殘基99至108之胺基酸序列的HCDR；且其中該抗體包含輕鏈可變區(VL)，其包含：包含SEQ ID NO: 172之殘基24至38之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 172之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 172之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3。
50. 如實施例49之經分離抗體，其中與包含有包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列的VL的抗體相比，該抗體在pH 6.0下以較低親和力結合至PAD4。
51. 如實施例1至50中任一例之經分離抗體，其為IgA、IgG或IgM抗體。
52. 如實施例1至50中任一例之經分離抗體，其為IgG抗體，諸如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體或鼠類IgG1或IgG2抗體。
53. 如實施例52之經分離抗體，其中該抗體包含野生型、人類IgG1、IgG2或IgG4重鏈恆定區。
54. 如實施例1至50中任一例之經分離抗體，其中該抗體包含人類IgG1或IgG2重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之胺基酸序列；及/或其中該抗體包含輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之胺基酸序列。
55. 如實施例1至50中任一例之經分離抗體，其中該抗體包含人類IgG1或IgG2重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列，及/或包含輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列。
56. 如實施例1至55中任一例之經分離抗體，其中該抗體包含人類IgG1或IgG2重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列。
57. 如實施例1至56中任一例之經分離抗體，其中該抗體包含輕鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列。
58. 如實施例1至57中任一例之經分離抗體，其為全長抗體。
59. 如實施例1至57中任一例之經分離抗體，其為在重鏈恆定區中缺乏C端離胺酸之IgG抗體。
60. 如實施例1至50中任一例之經分離抗體，其為抗體片段，諸如Fv、單鏈Fv (scFv)、Fab、Fab'或(Fab')
2。
61. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列、然後是SEQ ID NO: 178之胺基酸序列的重鏈(HC)；及包含SEQ ID NO: 70之胺基酸序列、然後是SEQ ID NO: 194之胺基酸序列的輕鏈(LC)。
62. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列、然後是SEQ ID NO: 180之胺基酸序列的重鏈(HC)；及包含SEQ ID NO: 70之胺基酸序列、然後是SEQ ID NO: 194之胺基酸序列的輕鏈(LC)。
63. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 196之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO: 200之胺基酸序列的輕鏈。
64. 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 198之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO: 200之胺基酸序列的輕鏈。
65. 如實施例1至64中任一例之經分離抗體，其為雙特異性或多特異性抗體，或其與至少一個其他分子共價或非共價結合。
66. 如實施例65之經分離抗體，其中該抗體與至少一個其他分子共價或非共價結合，其中該至少一個其他分子包含偵測標記及/或藥物。
67. 一種特異性結合至鼠類蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)，其包含：包含SEQ ID NO: 208之位置31至35之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、包含SEQ ID NO: 208之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 208之位置99至107之胺基酸序列的HCDR3；且其中該抗體包含輕鏈可變區(VL)，其包含：包含SEQ ID NO: 210之殘基24至38之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 210之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 210之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3。
68. 如實施例67之經分離抗體，其中該抗體包含人類IgG1重鏈可變區(VH)，其包含與SEQ ID NO: 208之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之胺基酸序列；及/或其中該抗體包含輕鏈可變區(VL)，其包含與SEQ ID NO: 210之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之胺基酸序列。
69. 如實施例67之經分離抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO: 208之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之VH胺基酸序列；及/或其中該抗體包含與SEQ ID NO: 210之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之VL胺基酸序列。
70. 如實施例67至69中任一例經分離之抗體，其中該抗體包含SEQ ID NO: 208之VH胺基酸序列及/或SEQ ID NO: 210之VL胺基酸序列。
71. 如實施例67至70中任一例之經分離抗體，其中該抗體包含：包含與SEQ ID NO: 210之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之胺基酸序列的重鏈，及/或其中該抗體包含：包含與SEQ ID NO: 212之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之胺基酸序列的輕鏈。
72. 如實施例67至71中任一例之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 212之胺基酸序列的重鏈，及/或其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 214之胺基酸序列的輕鏈。
73. 如實施例1至66中任一項之經分離抗體，其中該抗體不結合至人類蛋白質精胺酸脫亞胺酶2 (PAD2)。
74. 如實施例1至66或73中任一例之經分離抗體，其中該抗體以10至200 nM、50至200 nM、10至100 nM、20至100 nM或50至100 nM之IC50抑制PAD4將肽受質TSTGGRQGSHH (SEQ ID NO: 216)中之精胺酸轉化為瓜胺酸。
75. 如實施例1至66、73或74中任一例之經分離抗體，其中該抗體視情況以劑量依賴性方式以0.1至10 nM (諸如0.2至5 nM)之IC50抑制PAD4將肽受質(SHQEST
RGKSKGKAAAAA; SEQ ID NO: 232)中之精胺酸轉化為瓜胺酸，其中PAD4濃度為1至8 µg/mL。
76. 如實施例1至66或73至75中任一例之經分離抗體，其中該抗體抑制PAD4對
Nα-苯甲醯基-L-精胺酸乙酯鹽酸鹽(BAEE)之脫胺作用。
77. 如實施例1至66或73至76中任一例之經分離抗體，其中該抗體以小於5 nM、小於3 nM、小於1 nM、小於0.5 nM、小於0.1 nM、0.01 nM至5 nM、0.01 nM至1 nM、0.05 nM至1 nM、0.1 nM至1 nM、0.1 nM至0.5 nM、0.05 nM至0.5 nM、0.05 nM至0.1 nM、或0.5 nM至1 nM之K
D特異性結合至PAD4。
78. 如實施例77之經分離抗體，其中該抗體以小於5 nM、小於3 nM、小於1 nM、小於0.5 nM、小於0.1 nM、0.01 nM至5 nM、0.01 nM至1 nM、0.05 nM至1 nM、0.1 nM至1 nM、0.1 nM至0.5 nM、0.05 nM至0.5 nM、0.05 nM至0.1 nM、或0.5 nM至1 nM之K
D特異性結合至PAD4，其係(a)在37℃、在1至2 mM氯化鈣(例如1 mM氯化鈣)之存在下及/或(b)在37℃、在不存在額外Ca
2+及存在2 mM EDTA的情況下藉由表面電漿子共振(surface plasmon resonance；SPR)所測定。
79. 如實施例1至66或73至78中任一例之經分離抗體，其中該抗體在ECM分析中的ECM評分小於50、小於30、小於10、小於5、為1至30、1至20、1至10、1至5、1至3、1、2、3、4或5。
80. 如實施例1至66或73至79中任一例之經分離抗體，其中藉由電腦模擬免疫原性分析(in silico immunogenicity assay)所量測，該抗體之免疫原性小於以下中之一者、兩者或全部三者：Campath®(阿倫單抗(alemtuzumab))、Rituxan®(利妥昔單抗(rituximab))、Zenapax® (達利珠單抗(daclizumab))。
81. 如實施例1至66或73至80中任一例之經分離抗體，其中與同型對照抗體相比，該抗體減少LPS刺激之人類血液單核球中細胞外瓜胺酸化組蛋白H3的量及/或減少GM-CSF之分泌及/或GM-CSF之基因表現。
82. 如實施例1至66或73至81中任一例之經分離抗體，其中該抗體能夠被LPS刺激之人類血液單核球內化。
83. 如實施例1至82中任一例之經分離抗體，其中該抗體抑制PAD4在發炎肺部之功能，例如藉由經肺部所收集之支氣管肺泡灌洗液(broncheoalveolar lavage fluid；BALF)中的(例如H3)之瓜胺酸化減少證明。
84. 如實施例1至83中任一例之經分離抗體，其中該抗體抑制PAD4在發炎關節之功能，例如藉由經關節組織中ITIH4及/或PRG4的瓜胺酸化減少證明。
85. 如實施例1至84中任一例之經分離抗體，其中與同型對照抗體相比，該抗體減少嗜中性球、單核球、M1巨噬細胞及/或M2巨噬細胞中(例如H3)之瓜胺酸化。
86. 如實施例1至66或73至85中任一例之經分離抗體，其中與同型對照抗體相比，該抗體減少在人類PAD4基因敲入小鼠的LPS誘導之急性肺部發炎模型中的BALF中的細胞外瓜胺酸化(例如H3及/或ITIH4瓜胺酸化)的量，視情況其中瓜胺酸化H3的量減少至少15%、至少30%、至少40%、至少50%或至少60%，及/或其中瓜胺酸化ITIH4的量減少至少50%、至少70%或至少80%。
87. 如實施例1至66或73至86中任一例之經分離抗體，其中與同型對照抗體相比，該抗體減少在人類PAD4基因敲入小鼠的LPS誘導之急性關節損傷模型中的小鼠髕骨中細胞外瓜胺酸化(例如PRG4及/或ITIH4瓜胺酸化)的量，視情況其中減少瓜胺酸化ITIH4及/或瓜胺酸化PRG4的EC50為2 nM或更低、1 nM或更低、0.1 nM或更低、0.05至2 nM、或0.1至1 nM。
88. 一種醫藥組合物，其包含如實施例1至87中任一例之抗體及醫藥學上可接受之載劑。
89. 一種經分離核酸或兩種或更多種核酸之集合，該(等)核酸編碼如實施例1至87中任一例之抗體。
90. 一種經分離載體，其包含一或多種編碼如實施例1至87中任一例之抗體之重鏈及輕鏈的核酸。
91. 一種經分離宿主細胞，其包含如實施例89之核酸或如實施例90之載體。
92. 一種產生特異性結合至PAD4之抗體的方法，其包含在適於表現該抗體之條件下培養如實施例91之宿主細胞。
93. 如實施例92之方法，其進一步包含自該宿主細胞回收該抗體。
94. 一種抗體，其係藉由如實施例92或93之方法產生。
95. 一種如實施例1至87中任一例之抗體或如實施例88之醫藥組合物的用途，其係用於製備用以治療自體免疫病症之藥劑。
96. 如實施例95之用途，其中該自體免疫病症為類風濕性關節炎、狼瘡(例如全身性紅斑性狼瘡症(SLE))、狼瘡性腎炎、血管炎(例如ANCA相關血管炎)、血栓(例如靜脈血栓)、發炎性腸病(IBD) (例如潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病)或本文所描述之另一種自體免疫病症。
97. 如實施例1至87中任一例之經分離抗體或如實施例88之醫藥組合物，其係用於治療自體免疫病症。
98. 如實施例97所使用之用途，其中該自體免疫病症為類風濕性關節炎、狼瘡(例如全身性紅斑性狼瘡症(SLE))、狼瘡性腎炎、血管炎(例如ANCA相關血管炎)、血栓(例如靜脈血栓)、發炎性腸病(IBD) (例如潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病)或本文所描述之另一種自體免疫病症。
99. 一種治療有需要個體之自體免疫病症的方法，其包含向該個體投與有效量之如實施例1至87中任一例之經分離抗體或如實施例88之醫藥組合物。
100. 如實施例99之方法，其中該自體免疫病症為類風濕性關節炎、狼瘡(例如全身性紅斑性狼瘡症(SLE))、狼瘡性腎炎、血管炎(例如ANCA相關血管炎)、血栓(例如靜脈血栓)、發炎性腸病(IBD) (例如潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病)或本文所描述之另一種自體免疫病症。
101. 如實施例95至100中任一例之用途、所使用之抗體或方法，其中該方法或用途包含投與至少一種其他治療劑，視情況其中該至少一種其他治療劑為以下中之一或多者：甲胺喋呤(methotrexate)、阿達木單抗(adalimumab)、依那西普(etanercept)、英利昔單抗(infliximab)、羥基氯奎(hydroxychloroquine)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、來氟米特(leflunomide)、阿巴西普(abatacept)、阿那白滯素(anakinra)、賽妥珠單抗(certolizumab)、戈利木單抗(golimumab)、利妥昔單抗、沙利姆單抗(sarilumab)、托珠單抗(tocilizumab)、巴瑞替尼(baricitinib)、托法替尼(tofacitinib)或優帕替尼(upadacitinib)。
其他例示性實施例包括如實施例1至87中任一例之抗體，其包含胺基酸序列之至少一個轉譯後修飾。在一些實施例中，該修飾為將N端Glu或Gln修飾為焦麩胺酸鹽。在一些此類實施例中，輕鏈N端Glu或Gln經修飾為焦麩胺酸鹽。
本文中之揭示內容亦包含：如以上實施例1至87中任一例之抗體或如以上實施例88之醫藥組合物的用途，其係用於製備用以治療有發展RA風險之個體的藥劑；及如以上實施例1至87中任一例之經分離抗體或如以上實施例88之醫藥組合物，其用於治療有發展RA風險之個體。本發明亦涵蓋一種治療有發展RA風險之個體的方法，其包含向該個體投與有效量之如以上實施例1至87中任一例之經分離抗體或如實施例88之醫藥組合物。在某些情況下，個體有以下一或多種狀況：(a)至少一名患有RA的一等親(例如父母或兄弟姐妹)；(b)血清中存在抗瓜胺酸化蛋白質抗體(ACPA)；(c)血清中存在類風濕因子(rheumatoid factor；RF)；(d)至少一個關節出現關節痛；(e)藉由超音波或磁共振成像(magnetic resonance imaging；MRI)觀測到至少一個關節發炎；(f)未分化關節炎。在一些情況下，個體處於緩解期。在一些情況下，該方法或用途包含投與至少一種其他治療劑，視情況其中該至少一種其他治療劑為以下中之一或多者：甲胺喋呤、阿達木單抗、依那西普、英利昔單抗、羥基氯奎、柳氮磺胺吡啶、來氟米特、阿巴西普、阿那白滯素、賽妥珠單抗、戈利木單抗、利妥昔單抗、沙利姆單抗、托珠單抗、巴瑞替尼、托法替尼或優帕替尼。
在其他實施例中，如實施例1至87中任一者之抗體或如實施例88之醫藥組合物可用於製備用以抑制個體之NETosis或METosis的藥劑。在一些實施例中，個體係患有自體免疫病症(諸如類風濕性關節炎、狼瘡(例如全身性紅斑狼瘡症(SLE))、狼瘡性腎炎、血管炎(例如ANCA相關血管炎)、血栓(例如靜脈血栓)、發炎性腸病(IBD) (例如潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病))的個體，或係有發展自體免疫疾病(例如類風濕性關節炎)風險的個體。其他實施例包括如實施例1至87中任一例之經分離抗體或如請求項88之醫藥組合物，其用於抑制個體之NETosis或METosis。在一些實施例中，個體係患有自體免疫病症(諸如類風濕性關節炎、狼瘡、狼瘡性腎炎、血管炎或血栓(例如靜脈血栓)、發炎性腸病(IBD) (例如潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病))或本文所揭示之另一種自體免疫病症的個體。在一些實施例中，個體係有發展自體免疫病症(例如類風濕性關節炎)風險之個體。其他實施例亦包括一種抑制個體中NETosis或METosis的方法，該方法包含向該個體投與有效量之如實施例1至87中任一例之抗體或如實施例88之醫藥組合物。在一些實施例中，個體係患有自體免疫病症(諸如類風濕性關節炎、狼瘡(例如全身性紅斑狼瘡症(SLE))、狼瘡性腎炎、血管炎(例如ANCA相關血管炎)、血栓(例如靜脈血栓)、發炎性腸病(IBD) (例如潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病))或本文所揭示之另一種自體免疫病症的個體。在一些實施例中，個體係有發展自體免疫病症(例如類風濕性關節炎)風險之個體。在一些情況下，該方法或用途包含投與至少一種其他治療劑，視情況其中該至少一種其他治療劑為以下中之一或多者：甲胺喋呤、阿達木單抗、依那西普、英利昔單抗、羥基氯奎、柳氮磺胺吡啶、來氟米特、阿巴西普、阿那白滯素、賽妥珠單抗、戈利木單抗、利妥昔單抗、沙利姆單抗、托珠單抗、巴瑞替尼、托法替尼或優帕替尼。本文中之揭示內容亦涵蓋在活體外抑制生物樣本中NETosis或METosis之方法，其包含向該生物樣本投與有效量之如實施例1至87中任一例之經分離抗體或如實施例88之醫藥組合物。本文中之方法及用途亦包含抑制個體中瓜胺酸化的方法，其包含向該個體投與有效量之如實施例1至87中任一例之經分離抗體，或如實施例1至87中任一例之經分離抗體用於抑制個體中瓜胺酸化的用途，或如實施例1至87中任一例之經分離抗體用於製備用以抑制個體中瓜胺酸化之藥劑的用途。本發明亦包括在活體外抑制生物樣本中瓜胺酸化的方法，其包含向該生物樣本投與有效量之如實施例1至87中任一例之經分離抗體。
在其他實施例中，如實施例1至87中任一例之抗體或如實施例88之醫藥組合物可用於製備預防自體免疫病症(諸如類風濕性關節炎、狼瘡(例如全身性紅斑性狼瘡症(SLE))、狼瘡性腎炎、血管炎(例如ANCA相關血管炎)、血栓(例如靜脈血栓)、發炎性腸病(IBD) (潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病))或本文所揭示之另一種自體免疫病症發作或復發的藥劑，或如實施例1至87中任一例之經分離抗體或如請求項88之醫藥組合物可用於預防自體免疫性病症(諸如類風濕性關節炎、狼瘡(例如全身性紅斑性狼瘡症(SLE))、狼瘡性腎炎、血管炎(例如ANCA相關血管炎)、血栓(例如靜脈血栓)、發炎性腸病(IBD) (例如潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病))或本文所揭示之另一種自體免疫性病症的發作或復發。又其他實施例包括一種預防有需要個體之自體免疫病症(諸如類風濕性關節炎、狼瘡、狼瘡性腎炎、血管炎、血栓(例如靜脈血栓)、發炎性腸病(IBD)、結腸炎、潰瘍性結腸炎)或本文所揭示之另一種自體免疫病症發作或復發的方法，其包含向該個體投與有效量的如實施例1至87中任一例之經分離抗體或如實施例88之醫藥組合物。在一些實施例中，已確定個體易發作或復發病症。在本文中之一些此類用途及方法中，將抗體與另一種治療劑一起向個體投與。
在另外的實施例中，如實施例1至87中任一例之經分離抗體或如實施例88之醫藥組合物可用於製備治療癌症之藥劑，或該經分離抗體或醫藥組合物可用於治療癌症。其他實施例亦包括一種治療有需要個體之癌症的方法，其包含向該個體投與有效量之如實施例1至87中任一例之經分離抗體或如實施例88之醫藥組合物。在一些情況下，此類方法或用途包含向個體投與至少一種其他治療劑，諸如免疫檢查點抑制劑、化學治療劑、抗血管生成劑或抗腫瘤劑，或另一種療法，諸如放射線療法、激素療法或手術治療。
在其他實施例中，如實施例1至87中任一例之抗體或如實施例88之醫藥組合物可用於製備治療傳染病之藥劑，或如實施例1至87中任一例之經分離抗體或如實施例88之醫藥組合物可用於治療傳染病。其他實施例包括一種治療有需要個體之傳染病的方法，其包含投與有效量的本文之抗體。在本文中之一些此類用途及方法中，將抗體與另一種治療劑一起投與。
應理解，前文一般描述及以下詳細描述兩者僅為例示性及解釋性的，且並不限定申請專利範圍。本文所引用之所有參考文獻均以全文引用的方式併入本文中。
相關申請之交互引用
本申請案主張2022年7月22日申請之美國臨時申請案第63/369,184號及2022及8月12日申請之美國臨時申請案第63/397,698號之優先權權益，該兩個臨時申請案均以全文引用之方式併入本文中。
I. 定義
除非另有定義，否則結合本發明使用之科學與技術術語將具有一般熟習此項技術者通常理解之含義。此外，除非上下文另有要求，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。
在本申請案中，除非另有陳述，否則「或」之使用意謂「及/或」。在多個附屬項的上下文中，使用「或」僅以擇一方式重新提及超過一個前述獨立項或附屬項。此外，除非另有具體說明，否則諸如「元素」或「組分」之術語涵蓋包含一個單位之元素及組分及包含多於一個次單位之元素及組分兩者。
與重組DNA、寡核苷酸合成、組織培養及轉型(例如電穿孔、脂質體轉染)、酶促反應及純化技術結合使用之例示性技術描述於例如Sambrook等人Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))等處。
如本文所使用，術語「約」係指數值，包括例如整數、分數及百分比，無論是否明確指示。術語「約」通常係指一般熟習此項技術者將認為等於所列舉值(例如，具有相同功能或結果)之數值的範圍(例如，所列舉範圍之+/-5-10%)。當諸如至少及約的術語出現在數值或範圍清單之前時，該等術語將修改清單中提供的所有值或範圍。在一些情況下，術語約可包括經捨入至最接近有效數字之數值。
術語「多肽」係指胺基酸殘基之聚合物，且不限於最小長度。「蛋白質」可包含一或多個多肽。此類胺基酸殘基之聚合物可含有天然或非天然胺基酸殘基，且包括(但不限於)肽、寡肽、胺基酸殘基之二聚體、三聚體及多聚體。定義涵蓋全長蛋白與其片段。該等術語亦包括多肽之表現後修飾，例如醣基化、唾液酸化、乙醯化、磷酸化及其類似修飾。此外，出於本發明之目的，「多肽」或「蛋白質」係指分別包括天然序列之諸如缺失、添加及取代(一般在性質上係保守取代)之修飾的多肽或蛋白質，只要該蛋白質維持所需活性即可。此等修飾可為有意的，如經由定點突變誘發，或可為偶然的，諸如經由產生蛋白質之宿主的突變或因PCR擴增所致的錯誤。蛋白質可包含兩個或更多個多肽。
如本文所用，除非另有明確說明(亦即，鼠類PAD4、獼猴PAD4或類似者)，否則「PAD4」或「蛋白質精胺酸脫亞胺酶4」或「肽基精胺酸脫亞胺酶4」係指人類PAD4 (huPAD4；UniProt ID: Q9UM07)。例示性人類PAD4胺基酸序列顯示於SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2以及SEQ ID NO: 3中。
本文中之術語「抗體」係指包含重鏈之至少互補決定區(CDR) 1、CDR2及CDR3及輕鏈之至少CDR1、CDR2及CDR3的分子，其中該分子能夠結合至抗原。術語係以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體、雙功能抗體等)、全長抗體、單鏈抗體、抗體結合物及抗體片段，只要其展現所需PAD4特異性結合活性即可。
「經分離(isolated)」抗體係已與其天然環境之組分分離之抗體。在一些態樣中，藉由例如電泳(例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細電泳法)或層析(例如，離子交換或逆相HPLC)所測定，抗體經純化至大於95%或99%之純度。關於評估抗體純度之方法的綜述， 參見例如Flatman等人，
J. Chromatogr. B848:79-87 (2007)。
「抗原」係指抗體標靶，亦即抗體所特異性結合之分子。術語「表位」表示抗體所結合之蛋白質或非蛋白質抗原上之位點。蛋白質上之表位可以由連續的胺基酸延伸段(線性表位)形成，或包含例如由於抗原的摺疊(亦即，藉由蛋白質抗原之三級摺疊)而在空間上接近的非連續胺基酸(構形表位)。線性表位通常在蛋白質抗原暴露於變性劑之後仍與抗體結合，而構形表位通常在用變性劑處理之後遭到破壞。
「抗PAD4抗體」或「PAD4抗體」或「特異性結合至PAD4之抗體」或「結合至PAD4之抗體」及類似片語係指如本文所定義的特異性結合至PAD4之抗體。
術語「重鏈」係指包含至少一重鏈可變區、具有或不具有前導序列之多肽。在一些實施例中，重鏈包含重鏈恆定區的至少一部分。術語「全長重鏈」係指包含重鏈可變區及重鏈恆定區、具有或不具有前導序列之多肽。
術語「輕鏈」係指包含至少一輕鏈可變區、具有或不具有前導序列的多肽。在一些實施例中，輕鏈包含輕鏈恆定區的至少一部分。術語「全長輕鏈」係指包含輕鏈可變區及輕鏈恆定區、具有或不具有前導序列之多肽。
如本文所用，術語「互補決定區」(「CDR」)係指抗體可變區中序列高度可變且決定抗原結合特異性的各區域。大體而言，抗體包含六個CDR：三個位於VH中(CDR-H1或重鏈CDR1、CDR-H2、CDR-H3)，且三個位於VL中(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。除非另外指明，否則根據本文中之序列表確定CDR。
「構架」或「FR」係指可變區殘基中不屬於互補決定區(CDR)之一部分的殘基。可變區之FR一般由四個FR組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，CDR及FR序列通常按以下順序出現在VH(或VL)中: FR1-CDR-H1(CDR-L1)-FR2-CDR-H2(CDR-L2)-FR3- CDR-H3(CDR-L3)-FR4。
術語「可變區」或「可變域」係指涉及抗體與抗原之結合的抗體重鏈或輕鏈域。天然抗體之重鏈及輕鏈之可變域(分別為VH及VL)一般具有相似的結構，各域包含四個保守構架區(FR)及三個互補決定區(CDR)。參見例如Kindt等人
Kuby Immunology, 第6版，W.H. Freeman and Co., 第91頁(2007)。可變域可包含重鏈(HC) CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3，具有或沒有全部或一部分FR1及/或FR4；及輕鏈(LC) CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3，具有或沒有全部或一部分FR1及/或FR4。亦即，可變域可缺乏FR1及/或FR4之一部分，只要其保留抗原結合活性即可。單個VH或VL域可能足以賦予抗原結合特異性。此外，可使用VH或VL域自結合抗原之抗體分離結合特定抗原之抗體，以分別篩選互補的VL或VH域之集合庫。參見例如Portolano等人，
J. Immunol.150 :880-887 (1993)；Clarkson等人，
Nature352 :624-628 (1991)。
抗體之輕鏈及重鏈「恆定區」係指FR及CDR以及可變區之外的其他序列部分。某些抗體片段可缺乏全部或一些恆定區。各重鏈自N端至C端具有可變域(VH) (亦稱為可變重鏈域或重鏈可變區)，接著為三個恆定重鏈域(CH1、CH2及CH3)。類似地，各輕鏈自N端至C端具有可變域(VL) (亦稱為可變輕鏈域或輕鏈可變區)，接著為恆定輕鏈(CL)域。
本文中的術語「Fc區」用於定義含有至少一部分恆定區之免疫球蛋白重鏈之C端區。該術語包括天然序列Fc區及變異Fc區。在一個態樣中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基端的Gly446及Lys447 (EU編號)。宿主細胞所產生的抗體可在重鏈C端經歷一或多個(尤其是一或兩個)胺基酸之轉譯後分裂。因此，藉由表現編碼全長重鏈之特定核酸分子由宿主細胞所產生之抗體可包括全長重鏈，或其可包括全長重鏈之分裂變異體。其可能是重鏈之最後兩個C端胺基酸分別為甘胺酸及離胺酸的情況。因此，Fc區之C端離胺酸或C端甘胺酸及離胺酸可以存在或可以不存在。因此，「全長重鏈恆定區」或「全長抗體」，例如係人類IgGl抗體，包括具有C端甘胺酸及離胺酸兩者，但不含C端離胺酸或不含C端甘胺酸及離胺酸兩者的IgG1。除非本文另有說明，否則Fc區或恆定區中之胺基酸殘基係根據EU編號系統」亦稱為EU索引)編號，如Kabat等人，
Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991中所描述。
「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區之彼等生物活性，其隨抗體同型變化。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；及B細胞活化。
抗體「類別」係指其重鏈所具有之恆定域或恆定區的類型。存在五個主要類別之抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等抗體中之若干個可進一步分成子類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同類別之免疫球蛋白之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。抗體之輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列歸為兩種類型中之一種，稱為卡帕(kappa) (κ)及拉姆達(lambda) (λ)。
「抗體片段」係指並非完整抗體之分子，其包含完整抗體中與完整抗體所結合之抗原(亦即PAD4)進行結合的部分。抗體片段之實例包括(但不限於) Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')
2；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv及scFab)；單域抗體(dAb)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。對於某些抗體片段之綜述而言，參見Holliger及Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005)。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用，係指具有實質上與天然抗體結構類似之結構，或在IgG抗體的情況下具有含有如上文所定義之Fc區的重鏈的抗體。
術語「嵌合」抗體係指其中重鏈及/或輕鏈之一部分來源於特定來源或物種，而該重鏈及/或輕鏈之剩餘部分來源於不同來源或物種之抗體。
「人源化」抗體係指包含來自非人類CDR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基之嵌合抗體。在某些態樣中，人源化抗體將包含實質上全部至少一個且通常兩個可變域，其中全部或實質上全部CDR對應於非人類抗體之CDR，且全部或實質上全部FR對應於人類抗體之FR。人源化抗體視情況可包含來源於人類抗體之抗體恆定區之至少一部分。抗體(例如非人類抗體)之「人源化形式」係指已進行人源化之抗體。
如本文所使用，術語「單株抗體」係指自實質上均質之抗體群體獲得的抗體，亦即，除了例如含有天然存在之突變或在單株抗體製劑製備期間產生的可能變異體抗體外，構成該群體之個別抗體係相同的及/或結合相同表位，該等變異體一般少量存在。與典型地包括針對不同決定子(表位)之不同抗體的多株抗體製劑形成對比，單株抗體製劑中之各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。因此，修飾語「單株」表示獲自實質上均質抗體群體之抗體特性，且不應解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。
「多特異性」抗體為特異性結合至超過一個目標抗原的抗體，而「雙特異性」抗體為特異性結合至兩個抗原的抗體。「抗體結合物」係與一或多種異源分子(包括但不限於治療劑或標記)結合之抗體。
抗體可以作為某些宿主細胞生產過程的一部分或透過活體內代謝進行修飾。本文中之抗體或抗體區胺基酸序列意欲不僅涵蓋特定胺基酸序列，而且涵蓋轉譯後修飾之序列，例如包括側鏈修飾及裂解。此類轉譯後修飾可例如由於在宿主細胞中產生抗體及/或由於動物(例如人類)的活體內轉譯後修飾而發生。
在一些實施例中，本文所揭示之抗體包含轉譯後修飾(例如一或多個轉譯後修飾)。轉譯後修飾可包括例如泛素化、磷酸化、乙醯化、羥基化、甲基化、醣基化、單磷酸腺苷酸化、異戊烯化、去醯胺化、消除(elimylation)、瓜胺酸化及胺甲醯化。在一些實施例中，抗體未經轉譯後修飾。
如上文所指出，抗體可經歷一或多個，尤其是一個或兩個來自重鏈之C端的胺基酸(通常為Gly-Lys)之轉譯後裂解。此裂解可例如由於在宿主細胞中產生抗體之過程而發生。藉由表現編碼全長重鏈之特定核酸分子產生之抗體可包括全長重鏈，或其可包括全長重鏈之裂解變異體，諸如缺乏C端Lys或C端Lys之重鏈。
其他類型之轉譯後修飾可在抗體產生期間發生或以其他方式在活體內發生，諸如胺基酸側鏈之修飾。舉例而言，抗體鏈上之N端Glu或Gln殘基可經轉譯後修飾為N端焦麩胺酸鹽(亦稱為吡咯啶甲酸鹽；縮寫為pE)。
關於肽、多肽或抗體序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」及「同源性」被定義為在比對序列且必要時引入空位以實現最大序列一致性百分比之後，候選序列中之胺基酸殘基與特定肽或多肽序列中之胺基酸殘基一致的百分比。出於測定胺基酸序列一致性百分比之目的之比對可以在此項技術之技能範圍內的各種方式達成，例如使用公開可用之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM (DNASTAR)軟體來達成。熟習此項技術者可確定用於量測比對之適當參數，包括在所比較序列之全長內達成最大比對所需的任何演算法。
術語「信號序列」或「前導序列」係指位於多肽N端，有助於自哺乳動物細胞分泌多肽的胺基酸殘基序列。前導序列可在自哺乳動物細胞輸出多肽時裂解形成成熟蛋白。前導序列可為天然或合成的，且可與其所連接之蛋白質異源或同源。非限制性例示性前導序列亦包括來自異源蛋白之前導序列。在一些實施例中，抗體缺乏前導序列。在一些實施例中，抗體包含至少一個前導序列，其可選自天然抗體前導序列及異源前導序列。
術語「核酸分子」或「多核苷酸」包括包含核苷酸聚合物之任何化合物及/或物質。各核苷酸由鹼基，具體而言嘌呤或嘧啶鹼基(亦即胞嘧啶I、鳥嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(亦即去氧核糖或核糖)及磷酸酯基構成。通常，核酸分子係由鹼基序列描述，其中該等鹼基表示核酸分子之一級結構(線性結構)。該鹼基序列通常係自5'至3'表示。在本文中，術語核酸分子涵蓋去氧核糖核酸(DNA)，包括例如互補DNA (cDNA)及基因體DNA；核糖核酸(RNA)，尤其是信使RNA (mRNA)；合成形式之DNA或RNA；及包含兩個或更多個此等分子之混合聚合物。核酸分子可呈線性或環狀。另外，術語核酸分子包括有義股及反義股兩者，以及單股及雙股形式。此外，本文所描述之核酸分子可含有天然存在或非天然存在之核苷酸。非天然存在之核苷酸之實例包括具有衍生糖或磷酸酯主鏈鍵或經化學修飾之殘基之經修飾核苷酸鹼基。核酸分子亦涵蓋DNA及RNA分子，其適用作活體外及/或活體內，例如在宿主或患者中直接表現本發明之抗體之載體。此類DNA (例如cDNA)或RNA (例如mRNA、環狀RNA)載體可未經修飾或經修飾。
「經分離」核酸係指已與其天然環境之組分分離之核酸分子。經分離核酸包括通常含有核酸分子之細胞中所含的核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外或存在於不同於其天然染色體位置之染色體位置處。
「編碼抗PAD4抗體之經分離核酸」係指編碼抗PAD4抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之一或多個核酸分子，包括單一載體或不同載體中之此類核酸分子，及存在於宿主細胞中一或多個位置處之此類核酸分子。
如本文所使用，術語「載體」係指能夠傳播與其連接之另一核酸的核酸分子。該術語包括呈自我複製核酸結構之載體以及併入其所引入之宿主細胞基因體中的載體。某些載體能夠導引其以操作方式連接之核酸的表現。此等載體在本文中稱為「表現載體」。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指已引入有外源核酸之細胞，包括該等細胞之後代。
在本發明中，當提及例如蛋白質及其配位體或抗體及其抗原標靶或一些其他結合對時，「結合(binds/binding」或「特異性結合(specific binding)」及類似術語意謂結合對成員之間的結合親和力足夠強，以至於相互作用無法歸因於隨機分子締合(亦即「非特異性結合」)。此類結合通常需要1 μM或更小的解離常數(K
D)，且通常可涉及100 nM或更小的K
D。
「親和力」係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間的非共價相互作用力之總和。除非另有指示，否則如本文所使用，「結合親和力」係指反映結合對(例如，抗體與抗原)成員之間1:1相互作用之固有結合親和力。親和力通常可由解離常數(K
D)表示。抗體對抗原之親和力可藉由此項技術中已知之常見方法，諸如表面電漿子共振(SPR)量測。
如本文所使用，術語「促效劑」係指使與其結合之分子的至少一種活性或功能增加、或以其他方式活化或幫助活化該分子的物質，例如抗體。如本文所使用，術語「拮抗劑」或「抑制劑」係指使與其結合之分子的至少一種活性或功能減少、或以其他方式阻斷或抑制該分子之至少一種活性或功能的物質，例如抗體。
術語「抑制(inhibition/inhibit)」更一般而言係指減少或停止任何事件(諸如蛋白質配位體結合)，或減少或停止任何表型特徵，或減少或停止該特徵之發生率、程度或可能性。「降低(reduce)」或「抑制(inhibit)」係指與參考相比減少、降低或遏制活性、功能及/或量。抑制或降低不一定為完全的。舉例而言，在某些實施例中，「降低」或「抑制」意謂能夠整體減少20%或更多。在另一實施例中，「降低」或「抑制」意謂能夠整體減少50%或更多。在另一實施例中，「降低」或「抑制」意謂能夠整體減少75%、85%、90%、95%或更多。
如本文所使用，「治療」涵蓋人類疾病治療劑的任何投與或施用，且包括抑制疾病或疾病之進展或一或多種疾病症狀，抑制或減緩疾病或其進展或其一或多種症狀，遏制其發展，部分或完全減輕疾病或其一或多種症狀，或預防疾病之一或多種症狀復發。
術語「個體」及「患者」在本文中可互換使用以指人類，除非另有明確指示(亦即，鼠類個體或其類似者)。
如本文所使用，「自體免疫疾病」或「自體免疫疾病」涵蓋特徵在於個體免疫系統攻擊其自身正常細胞及組織的疾病，並且亦涵蓋特徵可在於或可不在於存在自體抗體的免疫介導性疾病。本發明通篇提供自體免疫疾病之許多非限制性實例。自體免疫疾病之一些非限制性實例包括類風濕性關節炎(RA)、狼瘡(例如全身性紅斑狼瘡症(SLE))、狼瘡性腎炎、血管炎(例如ANCA相關血管炎)、血栓(例如靜脈血栓)及發炎性腸病(IBD) (例如潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病)。術語「疾病」與「病症」在本文中可互換使用。在一些實施例中，自體免疫疾病之特徵在於存在自體抗體。
術語「有效量」或「治療有效量」係指有效治療個體之疾病或病症以便部分或完全減輕一或多種症狀之藥物的量。在一些實施例中，有效量係指在所需劑量及時間段下有效達成所需治療或預防結果的量。
如本文所使用之「生物樣本」係指自個體或自動物獲取之樣本。生物樣本之實例包括組織樣本及液體生物樣本，諸如全血、血清、血漿、血液上清液或滑液。生物樣本可以直接取自個體，或者可以在使用之前首先以某種方式進行化學或物理修飾，例如，以便幫助分析樣本。
II. 例示性抗PAD4抗體
本文提供特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之抗體。在一些實施例中，抗體抑制PAD4之活性，諸如精胺酸之瓜胺酸化。
植株 13 及相關抗體
舉例而言，本文中之揭示內容係關於基於被稱作「植株13」的鼠類抗人類抗體之一組抗體，例如如下文實例1中進一步描述。例如，植株13係以其原始的鼠類抗人類形式製備，然後進行人源化以產生一系列稱為hz13-1至hz13-12的抗體，其中hz13-5及hz13-12在位置D31至D31E處進一步得以修飾(抗體hz13-5 D31E及hz13-12 D31E)，如本文實例中所描述。進行植株13 Fab與PAD4結合的低溫EM研究，並進行互補位定位以鑑別植株13可變區及其直接接觸PAD4之人源化變異體的部分，提供關於植株13可變區部分及其決定PAD4結合之相關人源化抗體的其他結構資訊。(參見以下實例12至13)。亦進一步修飾抗體hz13-5，以鑑別以pH依賴性方式結合至PAD4之抗體。(參見以下子章節及實例14)。
舉例而言，在一些實施例中，本發明係關於一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：重鏈可變區(VH)，其包含有包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的HCDR3；及輕鏈可變區(VL)，其包含有包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的LCDR3。
在一些實施例中，本發明係關於一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)，其包含有包含SEQ ID NO: 62之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的HCDR3；及輕鏈可變區(VL)，其包含有包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的LCDR3。
在一些實施例中，本發明係關於一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：重鏈可變區(VH)，其包含有包含SEQ ID NO: 4或62之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)及包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的HCDR3；及輕鏈可變區(VL)，其包含有包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)。詳言之，對包含以上重鏈及輕鏈CDR集合之抗體的互補位定位及結構分析揭露，與PAD4接觸的係HCDR1、HCDR3及LCDR1。(參見圖8A至圖8B)。因此，在一些實施例中，本文中之抗體包含上述此等三個CDR之集合。在一些實施例中，抗體包含VH及VL，該VH包含：包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的HCDR1及包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的HCDR3；該VL包含：包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的LCDR1。在其他實施例中，抗體包含VH及VL，該VH包含：包含SEQ ID NO: 62之胺基酸序列的HCDR1及包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的HCDR3；該VL包含：包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的LCDR1。
在一些實施例中，抗體包含重鏈可變區(VH)，其包含SEQ ID NO: 221或225之胺基酸序列及SEQ ID NO: 222之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL)，其包含SEQ ID NO: 223之胺基酸序列。此等互補位區中之各者均被鑑別為接觸PAD4，如實例及圖8A至圖8B中所描述。在一些實施例中，該抗體進一步包含：包含SEQ ID NO: 224之胺基酸序列的輕鏈恆定區。
在一些實施例中，抗體包含VH，其包含Kabat位置94處的甘胺酸(Gly94)。(參見圖1E)。因此，舉例而言，最初鑑別之小鼠抗人類之子胡13抗體包含Kabat位置94處之甘胺酸，但若干人類構架區不包含甘胺酸。因此，在某些人源化抗體中，需要進行回復突變才能在Kabat位置94獲得甘胺酸。Gly94係與VH CDR3相鄰之環(亦即，VH CDR3環)中的胺基酸殘基。在一些實施例中，Gly94與VH CDR3環之靈活性及/或幾何結構有關。在一些實施例中，Gly94可與VH CDR3相互作用。在一些實施例中，Gly94與抗PAD4抗體之活性有關。在一些實施例中，Gly94突變為不同的胺基酸(諸如蘇胺酸)導致VH CDR3環的靈活性降低、VH CDR3環的幾何結構改變、位置94處的胺基酸與VH CDR3環之間的相互作用降低、抗PAD4抗體與PAD4的結合減少、抗PAD4抗體之活性降低、抗PAD4抗體與細胞外基質(ECM)蛋白的結合增加、抗PAD4抗體二級結構之改變、抗PAD4抗體穩定性的降低、或其任何組合。因此，在一些實施例中，抗體之VH包含Kabat位置94 (SEQ ID NO: 10之位置98)處之甘胺酸。(參見圖1E，其描繪剛好位於HCDR3之前的此殘基位置)。
在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58或68中任一者之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60或70中任一者之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：與SEQ ID NO: 10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58或68中任一者之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及與SEQ ID NO: 12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60或70中任一者之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含VH，其包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58或68中任一者的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含VL，其包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60或70中任一者的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：VH，其包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58或68中任一者的胺基酸序列；及VL，其包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60或70中任一者的胺基酸序列。在一些此類情況下：該抗體VH及VL進一步包含：(a)包含SEQ ID NO: 4或62之胺基酸序列的HCDR1，及包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的HCDR3，以及包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的LCDR1；(b)包含SEQ ID NO: 4或62之胺基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的HCDR2、包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的HCDR3、包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的LCDR2、包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的LCDR3；或(c) VH中SEQ ID NO: 221或225之胺基酸序列及VL中SEQ ID NO: 222之胺基酸序列，進一步視情況地，輕鏈恆定區包含SEQ ID NO:224之胺基酸序列。因此，在此類情況下，VH及VL與上文所列之序列識別編號相比的變異位於此等特定CDR或互補位序列之外的區域。在一些實施例中，抗體包含VH，其包含SEQ ID NO: 10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58或68中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含VL，其包含SEQ ID NO: 12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60或70中任一者之胺基酸序列。
在又其他實施例中，抗體包含以下兩者：VH，其包含SEQ ID NO: 10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58或68中任一者之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO: 12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60或70中任一者之胺基酸序列。因此，舉例而言，以下例示性抗體在本發明之範疇內：
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列的VL；
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列的VL；
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列的VL；
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列的VL；
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列的VL；
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列的VL；
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 36之胺基酸序列的VL；
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 38之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列的VL；
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 44之胺基酸序列的VL；
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的VL；
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 52之胺基酸序列的VL；
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 54之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 56之胺基酸序列的VL；
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 58之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列的VL；
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 70之胺基酸序列的VL。
在以上抗體中任一者中，在一些情況下，抗體結合至包含SEQ ID NO: 217及SEQ ID NO: 218之PAD4上的表位。
在本文之一些實施例中，抗體為IgA、IgG或IgM抗體。在一些情況下，抗體為IgG抗體，諸如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體，或鼠類IgG1或IgG2抗體。在一些情況下，抗體包含野生型、人類IgG1、IgG2或IgG4重鏈恆定區。在一些實施例中，抗體包含全長重鏈及/或全長輕鏈。在其他情況下，抗體在重鏈恆定區末端缺乏C端離胺酸。在又其他情況下，抗體在重鏈恆定區末端缺乏C端甘胺酸-離胺酸。在一些情況下，抗體為抗體片段，諸如Fv、單鏈Fv (scFv)、Fab、Fab'或(Fab')
2。
在一些實施例中，抗體為雙特異性或多特異性抗體，或其與至少一個其他分子共價或非共價結合。在一些實施例中，抗體與至少一個其他分子共價或非共價結合，其中該至少一個其他分子包含偵測標記及/或藥物。
在一些實施例中，抗體包含人類IgG1重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：人類IgG1重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的胺基酸序列；及輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的胺基酸序列。在一些情況下，抗體包含重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列。在一些情況下，抗體包含輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列。在一些情況下，抗體包含以下兩者：重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列；及輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含人類IgG1重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含輕鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：人類IgG1重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列；及輕鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列。
植株 20 及相關抗體
本發明進一步係關於第二小鼠抗人類抗體、植株20及其變化形式變異體hz20-1至hz20-14，如以下實例中所描述。因此，在一些實施例中，本發明係關於一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：重鏈可變區(VH)，其包含有包含SEQ ID NO: 72之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 74之胺基酸序列的HCDR3；及輕鏈可變區(VL)，其包含有包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 76之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 77之胺基酸序列的LCDR3。
在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 78、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、122、126、130或134中任一者之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、124、128、132或136中任一者之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，該抗體包含VH，其包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 78、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、122、126、130或134中任一者之胺基酸序列，且其中該抗體包含VL，其包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、124、128、132或136中任一者之胺基酸序列。在一些此類情況下，抗體VH進一步包含：包含SEQ ID NO: 72之胺基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列的HCDR2或包含SEQ ID NO: 74之胺基酸序列的HCDR3。在一些情況下，抗體VL進一步包含：包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 76之胺基酸序列的LCDR2或包含SEQ ID NO: 77之胺基酸序列的LCDR3。在一些實施例中，抗體包含VH，其包含SEQ ID NO: 78、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、122、126、130或134中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含VL，其包含SEQ ID NO: 80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、124、128、132或136中任一者之胺基酸序列。
在又其他實施例中，抗體包含VH，其包含SEQ ID NO: 78、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、122、126、130或134中任一者之胺基酸序列；且包含VL，其包含SEQ ID NO: 80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、124、128、132或136中任一者之胺基酸序列。因此，舉例而言，以下例示性抗體在本發明之範疇內：
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 78之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 80之胺基酸序列的VL；
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 82之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 84之胺基酸序列的VL；
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 86之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 88之胺基酸序列的VL；
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 90之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 92之胺基酸序列的VL；
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 94之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 96之胺基酸序列的VL；
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 98之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 100之胺基酸序列的VL；
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 102之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 104之胺基酸序列的VL；
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 106之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 108之胺基酸序列的VL；
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 110之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 112之胺基酸序列的VL；
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 114之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 116之胺基酸序列的VL；
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 118之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 120之胺基酸序列的VL；
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 122之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 124之胺基酸序列的VL；
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 126之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 128之胺基酸序列的VL；
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 130之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 132之胺基酸序列的VL；
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 134之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 136之胺基酸序列的VL。
在以上抗體中任一者中，在一些情況下，抗體結合至包含SEQ ID NO: 219及SEQ ID NO: 220之PAD4上的表位。
在本文之一些實施例中，抗體為IgA、IgG或IgM抗體。在一些情況下，抗體為IgG抗體，諸如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體，或鼠類IgG1或IgG2抗體。在一些情況下，抗體包含野生型、人類IgG1、IgG2或IgG4重鏈恆定區。在某些態樣中，抗體屬於人類IgG1同型。在某些態樣中，抗體屬於人類IgG1同型，其具有P329G、L234A及L235A突變(LALAPG；EU編號)以減弱Fc區效應功能。在其他態樣中，抗體屬於人類IgG2同型。在某些態樣中，抗體屬於IgG4同型，其中鉸鏈區中具有S228P突變(EU編號)以改良IgG4抗體之穩定性。在一些態樣中，抗體(例如非人源化抗體)可具有非人類IgG恆定區，且可為例如鼠類IgG2a抗體，諸如鼠類IgG2a LAPG抗體。在一些實施例中，抗體包含全長重鏈及/或全長輕鏈。在其他情況下，抗體在重鏈恆定區末端缺乏C端離胺酸。在又其他情況下，抗體在重鏈恆定區末端缺乏C端甘胺酸-離胺酸。在一些情況下，抗體為抗體片段，諸如Fv、單鏈Fv (scFv)、Fab、Fab'或(Fab')
2。
在一些實施例中，抗體為雙特異性或多特異性抗體，或其與至少一個其他分子共價或非共價結合。在一些實施例中，抗體與至少一個其他分子共價或非共價結合，其中該至少一個其他分子包含偵測標記及/或藥物。
在一些實施例中，抗體包含人類IgG1重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：人類IgG1重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的胺基酸序列；及輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的胺基酸序列。在一些情況下，抗體包含重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列。在一些情況下，抗體包含輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列。在一些情況下，抗體包含以下兩者：重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列；及輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含人類IgG1重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含輕鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：人類IgG1重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列；及輕鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列。
pH 依賴性植株 13 相關抗體
在一些實施例中，本發明係關於親本抗體植株13或hz13-5之一或多種抗體變異體，其中特定殘基係如以下實例14中所描述進行修飾。在某些情況下，但並非在所有情況下，此等修飾均顯示影響PAD4結合之pH依賴性，如實例14中所描述。
在一些實施例中，本發明係關於一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含VH，其包含：包含位置26至35之胺基酸序列的HCDR1；包含位置50至66之胺基酸序列的HCDR2；及包含SEQ ID NO: 138、SEQ ID NO: 140、SEQ ID NO: 142、SEQ ID NO: 144、SEQ ID NO: 146、SEQ ID NO: 148、SEQ ID NO: 150、SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 154、 SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 166或SEQ ID NO: 168之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3。在以上一些實施例中，抗體進一步包含VL，其包含：包含SEQ ID NO: 170之殘基24至38之胺基酸序列的LCDR1；包含SEQ ID NO: 170之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2；及包含SEQ ID NO: 170之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3。在以上其他實施例中，抗體進一步包含VL，其包含：包含SEQ ID NO: 172之殘基24至38之胺基酸序列的LCDR1；包含SEQ ID NO: 172之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2；及包含SEQ ID NO: 172之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3。
在一些實施例中，該抗體包含：
- VH，其包含：包含SEQ ID NO: 138之位置26至35之胺基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 138之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 138之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO: 170之殘基24至38之胺基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 170之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 170之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3；
- VH，其包含：包含SEQ ID NO: 140之位置26至35之胺基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 140之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 140之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO: 170之殘基24至38之胺基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 170之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 170之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3；
- VH，其包含：包含SEQ ID NO: 142之位置26至35之胺基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 142之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 142之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO: 170之殘基24至38之胺基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 170之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 170之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3；
- VH，其包含：包含SEQ ID NO: 144之位置26至35之胺基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 144之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 144之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO: 170之殘基24至38之胺基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 170之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 170之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3；
- VH，其包含：包含SEQ ID NO: 146之位置26至35之胺基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 146之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 146之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO: 170之殘基24至38之胺基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 170之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 170之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3；
- VH，其包含：包含SEQ ID NO: 148之位置26至35之胺基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 148之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 148之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO: 170之殘基24至38之胺基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 170之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 170之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3；
- VH，其包含：包含SEQ ID NO: 150之位置26至35之胺基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 150之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 150之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO: 170之殘基24至38之胺基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 170之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 170之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3；
- VH，其包含：包含SEQ ID NO: 152之位置26至35之胺基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 152之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 152之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO: 170之殘基24至38之胺基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 170之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 170之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3；
- VH，其包含：包含SEQ ID NO: 154之位置26至35之胺基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 154之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 154之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO: 170之殘基24至38之胺基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 170之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 170之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3；
- VH，其包含：包含SEQ ID NO: 156之位置26至35之胺基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 156之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 156之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO: 170之殘基24至38之胺基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 170之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 170之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3；
- VH，其包含：包含SEQ ID NO: 158之位置26至35之胺基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 158之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 158之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO: 170之殘基24至38之胺基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 170之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 170之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3；
- VH，其包含：包含SEQ ID NO: 160之位置26至35之胺基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 160之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 160之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO: 170之殘基24至38之胺基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 170之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 170之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3；
- VH，其包含：包含SEQ ID NO: 162之位置26至35之胺基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 162之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 162之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO: 170之殘基24至38之胺基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 170之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 170之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3；
- VH，其包含：包含SEQ ID NO: 164之位置26至35之胺基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 164之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 164之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO: 170之殘基24至38之胺基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 170之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 170之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3；
- VH，其包含：包含SEQ ID NO: 166之位置26至35之胺基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 166之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 166之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO: 170之殘基24至38之胺基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 170之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 170之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3；或
- VH，其包含：包含SEQ ID NO: 168之位置26至35之胺基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 168之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 168之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO: 170之殘基24至38之胺基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 170之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 170之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3。
在一些實施例中，該抗體包含：
- VH，其包含：包含SEQ ID NO: 138之位置26至35之胺基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 138之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 138之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO: 172之殘基24至38之胺基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 172之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 172之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3；
- VH，其包含：包含SEQ ID NO: 140之位置26至35之胺基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 140之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 140之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO: 172之殘基24至38之胺基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 172之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 172之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3；
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- VH，其包含：包含SEQ ID NO: 156之位置26至35之胺基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 156之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 156之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO: 172之殘基24至38之胺基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 172之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 172之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3；
- VH，其包含：包含SEQ ID NO: 158之位置26至35之胺基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 158之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 158之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO: 172之殘基24至38之胺基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 172之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 172之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3；
- VH，其包含：包含SEQ ID NO: 160之位置26至35之胺基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 160之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 160之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO: 172之殘基24至38之胺基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 172之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 172之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3；
- VH，其包含：包含SEQ ID NO: 162之位置26至35之胺基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 162之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 162之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO: 172之殘基24至38之胺基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 172之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 172之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3；
- VH，其包含：包含SEQ ID NO: 164之位置26至35之胺基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 164之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 164之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO: 172之殘基24至38之胺基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 172之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 172之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3；
- VH，其包含：包含SEQ ID NO: 166之位置26至35之胺基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 166之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 166之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO: 172之殘基24至38之胺基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 172之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 172之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3；或
- VH，其包含：包含SEQ ID NO: 168之位置26至35之胺基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 168之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 168之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及VL，其包含：包含SEQ ID NO: 172之殘基24至38之胺基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 172之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 172之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3。
在以上一些實施例中，該抗體包含VH，其包含與SEQ ID NO: 138、SEQ ID NO: 140、SEQ ID NO: 142、SEQ ID NO: 144、SEQ ID NO: 146、SEQ ID NO: 148、SEQ ID NO: 150、SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 154、SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 166或SEQ ID NO: 168之胺基酸序列至少90%一致、至少95%一致、或至少97%一致的胺基酸序列。在一些以上實施例中，抗體包含有包含與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%一致、至少95%一致或至少97%一致之胺基酸序列的VL。在其他實施例中，抗體包含有包含與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%一致、至少95%一致或至少97%一致之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，該抗體進一步包含如上文所提供之相應HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3。
在以上一些實施例中，抗體包含VH，其包含SEQ ID NO: 138、SEQ ID NO: 140、SEQ ID NO: 142、SEQ ID NO: 144、SEQ ID NO: 146、SEQ ID NO: 148、SEQ ID NO: 150、SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 154、SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 166或SEQ ID NO: 168之胺基酸序列。在以上一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在以上一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 138、SEQ ID NO: 140、SEQ ID NO: 142、SEQ ID NO: 144、SEQ ID NO: 146、SEQ ID NO: 148、SEQ ID NO: 150、SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 154、SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 166或SEQ ID NO: 168之胺基酸序列的VH；以及包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在以上一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 138、SEQ ID NO: 140、SEQ ID NO: 142、SEQ ID NO: 144、SEQ ID NO: 146、SEQ ID NO: 148、SEQ ID NO: 150、SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 154、SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 166或SEQ ID NO: 168之胺基酸序列的VH；以及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，本發明係關於一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)，其包含：包含SEQ ID NO: 138之位置26至35之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、包含SEQ ID NO: 138之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 138之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及輕鏈可變區(VL)，其包含：包含SEQ ID NO: 170之殘基24至38之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 170之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 170之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 138之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：與SEQ ID NO: 138之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 138之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 138之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：與SEQ ID NO: 138之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 138之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 138之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 138之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 138之胺基酸序列的VH；及與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 138之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之VH；及包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 138之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 138之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 138之胺基酸序列的VH；及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 138之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之VH；及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 138之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，本發明係關於一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)，其包含：包含SEQ ID NO: 140之位置26至35之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、包含SEQ ID NO: 140之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 140之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及輕鏈可變區(VL)，其包含：包含SEQ ID NO: 170之殘基24至38之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 170之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 170之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 140之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 140之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 140之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 140之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：與SEQ ID NO: 140之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 140之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 140之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 140之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 140之胺基酸序列的VH；及與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 140之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 140之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 140之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 140之胺基酸序列的VH；及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 140之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之VH；及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 140之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，本發明係關於一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)，其包含：包含SEQ ID NO: 142之位置26至35之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、包含SEQ ID NO: 142之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 142之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及輕鏈可變區(VL)，其包含：包含SEQ ID NO: 170之殘基24至38之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 170之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 170之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 142之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 142之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 142之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 142之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：與SEQ ID NO: 142之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 142之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 142之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 142之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 142之胺基酸序列的VH；及與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 142之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 142之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 142之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 142之胺基酸序列的VH；及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 142之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 142之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，本發明係關於一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)，其包含：包含SEQ ID NO: 144之位置26至35之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、包含SEQ ID NO: 144之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 144之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及輕鏈可變區(VL)，其包含：包含SEQ ID NO: 170之殘基24至38之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 170之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 170之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 144之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 144之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 144之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 144之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 144之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 144之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 144之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 144之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 144之胺基酸序列的VH；及與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 144之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 144之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 144之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 144之胺基酸序列的VH；及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 144之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 144之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，本發明係關於一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)，其包含：包含SEQ ID NO: 146之位置26至35之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、包含SEQ ID NO: 146之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 146之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及輕鏈可變區(VL)，其包含：包含SEQ ID NO: 170之殘基24至38之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 170之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 170之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 146之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 146之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 146之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 146之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：與SEQ ID NO: 146之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 146之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 146之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 146之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 146之胺基酸序列的VH；及與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 146之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 146之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 146之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 146之胺基酸序列的VH；及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 146之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 146之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，本發明係關於一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)，其包含：包含SEQ ID NO: 148之位置26至35之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、包含SEQ ID NO: 148之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 148之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及輕鏈可變區(VL)，其包含：包含SEQ ID NO: 170之殘基24至38之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 170之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 170之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 148之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 148之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 148之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 148之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 148之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 148之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 148之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 148之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 148之胺基酸序列的VH；及與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 148之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之VH；及包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 148之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 148之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 148之胺基酸序列的VH；及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 148之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 148之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，本發明係關於一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)，其包含：包含SEQ ID NO: 150之位置26至35之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、包含SEQ ID NO: 150之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 150之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及輕鏈可變區(VL)，其包含：包含SEQ ID NO: 170之殘基24至38之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 170之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 170之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 150之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：與SEQ ID NO: 150之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 150之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 150之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 150之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 150之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 150之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 150之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 150之胺基酸序列的VH；及與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 150之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 150之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 150之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 150之胺基酸序列的VH；及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 150之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 150之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，本發明係關於一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)，其包含：包含SEQ ID NO: 152之位置26至35之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、包含SEQ ID NO: 152之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 152之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及輕鏈可變區(VL)，其包含：包含SEQ ID NO: 170之殘基24至38之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 170之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 170之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 152之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 152之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 152之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 152之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：與SEQ ID NO: 152之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 152之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 152之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 152之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 152之胺基酸序列的VH；及與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 152之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 152之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 152之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 152之胺基酸序列的VH；及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 152之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 152之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，本發明係關於一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)，其包含：包含SEQ ID NO: 154之位置26至35之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、包含SEQ ID NO: 154之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 154之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及輕鏈可變區(VL)，其包含：包含SEQ ID NO: 170之殘基24至38之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 170之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 170之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 154之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 154之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 154之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 154之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：與SEQ ID NO: 154之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 154之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 154之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 154之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 154之胺基酸序列的VH；及與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 154之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 154之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 154之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 154之胺基酸序列的VH；及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 154之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之VH；及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 154之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，本發明係關於一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)，其包含：包含SEQ ID NO: 156之位置26至35之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、包含SEQ ID NO: 156之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 156之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及輕鏈可變區(VL)，其包含：包含SEQ ID NO: 170之殘基24至38之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 170之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 170之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 156之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：與SEQ ID NO: 156之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 156之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 156之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：與SEQ ID NO: 156之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 156之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 156之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 156之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 156之胺基酸序列的VH；及與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 156之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 156之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 156之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 156之胺基酸序列的VH；及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 156之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 156之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，本發明係關於一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)，其包含：包含SEQ ID NO: 158之位置26至35之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、包含SEQ ID NO: 158之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 158之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及輕鏈可變區(VL)，其包含：包含SEQ ID NO: 170之殘基24至38之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 170之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 170之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 158之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 158之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 158之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 158之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：與SEQ ID NO: 158之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 158之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 158之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 158之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 158之胺基酸序列的VH；及與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 158之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 158之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 158之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 158之胺基酸序列的VH；及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 158之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 158之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，本發明係關於一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)，其包含：包含SEQ ID NO: 160之位置26至35之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、包含SEQ ID NO: 160之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 160之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及輕鏈可變區(VL)，其包含：包含SEQ ID NO: 170之殘基24至38之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 170之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 170之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 160之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 160之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 160之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 160之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：與SEQ ID NO: 160之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 160之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 160之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 160之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 160之胺基酸序列的VH；及與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 160之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 160之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 160之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 160之胺基酸序列的VH；及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 160之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 160之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，本發明係關於一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)，其包含：包含SEQ ID NO: 162之位置26至35之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、包含SEQ ID NO: 162之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 162之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及輕鏈可變區(VL)，其包含：包含SEQ ID NO: 170之殘基24至38之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 170之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 170之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 162之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 162之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 162之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 162之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：與SEQ ID NO: 162之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 162之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 162之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 162之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 162之胺基酸序列的VH；及與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 162之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之VH；及包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 162之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 162之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 162之胺基酸序列的VH；及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 162之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之VH；及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 162之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，本發明係關於一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)，其包含：包含SEQ ID NO: 164之位置26至35之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、包含SEQ ID NO: 164之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 164之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及輕鏈可變區(VL)，其包含：包含SEQ ID NO: 170之殘基24至38之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 170之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 170之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 164之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 164之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之VH；及與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之VL。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 164之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 164之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 164之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之VH；及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之VL。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 164之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 164之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 164之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 164之胺基酸序列的VH；及與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 164之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之VH；及包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 164之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 164之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 164之胺基酸序列的VH；及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 164之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之VH；及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 164之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，本發明係關於一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)，其包含：包含SEQ ID NO: 166之位置26至35之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、包含SEQ ID NO: 166之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 166之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及輕鏈可變區(VL)，其包含：包含SEQ ID NO: 170之殘基24至38之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 170之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 170之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 166之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：與SEQ ID NO: 166之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之VH；及與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之VL。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 166之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 166之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：與SEQ ID NO: 166之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及與列SEQ ID NO: 172之胺基酸序至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 166之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 166之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 166之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 166之胺基酸序列的VH；及與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 166之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之VH；及包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 166之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 166之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 166之胺基酸序列的VH；及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 166之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之VH；及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 166之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，本發明係關於一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)，其包含：包含SEQ ID NO: 168之位置26至35之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、包含SEQ ID NO: 168之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 168之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及輕鏈可變區(VL)，其包含：包含SEQ ID NO: 170之殘基24至38之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 170之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 170之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3。在一些實施例中，該抗體包含與SEQ ID NO: 168之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH。在一些實施例中，該抗體包含與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 168之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之VH；及與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之VL。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 168之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 168之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：與SEQ ID NO: 168之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之VH；及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之VL。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 168之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 168之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 168之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 168之胺基酸序列的VH；及與SEQ ID NO: 170之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 168之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之VH；及包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 168之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 168之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 168之胺基酸序列的VH；及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 168之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之VH；及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 168之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。
在一些情況下，抗體為IgG抗體，諸如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體，或鼠類IgG1或IgG2抗體。在一些情況下，抗體包含野生型、人類IgG1、IgG2或IgG4重鏈恆定區。在一些實施例中，抗體包含全長重鏈及/或全長輕鏈。在其他情況下，抗體在重鏈恆定區末端缺乏C端離胺酸。在又其他情況下，抗體在重鏈恆定區末端缺乏C端甘胺酸-離胺酸。在一些情況下，抗體為抗體片段，諸如Fv、單鏈Fv (scFv)、Fab、Fab'或(Fab')
2。
在一些實施例中，抗體為雙特異性或多特異性抗體，或其與至少一個其他分子共價或非共價結合。在一些實施例中，抗體與至少一個其他分子共價或非共價結合，其中該至少一個其他分子包含偵測標記及/或藥物。
在一些實施例中，抗體包含人類IgG1重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：人類IgG1重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的胺基酸序列；及輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之胺基酸序列。在一些情況下，抗體包含重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列。在一些情況下，抗體包含輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列。在一些情況下，抗體包含以下兩者：重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列；及輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含人類IgG1重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含輕鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：人類IgG1重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列；及輕鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列。
鼠類抗體
在一些實施例中，本發明係關於一種特異性結合至鼠類蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含VH，其包含：包含SEQ ID NO: 208之位置31至35之胺基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 208之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 208之位置99至107之胺基酸序列的HCDR3；且其中該抗體包含輕鏈可變區(VL)，其包含：包含SEQ ID NO: 210之殘基24至38之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 210之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 210之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3。
在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 208之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 210之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：與SEQ ID NO: 208之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及與SEQ ID NO: 210之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 208之胺基酸的VH。在一些實施例中，抗體包含有包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 210中任一者之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 208之胺基酸的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 210中任一者之胺基酸序列的VL。在一些此類情況下，該抗體進一步包含：包含SEQ ID NO: 208之位置31至35之胺基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 208之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 208之位置99至107之胺基酸序列的HCDR3；包含SEQ ID NO: 210之殘基24至38之胺基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 210之殘基54至60之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 210之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 208之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 210之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 208之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 210之胺基酸序列的VL。
在本文之一些實施例中，抗體為IgA、IgG或IgM抗體。在一些情況下，抗體為鼠類IgG1或IgG2抗體。在一些實施例中，抗體包含全長重鏈及/或全長輕鏈。在其他情況下，抗體在重鏈恆定區末端缺乏C端離胺酸。在又其他情況下，抗體在重鏈恆定區末端缺乏C端甘胺酸-離胺酸。在一些情況下，抗體為抗體片段，諸如Fv、單鏈Fv (scFv)、Fab、Fab'或(Fab')
2。
在一些實施例中，抗體為雙特異性或多特異性抗體，或其與至少一個其他分子共價或非共價結合。在一些實施例中，抗體與至少一個其他分子共價或非共價結合，其中該至少一個其他分子包含偵測標記及/或藥物。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 212之胺基酸序列的HC。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 214之胺基酸序列的LC。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含SEQ ID NO: 212之胺基酸序列的HC；包含SEQ ID NO: 214之胺基酸序列的LC。
III. 例示性抗體變異體、片段及恆定區
在許多實施例中，特異性結合至PAD4之抗體可單獨或以組合形式進一步合併任一特徵，如以下部分中所描述。
A. 抗體片段
在某些實施例中，本文所提供之抗體為抗體片段。抗體片段包括(但不限於) Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')
2、Fv及scFv片段，及下文所描述之其他片段。關於某些抗體片段之綜述，Hudson等人，Nat. Med. 9:129-134 (2003)。關於scFv片段之綜述，參見例如Pluckthün，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 第113卷, Rosenburg及Moore編, (Springer-Verlag, New York), 第269至315頁(1994)；亦參見WO 93/16185；及美國專利案第5,571,894號及第5,'87,458號。關於包含救助受體結合表位殘基及具有增加之活體內半衰期之Fab及F(ab')
2片段的論述，參見美國專利第5,869,046號。
雙功能抗體為其中兩個抗原結合位點可為二價或雙特異性之抗體片段。參見例如EP 404,097; WO 1993/01161；Hudson等人，Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於等人，Nat. Med.
