CN119371491A - Pegcetacoplan的纯化方法和制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多肽药物技术领域，尤其是涉及一种Pegcetacoplan的纯化方法和制备方法。Pegcetacoplan的纯化方法包括：（a）对待纯化样品进行反相制备液相色谱纯化，收集含Pegcetacoplan的洗脱馏分；（b）超滤处理后，进行阳离子交换层析，收集含Pegcetacoplan的洗脱馏分；反相制备液相色谱纯化中，流动相A为试剂A的水溶液；流动相B为乙腈；阳离子交换层析中，平衡缓冲液为乙酸钠、磷酸二氢钠或磷酸二氢钾的水溶液。本发明针对Pegcetacoplan的结构及合成特性，结合反相制备液相色谱纯化、超滤、阳离子交换层析工序，可获得高纯度Pegcetacoplan，同时保证高收率。
Description
技术领域
本发明涉及多肽药物技术领域，尤其是涉及一种Pegcetacoplan的纯化方法和制备方法。
背景技术
多肽，作为一种重要的生物活性分子，其具有广泛的药理活性，如抗菌、抗病毒、抗肿瘤等。近年来，随着生物技术的不断发展，多肽药物已成为新药研发的热点领域。然而，多肽分子在合成过程中往往伴随着诸多副产物和杂质，这些杂质的存在将直接影响多肽药物的活性和稳定性。因此，多肽的纯化成为制备高活性、高纯度多肽药物的关键环节。
Pegcetacoplan是一种聚乙二醇化双环肽，由于PEG与多肽的偶联反应都是随机性亲核反应，其反应后的产物是修饰混合物，并且这些修饰混合物中的各个物质除了分子质量和表面电荷存在细小差异外，其他理化性质非常接近，因而给纯化工作带来了困难。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的一个目的在于提供Pegcetacoplan的纯化方法，能够显著提高Pegcetacoplan的纯度。
本发明的另一目的在于提供Pegcetacoplan的制备方法，包括上述Pegcetacoplan的纯化方法。
为了实现本发明的上述目的，本发明一方面提供了Pegcetacoplan的纯化方法，包括如下步骤：
（a）对待纯化样品进行反相制备液相色谱纯化，收集含Pegcetacoplan的洗脱馏分；
（b）对所述含Pegcetacoplan的洗脱馏分进行超滤处理后，进行阳离子交换层析，收集含Pegcetacoplan的洗脱馏分；
所述反相制备液相色谱纯化中，流动相A为试剂A的水溶液；流动相B为乙腈；所述试剂A包括甲酸、三氟乙酸、磷酸和三乙胺中的至少一种；
所述阳离子交换层析中，平衡缓冲液为试剂B的水溶液，所述试剂B包括乙酸钠、磷酸二氢钠和磷酸二氢钾中的至少一种。
在本发明的具体实施方式中，所述流动相A为三乙胺和磷酸的水溶液。进一步地，所述流动相A中，三乙胺和磷酸的体积分数分别为1.8%～2.2%和0.9%～1.1%。
在本发明的具体实施方式中，所述平衡缓冲液中，所述试剂B的浓度为0.1～5mM，优选为3～5mM。进一步地，所述平衡缓冲液的pH为3～5.2。
在本发明的具体实施方式中，所述反相制备液相色谱纯化中，色谱柱为反相C18色谱柱。进一步地，所述色谱柱为YMC反相C18色谱柱。
在本发明的具体实施方式中，所述反相制备液相色谱纯化中，采用所述流动相A和所述流动相B进行梯度洗脱；所述梯度洗脱包括：0～60min内，所述流动相B的体积分数由20%～28%变至46%～60%。
在本发明的具体实施方式中，所述反相制备液相色谱纯化中，采用检测波长为220nm的紫外检测器检测，收集含Pegcetacoplan的洗脱馏分。
在本发明的具体实施方式中，所述阳离子交换层析包括：将所述超滤处理后的溶液上样，然后采用所述平衡缓冲液进行平衡，再采用洗脱溶剂进行洗脱。进一步地，采用所述平衡缓冲液和流动相C进行所述洗脱，所述流动相C为含磷酸二氢钠和氯化钠的乙腈水溶液。
在本发明的具体实施方式中，所述流动相C中，所述磷酸二氢钠的浓度为1～5mM，所述氯化钠的浓度为0.4～0.6M，所述乙腈水溶液中，乙腈的体积分数为15%～25%。
在本发明的具体实施方式中，所述洗脱包括：0～15CV内，所述流动相C的体积分数由0%变至40%。
在本发明的具体实施方式中，所述阳离子交换层析中，层析介质包括NanoGel -50SP HP、Proteomix PRO30-S、Welch Precot SP Polymate、Monomix HC30-SP和BiolinkMaxgo 30S中的至少一种。
在本发明的具体实施方式中，所述超滤处理包括：将所述含Pegcetacoplan的洗脱馏分超滤浓缩8～12倍，并采用水超滤至透过液电导≤0.1μs/cm，采用磷酸二氢钠水溶液稀释截留液至原洗脱馏分的体积。进一步地，所述磷酸二氢钠水溶液的浓度为0.1～5mM，优选为3～5mM。
在本发明的具体实施方式中，所述纯化方法还包括：将步骤（b）所述的含Pegcetacoplan的洗脱馏分进行转盐处理后，浓缩、冻干。
