CN115894663A - 一种重组人白细胞介素-2纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及蛋白纯化技术领域，具体公开一种通过离子交换层析纯化重组人IL‑2（hIL‑2）的方法。所述通过离子交换层析纯化hIL‑2的方法采用阳离子交换层析法和阴离子交换层析法相结合的方法进行纯化，得到所述的hIL‑2。本发明提供的离子交换层析法纯化hIL‑2的方法，使用阳离子交换柱（SP）和阴离子交换柱（Q）相互结合的方法进行纯化，改变了传统的仅依赖凝胶过滤层析法纯化hIL‑2的方法，提高了二硫键错配hIL‑2的去除效率，同时降低了填料成本，操作简单，便于放大。

Description

一种重组人白细胞介素-2纯化方法

技术领域

本发明涉及蛋白纯化技术领域，尤其涉及一种通过离子交换层析纯化重组人白细胞介素-2（hIL-2）的方法。

背景技术

人白细胞介素-2（hIL-2）是人体中一种重要的细胞因子，其在T细胞增殖和分化过程中发挥重要作用。成熟hIL-2由133个氨基酸组成，等电点为6.5-7.5，有三个半胱氨酸残基，分别位于第58、105和125位，125位为游离状。hIL-2目前批准的适应症包括肾细胞癌、黑色素瘤等，目前低剂量hIL-2也应用于多种自身免疫病的治疗，另外hIL-2在CAR-T细胞制备等过程中也发挥关键作用。

目前hIL-2主要用重组大肠杆菌来生产，天然IL-2蛋白内部存在一个二硫键，由于表达的hIL-2不能形成二硫键，因此主要积累在包涵体中，纯化时需要先破碎菌体，经过离心获得包涵体，再对包涵体蛋白进行裂解复性，复性时二硫键容易错配。正确的二硫键对于IL-2活性的保持是必须的。复性后再利用层析纯化，对hIL-2进行纯化，去除二硫键错配hIL-2以及其他包涵体杂蛋白，获得纯化的hIL-2。目前纯化工艺中，大多包括凝胶过滤层析步骤（田志刚等，1994年，重组人IL-2的纯化和初步质量检测，中华生化药物杂志；吕建龙，重组人白介素-2纯化工艺的改进和放大研究，2016年，北京化工大学硕士学位论文；高晋，重组人白介素-2的纯化工艺研究，吉林大学硕士学位论文），但凝胶过滤层析对二硫键错配hIL-2的清除能力有限，给纯化工艺生产和规模放大过程带来诸多不便。朱文瑾等公开了一种高纯度重组白介素-2的制备工艺（专利申请公开号：CN 111676261 A）通过疏水层析、反相层析和弱阴离子层析纯化重组IL-2，对去除内毒素效果显著，但未报道去除错配IL-2的效果。

凝胶过滤层析因层析介质的结构和作用原理而得名，它的主要原理是利用分离对象中各组份的分子量之间大小不同达到将不同组份进行分离的目标。当被分离的物质在凝胶层析柱内部行进时，较凝胶孔径大的分子由于进不了凝胶介质的内部孔径，因此只能从凝胶介质与介质之间的空隙中穿过层析柱，由于走的路径比较短，所以，在相同的洗脱流速下，先于其他分子被洗脱下来；而小于凝胶孔径的分子则被迫进入到了凝胶介质内部的网孔中，并随洗脱液的流动在介质中的网孔中随意穿行，因此在层析柱内行进的路程变长，而在相同的洗脱流速下，迁移比较慢，最后才被洗脱出层析柱；通过对不同时间段的洗脱液分别进行单独收集，便可将被分离对象中的各组分进行有效分离。

凝胶过滤层析分离原理就决定其与其他纯化方法相比，对装柱质量要求更高，流速更慢，上样体积小（一般不超过柱体积的5%），填料成本高，导致工艺放大过程更加困难。另外，其分离作用主要依赖分子量的差异。复性过程中二硫键错配的hIL-2与正常hIL-2的分子量无差异，导致其对错配hIL-2的去除能力有限，需在前期复性阶段对工艺进行严格控制。

发明内容

针对现有hIL-2纯化方法存在的上述问题，本发明提供一种通过离子交换层析纯化hIL-2的方法。

离子交换层析是利用离子交换剂为固定相，通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换而达到分离目的的洗脱层析法。离子交换主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中荷电的微小差异而进行分离，具有较高的分离容量。几乎所有的生物大分子都是极性的，除等电点PH值外，都可使其带电，所以离子交换已常用于生物大分子的纯化。本发明通过对离子交换层析方法进行不断优化，调整流程，将现有工艺的凝胶过滤层析方法替换成离子交换层析，进一步降低了填料成本，使纯化工艺更加适于工艺放大。

为了实现上述目的，本发明采用的离子交换层析法为阳离子交换层析和阴离子交换层析相结合的方式，具体包括，将含有hIL-2的待纯化样品上样至阳离子柱，利用洗脱液对阳离子柱进行梯度洗脱，收集洗脱峰主成分进行超滤脱盐后进行阴离子层析，收集流出峰以获得纯化的hIL-2。