9:129-134 (2003)中。
單域抗體為包含抗體之重鏈可變域之全部或一部分或輕鏈可變域之全部或一部分的抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人類單域抗體(Domantis, Inc., Waltham, MA；參見例如美國專利第6,248,516號)。
抗體片段可藉由如本文中所描述之各種技術製得，包括(但不限於)蛋白水解消化完整抗體以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)產生。
B. 雙特異性或多特異性抗體
在某些實施例中，本文所提供之抗體為多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體為對至少兩個不同位點具有結合特異性之單株抗體。在某些實施例中，結合特異性之一係針對TREM2且另一者係針對任何其他抗原。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合至TREM2之兩個不同表位。雙特異性抗體亦可用於定位諸如細胞毒性劑之藥物或定位偵測標記至表現TREM2之細胞。在一些實施例中，多特異性抗體(例如雙特異性抗體)包含含有如本文所描述之CDR或可變區的第一可變域。雙特異性抗體可製備為全長抗體或抗體片段。
用於製造多特異性抗體之技術包括(但不限於)具有不同特異性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之重組共表現(參見Milstein及Cuello,
Nature305: 537 (1983))、WO 93/08829, 及Traunecker等人，
EMBO J.10: 3655 (1991))及「杵臼」工程改造(參見例如美國專利第5,731,168號)。多特異性抗體亦可如下製得：用於製造抗體Fc-雜二聚分子之工程改造靜電導向效應(WO 2009/089004A1)；使兩種或更多種抗體或片段交聯(參見例如美國專利第4,676,980號及Brennan等人，
Science, 229: 81 (1985))；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體(參見例如Kostelny等人，
J. Immunol.,18(5):1547-1553 (1992))；使用用於製得雙特異性抗體片段之「雙功能抗體」技術(參見例如Hollinger等人，
Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90:6444-6448 (1993))；及使用單鏈Fv (sFv)二聚體(參見例如Gruber等人，
J. Immunol.,152:5368 (1994))；及如例如Tutt等人，
J. Immunol.147: 60 (1991)中所描述製備三特異性抗體。
本文中亦包括具有三個或更多個功能性抗原結合位點之工程改造抗體，包括「章魚抗體」(參見例如US 2006/0025576)。
C. 嵌合抗體及人源化抗體
在某些實施例中，本文中所提供之抗體為嵌合抗體。某些嵌合抗體描述於例如美國專利第4,816,567號；以及Morrison等人之
Proc. Natl. Acad. Sci. USA(81:6851-6855 (1984))中。在一個實例中，嵌合抗體包含非人類可變區(例如，衍生自小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物(諸如猴)之可變區)及人類恆定區。在另一實例中，嵌合抗體為「類別轉換」抗體，其中類別或子類已自親本抗體之類別或子類別變化。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在某些實施例中，嵌合抗體為人源化抗體。通常，對非人類抗體進行人源化以降低對人類之免疫原性，同時保留親本非人類抗體之特異性及親和力。一般而言，人源化抗體包含一或多個可變域，其中HVR，例如CDR (或其一部分)，來源於非人類抗體，且FR (或其一部分)來源於人類抗體序列。人源化抗體視情況亦將包含人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人源化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如HVR殘基所來源之抗體)之相應殘基取代以例如恢復或提高抗體特異性或親和力。
人源化抗體及其製造方法評述於例如Almagro及Fransson,
Front. Biosci.13:1619-1633 (2008)中，且進一步描述於例如Riechmann等人，
Nature332:323-329 (1988)；Queen等人，
Proc. Nat'l Acad. Sci.USA 86:10029-10033 (1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri等人，
Methods36:25-34 (2005)(描述特異性決定區(SDR)移植)；Padlan,
Mol. Immunol.28:489-498 (1991) (描述「表面再塑」)；Dall'Acqua等人，
Methods36:43-60 (2005)(描述「FR改組」)；及Osbourn等人，
Methods36:61-68 (2005)及Klimka等人，
Br. J. Cancer,83:252-260 (2000)(描述FR改組之「導引選擇」方法)。
可以用於人源化之人類構架區包括(但不限於)：使用「最佳擬合」方法選擇之構架區(參見例如Sims等人
J. Immunol.151:2296 (1993))；來源於輕鏈或重鏈可變區之特定子組之人類抗體之共同序列的構架區(參見例如Carte r等人
Pro c. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；及Presta等人
J. Immunol., 151:2623 (1993))；人類成熟(體細胞突變)構架區或人類生殖系構架區(參見例如Almagro及Fransson,
Front. Biosci.13:1619-1633 (2008))；及來源於篩選FR集合庫之構架區(參見例如Baca等人，
J. Biol. Chem.272:10678-10684 (1997)及Rosok等人，
J. Biol. Chem.271:22611-22618 (1996))。
在一些實施例中，人源化抗體可以包含人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重鏈恆定區。
D. 醣基化及聚乙二醇化變異體
在某些實施例中，抗體之醣基化經修改。舉例而言，可產生非醣基化抗體(亦即，抗體缺乏醣基化)。可改變醣基化以例如增加抗體對抗原之親和力。此類碳水化合物修飾可藉由例如改變抗體序列內之一或多個醣基化位點來實現。舉例而言，可進行一或多個胺基酸取代，從而消除一或多個可變區構架醣基化位點，以由此消除該位點之醣基化。此類非醣基化可增加抗體對抗原之親和力。此類方法進一步詳細描述於Co等人之美國專利第5,714,350號及第6,350,861號中。
可藉由使N297殘基突變為另一殘基(例如N297A)，及/或藉由使相鄰胺基酸(例如298)突變來阻止N297上恆定區之醣基化，由此降低N297上之醣基化。
另外或替代地，可產生醣基化類型改變之抗體，諸如岩藻糖基殘基量降低之低岩藻醣基化抗體或等分GlcNac結構增加之抗體。已證明此類改變之醣基化模式會提高抗體之ADCC能力。此類碳水化合物修飾可藉由例如在醣基化機制改變之宿主細胞中表現抗體來實現。醣基化機制改變之細胞已描述於此項技術中，且可用作表現本文中所描述之重組抗體以由此產生醣基化改變之抗體的宿主細胞。舉例而言，Hanai等人之EP 1,176,195描述一種細胞株，其中編碼岩藻糖基轉移酶之FUT8基因在功能上被破壞，使得此細胞株中所表現之抗體展現低岩藻醣基化。Presta之PCT公開案WO 03/035835描述一種變異CHO細胞株Led 3細胞，其使岩藻糖連接至Asn(297)所連接碳水化合物之能力降低，亦導致該宿主細胞中所表現之抗體發生低岩藻醣基化(亦參見Shields, R.L.等人，2002
J. Biol. Chem. 277:26733-26740)。Umana等人之PCT公開案WO 99/54342描述一種細胞株，其經工程改造以表現醣蛋白修飾之糖基轉移酶{例如β(1,4)-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶III (GnTIII))，使得在經工程改造之細胞株中表現的抗體展現增加之等分GlcNac結構，引起抗體之ADCC活性增加(亦參見Umana等人(1999)
Nat. Biotech.17: 176-180)。
本文所描述之抗體之另一修飾為聚乙二醇化。抗體可經聚乙二醇化以例如延長抗體之生物(例如血清)半衰期。為使抗體發生聚乙二醇化，通常使抗體或其片段與聚乙二醇(PEG)(諸如PEG之反應性酯或醛衍生物)在使一或多個PEG基團連接至抗體或抗體片段的條件下反應。在一些實施例中，聚乙二醇化係經由與反應性PEG分子(或類似反應性水溶性聚合物)之醯化反應或烷基化反應進行。如本文所用，術語「聚乙二醇」意欲涵蓋已用於衍生其他蛋白質之任何PEG形式，諸如單(CI-CIO)烷氧基或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-順丁烯二醯亞胺。在某些實施例中，待聚乙二醇化之抗體為非醣基化抗體。蛋白質聚乙二醇化方法為此項技術中已知且可應用於本文所描述之抗體。參見例如Nishimura等人之EP 0 154 316及Ishikawa等人之EP 0 401 384。
E. 恆定區
在一些實施例中，本文所描述之抗體包含一或多個人類恆定區。在一些實施例中，人類重鏈恆定區屬於選自IgA、IgG及IgD之同型。在一些實施例中，人類輕鏈恆定區屬於選自κ及λ之同型。在一些實施例中，本文所描述之抗體包含人類IgG恆定區，諸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些實施例中，本文所描述之抗體包含人類IgG4重鏈恆定區。在一些此類實施例中，本文所描述之抗體包含人類IgG4恆定區中之S241P突變。在一些實施例中，本文所描述之抗體包含人類IgG4恆定區及人類κ輕鏈。
重鏈恆定區之選擇可決定抗體是否將具有活體內效應功能。在一些實施例中，此類效應功能包括抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)，且可導致殺死抗體所結合之細胞。在一些治療方法中，包括治療一些癌症之方法中，例如當抗體結合於支援腫瘤維持或生長的細胞時，可能需要殺死細胞。可支援腫瘤維持或生長的例示性細胞包括(但不限於)腫瘤細胞本身、幫助將血管募集至腫瘤之細胞及提供支援或促進腫瘤生長或腫瘤存活的配體、生長因子或反受體之細胞。在一些實施例中，當需要效應功能時，選擇包含人類IgG1重鏈或人類IgG3重鏈之抗體。
在某些實施例中，改變本文所提供之抗體以增加或減少抗體醣基化之程度。在抗體上添加醣基化位點或使抗體缺失醣基化位點可藉由改變胺基酸序列以便產生或移除一或多個醣基化位點來便利地實現。
在抗體包含Fc區之情況下，可改變連接於其上之碳水化合物。由哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包含分支鏈雙觸角寡醣，其通常藉由N鍵連接至Fc區之CH2域之Asn297。參見例如Wright等人，
TIBTECH15:26-32 (1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及連接至雙觸寡醣結構之「主幹」中之GlcNAc的岩藻糖。在一些實施例中，可對本發明抗體中之寡醣進行修飾以便形成具有某些改良特性之抗體。舉例而言，在一些實施例中，抗體可例如藉由使通常經含有岩藻糖之醣基化或經由其他手段醣基化之諸如Asn297之殘基突變來去岩藻醣基化。在一些實施例中，本文中之抗體可包含去岩藻醣基化人類IgG1恆定區。
抗體進一步具備等分寡醣，例如其中連接至抗體之Fc區的雙觸寡醣由GlcNAc等分。此類抗體可具有減少之岩藻醣基化及/或改良之ADCC功能。此類抗體之實例描述於例如WO 2003/011878 (Jean-Mairet等人)；美國專利第6,602,684號(Umana等人)；及US 2005/0123546 (Umana等人)中。亦提供寡醣中之至少一個半乳糖殘基與Fc區連接之抗體。此類抗體可具有改良之CDC功能。此類抗體描述於例如WO 1997/30087 (Patel等人)；WO 1998/58964 (Raju, S.)；及WO 1999/22764 (Raju, S.)中。
亦提供具有胺基端前導序列延伸部分之抗體。舉例而言，胺基端前導序列之一或多個胺基酸殘基存在於抗體之任何一或多個重鏈或輕鏈之胺基端。例示性胺基端前導序列延伸部分包含三個胺基酸殘基VHS或由其組成，該三個胺基酸殘基存在於抗體之一個或兩個輕鏈上。
可例如在投與具有變異Fc區之多肽的轉殖基因小鼠、人類或非人類靈長類動物中分析人類FcRn高親和力結合多肽之活體內或血清半衰期。亦參見例如Petkova等人
International Immunology18(12):1759-1769 (2006)。
在本發明之一些實施例中，與包含岩藻糖之親本抗體相比，去岩藻醣基化抗體在人類效應細胞存在下更有效介導ADCC，通常，ADCC活性可使用如本文中揭示之活體外ADCC分析測定，但涵蓋例如在動物模型等中測定ADCC活性之其他分析或方法。
在某些實施例中，Fc區藉由用不同胺基酸殘基置換至少一個胺基酸殘基來改變，以改變抗體之效應功能。舉例而言，一或多個選自胺基酸殘基234、235、236、237、297、318、320、322、330及/或331 (EU編號)之胺基酸可經不同胺基酸殘基置換，以使得抗體對效應子配體之親和力改變，但保留親本抗體之抗原結合能力。親和力改變之效應子配體可為例如Fc受體或補體之C1組分。此方法進一步詳細描述於Winter等人之美國專利第5,624,821號及第5,648,260號中。
在一些實例中，一或多個選自胺基酸殘基329、331及322之胺基酸可經不同胺基酸殘基置換，以使得抗體具有改變之C1q結合及/或降低或消除之補體依賴性細胞毒性(CDC)。此方法進一步詳細描述於Idusogie等人之美國專利第6,194,551號中。
在一些實例中，改變胺基酸位置231及239內之一或多個胺基酸殘基，由此改變抗體固定補體之能力。此方法進一步描述於例如Bodmer等人之PCT公開案WO 94/29351中。在一些實例中，Fc區可藉由修飾以下位置之一或多個胺基酸而經修飾以減小抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或減小與Fcγ受體之親和力：234、235、236、238、239、240、241 、243、244、245、247、248、249、252、254、255、256、258、262、263、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、299、301、303、305、307、309、312、313、315、320、322、324、325、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、433、434、435、436、437、438或439 (EU編號)。例示性取代包括236A、239D、239E、268D、267E、268E、268F、324T、332D及332E。例示性變異體包括239D/332E、236A/332E、236A/239D/332E、268F/324T、267E/268F、267E/324T及267E/268F/324T (EU編號)。可針對Fcs進行之其他Fc修飾為降低或消除與FcγR及/或補體蛋白之結合的彼等修飾，由此降低或消除Fc介導之效應功能，諸如ADCC、ADCP及CDC。例示性修飾包括(但不限於)位置234、235、236、237、267、269、325、328、330及/或331 (例如330及331)處之取代、插入及缺失，其中編號根據EU索引進行。例示性取代包括(但不限於)234A、235E、236R、237A、267R、269R、325L、328R、330S及331S (例如330S及331S)，其中編號根據EU索引進行。Fc變異體可包含236R/328R。用於減少FcγR與補體相互作用之其他修飾包括取代297A、234A、235A、237A、318A、228P、236E、268Q、309L、330S、331S、220S、226S、229S、238S、233P及234V，以及位置297之醣基化藉由突變或酶方式移除或藉由在不使蛋白質醣基化之生物體(諸如細菌)中產生來移除。此等及其他修飾綜述於Strohl, 2009,
Current Opinion in Biotechnology20:685-691中。舉例而言，人類IgG1.3 Fc恆定區含有L234A、L235E及G237A取代。IgG1fa.P238K (或IgG1.P238K)含有P238K取代。IgG1.1f包含L234A、L235E、G237A、A330S及P331S取代。(所有編號均在EU索引下)。
亦可使用增強對抑制性受體FcγRIIb之親和力之Fc變異體。此類變異體可提供具有與FcγRIIb細胞，包括例如B細胞及單核球相關之免疫調節活性的Fc融合蛋白。在一個實施例中，Fc變異體提供相對於一或多種活化受體，選擇性增強之對FcγRIIb之親和力。用於改變與FcγRIIb之結合之修飾包括在選自由以下組成之群的位置處之一或多個修飾：根據EU索引之234、235、236、237、239、266、267、268、325、326、327、328、330、331及332。用於增強FcγRllb親和力之例示性取代包括(但不限於) 234A、234D、234E、234F、234W、235D、235E、235F、235R、235Y、236D、236N、237A、237D、237N、239D、239E、266M、267D、267E、268D、268E、327D、327E、328F、328W、328Y、330S、331S及332E。例示性取代包括235Y、236D、239D、266M、267E、268D、268E、328F、328W及328Y。用於增強與FcγRIIb之結合之其他Fc變異體包括235Y/267E、236D/267E、239D/268D、239D/267E、267E/268D、267E/268E及267E/328F。(所有編號均在EU索引下)。
用於增強FcγR與補體相互作用之其他修飾包括(但不限於)取代298 A、333A、334A、326A、2471、339D、339Q、280H、290S、298D、298V、243L、292P、300L、396L、3051及396L。此等及其他修飾綜述於Strohl, 2009, Current Opinion in Biotechnology 20:685-691中。增加與Fcγ受體之結合的Fc修飾包括在Fc區之以下胺基酸位置中之任一者或多者處的胺基酸修飾：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、279、280、283、285、298、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、312、315、324、327、329、330、335、337、338、340、360、373、376、379、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439，其中Fc區中之殘基之編號為如專利公開案第WO 00/42072號中之EU索引之編號。
視情況，Fc區可包含熟習此項技術者已知之額外及/或替代位置處之非天然存在之胺基酸殘基(參見例如美國專利第5,624,821號、第6,277,375號、第6,737,056號、第6,194,551號、第7,317,091號、第8,101,720號；PCX專利公開案WO 00/42072、WO 01/58957、WO 02/06919、WO 04/016750、WO 04/029207、WO 04/035752、WO 04/074455、WO 04/099249、WO 04/063351、WO 05/070963、WO 05/040217、WO 05/092925及WO 06/020114)。
Fc區對其配體之親和力及結合特性可藉由此項技術中已知之多種活體外分析方法(基於生物化學或免疫之分析)測定，該等方法包括(但不限於)平衡方法(例如酶聯免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA))或動力學(例如BIACORE分析)及其他方法，諸如間接結合分析、競爭性抑制分析、螢光共振能量轉移(FRET)、凝膠電泳及層析(例如凝膠過濾)。此等及其他方法可利用所檢驗之組分中之一或多者上的標記及/或採用多種偵測方法，包括(但不限於)顯色、螢光、發光或同位素標記。結合親和力及動力學之詳細描述可見於Paul, W. E.編, Fundamental Immunology, 第4版, Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)，其聚焦於抗體-免疫原相互作用。
在某些實施例中，抗體經修飾以延長其生物半衰期。各種方法皆可行。舉例而言，此舉可藉由增加Fc區對FcRn之結合親和力實現，例如，以下殘基中之一或多者可發生突變：252、254、256、433、435、436，如美國專利第6,277,375號中所描述。特定例示性取代包括以下中之一或多者：T252L、T254S及/或T256F。或者，為了延長生物半衰期，抗體可在CH1或CL區內改變以含有獲自IgG之Fc區之CH2域之兩個環的救助受體結合表位，如Presta等人之美國專利第5,869,046號及第6,121,022號中所描述。增加與FcRn之結合及/或改良藥物動力學特性的其他例示性變異體包括位置259、308、428及434處之取代，包括例如2591、308F、428L、428M、434S、4341 1.434F、434Y及434X1。增加Fc與FcRn之結合的其他變異體包括：250E、250Q、428 L、428F、250Q/428L (Hinton等人2004,
J. Biol. Chem.279(8): 6213-6216，Hinton等人2006
Journal of Immunology176:346-356)、256A、272A、286A、305A、307A、307Q、31 1A、312A、376A、378Q、380A、382A、434A (Shields等人，
Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604)、252F、252T、252Y、252W、254T、256S、256R、256Q、256E、256D、256T、309P、31 1 S、433R、433S、4331、433P、433Q、434H、434F、434Y、252Y/254T/256E、433K/434F/436H、308T/309P/311S (Dall'Acqua等人
Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180，Dal'Acqua等人，2006,
Journal of Biological Chemistry281:23514-23524)。用於調節FcRn結合之其他修飾描述於Yeung等人，2010,
J Immunol, 182:7663-7671中。
在某些實施例中，可使用具有特定生物學特徵之雜交IgG同型。舉例而言，IgG1/IgG3雜交變異體可藉由用來自兩種同型不同之位置處之IgG3的胺基酸取代CH2及/或CH3區中之IgG1位置來構築。因此，可構築包含一或多個取代，例如274Q、276K、300F、339T、356E、358M、384S、392N、397M、4221、435R及436F之雜交變異IgG抗體。在本文所描述之一些實施例中，IgG1/IgG2雜交變異體可藉由用來自兩種同型不同之位置處之IgG1的胺基酸取代CH2及/或CH3區中之IgG2位置來構築。因此，可構築包含一或多個取代，例如以下胺基酸取代中之一或多者的雜交變異IgG抗體：233E、234L、235L、+236G (係指在位置236處插入甘胺酸)及327A。
此外，人類IgG1上之針對FcγRI、FcγRII、FcγRIII及FcRn之結合位點已經定位且具有改良之結合的變異體已有描述(參見Shields, R.L.等人(2001),
J. Biol. Chem.276:6591-6604)。顯示位置256、290、298、333、334及339之特異性突變改良與FcγRIII之結合。另外，顯示以下組合突變體改良FcγRIII結合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A及S298A/E333A/K334A，已顯示其展現增強之FcγRIIIa結合及ADCC活性(Shields等人，2001)。已鑑別強烈增強與FcγRIIIa之結合的其他IgG1變異體，包括具有S239D/I332E及S239D/I332E/A330L突變之變異體，其顯示對FcγRIIIa之親和力的最大增加、FcγRIIb結合之減小及在食蟹獼猴中之強烈細胞毒性活性(Lazar等人，2006)。將三重突變引入至諸如阿侖單抗(alemtuzumab)(CD52特異性)、曲妥珠單抗(trastuzumab)(HER2/neu特異性)、利妥昔單抗(rituximab)(CD20特異性)及西妥昔單抗(cetuximab)(EGFR特異性)之抗體中轉化成活體外ADCC活性大大增強，且S239D/I332E變異體顯示在猴中耗乏B細胞之能力增強(Lazar等人，2006)。另外，已鑑別在B細胞惡性腫瘤及乳癌之模型中在表現人類FcγRIIIa之轉殖基因小鼠中的含有L235V、F243L、R292P、Y300L及P396L突變之IgG1突變體，其展現與FcγRIIIa之增強結合及伴隨之增強ADCC活性(Stavenhagen等人,2007；Nordstrom等人，2011)。可使用之其他Fc突變體包括：S298A/E333A/L334A、S239D/I332E、S239D/I332E/A330L、L235V/F243L/R292P/Y300L/ P396L及M428L/N434S。
在某些實施例中，選擇與FcγRs之結合減少的Fc。具有減少之FcγR結合的例示性Fc，例如IgG1 Fc包含以下三個胺基酸取代：L234A、L235E及G237A。
在某些實施例中，選擇補體結合減少之Fc。具有減少之補體結合之例示性Fc，例如IgG1 Fc具有以下兩個胺基酸取代：A330S及P331S。
在某些實施例中，選擇基本上不具有效應功能之Fc，亦即其與FcγR之結合減少且補體結合減少。無效應之例示性Fc，例如IgG1 Fc包含以下五個突變：L234A、L235E、G237A、A330S及P331S。
當使用IgG4恆定域時，其可包括取代S228P，其模擬IgG1中之鉸鏈序列且由此使IgG4分子穩定。
亦可使用WO 2017/087678或WO2016081746中所描述之Fc修飾。
在某些實施例中，抗體之醣基化經修改。舉例而言，可產生非醣基化抗體(亦即，抗體缺乏醣基化)。可改變醣基化以例如增加抗體對抗原之親和力。此類碳水化合物修飾可藉由例如改變抗體序列內之一或多個醣基化位點來實現。舉例而言，可進行一或多個胺基酸取代，從而消除一或多個可變區構架醣基化位點，以由此消除彼位點之醣基化。此類非醣基化可增加抗體對抗原之親和力。此方法進一步詳細描述於Co等人之美國專利第5,714,350號及第6,350,861號中。
可藉由使N297殘基突變為另一殘基(例如N297A)，及/或藉由使相鄰胺基酸(例如298)突變來阻止N297上恆定區之醣基化，由此降低N297上之醣基化。
另外地或替代地，可產生醣基化類型改變之抗體，諸如岩藻糖基殘基量降低之低岩藻醣基化抗體或等分GlcNac結構增加之抗體。已證明此類改變之醣基化模式會提高抗體之ADCC能力。此類碳水化合物修飾可藉由例如在醣基化機制改變之宿主細胞中表現抗體來實現。醣基化機制改變之細胞已描述於此項技術中，且可用作表現本文所描述之重組抗體以由此產生醣基化改變之抗體的宿主細胞。舉例而言，Hanai等人之EP 1,176,195描述一種細胞株，其中編碼岩藻糖基轉移酶之FUT8基因在功能上被破壞，使得此細胞株中所表現之抗體展現低岩藻醣基化。Presta之PCT公開案WO 03/035835描述一種變異CHO細胞株Led 3細胞，其使岩藻糖連接至Asn(297)所連接碳水化合物之能力降低，亦導致該宿主細胞中所表現之抗體發生低岩藻醣基化(亦參見Shields, R.L.等人，2002
J. Biol. Chem. 277:26733-26740)。Umana等人之PCT公開案WO 99/54342描述一種細胞株，其經工程改造以表現醣蛋白修飾之糖基轉移酶{例如β(1,4)-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶III (GnTIII))，使得在經工程改造之細胞株中表現的抗體展現增加之等分GlcNac結構，引起抗體之ADCC活性增加(亦參見Umana等人(1999)
Nat. Biotech.17: 176-180)。
本文所描述之抗體之另一修飾為聚乙二醇化。抗體可經聚乙二醇化以例如延長抗體之生物(例如血清)半衰期。為使抗體發生聚乙二醇化，通常使抗體或其片段與聚乙二醇(PEG)(諸如PEG之反應性酯或醛衍生物)在使一或多個PEG基團連接至抗體或抗體片段的條件下反應。在一些實施例中，聚乙二醇化經由與反應性PEG分子(或類似反應性水溶性聚合物)之醯化反應或烷基化反應進行。如本文所用，術語「聚乙二醇」意欲涵蓋已用於衍生得到其他蛋白質之任一種PEG形式，諸如單(CI-CIO)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-順丁烯二醯亞胺。在某些實施例中，待聚乙二醇化之抗體為非醣基化抗體。蛋白質聚乙二醇化方法為此項技術中已知且可應用於本文所描述之抗體。參見例如Nishimura等人之EP 0 154 316及Ishikawa等人之EP 0 401 384。
IV. 特定抗PAD4抗體之例示性特性
在許多實施例中，特異性結合至PAD4之抗體可單獨或以組合形式包含以下特性中之任一者。
在一些情況下，抗體與諸如PAD4之配位體之結合可藉由表面電漿子共振(SPR)測定。在一些實施例中，抗體在SPR分析中以小於5 nM、小於1 nM、小於0.5 nM、小於0.1 nM、0.01 nM至5 nM、0.01 nM至1 nM、0.05 nM至1 nM、0.1 nM至1 nM、0.1 nM至0.5 nM、0.05 nM至0.5 nM、0.05 nM至0.1 nM或0.5 nM至1 nM之K
D特異性結合至PAD4。舉例而言，此K
D可藉由SPR分析獲得。在一些實施例中，抗體在SPR分析中係在1至2 mM氯化鈣的存在下(例如在1 mM氯化鈣的存在下)以小於5 nM、小於1 nM、小於0.5 nM、小於0.1 nM、0.01 nM至5 nM、0.01 nM至1 nM、0.05 nM至1 nM、0.1 nM至1 nM、0.1 nM至0.5 nM、0.05 nM至0.5 nM、0.05 nM至0.1 nM或0.5 nM至1 nM之K
D特異性結合至PAD4。在一些實施例中，透過SPR，抗體係在存在1至2 mM氯化鈣(例如在1 mM氯化鈣)及不存在鈣離子的兩種情況下(由於不存在額外的鈣鹽以及存在EDTA，諸如1 mM或2 mM EDTA)以如下K
D特異性結合至PAD4：小於5 nM、小於1 nM、小於0.5 nM、小於0.1 nM、0.01 nM至5 nM、0.01 nM至1 nM、0.05 nM至1 nM、0.1 nM至1 nM、0.1 nM至0.5 nM、0.05 nM至0.5 nM、0.05 nM至0.1 nM或0.5 nM至1 nM。因此，在此情況下，抗體在鈣離子(諸如氯化鈣)存在及不存在的情況下均特異性結合至PAD4。舉例而言，參見本文中關於實例之表2及表3。
在一些實施例中，抗PAD4抗體不結合至人類蛋白質精胺酸脫亞胺酶2 (PAD2)。因此，在諸如透過SPR之結合分析中，偵測到與PAD2之結合太弱。在一些情況下，抗體例如如上文剛剛所描述特異性結合至人類PAD4，但不結合至鼠類PAD4 (亦即在SPR或類似分析中未偵測到與鼠類PAD4的結合)。在一些情況下，抗體例如如上文剛剛所描述特異性結合於人類PAD4，但不結合至獼猴PAD4 (亦即在SPR分析中未偵測到與獼猴PAD4的結合)，而在其他情況下，抗體在SPR分析中特異性結合至人類及獼猴PAD4。在一些情況下，透過SPR，抗體特異性結合至人類及食蟹獼猴PAD4，但不結合至鼠類PAD4。在其他情況下，藉由SPR所測定，抗體特異性結合至人類PAD4，但不結合至獼猴或鼠類PAD4。
在一些實施例中，抗體在ECM分析中的ECM評分小於50、小於30、小於10、小於5、為1至30、1至20、1至10、1至5、1至3、1、2、3、4或5。(參見例如表5)。如以下實例5中所描述，ECM評分指示抗體非特異性結合至細胞外基質(ECM)之程度。可使用預塗ECM培養盤(諸如市售96孔盤)進行分析。在將抗體用ECM塗佈之盤培育1小時，隨後與HRP結合之偵測抗體一起培育且與TMB受質反應，然後將450 nm處量測之吸光度值除以未添加抗體之對照孔的吸光度值之後，即可測定ECM評分。(參見以下實例5)。
在一些實施例中，在Agilent 1260 Infinity II HPLC系統上，使用移動相A (0.1 M磷酸鈉，pH 7.0，2 M硫酸銨)及移動相B (0.1 M磷酸鈉溶液，pH 7.0)之線性梯度20 min，在1.0 ml/min之流動速率下，在25℃管柱溫度下，本文中之抗體在TSKgel Butyl-NPR管柱(4.6 mm×3.5 cm，2.5 μm粒度，Tosoh P/N 14947)上的疏水性相互作用層析(HIC)滯留時間為9至11分鐘。(參見以下實例6)。在一些實施例中，藉由固有螢光所量測，抗體在pH 6.0及pH 8.3兩者下具有60與70℃之間的熔融溫度(Tm)。在一些實施例中，藉由靜態光散射所量測，抗體之聚集溫度(Tagg)在pH 6.0下在64℃與75℃之間且在pH 8.3下在60℃至70℃之間。(參見實例7)。
在一些實施例中，使用Epivax®免疫原性測試量測，抗體具有相對較低的免疫原性。商業電腦模擬免疫原性風險評估演算法(Epivax®)對8種人類HLA DRB1等位基因超類型中的肽MHC II類結合進行排名，以覆蓋人群中存在的＞90%的變異性(De Groot及Martin, Clin Immunol, 2009, 131(2): 第189至201頁)。(參見實例15)。舉例而言，藥物Campath® (阿倫單抗(alemtuzumab))、Rituxan® (利妥昔單抗(rituximab))、Zenapax® (達利珠單抗(daclizumab))、Humicade® (CDP-571)、Mylotarg® (吉妥珠單抗(gemtuzumab))及Avastin® (貝伐珠單抗(bevacizumab))之電腦模擬免疫原性評分在0%至45%範圍內，如下表10中所示，其中Campath® (阿倫單抗)、Rituxan® (利妥昔單抗)、Zenapax® (達利珠單抗)及Humicade® (CDP-571)各自分別在45%至7%範圍內。相比之下，在一些實施例中，本文中之抗體在相同分析中的免疫原性評分在0至5%範圍內，諸如0至2%或0至1%。本文中之某些抗體的免疫原性評分為0%。(參見表10)。因此，在某些情況下，以電腦模擬免疫原性分析所量測，抗體之免疫原性低於Campath® (阿倫單抗)、Rituxan® (利妥昔單抗)及Zenapax® (達利珠單抗)中之一者、兩者或全部三者。
在一些實施例中，抗體在活體外抑制PAD4之酶促活性。舉例而言，在一些情況下，抗體以10至200 nM、50至200 nM、10至100 nM、20至100 nM或50至100 nM之IC50在活體外抑制PAD4將肽受質TSTGGRQGSHH (SEQ ID NO: 216)中之精胺酸轉化為瓜胺酸。(參見實例4，表4)。舉例而言，在一些情況下，抗體在活體外抑制PAD4將肽受質(SHQEST
RGKSKGKAAAAA; SEQ ID NO: 232)中之精胺酸轉化為瓜胺酸。舉例而言，在一些情況下，視情況以劑量依賴性方式以0.1至10 nM (諸如0.2至5 nM)之IC50進行抑制，其中PAD4濃度為1至8 µg/mL。(參見例如以下實例16)。
在一些實施例中，在來自人類個體(例如患有疾病(例如本文所揭示之疾病，例如發炎性或自體免疫疾病，例如類風濕性關節炎)之患者)之內源性抗PAD4抗體(例如內源性抗PAD4抗體之多株混合物)存在下，抗體在活體外抑制PAD4之酶促活性。內源性抗PAD4抗體可包括或可為例如PAD4抑制抗體及/或PAD4活化抗體。在一些實施例中，抗體在活體外抑制在結合及活化人類PAD4之內源抗體(活化抗體)存在下PAD4之酶促活性。在一些實施例中，活化抗體為來源於患有類風濕性關節炎之患者的抗體。在一些實施例中，活化抗體係與人類PAD3及人類PAD4有交叉反應之抗體。
在一些情況下，與同型對照抗體相比，該抗體減少LPS刺激之人類血液單核體中細胞外瓜胺酸化組蛋白H3的量。在一些情況下，與同型對照抗體相比，抗體減少LPS刺激之人類血液單核球中GM-CSF之分泌。在一些情況下，與同型對照抗體相比，抗體減少LPS刺激之人類血液單核球中GM-CSF之基因表現。在一些情況下，抗體具有此等三種特性中之兩種。在一些情況下，抗體具有此等特性中之全部三種。在一些實施例中，LPS刺激之人類血液單核球係自新鮮人類PBMC分離之CD14+CD16-單核球。(參見本文中之實例17)。在一些實施例中，抗體能夠被LPS刺激之人類血液單核球內化。舉例而言，抗體可用染料標記以偵測單核球內化。在一些情況下，抗體可藉由LPS刺激之CD14+人類單核球內化。(參見實例18)。此類結果表明，本文中之抗PAD4抗體可以在單核球內在細胞內發揮作用，且在一些實施例中可以在細胞外與細胞內阻斷PAD4功能。
在一些實施例中，抗體抑制PAD4在發炎肺部中起作用。舉例而言，此可藉由自肺部收集之支氣管肺泡灌洗液(BALF)中組蛋白H3或ITIH4的瓜胺酸化的減少證明，如本文實例20或25中所描述。舉例而言，可自患有急性或慢性肺部發炎的小鼠收集BALF且在抗體存在下及在野生型對照存在下分析瓜胺酸化H3或ITIH4蛋白質的量。在一些實施例中，小鼠為人類PAD4基因敲入小鼠。在一些情況下，與同型對照(IC)抗體相比，在存在抗體的情況下，人類PAD4基因敲入小鼠中瓜胺酸化H3的量減少至少15%、至少30%、至少40%、至少50%或至少60%，及/或瓜胺酸化ITIH4的量減少至少50%、至少70%或至少80%，例如藉由下式所計算：抑制% = [(IC- naïve) - (PAD4 mAb-naïve) /(IC-naïve)] × 100，其中量測未治療(naïve)小鼠、接受IC之小鼠及接受抗PAD4抗體之小鼠的瓜胺酸化H3或ITIH4的量。
在一些實施例中，抗體抑制PAD4在發炎關節中起作用，例如如實例21、22及/或26中所描述。此可例如藉由患有急性或慢性關節發炎(諸如關節注射LPS誘導之發炎)之小鼠模型中之關節組織中ITIH4及/或PRG4的瓜胺酸化減少來證明。在一些情況下，小鼠可為人類PAD4基因敲入小鼠。在一些情況下，與同型對照抗體相比，在人類PAD4基因敲入小鼠之LPS誘導之急性關節損傷模型中，該抗體減少小鼠髕骨中之細胞外瓜胺酸化PRG4及/或瓜胺酸化ITIH4之量。在一些情況下，使瓜胺酸化ITIH4及/或瓜胺酸化PRG4減少的EC50為2 nM或更低、1 nM或更低、0.1 nM或更低、0.05至2 nM或0.1至1 nM。
在一些實施例中，本文中之抗體可減少姥鮫烷(pristane)誘導之細胞外陷阱形成嗜中性球(NETosis)及/或細胞外陷阱形成單核球(METosis)。(參見實例23)。METosis係自單核球或巨噬細胞釋放由散佈著組蛋白及細胞蛋白的細胞DNA組成的細胞外陷阱的過程。此種由METosis或NETosis (嗜中性球起源)形成的網狀物質對於防禦微生物很重要，而且亦係自體免疫病理學及無菌發炎的主要驅動因素。例如，可以在用本文之抗體或用同型對照抗體處理後向小鼠(諸如人類PAD4基因敲入小鼠)腹膜內注射姥鮫烷。在一些情況下，在此類姥鮫烷誘導之小鼠模型中，與同型對照抗體相比，本文中之抗體可以減少腹膜液中之嗜中性球、單核球、M1巨噬細胞及/或M2巨噬細胞中H3的瓜胺酸化。在另外的情況下，抗體亦可以減少小鼠腹膜液中嗜中性球及單核球/巨噬細胞的可溶性標記物的量，諸如彈性蛋白酶、MPO、MIP-2α、GROα/KC、MCP1、MIP1β、IL6及MIP3α。(參見實例23)。
在一些實施例中，在膠原蛋白誘發之關節炎小鼠模型中，本文中之抗體可抑制PAD4依賴性反應。(參見實例24)。例如，在一些實施例中，根據以下量表，與同型對照相比，本文中之抗體顯著降低關節炎模型中小鼠的關節炎臨床評分：(1)正常；(2)輕度，踝部或腕部有清晰紅腫，或僅限於個別足趾明顯紅腫，不論受影響的足趾有多少；(3)踝部或腕部中度紅腫；(4)包括足趾在內的整個腳爪嚴重紅腫；(5)肢體發炎最嚴重，涉及多個關節。例如，在一些情況下，本文中之抗體亦分別減少藉由SG+MPO+嗜中性球及SG+MPO+單核球/巨噬細胞評估的NETosis及METosis，及/或減少單核球/巨噬細胞的可溶性標記物，諸如彈性蛋白酶及MPO，及/或降低嗜中性球、單核球及/或巨噬細胞中H3蛋白瓜胺酸化的比例。(參見實例24)。
在一些實施例中，在存在及不存在疾病相關抗PAD4抗體的兩種情況下，該抗體抑制血清中蛋白多醣4 (PRG4)、血纖維蛋白原A (FGA)、間α-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4 (ITIH4)、α-1-微球蛋白/比庫寧前驅體(AMBP)及凝溶膠蛋白(GSN)中之一或多者的瓜胺酸化，例如，如實例27中所描述。在一些此類情況下，來自RA患者之樣本中存在疾病相關抗PAD4抗體不會顯著影響抗體的抑制活性，亦即，與來自正常健康個體之樣本中的抗體的抑制活性相比。在一些實施例中，諸如在實例28中所描述之分析中，當在活體外以1至5μg/mL與人體組織樣本一起培育時，抗體不會與正常人體組織發生交叉反應，並且不結合至正常人體組織細胞膜。在一些實施例中，例如(諸如)在實例29中所描述之分析中，在培育、然後與經過調理之結合大腸桿菌顆粒一起培育後，抗體不會誘導全血中嗜中性球的吞噬作用。在一些實施例中，諸如在實例29中所描述之分析中，抗體在高達400 μg/mL的濃度下不會誘導嗜中性球的呼吸爆發(respiratory burst)。
V. 例示性抗PAD4抗體 A. 抗體hz13-5 D31E
在一些實施例中，本發明係關於特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：(i)重鏈可變區(VH)，其包含有包含SEQ ID NO: 62之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)及包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的HCDR3；及(ii)輕鏈可變區(VL)，其包含有包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)。在一些實施例中，VH包含有包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的HCDR2，且VL包含有包含SSEQ ID NO: 8之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的LCDR3。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 68之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 70之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：與SEQ ID NO: 68之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及與SEQ ID NO: 70之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，VH與SEQ ID NO: 68之胺基酸序列至少90%一致且VL與SEQ ID NO: 70之胺基酸序列至少90%一致。在一些實施例中，VH與SEQ ID NO: 68之胺基酸序列至少95%一致且VL與SEQ ID NO: 70之胺基酸序列至少95%一致。在一些實施例中，VH與SEQ ID NO: 68之胺基酸序列至少97%一致且VL與SEQ ID NO: 70之胺基酸序列至少97%一致。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 68之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 70之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 68之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 70之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體之VH包含Kabat位置94處之甘胺酸，該位置對應於SEQ ID NO: 10之位置98。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列的VH；及與SEQ ID NO: 70之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 70之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 68之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之VH；及包含SEQ ID NO: 70之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 70之胺基酸序列的VL。
在一些情況下，抗體為IgG抗體，諸如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體。在一些實施例中，抗體包含人類IgG1重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：人類IgG1重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的胺基酸序列；及輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的胺基酸序列。在一些情況下，抗體包含重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列。在一些情況下，抗體包含輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列。在一些情況下，抗體包含以下兩者：重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列；及輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含人類IgG1重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含輕鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：人類IgG1重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列；及輕鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列。
在一些情況下，抗體包含：包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列，然後是SEQ ID NO: 178之胺基酸序列的重鏈(HC)；及包含SEQ ID NO: 70之胺基酸序列，然後是SEQ ID NO: 194之胺基酸序列的輕鏈(LC)。在一些情況下，抗體包含：包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列，然後是SEQ ID NO: 180之胺基酸序列的重鏈(HC)；及包含SEQ ID NO: 70之胺基酸序列，然後是SEQ ID NO: 194之胺基酸序列的輕鏈(LC)。在一些情況下，抗體包含：包含SEQ ID NO: 196之胺基酸序列的HC；及包含SEQ ID NO: 200之胺基酸序列的輕鏈。在一些情況下，該抗體包含：包含SEQ ID NO: 198之胺基酸序列的HC；及包含SEQ ID NO: 200之胺基酸序列的輕鏈。在一些情況下，抗體包含由SEQ ID NO: 196之胺基酸序列組成之HC及由SEQ ID NO: 200之胺基酸序列組成之輕鏈。在一些情況下，抗體包含由SEQ ID NO: 198之胺基酸序列組成之HC及由SEQ ID NO: 200之胺基酸序列組成之輕鏈。
在一些情況下，抗體結合至包含SEQ ID NO: 217及SEQ ID NO: 218之PAD4上的表位。
在一些實施例中，抗體在SPR分析中係例如在存在1至2 mM氯化鈣(例如在1 mM氯化鈣)及不存在鈣離子的兩種情況下(由於不存在額外的鈣鹽以及存在EDTA，諸如1 mM或2 mM EDTA)以如下K
D特異性結合至PAD4：0.05 nM至1 nM、0.1 nM 至1 nM、0.1 nM至0.5 nM、0.05 nM至0.5 nM、或0.05 nM至0.1 nM、或0.09 nM、0.1 nM、或0.2 nM。參見表2及表3。在一些實施例中，透過SPR，抗體特異性結合至人類PAD4，但不結合至獼猴或鼠類PAD4。
在一些實施例中，使用Epivax®免疫原性測試量測，抗體之免疫原性評分為0至1%、0至0.5%或0%、0.5%或1%。在一些情況下，抗體評分為0%。(參見表10)。在一些情況下，藉由電腦模擬免疫原性分析所量測，抗體之免疫原性小於以下中之一者、兩者或全部三者：Campath®(阿倫單抗)、Rituxan®(利妥昔單抗)及Zenapax® (達利珠單抗)。
在一些實施例中，抗體視情況以劑量依賴性方式以0.1至10 nM (諸如0.2至5 nM)之IC50在活體外抑制PAD4將肽受質(SHQEST
RGKSKGKAAAAA; SEQ ID NO: 232)中之精胺酸轉化為瓜胺酸，其中PAD4濃度為1至8 µg/mL。(參見例如以下實例16)。
在一些實施例中，抗體在活體外抑制在結合及活化人類PAD4之抗體(活化抗體)存在下PAD4之酶促活性。在一些實施例中，活化抗體為來源於患有類風濕性關節炎之患者的抗體。在一些實施例中，活化抗體係與人類PAD3及人類PAD4有交叉反應之抗體。
在一些情況下，與同型對照抗體相比，該抗體減少LPS刺激之人類血液單核體中細胞外瓜胺酸化組蛋白H3的量。在一些實施例中，LPS刺激之人類血液單核球係自新鮮人類PBMC分離之CD14+CD16-單核球。(參見本文中之實例17)。在一些實施例中，抗體能夠被LPS刺激之人類血液單核球內化，諸如被LPS刺激之CD14+人類單核球內化。(參見實例18)。
在一些實施例中，抗體抑制PAD4在發炎肺部中起作用。舉例而言，此可藉由自肺部收集之支氣管肺泡灌洗液(BALF)中組蛋白H3或ITIH4的瓜胺酸化的減少證明，如本文實例25中所描述。舉例而言，可自患有急性或慢性肺部發炎的小鼠收集BALF且在抗體存在下及在野生型對照存在下分析瓜胺酸化H3或ITIH4蛋白質的量。在一些實施例中，小鼠為人類PAD4基因敲入小鼠。在一些情況下，與同型對照(IC)抗體相比，在存在抗體的情況下，人類PAD4基因敲入小鼠中瓜胺酸化H3的量減少至少15%、至少30%、至少40%、至少50%或至少60%，及/或瓜胺酸化ITIH4的量減少至少50%、至少70%或至少80%，例如藉由下式所計算：抑制% = [(IC- naïve) - (PAD4 mAb-naïve) /(IC-naïve)] × 100，其中量測未治療(naïve)小鼠、接受IC之小鼠及接受抗PAD4抗體之小鼠的瓜胺酸化H3或ITIH4的量。
在一些實施例中，抗體抑制PAD4在發炎關節中起作用，如實例26中所描述。此可例如藉由患有急性或慢性關節發炎(諸如關節注射LPS誘導之發炎)之小鼠模型中之關節組織中ITIH4及/或PRG4的瓜胺酸化減少來證明。在一些情況下，小鼠可為人類PAD4基因敲入小鼠。在一些情況下，與同型對照抗體相比，在人類PAD4基因敲入小鼠之LPS誘導之急性關節損傷模型中，該抗體減少小鼠髕骨中之細胞外瓜胺酸化PRG4及/或瓜胺酸化ITIH4之量。在一些情況下，使瓜胺酸化ITIH4及/或瓜胺酸化PRG4減少的EC50為2 nM或更低、1 nM或更低、0.1 nM或更低、0.05至2 nM或0.1至1 nM。
在一些實施例中，抗體可適用於在個體中或在活體外(諸如在生物樣本中)抑制蛋白質之瓜胺酸化。舉例而言，在一些實施例中，在存在及不存在疾病相關抗PAD4抗體的兩種情況下，該抗體抑制血清中蛋白多醣4 (PRG4)、血纖維蛋白原A (FGA)、間α-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4 (ITIH4)、α-1-微球蛋白/比庫寧前驅體(AMBP)及凝溶膠蛋白(GSN)中之一或多者的瓜胺酸化，例如，如實例27中所描述。在一些此類情況下，例如，與來自正常健康個體之樣本中的抗體的抑制活性相比，來自RA患者之樣本中存在疾病相關抗PAD4抗體不會顯著影響抗體的抑制活性。在一些實施例中，諸如在實例28中所描述之分析中，當在活體外以1至5μg/mL與人體組織樣本一起培育時，抗體不會與正常人體組織發生交叉反應，並且不結合至正常人體組織細胞膜。在一些實施例中，例如(諸如)在實例29中所描述之分析中，在培育、然後與經過調理之結合大腸桿菌顆粒一起培育後，抗體不會誘導全血中嗜中性球的吞噬作用。在一些實施例中，諸如在實例29中所描述之分析中，抗體在高達400μg/mL的濃度下不會誘導嗜中性球的呼吸爆發。
B. 抗體hz13-5
在一些實施例中，本發明係關於特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含(i)重鏈可變區(VH)，其包含有包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)及包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的HCDR3；及(ii)輕鏈可變區(VL)，其包含有包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)。在一些實施例中，VH包含有包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的HCDR2，且VL包含有包含SSEQ ID NO: 8之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的LCDR3。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 30之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 32之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：與SEQ ID NO: 30之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及與SEQ ID NO: 32之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，VH與SEQ ID NO: 30之胺基酸序列至少90%一致且VL與SEQ ID NO: 32之胺基酸序列至少90%一致。在一些實施例中，VH與SEQ ID NO: 30之胺基酸序列至少95%一致且VL與SEQ ID NO: 32之胺基酸序列至少95%一致。在一些實施例中，VH與SEQ ID NO: 30之胺基酸序列至少97%一致且VL與SEQ ID NO: 32之胺基酸序列至少97%一致。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 30之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 32之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 30之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 32之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體之VH包含Kabat位置94處之甘胺酸，該位置對應於SEQ ID NO: 10之位置98。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列的VH；及與SEQ ID NO: 32之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 30之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列的VL。
在一些情況下，抗體為IgG抗體，諸如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體。在一些實施例中，抗體包含人類IgG1重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：人類IgG1重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的胺基酸序列；及輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的胺基酸序列。在一些情況下，抗體包含重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列。在一些情況下，抗體包含輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列。在一些情況下，抗體包含以下兩者：重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列；及輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含人類IgG1重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含輕鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：人類IgG1重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列；及輕鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列。
在一些情況下，抗體包含：包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列，然後是SEQ ID NO: 178之胺基酸序列的重鏈(HC)；及包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列，然後是SEQ ID NO: 194之胺基酸序列的輕鏈(LC)。在一些情況下，抗體包含：包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列，然後是SEQ ID NO: 180之胺基酸序列的重鏈(HC)；及包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列，然後是SEQ ID NO: 194之胺基酸序列的輕鏈(LC)。
在一些情況下，抗體結合至包含SEQ ID NO: 217及SEQ ID NO: 218之PAD4上的表位。
在一些實施例中，抗體在SPR分析中係例如在存在1至2 mM氯化鈣(例如在1 mM氯化鈣)及不存在鈣離子的兩種情況下(由於不存在額外的鈣鹽以及存在EDTA，諸如1 mM或2 mM EDTA)以如下K
D特異性結合至PAD4：0.05 nM至1 nM、0.1 nM 至1 nM、0.1 nM至0.5 nM、0.05 nM至0.5 nM、或0.05 nM至0.1 nM、或0.09 nM、0.1 nM、或0.2 nM。參見表2及表3。在一些實施例中，透過SPR，抗體特異性結合至人類PAD4，但不結合至獼猴或鼠類PAD4。
在一些實施例中，抗體之ECM評分小於10、小於5、為1至5、1至2或1。(參見例如表5)。
在一些實施例中，使用Epivax®免疫原性測試量測，抗體之免疫原性評分為0至1%、0至0.5%、或0%、0.5%或1%。(參見表10)。在一些情況下，藉由電腦模擬免疫原性分析所量測，抗體之免疫原性小於以下中之一者、兩者或全部三者：Campath®(阿倫單抗)、Rituxan®(利妥昔單抗)及Zenapax® (達利珠單抗)。
在一些實施例中，例如在如以下實例4中所示之分析中，抗體以25至100 nM、或30至60 nM、或40至60 nM之IC50在活體外抑制PAD4將肽受質(TSTGGRQGSHH；SEQ ID NO: 216)中之精胺酸轉化為瓜胺酸。
在一些實施例中，抗體在活體外抑制在結合及活化人類PAD4之抗體(活化抗體)存在下PAD4之酶促活性。在一些實施例中，活化抗體為來源於患有類風濕性關節炎之患者的抗體。在一些實施例中，活化抗體係與人類PAD3及人類PAD4有交叉反應之抗體。
在一些情況下，與同型對照抗體相比，該抗體減少LPS刺激之人類血液單核體中細胞外瓜胺酸化組蛋白H3的量。在一些實施例中，LPS刺激之人類血液單核球係自新鮮人類PBMC分離之CD14+CD16-單核球。(參見本文中之實例17)。在一些實施例中，抗體能夠被LPS刺激之人類血液單核球內化，諸如被LPS刺激之CD14+人類單核球內化。(參見實例18)。
在一些實施例中，抗體抑制PAD4在發炎肺部中起作用。舉例而言，此可藉由自肺部收集之支氣管肺泡灌洗液(BALF)中組蛋白H3或ITIH4的瓜胺酸化的減少證明，如本文實例25中所描述。舉例而言，可自患有急性或慢性肺部發炎的小鼠收集BALF且在抗體存在下及在野生型對照存在下分析瓜胺酸化H3或ITIH4蛋白質的量。在一些實施例中，小鼠為人類PAD4基因敲入小鼠。在一些情況下，與同型對照(IC)抗體相比，在存在抗體的情況下，人類PAD4基因敲入小鼠中瓜胺酸化H3的量減少至少15%、至少30%、至少40%、至少50%或至少60%，及/或瓜胺酸化ITIH4的量減少至少50%、至少70%或至少80%，例如藉由下式所計算：抑制% = [(IC- na-ve) - (PAD4 mAb-naïve) /(IC-naïve)] × 100，其中量測未治療(naïve)小鼠、接受IC之小鼠及接受抗PAD4抗體之小鼠的瓜胺酸化H3或ITIH4的量。
在一些實施例中，抗體抑制PAD4在發炎關節中起作用，如實例26中所描述。此可例如藉由減少患有急性或慢性關節發炎(諸如關節注射LPS誘導之發炎)之小鼠模型中之關節組織中ITIH4及/或PRG4的瓜胺酸化來證明。在一些情況下，小鼠可為人類PAD4基因敲入小鼠。在一些情況下，與同型對照抗體相比，在人類PAD4基因敲入小鼠之LPS誘導之急性關節損傷模型中，該抗體減少小鼠髕骨中之細胞外瓜胺酸化PRG4及/或瓜胺酸化ITIH4之量。在一些情況下，使瓜胺酸化ITIH4及/或瓜胺酸化PRG4減少的EC50為2 nM或更低、1 nM或更低、0.1 nM或更低、0.05至2 nM或0.1至1 nM。
C. 抗體hz13-12
在一些實施例中，本發明係關於一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含(i)重鏈可變區(VH)，其包含有包含SEQ ID NO: 62之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)及包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的HCDR3；及(ii)輕鏈可變區(VL)，其包含有包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)。在一些實施例中，VH包含有包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的HCDR2，且VL包含有包含SSEQ ID NO: 8之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的LCDR3。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 58之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 60之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：與SEQ ID NO: 58之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及與SEQ ID NO: 60之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，VH與SEQ ID NO: 58之胺基酸序列至少90%一致且VL與SEQ ID NO: 60之胺基酸序列至少90%一致。在一些實施例中，VH與SEQ ID NO: 58之胺基酸序列至少95%一致且VL與SEQ ID NO: 60之胺基酸序列至少95%一致。在一些實施例中，VH與SEQ ID NO: 58之胺基酸序列至少97%一致且VL與SEQ ID NO: 60之胺基酸序列至少97%一致。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 58之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 60之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 58之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 60之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體之VH包含Kabat位置94處之甘胺酸，該位置對應於SEQ ID NO: 10之位置98。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 58之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 58之胺基酸序列的VH，及與SEQ ID NO: 60之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含有與SEQ ID NO: 58之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之VH，及包含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 58之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列的VL。
