CN104098656A - 一种西那普肽的多肽合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种西那普肽的多肽合成方法，包括如下步骤：以2-氯-三苯基氯树脂起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护21肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团，TFA切肽后，获得粗品，粗品经C18柱分离纯化，冻干后，制得西那普肽精品。本发明的方法，工艺稳定，原辅材料来源方便，生产周期短，收率高，质量稳定，生产成本低，接肽收率高，避免使用氟化氢等剧毒试剂，三废污染少。每步接肽收率均在98.5%以上；切肽后收率为：98.3%，总收率为：47.9%，HPLC测定产品纯度为：99.6%。
Description
技术领域
本发明涉及西那普肽的制备方法，尤其涉及固相多肽合成西那普肽的制备方法。
背景技术
西那普肽，英文名：Surfaxin，Sinapultide，分子式：C126H238N26O22；CAS登记号：138531-07-4；分子量：2469.5；碳、氢、氮比例：C：61.28%，H：9.71%，N：14.75%。氨基酸序列：
H-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-OH；
结构式：
西那普肽是一个人工合成的21肽，用于治疗早产儿呼吸窘迫综合征。Discovery Laboratories Inc为原研公司，于2012年3月被美国FDA 批准上市。
中国专利申请号为201210345662.3，名称为“一种西那普肽的化学合成方法”的发明专利申请公开了一种合成西那普肽的方法。该发明提供的方法具体实现为：通过合成4个多肽小片段作为中间体，利用分段合成的方式经过3步偶联反应得到西那普肽树脂，然后进行裂解并纯化得到西那普肽纯品。该方法的需耗用4次树脂，成本比较高。
发明内容
本发明的目的是提供一种固相多肽合成西那普肽的制备方法，本发明的制备方法中只采用1次树脂，充分发挥了固相合成的优势，高效率的制备了西那普肽。
合成路线如下：
2-氯-三苯基氯-树脂
↓①Fmoc-Lys(Boc)-OH；②DIPEA；③甲醇
Fmoc-Lys(Boc)-树脂
↓①PIP；②HATU/HOAt，Fmoc-Leu-OH
Fmoc-Leu-Lys(Boc)-树脂
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Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
↓①PIP；②TFA/TIS/巯基乙醇；③磷酸盐溶液/乙腈；④冷冻干燥
Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-OH
本发明的技术方案如下：
固相多肽合成西那普肽的制备方法，包括如下步骤：以2-氯-三苯基氯树脂起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH进行缩合反应，获得保护二十一肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团，同步进行脱侧链保护基团；切肽，获得西那普肽粗品；纯化后制得西那普肽。
优选地，所述按照固相合成的方法，获得保护二十一肽树脂，包括如下步骤：
一、制备Fmoc-Lys(Boc)-树脂
1）取2-氯-三苯基氯树脂用DMF浸泡，使树脂充分溶胀，加DIPEA，Fmoc-Lys(Boc)-OH，反应，再加甲醇，反应；
2）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
二、制备Fmoc-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应；
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干；
三、制备Fmoc-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应；
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干；
四、制备Fmoc-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应；
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干；
五、制备Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应；
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干；
六、制备Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Lys(Boc)-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，反应；
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
七、制备Fmoc-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应；
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干；
八、制备Fmoc-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应；
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干；
九、制备Fmoc-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应；
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干；
十、制备Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(tBu)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应；
3）抽干，用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
十一、制备Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Lys(Boc)-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应；
3）抽干，用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
十二、制备Fmoc-Lue-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应；
3）抽干，用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
十三、制备Fmoc-Leu-Lue-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc) -树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应；
3）抽干，用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
十四、制备Fmoc-Leu-Lue-Lue-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu -Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应；
3）抽干，用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
十五、制备Fmoc-Leu-Lue-Leu-Lue-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu- Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应；
3）抽干，用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
十六、制备Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lue-Leu-Lue-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu -Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Lys(Boc)-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，反应；