在本发明的具体实施方式中，所述转盐处理包括：将步骤（b）所述的含Pegcetacoplan的洗脱馏分超滤浓缩4～6倍，再添加体积为浓缩后物料体积5倍的体积分数为0.1%的醋酸水溶液进行超滤。
在本发明的具体实施方式中，所述超滤所采用的膜包为TeomaxTM Ⅱ CassetteRC 3K-D 0.1m2。
本发明另一方面提供了一种Pegcetacoplan的制备方法，包括如下步骤：
（A）将Pegcetacoplan中间体环肽与PEG40K于溶剂中进行偶联反应，得到偶联液；
（B）将所述偶联液进行纯化处理，所述纯化处理按照上述任意一种所述的Pegcetacoplan的纯化方法进行。
在本发明的具体实施方式中，步骤（A）中，所述Pegcetacoplan中间体环肽与所述PEG40K的质量比为1﹕（7～8）。
在本发明的具体实施方式中，所述溶剂包括DMF。
在本发明的具体实施方式中，所述偶联反应包括：将所述Pegcetacoplan中间体环肽于溶剂中溶解，得到第一溶液；将所述PEG40K于溶剂中溶解，得到第二溶液；将所述第二溶液以100～140mL/min流速加入所述第一溶液中，然后于30～35℃反应1～2h。
在本发明的具体实施方式中，步骤（B）还包括：采用水将所述偶联液稀释8～12倍后，过滤，再进行所述纯化处理。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
（1）本发明针对Pegcetacoplan的结构及合成特性，结合反相制备液相色谱纯化、超滤、阳离子交换层析工序，可获得高纯度的Pegcetacoplan；
（2）本发明的纯化方法操作简单，易于实施，并且大大减少了有机试剂的使用，降低了成本。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
反相高效液相色谱法由非极性固定相与极性流动相组成，利用溶质的疏水性差别进行梯度洗脱分离纯化，反相高效液相色谱法高效、快速，适合规模相对较小、附加值高的产品，是多肽的主要分离纯化方法，是工业化生产的首选。但是，研究发现，反相高效液相色谱法虽然能够去除部分多肽小分子杂质，但由于工艺中单取代杂质和游离PEG与Pegcetacoplan的理化性质非常接近，难以通过膜过滤法等实现分离，导致产品纯度低。
发明人进一步研究发现，由于Pegcetacoplan中得到PEG与多肽的分子量相差较大，在Pegcetacoplan中间体环肽上修饰PEG后，在离子交换层析中会有屏蔽作用，导致Pegcetacoplan与层析介质结合力较弱，影响分离效果。因而，现有的Pegcetacoplan的纯化方法，均不能针对性对Pegcetacoplan偶联过程所形成的杂质进行有效的去除。本发明针对Pegcetacoplan的特殊结构特性，通过一步反相制备液相色谱纯化和一步阳离子交换层析的结合，获得高纯度的Pegcetacoplan。
基于此，本发明一方面提供了Pegcetacoplan的纯化方法，包括如下步骤：
（a）对待纯化样品进行反相制备液相色谱纯化，收集含Pegcetacoplan的洗脱馏分；
（b）对含Pegcetacoplan的洗脱馏分进行超滤处理后，进行阳离子交换层析，收集含Pegcetacoplan的洗脱馏分；
反相制备液相色谱纯化中，流动相A为试剂A的水溶液；流动相B为乙腈；试剂A包括甲酸、三氟乙酸、磷酸和三乙胺中的至少一种；
阳离子交换层析中，平衡缓冲液为试剂B的水溶液，试剂B包括乙酸钠、磷酸二氢钠和磷酸二氢钾中的至少一种。
本发明先采用反相制备液相色谱纯化，在相应的纯化条件下，除去小分子杂质以及有机试剂，并防止PEG修饰剂的水解产物产生；然后利用超滤法对反相制备液相色谱纯化过程引入的有机试剂进行去除，再通过阳离子交换层析的方式除去不利于分离的游离PEG和单取代杂质。采用本发明的纯化方式，能够获得纯度＞99.5%的Pegcetacoplan。
其中，反相制备液相色谱纯化中所采用的流动相A和流动相B，一方面保证各物质的有效分离，以及对小分子杂质和样品中的有机试剂的去除，另一方面，防止PEG修饰剂的水解产物产生，避免影响后续分离纯化步骤的稳定性。
并且，进一步研究发现，阳离子交换层析过程中，采用的平衡缓冲液中试剂B的种类，较大的影响对游离PEG、单取代杂质的分离效果以及目标产物的收率。本发明在进行反相制备液相色谱纯化和超滤处理后，进行阳离子交换层析上样，采用适宜的平衡缓冲液，以更好的分离目标产物和杂质，兼顾提高目标产物的纯度和收率。
在本发明的具体实施方式中，流动相A为三乙胺和磷酸的水溶液。进一步地，流动相A中，三乙胺和磷酸的体积分数分别为1.8%～2.2%和0.9%～1.1%。
本发明进一步优化了反相制备液相色谱纯化中所采用的流动相A，使得目标产物的纯度和收率均有显著的提高。如在不同实施方式中，流动相A中，三乙胺的体积分数可以为1.8%、1.9%、2%、2.1%、2.2%或其中任意两者组成的范围；磷酸的体积分数可以为0.9%、0.95%、1%、1.05%、1.1%或其中任意两者组成的范围。