在一些情況下，抗體為IgG抗體，諸如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體。在一些實施例中，抗體包含人類IgG1重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：人類IgG1重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的胺基酸序列；及輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之胺基酸序列。在一些情況下，抗體包含重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列。在一些情況下，抗體包含輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列。在一些情況下，抗體包含以下兩者：重鏈恆定區，包含其與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列；及輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含人類IgG1重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含輕鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：人類IgG1重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列；及輕鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列。
在一些情況下，抗體包含：包含SEQ ID NO: 58之胺基酸序列，然後是SEQ ID NO: 178之胺基酸序列的重鏈(HC)；及包含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列，然後是SEQ ID NO: 194之胺基酸序列的輕鏈(LC)。在一些情況下，抗體包含：包含SEQ ID NO: 58胺基酸序列，然後是SEQ ID NO: 180之胺基酸序列的重鏈(HC)；及包含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列，然後是SEQ ID NO: 194之胺基酸序列的輕鏈(LC)。
在一些情況下，抗體結合至包含SEQ ID NO: 217及SEQ ID NO: 218之PAD4上的表位。
在一些實施例中，抗體在SPR分析中係例如在存在1至2 mM氯化鈣(例如在1 mM氯化鈣)及不存在鈣離子的兩種情況下(由於不存在額外的鈣鹽以及存在EDTA，諸如1 mM或2 mM EDTA)以如下K
D特異性結合至PAD4：0.05 nM至1 nM、0.1 nM 至1 nM、0.1 nM至0.5 nM、0.05 nM至0.5 nM、或0.05 nM至0.1 nM、或0.09 nM、0.1 nM、或0.2 nM。參見表2及表3。在一些實施例中，透過SPR，抗體特異性結合至人類PAD4，但不結合至獼猴或鼠類PAD4。
在一些實施例中，抗體之ECM評分小於10、小於5、為1至5、1至2或1。(參見例如表5)。
在一些實施例中，使用Epivax®免疫原性測試量測，抗體之免疫原性評分為0至1%、0至0.5%、或0%、0.5%或1%。在一些情況下，抗體評分為0%。(參見表10)。在一些情況下，藉由電腦模擬免疫原性分析所量測，抗體之免疫原性小於以下中之一者、兩者或全部三者：Campath®(阿倫單抗)、Rituxan®(利妥昔單抗)及Zenapax® (達利珠單抗)。
在一些實施例中，例如在如以下實例4中所示之分析中，抗體以25至100 nM、或30至60 nM、或40至60 nM之IC50在活體外抑制PAD4將肽受質(TSTGGRQGSHH；SEQ ID NO: 216)中之精胺酸轉化為瓜胺酸。
在一些實施例中，抗體在活體外抑制在結合及活化人類PAD4之抗體(活化抗體)存在下PAD4之酶促活性。在一些實施例中，活化抗體為來源於患有類風濕性關節炎之患者的抗體。在一些實施例中，活化抗體係與人類PAD3及人類PAD4有交叉反應之抗體。
在一些情況下，與同型對照抗體相比，該抗體減少LPS刺激之人類血液單核體中細胞外瓜胺酸化組蛋白H3的量。在一些實施例中，LPS刺激之人類血液單核球係自新鮮人類PBMC分離之CD14+CD16-單核球。(參見本文中之實例17)。在一些實施例中，抗體能夠被LPS刺激之人類血液單核球內化，諸如被LPS刺激之CD14+人類單核球內化。(參見實例18)。
在一些實施例中，抗體抑制PAD4在發炎肺部中起作用。舉例而言，此可藉由自肺部收集之支氣管肺泡灌洗液(BALF)中組蛋白H3或ITIH4的瓜胺酸化的減少證明，如本文實例25中所描述。舉例而言，可自患有急性或慢性肺部發炎的小鼠收集BALF且在抗體存在下及在野生型對照存在下分析瓜胺酸化H3或ITIH4蛋白質的量。在一些實施例中，小鼠為人類PAD4基因敲入小鼠。在一些情況下，與同型對照(IC)抗體相比，在存在抗體的情況下，人類PAD4基因敲入小鼠中瓜胺酸化H3的量減少至少15%、至少30%、至少40%、至少50%或至少60%，及/或瓜胺酸化ITIH4的量減少至少50%、至少70%或至少80%，例如藉由下式所計算：抑制% = [(IC- na-ve) - (PAD4 mAb-naïve) /(IC-naïve)] × 100，其中量測未治療(naïve)小鼠、接受IC之小鼠及接受抗PAD4抗體之小鼠的瓜胺酸化H3或ITIH4的量。
在一些實施例中，抗體抑制PAD4在發炎關節中起作用，如實例26中所描述。此可例如藉由減少患有急性或慢性關節發炎(諸如關節注射LPS誘導之發炎)之小鼠模型中之關節組織中ITIH4及/或PRG4的瓜胺酸化來證明。在一些情況下，小鼠可為人類PAD4基因敲入小鼠。在一些情況下，與同型對照抗體相比，在人類PAD4基因敲入小鼠之LPS誘導之急性關節損傷模型中，該抗體減少小鼠髕骨中之細胞外瓜胺酸化PRG4及/或瓜胺酸化ITIH4之量。在一些情況下，使瓜胺酸化ITIH4及/或瓜胺酸化PRG4減少的EC50為2 nM或更低、1 nM或更低、0.1 nM或更低、0.05至2 nM或0.1至1 nM。
D. 抗體hz20-2
在一些實施例中，本發明係關於一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)，其包含有包含SEQ ID NO: 72之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 74之胺基酸序列的HCDR3；及輕鏈可變區(VL)，其包含有包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 76之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 77之胺基酸序列的LCDR3。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 86之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 88之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 86之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH，及與SEQ ID NO: 88之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，VH與SEQ ID NO: 86之胺基酸序列至少90%一致且VL與SEQ ID NO: 88之胺基酸序列至少90%一致。在一些實施例中，VH與SEQ ID NO: 86之胺基酸序列至少95%一致且VL與SEQ ID NO: 88之胺基酸序列至少95%一致。在一些實施例中，VH與SEQ ID NO: 86之胺基酸序列至少97%一致且VL與SEQ ID NO: 88之胺基酸序列至少97%一致。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 86之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 88之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 86之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 88之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 86之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 86之胺基酸序列之VH，及與SEQ ID NO: 88之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 88之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 86之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH，及包含SEQ ID NO: 88之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 86之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 88之胺基酸序列的VL。
在一些情況下，抗體為IgG抗體，諸如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體。在一些實施例中，抗體包含人類IgG1重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：人類IgG1重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之胺基酸序列；及輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之胺基酸序列。在一些情況下，抗體包含重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列。在一些情況下，抗體包含輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列。在一些情況下，抗體包含以下兩者：重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列；及輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含人類IgG1重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含輕鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：人類IgG1重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列；及輕鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列。
在一些情況下，抗體包含：包含SEQ ID NO: 86之胺基酸序列，然後是SEQ ID NO: 178之胺基酸序列的重鏈(HC)；及包含SEQ ID NO: 88之胺基酸序列，然後是SEQ ID NO: 194之胺基酸序列的輕鏈(LC)。在一些情況下，抗體包含：包含SEQ ID NO: 86之胺基酸序列，然後是SEQ ID NO: 180之胺基酸序列的重鏈(HC)；及包含SEQ ID NO: 88之胺基酸序列，然後是SEQ ID NO: 194之胺基酸序列的輕鏈(LC)。
在一些情況下，抗體結合至包含SEQ ID NO: 219及SEQ ID NO: 220之PAD4上的表位。
在一些實施例中，抗體在SPR分析中係例如在存在1至2 mM氯化鈣(例如在1 mM氯化鈣)及不存在鈣離子的兩種情況下(由於不存在額外的鈣鹽以及存在EDTA，諸如1 mM或2 mM EDTA)以如下K
D特異性結合至PAD4：0.05 nM至1 nM、0.1 nM 至1 nM、0.1 nM至0.5 nM、0.05 nM至0.5 nM、或0.05 nM至0.1 nM、或0.09 nM、0.1 nM、或0.2 nM。參見表2及表3。在一些實施例中，使用SPR進行測定，抗體特異性結合至人類PAD4，但不結合至鼠類PAD4。在一些實施例中，使用SPR進行測定，抗體特異性結合至人類PAD4，但不結合至獼猴PAD4。
在一些實施例中，抗體之ECM評分小於20、小於10、為4至10、4至8或5至7。(參見例如表5)。
在一些實施例中，使用Epivax®免疫原性測試量測，抗體之免疫原性評分為0至5%、0至3%、或1至2%。(參見表10)。在一些情況下，藉由電腦模擬免疫原性分析所量測，抗體之免疫原性小於以下中之一者、兩者或全部三者：Campath®(阿倫單抗)、Rituxan®(利妥昔單抗)及Zenapax® (達利珠單抗)。
在一些實施例中，例如在如以下實例4中所示之分析中，抗體以50至100 nM、或50至80 nM、或60至80 nM之IC50在活體外抑制PAD4將肽受質(TSTGGRQGSHH；SEQ ID NO: 216)中之精胺酸轉化為瓜胺酸。
在一些實施例中，抗體在活體外抑制在結合及活化人類PAD4之抗體(活化抗體)存在下PAD4之酶促活性。在一些實施例中，活化抗體為來源於患有類風濕性關節炎之患者的抗體。在一些實施例中，活化抗體係與人類PAD3及人類PAD4有交叉反應之抗體。
在一些情況下，與同型對照抗體相比，該抗體減少LPS刺激之人類血液單核體中細胞外瓜胺酸化組蛋白H3的量。在一些實施例中，LPS刺激之人類血液單核球係自新鮮人類PBMC分離之CD14+CD16-單核球。(參見本文中之實例17)。在一些實施例中，抗體能夠被LPS刺激之人類血液單核球內化，諸如被LPS刺激之CD14+人類單核球內化。(參見實例18)。
在一些實施例中，抗體抑制PAD4在發炎肺部中起作用。舉例而言，此可藉由自肺部收集之支氣管肺泡灌洗液(BALF)中組蛋白H3或ITIH4的瓜胺酸化的減少證明，如本文實例25中所描述。舉例而言，可自患有急性或慢性肺部發炎的小鼠收集BALF且在抗體存在下及在野生型對照存在下分析瓜胺酸化H3或ITIH4蛋白質的量。在一些實施例中，小鼠為人類PAD4基因敲入小鼠。在一些情況下，與同型對照(IC)抗體相比，在存在抗體的情況下，人類PAD4基因敲入小鼠中瓜胺酸化H3的量減少至少10%或至少15%，及/或瓜胺酸化ITIH4的量減少至少50%、至少70%或至少80%，例如藉由下式所計算：抑制% = [(IC- naïve)) - (PAD4 mAb-naïve) /(IC-naïve)] × 100，其中量測未治療(naïve)小鼠、接受IC之小鼠及接受抗PAD4抗體之小鼠的瓜胺酸化H3或ITIH4的量。
在一些實施例中，抗體抑制PAD4在發炎關節中起作用，如實例26中所描述。此可例如藉由減少患有急性或慢性關節發炎(諸如關節注射LPS誘導之發炎)之小鼠模型中之關節組織中ITIH4及/或PRG4的瓜胺酸化來證明。在一些情況下，小鼠可為人類PAD4基因敲入小鼠。在一些情況下，與同型對照抗體相比，在人類PAD4基因敲入小鼠之LPS誘導之急性關節損傷模型中，該抗體減少小鼠髕骨中之細胞外瓜胺酸化PRG4及/或瓜胺酸化ITIH4之量。在一些情況下，使瓜胺酸化ITIH4及/或瓜胺酸化PRG4減少的EC50為2 nM或更低、1 nM或更低、或0.5至1.5 nM。
E. 抗體hz20-7
在一些實施例中，本發明係關於一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)，其包含有包含SEQ ID NO: 72之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 74之胺基酸序列的HCDR3；及輕鏈可變區(VL)，其包含有包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 76之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 77之胺基酸序列的LCDR3。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 106之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 108之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 106之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH，及與SEQ ID NO: 108之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，VH與SEQ ID NO: 106之胺基酸序列至少90%一致且VL與SEQ ID NO: 108之胺基酸序列至少90%一致。在一些實施例中，VH與SEQ ID NO: 106之胺基酸序列至少95%一致且VL與SEQ ID NO: 108之胺基酸序列至少95%一致。在一些實施例中，VH與SEQ ID NO: 106之胺基酸序列至少97%一致且VL與SEQ ID NO: 108之胺基酸序列至少97%一致。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 106之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 108之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 106之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 108之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 106之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 106之胺基酸序列之VH及與SEQ ID NO: 108之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 108之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 106之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH及包含SEQ ID NO: 106之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 106之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 108之胺基酸序列的VL。
在一些情況下，抗體為IgG抗體，諸如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體。在一些實施例中，抗體包含人類IgG1重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：人類IgG1重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之胺基酸序列；及輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO:194之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之胺基酸序列。在一些情況下，抗體包含重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列。在一些情況下，抗體包含輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列。在一些情況下，抗體包含以下兩者：重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列；及輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含人類IgG1重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含輕鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：人類IgG1重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列；及輕鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列。
在一些情況下，抗體包含：包含SEQ ID NO: 106之胺基酸序列，然後是SEQ ID NO: 178之胺基酸序列的重鏈(HC)；及包含SEQ ID NO: 108之胺基酸序列，然後是SEQ ID NO: 194之胺基酸序列的輕鏈(LC)。在一些情況下，抗體包含：包含SEQ ID NO: 106胺基酸序列，然後是SEQ ID NO: 180之胺基酸序列的重鏈(HC)；及包含SEQ ID NO: 108之胺基酸序列，然後是SEQ ID NO: 194之胺基酸序列的輕鏈(LC)。
在一些情況下，抗體結合至包含SEQ ID NO: 219及SEQ ID NO: 220之PAD4上的表位。
在一些實施例中，抗體在SPR分析中係例如在存在1至2 mM氯化鈣(例如在1 mM氯化鈣)及不存在鈣離子的兩種情況下(由於不存在額外的鈣鹽以及存在EDTA，諸如1 mM或2 mM EDTA)以如下K
D特異性結合至PAD4：0.1 nM至1 nM、或0.3 nM至1 nM。參見表2及表3。在一些實施例中，使用SPR進行測定，抗體特異性結合至人類PAD4，但不結合至鼠類PAD4。在一些實施例中，使用SPR進行測定，抗體特異性結合至人類PAD4，但不結合至獼猴PAD4。
在一些實施例中，抗體之ECM評分小於20、小於10、為2至10、4至8或4至7。(參見例如表5)。
在一些實施例中，使用Epivax®免疫原性測試量測，抗體之免疫原性評分為0至5%、0至3%、或0至2%。在一些情況下，抗體評分為0.5至1%。(參見表10)。在一些情況下，藉由電腦模擬免疫原性分析所量測，抗體之免疫原性小於以下中之一者、兩者或全部三者：Campath®(阿倫單抗)、Rituxan®(利妥昔單抗)及Zenapax® (達利珠單抗)。
在一些實施例中，例如在如以下實例4中所示之分析中，抗體以50至100 nM、或50至80 nM、或60至80 nM之IC50在活體外抑制PAD4將肽受質(TSTGGRQGSHH；SEQ ID NO: 216)中之精胺酸轉化為瓜胺酸。
在一些實施例中，抗體在活體外抑制在結合及活化人類PAD4之抗體(活化抗體)存在下PAD4之酶促活性。在一些實施例中，活化抗體為來源於患有類風濕性關節炎之患者的抗體。在一些實施例中，活化抗體係與人類PAD3及人類PAD4有交叉反應之抗體。
在一些情況下，與同型對照抗體相比，該抗體減少LPS刺激之人類血液單核體中細胞外瓜胺酸化組蛋白H3的量。在一些實施例中，LPS刺激之人類血液單核球係自新鮮人類PBMC分離之CD14+CD16-單核球。(參見本文中之實例17)。在一些實施例中，抗體能夠被LPS刺激之人類血液單核球內化，諸如被LPS刺激之CD14+人類單核球內化。(參見實例18)。
在一些實施例中，抗體抑制PAD4在發炎肺部中起作用。舉例而言，此可藉由自肺部收集之支氣管肺泡灌洗液(BALF)中組蛋白H3或ITIH4的瓜胺酸化的減少證明，如本文實例25中所描述。舉例而言，可自患有急性或慢性肺部發炎的小鼠收集BALF且在抗體存在下及在野生型對照存在下分析瓜胺酸化H3或ITIH4蛋白質的量。在一些實施例中，小鼠為人類PAD4基因敲入小鼠。在一些情況下，與同型對照(IC)抗體相比，在存在抗體的情況下，人類PAD4基因敲入小鼠中瓜胺酸化H3的量減少至少10%或至少15%，及/或瓜胺酸化ITIH4的量減少至少50%、至少70%或至少80%，例如藉由下式所計算：抑制% = [(IC- naïve)) - (PAD4 mAb-naïve) /(IC-naïve)] × 100，其中量測未治療(naïve)小鼠、接受IC之小鼠及接受抗PAD4抗體之小鼠的瓜胺酸化H3或ITIH4的量。
F. pH依賴性抗體hz13-5 VH_D31H:Vk_I30H
在一些實施例中，本發明係關於一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)，其包含：包含SEQ ID NO: 168之位置26至35之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、包含SEQ ID NO: 168之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 168之位置99至108之胺基酸序列的HCDR3；及輕鏈可變區(VL)，其包含：包含SEQ ID NO: 172之殘基24至38之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 172之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 172之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 168之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：與SEQ ID NO: 168之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之VH；及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：與SEQ ID NO: 168之胺基酸序列至少90%一致的VH；及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：與SEQ ID NO: 168之胺基酸序列至少95%一致的VH；及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少95%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：與SEQ ID NO: 168之胺基酸序列至少97%一致的VH；及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少97%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 168之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 168之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體之VH包含Kabat位置94 (SEQ ID NO: 10之位置98)處之甘胺酸。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 58之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 168之胺基酸序列的VH，及與SEQ ID NO: 172之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 168之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH，及包含SEQ ID NO: 72之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 168之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VL。
在一些情況下，抗體包含：包含SEQ ID NO: 168之胺基酸序列，然後是SEQ ID NO: 178之胺基酸序列的重鏈(HC)；及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列，然後是SEQ ID NO: 194之胺基酸序列的輕鏈(LC)。在一些情況下，抗體包含：包含SEQ ID NO: 168胺基酸序列，然後是SEQ ID NO: 180之胺基酸序列的重鏈(HC)；及包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列，然後是SEQ ID NO: 194之胺基酸序列的輕鏈(LC)。
在一些情況下，抗體為IgG抗體，諸如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體。在一些實施例中，抗體包含人類IgG1重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：人類IgG1重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之胺基酸序列；及輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之胺基酸序列。在一些情況下，抗體包含重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列。在一些情況下，抗體包含輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列。在一些情況下，該抗體包含以下兩者：重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列；及輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含人類IgG1重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含輕鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：人類IgG1重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列；及輕鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列。
在抗體hz13-5 VH_D31H:Vk_I30H之情況下，觀測到與人類PAD4之pH依賴性結合。此突變體在pH 7.6下之結合活性與(未突變) hz13-5同人類PAD4的結合相當(參見圖13M)。儘管親本hz13-5保持在pH 6.0下結合，但突變hz13-5 VH_D31H::Vk_I30HpH 6.0下展現出與人類PAD4之結合損失。參見圖13N。
G. 鼠類替代抗體mumAb
在一些實施例中，本發明係關於一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)，其包含：包含SEQ ID NO: 208之位置31至35之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、包含SEQ ID NO: 208之位置50至66之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 208之位置99至107之胺基酸序列的HCDR3；及輕鏈可變區(VL)，其包含：包含SEQ ID NO: 210之殘基24至38之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 210之殘基54至60之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 210之殘基93至101之胺基酸序列的LCDR3。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 208之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO: 210之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：與SEQ ID NO: 208之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及與SEQ ID NO: 210之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：與SEQ ID NO: 208之胺基酸序列至少90%一致的VH；及與SEQ ID NO: 210之胺基酸序列至少90%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：與SEQ ID NO: 208之胺基酸序列至少95%一致的VH；及與SEQ ID NO: 210之胺基酸序列至少95%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：與SEQ ID NO: 208之胺基酸序列至少97%一致的VH；及與SEQ ID NO: 210之胺基酸序列至少97%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 208之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 210之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含以下兩者：包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 208之胺基酸序列的VH；及包含經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之SEQ ID NO: 210之胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 208之胺基酸序列的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 208之胺基酸序列的VH；及與SEQ ID NO: 210之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VL。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO: 210之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：與SEQ ID NO: 208之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的VH；及包含SEQ ID NO: 210之胺基酸序列的VL。在一些實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO: 208之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 210之胺基酸序列的VL。
在一些情況下，抗體包含：包含SEQ ID NO: 212之胺基酸序列的重鏈(HC)及包含SEQ ID NO: 214之胺基酸序列的輕鏈(LC)。
本發明亦涵蓋例如一或多種編碼如上文所描述之抗鼠類PAD4抗體之核酸分子、包含一或多種編碼抗鼠類PAD4抗體之核酸分子的載體，及表現抗鼠類PAD4抗體之宿主細胞或動物模型(亦即，包含編碼抗鼠類PAD4抗體之核酸或載體的宿主細胞或動物模型)。此類核酸分子、載體或宿主細胞可如本文以下部分中所描述。例示性載體包括DNA載體、RNA載體(例如mRNA及環狀RNA、自擴增RNA載體等)、噬菌體載體、病毒載體(例如痘病毒載體、痘瘡病毒載體、腺病毒載體、經修飾痘瘡病毒安卡拉(MVA)載體等)、反轉錄病毒載體等。例示性動物模型包括例如鼠類模型，其中向小鼠投與如上文所描述之抗鼠類PAD4抗體、或一或多種編碼此類抗鼠類PAD4抗體之核酸分子、載體或宿主細胞。
觀測到鼠類替代抗體mumAb具有若干種與本文所描述之其他抗體(諸如人源化植株13或植株20衍生物)之活體外及活體內特性類似的活體外及活體內特性。舉例而言，在一些情況下，抗體抑制PAD4在發炎肺部中起作用。舉例而言，此可藉由自肺部收集之支氣管肺泡灌洗液(BALF)中組蛋白H3或ITIH4的瓜胺酸化的減少證明，如本文實例20中所描述。舉例而言，可以自具有正常鼠類PAD4的具有急性或慢性肺部發炎的小鼠收集BALF且在抗體存在下及在野生型對照存在下分析瓜胺酸化H3或ITIH4蛋白質的量。在一些情況下，與同型對照(IC)抗體相比，在存在抗體的情況下，小鼠中瓜胺酸化H3的量減少至少15%、至少30%、至少40%、至少50%或至少60%，及/或瓜胺酸化ITIH4的量減少至少50%、至少70%或至少80%，例如藉由下式所計算：抑制% = [(IC- naïve)) - (PAD4 mAb-naïve) /(IC-naïve)] × 100，其中量測未處理(naïve)小鼠、接受IC之小鼠及接受抗PAD4抗體之小鼠的瓜胺酸化H3或ITIH4的量。
在一些實施例中，抗體抑制PAD4在發炎關節中起作用，例如如實例21及22中所例示及描述。此可例如藉由減少具有正常鼠類PAD4的患有急性或慢性關節發炎(諸如關節注射LPS誘導之發炎)之小鼠模型中之關節組織中ITIH4及/或PRG4的瓜胺酸化來證明。在一些情況下，與同型對照抗體相比，在人類PAD4基因敲入小鼠之LPS誘導之急性關節損傷模型中，該抗體減少小鼠髕骨中之細胞外瓜胺酸化PRG4及/或瓜胺酸化ITIH4之量。
在一些實施例中，本文中之抗體可減少姥鮫烷誘導之細胞外陷阱形成嗜中性球(NETosis)及/或細胞外陷阱形成單核球(METosis)。(參見實例23)。例如，在用本文中之抗體或用同型對照抗體處理後，可以經腹膜內向小鼠注射姥鮫烷。在一些情況下，在此類姥鮫烷誘導之小鼠模型中，與同型對照抗體相比，該抗體減少腹膜液中之嗜中性球、單核球、M1巨噬細胞及/或M2巨噬細胞中H3的瓜胺酸化。在另外的情況下，抗體減少小鼠腹膜液中嗜中性球及單核球/巨噬細胞的可溶性標記物的量，諸如彈性蛋白酶、MPO、MIP-2α、GROα/KC、MCP1 、MIP1β、IL6及MIP3α。(參見實例23)。
在一些實施例中，在膠原蛋白誘發之關節炎小鼠模型中，該抗體抑制PAD4依賴性反應。(參見實例24)。例如，在一些實施例中，根據以下量表，與同型對照相比，本文中之抗體顯著降低關節炎模型中小鼠的關節炎臨床評分：(1)正常；(2)輕度，踝部或腕部有清晰紅腫，或僅限於個別足趾明顯紅腫，不論受影響的足趾有多少；(3)踝部或腕部中度紅腫；(4)包括足趾在內的整個腳爪嚴重紅腫；(5)肢體發炎最嚴重，涉及多個關節。例如，在一些情況下，該抗體亦分別減少藉由SG+MPO+嗜中性球及SG+MPO+單核球/巨噬細胞評估的NETosis及METosis，及/或減少單核球/巨噬細胞的可溶性標記物，諸如彈性蛋白酶及MPO，及/或降低嗜中性球、單核球及/或巨噬細胞中H3蛋白瓜胺酸化的比例。(參見實例24)。
VI. 編碼抗PAD4抗體之核酸分子
提供核酸分子，其包含編碼抗PAD4抗體之一或多個鏈的多核苷酸。在一些實施例中，核酸分子包含編碼抗PAD4抗體之重鏈或輕鏈的多核苷酸。在一些實施例中，核酸分子包含編碼抗PAD4抗體之重鏈的多核苷酸及編碼抗PAD4抗體之輕鏈的多核苷酸兩者。在一些實施例中，第一核酸分子包含編碼重鏈之第一多核苷酸且第二核酸分子包含編碼輕鏈之第二多核苷酸。
編碼重鏈及輕鏈多肽(諸如本文中抗體之VH、VL、HC或LC)之多核苷酸的適當實例提供於以下序列表中，或包括與所提供之序列簡併之彼等序列的變異體，亦即，與所提供之序列相比，含有一或多個密碼子交換。舉例而言，鑒於遺傳密碼係冗餘的，因為在許多情況下，多於一個密碼子可以編碼單一胺基酸殘基，在某些情況下，諸如由於用於表現抗體之特定宿主細胞的密碼子偏好，一個密碼子可以交換為編碼相同胺基酸殘基之另一個密碼子。
在一些此類實施例中，重鏈及輕鏈由一個核酸分子表現，或由兩個獨立核酸分子以兩個獨立多肽形式表現。在一些實施例中，諸如當抗體為scFv時，單一多核苷酸編碼包含連接在一起的重鏈及輕鏈的單一多肽。
在一些實施例中，編碼抗PAD4抗體之重鏈或輕鏈的多核苷酸包含編碼前導序列之核苷酸序列，該前導序列在轉譯時位於重鏈或輕鏈之N端。前導序列可為天然重鏈或輕鏈前導序列，或可為另一異源前導序列。
核酸分子可使用此項技術中習知的重組DNA技術構築。在一些實施例中，核酸分子係適於在所選宿主細胞中表現的表現載體。
VII. 抗PAD4抗體表現及產生 A. 載體
提供包含編碼抗PAD4重鏈及/或反PAD4輕鏈之多核苷酸的載體。亦提供包含編碼抗PAD4重鏈及/或抗PAD4輕鏈之多核苷酸的載體。此類載體包括(但不限於) DNA載體、RNA載體(例如mRNA及環狀RNA、自擴增RNA載體等)、噬菌體載體、病毒載體(例如痘病毒載體、痘瘡病毒載體、腺病毒載體、經修飾痘瘡病毒安卡拉(MVA)載體等)、反轉錄病毒載體等。在一些實施例中，載體包含編碼重鏈之第一多核苷酸序列及編碼輕鏈之第二多核苷酸序列。在一些實施例中，重鏈及輕鏈係以兩個獨立多肽形式自載體表現。在一些實施例中，重鏈及輕鏈係作為單一多肽之一部分表現，諸如當抗體係scFv時。
在一些實施例中，第一載體包含編碼重鏈之多核苷酸且第二載體包含編碼輕鏈之多核苷酸。在一些實施例中，第一載體及第二載體以類似量(諸如類似莫耳量或類似質量)轉染至宿主細胞中。在一些實施例中，將5:1與1:5之間的莫耳比或質量比的第一載體及第二載體轉染至宿主細胞中。在一些實施例中，使用1:1與1:5之間的質量比的編碼重鏈之載體及編碼輕鏈之載體。在一些具體例中，使用1:2之質量比的編碼重鏈之載體及編碼輕鏈之載體。
在一些實施例中，選擇為了在CHO或CHO衍生之細胞或NSO細胞中表現多肽而最佳化的載體。例示性的此類載體描述於例如Running Deer等人，
Biotechnol. Prog. 20:880-889 (2004)中。
在一些實施例中，選擇用於在動物(包括人類)中活體內表現抗PAD4重鏈及/或抗PAD4輕鏈之載體。在一些此類實施例中，在以組織特異性方式起作用的啟動子控制下表現多肽。舉例而言，肝臟特異性啟動子描述於例如PCT公開案第WO 2006/076288號中。
B. 宿主細胞
在各種實施例中，抗PAD4重鏈及/或抗PAD4輕鏈可表現於原核細胞中，諸如細菌細胞；或表現於真核細胞中，諸如真菌細胞(諸如酵母)、植物細胞、昆蟲細胞及哺乳動物細胞。此類表現可例如根據此項技術中已知之程序來進行。可用於表現多肽之例示性真核細胞包括(但不限於) COS細胞，包括COS 7細胞；293細胞，包括293-6E細胞；CHO細胞，包括CHO-S及DG44細胞；PER.C6®細胞(Crucell)；及NSO細胞。在一些實施例中，抗PAD4重鏈及/或抗PAD4輕鏈可表現於酵母中。參見例如美國公開案第US 2006/0270045 A1號。在一些實施例中，特定真核宿主細胞係根據其對抗PAD4重鏈及/或抗PAD4輕鏈進行所需轉譯後修飾的能力加以選擇。舉例而言，在一些實施例中，CHO細胞產生多肽，該等多肽之唾液酸化含量高於在293細胞中所產生之相同多肽。
向所需宿主細胞中引入一或多種核酸可藉由任何方法實現，包括但不限於磷酸鈣轉染、DEAE-聚葡萄糖介導之轉染、陽離子脂質介導之轉染、電穿孔、轉導、感染等。非限制性例示性方法描述於例如Sambrook等人，
Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)中。核酸可根據任何適合方法短暫或穩定轉染於所需宿主細胞中。
在一些實施例中，可根據任何適合方法在已使用一或多種編碼多肽之核酸分子工程改造的動物中活體內產生一或多種多肽。
C. 抗PAD4抗體之純化
抗PAD4抗體可藉由任何適合方法純化。此類方法包括(但不限於)使用親和力基質或疏水性相互作用層析法或尺寸排阻層析法。(關於人源化抗體之純化的描述，參見例如實例2)。
D. 抗PAD4抗體之游離產生
在一些實施例中，在游離系統中產生抗PAD4抗體。非限制性例示性游離系統描述於例如Sitaraman等人，
Methods Mol. Biol.498: 229-44 (2009)；Spirin,
Trends Biotechnol.22: 538-45 (2004)；Endo等人，
Biotechnol. Adv.21: 695-713 (2003)中。
VIII. 治療組合物及方法 A. 使用抗PAD4抗體治療疾病之方法
提供本發明抗體及包含本發明抗體之組合物以供用於治療個體(例如人類或其他動物)之疾病或病症之方法中。亦提供治療疾病之方法，其包含投與抗PAD4抗體。術語「疾病」及「病症」在本文中在待治療之適應症的上下文中可互換使用。
在一些實施例中，病症為癌症或自體免疫病症或傳染病。在一些實施例中，病症係與NETosis、METosis、抗瓜胺酸化蛋白質抗體(ACPA)之存在、PAD4表現增加或PAD4活性增加(諸如多肽(諸如組蛋白H3)之瓜胺酸化增加)相關之病症。
舉例而言，經PAD4進行瓜胺酸係化一種壓力反應，並且可以作為用於去除壓力細胞的信號。(Brentville等人，Oncoimmunology 8: e1576490 (2019))。經PAD4瓜胺酸化之蛋白質成為抗原受質，並且係細胞(亦即T細胞)及體液(亦即B細胞衍生之抗體)適應性免疫反應的標靶。(參見例如Curran等人Nat. Rev. Rheumatol. 16: 301-15 (2020)；Brentville等人)。因此，PAD4活性可導致抗瓜胺酸化蛋白質抗體(ACPA)生成。在嗜中性球中，PAD4亦在稱為NETosis之過程中發揮作用，透過該過程，嗜中性球擠出含有DNA支架、瓜胺酸化組蛋白及抗菌嗜中性球性顆粒之解濃縮染色質結構複合物。(Li等人J. Exp. Med. 207: 1853-62 (2010))。此等擠出的複合物被稱為嗜中性球細胞外陷阱(NET)，且在NETosis期間，此等NET會捕捉且殺死入侵的微生物，作為先天性免疫反應之一部分。(Chamardani等人，Mol. Cell. Biochem. 477: 673-88 (2022))。涉及單核球之類似過程被稱為METosis且涉及單核球細胞外陷阱(MET)之形成。
某些疾病及病症與NETosis、METosis、抗瓜胺酸化蛋白質抗體(ACPA)之存在、PAD4表現增加或PAD4活性增加(諸如多肽(諸如組蛋白H3)之瓜胺酸化增加)相關。本文中之揭示內容亦涵蓋本文中之抗體用於治療此類疾病及病症之用途。本文中之揭示內容亦涵蓋本文中之抗體用於抑制個體之NETosis或METosis之用途。本文之揭示內容進一步涵蓋本文中之抗體用於抑制個體中之瓜胺酸化之用途。抑制瓜胺酸化可包含在血清、全血、血漿、血液上清液或滑液中或其他體液或組織中發現之一或多種蛋白質處的瓜胺酸。實例包括例如蛋白多醣4 (PRG4)、血纖維蛋白原A (FGA)、間α-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4 (ITIH4)、α-1-微球蛋白/比庫寧前驅體(AMBP)及凝溶膠蛋白(GSN)中之一或多者。在一些情況下，抗PAD4抗體可用於抑制患有例如自體免疫疾病或本文所揭示之另一病狀之個體中的METosis或METosis。在一些情況下，抗PAD4抗體可用於抑制患有例如自體免疫疾病或本文所揭示之另一病狀之個體中的瓜胺酸化。
在一些情況下，本文中之抗體可用於「預防病症發作或復發」，諸如自體免疫病症，或與NETosis或METosis、抗瓜胺酸蛋白質抗體(ACPA)之存在、PAD4表現增加或PAD4活性增加(諸如多肽(諸如組蛋白H3)瓜胺酸化增加)相關的病症。如本文所使用，「預防發作或復發」意指例如由於用其他療法進行治療而抑制個體中與病症相關之至少一種症狀的發作或復發(例如，抑制RA個體中關節發炎的發作，或抑制RA個體中關節發炎的復發)，該個體諸如係確定易患症狀之個體或處於緩解中或其先前症狀已減輕的個體。如本文所使用，「預防發作或復發」亦涵蓋抑制諸如在其症狀已減輕至低水準的個體中該病症之至少一種症狀的增加(例如，RA個體中關節發炎的明顯增加)。因此，在此類情況下，可以將本文中之抗體提供給目前未表現出病症症狀之個體，以停止或減緩症狀之發作，或者可以將抗體提供給處於緩解期之個體，以停止或減緩該病症之新症狀的發作或相關病症之發作。例如，個體可具有病症之亞臨床跡象，諸如ACPA之存在、類風濕因子(RF)之存在、或PAD4表現增加、或多肽瓜胺酸化增加中之一或多者，例如在生物樣本(諸如全血、血漿、血清、血液上清液或滑液)中所偵測到的，但個體可能尚未顯示出病症的症狀。
在一些實施例中，病症為自體免疫病症。舉例而言，多種資料表明，PAD4在諸如類風濕性關節炎(RA)、狼瘡(包括全身性紅斑性狼瘡症(SLE)、狼瘡性腎炎、血管炎(包括抗嗜中性球性細胞質抗體(ANCA)相關血管炎、發炎性腸病(IBD) (包括潰瘍性結腸炎及克羅恩氏病)、血栓(例如靜脈血栓)、抗磷脂抗體症候群及囊腫性纖維化之自體免疫疾病中發揮作用。(參見例如Curran等人；Yadav等人，J. Cyst. Fibros. 18: 636-45 (2018)；Wang等人，Front. Immunol. 13: 895216 (2022)；Fresneda Alarcon等人Frong. Immunol. 12: 649693 (2021)；Weeding等人，Clin. Immunol. 196: 110-116 (2018); Xu等人，Chinese J. Microbiology and Immunology 12: 115-121 (2020)；Yoshida等人，Clin. Kidney J. 6: 308-12 (2013)；O'Sullivan等人，Rheumatology, 58(Suppl. 2): kez061.024 (2019)；Pan等人，Authorea Preprints, 2021, DOI: 10.22541/au.161590650.07168461/v1)。
在一些實施例中，自體免疫病症包含或為類風濕性關節炎(RA)。在一些實施例中，病症為RA，或待治療之個體已診斷患有RA。在一些實施例中，個體被認為有發展RA之風險。在一些實施例中，RA為幼發型RA、幼年型特發性關節炎(JIA)或幼年型類風濕性關節炎(JRA)。在一些實施例中，個體患有類風濕滑膜炎或繼發於RA之顯著全身性涉及(包括但不限於血管炎、肺纖維化或費爾蒂氏症候群(Felty's syndrome))。在一些實施例中，個體的抗瓜胺酸化蛋白質抗體(ACPA)呈陽性。在一些實施例中，個體的抗PAD4自體抗體呈陽性。典型地，此類抗PAD4自體抗體活化PAD4。
類風濕性關節炎(RA)係一種嚴重的自體免疫疾病，其病理學通常包括存在自體抗體，包括抗瓜胺酸化蛋白質抗體(ACPA)。PAD4係一種轉譯後修飾酶，其可將蛋白質瓜胺酸化成為新自體抗原。此等新自體抗原在被呈現時會導致ACPA的產生，並被ACPA識別以形成免疫複合物，由此導致疾病的發生及進展。PAD4以ACPA非依賴性方式在RA發病機制中之作用例如係綜述於Curran AM、Naik P、Giles JT、Darrah E. Nat Rev Rheumatol. 2020年6月;16(6):301-315中。PAD4在RA中的重要性已得到多條證據的進一步支持。舉例而言，PADI基因被鑑別為RA之風險基因座，如Curran AM、Naik P、Giles JT、Darrah E. Nat Rev Rheumatol. 2020年6月;16(6):301-315中所綜述。例如，編碼PAD4之PADI4基因中之單核苷酸多型性已被鑑別出有促於RA之易感性單倍型。(Susuki等人，Nat. Genet. 34: 395-402 (2003))。PADI4啟動子區域的表觀遺傳變化亦被發現與RA疾病活動度以及RA個體之ACPA含量相關。(Kolarz等人，J. Clin. Med. 9: 2049 (2020)；Reyes-Castillo等人，Clin. Exp. Immunol. 182: 119-31 (2015))。在機制層面上，PAD4瓜胺酸化已知為ACPA標靶的各種蛋白質，該等抗體經由抗CCP測試用作個體之RA分類及診斷的一部分。除ACPA以外，抗PAD4抗體亦存在於一部分RA患者中，並且與腫脹關節計數增加及RA疾病嚴重程度顯著相關。在RA個體中發現的此等抗PAD4抗體中有活化RA個體中之PAD4的抗體。(Halvorsen等人，Ann. Rheum. Dis. 68: 249-52 (2009)；Zhao等人，J. Rheumatol. 35: 969-74 (2008)；Darrah等人，Sci. Transl. Med. 5: 186ra65 (2013))。正如Curran等人回顧，在高達45%的RA患者體內偵測到抗PAD4自身抗體，並顯示其與疾病活動度相關。在臨床前已顯示PAD4缺陷可以改善實驗性發炎關節炎小鼠模型(Weri Y.等人，Sci Rep. 2015 Aug 21;5:13041.；Suzuki A等人，BMC Musculoskelet Disord. 2016年5月5日；17:205; Fukui S.等人，Arthritis Rheumatol. 2022年2月15日. doi: 10.1002/art.42093)。本文實例中之資料進一步顯示本文所提供之抗體在鼠類模型中的活性及功效，該等小鼠模型包括但不限於膠原蛋白誘導之關節炎、急性關節發炎及慢性關節發炎模型。在一些實施例中，不僅可以使用本文中之抗體治療RA個體，而且可以使用抗體治療有發展RA之風險的個體。例如，在一些實施例中，有發展RA風險之個體具有患有RA的一等親(亦即，父母或兄弟姐妹)，及/或血清中存在抗瓜胺酸化蛋白質抗體(ACPA)，及/或血清中存在類風濕因子(RF)。例如，可在一些情況下使用抗CCP測試(諸如ELISA測試)測定抗瓜胺酸化蛋白質抗體之存在。例如，在340名不符合RA分類標準但仍進行抗CCP測試(諸如由於關節疼痛或肺病)的個體中，有46%的個體發現抗CCP抗體測試呈陽性(亦即存在ACPA)。彼等46%的人在後續5年內繼續符合RA分類。(Ford等人，Rheum. Dis. Clin North Am 45: 101-112 (2019)。在一些情況下，此類抗CCP測試結果一直在RA症狀發作之前10年均可呈陽性。(參見例如Jones等人，Curr. Op. Drug Discov. Dev., 12(5): 616-627 (2009))。PAD4已在RA個體之滑液及滑膜生檢體中與瓜胺酸化蛋白質一起被發現，並且亦在RA個體之嗜中性球產生之NET中被發現。據認為，此等目標蛋白(諸如血纖維蛋白原、波形蛋白及組蛋白)之瓜胺酸化在RA發展的亞臨床階段得到促進，並且可能由諸如吸菸(已知吸菸會增加肺組織中之PAD表現)及牙周病(經由口腔微生物牙齦卟啉單胞菌(
P. gingivalis)之PAD活性)等因素觸發。(Curran等人；Chang等人，Arthitis Res. Ther. 7: R268 (2005)；Smolen等人，Nat. Rev. Dis. Priers 4: 18001 (2018))。因此，在一些情況下，有發展RA風險之個體具有吸菸史(例如，香菸、雪茄)或使用菸草產品(例如，咀嚼菸草)的歷史，及/或患有牙周病。
在一些此類情況下，有發展RA風險之個體沒有關節炎之臨床症狀。然而，在一些實施例中，個體顯示出關節炎之亞臨床症狀，諸如藉由成像(諸如超音波或磁共振成像(MRI))可見的關節發炎、經由抗CCP測試發現存在ACPA、存在類風濕因子(RF)、或RA個體所特有的PADI4基因或其啟動子區域中之SNP或其他遺傳改變。在一些情況下，個體具有此類亞臨床症狀以及患有RA的一等親及血清ACPA或血清類風濕因子(RF)中的一種或兩種。在其他情況下，個體已診斷患有關節痛或未分化關節炎。舉例而言，本文中之「關節痛」係指至少一個關節，例如踝部、腳趾、肩膀、肘部、腕部、膝部、髖部或手部、手指或脊椎中之一個多個關節的疼痛或酸痛的症狀。患有關節痛之個體亦可能在一或多個關節中有壓痛、發紅、發熱、活動能力喪失、僵硬、虛弱、麻及/或刺痛。「未分化關節炎」係指個體之關節炎的診斷，其中關節炎之類型(諸如RA或骨關節炎)未指定或無法確定。在患有關節疼痛或未分化關節炎之個體的情況下，該個體亦可以具有以下中之一或多者：患有RA之一等親、血清中有ACPA、血清中有RF及亞臨床關節炎症(例如，透過超音波或MRI)。舉例而言，在有發展RA風險之此類個體中，治療可以包括例如減輕一或多種出現的臨床症狀及/或一或多種出現的亞臨床症狀之影響。在一些情況下，本文中之抗體可以藉由預防有發展RA風險之個體中RA發作或復發的方法投與。
在一些實施例中，RA個體或有發展RA風險之個體具有合併症(comorbidity)。在一些實施例中，合併症為肺部病症，諸如間質性肺病(ILD)、肋膜積液、環杓關節炎(cricoarytenoiditis)、縮窄性或濾泡性細支氣管炎支氣管擴張、肺血管炎或肺高血壓。(參見例如S. Kadura & G. Raghu, Eur. Respiratory Rev. 30: 210011 (2021))。在一些情況下，肺部病症為實質肺病(例如肺炎)、氣道疾病(例如環杓關節炎)或肋膜病(例如肋膜積液)。(S. Kadura及G. Raghu)。在一些實施例中，合併症係一種以肺部發炎及/或瘢痕形成(纖維化)為特徵的肺部疾病，例如間質性肺病(ILD)，亦稱為肺纖維化。舉例而言，本文中之實例20及25使用急性肺部發炎模型，顯示本文中之幾種抗PAD4抗體抑制PAD4在發炎肺部中起作用，其係藉由自發炎肺部收集之支氣管肺泡灌洗液(BALF)中組蛋白H3及/或ITIH4之瓜胺酸化減少所證明(參見例如表17)。
在其他實施例中，個體尚未被診斷患有RA，但患有肺部病症，例如以肺部發炎及/或瘢痕形成為特徵的病症，諸如間質性肺病(ILD)，亦稱為肺纖維化，或患有肺實質疾病(例如，肺炎)、氣道疾病(例如，環杓關節炎)或肋膜疾病(例如，肋膜積液)，或患有間質性肺病(ILD)、肋膜積液、環杓關節炎、縮窄性或濾泡性細支氣管炎支氣管擴張、肺血管炎或肺高血壓。例如，ILD亦可能與其他自體免疫疾病(諸如硬皮症、皮肌炎及多發性肌炎、混合結締組織病、休格連氏症候群(Sjogren's syndrome)並存，亦可能係由某些傳染病(諸如肺炎)或暴露於某些藥物或有害物質(諸如石棉)引起，或可能由不受控制的胃食道逆流引起。
在一些實施例中，自體免疫病症包含或係除RA以外之風濕性自體免疫疾病。舉例而言，PAD4基因多型性不僅與RA相關，而且與狼瘡(諸如全身性紅斑狼瘡症(SLE)、皮膚紅斑狼瘡及狼瘡性腎炎)相關。舉例而言，已發現Padi4 -/- 個體表現出自體抗體、I型FN反應、免疫細胞活化、血管功能障礙及NET免疫原性下降。人類T細胞表現PAD4及PAD2兩者，且當暴露於PAD2或PAD4抑制劑時，顯示Th1極化被消除。在狼瘡性腎炎之情況下，例如，與野生型小鼠相比，Padi4基因敲除小鼠表現出蛋白尿進展的顯著改善、腎臟嗜中性球浸潤減少，以及p38 MAPK磷酸化減少及JNK相關白胺酸拉鏈蛋白(JLP) (一種p38 MAPK支架蛋白)表現降低。(參見例如Massarenti等人，Scand. J. Rheumatol. 48(2): 133-140 (2019)；Y. Liu等人，JCI Insight 3(23): e124729；N. Hanata等人，Front. Immunol. 11: 1095 (2020))。
NETosis與狼瘡及其他自體免疫疾病以及腎病的病理生理學相關，包括例如全身性紅斑性狼瘡症、血管炎(例如ANCA相關血管炎)、抗磷脂抗體症候群、1型糖尿病及腎炎性疾病(絲球體腎炎，例如增生性絲球體腎炎和非增生性絲球體腎炎)，並且亦與癌症之病理生理學相關。(參見例如Li等人，Molecular Cancer Therapeutics, 19: 1530-38 (2020), Teijeira等人Immunity: 56, 856-871 (2020), Gupta, S.及Kaplan, M.J. Nat Rev Nephrol 12(7):402-413 (2016))。NET係細胞外網狀結構，由染色質骨架及各種肽與蛋白質組成，由嗜中性球在稱為NETosis的過程中回應各種刺激而形成。已發現NETosis涉及組蛋白(諸如組蛋白H3)之瓜胺酸化，其需要PAD4活性。例如，在血管炎中，NETosis係疾病之關鍵驅動因素。(參見例如B. Arneth等人，Int. J. Med. Sci. 18: 1532-40 (2021)；JM Berthelot等人，Joint Bone Spine 84(3): 255-262 (2017)；ZL Wang等人，Beijing Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban 46(2): 200-6 (2014))。已發現本文所提供之PAD4抗體抑制NETosis及H3之瓜胺酸化(參見實例)並且可用於治療或預防NETosis相關疾病的發作或復發。在一些實施例中，疾病為癌症(例如，本文所揭示之癌症)；或自體免疫疾病，諸如狼瘡(例如，全身性紅斑性狼瘡症)、血管炎(例如，ANCA相關血管炎)、抗磷脂抗體症候群、1型糖尿病、發炎性腸病(IBD) (例如潰瘍性結腸炎及克羅恩氏病)及囊腫性纖維化；或腎病，諸如腎炎性疾病(例如，增生性絲球體腎炎及非增生性絲球體腎炎)。因此，本文中之方法包括在個體中或在活體外抑制NETosis或METosis的方法，其包含投與有效量的本文中之抗體。
此外，例如，在血栓中不存在PAD4或抑制PAD4已被證明可以消除肝素誘導之血栓形成。此外，活體內注射重組人PAD4可誘導腸系膜微靜脈中馮威里氏因子(von Willebrand factor)血小板串的形成，其依賴PAD4酶促活性。注射了重組人類PAD4之野生型小鼠血漿中的內源性ADAMTS13活性亦降低。投與重組人類PAD4亦可以縮短血管閉塞時間並顯著減少血栓栓塞。(參見例如J. Perdomo等人，Nature Commun. 10(1): 1322 (2019)；N. Sorvillo等人，Circulation Res. 125(5): 507-519 (2019))。
此外，已知PAD4活性異常與除RA以外的自體免疫疾病相關，諸如多發性硬化症(MS)、自體免疫性腦脊髓炎、阻塞性腎病變、阿茲海默症(Alzheimer's disease；AD)及發炎性腸病(IBD) (例如，潰瘍性結腸炎及克羅恩氏病)，以及僵直性脊椎炎、骨關節炎、青光眼、瘙癢病(Scrapie)及HIV/AIDS。例如，已在所有彼等病狀中均發現PAD酶及/或瓜胺酸化蛋白質的含量升高。(參見例如Chumanevich等人，Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 300(6): G929-G938 (2011)；Jones等人，Curr. Op. Drug Discov. Dev., 12(5): 616-627 (2009))。舉例而言，在MS中，在患者模型或動物模型兩者中均發現髓磷脂鹼性蛋白異常去亞胺化，並且觀測到PAD4含量升高；而在馬堡MS (一種特別嚴重的MS形式)中，發現瓜胺酸化之髓磷脂鹼性蛋白的含量非常高。(參見例如Jones等人，Curr. Op. Drug Discov. Dev., 12(5): 616-627 (2009))。此外，PAD受質之去胺作用被認為係回應於TNF-α信號傳導而發生的，而抗TNF-α抗體已被用於治療各種自體免疫疾病，諸如RA及IBD，表明PAD活性升高可係由於不受控制之TNF-α信號傳導引起。(參見
Chumanevich等人，見上文)。例如，Chumenevich及其同事發現結腸炎模型中PAD4含量升高，並表明小分子PAD抑制劑可用於治療葡聚醣硫酸鈉(DSS)誘導之鼠類結腸炎模型中之結腸炎。(
Id)。因此，在一些實施例中，自體免疫病症包含IBD。在一些實施例中，自體免疫病症包含結腸炎，諸如潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病、麩質敏感性腸病或惠普爾氏病(Whipple's disease)。
在一些實施例中，自體免疫病症包含狼瘡，諸如全身性紅斑狼瘡症、皮膚紅斑狼瘡或狼瘡性腎炎。在一些實施例中，自體免疫性病症包含血管炎。血管炎之例示性類型包括白塞氏症(Bechet's Disease)、柏格氏症(Buerger's Disease ((閉塞性血栓性脈管炎)、嗜酸球性肉芽腫性多血管炎(EGPA；以前稱為查-施二氏病(Churg Strauss))、冷凝球蛋白血症、巨細胞動脈炎(顳動脈炎)、亨-舍二氏紫斑症(Henoch-Schönlein purpura；HSP；IgA血管炎)、顯微鏡下多血管炎、結節性多動脈炎、風濕性多肌痛、類風濕性血管炎、高安氏動脈炎(Takayasu's arteritis)、肉芽腫性多血管炎(GPA；以前稱為韋格納氏病(Wegener's))、ANCA相關血管炎(諸如PR3-ANCA相關血管炎或MPO-ANCA相關血管炎)、過敏性血管炎、孤立性主動脈炎、中樞神經系統血管炎、中樞神經系統原發性血管炎(PACNS)、川崎病、蕁麻疹性血管炎、藥物誘導之血管炎、復發性多軟骨炎(RP)。在一些實施例中，自體免疫病症包含血栓。在一些情況下，該自體免疫疾病包含關節炎，諸如(例如)急性關節炎、慢性關節炎、痛風或痛風性關節炎、急性免疫性關節炎、慢性發炎性關節炎、退化性關節炎、II型膠原蛋白誘發之關節炎、傳染性關節炎、膿毒性關節炎、萊姆關節炎、增生性關節炎、牛皮癬性關節炎、斯蒂爾氏病(Still's disease)、脊椎關節炎、骨關節炎、慢性漸進性關節炎(arthritis chronica progrediente)、變形性關節炎、原發性慢性多發性關節炎、反應性關節炎、更年期關節炎、雌激素耗竭性關節炎、僵直性脊椎炎或類風濕性脊椎炎。在一些情況下，自體免疫病症包含多發性硬化症(MS)，該多發性硬化症可包括：原發性進行性多發性硬化症(PPMS)、復發緩解型多發性硬化症(RRMS)、繼發性進行性多發性硬化症(SPMS)及進行性復發性多發性硬化症(PRMS)。在一些情況下，自體免疫疾病包括全身性硬化症(硬皮症)、特發性發炎性肌病(諸如(例如)皮肌炎、多發性肌炎、壞死性自體免疫性肌病或單發性包涵體肌炎)、休格連氏症候群、類肉瘤病、自體免疫溶血性貧血、免疫性全血球減少症、陣發性夜間血紅素尿症(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria)、自體免疫性血小板減少症(autoimmune thrombocytopenia)(諸如(例如)特發性血小板減少性紫斑症、免疫介導性,血小板減少症、急性血小板減少性紫斑症、慢性血小板減少性紫斑症)、甲狀腺炎(諸如(例如)格雷夫氏病(Grave's disease)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、幼年型淋巴球性甲狀腺炎、萎縮性甲狀腺炎)、糖尿病、免疫介導性腎病(絲球體腎炎、腎小管間質性腎炎)、中樞及/或周邊神經系統脫髓鞘疾病(諸如(例如)多發性硬化症、特發性脫髓鞘性多發性神經病變(idiopathic demyelinating polyneuropathy)或格-巴二氏症候群(Guillain-Barre syndrome)，或慢性發炎去髓鞘型多發性神經病變(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy))、肝膽疾病(諸如(例如)傳染性肝炎(例如A型、B型、C型、D型、E型或其他非親肝病毒型肝炎)、自體免疫性慢性活動性肝炎、原發性膽汁性肝硬化、肉芽腫性肝炎或硬化性膽管炎)、發炎性腸病(IBD)(諸如(例如)潰瘍性結腸炎、克羅恩氏症、麩質敏感性腸病或惠普爾氏病)、自體免疫或免疫介導性皮膚病(諸如(例如)大皰性皮膚病、多形性紅斑、接觸性皮膚炎或牛皮癬)、過敏性疾病(諸如(例如)哮喘、過敏性鼻炎、異位性皮膚炎、食物過敏或蕁麻疹)、肺部免疫疾病(諸如(例如)嗜酸球性肺炎、特發性肺纖維化或過敏性肺炎)、移植相關疾病(諸如(例如)移植物排斥或移植物抗宿主疾病)、纖維化(諸如(例如)腎纖維化或肝纖維化)、心血管疾病(包括動脈粥狀硬化及冠狀動脈疾病、與慢性腎病相關之心血管事件、心肌梗塞及充血性心臟衰竭)、糖尿病(包括II型糖尿病)、阻塞性細支氣管炎伴隨機化性肺炎(BOOP)，或吞噬血球症候群(hemophagocytic syndrome)、巨噬細胞活化症候群、類肉瘤病或牙周炎。在一些情況下，自體免疫病症包含抗甲胺喋呤自體免疫病症，諸如抗甲胺喋呤RA、狼瘡、血管炎、血栓、MS或其類似者。在一些情況下，自體免疫病症包含腎病，諸如腎炎性疾病，諸如腎纖維化、慢性腎病、增生性絲球體腎炎或非增生性絲球體腎炎。