具体步骤如下：

（1）阳离子交换层析纯化：用平衡液平衡阳离子柱后，将含有hIL-2的待纯化样品上样至阳离子柱，上样完成后，用平衡液平衡至基线平稳，用洗脱液对阳离子柱进行梯度洗脱，洗脱时间为40-50min，收集紫外吸光范围为20MAU-800MAU-20MAU洗脱峰主成分。

（2）超滤脱盐：用平衡液充分平衡5KD超滤膜包，将阳离子交换层析纯化得到的洗脱峰主成分利用超滤膜包进行超滤脱盐，待样品电导率低于5ms/cm为止，收集样品。

（3）阴离子交换层析法纯化：用平衡液充分平衡阴离子柱至基线平稳，将超滤脱盐收集的样品上样，保留时间大于等于33min，收集流穿蛋白峰溶液，并加吐温-20混匀后，置冰箱2-8℃保存；将得到的蛋白峰溶液混合液用5KD浓缩膜浓缩，用PH4-5的醋酸-醋酸钠缓冲液补至原体积，重复两次即可换液，得到hIL-2纯化液。

在一种实施方案中，所述阳离子交换层析的填料为SP Sepharose Fast Flow。

在一种实施方案中，所述阴离子交换层析的填料为Q Sepharose Fast Flow。

在一种实施方案中，所述超滤膜包为5KD分子量。

在一种实施方案中，所述平衡液和洗脱液为磷酸缓冲液。

在一种实施方案中，所述阳离子交换层析纯化与阴离子交换层析纯化的平衡液为磷酸缓冲液为5-20mM的PB缓冲液，PH为5.9-6.1；洗脱液为含有盐的磷酸缓冲液，优选磷酸缓冲液为5-20mM的PB缓冲液，盐离子浓度为1M。

在一种实施方案中，所述阳离子交换层析纯化洗脱液以15%-50%进行梯度洗脱。

在一种实施方案中，所述脱盐过程中平衡液为5-20mM的PB缓冲液。

本发明的技术方案具有以下技术效果：样品处理量更大，分辨率更高；易于操作，原材料成本较之前大幅降低，且纯化规模更易放大；对于错配的hIL-2去除效果更好，使产品质量更加提高。

附图说明

图1.离子交换层析法纯化产物错配hIL-2液相图和比例

图2.凝胶过滤纯化方法纯化产物错配hIL-2液相图和比例

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

通过在样品中掺入错配hIL-2分子，我们制备出一批错配率高的hIL-2，其反相色谱检测错配比例达18.7%，用于对比离子交换层析纯化方法和凝胶过滤层析纯化方法纯化效果。

实施例：离子交换层析法

首先通过阳离子交换层析纯化hIL-2，包括以下步骤：

A、配制相关溶液：

平衡液：20mM的PB缓冲液（PH=6）。

洗脱液：向20mM的PB缓冲液（PH=6）中加入1M Nacl。

含有hIL-2的平衡液：向上述平衡液中加入hIL-2。

B、阳离子纯化：

用10柱体积的平衡液充分平衡SP柱（XK26/40，SP Sepharose FF）至基线平稳，用含有hIL-2的平衡液800ml上样，上样保留时间≥4h，上样完成后，用2柱体积的平衡液平衡。

C、洗脱纯化

平衡至基线平稳后，用15%的洗脱液洗脱样品，弃掉洗脱出的杂质峰，用16%-50%的洗脱液进行梯度洗脱，洗脱时间为40-50min，收集紫外20MAU-800MAU-20MAU部分为主成分约100-150ml。用100%洗脱液洗脱出剩余杂质峰。

继而通过超滤膜包进行超滤脱盐，包括以下步骤：

A、配制相关溶液：

平衡液：20mM的PB缓冲液（PH=6）。

B、超滤脱盐：

用平衡液充分平衡5KD超滤膜包，对阳离子层析收集样品进行浓缩，用平衡液进行脱盐，直到电导率低于5ms/cm。

最后通过阴离子交换层析进行纯化：

A、配制相关溶液：

平衡液：20mM的PB缓冲液（PH=6）。

洗脱液：20mM的PB缓冲液（PH=6）中加入1M Nacl。

B、阴离子纯化：

用3柱体积的平衡液充分平衡Q柱（XK26/40，Q Sepharose FF）至基线平稳，将脱盐样品溶液100-150ml上样，上样保留时间≥33min。收集流穿蛋白峰溶液共150ml，加0.05%的吐温-20，混匀后置冰箱2-8℃保存。

C、换液浓缩：

将收集的蛋白峰溶液150ml用5KD浓缩膜浓缩，用PH4.4的上述醋酸-醋酸钠缓冲液补至原体积，重复两次即可换液，得hIL-2终浓度为1.5mg/ml，终体积为50ml。SDS非还原电泳检测条带正确。