在本发明的具体实施方式中，平衡缓冲液中，试剂B的浓度为0.1～5mM，优选为3～5mM。进一步地，平衡缓冲液的pH为3～5.2。在实际操作中，采用平衡缓冲液中的试剂B中相应的酸来调节平衡缓冲液的pH。例如，试剂B为乙酸钠时，采用乙酸调节pH；试剂B为磷酸二氢钠或磷酸二氢钾时，采用磷酸调节pH。
在本发明的具体实施方式中，平衡缓冲液中，试剂B为磷酸二氢钠。
本发明进一步对阳离子交换层析中的平衡缓冲液的试剂B的种类、浓度以及pH进行优化，配合前序的反相制备液相色谱纯化和超滤工序，能够显著提高目标产物的纯度和收率。如在不同实施方式中，试剂B的浓度可以为0.1mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM或其中任意两者组成的范围；平衡缓冲液的pH可以为3、3.5、4、4.5、5、5.2或其中任意两者组成的范围。
在本发明的具体实施方式中，反相制备液相色谱纯化中，色谱柱为反相C18色谱柱。进一步地，色谱柱为YMC反相C18色谱柱。
其中，YMC反相C18色谱柱的规格为20×250mm，10μm，120Å，采用YMC反相C18色谱柱更有利于Pegcetacoplan的分离。
在本发明的具体实施方式中，反相制备液相色谱纯化中，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱；梯度洗脱包括：0～60min内，流动相B的体积分数由20%～28%变至46%～60%。
本发明的反相制备液相色谱纯化中，在采用特定的流动相A和流动相B的基础上，针对在该纯化阶段预分离除去的杂质种类，对洗脱程序进行进一步的调整，以在较短的时间内有效去除该阶段预分离的物质，保证较高的纯度和收率。如在不同实施方式中，梯度洗脱中，0～60min内，流动相B的体积分数可以由20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%或其中任意两者组成的范围，变至46%、48%、50%、52%、54%、55%、56%、58%、60%其中任意两者组成的范围。
在本发明的优选实施方式中，反相制备液相色谱纯化中，梯度洗脱包括：0～60min内，流动相B的体积分数由25%～26%变至46%～50%。
在本发明的具体实施方式中，反相制备液相色谱纯化中，采用检测波长为220nm的紫外检测器检测，收集含Pegcetacoplan的洗脱馏分。
在本发明的具体实施方式中，阳离子交换层析包括：将超滤处理后的溶液上样，然后采用平衡缓冲液进行平衡，再采用洗脱溶剂进行洗脱。进一步地，采用平衡缓冲液和流动相C进行洗脱，流动相C为含磷酸二氢钠和氯化钠的乙腈水溶液。
在实际操作中，采用平衡缓冲液进行平衡，直至洗脱液在220nm检测波长的吸收为0，再进行后续洗脱。
在本发明的具体实施方式中，流动相C中，磷酸二氢钠的浓度为1～5mM，氯化钠的浓度为0.4～0.6M，乙腈水溶液中，乙腈的体积分数为15%～25%。
在阳离子交换层析中，在上样后通过采用特定的平衡缓冲液进行平衡，以充分去除杂质，同时避免目标产物的洗脱以保证收率；平衡后，再采用特定的洗脱溶剂洗脱。如在不同实施方式中，流动相C中，磷酸二氢钠的浓度可以为1mM、2mM、3mM、4mM、5mM其中任意两者组成的范围；氯化钠的浓度可以为0.4M、0.45M、0.5M、0.55M、0.6M或其中任意两者组成的范围；乙腈水溶液中，乙腈的体积分数可以为15%、18%、20%、22%、25%或其中任意两者组成的范围。在一优选实施方式中，流动相C中，磷酸二氢钠的浓度为3mM，氯化钠的浓度为0.5M，乙腈水溶液中，乙腈的体积分数为20%。
在本发明的具体实施方式中，洗脱包括：0～15CV内，流动相C的体积分数由0%变至40%。
在本发明的具体实施方式中，阳离子交换层析中，层析介质包括NanoGel -50SPHP、Proteomix PRO30-S、Welch Precot SP Polymate、Monomix HC30-SP和Biolink Maxgo30S中的至少一种，优选为NanoGel-50SP HP。
阳离子交换层析主要利用的是层析介质与待分离物质之间的静电相互作用的差异实现分离，而静电相互作用的影响因素众多，包括但不限于层析介质种类、平衡缓冲液及洗脱溶剂种类以及待分离物质种类。本发明针对经反相制备液相色谱纯化和超滤处理后的待分离物质，配合相应的平衡缓冲液、洗脱溶剂等，在采用NanoGel-50SP HP作为层析介质时，相较于其余层析介质，在显著提高目标产物纯度的情况下，还能够提高载样量，提高效率。
在本发明的具体实施方式中，超滤处理包括：将含Pegcetacoplan的洗脱馏分超滤浓缩8～12倍，并采用水超滤至透过液电导≤0.1μs/cm，采用磷酸二氢钠水溶液稀释截留液至原洗脱馏分的体积。进一步地，磷酸二氢钠水溶液的浓度为0.1～5mM，优选为3～5mM。
研究发现，如直接对偶联反应后的物料进行超滤处理，由于体系中大量有机溶剂的干扰，容易造成目标产物的穿透，难以实现对杂质的分离。本发明在反相制备液相色谱纯化后进行上述超滤处理，一方面去除反相制备液相色谱纯化过程中引入的有机溶剂，再采用磷酸二氢钠水溶液换液，在避免目标产物降解的同时，降低样品的离子强度，以在后续阳离子交换层析中实现进一步的分离纯化。