在一些情況下，個體患有與以下中之一或多者相關之病症：NETosis、METosis、抗瓜胺酸化蛋白質抗體(ACPA)之存在、PAD4表現增加，或PAD4活性增加(諸如多肽之瓜胺酸化增加)。在一些情況下，該病症包含酸誘導之肺損傷、痤瘡(PAPA)、急性淋巴球性白血病、急性呼吸窘迫症候群、阿迪森氏病(阿狄森氏病)、腎上腺增生(adrenal hyperplasia)、腎上腺皮質功能不全(adrenocortical insufficiency)、老化、AIDS、酒精性肝炎、酒精性肝病、過敏原誘導之哮喘、過敏性支氣管肺病、麴菌病(aspergillosis)、過敏性結膜炎、禿髮、阿茲海默症、澱粉樣變性、肌萎縮側索硬化症、體重減輕、心絞痛、血管性水腫、無汗性外胚層發育不全-ID、僵直性脊椎炎、眼前段發炎、抗磷脂症候群、口瘡性口炎、闌尾炎、關節炎、哮喘、動脈粥狀硬化、異位性皮膚炎、自體免疫疾病、自體免疫肝炎、蜂蜇誘發之發炎、貝塞氏症、貝塞氏症候群、伯耳氏癱(Bells Palsy)、鈹中毒、布勞症候群(Blau syndrome)、骨痛、支氣管炎、細支氣管炎、燒傷、滑囊炎、心臟肥大、 腕隧道症候群、分解代謝障礙、白內障、腦動脈瘤、化學刺激誘發的發炎、脈絡膜視網膜炎、慢性心臟衰竭、早產兒慢性肺病、慢性淋巴球性白血病、慢性阻塞性肺病、結腸炎、複雜區域疼痛症候群、結締組織疾病、COPD、角膜潰瘍、克羅恩氏病、隱熱蛋白相關週期性症候群、週期性症候群、囊腫性纖維化、介白素-1-受體拮抗劑缺乏症(DIRA)、皮膚炎、皮膚炎內毒素血症、皮肌炎、瀰漫型內因性腦橋神經膠質瘤、乾眼症、子宮內膜異位症、內毒素血症、上髁炎、紅血球母細胞減少症(erythroblastopenia)、家族性澱粉樣變性多發性神經病變、家族性寒冷性蕁麻疹、家族性地中海熱、胎兒生長遲緩、青光眼、腎絲球疾病、腎絲球腎炎、痛風、痛風性關節炎、移植物抗宿主疾病、痛風疾病、頭部損傷、頭痛、聽力損失、心臟病、溶血性貧血、亨-舍二氏紫斑症、肝炎、遺傳性週期性發熱症候群、帶狀疱疹及單純疱疹、HIV-1、霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、亨廷頓氏病(Huntington's disease)、透明膜病(hyaline membrane disease)、高氨血症(hyperammonemia)、高鈣血症(hypercalcemia)、高膽固醇血症(hypercholesterolemia)，高免疫球蛋白血症D伴反覆發熱(hyperimmunoglobulinemia D with recurrent fever；HIDS)、發育不全及其他貧血、發育不全性貧血，特發性血小板減少性紫斑症，色素失調症(incontinentia pigmenti)、傳染性單核白血球增多症、發炎性腸病、發炎性肺病、發炎性神經病變、發炎性疼痛、昆蟲叮咬誘發的發炎、虹膜炎、刺激誘發的發炎、缺血/再灌注、幼年型類風濕性關節炎、角膜炎、腎臟疾病、寄生蟲感染引起的腎臟損傷、寄生蟲感染引起的腎臟損傷、腎臟移植排斥預防、 鉤端螺旋體病(leptospirosis)、路易氏體失智症(Lewy body dementia)、呂佛勒氏症候群(Loeffler's syndrome)、肺損傷、狼瘡、狼瘡性腎炎、腦膜炎、間皮瘤、混合結締組織疾病、穆-韋二氏症候群(Muckle -Wells syndrome)(蕁麻疹性耳聾性澱粉樣變性)、多發性硬化症、多系統萎縮(multiple system atrophy)、肌肉消瘦(muscle wasting)、肌肉萎縮(muscular dystrophy)、重症肌無力、心肌炎、蕈樣黴菌病(mycosis fungoides)、骨髓發育不全症候群(myelodysplastic syndrome)、肌炎、鼻竇炎、壞死性小腸結腸炎、新生兒發作型多系統發炎疾病(NOMID)、腎病症候群、神經炎、神經病理性疾病、非過敏原誘發之哮喘、肥胖、眼部過敏、視神經炎、器官移植、骨關節炎、中耳炎、佩吉特氏病(Paget's disease)、疼痛、胰臟炎、帕金森氏病(Parkinson's disease)、天疱瘡、心包炎、週期性發熱、牙周炎、腹膜子宮內膜異位症、百日咳、咽炎及腺炎(PFAPA症候群)、植物刺激誘發之發炎、肺炎、侷限性肺炎(pneumonitis)、肺囊蟲感染、毒葛或漆酚油誘發之發炎、結節性多動脈炎、多軟骨炎、多囊性腎病、多發性肌炎、牛皮癬，社會心理應激病、肺病、肺高血壓、肺纖維化、壞疽性膿皮症、化膿性無菌關節炎、 腎病、視網膜疾病、風濕病心臟炎(rheumatic carditis)、風濕性疾病、類風濕性關節炎、類肉瘤病、皮脂溢(seborrhea)、敗血症、劇痛、鐮狀細胞病、鐮狀細胞貧血、二氧化矽誘發之疾病、休格連氏症候群、皮膚病、睡眠呼吸暫停、脊髓損傷、脊椎炎、脊椎關節病、史-瓊二氏症候群(Stevens-Johnson syndrome)、中風、蛛膜下出血、曬傷、顳動脈炎(temporal arteritis)、腱鞘炎(tenosynovitis)、血小板減少症(thrombocytopenia)、甲狀腺炎、組織移植、TNF受體相關週期性症候群(TRAPS)、弓蟲病(toxoplasmosis)、移植、創傷性腦損傷、肺結核(tuberculosis)、1型糖尿病、2型糖尿病、潰瘍性結腸炎、蕁麻疹性葡萄膜炎(包括非肉芽腫性葡萄膜炎及肉芽腫性葡萄膜炎)、創傷癒合、韋格納氏肉芽腫病(Wegener's granulomatosis)、間質性肺病、牛皮癬性關節炎、幼年型特發性關節炎、抗嗜中性球細胞質抗體(ANCA)相關血管炎、抗磷脂抗體症候群、深層靜脈栓塞、纖維化、阿茲海默症、硬皮病或CREST症候群。
在一些實施例中，該病症為癌症。例如，已在癌症中鑑別出嗜中性球發炎、嗜中性球細胞外陷阱(NET)及/或單核球細胞外陷阱(MET)，並且與較差的預後相關。(參見例如Li等人，Molecular Cancer Therapeutics, 19: 1530-38 (2020))。在一些實施例中，本文所描述之抗體可以減少形成細胞外陷阱形成嗜中性球，及/或抑制NETosis，減少細胞外陷阱形成單核球，及/或抑制METosis，及/或減弱癌症生長。舉例而言，研究表明，PAD4催化之NET形成在多種腫瘤中上調，並且PAD4在多種癌症中過度表現。(H. Chen等人，Cell Mol. Biol. Lett 26:9 (2021))。亦顯示小分子PAD4抑制劑在癌症模型中抑制腫瘤生長且抑制組蛋白H3瓜胺酸化。(
參見 Id)。因此，在一些實施例中，本文中之抗體抑制癌症個體中之NETosis及/或METosis。另外，已報導PAD4在癌症患者之某些腫瘤組織中及血液樣本中高度表現。(參見例如Wang等人，Biomedicine & Pharmacotherapy 153: 113289 (2022))。亦已報導PAD4可促進癌細胞之放射抗性、存活、遷移及侵襲。(Chen等人Cell Mol Biol Lett (2021) 26:9)。在一些實施例中，抗體可抑制患者中至少一種腫瘤之生長及/或減小患者中至少一種腫瘤之體積。在一些實施例中，抗體提高腫瘤之放射敏感性或降低腫瘤之放射抗性。
在一些實施例中，該癌症係一種通常對免疫療法有反應的癌症。在一些實施例中，該癌症係一種通常對免疫療法沒有反應的癌症。在一些實施例中，該癌症包含實體腫瘤。在一些實施例中，癌症包含血液惡性腫瘤(液體腫瘤)。
在一些實施例中，癌症為癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤或白血病。在一些實施例中，癌症為鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、垂體癌、食道癌、星形細胞瘤、軟組織肉瘤、非小細胞肺癌(包括鱗狀細胞非小細胞肺癌)、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、胰臟癌、神經膠母細胞鱗狀細胞癌、 小細胞肺癌(small-cell lung cancer；SCLC)、非小細胞肺癌、鱗狀非小細胞肺癌(squamous non-small cell lung cancer；NSCLC)、非鱗狀NSCLC、神經膠質瘤、胃腸癌、腎癌(例如透明細胞腎癌)、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、結腸直腸癌、子宮內膜癌、腎癌(kidney cancer)(例如腎細胞癌(renal cell carcinoma；RCC))、前列腺癌(例如激素難治性前列腺癌(hormone refractory prostate adenocarcinoma))、甲狀腺癌、神經母細胞瘤、胰臟癌、神經膠母細胞瘤(多形性神經膠母細胞瘤)、子宮頸癌、胃癌(stomach cancer)、膀胱癌、肝腫瘤(hepatoma)、乳癌(包括三陰性乳癌、ER陽性乳癌、ER陰性乳癌、淋巴結陽性乳癌及淋巴結陰性乳癌)、結腸癌及頭頸癌(或癌瘤)；胃癌(gastric cancer)、生殖細胞腫瘤、兒科肉瘤(pediatric sarcoma)、鼻腔鼻竇自然殺手(sinonasal natural killer)/T細胞淋巴瘤、黑色素瘤(例如轉移性惡性黑色素瘤，諸如皮膚或眼內惡性黑素色瘤)、骨癌、皮膚癌、子宮癌、肛門區癌(cancer of the anal region)、睪丸癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌瘤、陰道癌瘤、外陰癌瘤、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、兒童實體腫瘤、尿管癌、腎盂癌瘤、中樞神經系統(CNS)贅瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成(tumor angiogenesis)、脊椎腫瘤(spinal axis tumor)、腦癌、腦幹神經膠質瘤、垂體腺瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、表皮樣癌(epidermoid cancer)、鱗狀細胞癌、T細胞淋巴瘤、環境誘發之癌症(包括由石棉誘發之癌症)、病毒相關癌症或病毒源性癌症(例如人類乳頭狀瘤病毒(HPV相關或HPV源性腫瘤))、來源於兩個主要血球譜系(亦即，骨髓細胞株(其產生顆粒球、紅血球、凝血細胞、巨噬細胞及肥大細胞)或淋巴細胞株(其產生B、T、NK及漿細胞))中任一者的血液科惡性腫瘤，諸如(任何類型)之白血病、淋巴瘤或骨髓瘤，例如急性、慢性、淋巴球性及/或骨髓性白血病，諸如急性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)及慢性骨髓性白血病(CML)、未分化AML(MO)、骨髓母細胞白血病(myeloblastic leukemia；ML)、骨髓母細胞白血病(M2；細胞成熟)、前髓細胞性白血病(promyelocytic leukemia)(M3或M3變型[M3V])、骨髓單核球性白血病(myelomonocytic leukemia)(含嗜酸性球增多症(eosinophilia)之M4或M4變型[M4E])、單核球性白血病(M5)、紅血球性白血病(erythroleukemia)(M6)、巨核母細胞白血病(megakaryoblastic leukemia)(M7)、孤立顆粒球性肉瘤及綠色瘤(chloroma)；淋巴瘤，諸如霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma；HL)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma；NHL)、B細胞血液科惡性腫瘤(例如B細胞淋巴瘤)、T細胞淋巴瘤、淋巴漿細胞樣淋巴瘤(lymphoplasmacytoid lymphoma)、單核球樣B細胞淋巴瘤、黏膜相關淋巴組織(MALT)淋巴瘤、多形性(例如Ki 1+)大細胞淋巴瘤、成人T細胞淋巴瘤/白血病、套細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤(angio-immunoblastic T-cell lymphoma)、血管中心性淋巴瘤(angiocentric lymphoma)、腸道T細胞淋巴瘤、原發性縱隔B細胞淋巴瘤(primary mediastinal B-cell lymphoma)、前驅T淋巴母細胞淋巴瘤(precursor T-lymphoblastic lymphoma)、T淋巴母細胞淋巴瘤；及淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)、周邊T細胞淋巴瘤、淋巴母細胞淋巴瘤、移植後淋巴增生病、真性組織細胞淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、淋巴母細胞淋巴瘤(LBL)、淋巴譜系造血性腫瘤、急性淋巴母細胞白血病、瀰漫性大型B細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、濾泡性淋巴瘤、瀰漫性組織細胞淋巴瘤(DHL)、免疫母細胞大細胞淋巴瘤、前驅B淋巴母細胞淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤(CTLC)(亦被稱作蕈樣黴菌病(mycosis fungoides)或塞紮萊症候群(Sezary syndrome))及淋巴漿細胞樣淋巴瘤(LPL)伴瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)；骨髓瘤，諸如IgG骨髓瘤、輕鏈骨髓瘤(light chain myeloma)、非分泌性骨髓瘤(nonsecretory myeloma)、和緩性骨髓瘤(smoldering myeloma)(亦被稱作惰性骨髓瘤)、孤立性漿細胞瘤(solitary plasmocytoma)及多發性骨髓瘤、慢性淋巴球性白血病(CLL)、毛細胞淋巴瘤(hairy cell lymphoma)；骨髓譜系造血性腫瘤、間葉細胞源性腫瘤，包括纖維肉瘤及橫紋肌肉瘤；精原細胞瘤、畸胎上皮癌(teratocarcinoma)、中心及周邊神經腫瘤(諸如星形細胞瘤、神經鞘瘤)；間葉細胞源性腫瘤，諸如纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤及骨肉瘤；及其他腫瘤，包括黑色素瘤、著色性乾皮病(xeroderma pigmentosum)、角化棘皮瘤(keratoacanthoma)、精原細胞瘤、甲狀腺濾泡癌、畸胎上皮癌；淋巴譜系造血性腫瘤，例如T細胞及B細胞腫瘤，諸如T細胞病症，諸如T前淋巴球性白血病(T-PLL)，諸如屬於小細胞及腦細胞類；T細胞類大顆粒淋巴球性白血病(large granular lymphocyte leukemia；LGL)；a/d T-NHL肝脾淋巴瘤；胸腺周邊/胸腺後T細胞淋巴瘤(多形性及免疫母細胞亞型)；血管中心性(鼻部)T細胞淋巴瘤；頭頸癌、腎癌、直腸癌、甲狀腺癌；急性骨髓淋巴瘤；以及該等癌症之任何組合。本文所描述之方法亦可用於治療轉移性癌症、不可切除癌症、難治性癌症(例如難以用先前免疫療法(例如抗CTLA-4或抗PD-1抗體)治療之癌症)及/或復發性癌症。
在某些實施例中，向患有展現出對先前的治療(諸如標準照護治療)之反應不充分或有進展的癌症之患者投與本文所描述之抗體，該先前治療係例如使用免疫腫瘤學或免疫療法藥物之先前治療。在一些實施例中，癌症對先前的治療具有難治性或抗藥性，或本質上具有難治性或抗藥性(例如，難以用諸如PD-1通路拮抗劑之免疫檢查點抑制劑治療)，或獲得抗藥性或難治狀態舉例而言，可將本文所描述之抗體單獨地或與另一種療法(例如抗PD-1路徑拮抗劑療法)組合投與給對第一療法(諸如標準護理療法)無反應或不充分反應的個體，或例如用化學療法或用諸如PD-1路徑拮抗劑之免疫檢查點抑制劑治療後具有疾病進展的個體。在其他實施例中，向先前未接受(亦即，用免疫檢查點抑制劑，例如PD-1路徑拮抗劑治療)之患者投與本文所描述之抗體。在一些實施例中，抗PD1路徑拮抗劑為小分子抗PD-1、抗PD-L1或抗CTLA4拮抗劑，或為抗PD-1、抗PD-L1或抗CTLA4抗體，諸如納武利尤單抗(nivolumab)、帕博利珠單抗(pembrolizumab)、西米普利單抗(cemiplimab)、阿替利珠單抗(atezolizumab)、多塔利單抗(dostarlimab)、度伐魯單抗(durvalumab)、阿維魯單抗(avelumab)或伊匹單抗(ipilimumab)。
在一些實施例中，本文中之抗體用於治療傳染病。舉例而言，在各種感染中亦已發現NETosis之發生。(參見例如Li等人，Molecular Cancer Therapeutics, 19: 1530-38 (2020))。
本文中可治療之傳染病包括例如病毒性疾病(包括AIDS (HIV感染)、肝炎(A、B、C、D及E型)及疱疹)、細菌感染、真菌感染、原蟲感染及寄生蟲感染。病原性感染之實例包括(但不限於) HIV、肝炎(A、B及C型)、流感、疱疹(例如，VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II、CMV、埃-巴二氏病毒(Epstein Barr virus))、梨形鞭毛蟲(Giardia)、瘧疾、利什曼原蟲(Leishmania)、金黃色葡萄球菌(
Staphylococcus aureus)、綠膿桿菌(
Pseudomonas aeruginosa)、腺病毒、流感病毒、黃病毒(flavivirus)、埃可病毒(echoviru)s、鼻病毒(rhinovirus)、科沙奇病毒(coxsackie virus)、冠狀病毒、呼吸道融合細胞病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、德國麻疹病毒(rubella virus)、細小病毒(parvovirus)、痘瘡病毒、HTLV病毒、登革熱病毒(dengue virus)、乳突病毒(papillomavirus)、軟疣病毒(molluscum virus)、脊髓灰白質炎病毒(poliovirus)、狂犬病病毒、JC病毒、蟲媒病毒腦炎病毒(arboviral encephalitis virus)、披衣菌(chlamydia)、立克次體細菌(rickettsial bacteria)、分枝桿菌(mycobacteria)、葡萄球菌(staphylococci)、鏈球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumonococci)、腦膜炎球菌(meningococci)及淋球菌(gonococci)、克雷伯氏菌(klebsiella)、變形桿菌(proteus)、沙雷氏菌(serratia)、假單胞菌(pseudomonas)、退伍軍人症桿菌(legionella)、白喉桿菌(diphtheria)、沙門氏菌(salmonella)、桿菌(bacilli)、霍亂、破傷風、肉毒中毒、炭疽病、鼠疫、鉤端螺旋體病、萊姆病菌、念珠菌(Candida) (白色念珠菌、克魯斯念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌等)、新型隱球菌(
Cryptococcus neoformans)、麴菌屬(Aspergillus)(熏煙色麴菌(fumigatus)、黑色麴菌(niger)等)、毛黴目屬(Genus Mucorales)(白黴菌(mucor)、洋四氯蟲(absihlorambzopus))、申克氏孢子絲菌(
Sporothrix schenkii)、皮膚炎芽孢菌(
Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(
Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(
Coccidioides immitis)及莢膜組織胞漿菌(
Histoplasma capsulatum)、痢疾阿米巴原蟲(
Entamoeba histolytica)、大腸纖毛蟲(
Balantidium coli)、福氏耐格里阿米巴原蟲(Naegleriafowleri)、棘阿米巴屬(
Acanthamoeba sp.)、蘭比亞梨形鞭毛蟲(
Giardia lambia)、隱孢子蟲屬(
Cryptosporidium sp.)、卡氏肺孢子蟲(
Pneumocystis carinii)、間日瘧原蟲(
Plasmodium vivax)、微小巴貝蟲(
Babesia microti)、布氏錐蟲(
Trypanosoma brucei)、克氏錐蟲(
Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原蟲(
Leishmania donovani)、剛地弓形蟲(
Toxoplasma gondii)及巴西日圓線蟲(
Nippostrongylus brasiliensis)。在一些情況下，傳染病係由病毒病原體引起。在其他情況下，其係由細菌病原體引起。
在一些情況下，本文中之抗PAD4抗體可用於抑制個體或生物樣本中之NETosis及/或METosis。可例如使用生物樣本評估NETosis及/或METosis之抑制，該生物樣本諸如係全血樣本、血清樣本、血漿樣本、滑液樣本、肺液樣本、組織樣本(例如關節組織樣本、肺組織樣本)、腫瘤樣本，或含有易受NETosis或METosis之嗜中性球、單核球及/或巨噬細胞的其他生物樣本。因此，本發明包括本文所揭示之抗PAD4抗體之用途，其係用於抑制個體中之NETosis及/或METosis，或用於製備抑制個體中之NETosis及/或METosis之藥劑，以及用於抑制個體中或在活體外抑制生物樣本中NETosis及/或METosis之方法中，該方法包含投與有效量的本文所描述之抗PAD4抗體。
在一些情況下，本文所揭示之抗PAD4抗體可用於抑制個體或生物樣本中之瓜胺酸華。可在活體外評估對來自個體之生物樣本中瓜胺酸化之抑制。生物樣本可為例如全血、血清、血漿、血液上清液、滑液、組織(例如關節組織、肺組織)或腫瘤樣本。因此，本發明包括本文所揭示之抗PAD4抗體之用途，其係用於抑制個體中之瓜胺酸化，或用於製備抑制個體中之瓜胺酸化的藥劑，以及用於抑制個體中之瓜胺酸化的方法，該方法包含向該個體投與有效量的本文所揭示之抗PAD4抗體。在一些情況下，與在投與抗PAD4抗體之前個體中之瓜胺酸化相比，抑制個體中之瓜胺酸化(例如一或多種蛋白質或蛋白質上的特定瓜胺酸位點的瓜胺酸化)。其可以藉由將抗體投與給個體之後獲得的個體生物樣本中的瓜胺酸化與抗體投與之前獲得的生物樣本中的瓜胺酸化進行比較，或與對照生物樣本進行比較來評估。本發明亦關於抑制生物樣本之瓜胺酸華，其包含向該樣本投與有效量之抗PAD4抗體。在一些情況下，與對照樣本(例如，尚未暴露於抗PAD4抗體之對照樣本，例如，未處理或處理前對照樣本，或已暴露於對照抗個體基因型抗體的對照樣本)相比，已暴露於抗PAD4抗體之生物樣本中的瓜胺酸化(例如，一或多種蛋白質或蛋白質上的特定瓜胺酸化位點之瓜胺酸化)受到抑制。
可例如藉由評估生物樣本中蛋白質或其肽片段之瓜胺酸化評估瓜胺酸化。在一些實施例中，蛋白質為表20中所列之蛋白質。在一些實施例中，肽為表20中所列的肽。在一些情況下，可評估超過一種蛋白質或肽片段(例如超過一種蛋白質及/或超過一種來自相同蛋白質之肽片段)。在一些情況下，表20中所列之一或多種蛋白質或肽可用於確定瓜胺酸化。可在特定瓜胺酸位點，例如表20中鑑別之瓜胺酸化位點或對應位點處評估瓜胺酸化。如此處所使用，「對應位點」係指可例如使用序列比對確定之對應瓜胺酸化位點。舉例而言，天然存在之蛋白質(例如表20中所列之蛋白質)變異體或同功異型物可與表20中提及之蛋白質序列比對以鑑別對應於所鑑別之瓜胺酸化位點的瓜胺酸化位點。在一些實施例中，使用質譜(例如使用LC/MS)評估瓜胺酸化。在一些實施例中，可使用質譜量測瓜胺酸化蛋白質或肽之濃度及對應總蛋白質或肽之濃度(包括適用蛋白質之經修飾及未經修飾之形式)來評估瓜胺酸。此等濃度可例如使用質譜來量測。在一些實施例中，此等濃度可以瓜胺酸化比率表示，其為瓜胺酸化蛋白質之濃度(或來自蛋白質之瓜胺酸化肽的濃度)與對應總蛋白質之濃度的比率。在一些實施例中，藉由對生物樣本進行酶消化且評估樣本中之瓜胺酸化肽(諸如本文中之表18或20中所列之肽)的濃度及樣本中對應總蛋白質的濃度來評估瓜胺酸化。在一些實施例中，藉由量測來自蛋白質之特徵肽之濃度來量測對應總蛋白質之濃度，該特徵肽係未經修飾且因此表示對應蛋白質(包括任何經修飾及未經修飾形式之蛋白質)之總濃度的肽。在兩個樣本(例如預處理及處理後樣本，或經處理樣本及對照樣本)中評估之瓜胺酸化比率的比較可用於評估抗PAD4抗體對瓜胺酸化之抑制。經受抗PAD4抗體處理之樣本中(例如，來自經受抗PAD4抗體處理之個體的樣本中)較低的瓜胺酸化率表明抗PAD4抗體對瓜胺酸化的抑制在一些情況下，可評估兩種或更多種蛋白質或其肽片段(諸如本文中之表18或20中所提供之蛋白質或肽片段中的兩者或更多者)的瓜胺酸化。
表20：可由PAD4瓜胺酸且由本文所揭示之抗PAD4抗體抑制之蛋白質、肽及特異性瓜胺酸位化點
| 蛋白質( 縮寫) | 縮寫 | UniProt ID | 瓜胺酸化位點加粗體且 帶下劃線 的蛋白質之肽片段 (SEQ ID NO) | 胺基酸( 其中肽在蛋白質序列中) | 瓜胺酸化位點 |
| 蛋白多醣4 | PRG4 | Q92954 | AITT R SGQTLSK (SEQ ID NO: 236) | 1387-1398 | Q92954之R1391 |
| 血纖維蛋白原α鏈 | FGA | P02671 | ESSSHHPGIAEFPS R GK (SEQ ID NO: 241) | 559-575 | P02671之R573 |
| 血纖維蛋白原α鏈 | FGA | P02671 | QFTSSTSYN R GDSTFESK (SEQ IN NO: 237) | 582-600 | P02671之R591 |
| 補體C3 | C3 | P01024 | SGQSED R QPVPGQQMTLK (SEQ ID NO: 242) | 567-584 | P01024之R573 |
| 補體C3 | C3 | P01024 | ASHLGLA R SNLDEDIIAEENIVSR (SEQ ID NO: 243) | 741-764 | P01024之R748 |
| 間-α-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4 | ITIH4 | Q14624 | QLGLPGPPDVPDHAAYHPF R R (SEQ ID NO: 238) | 669-689 | Q14624之R688 |
| 蛋白質AMBP | AMBP | P02760 | GPC R AFIQLWAFDAVK (SEQ ID NO: 239) | 294-309 | P02760之R297 |
| α-2-巨球蛋白 | A2M | P01023 | VGFYESDVMG R GHAR (SEQ ID NO: 244) | 705-719 | P01023之R715 |
| 凝溶膠蛋白 | GSN | P06396 | ATAS R GASQAGAPQGR (SEQ ID NO: 240) | 28-43 | P06396之R32 |
| 結合球蛋白 | HP | P00738-1 | L R TEGDGVYTLNDK (SEQ ID NO: 245) | 58-71 | P00738-1之R59 |
| 血清轉鐵蛋白 | TF | P02787-1 | DLLF R DDTVCLAK (SEQ ID NO: 246) | 647-660 | P02787-1之R651 |
在一些實施例中，本文所揭示之抗PAD4抗體抑制以下中之一或多者的瓜胺酸化：蛋白多醣4 (PRG4)、血纖維蛋白原α鏈(FGA)、補體C3 (C3)、間α-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4 (ITIH4)、蛋白質AMBP (AMBP)、α-2巨球蛋白(A2M)、凝溶膠蛋白(GSN)、結合球蛋白(HP)或血清轉鐵蛋白(TF)。在一些實施例中，抗體抑制表20或表18中所示之瓜胺酸化位點或對應位點處的瓜胺酸化。在一些實施例中，抗體抑制表18中所示之至少一種蛋白質或肽的瓜胺酸化。在一些實施例中，抗體例如抑制SEQ ID NO: 216或SEQ ID NO: 232中發現之精胺酸殘基的瓜胺酸化。在一些實施例中，抗體例如抑制在SEQ ID NO: 216、SEQ ID NO: 232或SEQ ID NO: 236至246中之任何一或多者中發現的精胺酸殘基的瓜胺酸化。
B. 投與途徑及載劑
在各種實施例中，抗PAD4抗體或抗PAD4抗體組合物可藉由多種途徑活體內投與，包括(但不限於)經口、動脈內、非經腸、鼻內、肌肉內、心內、心室內、氣管內、經頰、經直腸、腹膜內、皮內、局部、經皮及鞘內，或另外藉由植入或吸入投與。本發明組合物可調配成製劑，諸如液體調配物或適於注射、吸入等之調配物。或者，在一些實施例中，組合物可以凍乾粉末形式提供，該凍乾粉末可在添加適當液體或載劑(例如無菌水)時復原。適當調配物及投與途徑可根據預期應用來選擇。
在一些實施例中，投與為靜脈內或皮下投與。在一些實施例中，投與為靜脈內投與。在一些實施例中，投與為皮下投與。
在各種實施例中，包含抗PAD4抗體之組合物係以具有多種醫藥學上可接受之載劑的調配物形式提供(參見例如Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus, 第20版(2003)；Ansel等人，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 第7版，Lippencott Williams and Wilkins (2004)；Kibbe等人，Handbook of Pharmaceutical Excipients, 第3版，Pharmaceutical Press (2000))。可使用各種醫藥學上可接受之載劑，包括媒劑、佐劑及稀釋劑。此外，亦可使用各種醫藥學上可接受之輔助物質，諸如pH調節及緩衝劑、張力調節劑、穩定劑、濕潤劑及其類似者。非限制性的例示性載劑包括生理鹽水、緩衝生理鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其組合。在各種實施例中，包含抗PAD4抗體之組合物可藉由用適當載劑溶解、懸浮或乳化來調配以供注射，包括皮下投與。
在一些實施例中，載劑為無菌水溶液，例如生理鹽水(例如0.9% w/v氯化鈉)或右旋糖水溶液(例如5% w/v右旋糖，亦稱為D5W)。在一個實施例中，本文提供一種製造醫藥組合物(例如供注射，例如供靜脈內或皮下注射)之方法，該方法包含將本文所揭示之抗PAD4抗體之組合物與載劑組合以製造醫藥組合物。在一些實施例中，醫藥組合物包含至少0.25 mg/ml抗體。在一些實施例中，醫藥組合物包含0.25 mg/ml至100 mg/ml抗體，諸如0.25 mg/ml至50 mg/ml、1 mg/ml至50 mg/ml、或10 mg/ml至50 mg/ml。
醫藥組合物可以對治療特定適應症有效之量投與。亦提供包含一或多個容器之醫藥包裝及套組，其各自含有一或多次劑量之抗PAD4抗體。在一些實施例中，提供一種單位劑量，其中該單位劑量含有預定量的包含抗PAD4抗體之組合物，其具有或不具有一或多種另外的藥劑。
可視需要向個體投與抗PAD4抗體組合物。可由熟習此項技術者，諸如主治醫師，基於所治療病狀、所治療個體之年齡、所治療病狀之嚴重程度、所治療個體之一般健康狀況及其類似因素的考慮因素來決定投與頻率。在一些實施例中，向個體投與有效劑量之抗PAD4抗體一或多次。舉例而言，在一些實施例中，抗PAD4抗體係每週一次、每兩週一次、每三週一次、每月一次、每四週一次、每六週一次、每兩個月一次、每八週一次、每三個月一次或每六個月一次投與。在一些此類情況下，抗PAD4抗體在此時間段經靜脈內或皮下投與。在一些情況下，投與為靜脈內投與。在一些情況下，向個體投與抗體持續至少六個月、或至少一年、或至少兩年、或至少三年之時間，諸如以上述給藥頻率中之一者，諸如經靜脈內或皮下投與。
在一些情況下，抗體係以0.5 mg至1000 mg之劑量經靜脈內或皮下投與，諸如每兩週一次、每三週一次、每月一次、每四週一次、每六週一次、每兩個月一次、每八週一次、每三個月一次或每六個月一次。在一些此類情況下，抗體係以1 mg至900 mg、1 mg至300 mg、1 mg至100 mg、3 mg至300 mg、5 mg至300 mg之劑量投與。
C. 組合療法
抗PAD4抗體可單獨或與其他治療模式一起投與。此類其他治療模式可在投與抗PAD4抗體之前、實質上同時或之後提供。在一些實施例中，另一治療模式包含針對患者所患疾病的標準護理治療。本文所描述之抗體可與至少一種其他治療劑在相同的組合物中投與，或可與至少一種其他治療劑分開投與。在一些情況下，諸如在抗體-藥物結合物內，本文所描述之抗體亦可化學連接至其他治療劑。
對於類風濕性關節炎之治療而言，例如，抗PAD4抗體可以與一或多種其他治療劑一起投與，例如疾病調修抗風濕藥物(DMARD)，諸如甲胺喋呤(Trexall®或Otrexup®)、阿達木單抗(Humira®)、依那西普(Enbrel®)、英利昔單抗(Remicade®)、羥基氯奎(Plaquenil®)、柳氮磺吡啶(Azulfidine®)、來氟米特(Arava®)、阿巴西普(Orencia®)、阿那白滯素(Kineret®)、賽妥珠單抗(Cimzia®)、戈利木單抗(Simponi®)、利妥昔單抗(Rituxan®)、沙利姆單抗(Kevzara®)、托珠單抗(Actemra®)、巴瑞替尼(Olumiant®)、托法替尼(Xeljanz®)、優帕替尼(Rinvoq®)及Orencia® (阿巴西普)；非類固醇消炎藥(NSAID)，諸如布洛芬(ibuprofen) (Advil、Motrin及雙氯芬酸)及萘普生鈉；COX-2抑制劑(塞內昔布(celecoxib)或依託昔布(etoricoxib))；類固醇，諸如普賴蘇濃或普賴松。在一些情況下，抗PAD4抗體可與以下中之一或多者一起投與：抗TNF劑(例如抗TNF抗體)，諸如英利昔單抗(Remicade®)、阿達木單抗(Humira®)、戈利木單抗(Simponi®)、賽妥珠單抗(Cimzia®)及依那西普(Enbrel®)；糖皮質激素，諸如普賴松或甲基普賴蘇濃；來氟米特(Arava®)；硫唑嘌呤(Imuran®或Azasan®)；JAK抑制劑，諸如CP 590690；SYK抑制劑，諸如R788；TYK2抑制劑，諸如氘可來昔替尼(deucravacitinib) (Sotyktu®)、抗IL-6抗體；抗IL-6R抗體；抗CD-20抗體；抗CD19抗體；抗GM-CSF抗體；及抗GM-CSF -R抗體。對於自身免疫病狀之治療而言，抗PAD4抗體可以與其他治療劑一起投與，例如干擾素α；干擾素β；抗I型干擾素受體抗體，諸如阿尼魯單抗(anifrolumab) (Saphnelo®)；普賴松；抗α4整合素抗體，諸如Tysabri®；抗BAFF/BLyS抗體，諸如貝利尤單抗(belimumab) (Benlysta®)；抗CD20抗體，諸如Rituxan® (利妥昔單抗)；鈣調磷酸酶抑制劑，諸如環孢素(cyclosporin)或伏環孢素(voclosporin) (Lupkynis®)；補體抑制劑，諸如依庫珠單抗(eculizumab) (Soliris®)或阿伐可泮(avacopan) (Tavneos®)；黴酚酸嗎啉乙酯(mycophenolate mofetil)(CellCept®)或黴酚酸酯鈉(MyFortic®)；環磷醯胺(Cytoxan®)；FTY720 (芬戈莫德(fingolimod)，例如Gilenya®)；及Cladribine® (祿斯得停(Leustatin))。在一些情況下，抗PAD4抗體可與甲胺喋呤一起投與。在其他情況下，抗PAD4抗體係在另一種藥物不存在的情況下投與。例如，抗PAD4抗體可以與被認為係自體免疫病症護理標準的其他治療一起投與，或者可以添加至另一種治療方案或可以遵循另一種治療方案投與，例如，在治療方案未能成功滿足標準臨床治療目標或希望改善治療方案的情況下。
關於狼瘡之治療，例如，抗PAD4抗體可以與一或多種治療劑一起投與，該等治療劑諸如環孢靈、他克莫司(tacrolimus)、環磷醯胺、硫唑嘌呤(Imuran®)、黴酚酸酯(CellCept®)、利妥昔單抗(Rituxan®)及貝利尤單抗(Benlysta®)、類固醇(例如普賴松或普賴蘇濃)、降血壓藥(例如血管收縮素轉化酶(ACE)抑制劑、血管收縮素II受體阻斷劑(ARB))。
對於血管炎之治療而言，例如，抗PAD4抗體可以與一或多種其他治療劑一起投與。治療劑之非限制性實例包括類固醇(例如普賴松、普賴蘇濃、甲基普賴蘇濃或地塞米松(dexamethasone))、甲胺喋呤(Trexall®)、硫唑嘌呤(IImuran®，Azasan®)、黴酚酸酯(CellCept®)、環磷醯胺、托珠單抗(Actemra®)、利妥昔單抗(Rituxan®)、阿伐可泮、血漿置換術、黴酚酸嗎啉乙酯(MMF)、硫唑嘌呤(AZA)、來氟米特(LEF)、貝利尤單抗、美泊利單抗(meprolizumab)及奧馬珠單抗(omalizumab)。對於癌症之治療而言，抗PAD4抗體可以與一或多種其他抗癌劑一起投與，該等抗癌劑諸如免疫檢查點抑制劑、化學治療劑、生長抑制劑、放射毒性劑、免疫抑制劑、抗癌疫苗(諸如基因療法疫苗)、抗血管生成劑及/或抗贅生性組合物。本文所描述之抗體可以與其他抗癌劑在相同的組合物中投與，或可與抗癌劑分開投與。在後一種情況(分開投與)下，抗體可在抗癌劑之前、之後或與其同時投與，或可與其他已知治療劑共同投與。在一些實施例中，該等組合可有效地與標準癌症治療組合，諸如包括放射線、手術及激素剝奪。
免疫檢查點抑制劑之實例包括抑制調節免疫系統之特定信號傳導路徑的分子。參見例如Weber (2010) Semin. Oncol. 37:430；Pardoll (2012) Nat. Rev. Cancer 12:252。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑包含以下各者之拮抗劑：PD-1、PD-L1、CTLA4、LAG-3、半乳糖凝集素1、半乳糖凝集素9、CEACAM-1、BTLA、CD25、CD69、TIGIT、CD113、GPR56、VISTA、B7-H3、B7-H4、2B4、CD48、GARP、PD1H、LAIR1、TIM1、TIM3、TIM4、ILT4、IL-6、IL-10、TGFβ、VEGF、KIR、LAG-3、腺苷A2A受體、PI3Kδ或IDO。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑包含B7-1、B7-2、CD28、4-1BB (CD137)、4-1BBL、ICOS、ICOS-L、OX40、OX40L、GITR、GITRL、CD27、CD40、CD40L、DR3、CD28H、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、IFNα、STING之促效劑，或鐸樣受體促效劑，諸如TLR2/4促效劑。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑包含結合至膜結合蛋白質B7家族成員(諸如B7-1、B7-2、B7-H2 (ICOS-L)、B7-H3、B7-H4、B7-H5 (VISTA)及B7-H6)的藥劑。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑結合至TNF受體家族成員，或結合至與TNF受體家族成員結合的共刺激或共抑制分子，該TNF受體家族成員諸如係CD40、CD40L、OX40、OX40L、GITR、GITRL、CD70、CD27L、CD30、CD30L、4-1BBL、CD137 (4-1BB)、TRAIL/Apo2-L、TRAILR1/DR4、TRAILR2/DR5、TRAILR3、TRAILR4、OPG、RANK、RANKL、TWEAKR/Fn14、TWEAK、BAFFR、EDAR、XEDAR、EDA1、EDA2、TACI、APRIL、BCMA、LTβR、LIGHT、DeR3、HVEM、VEGL/TL1A、TRAMP/DR3、TNFR1、TNFβ、TNFR2、TNFα、1β2、FAS、FASL、RELT、DR6、TROY或NGFβ。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑對抑制T細胞活化之細胞介素(諸如IL-6、IL-10、TGFβ、VEGF)進行拮抗或抑制。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑包含刺激T細胞活化之細胞介素(諸如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21及IFNα)之促效劑。在一些實施例中，至少一種免疫刺激劑包含趨化介素(諸如CXCR2、CXCR4、CCR2或CCR4)之拮抗劑。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑包含抗體。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑包含疫苗，諸如間皮素靶向疫苗或減毒性李斯特菌(listeria)癌症疫苗，諸如CRS-207。
免疫檢查點抑制劑目標之例示性非限制實例為CTLA-4、PD-1及PD-L1。此類免疫檢查點抑制劑之非限制性實例包括抗CTLA4、抗PD-1及抗PD-L1抗體，諸如(例如)帕博利珠單抗(Keytruda®)、伊匹單抗(Yervoy®)、納武利尤單抗(Opdivo®)、阿替利珠單抗(Tecentriq®)、阿維魯單抗(Bavencio®)、多塔利單抗(Jemperli®)、西米普利單抗(Libtayo®)及度伐魯單抗(Imfinzi®)。
在一些實施例中，本文中之抗體與至少一種化學治療劑組合投與。可在本文中之方法中投與之化學治療劑之非限制性實例包括(但不限於)烷基化劑，諸如噻替派(thiotepa)及Cytoxan®/Neosar®環磷醯胺；來那度胺(lenalidomide)(Revlimid®)；硼替佐米(bortezomib)(Velcade®)；苯達莫司汀(bendamustine)(Treanda®)；利妥昔單抗(Rituxan®)；阿倫單抗(alemtuzumab)(Campath®)；奧法木單抗(ofatumumab) (Kesimpta®)；依維莫司(everolimus) (Afinitor®，Zortress®)；卡非佐米(carfilzomib) (Kyprolis™)；異環磷醯胺(ifosamade)；地塞米松；磺酸烷基酯，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，諸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)及烏瑞替派(uredopa)；乙烯亞胺及甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺、三乙烯磷醯胺、三乙烯硫代磷醯胺及三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙醯(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；喜樹鹼(包括合成類似物拓朴替康(topotecan))；苔蘚蟲素(bryostatin)；海洋抑素(callystatin)；CC-1065 (包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin)合成類似物)；念珠藻素(cryptophycin) (尤其是念珠藻素1及念珠藻素8)；海兔毒素(dolastatin)；倍癌黴素(duocarmycin)(包括合成類似物KW-2189及CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉鹼(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海綿抑素(spongistatin)；氮芥，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil) (Leukeran®)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺(cholophosphamidee)、雌氮芥(estramustine)、異環磷醯胺、甲氮芥(mechlorethamine)、甲氮芥氧化物鹽酸鹽、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶芥(uracil mustard)；亞硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，諸如烯二炔抗生素(例如卡奇黴素(calicheamicin)，尤其是卡奇黴素γ1I及卡奇黴素ωIl (參見例如,
Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994))；達內黴素(dynemicin)，包括達內黴素A；雙膦酸鹽，諸如氯屈膦酸鹽(clodronate)；埃斯培拉黴素(esperamicin)；以及新抑癌蛋白發色團及相關色蛋白烯二炔抗生素發色團、阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、安麴黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博來黴素(bleomycin)、放線菌素C、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(caminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycini)、放線菌素D (dactinomycin)、道諾黴素、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-側氧基-L-正白胺酸、Adriamycin® (小紅莓，包括𠰌啉基-小紅莓、氰基𠰌啉基-小紅莓、2-吡咯啉基-小紅莓及去氧小紅莓)、表柔比星、依索比星(esorubicin)、艾達黴素(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin)(諸如絲裂黴素C)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、潑非黴素(porfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、奎那黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲黴素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他汀(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺喋呤甲胺喋呤5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如迪諾特寧(denopterin)、甲胺喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine) (Fludara®)、6-巰基嘌呤、噻咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(gemcitabine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷；雄激素，諸如卡魯睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾內酯；抗腎上腺藥，諸如胺魯米特、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸(frolinic acid)；乙醯葡醛酯(aceglatone)；醛磷醯胺醣苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；貝斯布西(bestrabucil)；氯亞布曲克(chlorambucaxate)；地磷醯胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鳥胺酸(elfornithinee)；依利醋銨(elliptinium acetate)；埃博黴素；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基尿素；磨菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidainine)；類美登素(maytansinoid)，諸如美登素(maytansine)及安絲菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；噴司他汀(pentostatin)；苯來美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK®多醣複合物(JHS Natural Products, Eugene, OR)；雷佐生(razoxane)；根黴素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2''2',2''-三氯三乙胺；單端孢黴烯(trichothecene) (尤其是T-2毒素、黏液黴素A (verracurin A)、桿孢菌素A (roridin A)及蛇形菌素(anguidine))；尿烷；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(「Ara-C」)；環磷醯胺；紫杉烷，例如Taxol
®太平洋紫杉醇(paclitaxel) (Bristol- Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)、Abraxane®不含十六醇聚氧乙烯醚的白蛋白工程改造之太平洋紫杉醇奈米顆粒調配物(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)及Taxoter
e®多烯紫杉醇(Rhône- Poulenc Rorer, Antony, France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；Gemzar®吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤(mercaptopurine)、甲胺喋呤；鉑類似物，諸如順鉑、奧沙利鉑及卡鉑；長春花鹼(vinblastine)；鉑；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新鹼(Oncovin
®)；沙利度胺(thalidomide)(Thalomid
®)；Navelbine
®長春瑞濱(vinorelbine)；諾凡得龍(novantrone)；替尼泊甙(teniposide)；依達曲沙(edatrexate)；道諾黴素；胺基喋呤；截瘤達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(Camptosar, CPT-11) (包括伊立替康與5-FU及甲醯四氫葉酸的治療方案)；拓樸異構酶抑制劑RFS2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；類視黃素，諸如視黃酸；卡培他濱(capecitabine)；康普瑞汀(combretastatin)；甲醯四氫葉酸(LV)；奧沙利鉑(oxaliplatin)，包括奧沙利鉑治療方案(FOLFOX)；減少細胞增殖的PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR(例如厄洛替尼erlotinib)(Tarceva®))及VEGFA之抑制劑，以及以上任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。
可在本文中之方法中投與之其他非限制性例示性化學治療劑包括用於調節或抑制激素對癌症之作用的抗激素劑，諸如抗雌激素及選擇性雌激素受體調節劑(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括Nolvadex
®他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、曲洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen)、曲沃昔芬(trioxifene)、柯昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及Fareston
®托瑞米芬(toremifene)；抑制芳香酶之芳香酶抑制劑，其調節腎上腺中雌激素的產生，諸如(例如) 4(5)-咪唑、胺魯米特、Megase
®乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、Aromasin
®依西美坦(exemestane)、福美斯坦(formestanie)、法屈唑(fadrozole)、Rivisor
®伏羅唑(vorozole)、Femara
®來曲唑(letrozole)及Arimidex
®阿那曲唑(anastrozole)；及抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙立德(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二氧雜環戊烷核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，尤其抑是制異常細胞增殖中涉及之信號傳導路徑中之基因表現的彼等反義寡核苷酸，諸如(例如) PKC-α、Ralf及H-Ras；核糖核酸酶，諸如VEGF表現抑制劑(例如Angiozyme
®核糖核酸酶)及HER2表現抑制劑；疫苗，諸如基因療法疫苗，例如Allovectin
®疫苗、Leuvectin
®疫苗及Vaxid
®疫苗；Proleukin
®rIL-2；Lurtotecan
®拓樸異構酶1抑制劑；Abarelix
®rmRH；及以上中任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。
在一些實施例中，抗血管生成劑可與本文所揭示之抗體組合投與。抗血管生成劑之非限制性實例可包括對血管生成劑之抗體或其他拮抗劑，例如VEGF-A之抗體(例如貝伐珠單抗(Avastin
®))或VEGF-A受體(例如KDR受體或Flt-1受體)之抗體；抗PDGFR抑制劑，諸如Gleevec
®(甲磺酸伊馬替尼(Imatinib Mesylate))；阻斷VEGF受體信號傳導之小分子(例如PTK787/ZK2284、SU6668、Sutent
®/SU11248 (蘋果酸舒尼替尼(sunitinib malate))、AMG706或例如國際專利申請案WO 2004/113304中所描述的彼等藥劑)。抗血管生成劑亦包括天然血管生成抑制劑，例如血管生長抑素(angiostatin)、內皮生長抑素(endostatin)等。參見例如Klagsbrun及D'Amore (1991)
Annu. Rev. Physiol. 53:217-39；Streit及Detmar (2003)
Oncogene22:3172-3179 (例如表3，其列出惡性黑色素瘤之抗血管生成療法)；Ferrara及Alitalo (1999)
Nature Medicine5(12):1359-1364；Tonini等人(2003)
Oncogene22:6549-6556 (例如表2，其列出已知抗血管生成因子)；及Sato (2003)
Int. J. Clin. Oncol.8:200-206 (例如表1，其列出臨床試驗中所用之抗血管生成劑)。
在一些實施例中，腫瘤生長抑制劑可與本文所揭示之抗體組合投與。生長抑制劑之非限制性實例包括(但不限於)阻斷細胞週期進程(在除S期以外之位置處)之試劑，諸如誘發G1阻滯及M期阻滯之試劑。經典M期阻斷劑包括長春花(vincas) (長春新鹼(vincristine)及長春花鹼)、紫杉烷(taxane)及II型拓樸異構酶抑制劑(諸如小紅莓(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、道諾黴素(daunorubicin)、依託泊苷(etoposide)及博萊黴素(bleomycin))。阻滯G1之彼等藥劑亦深入到S期阻滯，例如DNA烷基化劑，諸如他莫西芬(tamoxifen)、普賴松(prednisone)、達卡巴嗪(dacarbazine)、甲氮芥(mechlorethamine)、順鉑(cisplatin)、甲胺喋呤、5-氟尿嘧啶及ara-C。其他資訊可見於Mendelsohn及Israel編,
The Molecular Basis of Cancer, 第1章, 名稱為「Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs」,Murakami等人(W.B. Saunders, Philadelphia, 1995), 例如第13頁。紫杉烷(太平洋紫杉醇及多烯紫杉醇)為來源於紫杉樹之抗癌藥物。來源於歐洲紫杉的多烯紫杉醇(Taxotere
®, Rhone-Poulenc Rorer)為太平洋紫杉醇(Taxol
®, Bristol-Myers Squibb)之半合成類似物。太平洋紫杉醇及多烯紫杉醇促進微管自微管蛋白二聚物組裝且藉由防止解聚合穩定微管，其致使抑制細胞中之有絲分裂。
對於發炎性或自體免疫或傳染病病狀或癌症的治療而言，在一些實施例中，可將消炎藥與本文所揭示之抗體組合投與。消炎藥可為例如類固醇或非類固醇消炎藥(NSAID)。在需要結合使用本文所描述之抗PAD4抗體進行治療時或在使用該等抗體進行治療之前使異常增殖細胞休眠的情況下，亦可向患者投與激素及類固醇(包括合成類似物)，諸如17a-炔雌醇、己烯雌酚、睪固酮、普賴松、氟甲睾酮(Fluoxymesterone)、丙酸屈他雄酮(Dromostanolone propionate)、睾內酯(Testolactone)、乙酸甲地孕酮、甲基普賴蘇濃(Methylprednisolone)、甲基-睪固酮(Methyl-testosterone)、普賴蘇濃(Prednisolone)、曲安西龍(Triamcinolone)、氯三芳乙烯(Chlorotrianisene)、羥基孕酮(Hydroxyprogesterone)、胺魯米特(Aminoglutethimide)、雌氮芥(Estramustine)、乙酸甲羥孕酮(Medroxyprogesteroneacetate)、亮丙立德、氟他胺、托瑞米芬或戈舍瑞林ZOLADEX
®。
本文所描述之抗PAD4抗體亦可與疫苗接種方案組合。已設計出針對傳染病及腫瘤之許多實驗性疫苗接種策略(參見Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C, 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738; 亦參見Restifo, N. 及Sznol, M., Cancer Vaccines, 第61章，第023-3043頁，DeVita等人(編), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology, 第五版)。因此，在一些實施例中，例如，本文中之抗體或編碼本文中之抗體之疫苗構築體可與傳染病或抗癌疫苗一起投與，或者與採用基於細胞(諸如樹突狀細胞)之療法或疫苗樣顆粒(VLP)的疫苗接種方案一起投與。
在其他情況下，本文中之抗體可與其他療法組合投與，諸如在腫瘤、手術干預或其類似者之情況下的放射線療法。
實例
實例1. 抗PAD4抗體之產生、表徵及人源化
使用重組人類PAD4蛋白質(rhPAD4)將五種PAD-/-小鼠免疫，以產生針對人類PAD4抗體。在56天內投與四次免疫劑量之rhPAD4，並在第59至60天收集小鼠脾細胞用於融合瘤融合及培養。藉由ELISA分析融合瘤融合體與rhPAD4之結合。將測試呈陽性的細胞分離、培養、選殖並儲存為融合瘤植株，以用於生產抗PAD4單株抗體。
對於各融合瘤抗體植株而言，使用桑格定序方法及標準生物資訊學方法測定抗體重鏈及輕鏈可變域VH及VL之序列及前導序列。再次藉由ELISA分析融合瘤抗體植株與PAD4之結合，且選擇藉由ELISA結合於PAD4之抗體進行進一步測試。
A. 純化及抗體表徵方法
純化方法。在進一步分析之前，自各融合瘤之60 mL經培養上清液中純化抗體。使用預填充之蛋白A管柱(GE Healthcare)進行純化。在通過蛋白質A管柱之前，將含有IgG1之各培養基調節至高鹽及高pH。裝載後，洗滌柱直至在流出液中發現不可偵測之蛋白質，並用100 mM磷酸鹽緩衝液、25 mM Tris (pH 2.5)溶離。對於IgG2抗體而言，將上清液在中性pH下裝載，並用PBS (pH. 7.2)與100 mM 檸檬酸鹽(pH 3.0)之1:1混合液溶離。濃縮洗出液之峰值溶離份，無菌過濾，量測OD280且儲存於-80℃。基於吸光度確定濃度：1 mg/mL的抗體在1 cm光程光析槽中預計在280 nm處的吸光度約為1.36。
親和力測試方法。使用BLITZ儀器(Forte Bio, Menlo Park, California)，使用生物感測器晶片(Anti-GST chip, Forte Bio, 目錄號18-5096)，藉由生物層干涉術(BLI)測定各抗體殖株對GST-PAD4融合蛋白之親和力。用檸檬酸鹽緩衝液、PBS或PBS/Ca將生物感測器處理15秒；將重組人類GST-PAD4添加於滴架上持續80秒，以用PAD4啟動生物感測器；然後將抗體添加於滴架上持續80秒，以允許抗體與PAD4之間的結合；將PBS/PBS-Ca添加於滴架上持續60秒以去除未結合抗體。使用1.2.0.49版BLITZ Pro軟體測定締合速率常數k
on、解離速率常數k
off及平衡解離常數K
D。
活性測試方法。進行另一種分析以測定抗體植株對藉由重組人類PAD4 (rhPAD4)及重組人類PAD2 (rhPAD2)產生瓜胺酸之影響。為了確定rhPAD4及rhPAD2之生物化學活性是否被抗體植株抑制，將100 nM之各重組蛋白質與濃度漸增之抗體植株一起在37℃、在100 mM Tris-HCl (pH 7.6)、1 mM CaCl
2、2 mM DTT及50 mM NaCl中培育15分鐘。添加BAEE (
Nα-苯甲醯基-L-精胺酸乙酯鹽酸鹽)受質(Sigma-Aldrich) (10 mM)，並使反應在37℃下進行30分鐘。用液氮淬滅反應物且使用COLDER分析定量瓜胺酸產生(Knipp及Vasak,
Anal. Biochem.2000, 286, 257-2641; Kearney等人
Biochemistry2005, 44, 10570-10582)。為確定PAD4活性%，在存在及不存在抗體植株的情況下測定瓜胺酸產生。
B. 抗體表徵結果
使用上述方法，發現十二種抗體植株具有顯著的抗PAD4活性，如表1中所示。
| 表1 ： 抗體親和力結果。 | |||
| 植株# | k on(1/Ms) | k off(1/s) | K D(M) |
| 3 | 1.56E+04 | ＜1.00E-06 | ＜6.40E-11 |
| 5 | 1.72E+04 | ＜1.00E-06 | ＜5.80E-11 |
| 6 | 9.53E+03 | 1.44E-02 | 1.51E-06 |
| 7 | 8.18E+03 | ＜1.00E-06 | ＜1.22E-10 |
| 9 | 4.30E+02 | ＜1.00E-06 | ＜2.33E-9 |
| 10 | 1.89E+04 | ＜1.00E-06 | ＜5.31E-11 |
| 13 | 4.11E+04 | ＜1.00E-06 | ＜2.44E-11 |
| 14 | 1.14E+04 | ＜1.00E-06 | ＜8.77E-11 |
| 17 | 1.80E+04 | ＜1.00E-06 | ＜5.56E-11 |
| 18 | 1.73E+04 | ＜1.00E-06 | ＜5.79E-11 |
| 20 | 5.83E+02 | ＜1.00E-06 | ＜1.71E-9 |
| 22 | 5.22E+03 | 2.11E-03 | 3.10E-07 |
圖1A顯示PAD4活性%，且圖1B顯示在250nM抗體濃度下使用活性分析測定的瓜胺酸產生的絕對量。在瓜胺酸產生分析中，若干抗體植株抑制PAD4之酶促活性。相比之下，植株6 PAD4顯示瓜胺酸化增加5.7倍，表明其活化PAD4活性。
發現植株13及20以劑量依賴性方式抑制PAD4 (圖1C及圖1D)。對於植株13而言，VH及VL胺基酸序列及其CDR分別顯示於圖1E及圖1F中。對於植株20而言，VH及VL胺基酸序列及其CDR顯示於圖1G及圖1H中。抗體實質上不抑制重組人類PAD2之活性，如圖2中所示。
如下文所描述對抗體植株13及20進行人源化且測試。
C. 抗體植株13及20之人源化
抗體植株13及20經電腦模擬人源化，且隨後如本文所描述製得及測試所得人源化抗體以產生抗人PAD4抗體，其在人類中的抗原性較低並且具有與親本鼠類抗體一樣好或更好的特徵(例如親和力、抑制活性及本文所描述之其他性質及活性)。選擇鼠類胺基酸殘基移植至人類免疫球蛋白生殖系序列上，目的是保留或提高鼠類抗體對人類PAD4的親和力。
本文所描述之電腦模擬人源化方案係用於所有鼠類植株(包括植株13及20)的通用方案，本文討論其用於此等兩個植株之人源化。使用植株13及20之可變域的胺基酸序列，根據Kabat或Chothia公式鑑別植株13及20的可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)的互補決定區(CDR) (參見例如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)；Chothia及Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)；有關根據Kabat及Chothia公式及其他公式定義CDR殘基之資訊，亦另參見bioinf.org.uk/abs/info.html#kabatnum。使用植株13及20的VH和VL序列自IMGT®人類免疫球蛋白功能基因庫中搜尋V及J人類生殖系資料庫中的重鏈(HC)和輕鏈(κ鏈；KC)序列(imgt.org/genedb/; Giudicelli V., Chaume D. and Lefranc M.-P.. Nucleic Acids Res., 33: D256 - D261 (2005), Lefranc及Lefranc,