3）抽干，用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
十七、制备Fmoc-Lue-Lys(Boc)Leu-Lue-Leu-Lue-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu -Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应；
3）抽干，用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
十八、制备Fmoc-Lue-Lue-Lys(Boc)Leu-Lue-Leu-Lue-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc) -Leu -Leu-Leu- Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应；
3）抽干，用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
十九、制备Fmoc-Lue-Lue-Lue-Lys(Boc)Leu-Lue-Leu-Lue-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu- Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu- Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应；
3）抽干，用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
二十、制备Fmoc-Lue-Lue-Lue-Lue-Lys(Boc)Leu-Lue-Leu-Lue-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu- Leu-Lys(Boc)-Leu -Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应；
3）抽干，用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
二十一、制备Fmoc-Lys(Boc)-Lue-Lue-Lue-Lue-Lys(Boc)-Leu-Lue-Leu-Lue-Lys(Boc)-Leu- Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Lys(Boc)-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，反应；
3）抽干，用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
4）加脱帽试剂，反应，抽干，用DMF、甲醇、DMF和甲醇洗涤，抽干；
所述接肽试剂为：DIPEA∶DMF=1∶10，体积比；
所述脱帽试剂为：PIP∶DMF=24.5∶75.5，体积比；
所述接肽反应温度为：0-5℃；接肽时间为：55分钟；
所述脱帽反应温度为：21-23℃；脱帽时间18分钟。
优选地，所述2-氯-三苯基氯树脂取代度为：0.45-0.55mmol/g。
优选地，所述脱去Fmoc-保护基团所用的脱帽试剂为PIP∶DMF=24.5∶75.5，体积比。
优选地，所述进行缩合反应所用的接肽试剂为DIPEA∶DMF=1∶10，体积比。
优选地，所述切肽所用的切肽试剂为：TFA/TIS=932ml/68ml。
优选地，所述切肽包括如下步骤：
将所述保护二十一肽树脂：Fmoc-Lys(Boc)-Lue-Lue-Lue-Lue-Lys(Boc)-Leu-Lue-Leu-Lue-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂加入预冷至-10至-7℃的切肽试剂中，反应，收集切肽后的粗品；
所说的切肽试剂为：TFA/TIS=932ml/68ml；
所说的切肽反应温度为：13-16℃；
所说的切肽反应时间为：65分钟。
优选地，所述纯化具体实现为：将所述二十一肽粗品经C18柱分离纯化、除盐，冻干后，制得西那普肽。
优选地，所述纯化具体实现为：将西那普肽粗品溶于乙酸中，过滤，滤液经C18柱纯化，流速为800-900ml/min；检测波长为：230nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后除盐，除溶剂、冻干，获得成品；
所述流动相为：0.122Mol/L 磷酸三乙胺/乙腈＝6.9/3.1。
有益效果
本发明的产品结构由21个氨基酸组成，其中16个Leu，5个Lys。因此给多肽合成带来一定的困难。本发明采用独特的组合的工艺来制备，取得了意想不到的效果。本发明以2-氯-三苯甲基树脂为起始原料，与树脂缩合的第一个氨基酸采用Fmoc-Lys(Boc)-OH，然后，逐个与Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH进行缩合反应，缩合剂为HATU/HOAt，得到Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂；用特殊的切肽试剂（TFA/TIS＝93.2/6.8）将多肽从树脂上切落；用特殊流动相（0.122Mol/L 磷酸三乙胺/乙腈＝6.9/3.1）进行分离纯化；得到纯度大于99.6%的西那普肽。本发明的方法，工艺稳定，原辅材料来源方便，生产周期短，收率高，质量稳定，生产成本低，接肽收率高，避免使用氟化氢等剧毒试剂，三废污染少。每步接肽收率均在98.5%以上；切肽后收率为：98.3%，总收率为：47.9%，HPLC测定产品纯度为：99.6%。
具体实施方式
实施例1
实施例和前述过程中所采用的原料列表如下：
| No | 品 名 | 生产厂商 |
| 1 | 2-氯-三苯基氯树脂 | 天津和成科技有限公司 |
| 2 | Fmoc-Lys(Boc)-OH | 苏州天马医药集团 |
| 3 | Fmoc-Leu-OH | 苏州天马医药集团 |
| 4 | 1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAt) | 苏州天马医药集团 |
| 5 | 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU) | 苏州天马医药集团 |
| 6 | N,N-二异丙基乙胺(DIPEA) | 国药集团化学试剂有限公司 |
| 7 | 二甲基甲酰胺(DMF) | 国药集团化学试剂有限公司 |
| 8 | 甲醇 | 国药集团化学试剂有限公司 |
| 9 | 六氢吡啶（PIP） | 国药集团化学试剂有限公司 |
| 11 | 三异丙基硅烷（TIS） | 国药集团化学试剂有限公司 |
| 12 | 三氟醋酸（TFA） | 国药集团化学试剂有限公司 |
实施例中：
接肽试剂为：DIPEA∶DMF=1∶10，体积比；
脱帽试剂为：PIP∶DMF=24.5∶75.5，体积比；
一、制备Fmoc-Lys(Boc)-树脂
1）取2-氯-三苯基氯树脂(0.5mmol/g树脂，50mmol) 100g，用1000ml DMF浸泡30分钟，使树脂充分溶胀，加DIPEA 20ml，Fmoc-Lys(Boc)-OH 23.5g，25℃反应65分钟。再加甲醇50ml，25℃反应60分钟。
2）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干。
二、制备Fmoc-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加1000ml脱帽试剂，21-23℃反应18分钟，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF各洗涤三次，抽干。
2）取53.0g Fmoc-Leu-OH、57.0g HATU、20.5g HOAt，用520ml接肽试剂溶解，加入反应容器，0-5℃反应55分钟。
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干。
三、制备Fmoc-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加1000ml脱帽试剂，21-23℃反应18分钟，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF各洗涤三次，抽干。
2）取53.0g Fmoc-Leu-OH、57.0g HATU、20.5g HOAt，用520ml接肽试剂溶解，加入反应容器，0-5℃反应55分钟。