如在不同实施方式中，稀释截留液的磷酸二氢钠水溶液中，磷酸二氢钠的浓度可以为0.1mM、0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM或其中任意两者组成的范围。
在本发明的具体实施方式中，纯化方法还包括：将步骤（b）的含Pegcetacoplan的洗脱馏分进行转盐处理后，浓缩、冻干。
在本发明的具体实施方式中，转盐处理包括：将步骤（b）的含Pegcetacoplan的洗脱馏分超滤浓缩4～6倍，再添加体积为浓缩后物料体积5倍的体积分数为0.1%的醋酸水溶液超滤。
在本发明的具体实施方式中，超滤所采用的膜包为TeomaxTM Ⅱ Cassette RC3K-D 0.1m2。其中，此处的超滤所采用的膜包适用于反相制备液相色谱纯化后的超滤处理，也适用于转盐处理中的超滤。
本发明另一方面提供了一种Pegcetacoplan的制备方法，包括如下步骤：
（A）将Pegcetacoplan中间体环肽与PEG40K于溶剂中进行偶联反应，得到偶联液；
（B）将偶联液进行纯化处理，纯化处理按照上述任意一种Pegcetacoplan的纯化方法进行。
其中，Pegcetacoplan中间体环肽可自制也可外购，具体地，Pegcetacoplan中间体环肽的结构式参考如下：
。
PEG40K具有如下结构通式，n为800～900之间的整数；
。
在本发明的具体实施方式中，步骤（A）中，Pegcetacoplan中间体环肽与PEG40K的质量比为1﹕（7～8）。
如在不同实施方式中，Pegcetacoplan中间体环肽与PEG40K的质量比可以为1﹕7、1﹕7.2、1﹕7.5、1﹕7.8、1﹕8或其中任意两者组成的范围。
在本发明的具体实施方式中，溶剂包括DMF。
在本发明的具体实施方式中，偶联反应包括：将Pegcetacoplan中间体环肽于溶剂中溶解，得到第一溶液；将PEG40K于溶剂中溶解，得到第二溶液；将第二溶液以100～140mL/min流速加入第一溶液中，然后于30～35℃反应1～2h。
在实际操作中，第一溶液中，Pegcetacoplan中间体环肽的浓度可以为6～8mg/mL；第二溶液中，PEG40K的浓度可以为20～30mg/mL，第二溶液加入第一溶液中的流速可以为100mL/min、110mL/min、120mL/min、130mL/min、140mL/min或其中任意两者组成的范围，调控上述工艺参数，以提高目标产物的收率。
在本发明的具体实施方式中，步骤（B）还包括：采用水将偶联液稀释8～12倍后，过滤，再进行纯化处理。
实施例1
本实施例提供了Pegcetacoplan的纯化方法，包括如下步骤：
（1）采用纯化水将偶联液稀释10倍后上样至色谱柱进行反相制备液相色谱法纯化，收集含Pegcetacoplan的洗脱馏分；其中，色谱柱为YMC反相C18色谱柱（20×250mm，10μm，120Å），检测波长为220nm；采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，流动相A为含2%（体积分数）三乙胺和1%（体积分数）磷酸的水溶液，流动相B为乙腈；梯度洗脱为：0～60min内，流动相B的体积分数由25%变至50%。
偶联液的制备包括：取137.5mg Pegcetacoplan中间体环肽成品加入20mL DMF超声使之充分溶解，得到第一溶液；取1g PEG40K溶于40mL DMF中，超声充分溶解，得到第二溶液；在搅拌条件下，将第二溶液以流速120mL/min加入第一溶液中，滴加完成后，于35℃搅拌反应1h，得到偶联液；偶联液中，目标产物的纯度为38.51%。
（2）将步骤（1）收集的含Pegcetacoplan的洗脱馏分超滤浓缩10倍，然后添加纯化水超滤至透过液电导为0.1μs/cm，然后剩余部分用3mM磷酸二氢钠水溶液补足至原洗脱馏分的体积。超滤所用膜包为TeomaxTM Ⅱ Cassette RC 3K-D 0.1m2。
（3）将步骤（2）得到的溶液上样至NanoGel -50SP HP阳离子交换层析柱，上样结束后，采用平衡缓冲液对阳离子交换层析柱进行平衡直至洗脱液在220nm的吸收为0；然后采用平衡缓冲液和流动相C（平衡缓冲液和流动相C的体积百分数之和为100%）进行洗脱，收集含Pegcetacoplan的洗脱馏分；
其中，平衡缓冲液为浓度为3mM的磷酸二氢钠的水溶液（pH为5.2）；流动相C为含3mM磷酸二氢钠和0.5M氯化钠的体积分数为20%的乙腈水溶液；洗脱中，在0～15CV内，流动相C的体积分数由0%变至40%。
（4）将步骤（3）收集的含Pegcetacoplan的洗脱馏分超滤浓缩5倍，再添加体积为浓缩后物料体积5倍的体积分数为0.1%的醋酸水溶液进行超滤，然后冻干，得到Pegcetacoplan纯品。
实施例2～5
实施例2～5参考实施例1的Pegcetacoplan的纯化方法，区别仅在于：步骤（1）的反相制备液相色谱法纯化参数不同，未提及部分均与实施例1相同，具体不同如下所示：