Biomedicines, 8(9):319 (2020))。鑑別出與植株13及20之鼠類序列具有最接近一致性的人類生殖系序列。使用來自植株13或20之鼠類CDR胺基酸序列置換人類生殖系序列內之對應人類CDR胺基酸序列。
將鼠類抗體之構架區之胺基酸序列(FR)與人類抗體之對應FR比對。此比對用於鑑別與對應人類抗體殘基非同源的鼠類抗體FR殘基，因為此等殘基可能係如下文所論述之回復突變之候選物。
構築植株13及20抗體的三維模型，以確定在人源化過程中是否可以耐受將給定位置處的鼠類胺基酸殘基突變為其人類生殖系類似物，特別是預期此類胺基酸取代是否會展現出以下一或多種作用：(1)與抗原非共價結合；(2)與CDR相互作用；(3)參與VL-VH界面的相互作用；(4)使免疫球蛋白結構穩定；或(5)形成醣基化位點。此外，確定用人類抗體FR序列中的對應胺基酸殘基取代鼠類結構中之任何胺基酸殘基是否會破壞此等作用中任一者。其主要係藉由計算與單點突變(∆G
mutation)相關之自由能變化來確定的。若認為可能具有破壞性(∆G
mutation＞0)，則原始鼠類胺基酸保留在某些人源化序列中之該位置，亦即在該位置進行人源化序列至鼠類序列的「回復突變」。然而，應注意，∆G
mutation雖然係突變誘發時蛋白質之整體穩定性變化的有用量度，但通常並不是選擇回復突變的唯一標準。在下文用特定實例在植株13人源化之情形下說明此點。在各種情況下，分別人源化鼠類VH鏈及VL鏈。對於各鏈而言，設計許多人源化構築體，其構架回復突變各不相同，但CDR係保守的。VH-VL序列配對係根據其在內部配對資料庫中的頻率進行優先選擇(優先選擇較高頻率的配對)。此內部資料庫併入有公共資訊(基於蛋白質資料庫(www.rcsb.org)中提供的免疫球蛋白結構及已知的臨床抗體)以及來自先前研究的非公開訊息，證明某些配對的有利表現。
在植株20的情況下，在人源化步驟之後使得抗體保留PAD4結合親和力，但具有與細胞外基質(ECM)蛋白的高度非特異性結合。因此，在彼等抗PAD4抗體之開發中進行其他方法及分析，如下文所描述。
1. 植株13之人源化
在對根據上述方法設計之植株13的人源化抗體進行實驗測試時，發現其不包含期望的抗原結合及生物物理特徵。檢查親本抗體與序列一致性最接近親本植株的人類生殖系抗體的序列比對提供重要的見解，即與VH CDR3相鄰的Gly94殘基(圖1E)不存在於所選人類生殖系序列中。實際上，人類生殖系在同等位置具有Thr。將鼠類植株13 VH親本序列(SEQ ID NO:10)中位置94處的Gly (其為高度柔性的胺基酸殘基)置換為柔性較低的Thr殘基，可能導致所得人源化構築體中之VH CDR3環周圍的剛性增加。基於能量考慮因素(ΔG
mutation)，雖然Thr原本係該位置的較佳殘基，但將Gly保持在位置94實際上比Thr更有可能維持結合抗原所需的VH CDR3環的構形靈活性，其係人源化抗體設計中之關鍵考慮因素。事實上，CDR移植物中Thr94的存在導致活性喪失，正如基於幾種人源化抗體之實驗測試所觀測到的(數據未顯示)。為瞭解決此問題，Thr經回復突變為親本序列之Gly。除其他之外，人源化抗PAD4抗體設計中之此額外步驟導致抗體與PAD4有效結合，儘管親本抗體及構架區中選定之人類生殖系的序列一致性相對較低。此外，所得人源化抗體保持正確的二級結構，並且與ECM蛋白的結合較低。
2. 植株20之人源化
與植株13不同，植株20之人源化抗體表現出與PAD4之高親和力結合以及與ECM蛋白之高非特異性結合。對VH-VL配對的檢查表明，最初選擇用於VH及VL人源化的人類生殖系在抗體中不常見配對在一起。因此，自內部資料庫中選擇不同且更有利的輕鏈(LC)生殖系序列，該序列允許選擇有利的VH及VL序列配對。此配對產生人源化植株20抗體，該等抗體與親體植株20相比保留高PAD4親和力，並且展現出ECM蛋白的結合減少。
3. 植株13及20之IgG生殖系
利用上述方法，選擇人類IgG生殖系用於鼠類VH及VL序列的人源化(參見序列表，其表明「描述」欄中使用的生殖系)。
認為兩對人類可變生殖系(VH生殖系IGHV1-46*01與VL生殖系IGKV4-1*01配對以及VH生殖系IGHV1-18*01與VL生殖系IGKV1-39*01配對)同樣適合於對植株20人源化，並相應地製造涉及植株20之兩對生殖系的人源化構築體。
對於植株13及20而言，除了CDR移植之人源化構築體之外，考慮到結構考慮因素，亦製得具有某些回復突變之構築體。基於植株13之抗體在本文中表示為hz13-1至hz13-12，而鼠類抗人類植株13抗體則表示為mAb13。類似地，基於植株20之抗體表示為hz20-1至hz20-14，而鼠類抗人類抗體則表示為mAb20。人源化植株13及植株20抗體之特性描述於以下實例中。
實例2：人源化抗體之表現及純化
表現方法。將PAD4 mAb重鏈(HC)及輕鏈(LC)之編碼序列選殖至pTT22閘或pTT5載體中。擴增構築體並用於使用Expi293表現系統(Thermo Fisher Scientific，目錄號A14635)短暫轉染Expi293F細胞。每公升細胞培養物使用0.5mg DNA轉染。首先，為了檢查表現量，以3 ml規模篩選PAD4單株抗體，其中HC:LC比率為1:1及1:2。短暫轉染後第5天收集樣本，並使用Octet
®系統(Sartorius)分析其力價。
為了以1L規模生產各抗體，使用2L康寧燒瓶將900 ml Expi293F細胞以2.8×10e6個細胞/mL接種在Expi293表現培養基中。將0.5 mg DNA/L培養物添加至50 ml預熱的OPTIMEM培養基中並輕輕混合。取決於初步篩選結果，所使用的HC:LC比率為1:1或1:2。使用前藉由輕輕上下移液來混合ExpiFectamine™ 293。將1.35 mL Expifectamine293添加至50 mL預熱的OPTIMEM培養基中並輕輕混合。培育混合物5分鐘。使用的DNA:ExpiFectamine™293比率為1:2.7。將稀釋的ExpiFectamine™ 293試劑添加至稀釋的DNA中，並藉由渦旋混合以產生ExpiFectamine™ 293-DNA複合物。在室溫下培育複合物20分鐘。隨後，將100 mL轉染混合物添加至含有900 mL細胞之搖瓶中且在添加期間輕輕渦旋該搖瓶。將細胞在37℃及8% CO
2下在濕潤氣氛中以125 rpm搖動培育。轉染後16至20小時，將5.0 mL ExpiFectamine™ 293轉染增進劑1及50 mL ExpiFectamine™ 293轉染增進劑2添加至各燒瓶中。第5天，以2000 rpm的速度離心樣本來收集抗體。保存各樣本之上清液並透過0.2 µm過濾器過濾，以便為抗體純化做準備。
純化方法。首先使用在AKTA Pure25系統上以DPBS (Corning)預平衡的rProtein A Sepharose FF (Cytiva)親和管柱捕捉自HEK 293表現系統收集的PAD4 mAb上清液。捕捉後，用DPBS清洗管柱直至達到基線，然後用80mM NaAc (pH 2.8)將PAD4 mAb溶離至含有約1/10V (總溶離體積) 1M Tris-HCl (pH 8.0)的收集瓶中，以在溶離時立即中和PAD4 mAb。將PAD4 mAb的rProtein A溶離池濃縮至較小體積，並透過SEC在26/600 Superdex-200上進一步精加工，以去除任何聚集體或多聚體。合併最終的S200 PAD4 mAb單體峰，使用Mustang-Q針筒過濾器(PALL Corp)降低內毒素，並使用0.2μm過濾器進行過濾滅菌。
實例3：人源化植株13及人源化植株20抗體之結合親和力
將植株13及20之人源化構築體型式轉換成IgG1.3抗體。藉由表面電漿子共振(SPR)量測其與人類PAD4之結合。使用Biacore® 8K、8K+或T200儀器(Cytiva)進行SPR量測。自此等SPR量測值確定抗體與PAD4之締合速率常數k
on、解離速率常數k
off及平衡解離常數K
D。
對於SPR量測而言，使用抗人類捕捉表面或蛋白質A表面(Cytiva目錄#29127555)抗人類捕捉表面係藉由依照製造商之胺偶合方案(Cytiva目錄號#BR-1006-33)將抗人類捕捉抗體(Cytiva目錄號#29234600)固定至CM5或CM4生物感測器的流通槽上製備的。在37℃下使用HBS-P (150 mM NaCl、10 mM HEPES (pH 7.6)、0.05% Tween-20) (TEKNOVA目錄號H8032)以及另外的150 mM NaCl及1 mM或2 mM CaCl
2(參見表2)或2 mM EDTA (參見表3)作為操作緩衝液來進行SPR實驗。將抗體在操作緩衝液中稀釋至1.5 µg/mL，且在活性生物感測器流通槽上以10 µL/min捕捉15至30秒。使用操作緩衝液製備多種濃度的PAD4 (例如，植株13及其衍生物濃度為0.59 nM至75 nM、或1.56 nM至50 nM，植株20及其衍生物濃度為2.34 nM至300 nM)，並以30 µL /min注射至所捕捉的抗體上。量測抗體與PAD4之締合及解離。注射一次30秒，然後注射一次15秒10 mM甘胺酸(pH 1.5)，用於在分析週期之間再生蛋白質A捕捉表面。對於抗人類捕捉表面而言，用兩次30秒的3 M MgCl
2注射進行再生。在2 mM CaCl
2的存在下進行mAb20及mAb13 SPR之SPR量測。在1 mM CaCl
2存在下測試其餘抗體。
速率常數k
on及k
off係自參考流通槽及0 nM空白減去之感測圖譜導出，並且在3.0.12.15655版Biacore® Insight評估軟體中與1:1結合模型擬合。觀測到與1:1結合模型的偏差，其可能係由於較高濃度下PAD4的二聚化增加所致。平衡解離常數K
D計算為各PAD4抗體的速率常數比k
off/k
on。抗體之k
on值、k
off值及K
D值呈現於表2及表3中。對於在多個SPR實驗中測試之彼等抗體而言，來自兩個或三個單獨實驗之平均值及標準差列於表2及3中。
| 表 2. 藉由 SPR 在 37 ℃ 下在 Ca 2+ 存在下測定之人源化抗體的結合親和力 | |||
| 抗體 | k on(M -1s -1) | k off(s -1) | K D(nM) |
| mAb20* | 4.3E+04 ± 1.1E+04 | 6.2E-03 ± 5.7E-04 | 150 ± 50** |
| hz20-1 | 5.5E+05 ± 5.8E+05 | 8.9E-04 ± 2.2E-04 | 2.7 ± 1.5 |
| hz20-2 | 2.9E+05 ± 5.9E+04 | 2.9E-04 ± 1.8E-04 | 1.1 ± 0.9 |
| hz20-3 | 5.0E+05 | 2.3E-04 | 0.5 |
| hz20-4 | 2.7E+05 ± 1.5E+04 | 4.6E-04 ± 2.3E-04 | 1.7 ± 0.8 |
| hz20-5 | 2.5E+05 ± 4.5E+04 | 4.5E-04 ± 1.5E-04 | 1.9 ± 0.9 |
| hz20-6 | 3.9E+05 | 2.5E-04 | 0.6 |
| hz20-7 | 3.5E+05 | 2.6E-04 | 0.8 |
| hz20-8 | 3.2E+05 ± 5.2E+04 | 2.5E-04 ± 1.9E-04 | 0.8 ± 0.7 |
| hz20-9 | 4.9E+05 | 1.5E-04 | 0.3 |
| hz20-10 | 6.4E+05 | 1.7E-04 | 0.3 |
| hz20-11 | 3.0E+05 ± 3.2E+04 | 2.5E-04 ± 1.7E-04 | 0.9 ± 0.7 |
| hz20-12 | 3.2E+05 ± 4.8E+04 | 1.9E-04 ± 1.0E-04 | 0.6 ± 0.4 |
| hz20-13 | 3.9E+05 | 1.9E-04 | 0.5 |
| hz20-14 | 3.4E+05 | 2.0E-04 | 0.6 |
| mAb13* | 3.5E+05 ± 7.1E+03 | 1.1E-03 ± 2.7E-04 | 3.2 ± 0.8 |
| hz13-1 | 8.8E+05 ± 2.3E+05 | 1.5E-04 ± 8.6E-05 | 0.2 ± 0.1 |
| hz13-2 | 1.7E+06 ± 3.6E+05 | 1.2E-04 ± 5.7E-05 | 0.1 ± 0.03 |
| hz13-3 | 1.5E+06 ± 1.8E+05 | 1.3E-04 ± 6.9E-05 | 0.1 ± 0.05 |
| hz13-4 | 9.3E+05 | 1.3E-04 | 0.1 |
| hz13-5 | 1.6E+06 ± 7.6E+04 | 1.2E-04 ± 5.8E-05 | 0.1 ± 0.04 |
| hz13-5 D31E | 1.32E+06 ± 9.12E+05 | 1.71E-04 ± 7.56E-05 | 0.147 ± 0.057 |
| hz13-6 | 1.6E+06 ± 2.8E+05 | 1.2E-04 ± 3.6E-05 | 0.1 ± 0.02 |
| hz13-7 | 1.2E+06 ± 1.2E+05 | 1.5E-04 ± 5.1E-05 | 0.1 ± 0.05 |
| hz13-8 | 1.7E+06 ± 2.9E+05 | 1.4E-04 ± 4.4E-05 | 0.1 ± 0.02 |
| hz13-9 | 2.0E+06 ± 7.4E+05 | 1.6E-04 ± 3.8E-05 | 0.1 ± 0.01 |
| hz13-10 | 2.2E+06 | 1.7E-04 | 0.1 |
| hz13-11 | 1.9E+06 | 1.5E-04 | 0.1 |
| hz13-12 | 3.1E+06 | 2.0E-04 | 0.1 |
| hz13-12 D31E | 2.7E+06 | 3.0E-04 | 0.1 |
| * 2 mM CaCl 2下進行SPR；所有人源化抗體均在1 mM CaCl 2存在下進行測試 ** 觀測到兩相結合反應，其產生近似的KD值 |
結果表明，無論鈣存在(表2)或不存在(由於EDTA結合所致)(表3)，抗體均以類似的親和力結合PAD4。
實例4：人源化抗體之酶動力學
| 表 3. 藉由 SPR 在 37 ℃ 下在 EDTA 存在下測定之人源化抗體的結合親和力 | |||
| 抗體 | k on(M -1s -1) | k off(s -1) | K D(nM) |
| hz20-2 | 3.1E+05 ± 8.1E+04 | 3.2E-04 ± 1.1E-04 | 1.0 ± 0.1 |
| hz20-3 | 3.4E+05 ± 4.5E+03 | 3.1E-04 ± 2.0E-04 | 0.9 ± 0.6 |
| hz20-4 | 2.4E+05 ± 2.9E+04 | 7.3E-04 ± 5.3E-04 | 3.0 ± 1.9 |
| hz20-6 | 3.0E+05 ± 1.7E+04 | 3.7E-04 ± 2.2E-04 | 1.2 ± 0.7 |
| hz20-5 | 2.4E+05 ± 7.3E+04 | 4.0E-04 ± 4.8E-05 | 1.7 ± 0.3 |
| hz20-7 | 3.8E+05 ± 6.8E+04 | 2.1E-04 ± 6.4E-05 | 0.5 ± 0.1 |
| hz20-8 | 3.6E+05 ± 9.5E+04 | 2.2E-04 ± 3.5E-05 | 0.6 ± 0.1 |
| hz20-9 | 4.8E+05 ± 1.1E+05 | 1.8E-04 ± 4.2E-05 | 0.4 ± 0.0 |
| hz20-10 | 4.8E+05 ± 1.5E+05 | 1.8E-04 ± 5.2E-05 | 0.4 ± 0.0 |
| hz20-11 | 3.9E+05 ± 1.3E+05 | 2.2E-04 ± 1.4E-05 | 0.6 ± 0.2 |
| hz20-12 | 3.8E+05 ± 1.1E+05 | 2.1E-04 ± 2.5E-05 | 0.6 ± 0.1 |
| hz20-13 | 4.4E+05 ± 1.7E+05 | 1.8E-04 ± 2.5E-05 | 0.4 ± 0.1 |
| hz20-14 | 4.5E+05 ± 1.8E+05 | 1.8E-04 ± 2.2E-05 | 0.4 ± 0.1 |
| hz20-1 | 2.2E+05 ± 8.2E+04 | 5.4E-04 ± 5.1E-05 | 2.6 ± 0.7 |
| hz13-1 | 1.3E+06 | 4.0E-04 | 0.3 |
| hz13-2 | 2.0E+06 | 2.5E-04 | 0.1 |
| hz13-3 | 1.9E+06 | 2.1E-04 | 0.1 |
| hz13-4 | 1.4E+06 | 3.2E-04 | 0.2 |
| hz13-5 | 2.1E+06 | 2.1E-04 | 0.1 |
| hz13-5 D31E | 1.17E+06 ± 1.16E+04 | 3.58E-04 ± 1.44E-05 | 0.306 ± 0.015 |
| hz13-6 | 1.7E+06 | 2.3E-04 | 0.1 |
| hz13-7 | 2.0E+06 | 2.5E-04 | 0.1 |
| hz13-8 | 1.9E+06 | 1.6E-04 | 0.1 |
| hz13-9 | 2.0E+06 | 1.9E-04 | 0.1 |
酶促阻斷分析。測試抗體對針對受質TSTGGRQGSHH (SEQ ID NO：216)之PAD4活性的抑制。PAD4將肽受質TSTGGRQGSHH中之精胺酸轉化為瓜胺酸。此反應可經由RapidFire™質譜(Agilent)監測。使用TSTGGRQGSHH測試抗體，以確定其是否能夠抑制PAD4的活性，從而減少瓜胺酸產物的形成。分析緩衝液如下：100 mM HEPES pH 7.4、200 mM NaCl、2 mM CaCl
2及5 mM DTT。分析條件如下：35 nM重組人類PAD4，500 µM TSTGGRQSHH肽，及2 µl抗體溶液。此分析中各反應之總體積為20×L。所使用之停止溶液為10%甲酸。
將抗體在分析緩衝液中以3倍間隔連續稀釋。最高抗體濃度比劑量反應曲線中使用的儲備濃度低至少10倍。
使用上述分析緩衝液及條件在微量滴定盤中製備反應混合物。每個孔中使用2 µl每種抗體溶液。在室溫下培育反應混合物30分鐘。為了停止反應，接著將10 µl每種反應混合物與40 µl 10%甲酸混合。在RapidFire™質譜分析之前，將盤儲存於-80℃。
將解凍樣本裝載至Agilent RapidFire™ 300及Agilent 「C」(C18)濾筒上，使用含有0.09%甲酸/0.01%三氟乙酸的水作為移動相，以1.5 ml/min的流動速率進行3000 ms脫鹽。一旦樣本經裝載及洗滌，使用含有0.09%甲酸/0.01%三氟乙酸之乙腈作為移動相，以1.25 ml/min之流動速率將樣本直接溶離至Sciex API4000三重四極質譜儀上持續3000 ms。在正ESI模式下分別以m/z=562.3/969.7及m/z=562.8/541.3監測受質及產物之MRM轉變。各轉變之停留時間設定為100 ms，且所使用之ESI電壓為5500，源溫度為650℃。使用RapidFire™積分器軟體對每次轉變提取之離子峰進行積分。此等值用於計算抑制百分比，其中抑制百分比 = (1-樣本反應/對照反應)*100。使用GraphPad® Prism™中的四參數Logistic Hill方程式擬合數據以確定IC50。所得IC50數據顯示於表4中。
實例5：人源化抗體之細胞外基質(ECM)評分
| 表 4. 人源化抗體之動力學數據。 | |
| 抗體 | IC 50( 平均值 ) ( 以 nM 為單位 ) |
| mAb20 | 104±30 |
| hz20-1 | 77 |
| hz20-2 | 73±47 |
| hz20-3 | 58±10 |
| hz20-4 | 118 |
| hz20-5 | 56.5 |
| hz20-6 | 64±46 |
| hz20-7 | 64.7 |
| hz20-8 | 71.9 |
| hz20-9 | 107 |
| hz20-10 | 57.4 |
| hz20-11 | 65.7 |
| hz20-12 | 59 |
| hz20-13 | 52.6 |
| hz20-14 | 56.9 |
| mAb13 | 30±9 |
| hz13-1 | 125 |
| hz13-2 | 96.4 |
| hz13-3 | 23.3 |
| hz13-4 | 115 |
| hz13-5 | 48.2 |
| hz13-6 | 39.1 |
| hz13-7 | 170 |
| hz13-8 | 62.8 |
| hz13-9 | 76 |
| hz13-10 | 55.8 |
| hz13-11 | 88.7 |
| hz13-12 | 42.4 |
為確定人源化抗體是否可能非特異性結合至細胞外基質蛋白質，進行以下測試。在室溫下用300 µL阻斷緩衝液(10% FCS/TBS，Alfa Aesar目錄號#J61327)培育96孔Corning薄層基質凝膠基質預塗之細胞外基質(ECM)培養盤一小時。在培育之後，將100 µL新鮮阻斷緩衝液中1、0.2及0.04 µM的抗體添加至各孔中。六個孔沒有添加樣本來計算背景及ECM評分。樣本培育1小時後，取出樣本並以PBS-T洗滌緩衝液洗滌盤3次。每孔添加100 µl 10 ng/mL山羊抗人類IgG-HRP結合偵測抗體(Jackson ImmunoResearch目錄號109-035-008)。在室溫再培育一小時之後，用PBS-T洗滌緩衝液洗滌各孔3次。洗滌後，將100 µl TMB受質(Surmodics 目錄#TMBW-1000-01)添加至每個孔中並使其反應15分鐘，然後添加100 µl 1 M磷酸停止溶液。然後在微量盤分析儀上讀取450 nm處的吸光度並在620 nm處進行參考。表5中呈現之ECM評分係藉由將樣本孔之吸光度值除以未添加樣本之孔的吸光度來計算的。較低的ECM評分通常為合乎需要的，因為其表明與細胞外基質蛋白質之結合較少。所有人源化植株13構築體均顯示較低的ECM評分，而約一半的人源化植株20構築體顯示出較高的ECM評分(等級為6或更高；選擇此截止值係因為使用相同方案測試之所有48種臨床批准之單株抗體均顯示ECM評分低於6)。
實例6：抗體疏水性
| 表 5. 人源化抗體之 ECM 評分。 | |
| 抗體 | ECM 評分 (1 µM) |
| hz20-1 | 1 |
| hz20-2 | 6 |
| hz20-3 | 20 |
| hz20-4 | 1 |
| hz20-5 | 3 |
| hz20-6 | 16 |
| hz20-7 | 5 |
| hz20-8 | 4 |
| hz20-9 | 19 |
| hz20-10 | 18 |
| hz20-11 | 4 |
| hz20-12 | 3 |
| hz20-13 | 19 |
| hz20-14 | 20 |
| hz13-1 | 1 |
| hz13-2 | 1 |
| hz13-3 | 1 |
| hz13-4 | 1 |
| hz13-5 | 1 |
| hz13-6 | 1 |
| hz13-7 | 1 |
| hz13-8 | 2 |
| hz13-9 | 2 |
| hz13-10 | 1 |
| hz13-11 | 1 |
| hz13-12 | 1 |
藉由疏水相互作用層析法(HIC)評估各人源化抗體之表面疏水性。將各抗體樣本10 µg裝載至Agilent 1260 Infinity II HPLC系統的TSKgel Butyl-NPR管柱(4.6mm × 3.5cm，2.5μm粒度，Tosoh P/N 14947)上。移動相A (0.1 M磷酸鈉pH 7.0、2 M硫酸銨)與移動相B (0.1 M磷酸鈉溶液pH 7.0)的線性梯度係在25℃管柱溫度下以1.0 ml/min之流動速率使用20分鐘。人源化抗體之HIC滯留時間(RT)列於表6中。基於HIC結果，當使用一組48種臨床批准之單株抗體作為參考時，所有人源化抗體均具有可接受的表面疏水性。(在使用相同實驗方案測試的此等臨床批准之單株抗體中大約75%顯示RT低於11分鐘)。
實例7：人源化抗體之穩定性
| 表 6. 人源化抗體之 HIC 數據。 | |
| 抗體 | HIC RT ( 分鐘 ) |
| hz20-1 | 10.2 |
| hz20-2 | 10 |
| hz20-3 | 9.7 |
| hz20-4 | 10 |
| hz20-5 | 10.2 |
| hz20-6 | 9.8 |
| hz20-7 | 10.2 |
| hz20-8 | 10.2 |
| hz20-9 | 10 |
| hz20-10 | 10 |
| hz20-11 | 10.3 |
| hz20-12 | 10.2 |
| hz20-13 | 10 |
| hz20-14 | 10 |
| hz13-1 | 9.6 |
| hz13-2 | 9.8 |
| hz13-3 | 9.8 |
| hz13-4 | 9.7 |
| hz13-5 | 9.8 |
| hz13-5 D31E | 9.9 |
| hz13-6 | 9.8 |
| hz13-7 | 9.7 |
| hz13-8 | 9.8 |
| hz13-9 | 9.8 |
| hz13-10 | 9.6 |
| hz13-11 | 9.6 |
| hz13-12 | 9.8 |
在此實例中所描述之實驗中，評估人源化植株13及人源化植株20抗體(各自具有如本文所揭示之序列，包括IgG1.3恆定區，如實例2中所描述表現及純化)的穩定性。
A. 冷凍/融化穩定性
藉由進行5次冷凍/融化循環來測定抗體之冷凍穩定性。將濃度為1 mg/mL及500 µL/瓶的各抗體添加至2 mL螺旋蓋透明小瓶(Agilent)中。將小瓶放入Biocision CoolCell™中並在-80℃儲存2小時。取出CoolCell™並在室溫(約23℃)下置放2小時。總共重複5次並對樣本進行分析。與最初的起始樣本相比，經歷凍結/融化循環的抗體沒有顯示任何顯著變化(數據未顯示)。
B. 藉由熔融溫度、聚集溫度及流體動力體積評估之熱穩定性
1. 方法
使用UNcle®生物製劑穩定性篩選平台(Unchained Labs, Pleasanton, CA)以使用靜態光散射、使用固有螢光及聚集溫度(T
agg)值來確定熔融溫度(T
m)，並用於使用螢光在熱熔融前後進行動態光散射(DLS)。將抗體以1 mg/mL裝載至(i) 20 mM組胺酸、260 mM蔗糖、50 µM DTPA、0.05% PS80 (pH 6.0條件)及(ii) 20 mM Tris、260 mM蔗糖、50 µM DTPA、0.05% PS80 (pH 8.3條件)。在20℃下對樣本進行DLS，採集時間為5 秒，總共採集4次。在90℃的溫度下再次進行熱升溫後的DLS。執行階梯式熱升溫以確定始於20℃且結束於90℃的T
m值及T
agg值，升溫速率為1℃/分鐘，階梯保持時間為30秒。使用UNcle®分析軟體進行數據分析。T
m值係使用溫度階梯之間的差值來確定的。T
agg值係使用266nm處的靜態光散射(SLS)確定的。
2. 結果
測定人源化PAD4抗體之熔融溫度T
m以評估其熱穩定性。如上文所描述在pH 6.0及pH 8.3下測定T
m值及T
agg值且結果顯示於表7中。總體而言，抗體在pH 6.0下表現出比pH 8.3更高的熱穩定性，但hz13-1及hz13-7在pH 6.0及pH 8.3下具有相同的穩定性。在pH 6.0下之T
m值在約64℃至約69℃範圍內，其對於抗體而言為典型的。pH 8.3下之T
m值在約58℃至約67℃範圍內，表明抗體在較高pH緩衝液中通常具有較低熱穩定性。同樣，與在pH 8.3 (61℃至69℃)下相比，抗體在pH 6.0 (64℃至76℃)下具有更高的T
agg值。動態光散射(DLS)在熱升溫開始時進行，且所有構築體的流體動力學直徑均顯示為約10 nm (數據未顯示)，其對於抗體而言係典型的。
C. 藉由尺寸排阻層析法(SEC)及肽定位體積評估之化學穩定性
3. 方法
| 表7. 熔融溫度及聚集溫度結果以 ℃ 為單位。 | ||||
| 抗體 | Tm 值 | Tagg 值 | ||
| pH 6.0 | pH 8.3 | pH 6.0 | pH 8.3 | |
| hz20-1 | 64.10 | 60.98 | 64.22 | 61.4 |
| hz20-2 | 67.30 | 61.67 | 69.44 | 63.6 |
| hz20-3 | 66.90 | 61.50 | 69.89 | 63.6 |
| hz20-4 | 65.65 | 62.51 | 66.94 | 64.6 |
| hz20-5 | 65.65 | 62.96 | 70.46 | 64.9 |
| hz20-6 | 66.55 | 61.69 | 71.05 | 63.7 |
| hz13-1 | 67.30 | 66.94 | 76.12 | 69.3 |
| hz13-2 | 68.65 | 65.91 | 74.20 | 66.8 |
| hz13-3 | 68.90 | 64.55 | 72.13 | 64.8 |
| hz13-4 | 68.95 | 63.20 | 70.35 | 64 |
| hz13-5 | 65.70 | 59.85 | 66.61 | 61.6 |
| hz13-6 | 63.95 | 57.87 | 64.72 | 59.6 |
| hz13-7 | 66.70 | 66.85 | 72.87 | 66.2 |
| hz13-8 | 68.43 | 64.23 | 70.83 | 65.2 |
| hz13-9 | 68.37 | 63.13 | 69.98 | 64.3 |
| hz13-10 | 67.90 | 63.60 | 70.12 | 65.94 |
| hz13-11 | 66.30 | 61.10 | 68.69 | 63.63 |
| hz13-12 | 66.90 | 61.40 | 67.97 | 64.70 |
| hz20-7 | 67.40 | 62.50 | 70.35 | 64.52 |
| hz20-8 | 66.80 | 63.60 | 69.65 | 65.61 |
抗體處理。將抗體在溫度控制條件下在4℃或40℃下儲存於Binder培育箱中。將20 mM組胺酸、260 mM蔗糖、50 µM DTPA、0.05% PS80的濃度為1 mg/mL的調配物(pH 6.0，其中每種抗體1 mL/小瓶)添加至2 mL螺旋蓋透明小瓶中(Agilent)，且將封口膜膠帶固定在頂部周圍，以確保截短穩定性研究的初始嚴密密封。將小瓶儲存於適當培育箱中。在第2週及第4週自各小瓶中取出500 µL樣本進行分析。藉由尺寸排阻層析法及肽定位分析化學可靠性。
尺寸排阻層析法 (SEC) 。SEC用於測定在儲存2週後及4週後抗體之尺寸均勻性。將Agilent 1260 Infinity
TM系統與Advancebio
TMSEC 300Å、4.6 × 300 mm、2.7 µm管柱聯合使用。操作緩衝液為100 mM磷酸鉀、250 mM氯化鈉，pH 6.8。將量為25 µg的樣本注入管柱中，並以0.5 mL/分鐘的速率運行15分鐘。在280 nm處分析層析圖，並使用峰面積來確定單體、高分子量物質及低分子量物質的百分比。在運行前後使用來自Bio-Rad實驗室的凝膠過濾標準，以確保管柱完整性。
LC-MS 胰蛋白酶肽定位及分析。使抗體在0.2% Rapigest界面活性劑(Waters Corp.)存在下變性，並用二硫蘇糖醇(DTT)在80℃還原30分鐘，用碘乙醯胺(IAM)在室溫避光烷基化30分鐘，並在37℃在Tris pH 7.4中經胰蛋白酶消化4小時，然後進行酸性淬滅。
在與Q-Exactive™ Plus質譜儀(Thermo Scientific, San Jose, CA)聯用的ACQUITY UPLC系統(Waters, Manchester, U.K.)上分析肽。使用60 min LC梯度將肽自Waters BEH C18管柱(130A 1.7 µm 2.1 × 150 mm，產品編號186002353)中溶離，加熱至50℃。梯度設定為在46 min內0.2%至30%溶劑B，流動速率為0.2 mL/min。溶劑A為含0.1%甲酸之水，且溶劑B為含0.1%甲酸之乙腈。質譜儀在正離子模式下操作，ESI電壓為3.5 kV，毛細管溫度：250℃，掃描範圍：320-1800，鞘氣流速：45。
藉由Biologic™軟體(Protein Metrics, Cupertino, CA)分析肽定位數據，前驅體質量容差為6 ppm，且片段質量容差為10 ppm。將胺甲醯胺基甲基化設定為固定修飾，且針對氧化及去醯胺搜尋可變修飾。MS/MS質譜及修飾含量均經過手動驗證及計算。監測肽之氧化、去醯胺化及異構化含量。相對修飾%係根據經修飾肽之AUC/(經修飾肽的AUC + 天然肽之AUC)*100計算。
4. 結果
SEC 。SEC結果顯示於圖3A中。在4℃及40℃下，抗體之單體峰通常下降不到5%。所有抗體在4℃均顯示極小變化(若存在)，過程為4週。在40℃下，與起始時間點相比，其顯示低分子量(LMW)片段化顯著增加，且顯示高分子量(HMW)聚集體數量穩定或略有增加。
肽定位。藉由肽定位檢驗人源化植株20抗體中之四者。結果表明，在40℃下儲存長達4週後沒有實質化學修飾(圖3B)。
藉由肽定位檢驗人源化植株13抗體中之四者：hz13-5、hz13-10、hz13-11及hz13-12。結果顯示，人源化植株13抗體在重鏈CDR1的D31處具有高達74%的異構化傾向(圖3C至圖3D)。在D31下觀測到的異構化在hz13-5中比在其他三種植株13衍生之抗體中少得多。其他位置未展示實質性化學修飾(圖3C)。D31異構化很明顯，但當透過SPR檢查異構化抗體時，異構化並不影響抗體的結合(數據未顯示)。
實例8：減輕D31處之異構化
進行後續研究以評估減輕在上述篩選中觀測到的重鏈CDR1位置D31處之異構化的方法。此實例中所用之抗體具有如本文所揭示之序列，包括IgG1.3恆定區，且如實例2中所述地表現及純化。
A. pH對異構化之影響
1. 方法
對植株13衍生物hz13-5及hz13-12進行pH篩選。由於異構化係熱及pH依賴性的，因此在受控溫度條件(4℃或40℃)下，在pH 6、6.5、7.0、7.5及8.0下檢查此等兩種構築體。對於pH 6.0及pH 6.5而言，所用調配物緩衝液為20 mM組胺酸、260 mM蔗糖、50 µM DTPA、0.05% PS80。對於pH 7.0、7.5及8.0而言，所用調配物緩衝液為20 mM磷酸鈉、260 mM蔗糖、50 µM DTPA、0.05% PS80。以1 mg/mL之濃度檢查樣本；將1 mL/小瓶之各抗體添加至2 mL螺旋帽透明小瓶(Agilent)中，且將封口膜膠帶固定在頂部周圍以確保用於截短穩定性研究之初始嚴密密封。將小瓶儲存於適當培育箱中。在第2週及第4週自各小瓶中取出500 µL樣本進行分析。藉由尺寸排阻層析法及肽定位分析化學可靠性。使用如上文實例7中所描述之方法進行SEC及肽定位。
2. 結果
hz13-12及hz13-5隨pH及時間變化的SEC結果分別顯示於圖3E及圖3F中。藉由肽定位觀測到，隨著pH增加，異構化量減少。在pH 8.0下，hz13-12 (圖3G至圖3J)及hz13-5 (圖3K至圖3N)的異構化程度係不可偵測的。然而，在6.5或更高的pH水準下，觀測到去醯胺化作用，且去醯胺化隨著pH的增加而增加。
B. D31E點突變之作用
1. 方法
所研究的減少或消除在重鏈CDR1之位置D31處觀測到的異構化的另一種策略是用麩胺酸置換在重鏈CDR1之位置31處的天冬胺酸(D31E突變)。其會導致同類電荷取代，並且由於R基團上的碳鏈較長，異構化速率可能會降低；其已被實驗證實。
製備兩種此類突變體：hz13-5 D31E及hz3-12 D31E。此等突變體在HEK細胞中產生、純化，並進行超過2個月的熱穩定性測試，其中測試係在Binder培育箱中在T0 (儲存前)及在4℃、25℃及40℃之受控溫度儲存後2週、4週及2個月的時間點進行。樣本濃度為50 mg/mL，調配物為20 mM組胺酸、260 mM蔗糖、50 µM DTPA、0.05% PS80 (pH 6.0)。將100 µL/小瓶的各抗體添加至帶有插入物的2 mL螺旋蓋透明小瓶(Agilent)中，並將封口膜膠帶固定在頂部以確保嚴密密封。將小瓶儲存於適當培育箱中。在2週、4週及2個月時自各小瓶中取出50 µL樣本，以藉由尺寸排阻層析法及肽定位進行分析。
2. 結果
hz13-12 D31E及hz13-5 D31E之SEC結果分別顯示於圖3O及圖3P中。在4℃培育之D31E突變抗體樣本在兩個月內保持穩定，幾乎沒有變化。在40℃培育之樣本顯示LMW片段化略有增加，在可接受的限度內。肽定位結果表明hz13-12D31E (圖3Q)及hz13-5D31E (圖3R)均顯示出可接受的化學穩定性。在40℃之高溫下，D52/55/56殘基處之異構化及Ns/Qs殘基處之去醯胺化有增加的趨勢。在較低溫度下未觀測到實質性化學修飾。
3. 結論
增加pH以減輕位置D31處之異構化往往會導致LC-CDR1中更多的去醯胺化，而D31E點突變不會導致此權衡。D31E突變抗體具有可接受之化學穩定性。因此，D31E突變被認定係減輕D31處異構化的有利方法。
實例9：高濃度調配物之穩定性
對於皮下投與而言，必須以高濃度配製抗體。進行兩組高濃度篩選實驗。
進行hz13-5親本及hz13-5 D31E突變體之高濃度熱穩定性篩選。熱穩定性研究超過3個月，其中在Binder培育箱中時間點為T0 (時間零，儲存前)及在2週、4週、2個月及3個月時在4℃、25℃及40℃的受控溫度儲存之後。抗體表現於HEK或CHO細胞中，純化且以150 mg/ml之濃度配製於20 mM組胺酸、260 mM蔗糖、50 µM DTPA、0.05% PS80 (pH 6.5)中。將100 µL/小瓶的各抗體添加至帶有插入物的2 mL螺旋蓋透明小瓶(Agilent)中，並將封口膜膠帶固定在頂部以確保嚴密密封。將小瓶儲存於適當培育箱中。在2週、4週、2個月及3個月時自各小瓶取出50 µL樣本進行分析。藉由SEC及肽定位分析化學可靠性。使用如實例7中所描述之方法進行SEC及肽定位。
使用SEC分析3個月內分子的聚集及片段化。Hz13-5在40℃下直至3個月才顯示HMW或LMW的變化，其中發現小幅增加(圖3S)。在25℃下，LMW在2週、4週及2個月時略有增加。3個月時，LMW及HMW均有所增加，但在可接受之限度內。在40℃下，LMW在2週及4週時略有增加，且在2個月及3個月時，LMW出現顯著增加，HMW亦略有增加。此等均在可接受之限度內。在4℃下至少3個月內未觀測到顯著變化。hz13-5 D31E抗體亦出現相同的趨勢(圖3T)。
在2週及4週時在pH 6.5下進行hz13-5親本的肽定位(結果顯示於圖3U中)。在儲存條件(4℃)下，位置D31處之異構化減至最少。在三個月內分析hz13-5 D31E之肽定位(結果顯示於圖3V)。雖然在壓力條件下化學修飾有所增加，但該抗體在4℃在3個月內表現出可接受的穩定性。
實例10：Hz13-5 D31E之經純化調配物之穩定性
Hz13-5 D31E產生於CHO細胞中，加以純化，且在pH 6.0下以54.6 mg/mL之濃度調配於20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、50 µM DTPA、0.05% PS80中。將100 µL/小瓶的各抗體添加至帶有插入物的2 mL螺旋蓋透明小瓶(Agilent)中，並將封口膜膠帶固定在頂部以確保嚴密密封。將小瓶儲存於適當培育箱中。熱穩定性研究超過3個月，其中在Binder培育箱中時間點為T0 (時間零，儲存前)及在2週、4週、2個月及3個月時在4℃、25℃及40℃的受控溫度儲存之後。在2週、4週、2個月及3個月時自各小瓶取出50 µL樣本進行分析。藉由尺寸排阻層析法(SEC)及肽定位分析化學可靠性。使用如實例7中所描述之方法進行SEC及肽定位。
Hz13-5 D31E具有可接受之穩定性概況，因為該材料在SEC概況(圖3W)及4℃下之化學穩定性(圖3X)中表現出最小的變化。
實例11：PAD4對人源化植株13及植株20抗體之表位定位
分析人類PAD4蛋白與植株13及植株20抗體相互作用後的結合表位。用於此分析之方法為氫/氘交換質譜法(HDX-MS)及正交共價標記足跡分析技術，尤其是蛋白質快速光化學氧化(FPOP)、甘胺酸乙酯標記(GEE)及焦碳酸二乙酯(DEPC)。
A. 表位表徵方法
氫 / 氘交換質譜分析 (HDX-MS) 方法。首先，進行非氘化實驗以產生重組人類PAD4的常見肽清單，並且產生人類PAD4與植株13的Fab (SEQ ID NO: 226及228)或與植株20的Fab (SEQ ID NO: 229及231)的蛋白質複合物。抗體濃度為15 µM，且蛋白質與配位體莫耳比為1:1莫耳比。在HDX-MS實驗中，將各樣本5 µL稀釋至55 µL D
2O緩衝液(10 mM磷酸鹽緩衝液，D
2O，pD 7.0)中以開始標記反應。反應進行不同的時間段：20秒、1 min、10 min及60 min。在各標記反應時段結束時，藉由添加淬滅緩衝液(具有4 M GdnCl及0.4 M TCEP之100 mM磷酸鹽緩衝液，pH 2.5，1:1，v/v)來淬滅反應。將50 µL經淬滅樣本注射至Waters HDX-MS系統中進行分析。在不存在或存在抗體之情況下監測常見胃蛋白酶肽中之氘吸收量。
蛋白質快速光化學氧化 (FPOP) 方法。藉由FPOP對重組人類PAD4、人類PAD4與植株13 Fab (SEQ ID NO: 226及228)之蛋白質複合物及人類PAD4與植株20 Fab (SEQ ID NO: 229及231)之蛋白質複合物進行表位定位(10 µM，1:1莫耳比)。使用KrF準分子雷射以藉由光解H
2O
2產生羥基自由基。激勵波長設定為248 nm以防止蛋白質中之雷射誘導之構形變化。緊接在標記之前，將5 μL組胺酸及5 μL H
2O
2添加至蛋白質樣本。蛋白質溶液之最終體積為50 μL，組胺酸之最終濃度為500 μM，且H
2O
2之最終濃度為15 mM。接著將樣本注射至具有UV透明窗之熔融二氧化矽套管中。以7.4 Hz之頻率將雷射調節至70毫焦/脈衝。FPOP及無雷射對照實驗均重複進行三次。在含有11 μL淬滅溶液(包含50 nM過氧化氫酶及20 mM甲硫胺酸)之微量離心管中收集各複本。使樣本變性、還原、烷基化且用胰蛋白酶消化，隨後進行LC/MS/MS分析。在不存在/存在抗體的情況下監測肽之氧化水準。僅將hPAD4與hPAD4/Fab之間的標記%有統計學上顯著差異(基於司徒頓T-測試，P值＜0.01)之殘基視為受保護之殘基。
GEE 標記 方法。將各1 mg/mL的10 µL樣本(人類PAD4、人類PAD4與植株13 Fab之蛋白質複合物，及人類PAD4與植株20 Fab之蛋白質複合物)與1 µL 2 M GEE及1 µL 50 mM 1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(EDC)在室溫下混合10 min來起始GEE標記。藉由向樣本中添加10 µL 1 M乙酸銨來淬滅反應。使17.5 µL各GEE標記樣本經受酶促消化。使樣本變性、還原、烷基化且用胰蛋白酶消化，隨後進行LC/MS/MS分析。僅將hPAD4與hPAD4/Fab之間的標記%有統計學上顯著差異(基於司徒頓T-測試，P值＜0.01)之殘基視為受保護之殘基。
DEPC 標記方法。藉由以8:1之DEPC:蛋白質莫耳比將各15 µL樣本(人類PAD4、人類PAD4與植株13之Fab的蛋白質複合物，及人類PAD4與植株20之Fab的15 µM蛋白質複合物)與DEPC混合來起始DEPC標記。標記在37℃下進行10 min，接著以1:50之比率用咪唑淬滅。就DEPC:咪唑莫耳比而言，使DEPC標記之樣本變性、還原、烷基化且用胰蛋白酶或GluC消化，隨後進行LC/MS/MS分析。僅將hPAD4與hPAD4/Fab之間的標記%有統計學上顯著差異(基於司徒頓T-測試，P值＜0.01)之殘基視為受保護之殘基。
B. 表位表徵結果
使用上述方法定位植株13及植株20之表位。首先，使用HDX-MS，hPAD4之序列覆蓋度達到＞98%。HDX-MS數據分析表明，植株13及植株20在hPAD4中具有不同表位(圖4A至圖4B)。植株13的一級HDX表位為
515FEGIKKKKQQKIKNILSNKTLREHNSF
541(圖4A；SEQ ID NO: 217)。植株13的二級HDX表位：
501FQEQQNEGHGEALL
514(圖4A；SEQ ID NO: 218)。植株20的一級HDX表位為
630INDFFTYHIRHGEVHCGTN
648(圖4B；SEQ ID NO: 219)。植株20的二級HDX表位為
337CPEEENMDDQW
347(圖4B；SEQ ID NO: 220)。
FPOP、GEE及DEPC標記方法證明瞭不同的殘基特異性反應性並提供hPAD4之100%序列的互補資訊。此等標記方法中之每一者均係單獨進行的，並且在hPAD4的整個序列上檢查每種方法的標記百分比，重點是如上文所描述藉由HDX-MS確定的表位區域。受保護的殘基係基於在hPAD4與hPAD4/Fab之間的標記%差異具有統計顯著性(基於司徒頓T-測試，p值＜0.01)確定的。圖5A至圖5B顯示獲自FPOP、GEE及DEPC標記實驗之分層圖。所示胺基酸殘基對應於植株13及植株20之HDX表位區中的標記殘基。具有統計顯著性之受保護殘基經鑑別如下：(1)由植株13保護之殘基：F515、E516、K519、K520、K521及K522；及(2)由植株20保護之殘基∶D632、Y636及H644/C645。圖6顯示在hPAD4之對應蛋白質序列上植株13及植株20之表位(藉由HDX-MS、FPOP、GEE及DEPC標記所測定) (圖6)。
實例12：鑑別抗PAD4植株13抗體上之表位
此實例描述抗人類PAD4植株13親本抗體(mAb13)在與人類PAD4相互作用時互補位的定位。
A. 用於互補位定位之HDX方法
使用氫/氘交換質譜法(HDXMS)探測互補位(mAb13與人類PAD4之結合位點)。進行非氘化實驗以產生mAb13之重組Fab及人類PAD4與mAb13之蛋白質複合物(15 µM，1:1莫耳比)的常見肽清單。通用HDX方法係如以上實例11中所描述。在不存在或存在人類PAD4之情況下監測常見胃蛋白酶肽中之氘吸收量。
B. 互補位定位結果
在定位mAb13之互補位的過程中，重鏈(HC)及輕鏈(LC)兩者均達到序列覆蓋度＞98%。亦即，HC獲得98.7%的序列覆蓋率，具有4.75%的冗餘度，LC獲得100%的序列覆蓋率，具有4.96%的冗餘度(圖7A至圖7B)。基於HDX保護水準確定互補位區域且顯示於圖8A至圖8B中。對於HC而言，所鑑別之第一互補位區為
27FNIKDHF
33(SEQ ID NO: 221)，其與重鏈互補決定區1 (HC-CDR1)重疊(圖8A)。針對HC鑑別之第二互補位區為
94FYCAGYGNYEGAMDY
108(SEQ ID NO: 222)，其與重鏈互補決定區3 (HC-CDR3)重疊(圖8A)。對於LC而言，所鑑別之第一互補位區為
26SENVNNYGIGFM
37(SEQ ID NO: 223)，其與輕鏈互補決定區1 (LC-CDR1)重疊(圖8B)。所鑑別之其他LC互補位區為
137VCFLNNFY
144(圖8B；SEQ ID NO: 224) (其對應於例示性人類LC恆定區中之片段VCLLNNFY (SEQ ID NO: 235))。藉由HDX-MS鑑別之主要互補位區域為HC-CDR1、HC-CDR3及LC-CDR1。由於所有人源化植株13抗體均具有與親本植株13相同的CDR，因此互補位定位數據適用於植株13的所有人源化變異體。
實例13：PAD4.植株13 Fab複合物的低溫電子顯微術(Cryo-EM)結構
使用低溫-電子顯微術測定PAD4與植株13 Fab之複合物的結構。
A. 用於純化PAD4及植株13 Fab之方法及用於複合及表徵PAD4.植株13 Fab複合物之方法
將人類PAD4 (1-663)基因選殖於pET28a載體(Novagen)中。PAD4蛋白質(N-His-TVMV-PAD4) (SEQ ID NO: 3)表現於Rosetta2 (DE3) pLysS大腸桿菌細胞中。將細胞以0.5 mM IPTG誘導且在18℃下生長過夜。藉由Ni-NTA親和層析法純化蛋白質，然後在緩衝液50 mM Tris (pH 8.5)、500 mM NaCl、1 mM DTT、1 mM EDTA中進行尺寸排除層析法。
將植株13 Fab重鏈(HC)及植株13 Fab輕鏈(LC)選殖於pTT5載體中，其中在HC中具有C端His標籤(分別為SEQ ID NO：226及228)。植株13 Fab (包含HC及LC)短暫表現於Expi-293細胞中。藉由Ni-NTA親和層析法，然後在PBS中進行尺寸排阻層析法來純化植株13 Fab。
為純化PAD4.植株13 Fab複合物，將經純化之植株13 Fab與PAD4以三莫耳過量混合且在4℃培育過夜。隨後在最終緩衝液(25 mM Tris pH 8.0、250 mM NaCl、1 mM DTT及1 mM EDTA)中進行尺寸排除層析法。
B. Cryo-EM方法
為了製備網格，將3 µL 1 mg/mL PAD4.植株13 Fab複合物應用於新輝光放電的Quantifoil 0.6/1 300編織網，並使用Vitrobot Mark IV (FEI)在4℃、100%相對濕度下吸水持續4秒，然後在液體乙烷中急凍。然後將網格運送至猶他大學生物化學系貝克曼冷凍顯微術中心，置於乾燥杜瓦瓶中，冷卻至液態氮溫度，以便收集數據。
為了收集數據，在猶他大學使用配備GIF量子能量濾波器(Gatan)及K3 Summit直接電子探測器(Gatan)的300 kV Titan Krios顯微鏡(Thermo Fisher Scientific)記錄4999個高倍放大率影片訊框。使用EPU軟體記錄影片訊框，校準像素大小為0.6723 Å，總劑量約48e-/Å2，離焦範圍為-0.7至-2.0 µm。
對於數據處理而言，使用cryoSPARC封裝。首先使用cryoSPARC的「Patch Motion」對記錄的影片訊框進行劑量分割及光束誘導運動校正。使用cryoSPARC的「Patch CTF」模組計算所有經過運動校正、對準及平均的影片訊框的對比度傳遞函數(CTF)。然後根據CTF估計解析度、冰厚度及運動校正期間的總運動選擇4017個影像。使用cryoSPARC中實施的斑點拾取器及基於模板之拾取組合拾取564,384個顆粒。隨後使所拾取之顆粒經受2D分類。在2D分類後選擇229,914個顆粒。接著使用cryoSPARC之從頭開始的重構築程式將此等所選顆粒分成兩個池。隨後將具有194,891個顆粒之較大池細化至約2.6Å解析度。然後使用另一輪從頭開始的重構築將194,891個顆粒進一步分為兩類。隨後將具有131,529個顆粒的較大顆粒池細化至約2.5 Å。所有解析度估計值均係基於黃金標準傅立葉殼相關臨限值標準0.143。
對於模型建立及細化而言，使用UCSF Chimera軟體將PAD4及植株13 Fab模型擬合至cryoEM圖譜中。然後使對接模型分別在Coot及Phoenix中進行迭代模型建構及真實空間細化。Coot及Pymol用於結構分析。
C. PAD4.植株13 Fab界面處之CDR
PAD4.植株13 Fab複合物(圖9A)被視為2:2 (二聚體)組裝體(圖9B)。無法解析重鏈及輕鏈恆定區，且遠離PAD4界面的部分VH區及VL區的cryoEM密度亦無法得到很好的解析。然而，明確定義PAD4.植株13 Fab界面。
鑑別個別CDR之作用及相互作用。各CDR均對在植株13與PAD4複合時掩埋的植株13 Fab之表面積有貢獻。觀測到來自重鏈之所有三個CDR (HC中之CDR1、CDR2及CDR3)與PAD4相互作用。相比之下，在LC中，僅CDR1與PAD4發生顯著相互作用。就複合時掩埋面積而言，各個CDR對與PAD4相互作用的貢獻在下表8中給出。LC CDR1主要與PAD4發生疏水性/凡得瓦爾相互作用，其中LC CDR1的Y28-羥基與PAD4的Gly603形成氫鍵。
D. 植株13 Fab抑制PAD4之作用機制
| 表8.植株13 Fab之CDR。 | ||
| CDR | 掩埋面積 % | 面積(Å 2) |
| LCDR1 | 34 | 225 |
| HCDR3 | 23 | 153 |
| HCDR2 | 15 | 99 |
| HCDR1 | 11 | 71 |
| LCDR2 | 8 | 54 |
| LCDR3 | 4 | 29 |
此實例中所描述之cryo-EM結構之分析提供似乎合理的作用抑制機制。在受質肽結合形式中，PAD4的離胺酸環(PAD4的胺基酸510至526，其含有PAD4之胺基酸519至522處的四離胺酸延伸段)充當由胺基酸630至638形成的螺旋的蓋子。胺基酸630至638處的螺旋對於活性位點中受質的正確定位可能很重要，因此由離胺酸環穩定。(圖11；改編自蛋白質資料庫ID 2DEW (已提交的人類肽基精胺酸脫亞胺酶4與包括Arg8的組蛋白H3 N端尾部複合的晶體結構；下文稱為(「2DEW」)，如rcsb.org/structure/2DEW; files.rcsb.org/pub/pdb/validation_reports/de/2dew/2dew_full_validation.pdf及PNAS (2006) 103, 5291-5296處所提供)。
另外，在PAD4.植株13 Fab複合物之cryoEM結構中(圖12)，抗體誘導PAD4離胺酸環之重組態。詳言之，HC CDR3使PAD4離胺酸環發生移位並產生用於植株13 Fab結合的新表位表面。發生移位的離胺酸環現在參與和抗體的直接相互作用，碰撞到630至638各催化螺旋並導致螺旋紊亂。此紊亂預計會使受質結合位點失去穩定性並抑制PAD4酶促活性。如在2DEW中，有序移動環630至643在空間上不與植株13 Fab結合相容。
此等cryoEM結構結果與上述實例12中討論的HDX互補位定位結果一致，其表明HC-CDR1、HC-CDR3及LC-CDR1係主要互補位。
E. pH依賴性抗PAD4抗體
亦分析此實例中所描述之cryo-EM結構以瞭解抗PAD4抗體之pH依賴性的結構基礎(參見以下實例14)。
實例14：基於親本抗體hz13-5之pH依賴性抗PAD4抗體之設計及表徵
製備抗體突變體以獲得pH依賴性抗PAD4抗體，其在中性或生理pH (諸如pH 7.4)下保留與PAD4的結合，但在酸性pH (諸如pH 6.0)下與PAD4具有較弱的結合。此抗體預計會在諸如滑液之環境中保留與PAD4的結合及複合，但一旦內化至細胞中，預計會在胞內體的酸性區室中與PAD4解離，導致PAD4被溶酶體關閉而降解且使抗體經由與FcRn的結合而循環回到表面；因此，pH依賴性使得抗體之降解減少。
A. 突變掃描文庫方法
突變掃描庫被設計成使得該文庫之各成員僅含有抗體之互補決定區(CDR)內的單一突變。CDR內的每個位置均突變為20個可能的胺基酸殘基中之任一者，並且文庫被設計為以此方式掃描抗體的所有6個CDR。因此，總共產生1360個單突變抗體，即基於植株13之親本抗體hz13-5。使用重疊PCR將突變掃描文庫建構為scFv (Xu L等人(2002) Chemistry & Biology 9: 933；Roberts RW及JW Szostak (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297；Kurz等人(2000) Nucleic Acids Res. 28(18):E83)。為了確保每個文庫成員只有一個突變，產生兩個突變掃描文庫：一個用於HC，另一個用於LC。例如，若突變掃描位於HC CDR中，則LC序列保持不變。
使用mRNA顯示進行突變掃描文庫的活體外選擇，使用先前描述之方法將個別成員製成mRNA-蛋白質融合分子(Xu L等人(2002) Chemistry & Biology 9: 933；Roberts RW and JW Szostak (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297；Kurz等人(2000) Nucleic Acids Res. 28(18):E83)。在選擇之前，將各文庫之融合分子的等分試樣留出用於下游分析(「輸入」)。然後選擇文庫在pH 7.4及pH 6下與1 nM生經生物素標記之人類PAD4結合，並使用KOH自鏈黴抗生物素蛋白溶離結合成員。最後，擴增溶離份分子的cDNA部分以及輸入溶離份，以便藉由次世代定序(NGS)進行分析。
利用配對末端2×300運行對重鏈或輕鏈文庫進行定序。將正向與反向讀段配對，修剪品質得分Q≥30，按個別樣本及選擇條件的條碼進行分組，過濾全長HC或LC序列，並過濾野生型或僅含有HC或LC之CDR內單一突變取代的變異體。不符合上述標準的序列被排除在進一步分析之外。將溶離份中各文庫成員之頻率除以輸入溶離份中各文庫成員之頻率，以得出富集比(ER)。該值進一步針對野生型序列的值進行標準化，以允許將各變異體與親本序列進行比較，以評估該位置處特定取代的耐受性。ER值接近或等於1 (亦即0.5 ＜ ER ＜ 1.5)的變異體具有中性突變，其中胺基酸取代耐受結合，而ER值小於0.5的變異體具有會不利地影響結合的突變。將計算出的文庫各個成員之ER比率以熱圖的形式表示，以便易於鑑別與野生型序列在pH 7.4下具有相當結合力的變異體，相反，與野生型序列在pH 6下相比，結合力降低。
B. 結果
基於熱圖分析(圖13A至圖13L)，選擇一組變異體以進一步表徵為完全IgG。此等變異體含有單一突變(其中ER在pH 6下顯示較弱的結合)或此類突變的組合，選擇此類突變之組合的目的係評估該組合是否會在pH 6下產生更大的結合損失。將所選突變放入基於植株13之抗體hz13-5中。其產生下表9中列出之31種變異體，並測試其與人類PAD4的pH依賴性結合。所列出之突變與基於植株13之抗體hz13-5相關。以下序列表中提供此等31種變異體的完全可變區序列。
| 表9. hz13-5 抗體之變異體。 | ||
| 抗體 | VH 突變 | Vk 突變 |
| hz13-5 VH P52aK | P52aK | 無 |
| hz13-5 VH I34H P52aK | I34H P52aK | 無 |
| hz13-5 VH I34H H35K P52aK | I34H H35K P52aK | 無 |
| hz13-5 VH I34H H35K | I34H H35K | 無 |
| hz13-5 VH I34H | I34H | 無 |
| hz13-5 VH H35K P52aK | H35K P52aK | 無 |
| hz13-5 VH H35K | H35K | 無 |
| hz13-5 VH H32W | H32W | 無 |
| hz13-5 VH D31H P52aK | D31H P52aK | 無 |
| hz13-5 VH D31H I34H P52aK | D31H I34H P52aK | 無 |
| hz13-5 VH D31H I34H H35K P52aK | D31H I34H H35K P52aK | 無 |
| hz13-5 VH D31H I34H H35K | D31H I34H H35K | 無 |
| hz13-5 VH D31H I34H | D31H I34H | 無 |
| hz13-5 VH D31H H35K P52aK | D31H H35K P52aK | 無 |
| hz13-5 VH D31H H35K | D31H H35K | 無 |
| hz13-5 VH D31H | D31H | 無 |
| hz13-5 VH P52aK::Vk_I30H | P52aK | I30H |
| hz13-5 VH_ I34H P52aK::Vk_ I30H | I34H P52aK | I30H |
| hz13-5 VH_ I34H H35K P52aK::Vk_I30H | I34H H35K P52aK | I30H |
| hz13-5 VH_ I34H H35K::VK_I30H | I34H H35K | I30H |
| hz13-5 VH_ I34H::Vk_I30H | I34H | I30H |
| hz13-5 VH_ H35K P52aK::Vk_I30H | H35K P52aK | I30H |
| hz13-5 VH_ H35K::Vk_ I30H | H35K | I30H |
| hz13-5 VH_ D31H P52aK::Vk_ I30H | D31H P52aK | I30H |
| hz13-5 VH_ D31H I34H P52aK::Vk_ I30H | D31H I34H P52aK | I30H |
| hz13-5 VH_ D31H I34H H35K P52aK::Vk_ I30H | D31H I34H H35K P52aK | I30H |
| hz13-5 VH_ D31H I34H H35K::Vk_ I30H | D31H I34H H35K | I30H |
| hz13-5 VH_ D31H I34H::Vk_I30H | D31H I34H | I30H |
| hz13-5 VH_ D31H H35K P52aK::Vk_ I30H | D31H H35K P52aK | I30H |
| hz13-5 VH_ D31H H35K::Vk_I30H | D31H H35K | I30H |
| hz13-5 VH_ D31H::Vk_I30H | D31H | I30H |
在上述測試之變異體中，僅一種變異體hz13-5 VH_D31H::Vk_I30H表現出與人類PAD4的pH依賴性結合。此突變體在pH 7.6下之結合活性與(未突變) hz13-5同人類PAD4的結合相當(參見圖13M)。儘管親本hz13-5保持在pH 6.0下結合，但突變hz13-5 VH_D31H::Vk_I30HpH 6.0下展現出與人類PAD4之結合損失。參見圖13N。
分析植株13 Fab之cryoEM結構以瞭解hz13-5 VH_D31H::Vk_I30H之pH依賴性結合的結構基礎。舉例而言，觀測到D31之側鏈與相鄰H32之側鏈相互作用(參見圖10)。D31亦與K30相鄰。HC中之此K30-D31-H32區域接近離胺酸環(PAD4之胺基酸510至526)之四離胺酸延伸段(PAD4之胺基酸519至522)。在酸性條件下，包含D31H突變之例示性抗PAD4將帶正電荷，並且K30-D31H-H32殘基將彼此排斥。該排斥將使PAD4-抗體相互作用失去穩定。在植株13 Fab之LC中，I30存在於疏水環境中。I30H突變將引入極性殘基於該疏水性環境中，其亦可使PAD4-抗體界面失去穩定。
實例15：抗PAD4植株13及植株20抗體展現低免疫原性
因為投與給患者的治療性蛋白質可以產生被患者的免疫系統識別為外來抗原的肽抗原，所以其可引發不期望的免疫反應，通常體現為抗藥物抗體(ADA)的產生。此過程的第一步係抗原呈現細胞(APC)(例如樹突細胞(DC))上的HLA II類分子與肽抗原結合。此肽主要組織相容複合物(MHC)複合物可由CD4 T細胞識別，其最終將誘導B細胞分化成漿細胞且導致ADA產生。
使用以下方法來表徵基於植株13之hz13-12抗體及基於植株20之hz20-7抗體之免疫原性。
A. 電腦模擬HLA結合方法
使用電腦模擬人類白血球抗原(HLA)結合工具，以藉由對覆蓋人類群體內之遺傳多樣性的多個HLA等位基因上跨越抗體的重疊15聚體的結合按順序排序來建模及預測抗原與MHC II類的結合(Wang等人，PLoS Comput Biol, 2008, 4(4): p. e1000048.)。
使用商業電腦模擬免疫原性風險評估演算法(Epivax)對跨8個人類HLA DRB1等位基因超型的肽MHC II類結合進行排序，以涵蓋人群中存在的＞90%的變異性(De Groot及Martin, Clin Immunol, 2009, 131(2): p. 189-201)。
B. 活體外DC-T細胞分析方法
在HLA II類分子結合肽抗原之後，產生針對治療性抗體之免疫反應的下一個關鍵步驟係CD4+T細胞的活化。此T細胞活化係由於識別抗原呈現細胞(APC)上的同源肽-MHC複合物(HLA)而發生的。使用不同的供體組進行活體外周邊血單核球(PBMC)分析，以基於分子在活體外刺激抗原特異性CD4+ T細胞的能力來確定分子是否含有功能性T細胞表位 (Joubert等人，2016, 11(8): p. e0159328)。
使用hz20-7、hz13-12、hz13-5及hz13-5 D31E進行關於能夠活化未處理T細胞之T細胞表位的活體外樹突狀細胞/T細胞(DC:T細胞)增殖分析。簡言之，藉由Ficoll (GE Healthcare, Chicago, IL)梯度離心分離來自健康志願者之PBMC，並使用聚合酶連鎖反應(PCR)擴增及與寡核苷酸探針(ProImmune, Sarasota, FL)雜交進行HLA分型。使用由與世界人口頻率非常匹配之HLA-DR II類等位基因構成的一組40個PBMC供體進行分析操作。
使用基於負向選擇珠粒之方法(Miltenyi Biotec Inc, Bergisch Gladbach, Germany)自PBMC中分離單核球，並在含有介白素(IL-4)及顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)之DC培養基(Lonza, Basel, Switzerland)中培養3天以產生未成熟的DC。將此等細胞用以下進行脈衝：(1)基於植株13之hz13-12抗體；(2)基於植株20之hz20-7抗體；(3) Avastin (抗VEGF單株抗體貝伐珠單抗)作為對照抗體，其展現低免疫原性(Hua等人，J Clin Pharmacol, 2014, 54(1): p. 14-22)；或(4) IL-21R mAb (AT-107，一種全人類抗IL-21R單株抗體)作為對照抗體，其展現出高免疫原性。過夜培養後，徹底洗滌細胞，並將細胞在含有TNF-α、IL-1β、IL-6及PGE2之培養基中培育過夜。
將2,000個經脈衝之成熟DC添加至用羧基螢光素琥珀醯亞胺酯(CFSE) (Invitrogen，Carlsbad，CA)標記的200,000個自體PBMC中以監測增殖，並使用六個複本及含有筆式鏈球菌(pen-strep)的DC培養基(Gibco, Waltham, MA)鋪於96孔盤中。在七天之後，洗掉培養基且用抗人類CD4+ APC (BD Biosciences, San Jose, CA)單株抗體標記細胞。藉由洗滌步驟移除未結合抗CD4單株抗體。以含3.7%福馬林(Sigma, St. Louis, MO)之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)固定細胞，並以流動式細胞測量術進行分析，以確定增殖抗原特異性CD4+ T細胞的百分比。
C. 免疫原性結果
電腦模擬免疫原性結果顯示於表10中。此等結果表明人源化抗PAD4抗體具有低免疫原性風險。發現抗PAD4抗體的免疫原性低於各種商業抗體(參見表格底部的比較抗體)。
| 表 10. 電腦模擬免疫原性結果。 | |||
| 抗體 | Epivax HC | Epivax LC | Epivax Ab 免疫原性等級 |
| hz20-1 | -39.86 | -21.44 | 0.72% |
| hz20-2 | -40.29 | -34.61 | 0.19% |
| hz20-3 | -35.73 | -34.61 | 0.30% |
| hz20-4 | -41.95 | -21.44 | 0.58% |
| hz20-5 | -29.51 | -21.44 | 1.72% |
| hz20-6 | -17.96 | -34.61 | 1.67% |
| hz20-7 | -39.72 | -22.61 | 0.70% |
| hz20-8 | -39.72 | -17.97 | 1.49% |
| hz20-9 | -39.24 | -22.61 | 0.84% |