对比例：凝胶过滤层析法

A、配制相关纯化工作液：

向50mM的PB缓冲液（PH=6.8）中加入1%SDS，0.001M EDTA，0.001M DTT。

B、凝胶过滤层析纯化：

用Sephacryl s-200填装凝胶柱，用5柱体积的平衡液充分平衡凝胶柱（φ10×100cm，）至基线平稳，hIL-2粗提样品在40℃水浴中溶解，上样量80-100mL/柱，流速20ml/min，随后用洗脱液（1%SDS，50mM PB，EDTA 0.001M，DTT 0.001M）洗脱，280nm检测，收样。

C、复性：样品用复性液（50mMPB pH=7.0，0.03%SDS，0.1M DTT，5mM CuSO4，0.1MEDTA）进行复性。取样品放入40℃水浴箱中，水浴5-10分钟，充分溶解。随后向样品中1:39（V/V）加入0.1M DTT，放入60℃水浴箱中水浴15 min。

D、凝胶过滤层析纯化：用Sephacryls-100对复性样品进行纯化，上样体积300-350mL/柱，Flow rate 15mL/min泵入已平衡柱内，洗脱收集样品。随后以1/99（V/V）加入5mMCuSO₄摇匀放置40min，再以1/9（V/V）体积加入0.1M EDTA 摇匀作用40min。

E、G-25柱脱盐：凝胶介质：sephadex-G25；柱尺寸：φ10×60cm。上样，样品Flowrate：15mL/min。随后用洗脱液洗脱，收集蛋白峰流出液，冲洗至电导率和UV基线平稳。

液相方法对离子交换层析纯化方法与凝胶过滤层析纯化方法进行对比，发现离子交换层析纯化方法明显降低错配hIL-2所占比例，（离子交换方法纯化后错配hIL-2比例低于0.77%，而凝胶过滤层析纯化方法纯化产物中错配比例为2.52%）。由此可知，离子交换层析纯化后明显降低hIL-2错配率，从而提高了蛋白活性及纯度，提升产品质量。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种通过离子交换层析法纯化hIL-2的方法，其特征在于包括采用阳离子交换层析法和阴离子交换层析法相结合的方法进行纯化。

2.如权利要求1所述的离子交换层析法纯化hIL-2的方法，包括采用阳离子交换层析法和阴离子交换层析法相结合的方法，其特征在于具体过程为将含有hIL-2的待纯化样品上样至阳离子柱，利用洗脱液对阳离子柱进行梯度洗脱，收集洗脱峰主成分用超滤膜包超滤脱盐后用阴离子柱进行纯化，收集流穿峰以获得纯化的hIL-2。

3.如权利要求2所述的离子交换层析法纯化hIL-2的方法，包括采用阳离子交换层析法和阴离子交换层析法相结合的方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）阳离子交换层析纯化：用平衡液平衡阳离子柱后，将含有hIL-2的待纯化样品上样至阳离子柱，上样完成后，用平衡液平衡至基线平稳，用洗脱液对阳离子柱进行梯度洗脱，收集紫外吸光范围为20MAU-800MAU-20MAU洗脱峰主成分；

（2）浓缩脱盐：用平衡液充分平衡超滤膜包，将阳离子交换层析纯化得到的洗脱峰主成分用超滤膜包进行浓缩脱盐，待样品电导率低于5ms/cm为止，收集样品；

（3）阴离子交换层析法纯化：用平衡液充分平衡阴离子柱至基线平稳，将脱盐收集的样品上样，收集流穿蛋白峰溶液，并加吐温-20混匀后，将得到的蛋白峰溶液混合液用5KD浓缩膜浓缩，用PH4.4的醋酸-醋酸钠缓冲液补至原体积，重复两次即可换液，得到hIL-2纯化液。

4.如权利要求2或3所述的通过离子交换层析法纯化hIL-2的方法，其特征在于：所述阳离子层析法填料为SP Sepharose Fast Flow。

5.如权利要求2或3所述的通过离子交换层析法纯化hIL-2的方法，其特征在于：所述阴离子层析法填料为Q Sepharose Fast Flow。

6.如权利要求2或3所述的通过离子交换层析法纯化hIL-2的方法，其特征在于：所述超滤膜包分子量为5KD。

7.如权利要求3所述的通过离子交换层析法纯化hIL-2的方法，其特征在于所述平衡液和洗脱液为磷酸缓冲液。

8.如权利要求3所述的通过离子交换层析法纯化hIL-2的方法，其特征在于：所述阳离子交换层析纯化与阴离子交换层析纯化的平衡液为磷酸缓冲液为5-20mM的PB缓冲液，PH为5.9-6.1；洗脱液为含有盐的磷酸缓冲液，优选磷酸缓冲液为5-20mM的PB缓冲液，盐离子浓度为1M。

9.如权利要求3所述的通过离子交换层析法纯化hIL-2的方法，其特征在于：所述阳离子交换层析纯化洗脱液以15%-50%进行梯度洗脱。

10.如权利要求3所述的通过离子交换层析法纯化hIL-2的方法，其特征在于：所述脱盐过程中平衡液为5-20mM的PB缓冲液。

Images