实施例2中流动相A不同于实施例1，实施例2的流动相A为体积分数为1%的TFA的水溶液；
实施例3中梯度洗脱不同于实施例1，实施例3的梯度洗脱为：0～60min内，流动相B的体积分数由26%变至46%；
实施例4中梯度洗脱不同于实施例1，实施例4的梯度洗脱为：0～60min内，流动相B的体积分数由28%变至48%；
实施例5中梯度洗脱不同于实施例1，实施例5的梯度洗脱为：0～60min内，流动相B的体积分数由20%变至60%。
分别对实施例1～5的纯化方法中，对应步骤（1）收集的含Pegcetacoplan的洗脱馏分进行纯度检测，并计算其收率，结果如表1所示。
表1 不同实施例的纯度及收率测试结果
从上述测试结果可知，实施例3的反相制备液相色谱纯化工艺，相较于其余工艺，具有更高的纯度和收率。需要说明的是：表1中的RP-HPLC纯度采用反相体系的HPLC进行检测，主要检测其中多肽相关杂质，可以反映相对纯度。
实施例6～9
实施例6～9参考实施例3的Pegcetacoplan的纯化方法，区别仅在于：步骤（3）的阳离子交换层析参数不同，未提及部分均与实施例3相同，具体不同如下所示：
实施例6中平衡缓冲液不同于实施例3，实施例6的平衡缓冲液为浓度为3mM的乙酸钠的水溶液；
实施例7中平衡缓冲液不同于实施例3，实施例7的平衡缓冲液为浓度为3mM的磷酸二氢钾的水溶液；
实施例8中平衡缓冲液不同于实施例3，实施例8的平衡缓冲液为浓度为0.5mM的磷酸二氢钠的水溶液；
实施例9中平衡缓冲液不同于实施例3，实施例9的平衡缓冲液为浓度为5mM的磷酸二氢钠的水溶液。
分别对实施例3、实施例6～9的纯化方法中，对应步骤（3）收集的含Pegcetacoplan的洗脱馏分进行纯度检测，并计算其收率，结果如表2所示。后续实施例对于步骤（3）收集的洗脱馏分的纯度是采用离子层析的HPLC进行检测，可以检测到多肽类杂质又可以检测到PEG类杂质，可以反映实际总纯度。
表2 不同实施例的纯度及收率测试结果
从上述测试结果可知，实施例6～8所得洗脱馏分中包含部分游离的PEG以及部分单取代，实施例9所得的洗脱馏分中虽然能够较好的分离杂质，但目标产物的收率较低。实施例3的纯化方法中，不仅能够较高的分离杂质，显著提高纯度，还能保证产物的收率，更满足生产需求。
实施例10～13
实施例10～13参考实施例3的Pegcetacoplan的纯化方法，区别仅在于：步骤（3）的阳离子交换层析参数不同，未提及部分均与实施例3相同，具体不同如下所示：
实施例10中流动相C不同于实施例3，实施例10的流动相C为含0.5M氯化钠的体积分数为20%的乙腈水溶液；
实施例11中流动相C不同于实施例3，实施例11的流动相C为含3mM磷酸二氢钠和0.5M氯化钠的体积分数为40%的乙腈水溶液；
实施例12中流动相C不同于实施例3，实施例12的流动相C为含3mM乙酸钠和0.5M氯化钠的体积分数为20%的乙腈水溶液；
实施例13中流动相C不同于实施例3，实施例13的流动相C为含5mM磷酸二氢钠和0.5M氯化钠的体积分数为20%的乙腈水溶液。
分别对实施例3、实施例10～13的纯化方法中，对应步骤（3）收集的含Pegcetacoplan的洗脱馏分进行纯度检测，并计算其收率，结果如表3所示。
表3 不同实施例的纯度及收率测试结果
实施例14～17
实施例14～17参考实施例3的Pegcetacoplan的纯化方法，区别仅在于：步骤（3）的阳离子交换层析参数不同，未提及部分均与实施例3相同，具体不同如下所示：
实施例14中阳离子交换层析柱为Proteomix PRO30-S阳离子交换层析柱；
实施例15中阳离子交换层析柱为Biolink Maxgo 30S阳离子交换层析柱；
实施例16中阳离子交换层析柱为Welch Precot SP Polymate阳离子交换层析柱；
实施例17中阳离子交换层析柱为Monomix HC30-SP阳离子交换层析柱。
分别对实施例3、实施例14～17的纯化方法中，对应步骤（3）的载样量以及收集的含Pegcetacoplan的洗脱馏分进行纯度检测，并计算其收率，结果如表4所示。
表4 不同实施例的载样量、纯度及收率测试结果
从上述测试结果可知，相较于其余实施例，实施例15～17的色谱柱填料不适于Pegcetacoplan的纯化，而实施例14的色谱柱填料对于杂质的分离具有一定的局限性，对比可知实施例3所采用的阳离子交换层析介质，在本发明的体系中，更有助于提高目标产物纯度，保证产物的收率，更满足生产需求。
实施例18～20
实施例18～20参考实施例3的Pegcetacoplan的纯化方法，区别仅在于：步骤（3）的阳离子交换层析参数不同，未提及部分均与实施例3相同，具体不同如下所示：
实施例18中平衡缓冲液不同于实施例3，实施例18的平衡缓冲液为浓度为3mM的磷酸二氢钠的水溶液，采用磷酸调节pH至3；
实施例19中平衡缓冲液不同于实施例3，实施例19的平衡缓冲液为浓度为3mM的磷酸二氢钠的水溶液，采用磷酸调节pH至4；