| hz20-10 | -39.24 | -17.97 | 1.71% |
| hz20-11 | -36.86 | -22.61 | 1.79% |
| hz20-12 | -36.86 | -17.97 | 3.04% |
| hz20-13 | -36.85 | -22.61 | 1.80% |
| hz20-14 | -36.85 | -17.97 | 3.05% |
| hz13-1 | -69 | -47.81 | 0% |
| hz13-2 | -69 | -35.19 | 0% |
| hz13-3 | -69 | 2.71 | 0.35% |
| hz13-4 | -54.33 | -47.81 | 0% |
| hz13-5 | -54.33 | -35.19 | 0% |
| hz13-6 | -54.33 | 2.71 | 1.45% |
| hz13-7 | -46.85 | -47.81 | 0% |
| hz13-8 | -46.85 | -35.19 | 0% |
| hz13-9 | -46.85 | 2.71 | 2.40% |
| hz13-10 | -41.88 | -11.22 | 1.49% |
| hz13-11 | -42.12 | -9.85 | 1.51% |
| hz13-12 | -42.12 | -11.22 | 1.38% |
| hz13-5 D31E | -55.30 | -37.60 | 0% |
| Campath | 45% | ||
| Rituxan | 27% | ||
| Zenapax | 14% | ||
| Humicade | 7% | ||
| Mylotarg | 2.90% | ||
| Avastin | 0% |
活體外分析結果顯示於圖14中。此等結果類似地指示hz20-7及hz13-12表現出低免疫原性。
在使用一組不同的40個健康PBMC供體之活體外DC-T細胞分析中，hz20-7、hz13-12、hz13-5及hz13-5 D31E抗體分別在7.5%、5%、18%及10%供體中顯示CD4+ T細胞增殖性反應。參見圖14。hz20-7、hz13-12及hz13-5 D31E之結果與低對照單株抗體(Avastin，貝伐珠單抗)的3.5%相當，其已表明在臨床上具有低免疫原性。hz13-5之18%反應速率雖然高於Avastin的歷史範圍(5至12.5%)，但仍屬於低免疫原性風險範圍(＜20%)。(Hua, F.、Comer, G. M.、Stockert, L.等人Anti-IL21 receptor monoclonal antibody (ATR-107): Safety, pharmacokinetics, and pharmacodynamic evaluation in healthy volunteers: A phase I, first-in-human study. The Journal of Clinical Pharmacology, 2014, 54: 14-22. doi:10.1002/jcph.158)。
高對照單株抗體(ATR-107)在41%的供體中顯示CD4+增殖，並且在臨床研究中已顯示具有76%的高ADA速率。(Hua, F, Comer, G M, Stockert, L等人Anti-IL21 receptor monoclonal antibody (ATR-107): Safety, pharmacokinetics, and pharmacodynamic evaluation in healthy volunteers: A phase I, first-in-human study. The Journal of Clinical Pharmacology. 2014,54:14-22)。
基於電腦模擬序列分析及活體外DC:T細胞增殖分析，hz20-7、hz13-12、hz13-5及hz13-5 D31E抗體在人類中引發針對抗體的不期望的免疫反應的風險被確定為低。
實例16：抗PAD4抗體hz13-5及hz13-5 D31E在活體外抑制PAD4活性
接下來測試抗體在活體外抑制受質上PAD4之活性的能力。
A. ELISA方法
將微量滴定盤(96孔Nunc MaxiSorp™ ELISA盤；Thermo Fisher Scientific目錄號44-2404-21)在PBS中用藉由GenScript® (SHQEST
RGKSKGKAAAAA; SEQ ID NO: 232)合成之1 μg/ml含有精胺酸之線性肽塗佈，且在4℃下培育過夜。用ELSA洗滌緩衝液(Cayman目錄號400062, 目錄號400035)洗滌培養盤三次。在含有50 mM NaCl、2 mM CaCl
2、1 mM DTT (Invitrogen，目錄號P/N 46-2250)及25 mM HEPES (Gibco目錄號15630-080)的緩衝液中，以13.5 nM (1 µg/mL)、27 nM、54 nM及108 nM (8 µg/mL)的濃度預培育重組人類PAD4 (rhPAD4) (Cayman Chemical #10500, Ann Arbor, MI)。然後將各預培育溶液與等體積的抗PAD4抗體hz13-5 D31E或同型對照抗體hIgG1.3f混合，在分析緩衝液中連續稀釋以達到在0.13 nM至66.7 nM範圍中的抗體濃度。將重組PAD4及抗體混合物在4℃培育60 min。將100 μl各反應物添加至肽塗佈之微量滴定盤的各孔中。將培養盤在37℃培育過夜，且隨後用洗滌緩衝液洗滌三次，且用阻斷緩衝液(Invitrogen目錄號DS98200)阻斷1小時，然後用洗滌緩衝液進一步洗滌各孔，並與100 µl辣根過氧化物酶(HRP)結合之抗瓜胺酸單株抗體植株1D9 (Cayman chemicals, 目錄號30773, 1:2000於PBS-0.05% Tween®-20中)一起在室溫下培育1.5小時。隨後，在洗滌緩衝液中洗滌培養盤三次且與過氧化酶受質(TMB)一起培育。30分鐘後，藉由添加2N硫酸(VWR目錄號VW3500-1)停止色彩反應 使用SpectraMax™ 190在450 nm處量測光密度(OD)。使用Soft Max Pro™ 7.1獲取數據。
按照製造商的方案，使用HRP結合套組(Abcam目錄號ab102890)製得HRP結合之抗瓜胺酸單株抗體植株1D9。將10 μl改質試劑添加至90 μl抗瓜胺酸抗體中。將混合物直接添加至凍乾HRP混合液上。將小瓶在室溫下遮光靜置3小時。培育之後，添加10 μl淬滅試劑且輕輕混合溶液。結合物在30分鐘之後不經進一步純化即使用。
所有分析重複進行三次。所有數據均顯示為重複三次量測之平均值及範圍。抑制百分比係在減去背景OD之後藉由OD值相比於單獨的PAD4之指定濃度的降低百分比來計算的。結果呈現為IC50值，其係使用GraphPad® Prism 9.4.0 (GraphPad Software, San Diego, CA)計算。IC50係藉由非線性回歸曲線與One site - Fit logIC50擬合測定的。
B. hz13-5 D31E在活體外抑制PAD4
藉由瓜胺酸ELISA所測定，抗體hz13-5 D31E以劑量依賴性方式抑制PAD4活性。IC
50隨著rhPAD4之濃度增加而按比例增加。13.5 nM (1 μg/ml)及108 nM (8 μg/ml) rhPAD4之代表性曲線顯示於圖15中。對於13.5 nM、27 nM及54 nM的rhPAD4濃度而言，同型對照抗體顯示出對高達66.7 nM的rhPAD4沒有效果；且對於108 nM的rhPAD4濃度而言，顯示出對高達133 nM的rhPAD4沒有效果。重複該實驗三次。表11顯示實驗各輪的IC50，隨後是三輪操作的平均值及標準差，顯示hz13-5 D31E抑制所測試肽中精胺酸的瓜胺酸化，其中取決於rhPAD4的濃度，IC50值約為0.5至5.0 nM。
亦用hz13-5抗體(IC50為在13.5 nM rhPAD4下0.70+/-0.34至在108 nM rhPAD4下5.02+/-0.88)及用下文實例19中描述的抗鼠類PAD4抗體進行類似的實驗。
實例17：基於植株13之抗PAD4抗體減少瓜胺酸化組蛋白且減少細胞介素表現及分泌
| 表11. 抗PAD4 抗體hz13-5 D31E 之IC50 。 | ||||||
| rhPAD4 | 13.5 nM | 27 nM | 54 nM | 108 nM | ||
| IC50 (nM)第1輪 | 0.34 | 1.77 | 3.13 | 6.03 | ||
| IC50 (nM)第2輪 | 0.73 | 1.26 | 3.14 | 4.29 | ||
| IC50 (nM)第3輪 | 0.37 | 0.89 | 2.68 | 4.65 | ||
| 平均值 +/- SD | 0.48 +/- 0.22 | 1.31 +/- 0.44 | 2.98 +/- 0.26 | 4.99 +/- 0.92 | ||
在此實例中，分析抗PAD4抗體減少細胞外瓜胺酸化H3及細胞介素在經脂多醣(LPS)刺激之人類血液單核球中分泌的能力。
A. LPS刺激之單核球分析方法
測試數種基於植株13之抗體。正如在其他實例中(除非另有具體描述)，否則用IgG1.3f恆定區(SEQ ID NO: 178)轉換抗體型式。抗體如下(1) hz13-5、(2) hz13-5 D31E、(3) hz13-3、(4) hz13-12、(5) hz20-2、(6) hz20-7、(7)同型對照hIgG1.3f。
藉由免疫磁性負向選擇，使用EasySep™人類單核球分離套組(StemCell, 目錄號19359)自新鮮人類PBMC分離人類單核球(CD14+CD16-)。洗滌經分離之人類CD14+單核球且在分析培養基IMDM (Gibco, 目錄號31980-030)及10%胎牛血清(FBS)中培養。
將7×10
4個人類CD14+單核球添加至96孔u形底聚苯乙烯培育盤之各孔中。將單核球與不同濃度的基於植株13之IgG1.3f抗體或同型對照抗體及10 µg/mL LPS一起培育。各孔中之培育體積為200 µL。在37℃、5% CO
2下培育培養盤24小時。
收集上清液以藉由ELISA套組(Cayman Chemical, 目錄號501620)偵測細胞外瓜胺酸化組蛋白H3 (Cit-H3)且藉由Alphalisa (Perkin Elmer, 目錄號AL216)偵測所分泌GM-CSF及其他細胞介素。使用細胞裂解物分離mRNA，以藉由qRT-PCR進行基因表現。使用Excel及GraphPad Prism軟體分析數據。
B. 功能性結果
基於植株13之抗體以劑量依賴性方式減少細胞外Cit-H3之量(圖16A至圖16F)。抗體亦減少GM-CSF之分泌(圖17A至圖17F)及GM-CSF之基因表現(圖18A至圖18B)。抗體亦遏制諸如TNFα及IL-1β之其他細胞介素之分泌及基因表現(數據未示出)。
另外，初始成像研究亦顯示，抗PAD4抗體可進入經LPS刺激之單核球(參見下文實例18)。總體而言，該等結果表明此等抗體可以在細胞內發揮作用，從而抑制細胞介素之分泌及基因表現。
實例18：藉由單核球共內化抗PAD4抗體
因為抗PAD4抗體阻斷GM-CSF分泌及基因表現，故假設抗PAD4抗體必須進入細胞以結合PAD4。此實例描述抗PAD4抗體hz13-5 D31E在單核球中之成像，其表明該抗體被單核球內化。
A. 活細胞成像方法
使用Incucyte
®活細胞分析(Sartorius)即時收集及分析活細胞影像。使用StemCell Technologies的EasySep™單核球分離套組(目錄號19669)自含有EDTA之健康人類全血中分離CD14+單核球。
使用Incucyte
®Fabfluor-pH抗體標記染料(目錄號4812)標記抗體。將標記染料用100 µL無菌水復水，並與抗PAD4 hz13-5 D31E抗體或同型對照抗體以1:3的比率在不含酚紅的RPMI中於37℃一起培育15分鐘。
將CD14+單核球懸浮於含有250 nM Incucyte® Cytotox Green試劑(目錄號#4633)的Gibco不含酚紅的RPMI (目錄號11835030)中，並以50 mL細胞/孔鋪於Incucyte® Imagelock培養盤(目錄號4379)中。將標記之PAD4抗體、標記之同型對照或不含抗體的Fabflu染料添加至細胞中。在添加結合抗體後15分鐘時，將LPS (最終濃度為10 mM)或含有PBS之培養基添加至各孔中。將培養盤置於Incucyte®儀器中且每30分鐘以20×放大率掃描持續48小時。使用Incucyte
®軟體進行分析。
B. 活細胞成像結果
活細胞成像結果顯示hz13-5 D31E抗體由單核球內化(圖19A)。藉由紅色螢光FabFluor®-pH染料的出現隨時間推移的增加所指示，在酸性細胞區室(pH範圍為4.5至5.5；例如晚期胞內體)中偵測到Hz13-5 D31E (圖19A)。6小時後在單核球內偵測到hz13-5 D31E抗體(圖19B)。內化水準在培育24及48小時時逐漸增加(圖19B)。在存在及不存在LPS刺激下發生抗體內化(圖19B)。同型對照亦由單核球內化，但含量比PAD4抗體低(圖19B)。
此等結果指示抗PAD4抗體之內化。此實例及先前實例中所提供之結果表明抗PAD4抗體可以在單核球中細胞內起作用，從而遏制細胞介素基因表現及分泌。此等研究結果表明抗PAD4抗體可以阻斷PAD4 (細胞外與細胞內)之功能。
實例19：製備針對鼠類PAD4之抗體
A. 用於產生抗鼠類PAD4抗體之小鼠融合瘤方法
人類與小鼠PAD4 (mPAD4)之間的同源性為73%，且本文所揭示之抗人類PAD4 mAb (植株20及其衍生物以及植株13及其衍生物)未展現出與mPAD4之結合，由此需要單獨操作以鑑別小鼠替代抗體。進行的最初的嘗試係用昆蟲細胞中產生的重組HIS-TVMV-mPAD4蛋白對Balb/C小鼠進行免疫。在未發現免疫反應之後，使用PAD4基因敲除C57bl/6小鼠。藉由每週6至9次注射與RIPA佐劑混合的相同蛋白質免疫原對12隻動物進行免疫。收集脾臟且均勻化以獲得脾細胞。
藉由與小鼠骨髓瘤融合搭配物SP2/0-Ag14 (ATCC CRL-1581™)電融合來產生融合瘤。將融合細胞鋪至選擇性HAT培養基中之多孔盤中持續6至10 天，且隨後藉由ELISA及HTRF篩選抗體分泌及與HIS-TVMV-mPAD4抗原的結合。此等融合產生467個特異性結合至小鼠PAD4 (mPAD4)蛋白質之親本融合瘤。然後對選定的融合瘤進行一輪次選殖並再評估抗原結合。擴增124個陽性融合瘤次殖株，並純化其抗體，以便藉由SPR及功能性小鼠PAD4 (mPAD4)酶阻斷分析進一步表徵。
B. 抗鼠類PAD4抗體之表徵方法
SPR 方法。一般而言，SPR方法係如上實例3中所描述，具有以下修改。使用的抗鼠類捕捉表面係藉由按照製造商的胺偶合方案(Cytiva目錄號BR-1006-33)將抗鼠類捕捉抗體(Cytiva目錄號BR100838)固定至CM5生物感測器之流動槽上來製備的。SPR實驗係在37℃下使用HBS-P (150 mM NaCl、10 mM HEPES，pH 7.6、0.05% Tween-20) (TEKNOVA目錄號H8032)以及額外的500 mM NaCl及2 mM CaCl
2作為操作緩衝液進行。使用操作緩衝液製備自0.8 nM至150 nM的數種濃度的PAD4。量測抗體與PAD4之締合及解離。兩次90秒注射10 mM甘胺酸(pH 1.7)用於再生抗鼠類捕捉表面。
酶促抑制分析。在酶促阻斷分析中測試抗體對於針對受質TSTGGRQGSHH (SEQ ID NO: 216)的鼠類PAD4活性之抑制。PAD4將肽受質TSTGGRQGSHH中之精胺酸轉化為瓜胺酸。使用TSTGGRQGSHH測試抗體，以確定其是否能夠抑制PAD4的活性，從而減少瓜胺酸產物的形成。此反應可經由RapidFire™質譜(Agilent)監測。一般而言，與此分析有關之材料及方法係如以上實例4中所描述，具有以下修改：(1)分析條件如下：50 nM重組mPAD4 (Cayman Chemical, 目錄號28910)、500 µM TSTGGRQGSHH肽及2 µl抗體溶液；(2)在微量滴定盤中製備反應混合物之後，在室溫下培育混合物90分鐘。
C. 結果
發現篩選獲得的超過80種抗體具有100 nM或更低的K
D值，而此等所測試抗體中之56種顯現出80%或更高的mPAD4抑制。自此等56種抗體中選擇一種抗體mumAb以用於本文所描述之後續實驗，並將型式轉換為mIgG1-D265A。使用上述SPR及酶促阻斷分析確定所選抗體的功能特徵，並且結果提供於下表12中。
| 表12. 小鼠抗mPAD4 mumAb 抗體之結合動力學。 | |||
| ka (1/Ms) | kd (1/s) | K D(nM) | IC50 (nM) |
| 2.9E+05 | 2.0E-04 | 0.7 | 13.2 |
所選的小鼠抗mPAD4抗體具有如下序列表中列出的重鏈及輕鏈可變區序列以及CDR序列。
實例20：抗鼠類PAD4鼠類抗體調節急性肺部發炎模型中之活體內PAD4活性
使用LPS急性肺部發炎(ALI)藥物動力學(PK)-藥效學模型來測定所選抗mPAD4鼠類抗體mumAb (參見實例19)在患有急性肺部發炎之野生型(WT)小鼠的活體內活性。LPS誘導之肺部發炎及關節發炎模型有助於確定關節及非關節組織中mPAD4與hPAD4抗體的Pk/PD關係。
A. 與鼠類ALI模型相關之方法
藉由皮下(SC)注射抗PAD4抗體(n = 6)、同型對照抗體(IC) (n = 6)或媒劑(n = 6)來處理C57Bl/6 WT小鼠(n = 總共24)(第-1天)。藉由以30 mg/kg或100 mg/kg sc注射投與抗體。以100 mg/kg投與IC。在投與抗體/媒劑一天後(亦即第0天)，用2 mg/mL LPS (Sigma)對小鼠進行霧化。一組小鼠(n=6)係以PBS代替LPS進行處理，並被指定為未處理小組。霧化後48小時，自肺部收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)。將BALF樣本離心，並藉由LC/MS量測上清液中之細胞外瓜胺酸化組蛋白3 (Cit-H3)作為藥效學(PD)讀數。細胞外Cit-H3的抑制%係藉由比較經mumAb處理之小鼠中的細胞外Cit-H3的量(表示為瓜胺酸化H3的量與總H3的比率，如圖20中所示)與經IC處理之小鼠中的細胞外Cit-H3的量來確定。mumAb的功效係藉由細胞外瓜胺酸化組蛋白-3 (Cit-H3)的減少% (圖20中的抑制%)反映。
B. 抗鼠類PAD4鼠類抗體減少LPS ALI模型中的瓜胺酸化
測試抗鼠類PAD4 mAb mumAb在LPS ALI模型中抑制PAD4功能的能力，其係由在BALF中細胞外Cit-H3的減少反映(圖20) 當與用IC抗體處理之小鼠的BALF相比時，用30 mg/kg mumAb處理之小鼠的BALF中Cit-H3減少約74%，且用100 mg/kg mumAb處理之小鼠的BALF中Cit-H3減少約83% (圖20)。在未處理小組中未量測到細胞外Cit-H3。
此等結果顯示抗PAD4抗體減少BALF中H3的瓜胺酸化，並表明抗PAD4抗體抑制PAD4在發炎肺部中起作用。
實例21：抗鼠類PAD4鼠類抗體調節急性關節發炎模型中之活體內PAD4活性
使用LPS急性關節發炎(AJI)藥效學(PD)模型來測定抗鼠類PAD4鼠類抗體(mumAb)在WT小鼠關節中的活體內活性。
A. 與鼠類AJI PD模型相關之方法
藉由如以上實例20中所述之皮下(SC)注射抗PAD4抗體或同型對照抗體(IC)處理C57Bl/6 WT小鼠，且進行以下修改。
以1 mg/kg、5 mg/kg、220 mg/kg或100 mg/kg投與抗PAD4抗體。以100 mg/kg投與IC。抗體/媒劑處理後的第二天(亦即第0天)，藉由關節內注射(ia)向每隻小鼠投與50 μg LPS。48小時後，自髕骨及滑膜中提取細胞外蛋白質。自膝關節切下小鼠髕骨及滑膜，並在37℃用培養基外植3小時。此等方法步驟顯示於圖21A至圖21B中。
製備髕骨外植體勻漿，並藉由LC/MS測定此等勻漿的上清液的細胞外Cit-ITIH4和Cit-PRG4作為PD讀數。將細胞外Cit-ITIH4及Cit-PRG4的減少%確定為經抗PAD4抗體處理之小鼠中細胞外Cit-ITIH4及Cit-PRG4 (相對於相關蛋白質的總量表示)與經IC處理之小鼠中細胞外Cit-ITIH4及Cit-PRG4的百分比。
B. 抗鼠類PAD4鼠類抗體減少LPS AJI模型中的瓜胺酸化
測試抗鼠類PAD4 mAb (mumAb)抑制PAD4在LPS AJI起作用的能力，其係藉由髕骨外植體上清液中細胞外Cit-ITIH4及Cit-PRG4的減少所反映(圖22A至圖22B)。用抗PAD4抗體處理的小鼠顯示Cit-ITIH4減少高達70% (圖22A)及Cit-PRG4減少高達97% (圖22B)。
此等結果表明抗PAD4抗體顯著降低髕骨外植體上清液中ITIH4及PRG4的瓜胺酸化，並指示抗PAD4抗體抑制PAD4在急性發炎關節中起作用。
實例22：抗鼠類PAD4鼠類抗體調節慢性關節發炎模型中之活體內PAD4活性
使用LPS慢性關節發炎(CJI)藥效學(PD)模型來測定抗鼠類PAD4鼠類抗體(mumAb)在WT小鼠關節中的活體內活性。
A. 與鼠類CJI PD模型相關之方法
一般而言，此實例中所用之方法係如以上實例21中所描述，具有以下修改。
與AJI模型不同，對小鼠進行三輪抗體及LPS注射處理，以模擬慢性關節發炎病狀。在每一輪中，在LPS ia注射前一天藉由SC注射投與抗PAD4抗體及IC (圖21A)。在第-1、5及11天投與此等注射。在每次用抗PAD4抗體或IC處理後的第二天，藉由ia注射投與50 μg LPS (亦即，在第0、6及12天(圖21A至圖21B))。第三次LPS ia注射後48小時，製備髕骨外植體勻漿，並分析此等勻漿的上清液的細胞外Cit-ITIH4及Cit-PRG4。
B. 抗鼠類PAD4鼠類抗體減少LPS CJI PD模型中的瓜胺酸化
測試抗PAD4抗體抑制PAD4在LPS CJI模型中起作用的能力，其係藉由髕骨外植體上清液中細胞外Cit-ITIH4及Cit-PRG4的減少所反映(圖23A至圖23B)。用抗PAD4抗體處理的小鼠顯示Cit-ITIH4減少高達88% (圖23A)及Cit-PRG4減少高達97% (圖23B)。來自經1 mg/kg或更多抗PAD4抗體處理之小鼠的樣本顯示Cit-PRG4減少94%或更多(圖23B)。
此等結果表明抗PAD4抗體顯著降低髕骨外植體上清液中ITIH4及PRG4的瓜胺酸化，並指示抗PAD4抗體抑制PAD4在慢性發炎關節中起作用。
實例23：抗鼠類PAD4鼠類抗體調節姥鮫烷誘導之腹膜炎模型中之活體內PAD4活性
測試抗鼠類PAD4 mumAb在短期藥效學(PD)模型中抑制數種活體內PAD4依賴性反應之能力。
A. 用於小鼠處理及姥鮫烷攻擊之材料及方法
在此實例中所描述之研究中使用以下材料及儀器。(1) 姥鮫烷；Sigma；目錄號P2870-100 ml。(2)雌性BALB/c小鼠，10至12週齡。(3)抗PAD4 ab mumAb。(4)同型對照抗體(IC)。(5) 1×PBS，其含有4 mM EDTA pH 7.4；Teknova；目錄號P0203。(6) ACK裂解緩衝液；Gibco；目錄號A10492-01 100 ml。(7) MACS緩衝液；Macs Militenyi Biotec；目錄號130-091-221。(8)標準FACS抗體。(9) Luna-II自動細胞計數器；Logos Biosystems。(10) 96孔U形底培養盤。(11)胎牛血清(FCS)；Summit；目錄號S-100-050；(12) DPBS；Gibco；目錄號14190。(13) FACS管；BD Biosciences；目錄號352063。(14) 40-µM組織過濾器；BD Falcon；目錄號352350。(15) GentleMACS C TUBES；Millitenyi；目錄號130-096-334。(16)固定及滲透溶液；BD Biosciences；目錄號554722。(17) Fc阻斷物；ebiosciences；目錄號14-0161-86。(17)多組織解離套組；Miltenyi；目錄號130-110-203。(19) AF647結合套組；abcam；目錄號AB269823。(19) AF488結合套組；abcam。
使用10至12週齡之BALB/c雌性小鼠。基於體重將小鼠隨機分為5個處理組，如下表13中所示。
| 表 13. BALB/c 小鼠之處理組。 | ||
| 小組編號 | n | 描述 |
| I | 6 | 未處理小組 |
| II | 6 | 經由sc注射用100 mg/kg同型對照(IC)處理 |
| III | 6 | 用mumAb處理；經由sc注射10 mg/kg |
| IV | 6 | 用mumAb處理；經由sc注射30 mg/kg |
| V | 6 | 用mumAb處理；經由sc注射100 mg/kg |
分別以10 mg/kg、30 mg/kg及100 mg/kg向第III組、第IV組及第V組中之小鼠投與mumAb。在第-1天，亦即在姥鮫烷攻擊之前24小時投與治療。在無菌PBS中製備mumAb。用100 mg/kg IC處理第II組小鼠。所有治療之給藥體積為每公斤體重10 mL。
經由腹膜內(ip)注射向小鼠投與姥鮫烷(亦即，姥鮫烷攻擊)。在第0天，亦即在用mumAb處理後24小時向第II組至第V組之小鼠投與500 μl姥鮫烷。第I組小鼠接受生理鹽水之ip注射。
在姥鮫烷攻擊之後16小時，麻醉小鼠，且收集血漿樣本。亦使小鼠安樂死，且藉由ip注射投與2 mL PBS-EDTA溶液。對小鼠之腹部進行按摩持續20至30秒。接著，使用2 mL注射器將2 mL經注射PBS-EDTA溶液連同腹膜液及細胞一起抽吸。
將腹膜液和細胞轉移至離心管中並保存在冰上直至處理。將腹膜液及細胞樣本在1500 rpm及4℃下離心5 min。將樣本的上清液儲存在-80℃，直至藉由ELISA進一步分析細胞外Cit-H3、細胞外PAD4、髓過氧化物酶(MPO)及嗜中性球彈性蛋白酶(NE)。使用Luminex®分析量測血漿及腹膜液樣本中的細胞介素及趨化介素含量。
在一些情況下，必要時用紅血球(RBC)裂解緩衝液裂解腹膜細胞沈澱團，在MACS緩衝液中洗滌，並在4℃下以1500 rpm離心5 min。使用細胞計數器，諸如Luna-II自動細胞計數器記錄腹膜細胞計數。在一些情況下，將腹膜細胞沈澱團再懸浮於MACS緩衝液中，並分成單獨的集合(panel)，以進行NETois/METosis及瓜胺酸化染色。
B. NETosis/METosis及瓜胺酸化染色方案及材料
MEtosis係自單核球或巨噬細胞釋放由散佈著組蛋白及細胞蛋白的細胞DNA組成的細胞外陷阱的過程。此種由METosis或NETosis (嗜中性球起源)形成的網狀物質對於防禦微生物很重要，而且亦係自體免疫病理學及無菌發炎的主要驅動因素。藉由Sytox Green™ (SG)、髓過氧化酶(MPO)及嗜中性球評估NETosis。藉由SG、MPO及單核球／巨噬細胞評估METosis。
SG/MPO之染色程序(集合1-表面集合-NETosis/METosis)如下。
| 表 14. 流式集合 1 。 | ||
| 螢光團 | 標記物 | 目錄號 |
| FITC | Sytox Green | S7020, Thermo Fisher |
| 未結合 | MPO | A039829-2, Agilent Dako |
| R-藻紅素親和純化F(ab') 2片段驢抗兔IgG (H+L) (PE) | 二級抗體 | 711-116-152, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. |
| APC CY7 | Ly6G | 127624, Biolegend |
| AF700 | CD45 | 103128, Biolegend |
| BV421 | CD11B | 101236, Biolegend |
| BV510 | ZA | 423102, Biolegend |
| BV605 | Ly6C | 128036, Biolegend |
| Pecy7 | F4/80 | 123114, Biolegend |
將細胞與Fc阻斷物一起在冰上培育15 min (每個樣本1 µL小鼠Fc阻斷物)且用50 µL於MACS緩衝液中製備之表面染色抗體混合液在冰上染色15 min。
Sytox Green™工作溶液係藉由將Sytox green儲備溶液進行1:3000稀釋以達到1.667μM的濃度來製備。
藉由將100μL DMSO添加至Zombie™ aqua小瓶中來製備Zombie™ aqua混合液。此溶液用於細胞之活/死染色。
添加50 µL Sytox™ green及50 µL Zombie™ aqua混合液，且將混合物在冰上進一步培育15 min。將染色樣本在1500 rpm及4℃下離心5 min。用MACS緩衝液洗滌培養盤兩次。
添加100 µL經稀釋之Cytofix™ (1份Cytofix™及4份MACS緩衝液)，混合且在冰上培育15 min。用MACS緩衝液洗滌細胞兩次且在4℃儲存於培養盤中過夜。
次日，用MACS緩衝液洗滌細胞。向各樣本中添加100 µL PE二級抗體(於MACS緩衝液中1:1000稀釋)且在冰上培育樣本30 min。
用Cytofix緩衝液(亦即1份Cytofix及4份MACS緩衝液)洗滌樣本兩次。將細胞在200 µL MACS緩衝液中復原。所有樣本均使用FACSCanto™流動式細胞測量術系統分析。
PAD4/檸Cit-H3之染色程序：集合2-細胞內集合-瓜胺酸化。
| 表 15. 流式集合 2 。 | ||
| 螢光團 | 標記物 | 目錄號 |
| FITC | PAD4-3D1 | 內部試劑 |
| AF647 | Cit-H3 | ab5103 |
| APC CY7 | Ly6G | 127624, Biolegend |
| BV421 | CD11B | 101236, Biolegend |
| BV510 | ZA | 423102, Biolegend |
| BV605 | Ly6C | 128036, Biolegend |
| AF700 | CD45 | 103128, Biolegend |
| Pecy7 | F4/80 | 123114, Biolegend |
| PerCP | CD206 |
將細胞與Fc阻斷物一起在冰上培育15 min，且將細胞用50 µL表面染色抗體混合液在冰上染色15 min。添加50 µL Zombie™ aqua混合液，且將樣本在冰上進一步培育15 min。將樣本在1500 rpm及4℃下洗滌兩次持續5 min。
向各樣本中添加150 µL Cytofix™/cytoperm。混合樣本且在冰上培育20 min。用MACS緩衝液洗滌細胞兩次且在4℃儲存於培養盤中過夜。
抗體結合方法。對於PAD4之結合而言，使用AF488結合套組將含100 µ gPAD4-3D1蛋白質之DPBS與AF488結合。進行結合反應過夜。對於Cit-H3之結合而言，使用AF647結合套組將含100 µg DPBS中之Cit-H3與AF647結合。進行結合反應過夜。
將細胞用200 µL來自AF488結合套組之1×滲透緩衝液在冰上滲透20至30 min。將細胞用含50 μL細胞內調配混合物(含有PAD4-F488、Cit H3-AF647及CD206)之1×滲透緩衝液在冰上染色30 min。
將樣本用MACS緩衝液洗滌兩次且在1500 rpm及4℃下離心5 min。將細胞在200 µL MACS緩衝液中復原。
所有樣本均使用FACSCanto™流動式細胞測量術系統分析且使用FlowJo® v.10分析數據。
C. 結果
如圖24A至圖24B中所示，抗PAD4 mAb顯著減少姥鮫烷誘導之細胞外陷阱形成嗜中性球(NETosis)及細胞外陷阱形成單核球(METosis)。類似地，mumAb處理導致總Cit-H3+嗜中性球及單核球的比例顯著降低(圖25A)以及Cit-H3+嗜中性球及單核球之的數目顯著減少(圖25B)。在M1巨噬細胞及M2巨噬細胞中，mumAb減少總Cit-H3+細胞(圖26A及圖26B，左圖)及CitH3之MFI (圖26A及圖26B，右圖)；在M2巨噬細胞中觀測到的作用更大(參見圖26A (M1巨噬細胞結果)及圖26B (M2巨噬細胞結果))。結果指示用抗PAD4 mAb治療減少發炎。
因為彈性蛋白酶用作嗜中性球NETosis的可溶性標記物並且MPO代表嗜中性球NETosis及單核球/巨噬細胞METosis兩者的可溶性標記物，所以在腹膜液中評估mumAb對此等標記物的影響。使用不同劑量的mumAb處理小鼠顯著降低自姥鮫烷處理之小鼠獲得之腹膜液中的彈性蛋白酶(圖27A)及MPO (圖27B)。mumAb亦減少腹膜液樣本中之趨化介素MIP-2α、GROα/KC、MCP1及MIP 1β，且MIP-2α的減少具有統計顯著性。mumAb亦顯著降低血漿樣本中的細胞介素IL6 (圖28B，左圖)及趨化介素MIP3α (圖28B，右圖)。
實例24：抗鼠類PAD4鼠類抗體調節膠原蛋白誘導之關節炎(CIA)模型中之活體內PAD4活性
使用預防性及半治療性劑量方案測試抗PAD4 mAb (mumAb)在膠原蛋白誘導之關節炎(CIA)模型中抑制疾病嚴重程度及數種PAD4依賴性反應的能力。
A. 用於小鼠處理之材料及方法
此實例中所用之材料及儀器係如以上實例23中所描述，具有幾種修改。在此實例中，不使用姥鮫烷。另外，使用13至14週齡雄性DBA1小鼠(Envigo USA)代替BALB/c雌性小鼠。
膠原蛋白溶液製備如下。藉由將30 µL冰醋酸添加至9.97 mL冰冷的MilliQ水中來製備0.05 M乙酸。將2.5 mL 0.05 M乙酸添加至含有10 mg II型牛膠原蛋白(Chondrex；目錄號20021)之小瓶中。將混合物在4℃儲存過夜以用於溶解。
膠原蛋白乳液製備如下。將含有Sigma Adjuvant System (Sigma Aldrich；目錄號S6322)及鹽水溶液之小瓶在37℃至40℃下培育10至15 min。使用1.0 mL注射器經由隔膜將0.5 mL鹽水添加至含有Sigma Adjuvant System之各小瓶中。將各小瓶充分渦旋至少2 min。將小瓶在37℃至40℃下再培育15 min。將0.5 mL膠原蛋白溶液添加至各小瓶中且使混合物渦旋1至2 min。
將此研究中所用之雄性DBA1小鼠分成6個不同小組。在開始實驗之前，使小鼠在暫留區域適應環境至少一週。
| 表16. DBA1小鼠之處理小組。 | ||
| 小組編號 | n | 描述 |
| I | 5 | 未處理小組 |
| II | 15 | 經由sc注射1×/週用100 mg/kg同型對照(IC)處理 |
| III | 15 | 用mumAb處理；經由sc注射，10 mg/kg；1×/週 |
| IV | 15 | 用mumAb處理；經由sc注射，30 mg/kg；1×/週 |
| V | 15 | 用mumAb處理；經由sc注射，100 mg/kg；1×/週 |
| VI | 10 | 用CTLA4-Ig處理；3 mg/kg，經由ip注射；2×/週 |
進行兩個獨立研究- (1)預防性研究及(2)半治療性研究。兩項研究共用同一初次免疫接種方案。在膠原蛋白免疫接種當天(第0天)，如上文所描述製備膠原蛋白乳液。使用異氟醚將DBA1小鼠麻醉。用70%異丙醇消毒各小鼠尾部，且在距尾底約1.0 cm至2.0 cm的2個區域中經由sc注射緩慢且堅決地投與100 µL乳液。
對於預防性研究而言，在第0天處理小鼠。用II型牛膠原蛋白對小鼠免疫。第0天開始，用含10 mg/kg、30 mg/kg及100 mg/kg mumAb之無菌PBS處理小鼠。在第0天經由sc注射每週一次向第III組、第IV組及第V組投與不同mumAb劑量(表16)。藉由皮下注射用IC (100 mg/kg)處理第II組中之小鼠(表16)。藉由ip注射一週兩次投與CTLA4-Ig (表16)。在第21天投與II型牛膠原蛋白之加打劑量。每週量測臨床評分及疾病發生率。
對於半治療性研究而言，如以上預防性研究中所述處理小鼠，並具有以下修改。在第21天而非第0天開始，用10 mg/kg、30 mg/kg及100 mg/kg mumAb處理小鼠。
每日觀測所有小鼠之任何異常行為。每週兩次評估症狀(亦即臨床評分)以及體重。在不同時間點收集血漿及/或血清樣本以確定預防性及半治療性研究之mumAb濃度。
在第44天終止兩項研究且將小鼠安樂死。捕捉第44天之臨床評分及腳爪重量。將小鼠抽血以獲得血漿及/或血清且儲存在-80℃用於各種分析。收集組織樣本(來自腳爪及髕骨)且立即處理以產生單細胞懸浮液以進行流動式細胞測量術。亦收集腳爪樣本以用於組織學、ELISA及其他分析。
B. 關節炎評分方法
根據以下量表對關節炎進行評分：(1)正常；(2)輕度，踝部或腕部有清晰紅腫，或僅限於個別足趾明顯紅腫，不論受影響的足趾有多少；(3)踝部或腕部中度紅腫；(4)包括足趾在內的整個腳爪嚴重紅腫；(5)肢體發炎最嚴重，涉及多個關節。
C. 處理腳爪樣本以進行流動式細胞測量術的方法
在預防性及半治療性研究結束時將小鼠安樂死。將發炎的後爪切斷(自脛跗關節)，收集在RPMI中，並保存在冰上。自發炎的後爪樣本去除皮膚。解剖脛腓骨、跗骨及蹠骨的末端。將足趾排除在處理之外。將發炎的關節及肌肉組織分成碎片並收集在MACS C管中。根據製造商的方案，使用多組織解離套組2 (Miltenyi；目錄號130-110-203)消化樣本。每樣本之總體積為5 mL。
使用pMACS octo解離器在37℃下進行組織消化。使樣本通過40 µm篩且收集於50 mL套管中。使用1×DPBS (Thermo Fisher；目錄號14190235)將各樣本之最終體積補足至25 mL。將樣本在1500 rpm及4℃下離心5 min。
將1 mL的ACK緩衝液(Thermo Fisher；目錄號A1049201)添加至各樣本的沈澱團中，充分混合，在室溫下培育1 min以用於RBC裂解。用1×DPBS將各樣本之體積補足至15 mL。將樣本再次在1500 rpm及4℃下離心5 min。
將各樣本沈澱團在0.5 mL MACS操作緩衝液(Miltenyi；目錄號130-091-221)中復原。將來自沈澱團之細胞染色進行組織學分析且根據下文所述之NETois/METosis及瓜胺酸化染色方案處理。
D. NETosis/METosis及瓜胺酸化染色方案及材料
用於SG/MPO之染色程序：集合1-表面集合-NETosis/METosis係如上文實例23中所描述。
PAD4/Cit-H3之染色程序：集合2-細胞內集合-瓜胺酸化係如上文實例23中所描述。
抗體結合方法係如上文實例23中所描述。
E. 組織學染色方法
將腳爪樣本用蘇木精及伊紅染色且進行組織學分析。
F. 處理小鼠後爪/關節以用於定量抗環狀瓜胺酸化肽抗體(ACPA)及ELISA之方法
在預防性及半治療性研究結束時將小鼠安樂死。將發炎的後爪切斷(自脛跗關節)，且收集在RPMI中，保存在冰上。用剪刀細分腳爪樣本，並將細碎的組織樣本收集在2 mL管中。將1 mL 1× RIPA緩衝液(Cell Signaling；目錄號9806)添加至各2 mL管中。每管亦添加一個金屬球。將2 mL樣本置放於組織裂解器II (Qiagen)中以進行珠粒均勻化。
在均勻化之後，將樣本在15000 xg及4℃下離心20 min。收集各樣本上清液，且隨後藉由ELISA分析(1)抗環狀瓜胺酸化肽抗體(ACPA；MyBioSource.com；目錄號MBS2607007)、(2) PAD4 (Cusabio；目錄號CSBFL017379MO)、(3) MPO (R&D Systems；目錄號DY3667)，及(4)嗜中性球彈性蛋白酶EA2 (R&D Systems；目錄號DY4517-05)。
G. 預防性研究之結果
如圖29A中所示，抗PAD4 mAb (mumAb)顯著降低關節炎臨床評分。疾病發生率及腳爪重量亦顯著降低(圖29B及圖29C)。mumAb亦減少免疫細胞之浸潤(圖30A至圖30E)。如圖31A至圖31B中所示，分別藉由SG+MPO+嗜中性球及SG+MPO+單核球/巨噬細胞評估，mumAb顯著減少NETosis及METosis。類似地，mumAb顯示總Cit-H3+嗜中性球、單核球及巨噬細胞之比例顯著降低(圖32A至圖32C)。
因為彈性蛋白酶及MPO代表嗜中性球及單核球/巨噬細胞的可溶性標記物，所以在腳爪勻漿中評估mumAb對此等標記物的影響。以不同劑量的mumAb處理小鼠顯著降低MPO及彈性蛋白酶(圖33B至圖33C)。亦顯著降低PAD4含量(圖33A)。
另外，藉由ELISA分析腳爪勻漿及血清樣本以進行ACPA偵測。mumAb顯示腳爪勻漿及血清中的ACPA顯著降低(圖34A)。類似地，抗CII Ab之力價亦顯著降低(圖34B)。mumAb亦顯示腳爪組織學評分顯著降低(圖35)。
H. 半治療性研究之結果
如圖36A中所示，mumAb顯著降低關節炎臨床評分。疾病發生率及腳爪重量亦顯著降低(圖36B至圖36C)。mumAb亦減少總免疫細胞及骨髓細胞之浸潤(圖37至圖37E)。此外，藉由SG+MPO+嗜中性球評估，mumAb顯著減少NETosis (圖38A)，並且藉由單核球及巨噬細胞指示，亦顯著減少METosis (圖38B)。類似地，mumAb顯著減少總Cit-H3+嗜中性球、單核球及M2巨噬細胞(分別為圖39A至圖39C)。
因為彈性蛋白酶及MPO代表嗜中性球及單核球/巨噬細胞的可溶性標記物，所以在腳爪勻漿中評估mumAb對此等標記物的影響。以不同劑量的mumAb處理小鼠顯著降低MPO及彈性蛋白酶(圖40B至圖40C)。亦顯著降低PAD4含量(圖40A)。
另外，藉由ELISA分析腳爪勻漿及血清樣本以進行ACPA偵測。mumAb顯示腳爪勻漿及血清中的ACPA顯著降低(圖41A)。類似地，抗CII Ab之力價亦顯著降低(圖41B)。mumAb亦顯示腳爪組織學評分顯著降低(圖42)。
實例25：抗人類PAD4抗體在LPS誘導之急性肺部發炎模型中之活性
使用LPS ALI PD模型測定抗人類PAD4抗體(Ab)在人類PAD4基因敲入(HU-PAD4KI)小鼠中之活體內活性。
A. 與鼠類ALI PD模型相關之方法
此實例中與鼠類ALI PD模型相關之方法係如以上實例20中所描述，並進行以下修改。使用C57Bl/6人類PAD4基因敲入(Hu-PAD4 KI)小鼠以及WT小鼠。此等小鼠均以下表17所示的0.24 mg/kg、1.2 mg/kg、6 mg/kg、3 mg/kg、10 mg/kg、30 mg/kg及/或100 mg/kg抗體處理。用100 mg/kg之同型對照鼠類抗體(IC mAb)處理對照小鼠。
B. 結果
測試抗人類PAD4 mAb植株13 (mAb13)及植株20 (mAb20)抑制PAD4在LPS ALI PD模型中起作用的能力。亦測試植株13之人源化衍生物(1) hz13-5及(2) hz13-12及植株20之人源化衍生物(1) hz20-2及(2) hz20-7。基於抗體對細胞外瓜胺酸化H3含量(相對於總細胞外H3)及細胞外瓜胺酸化ITIH4含量(相對於總細胞外ITIH4)的抑制來評估抗體的活性。與同型對照相比，所有此等抗體均在Hu-PAD4 KI小鼠中減少細胞外Cit-H3及細胞外Cit-ITIH4。
具體而言，mAb20在最低測試劑量(30 mg/kg)下使Hu-PAD4 KI小鼠中之細胞外Ci tH3減少41% (圖43A)。此活性對人類PAD4具有特異性，因為即使在100 mg/kg的劑量下，mAb20亦不會減少WT小鼠的細胞外Cit-H3。mAb20之人源化衍生物hz20-2 (圖43B)及hz20-7 (圖43C)在30 mg/kg下分別顯示細胞外Cit-H3減少12%及16%，且hz20-2在100 mg/kg下顯示細胞外Cit-H3減少48% (圖43B)。抗體hz20-2及hz20-7亦減少細胞外Cit-ITIH4。在30 mg/kg下，hz20-2 (圖43D)及hz20-7 (圖43E)使細胞外Cit-ITIH4分別減少80%及75%。
此外，mAb13減少Hu-PAD4KI小鼠中的細胞外Cit-H3，但不減少WT小鼠中的細胞外Cit-H3 (圖44A)。mAb13在30 mg/kg及100 mg/kg下分別使細胞外Cit-H3減少65%及70% (圖44A)。mAb13的第一種人源化衍生物hz13-12在減少細胞外Cit-H3方面同樣有效，證明在10 mg/kg下減少54%且在30 mg/kg下減少58% (圖44B)。藉由表明在6 mg/kg下減少86%及在30 mg/kg下減少95%，mAb13的第二種人源化衍生物hz13-5對細胞外Cit-H3減少具有甚至更大的影響(圖44C) 。類似地，hz13-12及hz13-5在6 mg/kg及更高之劑量下使細胞外Cit-ITIH4減少超過80% (圖44D至圖44E)。
結果顯示抗人類PAD4 mAb調節臨床前LPS ALI發炎模型中的PAD4功能。具體而言，抗體減少細胞外Cit-H3之含量。
表17概述細胞外Cit-H3及Cit-ITIH4之減少%，如圖43A至圖43E中及圖44A至圖44E中所示。
實例26：抗人類PAD4抗體在LPS誘導之急性關節發炎模型中之活性
| 表 17. 植株 13 及 20 親本及衍生物 Ab 在使用 Hu-PAD4KI 小鼠的 LPS ALI PD 模型中之活體內活性。 | ||||
| 抗體 | 濃度 | Cit-H3 減少 % | ITIH4 減少 % | |
| mAb20 | 30 | 41 | ND | |
| hz20-7 | 30 | 16 | 75 | |
| hz20-2 | 30 | 12 | 80 | |
| mAb13 | 30 | 65 | ND | |
| hz13-12 | 10 | 54 | 83 | |
| hz13-5 | 6 | 40 | 86 | |
| 數據顯示針對在LPS ALI PD模型中測試的植株13及20親本與衍生物的Cit-H3及Cit-ITIH4觀測到約50%抑制的濃度(或最大測試劑量)。「ND」表示未確定。 |
使用LPS誘導之AJI模型測定抗人類PAD4抗體(Ab)在人類PAD4基因敲入(HU-PAD4KI)小鼠之關節中的活體內活性。
A. 與LPS AJI模型相關之方法
與此實例中之LPS誘導之AJI模型相關之方法(圖45A至圖45B)係如以上實例21中所描述，並進行以下修改：使用C57Bl/6人類PAD4基因敲入(Hu-PAD4 KI)小鼠以及WT小鼠。在ia注射後的多個時間點，取出小鼠髕骨並外植以提取細胞外蛋白(圖45B)，並藉由LC/MS測定Cit-PRG4、Cit-ITIH4及hPAD4表現(圖45C至圖45E)。
在第一個實驗中，測試以下抗體：植株13之人源化衍生物hz13-5及hz13-12，及植株20之人源化衍生物hz20-2。經皮下用1 mg/kg、3 mg/kg、10 mg/kg、30 mg/kg或100 mg/kg的此等Ab處理小鼠。用100 mg/kg之同型對照鼠類抗體(IC mAb)處理對照小鼠。在第二個實驗中，測試hz13-5 D31E，並以最低投與劑量測試hz13-5。經皮下用0.1 mg/kg、1 mg/kg或30 mg/kg的hz13-5 D31E或用0.1 mg/kg的hz13-5處理小鼠。
B. 結果
首先，用不含抗體的LPS處理小鼠以確定量測瓜胺酸化蛋白表現量的理想時間範圍。在注射LPS後第2至3天觀測到Cit-PRG4、Cit-ITIH4及hPAD4的峰值表現量(圖45C至圖45E)。表現量在ia注射後第6天下降。因此，第2天被確定為測定Cit-PRG4及Cit-ITIH4蛋白表現的理想時間。
接下來，為了測試抗體抑制PAD4在LPS AJI PD模型中起作用的能力，如以上方法部分中所述且如圖45A至圖45B中所示投與抗體。基於植株13之hz13-12抗體(圖46A)、基於植株13之hz13-5抗體(圖46B)及基於植株20之hz20-2抗體(圖46C)以劑量依賴性方式降低Cit-ITIH4的相對含量。基於植株13之hz13-5具有最強的效果，其在1 mg/kg下減少81%且在30 mg/kg下減少95% (圖46B)。
在第一次實驗中，基於植株13之hz13-12抗體(圖47A)、基於植株13之hz13-5抗體(圖47B)及基於植株20之hz20-2抗體(圖47C)亦以劑量依賴性方式降低Cit-PRG4的相對含量。基於植株13之hz13-5具有最強的效果，其在1 mg/kg下減少83%且在30 mg/kg下減少100% (圖47B)。
在第二次實驗中，hz13-5 D31E及hz13-5兩者均抑制ITIH4 (圖48A)及PRG4 (圖48B)之瓜胺酸化。抗體hz13-5 D31E顯示對ITIH4及PRG4之瓜胺酸化的劑量依賴性抑制。
結果整體上指示抗人類PAD4 mAb抑制PAD4在此LPS誘導之AJI活體內模型中起作用。
實例27：治療性PAD4抗體在來自類風濕性關節炎患者之內源性PAD4抗體的存在下仍保持效力
A. 介紹
PAD4係透過嗜中性球活化、NETosis及細胞死亡在發炎關節中釋放至細胞外。PAD酶催化將精胺酸修飾為瓜胺酸殘基，並驅動瓜胺酸化新抗原的形成，該等抗原可被抗瓜胺酸化肽抗體(ACPA)識別，其係類風濕性關節炎之標誌。ACPA與瓜胺酸化蛋白之間形成的免疫複合物被認為會導致組織損傷並使發炎持續存在。除ACPA以外，約25至35%的RA患者表現抗PAD4 IgG，其中約20至40%會在PAD3/PAD4之間發生交叉反應，並可能增強PAD4活性，導致糜爛性更嚴重的疾病。在此實例中，在血清中或使用純化的免疫球蛋白G (IgG)研究內源性抗PAD4抗體的存在對抗體hz13-5 D31E效力的影響。
B. 材料及方法
a. 血清樣本
樣本係來自已確診疾病之類風濕性關節炎(RA)患者的血清樣本。將健康對照(NHV)的血清收集在BD Vacutainer SST採血管(目錄號367988)中。冷凍所有血清樣本直至等分於培養盤中。
b. PAD4抗體ELISA
按照製造商方案，使用來自Cayman Chemicals的PAD4自體抗體ELISA套組(500930)量測血清抗PAD4自體抗體。將血清樣本以1:150稀釋度在ELISA套組中提供的分析緩衝液中進行測試。
c. IgG純化
使用來自Thermo Scientific之Melon™凝膠IgG自旋純化套組(45206)來純化人類IgG。簡言之，將500 μl純化凝膠裝置至自旋管柱且用300 μl純化緩衝液洗滌兩次。用純化緩衝液將80 μl血清稀釋5倍且添加至含有自旋管柱之純化凝膠中。將管柱顛倒混合5分鐘並離心以收集經純化之IgG。使用來自Thermo Scientific之NanoDrop™ One儀器測定經純化IgG之濃度。
d. 瓜胺酸化H3酶促分析
所有試劑均針對100 µl最終反應進行計算。在42.5 μl體積中，將重組PAD4 (Cayman #10500)與經純化IgG在冰上一起預培育45分鐘。為了產生抑制曲線，將PBS或同型對照中的7.5 μl hz13-5 D31E系列稀釋液添加至PAD4/IgG混合物中且在冰上再培育45分鐘。添加含有氯化鈣之緩衝液中的組蛋白H3，且在培育箱中在37℃培育反應物(最終濃度：13.5 nM PAD4，2 mM CaCl2，10 µg/ml H3，100 µg/ml經純化IgG) 2小時。用10 μl 0.5 M EDTA停止H3瓜胺酸化反應。按照製造商方案，使用來自Cayman Chemicals的瓜胺酸化組蛋白H3 (植株11D3)ELISA套組(501620)量測瓜胺酸化之組蛋白H3。將瓜胺酸化樣本以1:100稀釋度在ELISA套組中提供的分析緩衝液中進行測試。
e. 誘導血清中之瓜胺酸化
為了產生抑制曲線，將PBS或同型對照中的7.5 μl hz13-5 D31E系列稀釋液添加至培養盤中的80 μl解凍血清中，混合，在CO
2培養箱中於37℃下培育6 h，然後在-80℃下儲存過夜。將含有與抗體混合之血清的培養盤解凍，且添加12.2 μl PAD4酶反應混合物(13.5 nM PAD4、100 mM Tris、2mM DTT最終)並在37℃下培育2 h。用10 μl 0.5 M EDTA停止反應。將培養盤密封且儲存於-80℃。
f. 藉由LC-MS量測瓜胺酸化肽
將十(10) µl血清解凍且用PBS稀釋15倍。使用含有20 µL CaptureSelect™人類白蛋白親和基質之CUSTOM PhyTip 200 µL CaptureSelect™人類白蛋白尖端(Biotage, San Jose, CA)，將六十(60) µl 15倍稀釋血漿用於耗乏人類血清白蛋白。將五(5) µl白蛋白耗乏血清與45 μl LYSE BCT緩衝液組合且在80℃加熱20分鐘。根據製造商方案，藉由添加胰蛋白酶及LysC對樣本進行酶促消化。使用preOmics BCT套組(目錄號P.O.00116)清除肽。
使用30分鐘prm-PASEF方法，在Bruker timsTOF質譜儀上藉由nanoLC-MS分析肽。使用Bruker NanoElute™ LC在AURORA ELITE (AUR-15075C18-CSI)管柱上進行層析分離。數據依賴性採集(DDA)數據係針對具有高PAD4濃度的樣本獲取的，並且針對每種感興趣之肽添加內標(重肽)。使用Skyline®軟體產生來自先前藉由全球蛋白質體學實驗鑑別之cit-蛋白質之cit-肽(瓜胺酸化肽)及未修飾肽序列的清單。接下來，Skyline®中之文庫係使用MaxQuant®生成的msms.txt、mqpar.xml及modifications.xml檔案產生的。在導入DDA數據且使用經導入數據以產生譜庫之後產生離子遷移率文庫。自Skyline®導出每種分析物的三個參數，以在TimsTOF Control 3.0軟體中建立prm-PASEF方法：滯留時間(RT)；離子遷移率(IM)及前驅體m/z。使用Skyline®工作流程分析數據。
g. IC50計算
IC50計算及統計係在GraphPad® Prism軟體中進行。將瓜胺酸化H3或瓜胺酸化%針對抗體濃度的對數進行繪圖，並進行非線性擬合(希爾斜率 = -1)。
C. 結果
a. PAD4抗體狀態
藉由ELISA評估來自21名RA患者及10名健康對照(NHV)之血清樣本中內源性PAD4自體抗體的存在。平均而言，RA中的OD顯著高於NHV中的OD (RA中為1.3對比NHV中為0.38，p＜0.0001，Mann Whitney T測試)。使用1作為陽性截止值，21份RA血清中有13份(62%)且沒有NHV血清可被視為抗PAD4 IgG+。圖49A顯示21個RA及10個NHV純化之IgG中藉由ELISA透過OD450量測的血清抗PAD4自體抗體。
b. 在經純化IgG存在下之Hz13-5 D31E效力
評估在來自21種RA及6種NHV血清的100 μg/ml經純化IgG的存在下hz13-5D31E抑制H3瓜胺酸化的效力(3個盤各自含有7個RA及2個NHV供體)。hz13-5 D31E在經純化之IgG的存在下抑制活體外PAD4驅動之H3瓜胺酸化，並且無論經純化之IgG來自RA抑或NHV血清，IC50沒有差異(圖49B，表18)，儘管事實上大部分RA IgG具有抗PAD4自體抗體。RA血清(n=21)之平均IC50 (nM)為8.2 (標準差為1.3)，而NHV血清(n=6)之平均IC50 (nM)為9.0 (標準差為2.5)。
c. RA患者血清中Hz13-5 D31E的效力
在添加或不添加不同劑量的hz13-5 D31E的情況下將21個RA及10個NHV供體的血清與13.5 nM PAD4一起培育以誘導瓜胺酸化。蛋白多醣4 (PRG4)、血纖維蛋白原A (FGA)、間-α-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4 (ITIH4)、α-1-微球蛋白/比庫寧前驅體(AMBP)及凝溶膠蛋白(GSN)中的5種所選肽的瓜胺酸化係藉由LC-MS量測且報導為瓜胺酸化占總肽的百分比。在所有具有供體間變異性的樣本中觀測到此等肽之瓜胺酸化。z13-5 D31E以劑量依賴性方式抑制此等肽中各者的瓜胺酸化，並且在NHV與RA之間效力類似(表18，透過Mann Whitney測試，NHV與RA之間沒有統計差異)。此外，藉由ELISA進行量測(圖49A)，任何IC50與抗PAD4自體抗體的存在(Spearman，未顯示)之間不存在相關性，表明內源性PAD4抗體的存在不影響hz13-5 D31E之效力。表18顯示hz13-5D31E對來自RA或NHV供體的5種血清肽之瓜胺酸化的IC50。SD係指標準差。表18中所示之序列自上而下分別為SEQ ID NO：236至240。
表 18
| 蛋白質 | 肽序列 (所評估之瓜胺酸化位點帶下劃線) | RA (n=21)之IC50 (nM)平均值(SD) | NHV (n=10)之IC50 (nM)平均值(SD) |
| PRG4 | AITT RSGQTLSK | 4.9 (3.5) | 4.4 (2.3) |
| FGA | QFTSSTSYN RGDSTFESK | 4.5(1.6) | 5.5(2.3) |
| ITIH4 | QLGLPGPPDVPDHAAYHPF RR | 5.2(1.5) | 5.7(2.6) |
| AMBP | GPC RAFIQLWAFDAVK | 4.3(1.0) | 5.1(2.1) |
| GSN | ATAS RGASQAGAPQGR | 7.1(3.6) | 7.7(9.3) |
透過兩次獨立的分析，在內源性抗PAD4自體抗體存在的情況下，在此一組21個RA血清樣本中未觀測到hz13-5D31E的效力變化。
實例28：抗PAD4抗體hz13-5 D31E與各種人類組織之交叉反應性研究
使用螢光素化hz13-5 D31E (hz13-5 D31E FITC)評估hz13-5 D31E與一組正常人類組織之潛在交叉反應性。將Hz13-5 D31E FITC以1 µg/mL及5 µg/mL應用於每個組織至少3個供體(若可用)的正常人體組織的冷凍切片。在此兩種濃度下，hz13-5 D31E FITC對人類周邊血液中常見的單核及多形核白血球的細胞質及細胞核進行中度至強烈染色。實驗表明，hz13-5 D31E FITC對大多數人類組織樣本中之多形核白血球的細胞質及細胞核進行染色，對淋巴結(主要是竇巨噬細胞)及周邊血液中的稀有單核白血球的細胞質進行染色，對脾中的網狀內皮細胞之細胞質進行染色。此等結果大體上與所報導的PAD4在周邊血液中顆粒球及單核球中的細胞質及細胞核中之表現一致。(Jones等人Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12(5): 616-27 (2009)；Vossenaar等人，Ann. Rheum. Dis. 63(4): 373-81；Zhou等人，Front. Immunol. 8: 1200 (2017))。此外，在所檢查的任何人類組織中均未觀測到膜與hz13-5 D31E FITC的結合。此等結果表明hz13-5 D31E FITC不會與正常人類組織發生交叉反應。
實例29：評估hz13-5 D31E抗體在人類全血中的活體外呼吸爆發及吞噬作用
在活體外人類全血分析中評估hz13-5D31E影響呼吸爆發及吞噬作用的可能性。
將嗜中性球與hz13-5 D31E或同型對照抗體(人類IgG1.3f抗體)一起培育，然後與經過調理之結合大腸桿菌生物顆粒在冰上一起培育不會誘導吞噬作用。在與hz13-5 D31E、同型對照或培養基對照一起培育，然後在37℃下與大腸桿菌生物顆粒一起培育之全血樣本的吞噬作用亦沒有差異。
呼吸爆發陽性對照PMA誘導來自所有供體之全血樣本中嗜中性球的呼吸爆發，其被呼吸爆發抑制劑山奈酚(Kaempferol)抑制。在測試濃度為0.128至400 µg/mL的hz13-5 D31E或同型對照抗體存在下，PMA不會誘導呼吸爆發。並且，hz13-5 D31E及同型對照抗體單獨在400 µg/mL濃度下不會誘導呼吸爆發，其係所測試的最高濃度，並且亦超過900 mg人體劑量中hz13-5 D31E的預測Cmax的兩倍。
此等結果表明，在此模型中測試的濃度下，hz13-5D31E對吞噬作用及呼吸爆發的先天免疫功能沒有影響。
實例30：PAD4抗體與檢查點抑制劑組合抑制活體內乳癌模型中的瓜胺酸化
使用4T1乳癌同基因型模型以在使用抗小鼠PAD4單株抗體(本文所描述之mumAb)或小分子PAD4抑制劑抑制或不抑制PAD4的情況下研究檢查點抑制劑之抗腫瘤活性。4T1模型描述於Teijeira等人(2020) Immunity: 56, 856-871中。當原位引入乳房脂肪墊時，腫瘤不僅在原發部位生長，而且還轉移至肝臟、肺臟及淋巴結。
將4T1細胞維持在含有10% FBS的RPMI-1640培養基中。向6至8週齡Balb/c小鼠的乳房脂肪墊皮下注射50 μL血清及無酚紅培養基中之5×10
4個細胞。植入後第7天開始每週進行腫瘤量測3次，且將動物隨機分為100 mm
3平均腫瘤體積之治療組(預期腫瘤範圍約70至150 mm
3)。
治療方案提供於下表19中。此研究中所用之治療包括：抗mPD-1抗體(aPD-1)，其為納武利尤單抗的鼠源化等效物；抗mCTLA-4抗體(aCTLA-4)，其為伊匹單抗之鼠源化等效物；小分子PAD4抑制劑GSK484；及PAD4抗體抑制劑(mumAb)；以及對照(GSK484稀釋液，mumAb同型對照)。表19中的第I組的小鼠接受針對KLH抗原(匙孔螺血氰蛋白)的同型對照抗體。表19之第2至7組接受表中所列的治療，其對應於各種抗腫瘤治療組合。分別以第四行中所列的劑量及第五行中所列的頻率投與第二行中所列的治療。第1至3組及第6至7組被設計為在較早時間點(植入後第19天)收集n=5個腫瘤以進行PD評估。監測所有小組中其餘n=15隻小鼠的腫瘤生長。
1aPD-1及aCTLA-4經IP投與、mumAb經SC投與；KLH =匙孔螺血氰蛋白
| 表 19. 治療方案 | |||||
| 小組 | 治療 | 小鼠編號 | 各相應治療之劑量mg/kg/天 | 各相應治療方案 | 途徑 |
| 1 | 對照KLH mIgG1 D265A + KLH mIgG2b + GSK稀釋液 | 20 | 10+10 | QWx3 + QWx3 + QDx7 | IP |
| 2 | aPD-1 + aCTLA-4 + GSK稀釋液 | 20 | 10+10 | QWx3 + QWx3 + QDx7 | IP |
| 3 | aPD-1 + aCTLA-4 + GSK484 | 20 | 10+10+ 5 | QWx3 + QWx3 + QDx7 | IP |
| 4 | aPD-1 + aCTLA-4 + 同型對照 | 15 | 10+10+100 | QWx3 + QWx3 + QWx3 | IP |
| 5 | aPD-1 + aCTLA-4 + mumAb | 15 | 10+10+30 | QWx3 + QWx3 + QWx3 | IP |
| 6 | aPD-1 + aCTLA-4 + mumAb | 20 | 10+10+100 | QWx3 + QWx3 + QWx3 | IP |
| 7 | aPD-1 + aCTLA-4 + mumAb | 20 | 10+10+100 | QWx3 + QWx3 + QWx3 | IP/SC 1 |
使用結果量度(i)腫瘤大小及(ii)來自切除之腫瘤的瓜胺酸化DNA的免疫組織化學來評估治療組之間的差異。與單獨的檢查點抑制劑治療相比，包括PAD4抑制劑之組合未顯示出改良之腫瘤生長抑制。值得注意的係，在aPD-1與aCTLA4之組合(該組合在此實例中稱為檢查點抑制劑雙聯體或CPI雙聯體)的第3劑之後(植入後第24天)，抗藥物抗體(ADA)的形成導致致命性全身性過敏反應。各組中用CPI雙聯體治療的小鼠均死亡，表明ADA並不針對mumAb。直至第三劑CPI雙聯體為止，小鼠的周邊暴露水準顯示出高於預測有效範圍的值。與對應的對照組(分別為第4組及第2組)相比，接受PAD4抑制劑mumAb (第5組、第6組及第7組)或GSK484 (第3組)的小組並未顯示出增強的腫瘤生長抑制。
在植入後第19天收集的小組中，觀測到腫瘤組蛋白H3瓜胺酸化的趨勢，與CPI雙聯體及同型對照(第4組)相比，第7組(100 mg/kg的高劑量aPAD4 mumAb以及CPI雙聯體的組合)中有顯著降低。此結果表明，投與足夠劑量的PAD4抗體可以抑制腫瘤中的瓜胺酸化。
參考文獻
R. Huang及G. Chen, Higher order structure characterization of protein therapeutics by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2014, 406, 6541-6558.
H. Wei, J. Mo, L. Tao, R. J. Russell, A. A. Tymiak, G. Chen, R. E. Iacob, J. R. Engen, Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry for probing higher order structure of protein therapeutics: methodology and applications. Drug Discovery Today, 2014, 19, 95-102.
L. M. Jones, J. B. Sperry, J. A. Carroll, M. L. Gross, Fast photochemical oxidation of proteins for epitope mapping. Analytical Chemistry, 2011, 83, 7657-7661.
H. Zhang, J. Wen, R. Huang, R. Blankenship, M. Gross, Mass spectrometry-based carboxyl footprinting of proteins: Method evaluation. International Journal of Mass Spectrometry, 2012, 312, 78-86.
C. Y. Tremblay, P. Limpikirati, R. W. Vachet. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2021, 32, 5, 1237-1248
Xu L等人(2002) Chemistry & Biology 9: 933
Roberts RW及JW Szostak (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297
Kurz等人. (2000) Nucleic Acids Res. 28(18):E83
Joubert, M.K.等人，Use of In Vitro Assays to Assess Immunogenicity Risk of Antibody-Based Biotherapeutics. PLoS One, 2016. 11(8): p. e0159328.
Wang, P.等人，A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach. PLoS Comput Biol, 2008. 4(4): p. e1000048.
De Groot, A.S.及W. Martin, Reducing risk, improving outcomes: bioengineering less immunogenic protein therapeutics. Clin Immunol, 2009. 131(2): p. 189-201.
Hua, F.等人，Anti-IL21 receptor monoclonal antibody (ATR-107): Safety, pharmacokinetics, and pharmacodynamic evaluation in healthy volunteers: a phase I, first-in-human study. J Clin Pharmacol, 2014. 54(1): p. 14-22.
Prometheus, 2012年7月, Proleukin® (aldesleukin), accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2012/103293s5130lbl.pdf.
Li, M., Lin, C., Deng, H., Strnad, J., Bernabei, L., Vogl, D. T., Burke, J. J., & Nefedova, Y. (2020). A Novel Peptidylarginine Deiminase 4 (PAD4) Inhibitor BMS-P5 Blocks Formation of Neutrophil Extracellular Traps and Delays Progression of Multiple Myeloma. Molecular cancer therapeutics, 19(7), 1530-1538. https://doi.org/10.1158/1535-7163.MCT-19-1020
Teijeira, Á., Garasa, S., Gato, M., Alfaro, C., Migueliz, I., Cirella, A., de Andrea, C., Ochoa, M. C., Otano, I., Etxeberria, I., Andueza, M. P., Nieto, C. P., Resano, L., Azpilikueta, A., Allegretti, M., de Pizzol, M., Ponz-Sarvisé, M., Rouzaut, A., Sanmamed, M. F., Schalper, K., … Melero, I. (2020). CXCR1 and CXCR2 Chemokine Receptor Agonists Produced by Tumors Induce Neutrophil Extracellular Traps that Interfere with Immune Cytotoxicity. Immunity, 52(5), 856-871.e8. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2020.03.001
Wang, Y., Liu, C., Zhang, N., Song, X., Song, Y., Cai, D., Fang, K., & Chang, X. (2022). Anti-PADI4 antibody suppresses breast cancer by repressing the citrullinated fibronectin in the tumor microenvironment. Biomedicine & pharmacotherapy = Biomedecine & pharmacotherapie, 153, 113289. Advance online publication. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2022.113289
Yazdani, H. O., Roy, E., Comerci, A. J., van der Windt, D. J., Zhang, H., Huang, H., Loughran, P., Shiva, S., Geller, D. A., Bartlett, D. L., Tsung, A., Sheng, T., Simmons, R. L., & Tohme, S. (2019). Neutrophil Extracellular Traps Drive Mitochondrial Homeostasis in Tumors to Augment Growth. Cancer research, 79(21), 5626-5639. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-19-0800
序列描述
下表提供本文中提及之某些序列的清單。在本文所揭示之抗體可變區序列中，重鏈可變區(VH) CDR1、CDR2和CDR3序列分別位於包含胺基酸26至35、50至65及95至102的Kabat位置，如圖1E中所示，該等位置對應於下表中SEQ ID NO: 10及SEQ ID NO: 78的胺基酸位置26至35、50至66和99至108，且輕鏈可變區(VL) CDR1、CDR2和CDR3序列分別位於包含胺基酸24至34、50至56及89至97的Kabat位置，如圖1F中所示，該等位置對應於下表中SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：80之胺基酸位置24至38、54至60及93至101。在某些VH及VL序列中，CDR序列呈粗體字，在一些情況下亦帶下劃線。在某些人源化抗體VH及VL序列中，構架區中之帶下劃線的胺基酸指示構架經回復突變成小鼠胺基酸。在某些全長重鏈及輕鏈序列中，可變區呈斜體。在某些突變恆定區序列中，與對應野生型序列相比發生變化的恆定區殘基係以粗體下劃線顯示。
| 序列表 . | ||
| ID NO. | 描述 | 序列 |
| 1 | 人類蛋白質精胺酸脫亞胺酶類型4 (huPAD4；UniProt ID: Q9UM07) | MAQGTLIRVTPEQPTHAVCVLGTLTQLDICSSAPEDCTSFSINASPGVVVDIAHGPPAKKKSTGSSTWPLDPGVEVTLTMKVASGSTGDQKVQISYYGPKTPPVKALLYLTGVEISLCADITRTGKVKPTRAVKDQRTWTWGPCGQGAILLVNCDRDNLESSAMDCEDDEVLDSEDLQDMSLMTLSTKTPKDFFTNHTLVLHVARSEMDKVRVFQATRGKLSSKCSVVLGPKWPSHYLMVPGGKHNMDFYVEALAFPDTDFPGLITLTISLLDTSNLELPEAVVFQDSVVFRVAPWIMTPNTQPPQEVYACSIFENEDFLKSVTTLAMKAKCKLTICPEEENMDDQWMQDEMEIGYIQAPHKTLPVVFDSPRNRGLKEFPIKRVMGPDFGYVTRGPQTGGISGLDSFGNLEVSPPVTVRGKEYPLGRILFGDSCYPSNDSRQMHQALQDFLSAQQVQAPVKLYSDWLSVGHVDEFLSFVPAPDRKGFRLLLASPRSCYKLFQEQQNEGHGEALLFEGIKKKKQQKIKNILSNKTLREHNSFVERCIDWNRELLKRELGLAESDIIDIPQLFKLKEFSKAEAFFPNMVNMLVLGKHLGIPKPFGPVINGRCCLEEKVCSLLEPLGLQCTFINDFFTYHIRHGEVHCGTNVRRKPFSFKWWNMVP |
| 2 | 全長PAD4構築體 | MAQGTLIRVTPEQPTHAVCVLGTLTQLDICSSAPEDCTSFSINASPGVVVDIAHSPPAKKKSTGSSTWPLDPGVEVTLTMKAASGSTGDQKVQISYYGPKTPPVKALLYLTAVEISLCADITRTGKVKPTRAVKDQRTWTWGPCGQGAILLVNCDRDNLESSAMDCEDDEVLDSEDLQDMSLMTLSTKTPKDFFTNHTLVLHVARSEMDKVRVFQATRGKLSSKCSVVLGPKWPSHYLMVPGGKHNMDFYVEALAFPDTDFPGLITLTISLLDTSNLELPEAVVFQDSVVFRVAPWIMTPNTQPPQEVYACSIFENEDFLKSVTTLAMKAKCKLTICPEEENMDDQWMQDEMEIGYIQAPHKTLPVVFDSPRNRGLKEFPIKRVMGPDFGYVTRGPQTGGISGLDSFGNLEVSPPVTVRGKEYPLGRILFGDSCYPSNDSRQMHQALQDFLSAQQVQAPVKLYSDWLSVGHVDEFLSFVPAPDRKGFRLLLASPRSCYKLFQEQQNEGHGEALLFEGIKKKKQQKIKNILSNKTLREHNSFVERCIDWNRELLKRELGLAESDIIDIPQLFKLKEFSKAEAFFPNMVNMLVLGKHLGIPKPFGPVINGRCCLEEKVCSLLEPLGLQCTFINDFFTYHIRHGEVHCGTNVRRKPFSFKWWNMVP |
| 3 | 具有可裂解N端his標籤及TMVM標籤之全長PAD4構築體 | MGSSHHHHHHSSGETVRFQGHMAQGTLIRVTPEQPTHAVCVLGTLTQLDICSSAPEDCTSFSINASPGVVVDIAHSPPAKKKSTGSSTWPLDPGVEVTLTMKAASGSTGDQKVQISYYGPKTPPVKALLYLTAVEISLCADITRTGKVKPTRAVKDQRTWTWGPCGQGAILLVNCDRDNLESSAMDCEDDEVLDSEDLQDMSLMTLSTKTPKDFFTNHTLVLHVARSEMDKVRVFQATRGKLSSKCSVVLGPKWPSHYLMVPGGKHNMDFYVEALAFPDTDFPGLITLTISLLDTSNLELPEAVVFQDSVVFRVAPWIMTPNTQPPQEVYACSIFENEDFLKSVTTLAMKAKCKLTICPEEENMDDQWMQDEMEIGYIQAPHKTLPVVFDSPRNRGLKEFPIKRVMGPDFGYVTRGPQTGGISGLDSFGNLEVSPPVTVRGKEYPLGRILFGDSCYPSNDSRQMHQALQDFLSAQQVQAPVKLYSDWLSVGHVDEFLSFVPAPDRKGFRLLLASPRSCYKLFQEQQNEGHGEALLFEGIKKKKQQKIKNILSNKTLREHNSFVERCIDWNRELLKRELGLAESDIIDIPQLFKLKEFSKAEAFFPNMVNMLVLGKHLGIPKPFGPVINGRCCLEEKVCSLLEPLGLQCTFINDFFTYHIRHGEVHCGTNVRRKPFSFKWWNMVP |
| 4 | HCDR1 mAb13 | DFNIKDHFIH |
| 5 | HCDR2 mAb13 | RIDPEDDETKYAPKFQD |
| 6 | HCDR3 mAb13 | YGNYEGAMDY |
| 7 | LCDR1 mAb13 | RASENVNNYGIGFMN |
| 8 | LCDR2 mAb13 | AASRRGS |
| 9 | LCDR3 mAb13 | QQSKEVPYT |
| 10 | mAb13重鏈可變區(VH) | EVLLQQSGAELVKPGASVRLSCTSS DFNIKDHFIH WVKQRTEQGLEWIG RIDPEDDETKYAPKFQD KVTITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVFYCAG YGNYEGAMDY WGQGTSVTVSS |
| 11 | mAb13重鏈可變區(VH) DNA序列 | GAGGTTCTGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCGGGGGCCTCAGTCAGGTTGTCCTGCACAAGTTCTGACTTCAATATTAAAGACCACTTTATACACTGGGTGAAGCAGAGGACTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGAAGATGATGAAACTAAATATGCCCCGAAATTCCAGGACAAGGTCACTATAACAGCGGACACGTCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACGTCTGAGGACACTGCCGTCTTTTACTGTGCTGGTTATGGTAACTACGAAGGGGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA |
| 12 | mAb13鏈可變區(VL) | DIVLTQSPTSLGVSPGQRATLSC RASENVNNYGIGFMN WFQQKPGQPPKLLIY AASRRGS GVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFC QQSKEVPYT FGGGTNLEIR |
| 13 | mAb13輕鏈可變區(VL) DNA序列 | GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAACTTCTTTGGGTGTGTCTCCAGGGCAGAGGGCCACCCTCTCCTGCAGAGCCAGCGAGAATGTTAATAATTATGGCATTGGTTTTATGAACTGGTTCCAACAGAAACCAGGACAGCCACCGAAACTCCTCATTTATGCTGCATCCAGGCGAGGATCCGGGGTCCCTGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCAGGGACAGACTTCAGCCTCAACATCCATCCTATGGAGGAGGATGATACTGCAATGTATTTCTGTCAACAAAGTAAGGAGGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAACCTGGAAATAAGA |
| 14 | hz13-1 VH | EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSC TSS DFNIKDHFIHWVRQAPGKGLEWMG RIDPEDDETKYAPKFQDRVTMT ADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCA G YGNYEGAMDYWGQGTLVTVSS |
| 15 | hz13-1 VH DNA序列 | GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCAGGAGCTTCCGTGAAGGTGAGCTGTACATCCAGCGACTTCAACATCAAGGATCACTTTATCCATTGGGTGAGACAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGATGGGAAGGATCGACCCCGAGGACGATGAGACAAAGTACGCTCCTAAGTTCCAGGATAGGGTGACCATGACAGCCGACACCTCTACAGATACCGCTTATATGGAGCTGTCTTCCCTGAGATCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCTGGCTACGGCAATTATGAGGGCGCCATGGATTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACCGTGAGCTCT |
| 16 | Hz13-1 VL | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASENVNNYGIGFMNWYQQKPGKAPKLLIY AASRRGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSKEVPYTFGQGTKVEIK |
| 17 | Hz13-1 VL DNA序列 | GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCAGCCTGTCTGCCTCCGTGGGCGATAGAGTGACCATCACATGTCGCGCTTCCGAGAACGTGAACAATTACGGCATCGGCTTCATGAATTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCTGCTAGCAGGAGGGGCTCTGGAGTGCCCTCCAGGTTCAGCGGCTCTGGCTCCGGAACCGACTTTACCCTGACAATCTCTTCCCTGCAGCCTGAGGATTTCGCTACATACTATTGCCAGCAGTCCAAGGAGGTGCCATATACCTTTGGCCAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAG |
| 18 | hz13-2 VH | EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSC TSS DFNIKDHFIHWVRQAPGKGLEWMG RIDPEDDETKYAPKFQDRVTMT ADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCA G YGNYEGAMDYWGQGTLVTVSS |
| 19 | hz13-2 VH DNA序列 | GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCAGGAGCTTCCGTGAAGGTGAGCTGTACATCCAGCGACTTCAACATCAAGGATCACTTTATCCATTGGGTGAGACAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGATGGGAAGGATCGACCCCGAGGACGATGAGACAAAGTACGCTCCTAAGTTCCAGGATAGGGTGACCATGACAGCCGACACCTCTACAGATACCGCTTATATGGAGCTGTCTTCCCTGAGATCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCTGGCTACGGCAATTATGAGGGCGCCATGGATTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACCGTGAGCTCT |
| 20 | hz13-2 VL | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASENVNNYGIGFMNW FQQKPGKAPKLLIY AASRRGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY FC QQSKEVPYTFGQGTKVEIK |
| 21 | hz13-2 VL DNA序列 | GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCAGCCTGTCTGCCTCCGTGGGCGATAGAGTGACCATCACATGTCGCGCTTCCGAGAACGTGAACAATTACGGCATCGGCTTCATGAATTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTATGCTGCTAGCAGGAGGGGCTCTGGAGTGCCCTCCAGGTTCAGCGGCTCTGGCTCCGGAACCGACTTTACCCTGACAATCTCTTCCCTGCAGCCTGAGGATTTCGCTACATACTTTTGCCAGCAGTCCAAGGAGGTGCCATATACCTTCGGCCAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAG |
| 22 | hz13-3 VH | EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSC TSS DFNIKDHFIHWVRQAPGKGLEWMG RIDPEDDETKYAPKFQDRVTMT ADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCA G YGNYEGAMDYWGQGTLVTVSS |
| 23 | hz13-3 VH DNA序列 | GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCAGGAGCTTCCGTGAAGGTGAGCTGTACATCCAGCGACTTCAACATCAAGGATCACTTTATCCATTGGGTGAGACAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGATGGGAAGGATCGACCCCGAGGACGATGAGACAAAGTACGCTCCTAAGTTCCAGGATAGGGTGACCATGACAGCCGACACCTCTACAGATACCGCTTATATGGAGCTGTCTTCCCTGAGATCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCTGGCTACGGCAATTATGAGGGCGCCATGGATTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACCGTGAGCTCT |
| 24 | hz13-3 VL | DI VMTQSPSSLSASVGDRVT LTC RASENVNNYGIGFMNW FQQKPGKAPKLLIY AASRRGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS MQPEDFATY FC QQSKEVPYTFGQGTKLEIK |
| 25 | hz13-3 VL DNA序列 | GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCAGCCTGTCTGCCTCCGTGGGCGATAGAGTGACCATCACATGTCGCGCTTCCGAGAACGTGAACAATTACGGCATCGGCTTCATGAATTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTATGCTGCTAGCAGGAGGGGCTCTGGAGTGCCCTCCAGGTTCAGCGGCTCTGGCTCCGGAACCGACTTTACCCTGACAATCTCTTCCCTGCAGCCTGAGGATTTCGCTACATACTTTTGCCAGCAGTCCAAGGAGGTGCCATATACCTTCGGCCAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAG |
| 26 | hz13-4 VH | EV LLVQSGAEVKKPGASVK LSC TSS DFNIKDHFIHWVRQAPGKGLEWMG RIDPEDDETKYAPKFQDRVTMT ADTSTDTAYMELSSLRSEDTAV FYCA G YGNYEGAMDYWGQGTLVTVSS |
| 27 | hz13-4 VH DNA序列 | GAGGTGCTGCTGGTGCAGTCCGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCAGGAGCTTCCGTGAAGCTGAGCTGTACATCCAGCGACTTCAACATCAAGGATCACTTTATCCATTGGGTGAGACAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGATGGGAAGGATCGACCCCGAGGACGATGAGACAAAGTACGCTCCTAAGTTCCAGGATAGGGTGACCATGACAGCCGACACCTCTACAGATACCGCTTATATGGAGCTGTCTTCCCTGAGATCCGAGGACACCGCCGTGTTTTACTGCGCTGGCTACGGCAATTATGAGGGCGCCATGGATTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACCGTGAGCTCT |
| 28 | Hz13-4 VL | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASENVNNYGIGFMNWYQQKPGKAPKLLIY AASRRGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSKEVPYTFGQGTKVEIK |
| 29 | Hz13-4 VL DNA序列 | GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCAGCCTGTCTGCCTCCGTGGGCGATAGAGTGACCATCACATGTCGCGCTTCCGAGAACGTGAACAATTACGGCATCGGCTTCATGAATTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCTGCTAGCAGGAGGGGCTCTGGAGTGCCCTCCAGGTTCAGCGGCTCTGGCTCCGGAACCGACTTTACCCTGACAATCTCTTCCCTGCAGCCTGAGGATTTCGCTACATACTATTGCCAGCAGTCCAAGGAGGTGCCATATACCTTTGGCCAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAG |
| 30 | hz13-5 VH | EV LLVQSGAEVKKPGASVK LSC TSS DFNIKDHFIHWVRQAPGKGLEWMG RIDPEDDETKYAPKFQDRVTMT ADTSTDTAYMELSSLRSEDTAV FYCA G YGNYEGAMDYWGQGTLVTVSS |
| 31 | hz13-5 VH DNA序列 | GAGGTGCTGCTGGTGCAGTCCGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCAGGAGCTTCCGTGAAGCTGAGCTGTACATCCAGCGACTTCAACATCAAGGATCACTTTATCCATTGGGTGAGACAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGATGGGAAGGATCGACCCCGAGGACGATGAGACAAAGTACGCTCCTAAGTTCCAGGATAGGGTGACCATGACAGCCGACACCTCTACAGATACCGCTTATATGGAGCTGTCTTCCCTGAGATCCGAGGACACCGCCGTGTTTTACTGCGCTGGCTACGGCAATTATGAGGGCGCCATGGATTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACCGTGAGCTCT |
| 32 | hz13-5 VL | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASENVNNYGIGFMNW FQQKPGKAPKLLIY AASRRGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY FC QQSKEVPYTFGQGTKVEIK |
| 33 | hz13-5 VL DNA序列 | GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCAGCCTGTCTGCCTCCGTGGGCGATAGAGTGACCATCACATGTCGCGCTTCCGAGAACGTGAACAATTACGGCATCGGCTTCATGAATTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTATGCTGCTAGCAGGAGGGGCTCTGGAGTGCCCTCCAGGTTCAGCGGCTCTGGCTCCGGAACCGACTTTACCCTGACAATCTCTTCCCTGCAGCCTGAGGATTTCGCTACATACTTTTGCCAGCAGTCCAAGGAGGTGCCATATACCTTCGGCCAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAG |
| 34 | hz13-6 VH | EV LLVQSGAEVKKPGASVK LSC TSS DFNIKDHFIHWVRQAPGKGLEWMG RIDPEDDETKYAPKFQDRVTMT ADTSTDTAYMELSSLRSEDTAV FYCA G YGNYEGAMDYWGQGTLVTVSS |
| 35 | hz13-6 VH DNA序列 | GAGGTGCTGCTGGTGCAGTCCGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCAGGAGCTTCCGTGAAGCTGAGCTGTACATCCAGCGACTTCAACATCAAGGATCACTTTATCCATTGGGTGAGACAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGATGGGAAGGATCGACCCCGAGGACGATGAGACAAAGTACGCTCCTAAGTTCCAGGATAGGGTGACCATGACAGCCGACACCTCTACAGATACCGCTTATATGGAGCTGTCTTCCCTGAGATCCGAGGACACCGCCGTGTTTTACTGCGCTGGCTACGGCAATTATGAGGGCGCCATGGATTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACCGTGAGCTCT |
| 36 | hz13-6 VL | DI VMTQSPSSLSASVGDRVT LTC RASENVNNYGIGFMNW FQQKPGKAPKLLIY AASRRGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS MQPEDFATY FC QQSKEVPYTFGQGTKLEIK |
| 37 | hz13-6 VL DNA序列 | GACATCGTGATGACCCAGTCTCCATCCAGCCTGTCTGCCTCCGTGGGCGATAGAGTGACCCTGACATGTCGCGCTTCCGAGAACGTGAACAATTACGGCATCGGCTTCATGAATTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTATGCTGCTAGCAGGAGGGGCTCTGGAGTGCCCTCCAGGTTCAGCGGCTCTGGCTCCGGAACCGACTTTACCCTGACAATCTCTTCCATGCAGCCTGAGGATTTCGCTACATACTTTTGCCAGCAGTCCAAGGAGGTGCCATATACCTTCGGCCAGGGCACAAAGCTGGAGATCAAG |
| 38 | hz13-7 VH | EV LLVQSGAEVKKPGASVK LSC TSS DFNIKDHFIHWVRQAPGKGLEW IG RIDPEDDETKYAPKFQDRVT IT ADTSTDTAY LELSSLRSEDTAV FYCA G YGNYEGAMDYWGQGTLVTVSS |
| 39 | hz137- VH DNA序列 | GAGGTGCTGCTGGTGCAGTCCGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCAGGAGCTTCCGTGAAGCTGAGCTGTACATCCAGCGACTTCAACATCAAGGATCACTTTATCCATTGGGTGAGACAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGATCGGAAGGATCGACCCCGAGGACGATGAGACAAAGTACGCTCCTAAGTTCCAGGATAGGGTGACCATCACAGCCGACACCTCTACAGATACCGCTTATCTGGAGCTGTCTTCCCTGAGATCCGAGGACACCGCCGTGTTTTACTGCGCTGGCTACGGCAATTATGAGGGCGCCATGGATTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACCGTGAGCTCT |
| 40 | Hz13-7 VL | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASENVNNYGIGFMNWYQQKPGKAPKLLIY AASRRGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSKEVPYTFGQGTKVEIK |
| 41 | Hz13-7 VL DNA序列 | GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCAGCCTGTCTGCCTCCGTGGGCGATAGAGTGACCATCACATGTCGCGCTTCCGAGAACGTGAACAATTACGGCATCGGCTTCATGAATTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCTGCTAGCAGGAGGGGCTCTGGAGTGCCCTCCAGGTTCAGCGGCTCTGGCTCCGGAACCGACTTTACCCTGACAATCTCTTCCCTGCAGCCTGAGGATTTCGCTACATACTATTGCCAGCAGTCCAAGGAGGTGCCATATACCTTTGGCCAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAG |
| 42 | hz13-8 VH | EV LLVQSGAEVKKPGASVK LSC TSS DFNIKDHFIHWVRQAPGKGLEW IG RIDPEDDETKYAPKFQDRVT IT ADTSTDTAY LELSSLRSEDTAV FYCA G YGNYEGAMDYWGQGTLVTVSS |
| 43 | hz13-8 VH DNA序列 | GAGGTGCTGCTGGTGCAGTCCGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCAGGAGCTTCCGTGAAGCTGAGCTGTACATCCAGCGACTTCAACATCAAGGATCACTTTATCCATTGGGTGAGACAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGATCGGAAGGATCGACCCCGAGGACGATGAGACAAAGTACGCTCCTAAGTTCCAGGATAGGGTGACCATCACAGCCGACACCTCTACAGATACCGCTTATCTGGAGCTGTCTTCCCTGAGATCCGAGGACACCGCCGTGTTTTACTGCGCTGGCTACGGCAATTATGAGGGCGCCATGGATTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACCGTGAGCTCT |
| 44 | hz13-8 VL | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASENVNNYGIGFMNW FQQKPGKAPKLLIY AASRRGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY FC QQSKEVPYTFGQGTKVEIK |
| 45 | hz13-8 VL DNA序列 | GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCAGCCTGTCTGCCTCCGTGGGCGATAGAGTGACCATCACATGTCGCGCTTCCGAGAACGTGAACAATTACGGCATCGGCTTCATGAATTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTATGCTGCTAGCAGGAGGGGCTCTGGAGTGCCCTCCAGGTTCAGCGGCTCTGGCTCCGGAACCGACTTTACCCTGACAATCTCTTCCCTGCAGCCTGAGGATTTCGCTACATACTTTTGCCAGCAGTCCAAGGAGGTGCCATATACCTTCGGCCAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAG |
| 46 | hz13-9 VH | EV LLVQSGAEVKKPGASVK LSC TSS DFNIKDHFIHWVRQAPGKGLEW IG RIDPEDDETKYAPKFQDRVT IT ADTSTDTAY LELSSLRSEDTAV FYCA G YGNYEGAMDYWGQGTLVTVSS |
| 47 | hz13-9 VH DNA序列 | GAGGTGCTGCTGGTGCAGTCCGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCAGGAGCTTCCGTGAAGCTGAGCTGTACATCCAGCGACTTCAACATCAAGGATCACTTTATCCATTGGGTGAGACAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGATCGGAAGGATCGACCCCGAGGACGATGAGACAAAGTACGCTCCTAAGTTCCAGGATAGGGTGACCATCACAGCCGACACCTCTACAGATACCGCTTATCTGGAGCTGTCTTCCCTGAGATCCGAGGACACCGCCGTGTTTTACTGCGCTGGCTACGGCAATTATGAGGGCGCCATGGATTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACCGTGAGCTCT |
| 48 | hz13-9 VL | DI VMTQSPSSLSASVGDRVT LTC RASENVNNYGIGFMNW FQQKPGKAPKLLIY AASRRGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS MQPEDFATY FC QQSKEVPYTFGQGTKLEIK |
| 49 | hz13-9 VL DNA序列 | GACATCGTGATGACCCAGTCTCCATCCAGCCTGTCTGCCTCCGTGGGCGATAGAGTGACCCTGACATGTCGCGCTTCCGAGAACGTGAACAATTACGGCATCGGCTTCATGAATTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTATGCTGCTAGCAGGAGGGGCTCTGGAGTGCCCTCCAGGTTCAGCGGCTCTGGCTCCGGAACCGACTTTACCCTGACAATCTCTTCCATGCAGCCTGAGGATTTCGCTACATACTTTTGCCAGCAGTCCAAGGAGGTGCCATATACCTTCGGCCAGGGCACAAAGCTGGAGATCAAG |
| 50 | hz13-10 VH | EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVS DFNIKDHFIHWVQQAPGKGLEWMG RIDPEDDETKYAPKFQDRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCA G YGNYEGAMDYWGQGTTVTVSS |
| 51 | hz13-10 VH DNA序列 | GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCAGGAGCTACCGTGAAGATCTCCTGTAAGGTGAGCGACTTCAACATCAAGGATCACTTTATCCATTGGGTGCAGCAGGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAGAATCGACCCCGAGGACGATGAGACCAAGTACGCTCCTAAGTTCCAGGATCGCGTGACCATCACAGCCGACACCTCTACAGATACCGCTTATATGGAGCTGTCCAGCCTGAGATCCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGCGCTGGCTACGGCAATTATGAGGGCGCCATGGATTACTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACAGTGTCTTCC |
| 52 | hz13-10 VL | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISC RASENVNNYGIGFMNWFQQRPGQSPR LLIY AASRRGSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE EEDVGVYYC QQSKEVPYTFGGGTKVEIK |
| 53 | hz13-10 VL DNA序列 | GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCCGCGCTTCCGAGAATGTGAACAATTACGGCATCGGCTTCATGAACTGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCAAGGCTGCTAATTTATGCTGCTTCTAGGAGGGGCTCCGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCAGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGAAGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCCAGCAGTCCAAGGAGGTGCCCTATACCTTTGGCGGCGGCACAAAGGTGGAGATCAAG |
| 54 | hz13-11 VH | EVQLVQSGAEVKKPGATVKISC TSS DFNIKDHFIHWVQQAPGKGLEWMG RIDPEDDETKYAPKFQDRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCA G YGNYEGAMDYWGQGTTVTVSS |
| 55 | hz13-11 VH DNA序列 | GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCAGGAGCTACCGTGAAGATCTCCTGTACCAGCAGCGACTTCAACATCAAGGATCACTTTATCCATTGGGTGCAGCAGGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAGAATCGACCCCGAGGACGATGAGACCAAGTACGCTCCTAAGTTCCAGGATCGCGTGACCATCACAGCCGACACCTCTACAGATACCGCTTATATGGAGCTGTCCAGCCTGAGATCCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGCGCTGGCTACGGCAATTATGAGGGCGCCATGGATTACTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACAGTGTCTTCC |
| 56 | hz13-11 VL | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISC RASENVNNYGIGFMNWFQQRPGQSPRRLIY AASRRGSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC QQSKEVPYTFGGGTKVEIK |
| 57 | hz13-11 VL DNA序列 | GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCCGCGCTTCCGAGAATGTGAACAATTACGGCATCGGCTTCATGAACTGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCAAGGCGCCTAATTTATGCTGCTTCTAGGAGGGGCTCCGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCAGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCCAGCAGTCCAAGGAGGTGCCCTATACCTTTGGCGGCGGCACAAAGGTGGAGATCAAG |
| 58 | hz13-12 VH | EVQLVQSGAEVKKPGATVKISC TSS DFNIKDHFIHWVQQAPGKGLEWMG RIDPEDDETKYAPKFQDRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCA G YGNYEGAMDYWGQGTTVTVSS |
| 59 | hz13-12 VH DNA序列 | GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCAGGAGCTACCGTGAAGATCTCCTGTACCAGCAGCGACTTCAACATCAAGGATCACTTTATCCATTGGGTGCAGCAGGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAGAATCGACCCCGAGGACGATGAGACCAAGTACGCTCCTAAGTTCCAGGATCGCGTGACCATCACAGCCGACACCTCTACAGATACCGCTTATATGGAGCTGTCCAGCCTGAGATCCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGCGCTGGCTACGGCAATTATGAGGGCGCCATGGATTACTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACAGTGTCTTCC |
| 60 | hz13-12 VL | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISC RASENVNNYGIGFMNWFQQRPGQSPR LLIY AASRRGSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE EEDVGVYYC QQSKEVPYTFGGGTKVEIK |
| 61 | hz13-12 VL DNA序列 | GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCCGCGCTTCCGAGAATGTGAACAATTACGGCATCGGCTTCATGAACTGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCAAGGCTGCTAATTTATGCTGCTTCTAGGAGGGGCTCCGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCAGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGAAGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCCAGCAGTCCAAGGAGGTGCCCTATACCTTTGGCGGCGGCACAAAGGTGGAGATCAAG |
| 62 | HCDR1 hz13-5 D31E及hz13-12 D31E | DFNIK E HFIH |
| 63 | HCDR2 hz13-5 D31E及hz13-12 D31E | RIDPEDDETKYAPKFQD |
| 64 | HCDR3 hz13-5 D31E及hz13-12 D31E | YGNYEGAMDY |
| 65 | LCDR1 hz13-5 D31E及hz13-12 D31E | RASENVNNYGIGFMN |
| 66 | LCDR2 hz13-5 D31E及hz13-12 D31E | AASRRGS |
| 67 | LCDR3 hz13-5 D31E及hz13-12 D31E | QQSKEVPYT |
| 68 | hz13-5 D31E VH | EV LLVQSGAEVKKPGASVK LSC TSS DFNIK EHFIH WVRQAPGKGLEWMG RIDPEDDETKYAPKFQDRVTMT ADTSTDTAYMELSSLRSEDTAV FYCA G YGNYEGAMDYWGQGTLVTVSS |
| 69 | hz13-5 D31E VH DNA序列 | GAAGTGCTACTAGTGCAAAGTGGTGCAGAAGTCAAGAAGCCTGGAGCTTCCGTGAAGCTGTCCTGCACCAGCTCCGACTTCAACATCAAGGAACACTTCATCCACTGGGTGCGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAATGGATGGGCAGAATCGATCCTGAGGACGACGAGACCAAGTACGCCCCTAAATTTCAGGACAGAGTGACCATGACAGCTGATACCAGCACCGACACCGCCTACATGGAACTGTCTTCTCTGAGATCCGAGGATACAGCCGTGTTCTACTGTGCTGGATATGGCAACTACGAGGGCGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCT |
| 70 | hz13-5 D31E VL | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASENVNNYGIGFMNW FQQKPGKAPKLLIY AASRRGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY FC QQSKEVPYTFGQGTKVEIK |
| 71 | hz13-5 D31E VL DNA序列 | GATATCCAAATGACTCAAAGTCCAAGTAGTCTGTCTGCTTCCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCTCCGAGAATGTGAACAACTACGGCATCGGCTTCATGAACTGGTTCCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCTTCTCGGAGAGGCTCCGGCGTGCCCAGCCGGTTCTCCGGATCTGGCTCTGGAACCGACTTCACCCTGACAATCTCCTCCCTGCAGCCTGAGGATTTTGCCACCTACTTCTGCCAGCAAAGCAAAGAGGTTCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG |
| 72 | HCDR1 mAb20 | GYTFTNYGIS |
| 73 | HCDR2 mAb20 | EIYPRSGNTYHNEKFKD |
| 74 | HCDR3 mAb20 | SMITTRYWYFDV |
| 75 | LCDR1 mAb20 | RASESVDTYGNSFMH |
| 76 | LCDR2 mAb20 | LASNLES |
| 77 | LCDR3 mAb20 | QQNNEDPLT |
| 78 | mAb20 VH | QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKAT GYTFTNYGISWVKQRTGQGLEWIG EIYPRSGNTYHNEKFKDKATLTADKSSSTAYMEFRSLTSEDSAVYFCAR SMITTRYWYFDVWGKGTTVTVSS |
| 79 | mAb20 VH DNA序列 | CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGCGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTACTGGCTACACCTTCACAAACTATGGAATAAGCTGGGTGAAGCAGAGAACTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTATCCTAGAAGTGGTAATACTTACCACAATGAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCGTACATGGAATTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGATCGATGATTACGACGAGGTACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA |
| 80 | mAb20 VL | NIVLTQSPASLAVSLGQRATLSC RASESVDTYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIY LASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYC QQNNEDPLTFGAGTKLELK |
| 81 | mAb20 VL DNA序列 | AACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCTTATCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATACTTATGGCAATAGTTTTATGCACTGGTACCAGCAGAAACCAGGTCAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCTTGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTGATCCTGTGGAGGCTGATGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAATAATGAGGATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA |
| 82 | hz20-1 VH | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTNYGISWVRQAPGQGLEWMG EIYPRSGNTYHNEKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR SMITTRYWYFDVWGKGTTVTVSS |
| 83 | hz20-1 VH DNA序列 | CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAACTACGGCATCAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCGAGATCTACCCCAGGAGCGGCAACACCTACCACAACGAGAAGTTCAAGGACAGGGTGACCATGACCAGGGACACCAGCACCAGCACCGTGTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGCATGATCACCACCAGGTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCAAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC |
| 84 | hz20-1 VL | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC RASESVDTYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIY LASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QQNNEDPLTFGAGTKLELK |
| 85 | hz20-1 VL DNA序列 | GACATCGTGATGACCCAGTCTCCCGATTCCCTGGCCGTGAGCCTGGGAGAGAGGGCTACCATCAACTGTCGGGCTTCCGAGAGCGTGGACACATACGGCAATTCTTTCATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACCTGGCTAGCAACCTGGAGTCTGGCGTGCCTGACAGATTCTCTGGCTCCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACAATCTCCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTATTGCCAGCAGAACAATGAGGACCCCCTGACCTTCGGCGCTGGCACAAAGCTGGAGCTGAAG |
| 86 | hz20-2 VH | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTNYGISWVRQAPGQGLEWMG EIYPRSGNTYHNEKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAR SMITTRYWYFDVWGQGTLVTVSS |
| 87 | hz20-2 VH DNA序列 | CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAACTACGGCATCAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCGAGATCTACCCCAGGAGCGGCAACACCTACCACAACGAGAAGTTCAAGGACAGGGTGACCATGACCACCGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAGCTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGCATGATCACCACCAGGTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC |
| 88 | hz20-2 VL | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASESVDTYGNSFMHWYQQKPGKAPKLLIY LASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQNNEDPLTFGQGTKVEIK |
| 89 | hz20-2 VL DNA序列 | GATATCCAGATGACCCAGTCCCCATCCAGCCTGTCTGCCTCCGTGGGCGATAGGGTGACCATCACATGTCGGGCTAGCGAGTCTGTGGACACCTACGGCAACAGCTTCATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACCTGGCTTCCAATCTGGAGAGCGGCGTGCCCTCTAGATTCTCCGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTTACCCTGACAATCTCTTCCCTGCAGCCTGAGGATTTCGCCACATACTATTGCCAGCAGAACAATGAGGACCCACTGACCTTTGGCCAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAG |
| 90 | hz20-3 VH | EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTNYGISWVRQAPGQGLEWMG EIYPRSGNTYHNEKFKDRVTMT AD KSTSTAYMELRSLRSDDTAVY FCAR SMITTRYWYFDVWGQGTLVTVSS |
| 91 | hz20-3 VH DNA序列 | GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAACTACGGCATCAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCGAGATCTACCCCAGGAGCGGCAACACCTACCACAACGAGAAGTTCAAGGACAGGGTGACCATGACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAGCTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTTCTGCGCCAGGAGCATGATCACCACCAGGTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC |
| 92 | hz20-3 VL | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASESVDTYGNSFMHWYQQKPGKAPKLLIY LASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQNNEDPLTFGQGTKVEIK |
| 93 | hz20-3 VLDNA序列 | GATATCCAGATGACCCAGTCCCCATCCAGCCTGTCTGCCTCCGTGGGCGATAGGGTGACCATCACATGTCGGGCTAGCGAGTCTGTGGACACCTACGGCAACAGCTTCATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACCTGGCTTCCAATCTGGAGAGCGGCGTGCCCTCTAGATTCTCCGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTTACCCTGACAATCTCTTCCCTGCAGCCTGAGGATTTCGCCACATACTATTGCCAGCAGAACAATGAGGACCCACTGACCTTTGGCCAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAG |
| 94 | hz20-4 VH | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTNYGISWVRQAPGQGLEWMG EIYPRSGNTYHNEKFKDRVTMT ADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR SMITTRYWYFDVWGKGTTVTVSS |
| 95 | hz20-4 VH DNA序列 | CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAACTACGGCATCAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCGAGATCTACCCCAGGAGCGGCAACACCTACCACAACGAGAAGTTCAAGGACAGGGTGACCATGACCGCCGACACCAGCACCAGCACCGTGTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGCATGATCACCACCAGGTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCAAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC |
| 96 | hz20-4 VL | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC RASESVDTYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIY LASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QQNNEDPLTFGAGTKLELK |
| 97 | hz20-4 VL DNA序列 | GACATCGTGATGACCCAGTCTCCCGATTCCCTGGCCGTGAGCCTGGGAGAGAGGGCTACCATCAACTGTCGGGCTTCCGAGAGCGTGGACACATACGGCAATTCTTTCATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACCTGGCTAGCAACCTGGAGTCTGGCGTGCCTGACAGATTCTCTGGCTCCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACAATCTCCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTATTGCCAGCAGAACAATGAGGACCCCCTGACCTTCGGCGCTGGCACAAAGCTGGAGCTGAAG |
| 98 | hz20-5 VH | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTNYGISWVRQ RPGQGLEW IG EIYPRSGNTYHNEKFKDRVTMT ADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR SMITTRYWYFDVWGKGTTVTVSS |
| 99 | hz20-5 VH DNA序列 | CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAACTACGGCATCAGCTGGGTGAGGCAGAGGCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGAGATCTACCCCAGGAGCGGCAACACCTACCACAACGAGAAGTTCAAGGACAGGGTGACCATGACCGCCGACACCAGCACCAGCACCGTGTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGCATGATCACCACCAGGTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCAAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC |
| 100 | hz20-5 VL | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC RASESVDTYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIY LASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QQNNEDPLTFGAGTKLELK |
| 101 | hz20-5 VL DNA序列 | GACATCGTGATGACCCAGTCTCCCGATTCCCTGGCCGTGAGCCTGGGAGAGAGGGCTACCATCAACTGTCGGGCTTCCGAGAGCGTGGACACATACGGCAATTCTTTCATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACCTGGCTAGCAACCTGGAGTCTGGCGTGCCTGACAGATTCTCTGGCTCCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACAATCTCCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTATTGCCAGCAGAACAATGAGGACCCCCTGACCTTCGGCGCTGGCACAAAGCTGGAGCTGAAG |
| 102 | hz20-6 VH | QVQLVQSGAEVKKPGASVK LSCKA T GYTFTNYGISWVRQAPGQGLEW IG EIYPRSGNTYHNEKFKDRVT LT AD KS SSTAYME FRSLRSDDTAVY FCAR SMITTRYWYFDVWGQGTLVTVSS |
| 103 | hz20-6 VH DNA序列 | CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGCTGAGCTGCAAGGCCACCGGCTACACCTTCACCAACTACGGCATCAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGAGATCTACCCCAGGAGCGGCAACACCTACCACAACGAGAAGTTCAAGGACAGGGTGACCCTGACCGCCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGGAGTTCAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTTCTGCGCCAGGAGCATGATCACCACCAGGTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC |
| 104 | hz20-6 VL | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASESVDTYGNSFMHWYQQKPGKAPKLLIY LASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQNNEDPLTFGQGTKVEIK |
| 105 | hz20-6 VL DNA序列 | GATATCCAGATGACCCAGTCCCCATCCAGCCTGTCTGCCTCCGTGGGCGATAGGGTGACCATCACATGTCGGGCTAGCGAGTCTGTGGACACCTACGGCAACAGCTTCATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACCTGGCTTCCAATCTGGAGAGCGGCGTGCCCTCTAGATTCTCCGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTTACCCTGACAATCTCTTCCCTGCAGCCTGAGGATTTCGCCACATACTATTGCCAGCAGAACAATGAGGACCCACTGACCTTTGGCCAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAG |
| 106 | hz20-7 VH | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTNYGISWVRQAPGQGLEWMG EIYPRSGNTYHNEKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAR SMITTRYWYFDVWGKGTTVTVSS |
| 107 | hz20-7 VH DNA序列 | CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCAGGCGCTTCCGTGAAGGTGAGCTGTAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACAAACTATGGAATCTCCTGGGTGAGGCAGGCTCCAGGACAGGGACTGGAGTGGATGGGCGAGATCTACCCTAGAAGCGGCAACACATATCACAATGAGAAGTTTAAGGACCGCGTGACCATGACCACAGATACCTCTACATCCACCGCCTACATGGAGCTGAGGAGCCTGCGGTCTGACGATACAGCCGTGTACTATTGCGCTAGATCCATGATCACCACACGCTACTGGTATTTCGACGTGTGGGGCAAGGGCACCACAGTGACCGTGTCCAGC |
| 108 | hz20-7 VL | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC RASESVDTYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIY LASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QQNNEDPLTFGQGTKLEIK |
| 109 | hz20-7 VL DNA序列 | GACATCGTGATGACCCAGTCTCCCGATTCCCTGGCCGTGAGCCTGGGAGAGAGGGCTACCATCAACTGTCGGGCTTCCGAGAGCGTGGACACATACGGCAATTCTTTCATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACCTGGCTAGCAACCTGGAGTCTGGCGTGCCTGACAGATTCTCTGGCTCCGGCAGCGGAACCGACTTCACCCTGACAATCTCCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTATTGCCAGCAGAACAATGAGGACCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACAAAGCTGGAGATCAAG |
| 110 | hz20-8 VH | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTNYGISWVRQAPGQGLEWMG EIYPRSGNTYHNEKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAR SMITTRYWYFDVWGKGTTVTVSS |
| 111 | hz20-8 VH DNA序列 | CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCAGGCGCTTCCGTGAAGGTGAGCTGTAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACAAACTATGGAATCTCCTGGGTGAGGCAGGCTCCAGGACAGGGACTGGAGTGGATGGGCGAGATCTACCCTAGAAGCGGCAACACATATCACAATGAGAAGTTTAAGGACCGCGTGACCATGACCACAGATACCTCTACATCCACCGCCTACATGGAGCTGAGGAGCCTGCGGTCTGACGATACAGCCGTGTACTATTGCGCTAGATCCATGATCACCACACGCTACTGGTATTTCGACGTGTGGGGCAAGGGCACCACAGTGACCGTGTCCAGC |
| 112 | hz20-8 VL | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC RASESVDTYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIY LASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTI DSLQAEDVAVYYC QQNNEDPLTFGQGTKLEIK |
| 113 | hz20-8 VL DNA序列 | GATATCGTGATGACCCAGTCCCCCGACAGCCTGGCCGTGTCTCTGGGAGAGAGGGCCACCATCAACTGTCGGGCTAGCGAGTCTGTGGATACATACGGCAATTCCTTCATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACCTGGCTTCTAACCTGGAGTCCGGCGTGCCTGACAGATTCTCCGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTTACCCTGACAATCGATTCCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTATTGCCAGCAGAACAATGAGGACCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACAAAGCTGGAGATCAAG |
| 114 | hz20-9 VH | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTNYGISWVRQAPGQGLEWMG EIYPRSGNTYHNEKFKDRVTMTTD KSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAR SMITTRYWYFDVWGKGTTVTVSS |
| 115 | hz20-9 VH DNA序列 | CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCAGGCGCTTCCGTGAAGGTGAGCTGTAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACAAACTATGGAATCTCCTGGGTGAGGCAGGCTCCAGGACAGGGACTGGAGTGGATGGGCGAGATCTACCCTAGAAGCGGCAACACCTATCACAATGAGAAGTTTAAGGACCGCGTGACAATGACCACCGATAAGTCTACCTCCACAGCCTACATGGAGCTGAGGAGCCTGCGGTCTGACGATACCGCCGTGTACTATTGCGCTAGATCCATGATCACCACACGCTACTGGTATTTCGACGTGTGGGGCAAGGGCACCACAGTGACAGTGTCCAGC |
| 116 | hz20-9 VL | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC RASESVDTYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIY LASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QQNNEDPLTFGQGTKLEIK |
| 117 | hz20-9 VL DNA序列 | GACATCGTGATGACCCAGTCTCCCGATTCCCTGGCCGTGAGCCTGGGAGAGAGGGCTACCATCAACTGTCGGGCTTCCGAGAGCGTGGACACATACGGCAATTCTTTCATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACCTGGCTAGCAACCTGGAGTCTGGCGTGCCTGACAGATTCTCTGGCTCCGGCAGCGGAACCGACTTCACCCTGACAATCTCCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTATTGCCAGCAGAACAATGAGGACCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACAAAGCTGGAGATCAAG |
| 118 | hz20-10 VH | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTNYGISWVRQAPGQGLEWMG EIYPRSGNTYHNEKFKDRVTMTTD KSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAR SMITTRYWYFDVWGKGTTVTVSS |
| 119 | hz20-10 VH DNA序列 | CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCAGGCGCTTCCGTGAAGGTGAGCTGTAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACAAACTATGGAATCTCCTGGGTGAGGCAGGCTCCAGGACAGGGACTGGAGTGGATGGGCGAGATCTACCCTAGAAGCGGCAACACCTATCACAATGAGAAGTTTAAGGACCGCGTGACAATGACCACCGATAAGTCTACCTCCACAGCCTACATGGAGCTGAGGAGCCTGCGGTCTGACGATACCGCCGTGTACTATTGCGCTAGATCCATGATCACCACACGCTACTGGTATTTCGACGTGTGGGGCAAGGGCACCACAGTGACAGTGTCCAGC |
| 120 | hz20-10 VL | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC RASESVDTYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIY LASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTI DSLQAEDVAVYYC QQNNEDPLTFGQGTKLEIK |
| 121 | hz20-10 VL DNA序列 | GATATCGTGATGACCCAGTCCCCCGACAGCCTGGCCGTGTCTCTGGGAGAGAGGGCCACCATCAACTGTCGGGCTAGCGAGTCTGTGGATACATACGGCAATTCCTTCATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACCTGGCTTCTAACCTGGAGTCCGGCGTGCCTGACAGATTCTCCGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTTACCCTGACAATCGATTCCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTATTGCCAGCAGAACAATGAGGACCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACAAAGCTGGAGATCAAG |
| 122 | hz20-11 VH | QVQLVQSGAEV AKPGASVKVSCKAS GYTFTNYGISWVRQ RPGQGLEWMG EIYPRSGNTYHNEKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRS EDTAVYYCAR SMITTRYWYFDVWGKGTTVTVSS |
| 123 | hz20-11 VH DNA序列 | CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGGCTAAGCCAGGAGCTTCCGTGAAGGTGAGCTGTAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAACTATGGCATCTCCTGGGTGAGGCAGAGGCCAGGACAGGGACTGGAGTGGATGGGCGAGATCTACCCTAGGAGCGGCAACACATATCACAATGAGAAGTTTAAGGACAGGGTGACCATGACCACAGATACCTCTACATCCACCGCCTACATGGAGCTGAGAAGCCTGCGCTCTGAGGACACAGCCGTGTACTATTGCGCTAGGTCCATGATCACCACACGGTACTGGTATTTCGACGTGTGGGGCAAGGGCACCACAGTGACCGTGTCCAGC |
| 124 | hz20-11 VL | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC RASESVDTYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIY LASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QQNNEDPLTFGQGTKLEIK |
| 125 | hz20-11 VLDNA序列 | GACATCGTGATGACCCAGTCTCCCGATTCCCTGGCCGTGAGCCTGGGAGAGAGGGCTACCATCAACTGTCGGGCTTCCGAGAGCGTGGACACATACGGCAATTCTTTCATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACCTGGCTAGCAACCTGGAGTCTGGCGTGCCTGACAGATTCTCTGGCTCCGGCAGCGGAACCGACTTCACCCTGACAATCTCCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTATTGCCAGCAGAACAATGAGGACCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACAAAGCTGGAGATCAAG |
| 126 | hz20-12 VH | QVQLVQSGAEV AKPGASVKVSCKAS GYTFTNYGISWVRQ RPGQGLEWMG EIYPRSGNTYHNEKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRS EDTAVYYCAR SMITTRYWYFDVWGKGTTVTVSS |
| 127 | hz20-12 VH DNA序列 | CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGGCTAAGCCAGGAGCTTCCGTGAAGGTGAGCTGTAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAACTATGGCATCTCCTGGGTGAGGCAGAGGCCAGGACAGGGACTGGAGTGGATGGGCGAGATCTACCCTAGGAGCGGCAACACATATCACAATGAGAAGTTTAAGGACAGGGTGACCATGACCACAGATACCTCTACATCCACCGCCTACATGGAGCTGAGAAGCCTGCGCTCTGAGGACACAGCCGTGTACTATTGCGCTAGGTCCATGATCACCACACGGTACTGGTATTTCGACGTGTGGGGCAAGGGCACCACAGTGACCGTGTCCAGC |
| 128 | hz20-12 VL | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC RASESVDTYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIY LASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTI DSLQAEDVAVYYC QQNNEDPLTFGQGTKLEIK |
| 129 | hz20-12 VL DNA序列 | GATATCGTGATGACCCAGTCCCCCGACAGCCTGGCCGTGTCTCTGGGAGAGAGGGCCACCATCAACTGTCGGGCTAGCGAGTCTGTGGATACATACGGCAATTCCTTCATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACCTGGCTTCTAACCTGGAGTCCGGCGTGCCTGACAGATTCTCCGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTTACCCTGACAATCGATTCCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTATTGCCAGCAGAACAATGAGGACCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACAAAGCTGGAGATCAAG |
| 130 | hz20-13 VH | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTNYGISWVRQ RPGQGLEWMG EIYPRSGNTYHNEKFKDRVTMTTD KSTSTAYMELRSLRS EDTAVYYCAR SMITTRYWYFDVWGKGTTVTVSS |
| 131 | hz20-13 VH DNA序列 | CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCAGGCGCTTCCGTGAAGGTGAGCTGTAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACAAACTATGGCATCTCCTGGGTGAGGCAGAGGCCAGGACAGGGACTGGAGTGGATGGGCGAGATCTACCCTAGGAGCGGCAACACCTATCACAATGAGAAGTTTAAGGACAGGGTGACAATGACCACCGATAAGTCTACCTCCACAGCTTACATGGAGCTGAGAAGCCTGCGCTCTGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCTAGGTCCATGATCACCACACGGTACTGGTATTTCGACGTGTGGGGCAAGGGCACCACAGTGACAGTGTCCAGC |
| 132 | hz20-13 VL | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC RASESVDTYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIY LASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QQNNEDPLTFGQGTKLEIK |
| 133 | hz20-13 VL DNA序列 | GACATCGTGATGACCCAGTCTCCCGATTCCCTGGCCGTGAGCCTGGGAGAGAGGGCTACCATCAACTGTCGGGCTTCCGAGAGCGTGGACACATACGGCAATTCTTTCATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACCTGGCTAGCAACCTGGAGTCTGGCGTGCCTGACAGATTCTCTGGCTCCGGCAGCGGAACCGACTTCACCCTGACAATCTCCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTATTGCCAGCAGAACAATGAGGACCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACAAAGCTGGAGATCAAG |
| 134 | hz20-14 VH | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTNYGISWVRQ RPGQGLEWMG EIYPRSGNTYHNEKFKDRVTMTTD KSTSTAYMELRSLRS EDTAVYYCAR SMITTRYWYFDVWGKGTTVTVSS |
| 135 | hz20-14 VH DNA序列 | CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCAGGCGCTTCCGTGAAGGTGAGCTGTAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACAAACTATGGCATCTCCTGGGTGAGGCAGAGGCCAGGACAGGGACTGGAGTGGATGGGCGAGATCTACCCTAGGAGCGGCAACACCTATCACAATGAGAAGTTTAAGGACAGGGTGACAATGACCACCGATAAGTCTACCTCCACAGCTTACATGGAGCTGAGAAGCCTGCGCTCTGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCTAGGTCCATGATCACCACACGGTACTGGTATTTCGACGTGTGGGGCAAGGGCACCACAGTGACAGTGTCCAGC |
| 136 | hz20-14 VL | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC RASESVDTYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIY LASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTI DSLQAEDVAVYYC QQNNEDPLTFGQGTKLEIK |
| 137 | hz20-14 VL DNA序列 | GATATCGTGATGACCCAGTCCCCCGACAGCCTGGCCGTGTCTCTGGGAGAGAGGGCCACCATCAACTGTCGGGCTAGCGAGTCTGTGGATACATACGGCAATTCCTTCATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACCTGGCTTCTAACCTGGAGTCCGGCGTGCCTGACAGATTCTCCGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTTACCCTGACAATCGATTCCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTATTGCCAGCAGAACAATGAGGACCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACAAAGCTGGAGATCAAG |
| 138 | hz13-5 VH_ P52aK | EVLLVQSGAEVKKPGASVKLSCTSS DFNIKDHFIHWVRQAPGKGLEWMG RIDKEDDETKYAPKFQDRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVFYCAG YGNYEGAMDYWGQGTLVTVSS |
| 139 | hz13-5 VH_ P52aK DNA序列 | GAGGTGCTGCTGGTGCAGTCTGGCGCTGAAGTGAAGAAGCCCGGAGCTTCTGTGAAGCTGTCCTGCACATCCTCCGACTTCAACATCAAGGACCACTTCATCCACTGGGTGCGGCAAGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGATGGGCCGGATCGACAAAGAGGACGACGAGACCAAGTACGCCCCTAAGTTCCAGGACAGAGTGACCATGACCGCCGATACCTCTACCGATACAGCCTACATGGAACTGTCTAGCCTGAGATCCGAGGATACCGCTGTGTTTTATTGTGCCGGATACGGCAACTACGAGGGCGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCAGC |
| 140 | hz13-5 VH_ I34H P52aK | EVLLVQSGAEVKKPGASVKLSCTSS DFNIKDHFHHWVRQAPGKGLEWMGRIDKEDDETKYAPKFQDRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVFYCAG YGNYEGAMDYWGQGTLVTVSS |
| 141 | hz13-5 VH_ I34H P52aK DNA序列 | GAGGTGCTGCTGGTGCAGTCTGGCGCTGAAGTGAAGAAGCCCGGAGCTTCCGTGAAGCTGTCTTGTACCTCCTCCGACTTCAACATCAAGGATCATTTTCACCACTGGGTGCGGCAAGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGATGGGACGGATCGACAAAGAGGACGACGAGACAAAGTACGCCCCTAAGTTCCAGGACAGAGTGACCATGACCGCTGATACCTCTACCGACACCGCCTACATGGAACTGAGCTCTCTGAGATCCGAGGATACAGCCGTGTTCTACTGCGCCGGCTATGGCAACTACGAGGGCGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCAGC |
| 142 | hz13-5 VH_ I34H H35K P52aK | EVLLVQSGAEVKKPGASVKLSCTSS DFNIKDHFHKWVRQAPGKGLEWMGRIKPEDDETKYAPKFQDRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVFYCAG YGNYEGAMDYWGQGTLVTVSS |
| 143 | hz13-5 VH_ I34H H35K P52aK DNA序列 | GAGGTGCTGCTGGTGCAGTCTGGCGCTGAAGTGAAAAAACCCGGAGCTAGCGTGAAGCTGTCTTGTACCTCCTCCGACTTCAACATCAAGGACCACTTTCACAAGTGGGTGCGGCAAGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGATGGGCCGGATCAAGCCTGAGGACGACGAGACAAAGTACGCCCCTAAGTTCCAGGACAGAGTGACCATGACCGCTGATACCTCTACCGATACCGCCTACATGGAACTGTCCAGCCTGAGATCCGAGGATACAGCCGTGTTCTACTGCGCCGGATATGGCAACTACGAGGGCGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCTCT |
| 144 | hz13-5 VH_ I34H H35K | EVLLVQSGAEVKKPGASVKLSCTSS DFNIKDHFHKWVRQAPGKGLEWMG RIDPEDDETKYAPKFQDRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVFYCAG YGNYEGAMDYWGQGTLVTVSS |
| 145 | hz13-5 VH_ I34H H35K DNA序列 | GAGGTGCTGCTGGTGCAGTCCGGCGCTGAAGTGAAAAAGCCTGGAGCCTCCGTGAAGCTGTCCTGCACCAGCAGCGACTTCAACATCAAGGACCACTTTCACAAGTGGGTGCGGCAAGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGATGGGCAGAATCGACCCTGAGGACGACGAGACCAAGTACGCCCCCAAGTTCCAGGACAGAGTGACCATGACCGCTGATACCTCTACAGATACCGCCTACATGGAACTCTCTTCTCTGAGATCCGAGGATACCGCCGTGTTCTATTGTGCCGGCTACGGCAACTACGAGGGCGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACAGTGTCCTCT |
| 146 | hz13-5 VH_ I34H | EVLLVQSGAEVKKPGASVKLSCTSS DFNIKDHFHHWVRQAPGKGLEWMG RIDPEDDETKYAPKFQDRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVFYCAG YGNYEGAMDYWGQGTLVTVSS |
| 147 | hz13-5 VH_ I34H DNA序列 | GAAGTGCTGCTGGTGCAGAGCGGAGCTGAGGTGAAAAAGCCCGGAGCTTCTGTGAAGCTGTCTTGTACCTCCTCCGACTTCAACATCAAGGACCACTTTCATCACTGGGTGCGGCAAGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGATGGGCCGGATCGATCCTGAGGACGACGAGACAAAGTACGCCCCTAAGTTCCAGGACAGAGTGACCATGACCGCTGATACCTCTACCGACACCGCCTACATGGAACTGTCCTCTCTGAGATCCGAGGATACAGCCGTGTTCTACTGCGCCGGCTATGGCAACTACGAGGGCGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCAGC |
| 148 | hz13-5 VH_ H35K P52aK | EVLLVQSGAEVKKPGASVKLSCTSS DFNIKDHFIKWVRQAPGKGLEWMG RIDKEDDETKYAPKFQDRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVFYCAG YGNYEGAMDYWGQGTLVTVSS |
| 149 | hz13-5 VH_ H35K P52aK DNA序列 | GAAGTGCTGCTGGTGCAGTCTGGCGCTGAGGTGAAAAAGCCCGGAGCTTCCGTGAAGCTGTCCTGCACCTCTTCCGACTTCAACATCAAGGACCACTTCATCAAGTGGGTGCGGCAAGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGATGGGCCGGATCGACAAAGAGGACGACGAGACCAAGTACGCCCCTAAGTTCCAGGACAGAGTGACCATGACCGCTGATACAAGCACCGATACCGCCTACATGGAACTGTCTTCTCTGAGATCCGAGGATACAGCCGTGTTTTATTGTGCCGGCTACGGCAACTACGAGGGCGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCAGC |
| 150 | hz13-5 VH_ H35K | EVLLVQSGAEVKKPGASVKLSCTSS DFNIKDHFIKWVRQAPGKGLEWMG RIDPEDDETKYAPKFQDRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVFYCAG YGNYEGAMDYWGQGTLVTVSS |
| 151 | hz13-5 VH_ H35K DNA序列 | GAAGTGCTGCTGGTGCAGTCTGGCGCTGAGGTGAAAAAGCCTGGAGCCTCCGTGAAGCTGTCTTGTACCTCCTCCGACTTCAACATCAAGGACCACTTCATCAAGTGGGTGCGGCAAGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGATGGGCCGGATCGACCCCGAGGACGACGAGACCAAGTACGCCCCTAAGTTTCAGGACAGAGTGACCATGACCGCTGATACATCTACCGATACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGATCCGAGGATACAGCCGTGTTCTACTGCGCTGGCTATGGCAACTACGAGGGCGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCTCT |
| 152 | hz13-5 VH_ H32W | EVLLVQSGAEVKKPGASVKLSCTSS DFNIKDWFIHWVRQAPGKGLEWMG RIDPEDDETKYAPKFQDRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVFYCAG YGNYEGAMDYWGQGTLVTVSS |
| 153 | hz13-5 VH_ H32W DNA序列 | GAAGTGCTGCTGGTGCAGTCTGGCGCTGAGGTGAAAAAGCCTGGAGCCTCCGTGAAGCTGTCCTGCACCTCCTCCGACTTCAACATCAAGGACTGGTTCATCCACTGGGTCAGACAGGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGATGGGCCGGATCGACCCCGAGGACGACGAGACCAAGTACGCCCCTAAGTTCCAGGACAGAGTGACCATGACCGCTGATACATCTACCGATACCGCCTACATGGAACTGTCTTCTCTGCGGAGCGAGGATACAGCCGTGTTTTATTGTGCTGGCTACGGCAACTACGAGGGCGCCATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTCGTGACCGTGTCCAGC |
| 154 | hz13-5 VH_ D31H P52aK | EVLLVQSGAEVKKPGASVKLSCTSS DFNIKHHFIHWVRQAPGKGLEWMG RIDKEDDETKYAPKFQDRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVFYCAG YGNYEGAMDYWGQGTLVTVSS |
| 155 | hz13-5 VH_ D31H P52aK DNA序列 | GAGGTGCTGCTGGTGCAGAGCGGAGCTGAAGTGAAGAAGCCTGGCGCTTCTGTGAAGCTGTCCTGCACCTCCTCCGATTTCAACATCAAGCACCATTTTATCCACTGGGTGCGGCAAGCTCCCGGCAAGGGCCTGGAATGGATGGGCCGGATCGACAAAGAGGACGACGAGACCAAGTACGCCCCTAAGTTCCAGGACAGAGTGACCATGACCGCTGATACATCTACCGACACCGCCTACATGGAACTGTCTAGCCTGAGATCCGAGGATACAGCCGTGTTCTACTGTGCCGGCTATGGAAACTACGAGGGCGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCTCT |
| 156 | hz13-5 VH_ D31H I34H P52aK | EVLLVQSGAEVKKPGASVKLSCTSS DFNIKHHFHHWVRQAPGKGLEWMG RIDKEDDETKYAPKFQDRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVFYCAG YGNYEGAMDYWGQGTLVTVSS |
| 157 | hz13-5 VH_ D31H I34H P52aK DNA序列 | GAAGTGCTGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCTTCTGTGAAGCTGTCCTGCACCTCCTCCGACTTCAACATCAAGCACCATTTTCACCACTGGGTGCGGCAAGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGATGGGCCGGATCGATAAAGAGGACGACGAGACAAAGTACGCCCCTAAGTTCCAGGACAGAGTGACCATGACCGCTGATACCTCTACCGACACCGCCTACATGGAACTGTCTAGCCTGAGATCCGAGGATACAGCCGTGTTCTATTGTGCCGGCTACGGCAACTACGAGGGAGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCAGC |
| 158 | hz13-5 VH_ D31H I34H H35K P52aK | EVLLVQSGAEVKKPGASVKLSCTSS DFNIKHHFHKWVRQAPGKGLEWMG RIDKEDDETKYAPKFQDRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVFYCAG YGNYEGAMDYWGQGTLVTVSS |
| 159 | hz13-5 VH_ D31H I34H H35K P52aK DNA序列 | GAGGTGCTGCTGGTGCAGTCCGGCGCTGAAGTGAAAAAGCCTGGAGCTTCTGTGAAGCTGTCCTGCACCTCTTCCGACTTCAACATCAAGCACCATTTCCACAAGTGGGTGCGGCAAGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGATGGGCCGGATCGACAAAGAGGACGACGAGACCAAGTACGCCCCCAAGTTCCAGGACAGAGTGACCATGACCGCTGATACAAGCACCGATACCGCCTACATGGAACTGTCTTCTCTGAGATCCGAGGATACAGCCGTGTTTTATTGTGCTGGCTACGGCAACTACGAGGGCGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCAGC |
| 160 | hz13-5 VH_ D31H I34H H35K | EVLLVQSGAEVKKPGASVKLSCTSS DFNIKHHFHKWVRQAPGKGLEWMG RIDPEDDETKYAPKFQDRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVFYCAG YGNYEGAMDYWGQGTLVTVSS |