实施例20中平衡缓冲液不同于实施例3，实施例20的平衡缓冲液为浓度为3mM的磷酸二氢钠的水溶液，采用磷酸调节pH至5。
分别对实施例3、实施例18～20的纯化方法中，对应步骤（3）的载样量以及收集的含Pegcetacoplan的洗脱馏分进行纯度检测，并计算其收率，结果如表5所示。
表5 不同实施例的载样量、纯度及收率测试结果
实施例21～24
实施例21～24参考实施例3的Pegcetacoplan的纯化方法，区别仅在于：步骤（2）的超滤处理不同，未提及部分均与实施例3相同，具体不同如下所示：
实施例21的步骤（2）包括：将步骤（1）收集的含Pegcetacoplan的洗脱馏分超滤浓缩10倍，然后添加纯化水超滤至透过液电导为0.1μs/cm，然后剩余部分用0.1mM磷酸二氢钠水溶液补足至原洗脱馏分的体积；
实施例22的步骤（2）包括：将步骤（1）收集的含Pegcetacoplan的洗脱馏分超滤浓缩10倍，然后添加纯化水超滤至透过液电导为0.1μs/cm，然后剩余部分用5mM磷酸二氢钠水溶液补足至原洗脱馏分的体积；
实施例23的步骤（2）包括：将步骤（1）收集的含Pegcetacoplan的洗脱馏分超滤浓缩10倍，然后添加纯化水超滤至透过液电导为0.1μs/cm，然后剩余部分用3mM柠檬酸钠水溶液补足至原洗脱馏分的体积；
实施例24的步骤（2）包括：将步骤（1）收集的含Pegcetacoplan的洗脱馏分超滤浓缩10倍，然后添加纯化水超滤至透过液电导为0.1μs/cm，然后剩余部分用水补足至原洗脱馏分的体积。
分别对实施例3、实施例21～24的纯化方法中，对应步骤（3）的载样量以及收集的含Pegcetacoplan的洗脱馏分进行纯度检测，并计算其收率，结果如表6所示。
表6 不同实施例的载样量、纯度及收率测试结果
对比例1
对比例1提供了Pegcetacoplan的纯化方法，包括如下步骤：
（1）采用纯化水将偶联液稀释10倍后，添加纯化水超滤5倍体积，收集超滤后液体，超滤所用膜包为TeomaxTM Ⅱ Cassette RC 3K-D 0.1m2；
偶联液的制备包括：取137.5mg Pegcetacoplan中间体环肽成品加入20mL DMF超声使之充分溶解，得到第一溶液；取1g PEG40K溶于40mL DMF中，超声充分溶解，得到第二溶液；在搅拌条件下，将第二溶液以流速120mL/min加入第一溶液中，滴加完成后，于35℃搅拌反应1h，得到偶联液。
（2）将步骤（1）收集的含Pegcetacoplan的液体上样至色谱柱进行反相制备液相色谱法纯化，收集含Pegcetacoplan的洗脱馏分；其中，色谱柱为YMC反相C18色谱柱（20×250mm，10μm，120Å），检测波长为220nm；采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，流动相A为含2%（体积分数）三乙胺和1%（体积分数）磷酸的水溶液，流动相B为乙腈；梯度洗脱为：0～60min内，流动相B的体积分数由26%变至46%；
（3）将步骤（2）得到的溶液上样至NanoGel -50SP HP阳离子交换层析柱，上样结束后，采用平衡缓冲液对阳离子交换层析柱进行平衡直至洗脱液在220nm的吸收为0；然后采用平衡缓冲液和流动相C（平衡缓冲液和流动相C的体积百分数之和为100%）进行洗脱，收集含Pegcetacoplan的洗脱馏分；
其中，平衡缓冲液为浓度为3mM的磷酸二氢钠的水溶液；流动相C为含3mM磷酸二氢钠和0.5M氯化钠的体积分数为20%的乙腈水溶液；洗脱中，在0～15CV内，流动相C的体积分数由0%变至40%。
（4）将步骤（3）收集的含Pegcetacoplan的洗脱馏分超滤浓缩5倍，再添加体积为浓缩后物料体积5倍的体积分数为0.1%醋酸水溶液进行超滤，然后冻干，得到Pegcetacoplan纯品。
对比例2
对比例2提供了Pegcetacoplan的纯化方法，包括如下步骤：（1）采用纯化水将偶联液稀释10 倍后，添加纯化水超滤5倍体积，收集超滤后液体，超滤所用膜包为TeomaxTM ⅡCassette RC 3K-D 0.1m2；
偶联液的制备包括：取137.5mg Pegcetacoplan中间体环肽成品加入20mL DMF超声使之充分溶解，得到第一溶液；取1g PEG40K溶于40mL DMF中，超声充分溶解，得到第二溶液；在搅拌条件下，将第二溶液以流速120mL/min加入第一溶液中，滴加完成后，于35℃搅拌反应1h，得到偶联液。（2）将步骤（1）得到的溶液上样至NanoGel -50SP HP阳离子交换层析柱，上样结束后，采用平衡缓冲液对阳离子交换层析柱进行平衡直至洗脱液在220nm的吸收为0；然后采用平衡缓冲液和流动相C（平衡缓冲液和流动相C的体积百分数之和为100%）进行洗脱，收集含Pegcetacoplan的洗脱馏分；