| 161 | hz13-5 VH_ D31H I34H H35K DNA序列 | GAGGTGCTGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAAGTGAAAAAGCCTGGAGCTTCCGTGAAGCTGTCCTGCACCTCTAGCGACTTCAACATCAAGCACCATTTTCACAAGTGGGTGCGGCAAGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGATGGGCCGGATCGACCCCGAGGACGACGAGACAAAGTACGCCCCTAAGTTCCAGGACAGAGTGACCATGACCGCTGATACCTCCACCGACACCGCCTACATGGAACTCTCTTCTCTGAGATCCGAGGATACAGCCGTGTTCTATTGTGCCGGCTACGGCAACTACGAGGGCGCCATGGATTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCAGC |
| 162 | hz13-5 VH_ D31H I34H | EVLLVQSGAEVKKPGASVKLSCTSS DFNIKHHFHHWVRQAPGKGLEWMG RIDPEDDETKYAPKFQDRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVFYCAG YGNYEGAMDYWGQGTLVTVSS |
| 163 | hz13-5 VH_ D31H I34H DNA序列 | GAGGTGCTGCTGGTGCAGTCCGGCGCTGAAGTGAAGAAACCTGGCGCTTCTGTCAAGCTGTCCTGTACATCTAGCGACTTCAACATCAAGCACCACTTCCATCACTGGGTGCGGCAAGCTCCTGGAAAGGGCCTGGAATGGATGGGCAGAATCGACCCTGAGGACGACGAGACCAAGTACGCCCCCAAGTTTCAGGACAGAGTGACCATGACCGCCGATACCTCCACCGATACAGCCTACATGGAACTGTCTTCTCTGCGGTCCGAGGATACCGCTGTGTTCTACTGCGCCGGCTATGGCAACTACGAGGGAGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTCGTGACCGTGTCCAGC |
| 164 | hz13-5 VH_ D31H H35K P52aK | EVLLVQSGAEVKKPGASVKLSCTSS DFNIKHHFIKWVRQAPGKGLEWMG RIDKEDDETKYAPKFQDRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVFYCAG YGNYEGAMDYWGQGTLVTVSS |
| 165 | hz13-5 VH_ D31H H35K P52aK DNA序列 | GAGGTGCTGCTGGTGCAGAGCGGAGCTGAAGTGAAAAAGCCCGGAGCTTCTGTGAAGCTGTCTTGTACCTCCTCCGACTTCAACATCAAGCACCACTTCATCAAGTGGGTGCGGCAAGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGATGGGCCGGATCGACAAAGAGGACGACGAGACCAAGTACGCCCCTAAGTTTCAGGACAGAGTGACCATGACCGCTGATACATCTACCGATACAGCCTACATGGAACTGTCCTCTCTGAGATCCGAGGATACCGCCGTGTTCTACTGCGCCGGCTATGGCAACTACGAGGGCGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCAGC |
| 166 | hz13-5 VH_ D31H H35K | EVLLVQSGAEVKKPGASVKLSCTSS DFNIKHHFIKWVRQAPGKGLEWMG RIDPEDDETKYAPKFQDRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVFYCAG YGNYEGAMDYWGQGTLVTVSS |
| 167 | hz13-5 VH_ D31H H35K DNA序列 | GAGGTGCTGCTGGTGCAGTCTGGCGCTGAAGTGAAAAAGCCTGGAGCTTCCGTGAAGCTGTCCTGCACCTCTAGCGACTTCAACATCAAGCACCACTTCATCAAGTGGGTGCGGCAAGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGATGGGCCGGATCGATCCCGAGGACGACGAGACCAAGTACGCCCCTAAGTTCCAGGACAGAGTGACCATGACCGCTGATACCTCCACCGACACAGCCTACATGGAACTGTCTTCTCTGAGATCCGAGGATACCGCCGTGTTTTATTGTGCCGGCTACGGCAACTACGAGGGAGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACAGTGTCCAGC |
| 168 | hz13-5 VH_ D31H | EVLLVQSGAEVKKPGASVKLSCTSS DFNIKHHFIHWVRQAPGKGLEWMG RIDPEDDETKYAPKFQDRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVFYCAG YGNYEGAMDYWGQGTLVTVSS |
| 169 | hz13-5 VH_ D31H DNA序列 | GAGGTGCTGCTGGTGCAGTCTGGCGCTGAAGTGAAAAAGCCTGGAGCCTCCGTGAAGCTGTCTTGCACCTCCTCCGACTTCAACATCAAGCACCATTTTATCCACTGGGTGCGGCAAGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGATGGGCCGGATCGACCCCGAGGACGACGAGACCAAGTACGCCCCTAAGTTCCAGGACAGAGTGACCATGACCGCTGATACATCTACCGATACCGCCTACATGGAACTCAGCTCTCTGAGATCCGAGGATACAGCCGTGTTCTATTGTGCTGGCTACGGCAACTACGAGGGCGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCAGC |
| 170 | 以下之VL序列：hz13-5 VH_ P52aK、hz13-5 VH_ I34H P52aK、hz13-5 VH_ I34H H35K P52aK、hz13-5 VH_ I34H H35K、hz13-5 VH_ I34H、hz13-5 VH_ H35K P52aK、hz13-5 VH_ H35K、hz13-5 VH_ H32W、hz13-5 VH_ D31H P52aK、hz13-5 VH_ D31H I34H P52aK、hz13-5 VH_ D31H I34H H35K P52aK、hz13-5 VH_ D31H I34H H35K、hz13-5 VH_ D31H I34H、hz13-5 VH_ D31H H35K P52aK、hz13-5 VH_ D31H H35K、hz13-5 VH_ D31H | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASENVNNYGIGFMNWFQQKPGKAPKLLIY AASRRGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFC QQSKEVPYTFGQGTKVEIK |
| 171 | 以下之VL DNA序列：hz13-5 VH_ P52aK、hz13-5 VH_ I34H P52aK、hz13-5 VH_ I34H H35K P52aK、hz13-5 VH_ I34H H35K、hz13-5 VH_ I34H、hz13-5 VH_ H35K P52aK、hz13-5 VH_ H35K、hz13-5 VH_ H32W、hz13-5 VH_ D31H P52aK、hz13-5 VH_ D31H I34H P52aK、hz13-5 VH_ D31H I34H H35K P52aK、hz13-5 VH_ D31H I34H H35K、hz13-5 VH_ D31H I34H、hz13-5 VH_ D31H H35K P52aK、hz13-5 VH_ D31H H35K、hz13-5 VH_ D31H | GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCAGCCTGTCTGCCTCCGTGGGCGATAGAGTGACCATCACATGTCGCGCTTCCGAGAACGTGAACAATTACGGCATCGGCTTCATGAATTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTATGCTGCTAGCAGGAGGGGCTCTGGAGTGCCCTCCAGGTTCAGCGGCTCTGGCTCCGGAACCGACTTTACCCTGACAATCTCTTCCCTGCAGCCTGAGGATTTCGCTACATACTTTTGCCAGCAGTCCAAGGAGGTGCCATATACCTTCGGCCAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAG |
| 172 | 以下之VL_I30H蛋白質序列：hz13-5 VH_ P52aK::Vk_I30H、hz13-5 VH_ I34H、P52aK::Vk_ I30H、hz13-5 VH_ I34H H35K P52aK::Vk_I30H、hz13-5 VH_ I34H H35K::VK_I30H、hz13-5 VH_ I34H::Vk_I30H、hz13-5 VH_ H35K P52aK::Vk_I30H、hz13-5 VH_ H35K::Vk_ I30H、hz13-5 VH_ D31H P52aK::Vk_ I30H、hz13-5 VH_ D31H I34H P52aK::Vk_ I30H、hz13-5 VH_ D31H I34H H35K P52aK::Vk_ I30H、hz13-5 VH_ D31H I34H H35K::Vk_ I30H、hz13-5 VH_ D31H I34H::Vk_I30H、hz13-5 VH_ D31H H35K P52aK::Vk_ I30H、hz13-5 VH_ D31H H35K::Vk_I30H、hz13-5 VH_ D31H::Vk_I30H | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASENVNNYG HGFMN WFQQKPGKAPKLLIY AASRRGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFC QQSKEVPYTFGQGTKVEIK |
| 173 | 以下之Vk_I30H DNA序列：hz13-5 VH_ P52aK::Vk_I30H、hz13-5 VH_ I34H、P52aK::Vk_ I30H、hz13-5 VH_ I34H H35K P52aK::Vk_I30H、hz13-5 VH_ I34H H35K::VK_I30H、hz13-5 VH_ I34H::Vk_I30H、hz13-5 VH_ H35K P52aK::Vk_I30H、hz13-5 VH_ H35K::Vk_ I30H、hz13-5 VH_ D31H P52aK::Vk_ I30H、hz13-5 VH_ D31H I34H P52aK::Vk_ I30H、hz13-5 VH_ D31H I34H H35K P52aK::Vk_ I30H、hz13-5 VH_ D31H I34H H35K::Vk_ I30H、hz13-5 VH_ D31H I34H::Vk_I30H、hz13-5 VH_ D31H H35K P52aK::Vk_ I30H、hz13-5 VH_ D31H H35K::Vk_I30H、hz13-5 VH_ D31H::Vk_I30H | GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCAGCCTGTCTGCTTCCGTGGGCGACAGAGTCACAATCACCTGTAGAGCCTCCGAAAACGTGAACAACTACGGCCATGGCTTCATGAACTGGTTCCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCCAAACTGCTGATCTACGCTGCTTCACGCCGGGGATCTGGCGTGCCCTCCCGGTTCTCCGGCTCCGGCTCTGGAACCGATTTTACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGCCTGAGGACTTCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGTCCAAAGAGGTGCCTTACACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAAATCAAG |
| 174 | hIgG1 HC恆定區 | ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| 175 | hIgG1 HC恆定區 DNA | GCGTCGACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAG |
| 176 | 無C端離胺酸之hIgG1 HC恆定區 | ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 177 | 無C端離胺酸之hIgG1 HC恆定區DNA | GCGTCGACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGT |
| 178 | hIgG1.3f HC恆定區；IgG 1.3包含突變L234A、L235E及G237A，此處以粗體及下劃線顯示。 | ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AE G A PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| 179 | hIgG1.3f HC恆定區DNA序列 | GCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGAAGGGGCCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAG |
| 180 | 無C端離胺酸之hIgG1.3f HC恆定區；IgG 1.3突變L234A、L235E及G237A在此處以粗體及下劃線顯示。 | ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AE G A PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 181 | 無C端離胺酸之hIgG1.3f HC恆定區；DNA序列 | GCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGAAGGGGCCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGT |
| 182 | hIgG1fa L235E、P238K (LEPK) HC恆定區；取代係以粗體下劃線顯示 | ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEL E GG K SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| 183 | hIgG1fa LEPK HC恆定區DNA序列 | GCGTCGACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGAGGGGGGAAAGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAA |
| 184 | 無C端離胺酸之hIgG1fa LEPK HC恆定區 | ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEL E GG K SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 185 | 無C端離胺酸DNA序列之hIgG1fa LEPK HC恆定區 | GCGTCGACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGAGGGGGGAAAGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGT |
| 186 | hIgG2.3 HC恆定區 | ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| 187 | hIgG2.3 HC恆定區DNA | GCGTCGACCAAGGGCCCCTCTGTGTTTCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACCTCTGAGTCTACCGCTGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCTCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCTCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCCTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGTAACGTGGACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAACGGAAGTCCTGCGTGGAATGCCCTCCTTGCCCTGCACCTCCTGTGGCTGGCAAATCCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAGACCATCTCCAAGACAAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCCAGCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCATTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCCCGGCAAA |
| 188 | 無C端離胺酸之hIgG2.3 HC恆定區 | ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 189 | 無C端離胺酸DNA之hIgG2.3 HC恆定區 | GCGTCGACCAAGGGCCCCTCTGTGTTTCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACCTCTGAGTCTACCGCTGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCTCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCTCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCCTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGTAACGTGGACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAACGGAAGTCCTGCGTGGAATGCCCTCCTTGCCCTGCACCTCCTGTGGCTGGCAAATCCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAGACCATCTCCAAGACAAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCCAGCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCATTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCCCGGC |
| 190 | hIgG2.3 P238K HC恆定區 | ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAG K SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| 191 | hIgG2.3 P238K HC恆定區DNA序列 | GCGTCGACCAAGGGCCCCTCTGTGTTTCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACCTCTGAGTCTACCGCTGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCTCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCTCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCCTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGTAACGTGGACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAACGGAAGTCCTGCGTGGAATGCCCTCCTTGCCCTGCACCTCCTGTGGCTGGCAAATCCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAGACCATCTCCAAGACAAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCCAGCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCATTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCCCGGCAAA |
| 192 | 無C端離胺酸之hIgG2.3 P238K HC恆定區 | ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAG K SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 193 | 無C端離胺酸DNA序列之hIgG2.3 P238K HC恆定區 | GCGTCGACCAAGGGCCCCTCTGTGTTTCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACCTCTGAGTCTACCGCTGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCTCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCTCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCCTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGTAACGTGGACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAACGGAAGTCCTGCGTGGAATGCCCTCCTTGCCCTGCACCTCCTGTGGCTGGCAAATCCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAGACCATCTCCAAGACAAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCCAGCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCATTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCCCGGC |
| 194 | 例示性LC恆定區 | RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
| 195 | 例示性LC恆定區DNA序列 | CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT |
| 196 | hz13 -5 D31E HC | EVLLVQSGAEVKKPGASVKLSCTSSDFNIKEHFIHWVRQAPGKGLEWMGRIDPEDDETKYAPKFQDRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVFYCAGYGNYEGAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| 197 | hz13 -5 D31E HC DNA序列 | GAAGTGCTGCTGGTGCAGTCTGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGAGCTAGCGTGAAGCTGTCCTGCACCTCCTCCGACTTCAACATCAAAGAGCACTTCATCCACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGATGGGCCGGATCGACCCTGAGGACGACGAGACCAAGTACGCCCCCAAGTTTCAAGATAGAGTGACCATGACCGCCGATACCTCTACCGACACAGCCTACATGGAACTGAGCTCTCTGAGATCCGAGGATACAGCTGTGTTCTATTGTGCTGGCTACGGCAACTACGAGGGAGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTCGTCACCGTGTCCTCTGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGAAGGGGCCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAA |
| 198 | 無C端離胺酸之hz13-5 D31E HC | EVLLVQSGAEVKKPGASVKLSCTSSDFNIKEHFIHWVRQAPGKGLEWMGRIDPEDDETKYAPKFQDRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVFYCAGYGNYEGAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 199 | 無C端離胺酸DNA之hz13-5 D31E HC DNA序列 | GAAGTGCTACTAGTGCAAAGTGGTGCAGAAGTCAAGAAGCCTGGAGCTTCCGTGAAGCTGTCCTGCACCAGCTCCGACTTCAACATCAAGGAACACTTCATCCACTGGGTGCGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAATGGATGGGCAGAATCGATCCTGAGGACGACGAGACCAAGTACGCCCCTAAATTTCAGGACAGAGTGACCATGACAGCTGATACCAGCACCGACACCGCCTACATGGAACTGTCTTCTCTGAGATCCGAGGATACAGCCGTGTTCTACTGTGCTGGATATGGCAACTACGAGGGCGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGAAGGGGCCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGT |
| 200 | hz13-5 D31E LC | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENVNNYGIGFMNWFQQKPGKAPKLLIYAASRRGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQSKEVPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
| 201 | hz13-5 D31E LC DNA序列 | GACATCCAGATGACCCAATCGCCATCGTCCCTGTCCGCATCCGTGGGAGACAGAGTGACAATTACTTGCCGGGCCAGCGAAAACGTGAACAACTACGGCATTGGCTTCATGAACTGGTTCCAGCAAAAGCCAGGAAAGGCCCCGAAGCTCCTGATCTACGCCGCAAGCCGGAGAGGTTCCGGAGTGCCCTCACGGTTCTCCGGCTCCGGATCTGGAACCGACTTCACACTGACCATTAGCAGCCTCCAGCCTGAGGACTTCGCCACCTACTTCTGCCAACAATCCAAGGAGGTGCCCTACACCTTTGGACAAGGCACCAAGGTCGAGATCAAGAGGACGGTGGCGGCACCCTCCGTGTTTATCTTCCCGCCGTCCGACGAACAGCTTAAGTCCGGCACTGCTTCGGTCGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTATCCTCGCGAGGCCAAAGTGCAGTGGAAGGTCGATAACGCGCTGCAGTCCGGGAATTCACAGGAATCAGTGACCGAACAGGATTCGAAGGACTCCACTTACTCGCTGTCGAGCACTCTCACTCTGAGCAAGGCCGACTACGAAAAGCACAAAGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCATCAGGGTTTGTCCTCCCCTGTGACCAAGAGCTTCAACAGAGGGGAGTGC |
| 202 | hz13-12 D31E HC | EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCTSSDFNIKEHFIHWVQQAPGKGLEWMGRIDPEDDETKYAPKFQDRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGYGNYEGAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| 203 | hz13-12 D31E HC DNA序列 | GAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGCGCTGAAGTGAAGAAGCCTGGAGCTACCGTCAAGATCTCCTGCACCTCCTCCGACTTCAACATCAAAGAGCACTTCATCCACTGGGTGCAGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGATGGGCCGGATCGATCCTGAGGACGACGAGACAAAGTACGCCCCCAAGTTTCAGGACAGAGTGACCATCACCGCTGATACATCTACCGACACCGCCTACATGGAACTGAGCTCTCTGCGGTCCGAGGATACCGCCGTGTACTATTGTGCTGGCTACGGCAACTACGAGGGCGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCCAGCGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGAAGGGGCCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAA |
| 204 | 無C端離胺酸之hz13-12 D31E HC | EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCTSSDFNIKEHFIHWVQQAPGKGLEWMGRIDPEDDETKYAPKFQDRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGYGNYEGAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 205 | 無C端離胺酸之hz13-12 D31E HC DNA序列 | GAGGTGCAACTGGTGCAGTCGGGAGCCGAAGTCAAGAAGCCTGGAGCCACCGTGAAGATCAGTTGCACCAGTTCCGATTTCAACATCAAGGAGCACTTCATCCACTGGGTGCAACAGGCTCCGGGAAAGGGCCTCGAGTGGATGGGGCGGATTGATCCCGAGGACGACGAAACCAAATACGCCCCGAAGTTTCAGGACCGGGTCACCATTACCGCCGACACCAGCACCGACACTGCGTACATGGAACTGTCGTCCCTGCGCTCCGAGGATACCGCCGTGTACTATTGCGCCGGTTACGGGAACTACGAGGGTGCCATGGATTACTGGGGACAGGGAACCACCGTGACTGTGTCCAGCGCGTCCACTAAGGGACCTTCAGTGTTCCCGCTGGCTCCTAGCTCAAAGTCCACCTCGGGAGGCACTGCAGCTCTGGGTTGCCTCGTGAAGGACTACTTCCCTGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAATTCCGGCGCTCTTACCTCCGGAGTGCATACTTTCCCCGCCGTGCTCCAAAGCTCCGGCCTGTACAGCCTGTCCTCCGTCGTGACTGTCCCGAGCTCGTCCCTGGGAACCCAGACTTACATTTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCAAACACCAAGGTCGATAAGAGGGTGGAACCCAAGAGCTGTGACAAGACTCACACTTGCCCGCCATGTCCAGCCCCTGAAGCCGAGGGTGCCCCATCTGTGTTTCTGTTCCCGCCCAAACCGAAGGACACCCTGATGATCTCAAGAACCCCGGAGGTCACCTGTGTGGTGGTCGACGTGTCCCACGAGGATCCCGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGACGGGGTGGAGGTCCATAACGCCAAGACAAAGCCGAGAGAGGAGCAGTACAACTCCACGTATCGCGTTGTCTCCGTGCTGACCGTGCTGCATCAGGACTGGCTCAACGGAAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCGAACAAGGCGTTGCCGGCACCAATCGAAAAGACTATCTCGAAAGCGAAGGGACAGCCCAGGGAGCCTCAGGTCTACACACTGCCTCCAAGCCGGGAAGAAATGACTAAGAACCAAGTGTCGCTGACTTGCCTTGTGAAGGGCTTTTACCCCTCCGACATTGCCGTCGAATGGGAATCCAACGGGCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCGCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCTTGTACTCGAAGCTGACCGTGGATAAGTCCCGGTGGCAACAGGGCAATGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAAGCCCTCCACAACCACTACACGCAGAAGTCCCTGTCGCTTTCACCCGGC |
| 206 | hz13-12 D31E LC | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRASENVNNYGIGFMNWFQQRPGQSPRLLIYAASRRGSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEEEDVGVYYCQQSKEVPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
| 207 | hz13-12 D31E LC DNA序列 | GACGTCGTGATGACCCAGTCGCCCCTGTCGTTGCCCGTGACTCTGGGTCAGCCTGCCTCAATTAGCTGTAGGGCCAGCGAGAACGTGAACAACTACGGAATCGGGTTCATGAACTGGTTCCAGCAACGCCCGGGACAAAGCCCCCGGCTGCTGATCTACGCCGCGTCAAGACGGGGTTCAGGAGTGCCAGATCGGTTCTCTGGTTCCGGATCGGGCACCGACTTCACGCTGAAAATCTCCCGCGTGGAAGAGGAGGACGTGGGAGTGTATTACTGTCAGCAGTCCAAGGAAGTGCCTTACACCTTCGGCGGCGGAACTAAGGTCGAGATTAAGAGGACCGTGGCTGCTCCTTCCGTGTTTATCTTCCCGCCGTCCGATGAACAGCTGAAGTCCGGGACTGCCAGCGTCGTGTGCCTGCTCAACAACTTTTACCCGCGGGAGGCCAAAGTGCAGTGGAAGGTCGACAACGCGCTCCAATCCGGCAATAGCCAGGAATCCGTGACCGAGCAGGACTCGAAGGATTCCACATACTCCCTGTCCTCGACCCTTACTCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTCTACGCCTGCGAAGTGACCCATCAAGGACTTTCCAGCCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGCGGCGAATGC |
| 208 | mumAb (鼠類替代) VH | EVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASDHTFT TYWIH WVKQRPGRGLEWIG RIGPNSGGSKYNEKFRT KATLTVDKPSSTAYMQLSSLKSEDSAVYFCAF SNYLDYLDY WGQGTTLTVSS |
| 209 | mumAb VH DNA序列 | GAGGTCCAGCTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGACCACACCTTCACCACCTACTGGATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACGAGGCCTTGAGTGGATTGGAAGGATTGGTCCTAATAGTGGTGGTTCTAAATACAATGAGAAGTTCAGGACCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAACCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGAAATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTTTGTGCCTTTAGTAACTACTTGGACTACCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA |
| 210 | muAb VL | DIVLTQSPASLAVSLGQRATISC KASQSVDHDGEGYMN WYQQKPGQPPKLLIY AASNLE SGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC QQINEDPYT FGGGTKLEIK |
| 211 | mumAb VL DNA序列 | GACATTGTGCTCACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTTGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATCATGATGGTGAAGGTTATATGAACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAATCTAGAATCTGGGATCCCAGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACTTATTACTGTCAGCAAATTAATGAGGATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA |
| 212 | mumAb HC; mIgG1 D265A | EVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASDHTFTTYWIHWVKQRPGRGLEWIG RIGPNSGGSKYNEKFRTKATLTVDKPSSTAYMQLSSLKSEDSAVYFCAF SNYLDYLDYWGQGTTLTVS SAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPG |
| 213 | mumAb HC DNA序列 | GAGGTCCAGCTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGACCACACCTTCACCACCTACTGGATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACGAGGCCTTGAGTGGATTGGAAGGATTGGTCCTAATAGTGGTGGTTCTAAATACAATGAGAAGTTCAGGACCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAACCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGAAATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTTTGTGCCTTTAGTAACTACTTGGACTACCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCTAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCGCTGGCCCCTGGATCCGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGCTCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGCCATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGT |
| 214 | mumAb LC; mIgG1 D265A | DIVLTQSPASLAVSLGQRATISC KASQSVDHDGEGYMNWYQQKPGQPPKLLIY AASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC QQINEDPYTFGGGTKLEIK RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC |
| 215 | mumAb LC DNA序列 | GACATTGTGCTCACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTTGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATCATGATGGTGAAGGTTATATGAACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAATCTAGAATCTGGGATCCCAGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACTTATTACTGTCAGCAAATTAATGAGGATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAATTGACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACCGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGT |
| 216 | PAD4分析受質 | TSTGGRQGSHH |
| 217 | 植株13的一級HDX表位 | FEGIKKKKQQKIKNILSNKTLREHNSF |
| 218 | 植株13的二級HDX表位 | FQEQQNEGHGEALL |
| 219 | 植株20的一級HDX表位 | INDFFTYHIRHGEVHCGTN |
| 220 | 植株20的二級HDX表位 | CPEEENMDDQW |
| 221 | 植株13 HC互補位區域1 | FNIKDHF |
| 222 | 植株13 HC互補位區域2 | FYCAGYGNYEGAMDY |
| 223 | 植株13 LC互補位區域1 | SENVNNYGIGFM |
| 224 | 植株13 LC互補位區域2 | VCFLNNFY |
| 225 | Hz13-5 D31E HC互補位區域1 | FNIK E HF |
| 226 | 具有his標籤之PAD4植株13 Fab；HC；方括號[]指示恆定區 | EVLLQQSGAELVKPGASVRLSCTSS DFNIKDHFIHWVKQRTEQGLEWIG RIDPEDDETKYAPKFQDKVTITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVFYCAG YGNYEGAMDYWGQGTSVTVSS[AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGG]HHHHHH |
| 227 | PAD4植株13 Fab；HC；方括號[]指示恆定區 | EVLLQQSGAELVKPGASVRLSCTSS DFNIKDHFIHWVKQRTEQGLEWIG RIDPEDDETKYAPKFQDKVTITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVFYCAG YGNYEGAMDYWGQGTSVTVSS[AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGG] |
| 228 | PAD4植株13 Fab；LC；方括號[]指示恆定區 | DIVLTQSPTSLGVSPGQRATLSC RASENVNNYGIGFMNWFQQKPGQPPKLLIY AASRRGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFC QQSKEVPYTFGGGTNLEIR[RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC] |
| 229 | 具有his標籤之PAD4植株20 Fab；HC；mIgG1 CH1及小鼠κ恆定區 | QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKAT GYTFTNYGISWVKQRTGQGLEWIG EIYPRSGNTYHNEKFKDKATLTADKSSSTAYMEFRSLTSEDSAVYFCAR SMITTRYWYFDVWGKGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGGHHHHHH |
| 230 | PAD4植株20 Fab；HC；mIgG1 CH1及小鼠κ恆定區 | QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKAT GYTFTNYGISWVKQRTGQGLEWIG EIYPRSGNTYHNEKFKDKATLTADKSSSTAYMEFRSLTSEDSAVYFCAR SMITTRYWYFDVWGKGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGG |
| 231 | 植株20 Fab；LC；mIgG1 CH1及小鼠κ恆定區 | NIVLTQSPASLAVSLGQRATLSC RASESVDTYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIY LASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYC QQNNEDPLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC |
| 232 | 精胺酸包被之線性肽 | SHQEST RGKSKGKAAAAA |
| 233 | hz13-12 D31E VH | EVQLVQSGAEVKKPGATVKISC TSS DFNIKEHFIHWVQQAPGKGLEWMG RIDPEDDETKYAPKFQDRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCA G YGNYEGAMDYWGQGTTVTVSS |
| 234 | hz13-12 D31E VL | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISC RASENVNNYGIGFMNWFQQRPGQSPR LLIY AASRRGSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE EEDVGVYYC QQSKEVPYTFGGGTKVEIK |
| 235 | 對應於植株13 LC互補位區域2之人類LC恆定區片段 | VCLLNNFY |
| 236 | 例示性PRG4肽序列(人類) | AITT RSGQTLSK |
| 237 | 例示性FGA肽序列(人類) | QFTSSTSYN RGDSTFESK |
| 238 | 例示性ITIH4肽序列(人類) | QLGLPGPPDVPDHAAYHPF RR |
| 239 | 例示性AMBP肽序列(人類) | GPC RAFIQLWAFDAVK |
| 240 | 例示性GSN肽序列(人類) | ATAS RGASQAGAPQGR |
| 241 | 例示性FGA肽序列(人類) | ESSSHHPGIAEFPS R GK |
| 242 | 例示性C3肽序列(人類) | SGQSED R QPVPGQQMTLK |
| 243 | 例示性C3肽序列(人類) | ASHLGLA R SNLDEDIIAEENIVSR |
| 244 | 例示性A2M肽序列(人類) | VGFYESDVMG R GHAR |
| 245 | 例示性HP肽序列(人類) | L R TEGDGVYTLNDK |
| 246 | 例示性TF肽序列(人類) | DLLF R DDTVCLAK |
圖1A至圖1D顯示例示性鼠類抗人類PAD4抗體(Ab)殖株之活性。圖1A及圖1B顯示基於精胺酸向瓜胺酸之轉化，抗體植株對PAD4活性之影響，其中圖1A顯示PAD4活性百分比且圖1B顯示在抗體植株存在下的瓜胺酸濃度。圖1C及圖1D顯示抗體以劑量依賴性方式抑制PAD4。圖1C顯示抗體殖株13之劑量反應曲線。圖1D顯示抗體殖株20之劑量反應曲線。
圖1E至圖1H顯示植株13之VH及VL胺基酸序列(VH=圖1E；VL=圖1F)及植株20 之VH及VL胺基酸序列(VH=圖1G；VL=圖1H)。在圖1E至1H中所示之序列中，(1) HCDR1、HCDR2及HCDR3序列分別位於胺基酸位置26至35、50至65及95至102；及(2) LCDR1、LCDR2及LCDR3序列分別位於胺基酸位置24至34、50至56及89至97。在圖1E及圖1G中，根據CDR之AbM定義，HCDR1顯示於胺基酸位置26至35處(圖1E及圖1G) (Abhinandan及Martin, Mol. Immunol. 45:3832-3839 (2008)；Swindells等人，J. Mol. Biol. 429:356-364 (2017))。根據Kabat編號方案，HCDR1實際上位於胺基酸位置31至35處(未顯示)。其餘CDR (HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3；圖1E至圖1H)係根據Kabat編號方案編號。
圖2顯示，PAD4抗體對PAD4具有特異性且實質上不抑制PAD2活性。
圖3A至圖3X顯示抗體穩定性，其係藉由尺寸排阻層析法(SEC)及肽定位評估。圖3A顯示20種例示性人源化(hz)植株13及20抗體之SEC結果。圖3B顯示例示性hz植株20抗體之肽定位結果。圖3C至圖3D顯示例示性hz植株13抗體之肽定位結果。圖3E及圖3F分別顯示hz13-12及hz13-5之SEC結果。圖3G至圖3J顯示hz13-12之肽定位結果。圖3K至圖3N顯示hz13-5之肽定位結果。圖3O及圖3P分別顯示hz13-12 D31E及hz13-5 D31E之SEC結果。圖3Q及圖3R分別顯示hz13-12 D31E及hz13-5 D31E之肽定位結果。圖3S顯示hz13-5之SEC結果。圖3T顯示hz13-5 D31E之SEC結果。圖3U及圖3V分別顯示高濃度hz13-5及hz13-5D31E之肽定位結果。圖3W及圖3X分別顯示hz13-5 D31E之SEC結果及肽定位結果。
圖4A至圖4B顯示藉由HDX-MS測定的植株13 (圖4A)及植株20 (圖4B)的表位。hPAD4中Fab結合後HDX顯著減少的區域被加框(黑線框表示一級表位；灰線框表示二級表位)。對於每種抗體而言，一級表位以相應黑線框上方帶下劃線的黑色文字顯示，二級表位以相應灰線框上方較小的文字顯示。
圖5A至圖5B顯示藉由FPOP、GEE及DEPC標記確定的植株13 (圖5A)及植株20 (圖5B)的結合殘基。受保護的殘基，在hPAD4與hPAD4/Fab之間的標記%差異具有統計顯著性(基於司徒頓T-測試，p值＜0.01)，並以星號標記。所得的MS/MS片段不足，無法區分對H644及C645的保護；此兩個殘基均被認為係植株20的結合殘基。
圖6顯示植株13及植株20之表位概述。藉由HDX-MS確定之表位區帶框。藉由FPOP、GEE及DEPC標記確定之結合殘基加下劃線且以粗體突出顯示。
圖7A至圖7B顯示胃蛋白酶對植株13 (HC；圖7A)及植株13輕鏈(LC；圖7B)的序列覆蓋。各條形表示胃蛋白酶肽。互補決定區(CDR)帶框。
圖8A至圖8B顯示在與hPAD4結合後植株13 Fab HC (圖8A)及植株13 Fab LC (圖8B)中HDX顯著減少的區域。植株13之互補位區域帶框。
圖9A至圖9B顯示PAD4.植株13 Fab複合物的低溫電子顯微術(Cryo-EM)結構。圖9A顯示PAD4.植株13 Fab單體。PAD4殘基係以三個字母碼編號。圓圈內係催化位點之大致位置。圖9B顯示PAD4.Fab13二聚體。
圖10顯示植株13之殘基D31及在PAD4與植株13 Fab之重鏈的界面處的相互作用。Fab殘基係以單一殘基碼編號，而PAD4殘基係以三字母碼編號。
圖11顯示人類PAD4之受質結合位點(PDB碼2DEW)。顯示離胺酸環及催化螺旋(離胺酸環包括LYS-519及ILE-526，且催化螺旋包括ILE-630及ILE-638)。共結晶受質肽之精胺酸殘基係以棒狀表現形式顯示。2DEW結構中之Ca
2+離子顯示為球體。
圖12顯示來自2DEW及PAD.植株13 Fab cryoEM結構之PAD4鏈的疊加。2DEW係以淺灰色陰影的卡通表現形式顯示，而來自PAD4.植株13 Fab cryoEM結構的PAD4係以黑色卡通顯示。植株13 Fab之重鏈及輕鏈顯示為細帶。PAD4殘基係以三字母碼編號，而植株13 Fab殘基係以單字母碼編號。離胺酸環之移動及其對催化螺旋之影響已由黑色箭頭顯示。2DEW結構中之Ca
2+離子顯示為球體。
圖13A至圖13N顯示來自pH依賴性抗PAD4抗體研究的熱圖(圖13A至圖13L)及SPR (圖13M至圖13N)量測值。在圖13A至圖13L所示的熱圖中，(1) ER值小於1表明取代將削弱與PAD4的結合，(2)數值大於1.00表明胺基酸取代將導致與PAD4更強的結合，並且(3) 1.00表明胺基酸取代不會導致結合變化(亦即，結合不會因為突變而更強或更弱)。在pH 7 (圖13A、圖13C、圖13E、圖13G、圖13I及圖13K)及pH 6 (圖13B、圖13D、圖13F、圖13H、圖13J及圖13L)下測試pH依賴性抗PAD4抗體。圖13A顯示在pH 7下植株13 (mAb13)之HCDR1。圖13B顯示在pH 6下植株13 (mAb13)之HCDR1。圖13C顯示在pH 7下植株13 (mAb13)之HCDR2。圖13D顯示在pH 6下植株13 (mAb13)之HCDR2。圖13E顯示在pH 7下植株(mAb13)之HCDR3。圖13F顯示在pH 6下植株13 (mAb13)之HCDR3。圖13G顯示在pH 7下植株13 (mAb13)之LCDR1。圖13H顯示在pH 6下植株13 (mAb13)之LCDR1。圖13I顯示在pH 7植株13 (mAb13)之LCDR2。圖13J顯示在pH 6下植株13 (mAb13)之LCDR2。圖13K顯示在pH 7下植株13 (mAb13)之HCDR3。圖13L顯示在pH 6下植株13 (mAb13)之LCDR3。圖13M至圖13N顯示例示性抗PAD4抗體hz13-5在pH 7.6 (圖13M)和pH 6.0 (圖13N)下記錄的SPR量測值。pH依賴性變異體*為hz13-5 VH_D31H::Vk_I30H。在pH 6.0下觀測到解離階段信號略微增加，其可能係由於PAD4在pH 6.0下穩定性較低從而可能導致PAD4在表面上發生一些聚集引起。
圖14顯示在自體抗原脈衝之單核球衍生之DC與抗體Avastin、IL-21R mAb (ATR-107)、基於植株13之hz13-12抗體、基於植株20之hz20-7、基於植株13之hz13-5及基於植株13之hz13-5 D31E一起培育7天之後具有陽性CD4+增殖反應的健康志願者人類供體(n=40)的百分比。
圖15顯示在範圍自13.5nM (1μg/mL)至108nM (8μg/mL)的四種濃度的重組人PAD4 (rhPAD4)下用抗體hz13-5D31E對人PAD4的劑量依賴性抑制。
圖16A至圖16F顯示用指定濃度的所示植株13 (C13)或植株20 (C20)抗體變異體或用同型對照抗體處理的脂多醣(LPS)刺激之人類CD14+單核球中細胞外瓜胺酸化組蛋白3減少。圖16A顯示與hz13-5一起培育之單核球中的瓜胺酸化組蛋白3含量。圖16B顯示與hz13-5 D31E一起培育之單核球中的瓜胺酸化組蛋白3含量。圖16C顯示與hz20-2一起培育之單核球中的瓜胺酸化組蛋白3含量。圖16D顯示與hz20 -7一起培育之單核球中的瓜胺酸化組蛋白3含量。圖16E顯示與hz13-3一起培育之單核球中的瓜胺酸化組蛋白3含量。圖16F顯示與hz13-12一起培育之單核球中的瓜胺酸化組蛋白3含量。
圖17A至圖17F顯示用指定濃度的所示植株13 (C13)或植株20 (C20)抗體變異體或用同型對照抗體處理的LPS刺激之人類CD14+單核球中GM-CSF (ng/mL)的減少。圖17A顯示與hz13-5一起培育之單核球中GM-CSF之偵測。圖17B顯示與hz13-5 D31E一起培育之單核球中GM-CSF的含量。圖17C顯示與hz13-3一起培育之單核球中GM-CSF的含量。圖17D顯示與hz13-12一起培育之單核球中GM-CSF的含量。圖17E顯示與hz20-2一起培育之單核球中GM-CSF的含量。圖17F顯示與hz20 -7一起培育之單核球中GM-CSF的含量。
圖18A至圖18B顯示用指定濃度的所示植株13(C13)抗體變異體處理的LPS刺激之人類CD14+單核球中的GM-CSF基因表現降低(倍數誘導，基於2,-deltadeltaCT計算))。圖18A顯示與hz13-5一起培育之單核球中GM-CSF之倍數誘導。圖18B顯示與hz13-5 D31E一起培育之單核球中GM-CSF之倍數誘導。藉由自PPIA中減去Ct值以產生DCt，將GM-CSF基因Ct值以管家基因肽基脯胺醯基順反異構酶A (PPIA)標準化。使用下式計算各樣本對管家基因之相對數量(RQ)值(倍數誘導)：RQ = 2
-DCt。
圖19A至圖19B顯示酸性細胞區室中抗PAD4抗體hz13-5D31E的偵測。圖19A顯示在48 h時在各指定條件下(中側圖=50 µg/mL hz13-5 D31E；右側圖=50 µg/mL同型對照) Fabfluor-pH紅色染色之供體GAC-077 (左側圖)以及FabFluor-pH與Cytotox綠色染色之重疊(中側圖及右側圖；共染色呈現黃色)的影像。圖19B顯示在2個供體GAC-077及GAC-045的條件下使用FAbFluor-pH染色量測的抗體內化面積(μm
2/影像)。
圖20顯示例示性抗PAD4抗體、抗鼠類PAD4 mAb、mumAb在脂多醣(LPS)誘導之急性肺部發炎藥效學(ALI PD)模型中的活體內功效。與同型對照(100 mpk)條件相比，30 mpk及100 mpk處理分別導致對細胞外瓜胺酸化H3的74%及83%抑制。「Mpk」= mg/Kg。「IC」= 同型對照抗體。「未處理態(Naïve)」= 未經LPS誘導。抑制百分比計算為 = [(IC- naïve) - (PAD4 mAb-naïve) /(IC-naïve)] × 100。
圖21A至圖21B顯示急性關節發炎(AJI)及慢性關節發炎(CJI)研究之實驗設計。圖21A顯示投與治療(皮下抗PAD4抗體或同型對照)、投與LPS以誘導發炎、結果評估的時間表。圖21B顯示誘導及評估結果之程序。
圖22A至圖22B顯示在LPS誘導之急性關節發炎(AJI)藥效學(PD)模型中藉由抗鼠類PAD4 mAb (mumAb)減少細胞外瓜胺酸化蛋白。圖22A顯示Cit-ITIH4結果。圖22B顯示Cit-PRG4結果。以與關於圖20所描述類似的方式計算抑制百分比。「Mpk」=mg/kg。「同型」=同型對照抗體(IC)。「未處理態」=未注射LPS。
圖23A至圖23B顯示在LPS誘導之慢性關節發炎(CJI)藥效學(PD)模型中藉由抗鼠類PAD4 mAb (mumAb)減少細胞外瓜胺酸化蛋白。圖23A顯示Cit-ITIH4結果。圖23B顯示Cit-PRG4結果。以與關於圖20所描述類似的方式計算抑制百分比。「Mpk」=mg/kg。「同型」=同型對照抗體(IC)。「未處理態」=未注射LPS。「PBS」 = 未處理小鼠假性注射磷酸鹽緩衝鹽水(PBS))代替LPS。
圖24A至圖24B顯示在姥鮫烷誘導之腹膜炎模型中藉由抗鼠類PAD4 mAb抗PAD4 mAb (mumAb)減少NETosis (圖24A)和METosis (圖24B)。N=每個處理組6個。以利用Dunnett測試的單向ANOVA與同型對照相比，*p＜ 0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。「Mpk」=mg/kg。「ISO」=同型對照抗體(IC)。「未處理態」=假注射PBS代替LPS。
圖25A至圖25B顯示在姥鮫烷誘導之腹膜炎模型中藉由抗鼠類PAD4 mAb (mumAb)減少嗜中性球及單核球中之Cit-H3。圖25A顯示細胞%且圖25B顯示細胞數目。N=每個處理組6個。以利用Dunnett測試的單向ANOVA與同型對照相比，*p＜ 0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。「Mpk」=mg/kg。「ISO」=同型對照抗體(IC)。「未處理態」=未接受姥鮫烷注射。
圖26A至圖26B顯示在姥鮫烷誘導之腹膜炎模型中藉由抗鼠類PAD4 mAb (mumAb)減少M1巨噬細胞(圖26A)及M2巨噬細胞(圖26B)中之Cit-H3。N=每個處理組6個。以利用Dunnett測試的單向ANOVA與同型對照相比，*p＜ 0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。「Mpk」=mg/kg。「ISO」=同型對照抗體(IC)。「未處理態」=未經姥鮫烷誘導。
圖27A至圖27B顯示在姥鮫烷誘導之腹膜炎模型中藉由抗鼠類PAD4 mAb (mumAb)減少腹膜液樣本中之彈性蛋白酶(圖27A)及MPO (圖27B)。N=每個處理組6個。以利用Dunnett測試的單向ANOVA與同型對照相比，*p＜ 0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。「Mpk」=mg/kg。「ISO」=同型對照抗體(IC)。「未處理態」=未經姥鮫烷誘導。
圖28A至圖28B顯示在姥鮫烷誘導之腹膜炎模型中藉由抗鼠類PAD4 mAb (mumAb)減少趨化介素及細胞介素。圖28A顯示腹膜液中的GROβ/MIP-2α、GROα/KC、MCP 1及MIP 1β含量。圖28B顯示血漿中的IL-6及MIP 3a含量。N=每個處理組6個。以利用Dunnett測試的單向ANOVA與同型對照相比，*p＜ 0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。「Mpk」=mg/kg。「ISO」=同型對照抗體(IC)。「未處理態」=未經姥鮫烷誘導。
圖29A至圖29C顯示膠原蛋白誘導之關節炎(CIA)模型中預防性研究之結果。抗鼠類PAD4 mAb (mumAb)降低臨床評分(圖29A)，疾病發生率(圖29B)及腳爪重量(圖29C)。N=每個處理組10至15個。以利用Dunnett測試的單向ANOVA與IC相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。「IC」=同型對照抗體。「未處理態」=未經膠原蛋白誘導。
圖30A至圖30E顯示CIA模型中預防性研究之結果。抗鼠類PAD4 mAb (mumAb)減少腳爪中之免疫細胞浸潤。圖30A：CD45+細胞。圖30B：總骨髓細胞；CD11b+細胞。圖30C：嗜中性球；CD11b+ Ly6G+ Ly6C-細胞。圖30D：單核球；CD11b+ Ly6G- Ly6C+細胞。圖30E：巨噬細胞；F4/80+細胞。N=每個處理組10至15個。N=未處理組中5個。以利用Dunnett測試的單向ANOVA與IC相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。「Mpk」=mg/kg。「ISO」=同型對照抗體(IC)。「未處理態」=未經膠原蛋白誘導。
圖31A至圖31B顯示CIA模型中預防性研究之結果。抗鼠類PAD4 mAb (mumAb)減少小鼠腳爪中的NETosis (圖31A)及METosis (圖31B，其中左圖顯示單核球數目，且右圖顯示巨噬細胞數目)。N=每個處理組10至15個。N=未處理組中5個。以利用Dunnett測試的單向ANOVA與IC相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。「Mpk」=mg/kg。「ISO」=同型對照抗體(IC)。「未處理態」=未經膠原蛋白誘導。
圖32A至圖32C顯示CIA模型中預防性研究之結果。抗鼠類PAD4 mAb (mumAb)減少小鼠腳爪中嗜中性球(圖32A)、單核球(圖32B)及M2巨噬細胞(圖32C)中的總Cit-H3。N=每個處理組10至15個。N=未處理組中5個。以利用Dunnett測試的單向ANOVA與IC相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。「Mpk」=mg/kg。「ISO」=同型對照抗體(IC)。
圖33A至圖33C顯示CIA模型中預防性研究之結果。抗鼠類PAD4 mAb (mumAb)減少小鼠腳爪中之PAD4 (圖33A)、MPO (圖33B)及嗜中性球彈性蛋白酶(圖33C)。N=每個處理組10至15個。N=未處理組中5個。以利用Dunnett測試的單向ANOVA與媒劑相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。「Mpk」=mg/kg。「未處理態」=未經膠原蛋白誘導。
圖34A至圖34B顯示CIA模型中預防性研究之結果。抗鼠類PAD4 mAb (mumAb)減少腳爪及血清中之抗瓜胺酸化肽抗體(ACPA；圖34A)，並且亦降低血清抗CII抗體力價(圖34B)。N=每個處理組10至15個。N=未處理組中5個。以利用Dunnett測試的單向ANOVA與IC相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。「Mpk」=mg/kg。「未處理態」=未經膠原蛋白誘導。
圖35顯示CIA模型中的預防性研究之結果。抗鼠類PAD4 mAb (mumAb)降低腳爪組織學評分(所提供之降低%與IC有關)。N=每個處理組10至15個。以利用Dunnett測試的單向ANOVA與媒劑相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。「Mpk」=mg/kg。「IC」=同型對照抗體。
圖36A至圖36C顯示CIA模型中半治療性研究之結果。抗鼠類PAD4 mAb (mumAb)降低臨床評分(圖36A)，疾病發生率(圖36B)及腳爪重量(圖36C)。N=每個處理組10至15個。以利用Dunnett測試的單向ANOVA與IC相比，*p＜ 0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。「IC」=同型對照抗體。
圖37A至圖37E顯示CIA模型中半治療性研究之結果。抗鼠類PAD4 mAb (mumAb)減少腳爪中之免疫細胞浸潤。圖37A：總細胞浸潤；CD45+細胞。圖37B：總骨髓細胞；CD11b+細胞。圖37C：嗜中性球；CD11b+ Ly6G+ Ly6C-細胞。圖37D：單核球；Ly6C+細胞。圖37E：巨噬細胞；F4/80+細胞。N=每個處理組10至15個。N=未處理組中5個。以利用Dunnett測試的單向ANOVA與IC相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。「Mpk」=mg/kg。「ISO」=同型對照抗體(IC)。「未處理態」=未經膠原蛋白誘導。
圖38A至圖38B顯示CIA模型中半治療性研究之結果。抗鼠類PAD4 mAb (mumAb)減少小鼠腳爪中之NETosis (圖38A)及METosis (圖38B)。N=每個處理組10至15個。N=未處理組中5個。以利用Dunnett測試的單向ANOVA與IC相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。「Mpk」=mg/kg。「ISO」=同型對照抗體(IC)。「未處理態」=未經膠原蛋白誘導。
圖39A至圖39C顯示CIA模型中半治療性研究之結果。抗鼠類PAD4 mAb (mumAb)減少小鼠腳爪中嗜中性球(圖39A)、單核球(圖39B)及M2巨噬細胞(圖39C)中的總Cit-H3。N=每個處理組10至15個。N=未處理組中5個。以利用Dunnett測試的單向ANOVA與媒劑相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。「Mpk」=mg/kg。「ISO」=同型對照抗體(IC)。「未處理態」=未經膠原蛋白誘導。
圖40A至圖40C顯示CIA模型中半治療性研究之結果。抗鼠類PAD4 mAb (mumAb)減少小鼠腳爪中之PAD4 (圖40A)、MPO (圖40B)及嗜中性球彈性蛋白酶(圖40C)。N=每個處理組10至15個。N=未處理組中5個。以利用Dunnett測試的單向ANOVA與媒劑相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。「Mpk」=mg/kg。「未處理態」=未經膠原蛋白誘導。
圖41A至圖41B顯示CIA模型中半治療性研究之結果。抗鼠類PAD4 mAb (mumAb)降低腳爪及血清中之ACPA (圖41A，分別為右側圖及左側圖)及血清抗CII抗體力價(圖41B)。N=每個處理組10至15個。N=未處理組中5個。以利用Dunnett測試的單向ANOVA與媒劑相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。「Mpk」=mg/kg。
圖42顯示CIA模型中半治療性研究之結果。抗鼠類PAD4 mAb (mumAb)降低腳爪組織學評分。N=每個處理組10至15個。以利用Dunnett測試的單向ANOVA與媒劑相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。「Mpk」= mg/kg。「IC」 = 同型對照抗體。
圖43A至圖43E顯示抗人類PAD4 mAb植株20及人源化衍生物在LPS ALI PD模型中之功效。圖43A、圖43B及圖43C分別顯示所示劑量下的植株20、人源化基於植株20之hz20-2抗體及人源化基於植株20之hz20-7抗體對相對於總細胞外H3的細胞外瓜胺酸化H3的影響；減少百分比表示相對於同型對照條件的減少。圖43D及圖43E分別顯示所示劑量下的基於植株20之hz20-2抗體及基於植株20之hz20-7抗體對相對於總細胞外ITIH4的細胞外瓜胺酸化ITIH4的影響；減少百分比表示相對於同型對照條件的減少。「Mpk」=mg/kg。「IC」=同型對照抗體。「未處理態」=未用LPS霧化。
圖44A至圖44E顯示抗人類PAD4 mAb植株13及人源化衍生物在LPS ALI PD模型中之功效。圖44A、圖44B及圖44C分別顯示所示劑量下的植株13、人源化基於植株13之hz13-12抗體及人源化基於植株13之hz13-5抗體對相對於總細胞外H3的細胞外瓜胺酸化H3的影響；減少百分比表示相對於同型對照條件的減少。圖44D及圖44E分別顯示所示劑量下的基於植株13之hz13-12抗體及基於植株13之hz13-5抗體對相對於總細胞外ITIH4的細胞外瓜胺酸化ITIH4的影響；減少百分比表示相對於同型對照條件的減少。「Mpk」=mg/kg。「IC」=同型對照抗體。「未處理態」=未用LPS霧化。
圖45A至圖45E顯示使用Hu-PAD4基因敲入小鼠的LPS AJI PD研究的實驗設計及人類PAD4終點。圖45A顯示研究時間表。圖45B顯示實驗程序的概述，包括在膝關節處的治療和自外植組織提取瓜胺酸化蛋白。顯示髕骨外植體上清液的細胞外Cit-PRG4 (圖45C)、細胞外Cit-ITIH4 (圖45D)及人類PAD4 (圖45E)。
圖46A至圖46C顯示抗人類PAD4抗體在LPS AJI PD研究中之功效。顯示所示劑量下的基於植株13之hz13-12抗體(圖46A)、基於植株13之hz13-5抗體(圖46B)及基於植株20之hz20-2抗體(圖46C)對相對於總細胞外ITIH4的細胞外瓜胺酸化ITIH4的影響；減少百分比表示相對於同型對照條件的減少。「Mpk」=mg/kg。「IC」=同型對照抗體。「未處理態」=未注射姥鮫烷。「PBS」=未經處理，注射磷酸鹽緩衝鹽水代替LPS。
圖47A至圖47C顯示抗人類PAD4抗體在LPS AJI PD研究中之功效。顯示髕骨外植體上清液的細胞外Cit-PRG4。顯示所示劑量下的基於植株13之hz13-12抗體(圖47A)、基於植株13之hz13-5抗體(圖47B)及基於植株20之hz20-2抗體(圖47C)對相對於總細胞外PRG4的細胞外瓜胺酸化PRG4的影響；減少百分比表示相對於同型對照條件的減少。「Mpk」=mg/kg。「IC」=同型對照抗體。「PBS」=磷酸鹽緩衝鹽水。「未處理態」=未注射LPS。
圖48A至圖48B顯示抗人類PAD4抗體hz13-5及hz13-5D31E在LPS AJI研究中的功效。此等抗體抑制ITIH4 (圖48A)及PRG4(圖48B)之瓜胺酸化；結果表明hz13-5 D31E抗體具有劑量依賴性抑制作用。「Mpk」=mg/kg。「IC」=同型對照抗體。「未處理態」=未注射LPS。
圖49A至圖49B顯示hz13-5D31E抗體在來自RA患者之內源性PAD4抗體存在下保持效力。圖49A顯示藉由ELISA中的OD450自21名RA患者及10名健康對照個體(NHV)的血清樣本的純化IgG量測的PAD4自體抗體。圖49B顯示在來自RA (實心方塊)或NHV (空心方塊)血清的純化IgG存在下hz13-5D31E對H3瓜胺酸化的抑制。虛線表示在來自RA供體(下線)及NHV供體(上線)的純化IgG的存在下且在不存在hz13-5 D31E的情況下PAD4對H3的瓜胺酸化。
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Claims (73)
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (protein arginine deiminase 4；PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：重鏈可變區(VH)，其包含有包含SEQ ID NO: 62之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)及包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的HCDR3；及輕鏈可變區(VL)，其包含有包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)。
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：重鏈可變區(VH)，其包含有包含SEQ ID NO: 62之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的HCDR3；及輕鏈可變區(VL)，其包含有包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的LCDR3。
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：重鏈可變區(VH)，其包含SEQ ID NO: 225之胺基酸序列及SEQ ID NO: 222之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL)，其包含SEQ ID NO: 223之胺基酸序列。
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：重鏈可變區(VH)，其包含有包含SEQ ID NO: 62之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)及包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的HCDR3；及輕鏈可變區(VL)，其包含有包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)，其中該抗體之該VH與SEQ ID NO: 68之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致。
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：重鏈可變區(VH)，其包含有包含SEQ ID NO: 62之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的HCDR3；及輕鏈可變區(VL)，其包含有包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的LCDR3，其中該抗體之該VH與SEQ ID NO: 68之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致。
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：重鏈可變區(VH)，其包含SEQ ID NO: 225之胺基酸序列及SEQ ID NO: 222之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL)，其包含SEQ ID NO: 223之胺基酸序列，其中該抗體之VH與SEQ ID NO: 68之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致。
- 如請求項1至4中任一項之經分離抗體，其中該抗體之VL與SEQ ID NO: 70之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致。
- 如請求項1至7中任一項之經分離抗體，其中該重鏈可變區包含Kabat位置94處之甘胺酸，該位置對應於SEQ ID NO: 68之位置98。
- 如請求項1至8中任一項之經分離抗體，其中該抗體包含有包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列的VH。
- 如請求項1至8中任一項之經分離抗體，其中該抗體包含有包含SEQ ID NO: 70之胺基酸序列的VL。
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 70之胺基酸序列的VL。
- 如請求項1至11中任一項之經分離抗體，其中該抗體結合至包含SEQ ID NO: 217及視情況存在之SEQ ID NO: 218之PAD4上的表位。
- 如請求項1至12中任一項之經分離抗體，其為IgA、IgG或IgM抗體。
- 如請求項1至12中任一項之經分離抗體，其為IgG抗體，諸如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體。
- 如請求項14之經分離抗體，其中該抗體包含野生型、人類IgG1、IgG2或IgG4重鏈恆定區。
- 如請求項1至12中任一項之經分離抗體，其中該抗體包含人類IgG1或IgG2重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致的胺基酸序列。
- 如請求項1至12或16中任一項之經分離抗體，其中該抗體包含輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%或至少99%一致之胺基酸序列。
- 如請求項1至12中任一項之經分離抗體，其中該抗體包含人類IgG1或IgG2重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列。
- 如請求項1至12或18中任一項之經分離抗體，其中該抗體包含輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列相比經1至10個胺基酸取代、1至5個胺基酸取代或1至3個胺基酸取代修飾之胺基酸序列。
- 如請求項1至19中任一項之經分離抗體，其中該抗體包含人類IgG1或IgG2重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 174、176、178、180、182、184、186、188、190或192中任一者之胺基酸序列。
- 如請求項1至20中任一項之經分離抗體，其中該抗體包含有包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列的輕鏈恆定區。
- 如請求項1至21中任一項之經分離抗體，其為全長抗體。
- 如請求項1至21中任一項之經分離抗體，其為在重鏈恆定區中缺乏C端離胺酸之IgG抗體。
- 如請求項1至12中任一項之經分離抗體，其為抗體片段，諸如Fv、單鏈Fv (scFv)、Fab、Fab'或(Fab') 2。
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列、然後是SEQ ID NO: 178之胺基酸序列的重鏈(HC)；及包含SEQ ID NO: 70之胺基酸序列、然後是SEQ ID NO: 194之胺基酸序列的輕鏈(LC)。
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列、然後是SEQ ID NO: 180之胺基酸序列的重鏈(HC)；及包含SEQ ID NO: 70之胺基酸序列、然後是SEQ ID NO: 194之胺基酸序列的輕鏈(LC)。
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 196之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO: 200之胺基酸序列的輕鏈。
- 一種特異性結合至蛋白質精胺酸脫亞胺酶4 (PAD4)之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 198之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO: 200之胺基酸序列的輕鏈。
- 如請求項1至28中任一項之經分離抗體，其為雙特異性或多特異性抗體，或其與至少一個其他分子共價或非共價結合。
- 如請求項29之經分離抗體，其中該抗體與至少一個其他分子共價或非共價結合，其中該至少一個其他分子包含偵測標記及/或藥物。
- 如請求項1至30中任一項之經分離抗體，其中該抗體不結合至人類蛋白質精胺酸脫亞胺酶2 (PAD2)。
- 如請求項1至31中任一項之經分離抗體，其中該抗體以10至200 nM、50至200 nM、10至100 nM、20至100 nM或50至100 nM之IC50抑制PAD4將肽受質TSTGGRQGSHH (SEQ ID NO: 216)中之精胺酸轉化為瓜胺酸。
- 如請求項1至32中任一項之經分離抗體，其中該抗體視情況以劑量依賴性方式以0.1至10 nM (諸如0.2至5 nM)的IC50抑制PAD4將肽受質(SHQEST RGKSKGKAAAAA；SEQ ID NO: 232)中之精胺酸轉化為瓜胺酸，其中PAD4濃度為1至8 µg/mL。
- 如請求項1至33中任一項之經分離抗體，其中該抗體抑制PAD4對 Nα-苯甲醯基-L-精胺酸乙酯鹽酸鹽(BAEE)之脫胺作用。
- 如請求項1至34中任一項之經分離抗體，其中該抗體以小於5 nM之K D特異性結合至PAD4。
- 如請求項35之經分離抗體，其中該抗體以0.05 nM至0.5 nM之K D特異性結合至PAD4，其係(a)在37℃、在1 mM氯化鈣之存在下及/或(b)在37℃、在不存在額外Ca 2+及存在2 mM EDTA的情況下藉由表面電漿子共振(surface plasmon resonance；SPR)所測定。
- 如請求項1至36中任一項之經分離抗體，其中該抗體在ECM分析中的ECM評分小於50、小於30、小於10、小於5、為1至30、1至20、1至10、1至5、1至3、1、2、3、4或5。
- 如請求項1至37中任一項之經分離抗體，其中以電腦模擬免疫原性分析進行量測，該抗體之免疫原性小於以下中之一者、兩者或全部三者：Campath® (阿倫單抗(alemtuzumab))、Rituxan® (利妥昔單抗(rituximab))、Zenapax® (達利珠單抗(daclizumab))。
- 如請求項1至38中任一項之經分離抗體，其中與同型對照抗體相比，該抗體減少LPS刺激之人類血液單核球中細胞外瓜胺酸化組蛋白H3的量及/或減少GM-CSF之分泌及/或GM-CSF之基因表現。
- 如請求項1至39中任一項之經分離抗體，其中該抗體能夠被LPS刺激之人類血液單核球內化。
- 如請求項1至40中任一項之經分離抗體，其中該抗體抑制PAD4在發炎肺部之功能，例如藉由經肺部所收集之支氣管肺泡灌洗液(broncheoalveolar lavage fluid；BALF)中的H3之瓜胺酸化減少證明。
- 如請求項1至41中任一項之經分離抗體，其中該抗體抑制PAD4在發炎關節之功能，例如藉由經關節組織中ITIH4及/或PRG4的瓜胺酸化減少證明。
- 如請求項1至42中任一項之經分離抗體，其中與同型對照抗體相比，該抗體減少嗜中性球、單核球、M1巨噬細胞及/或M2巨噬細胞中H3之瓜胺酸化。
- 如請求項1至43中任一項之經分離抗體，其中與同型對照抗體相比，該抗體減少在人類PAD4基因敲入小鼠的LPS誘導之急性肺部發炎模型中BALF中的細胞外瓜胺酸化H3及/或瓜胺酸化ITIH4的量，視情況其中瓜胺酸化H3的量減少至少15%、至少30%、至少40%、至少50%或至少60%，且其中瓜胺酸化ITIH4的量減少至少50%、至少70%或至少80%。
- 如請求項1至44中任一項之經分離抗體，其中與同型對照抗體相比，該抗體減少在人類PAD4基因敲入小鼠的LPS誘導之急性關節損傷模型中的小鼠髕骨中細胞外瓜胺酸化PRG4及/或瓜胺酸化ITIH4的量，視情況其中減少瓜胺酸化ITIH4及/或瓜胺酸化PRG4的EC50為2 nM或更低、1 nM或更低、0.1 nM或更低、0.05至2 nM、或0.1至1 nM。
- 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至45中任一項之抗體及醫藥學上可接受之載劑。
- 一種經分離核酸或兩種或更多種核酸之集合，該(等)核酸編碼如請求項1至45中任一項之抗體。
- 一種經分離載體，其包含一或多種編碼如請求項1至45中任一項之抗體之重鏈及輕鏈的核酸。
- 一種經分離宿主細胞，其包含如請求項47之核酸或如請求項48之載體。
- 一種產生特異性結合至PAD4之抗體的方法，其包含在適於表現該抗體之條件下培養如請求項49之宿主細胞。
- 如請求項50之方法，其進一步包含自該宿主細胞回收該抗體。
- 一種抗體，其係藉由如請求項50或51之方法產生。
- 一種如請求項1至45中任一項之抗體或如請求項46之醫藥組合物之用途，其係用於製備用以治療自體免疫病症之藥劑。
- 如請求項53之用途，其中該自體免疫病症為類風濕性關節炎、狼瘡(例如全身性紅斑狼瘡(SLE))、狼瘡性腎炎、血管炎(例如ANCA相關血管炎)、血栓(例如靜脈血栓)或發炎性腸病(IBD) (例如潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病(Crohn's disease))。
- 如請求項1至45中任一項之經分離抗體或如請求項46之醫藥組合物，其係用於治療自體免疫病症。
- 如請求項55所使用之抗體，其中該自體免疫病症為類風濕性關節炎、狼瘡(例如全身性紅斑狼瘡(SLE))、狼瘡性腎炎、血管炎(例如ANCA相關血管炎)、血栓(例如靜脈血栓)或發炎性腸病(IBD) (例如潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病)。
- 一種治療有需要個體之自體免疫病症的方法，其包含向該個體投與有效量的如請求項1至45中任一項之經分離抗體或如請求項46之醫藥組合物。
- 如請求項57之方法，其中該自體免疫病症為類風濕性關節炎、狼瘡(例如全身性紅斑狼瘡(SLE))、狼瘡性腎炎、血管炎(例如ANCA相關血管炎)、血栓(例如靜脈血栓)或發炎性腸病(IBD) (例如潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病)。
- 如請求項53至58中任一項之用途、供使用之抗體或方法，其中該方法或用途包含投與至少一種其他治療劑，視情況其中該至少一種其他治療劑為以下中之一或多者：甲胺喋呤(methotrexate)、阿達木單抗(adalimumab)、依那西普(etanercept)、英利昔單抗(infliximab)、羥基氯奎(hydroxychloroquine)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、來氟米特(leflunomide)、阿巴西普(abatacept)、阿那白滯素(anakinra)、賽妥珠單抗(certolizumab)、戈利木單抗(golimumab)、利妥昔單抗(rituximab)、沙利姆單抗(sarilumab)、托珠單抗(tocilizumab)、巴瑞替尼(baricitinib)、托法替尼(tofacitinib)或優帕替尼(upadacitinib)。
- 一種如請求項1至45中任一項之抗體或如請求項46之醫藥組合物的用途，其係用於製備用以治療有發展RA風險之個體的藥劑。
- 如請求項1至45中任一項之經分離抗體或如請求項46之醫藥組合物，其用於治療有發展RA風險之個體。
- 一種治療有發展RA風險之個體的方法，其包含向該個體投與有效量的如請求項1至45中任一項之經分離抗體或如請求項46之醫藥組合物。
- 如請求項60至62中任一項之用途、經分離抗體或方法，其中該個體有以下一或多種狀況： a. 至少一名患有RA的一等親(例如父母或兄弟姐妹)； b. 血清中存在抗瓜胺酸化蛋白質抗體(anti-citrullinated protein antibodies；ACPA)； c. 血清中存在類風濕因子(rheumatoid factor；RF)； d. 至少一個關節出現關節痛； e. 藉由超音波或磁共振成像(magnetic resonance imaging；MRI)觀測到至少一個關節發炎；或 f. 未分化關節炎。
- 如請求項60至63中任一項之用途、經分離抗體或方法，其中該個體處於緩解期。
- 如請求項60至64中任一項之用途、經分離抗體或方法，其中該治療係用於延遲RA發作。
- 一種如請求項1至45中任一項之抗體或如請求項46之醫藥組合物之用途，其係用於製備用以抑制個體中之NETosis或METosis的藥劑。
- 如請求項1至45中任一項之經分離抗體或如請求項46之醫藥組合物，其用於抑制個體中之NETosis或METosis。
- 一種抑制個體中NETosis或METosis之方法，其包含向該個體投與有效量的如請求項1至45中任一項之經分離抗體或如請求項46之醫藥組合物。
- 一種抑制個體中NETosis之方法，該方法包含向該個體投與有效量的如請求項1至45中任一項之經分離抗體或如請求項46之醫藥組合物。
- 一種抑制個體中METosis之方法，該方法包含向該個體投與有效量的如請求項1至45中任一項之經分離抗體或如請求項46之醫藥組合物。
- 一種在活體外抑制生物樣本中NETosis或METosis之方法，其包含向該生物樣本投與有效量的如請求項1至45中任一項之經分離抗體或如請求項46之醫藥組合物。
- 一種抑制個體中瓜胺酸化的方法，該方法包含向該個體投與有效量的如請求項1至45中任一項之經分離抗體或如請求項46之醫藥組合物。
- 一種在活體外抑制生物樣本中瓜胺酸化之方法，該方法包含向該生物樣本投與有效量的如請求項1至45中任一項之經分離抗體或如請求項46之醫藥組合物。
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| US6548640B1 (en) | 1986-03-27 | 2003-04-15 | Btg International Limited | Altered antibodies |
| JP3101690B2 (ja) | 1987-03-18 | 2000-10-23 | エス・ビィ・２・インコーポレイテッド | 変性抗体の、または変性抗体に関する改良 |
| DE68913658T3 (de) | 1988-11-11 | 2005-07-21 | Stratagene, La Jolla | Klonierung von Immunglobulin Sequenzen aus den variablen Domänen |
| ATE135370T1 (de) | 1988-12-22 | 1996-03-15 | Kirin Amgen Inc | Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor |
| DE3920358A1 (de) | 1989-06-22 | 1991-01-17 | Behringwerke Ag | Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung |
| US5571894A (en) | 1991-02-05 | 1996-11-05 | Ciba-Geigy Corporation | Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor |
| AU675916B2 (en) | 1991-06-14 | 1997-02-27 | Genentech Inc. | Method for making humanized antibodies |
| GB9114948D0 (en) | 1991-07-11 | 1991-08-28 | Pfizer Ltd | Process for preparing sertraline intermediates |
| WO1993008829A1 (en) | 1991-11-04 | 1993-05-13 | The Regents Of The University Of California | Compositions that mediate killing of hiv-infected cells |
| WO1993016185A2 (en) | 1992-02-06 | 1993-08-19 | Creative Biomolecules, Inc. | Biosynthetic binding protein for cancer marker |
| US5714350A (en) | 1992-03-09 | 1998-02-03 | Protein Design Labs, Inc. | Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region |
| AU691811B2 (en) | 1993-06-16 | 1998-05-28 | Celltech Therapeutics Limited | Antibodies |
| US5731168A (en) | 1995-03-01 | 1998-03-24 | Genentech, Inc. | Method for making heteromultimeric polypeptides |
| US5869046A (en) | 1995-04-14 | 1999-02-09 | Genentech, Inc. | Altered polypeptides with increased half-life |
| US6121022A (en) | 1995-04-14 | 2000-09-19 | Genentech, Inc. | Altered polypeptides with increased half-life |
| GB9603256D0 (en) | 1996-02-16 | 1996-04-17 | Wellcome Found | Antibodies |
| US6277375B1 (en) | 1997-03-03 | 2001-08-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Immunoglobulin-like domains with increased half-lives |
| WO1998058964A1 (en) | 1997-06-24 | 1998-12-30 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for galactosylated glycoproteins |
| CA2307166A1 (en) | 1997-10-31 | 1999-05-14 | Genentech, Inc. | Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms |
| AU760562B2 (en) | 1997-12-05 | 2003-05-15 | Scripps Research Institute, The | Humanization of murine antibody |
| US6194551B1 (en) | 1998-04-02 | 2001-02-27 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants |
| JP4334141B2 (ja) | 1998-04-20 | 2009-09-30 | グリカート バイオテクノロジー アクチェンゲゼルシャフト | 抗体依存性細胞傷害性を改善するための抗体のグリコシル化操作 |
| WO2000042072A2 (en) | 1999-01-15 | 2000-07-20 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants with altered effector function |
| US6737056B1 (en) | 1999-01-15 | 2004-05-18 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants with altered effector function |
| WO2000061739A1 (en) | 1999-04-09 | 2000-10-19 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Method for controlling the activity of immunologically functional molecule |
| EP1252192B1 (en) | 2000-02-11 | 2006-08-16 | MERCK PATENT GmbH | Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins |
| PL357939A1 (en) | 2000-04-11 | 2004-08-09 | Genentech, Inc. | Multivalent antibodies and uses therefor |
| US6725230B2 (en) | 2000-07-18 | 2004-04-20 | Aegis Analytical Corporation | System, method and computer program for assembling process data of multi-database origins using a hierarchical display |
| EP1423510A4 (en) | 2001-08-03 | 2005-06-01 | Glycart Biotechnology Ag | ANTIBODY GLYCOSYLATION VARIANTS WITH INCREASED CELL CYTOTOXICITY DEPENDENT OF ANTIBODIES |
| JP2005532253A (ja) | 2001-10-25 | 2005-10-27 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 糖タンパク質組成物 |
| US20040002587A1 (en) | 2002-02-20 | 2004-01-01 | Watkins Jeffry D. | Fc region variants |
| US20040132101A1 (en) | 2002-09-27 | 2004-07-08 | Xencor | Optimized Fc variants and methods for their generation |
| US7317091B2 (en) | 2002-03-01 | 2008-01-08 | Xencor, Inc. | Optimized Fc variants |
| DK1534335T4 (en) | 2002-08-14 | 2015-10-05 | Macrogenics Inc | FCGAMMARIIB-SPECIFIC ANTIBODIES AND PROCEDURES FOR USE THEREOF |
| AU2003279719B8 (en) | 2002-09-27 | 2009-01-08 | Xencor Inc. | Optimized Fc variants and methods for their generation |
| WO2004035752A2 (en) | 2002-10-15 | 2004-04-29 | Protein Design Labs, Inc. | ALTERATION OF FcRn BINDING AFFINITIES OR SERUM HALF-LIVES OF ANTIBODIES BY MUTAGENESIS |
| EP1587540B1 (en) | 2003-01-09 | 2021-09-15 | MacroGenics, Inc. | IDENTIFICATION AND ENGINEERING OF ANTIBODIES WITH VARIANT Fc REGIONS AND METHODS OF USING SAME |
| DK1638941T3 (da) | 2003-05-22 | 2010-10-11 | Abbott Lab | Indazol-, benzisoxazol- og benzisothiazolkinaseinhibitorer |
| US8101720B2 (en) | 2004-10-21 | 2012-01-24 | Xencor, Inc. | Immunoglobulin insertions, deletions and substitutions |
| GB0324368D0 (en) | 2003-10-17 | 2003-11-19 | Univ Cambridge Tech | Polypeptides including modified constant regions |
| SI1678314T1 (sl) | 2003-10-22 | 2013-01-31 | Keck Graduate Institute | Metode za sintetiziranje heteromultimernih polipeptidov pri kvasovkah s strategijo razmnoĺ˝evanja haploidnih celic |
| MX337587B (es) | 2003-11-05 | 2016-03-11 | Glycart Biotechnology Ag | Anticuerpos cd20 con funcion del efector y afinidad de enlace al receptor fc mejoradas. |
| KR101149242B1 (ko) | 2004-01-12 | 2012-05-25 | 어플라이드 몰리큘라 에볼류션, 인코포레이티드 | Ｆｃ 영역 변이체 |
| EP1737890A2 (en) | 2004-03-24 | 2007-01-03 | Xencor, Inc. | Immunoglobulin variants outside the fc region |
| JP5128935B2 (ja) | 2004-03-31 | 2013-01-23 | ジェネンテック， インコーポレイテッド | ヒト化抗ＴＧＦ−β抗体 |
| BR122018016031B8 (pt) | 2004-08-04 | 2021-07-27 | Applied Molecular Evolution Inc | processo para produzir um anticorpo monoclonal variante com resposta de adcc realçada |
| WO2006076288A2 (en) | 2005-01-11 | 2006-07-20 | Five Prime Therapeutics, Inc. | Dna constructs for long-term expression of intravascularly injected naked dna |
| JP6157046B2 (ja) | 2008-01-07 | 2017-07-05 | アムジェン インコーポレイテッド | 静電的ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果を用いた抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための方法 |
| LT3221346T (lt) | 2014-11-21 | 2020-11-10 | Bristol-Myers Squibb Company | Antikūnai, apimantys modifikuotas sunkiosios grandinės pastoviąsias sritis |
| EP4223786A3 (en) * | 2015-03-06 | 2023-08-16 | Public University Corporation Yokohama City University | Novel anti-pad4 antibodies |
| BR112018010172A2 (pt) | 2015-11-19 | 2018-11-21 | Bristol Myers Squibb Co | anticorpos contra receptor de fator de necrose de tumor induzido por glicocorticoide (gitr) e usos dos mesmos |
| JPWO2019131769A1 (ja) * | 2017-12-26 | 2021-02-12 | 公立大学法人名古屋市立大学 | 新規抗ｐａｄ４抗体 |
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