其中，平衡缓冲液为浓度为3mM的磷酸二氢钠的水溶液；流动相C为含3mM磷酸二氢钠和0.5M氯化钠的体积分数为20%的乙腈水溶液；洗脱中，在0～15CV内，流动相C的体积分数由0%变至40%。（3）将步骤（1）收集的含Pegcetacoplan的液体上样至色谱柱进行反相制备液相色谱法纯化，收集含Pegcetacoplan的洗脱馏分；其中，色谱柱为YMC反相C18色谱柱（20×250mm，10μm，120Å），检测波长为220nm；采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，流动相A为含2%（体积分数）三乙胺和1%（体积分数）磷酸的水溶液，流动相B为乙腈；梯度洗脱为：0～60min内，流动相B的体积分数由26%变至46%；（4）将步骤（3）收集的含Pegcetacoplan的洗脱馏分超滤浓缩5倍，再添加体积为浓缩后物料体积5倍的体积分数为0.1%的醋酸水溶液进行超滤，然后冻干，得到Pegcetacoplan纯品。
对比例3
对比例3提供了Pegcetacoplan的纯化方法，包括如下步骤：
（1）将偶联液用平衡液稀释10倍上样至NanoGel -50SP HP阳离子交换层析柱，上样结束后，采用平衡缓冲液对阳离子交换层析柱进行平衡直至洗脱液在220nm的吸收为0；然后采用平衡缓冲液和流动相C（平衡缓冲液和流动相C的体积百分数之和为100%）进行洗脱，收集含Pegcetacoplan的洗脱馏分；
其中，平衡缓冲液为浓度为3mM的磷酸二氢钠的水溶液；流动相C为含3mM磷酸二氢钠和0.5M氯化钠的体积分数为20%的乙腈水溶液；洗脱中，在0～15CV内，流动相C的体积分数由0%变至40%。
偶联液的制备包括：取137.5mg Pegcetacoplan中间体环肽成品加入20mL DMF超声使之充分溶解，得到第一溶液；取1g PEG40K溶于40mL DMF中，超声充分溶解，得到第二溶液；在搅拌条件下，将第二溶液以流速120mL/min加入第一溶液中，滴加完成后，于35℃搅拌反应1h，得到偶联液。
（2）将步骤（1）收集的含Pegcetacoplan馏分上样至色谱柱进行反相制备液相色谱法纯化，收集含Pegcetacoplan的洗脱馏分；其中，色谱柱为YMC反相C18色谱柱（20×250mm，10μm，120Å），检测波长为220nm；采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，流动相A为含2%（体积分数）三乙胺和1%（体积分数）磷酸的水溶液，流动相B为乙腈；梯度洗脱为：0～60min内，流动相B的体积分数由26%变至46%；
（3）将步骤（2）收集的含Pegcetacoplan的洗脱馏分超滤浓缩5倍，再添加体积为浓缩后物料体积5倍的体积分数为0.1%的醋酸水溶液进行超滤，然后冻干，得到Pegcetacoplan纯品。
对比例1～3的纯化方法中，对比例1和对比例2中第一步超滤过程中部分样品流穿，无法满足收率要求，对比例3在离子纯化过程中样品完全流穿，无法实现样品的纯化。
对比例4～5
对比例4～5参考实施例1的Pegcetacoplan的纯化方法，区别在于：步骤（1）的反相制备液相色谱法纯化参数不同，未提及部分均与实施例1相同，具体不同如下所示：
对比例4的流动相A不同：对比例4的流动相A为含50mM碳酸氢钠的水溶液；
对比例5的流动相B不同：对比例5的流动相B为甲醇。
对比例6～7
对比例6～7参考实施例1的Pegcetacoplan的纯化方法，区别在于：步骤（3）的阳离子交换层析参数不同，未提及部分均与实施例1相同，具体不同如下所示：
对比例6的平衡缓冲液不同：对比例7中的平衡缓冲液为pH为5的3mM柠檬酸钠的水溶液；
对比例7的平衡缓冲液不同：对比例8中的平衡缓冲液为pH为5的乙酸铵的水溶液。
分别对对比例4～7的纯化方法中，对应步骤（3）收集的含Pegcetacoplan的洗脱馏分进行纯度检测，并计算其收率，结果如表7所示。
表7 不同对比例的纯度及收率测试结果
备注：对比例4和对比例5中的收率为反相步骤的收率；对比例6和对比例7中的收率为阳离子交换层析步骤的收率。
根据上述测试结果可知，本发明针对Pegcetacoplan的结构及合成特性，结合反相制备液相色谱纯化、超滤、阳离子交换层析工序，可获得高纯度的Pegcetacoplan，获得的Pegcetacoplan产品的纯度可达99.98%，整体收率可达77.34%。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (20)
1.Pegcetacoplan的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
（a）对待纯化样品进行反相制备液相色谱纯化，收集含Pegcetacoplan的洗脱馏分；
（b）对所述含Pegcetacoplan的洗脱馏分进行超滤处理后，进行阳离子交换层析，收集含Pegcetacoplan的洗脱馏分；
所述反相制备液相色谱纯化中，流动相A为试剂A的水溶液；流动相B为乙腈；所述试剂A包括甲酸、三氟乙酸、磷酸和三乙胺中的至少一种；
所述阳离子交换层析中，平衡缓冲液为试剂B的水溶液，所述试剂B包括乙酸钠、磷酸二氢钠和磷酸二氢钾中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述流动相A为三乙胺和磷酸的水溶液；
所述流动相A中，三乙胺和磷酸的体积分数分别为1.8%～2.2%和0.9%～1.1%。
3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述平衡缓冲液中，所述试剂B的浓度为0.1～5mM。
4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述平衡缓冲液的pH为3～5.2。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述反相制备液相色谱纯化中，色谱柱为反相C18色谱柱。
6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述反相制备液相色谱纯化中，采用所述流动相A和所述流动相B进行梯度洗脱；所述梯度洗脱包括：0～60min内，所述流动相B的体积分数由20%～28%变至46%～60%。
7.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述反相制备液相色谱纯化中，采用检测波长为220nm的紫外检测器检测，收集含Pegcetacoplan的洗脱馏分。
8.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述阳离子交换层析包括：将所述超滤处理后的溶液上样，然后采用所述平衡缓冲液进行平衡，再采用洗脱溶剂进行洗脱；
采用所述平衡缓冲液和流动相C进行所述洗脱，所述流动相C为含磷酸二氢钠和氯化钠的乙腈水溶液。
9.根据权利要求8所述的纯化方法，其特征在于，所述流动相C中，所述磷酸二氢钠的浓度为1～5mM，所述氯化钠的浓度为0.4～0.6M，所述乙腈水溶液中，乙腈的体积分数为15%～25%。
10.根据权利要求8所述的纯化方法，其特征在于，所述洗脱包括：0～15CV内，所述流动相C的体积分数由0%变至40%。
11.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述阳离子交换层析中，层析介质包括NanoGel -50SP HP、Proteomix PRO30-S、Welch Precot SP Polymate、Monomix HC30-SP和Biolink Maxgo 30S中的至少一种。
12.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述超滤处理包括：将所述含Pegcetacoplan的洗脱馏分超滤浓缩8～12倍，并采用水超滤至透过液电导≤0.1μs/cm，采用磷酸二氢钠水溶液稀释截留液至原洗脱馏分的体积。
13.根据权利要求12所述的纯化方法，其特征在于，所述磷酸二氢钠水溶液的浓度为0.1～5mM。
14.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法还包括：将步骤（b）所述的含Pegcetacoplan的洗脱馏分进行转盐处理后，浓缩、冻干。
15.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述转盐处理包括：将步骤（b）所述的含Pegcetacoplan的洗脱馏分超滤浓缩4～6倍，再添加体积为浓缩后物料体积5倍的体积分数为0.1%的醋酸水溶液进行超滤。
16.根据权利要求1或15所述的纯化方法，其特征在于，所述超滤所采用的膜包为TeomaxTM Ⅱ Cassette RC 3K-D 0.1m2。
17.Pegcetacoplan的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（A）将Pegcetacoplan中间体环肽与PEG40K于溶剂中进行偶联反应，得到偶联液；
（B）将所述偶联液进行纯化处理，所述纯化处理包括权利要求1～16任一项所述的纯化方法。
18.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，步骤（A）中，所述Pegcetacoplan中间体环肽与所述PEG40K的质量比为1﹕（7～8）。
19.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，所述偶联反应包括：将所述Pegcetacoplan中间体环肽于溶剂中溶解，得到第一溶液；将所述PEG40K于溶剂中溶解，得到第二溶液；将所述第二溶液以100～140mL/min流速加入所述第一溶液中，然后于30～35℃反应1～2h。
20.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，步骤（B）还包括：采用水将所述偶联液稀释8～12倍后，过滤，再进行所述纯化处理。
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