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干。
四、制备Fmoc-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加1000ml脱帽试剂，21-23℃反应18分钟，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF各洗涤三次，抽干。
2）取53.0g Fmoc-Leu-OH、57.0g HATU、20.5g HOAt，用520ml接肽试剂溶解，加入反应容器，0-5℃反应55分钟。
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干。
五、制备Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加1000ml脱帽试剂，21-23℃反应18分钟，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF各洗涤三次，抽干。
2）取53.0g Fmoc-Leu-OH、57.0g HATU、20.5g HOAt，用520ml接肽试剂溶解，加入反应容器，0-5℃反应55分钟。
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干。
六、制备Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加1000ml脱帽试剂，21-23℃反应18分钟，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF各洗涤三次，抽干。
2）取70.5g Fmoc-Lys(Boc)-OH、57.0g HATU、20.5g HOAt，用520ml接肽试剂溶解，加入反应容器，0-5℃反应55分钟。
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干。
七、制备Fmoc-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加1000ml脱帽试剂，27-29℃反应15分钟，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干。
2）取74.2g Fmoc-Leu-OH、79.5g HATU、28.6g HOAt，用760ml接肽试剂溶解，加入反应容器，19-21℃反应45分钟。
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干。
八、制备Fmoc-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加1000ml脱帽试剂，21-23℃反应18分钟，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF各洗涤三次，抽干。
2）取53.0g Fmoc-Leu-OH、57.0g HATU、20.5g HOAt，用520ml接肽试剂溶解，加入反应容器，0-5℃反应55分钟。
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干。
九、制备Fmoc-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加1000ml脱帽试剂，21-23℃反应18分钟，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF各洗涤三次，抽干。
2）取53.0g Fmoc-Leu-OH、57.0g HATU、20.5g HOAt，用520ml接肽试剂溶解，加入反应容器，0-5℃反应55分钟。
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干。
十、制备Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu- D-Tyr (tBu)-树脂
1）加1000ml脱帽试剂，21-23℃反应18分钟，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF各洗涤三次，抽干。
2）取53.0g Fmoc-Leu-OH、57.0g HATU、20.5g HOAt，用520ml接肽试剂溶解，加入反应容器，0-5℃反应55分钟。
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干。
十一、制备Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加1000ml脱帽试剂，21-23℃反应18分钟，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF各洗涤三次，抽干。
2）取70.5g Fmoc-Lys(Boc)-OH、57.0g HATU、20.5g HOAt，用520ml接肽试剂溶解，加入反应容器，0-5℃反应55分钟。
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干。
十二、制备Fmoc-Lue-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加1000ml脱帽试剂，21-23℃反应18分钟，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF各洗涤三次，抽干。
2）取53.0g Fmoc-Leu-OH、57.0g HATU、20.5g HOAt，用520ml接肽试剂溶解，加入反应容器，0-5℃反应55分钟。
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干。
十三、制备Fmoc-Leu-Lue-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc) -树脂
1）加1000ml脱帽试剂，21-23℃反应18分钟，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF各洗涤三次，抽干。
2）取53.0g Fmoc-Leu-OH、57.0g HATU、20.5g HOAt，用520ml接肽试剂溶解，加入反应容器，0-5℃反应55分钟。
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干。
十四、制备Fmoc-Leu-Lue-Lue-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu -Lys(Boc)-树脂
1）加1000ml脱帽试剂，21-23℃反应18分钟，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF各洗涤三次，抽干。
2）取53.0g Fmoc-Leu-OH、57.0g HATU、20.5g HOAt，用520ml接肽试剂溶解，加入反应容器，0-5℃反应55分钟。
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干。
十五、制备Fmoc-Leu-Lue-Leu-Lue-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu- Leu -Lys(Boc)-树脂
1）加1000ml脱帽试剂，21-23℃反应18分钟，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF各洗涤三次，抽干。
2）取53.0g Fmoc-Leu-OH、57.0g HATU、20.5g HOAt，用520ml接肽试剂溶解，加入反应容器，0-5℃反应55分钟。
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干。
十六、制备Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lue-Leu-Lue-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu- Leu -Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加1000ml脱帽试剂，21-23℃反应18分钟，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF各洗涤三次，抽干。
2）取70.5g Fmoc-Lys(Boc)-OH、57.0g HATU、20.5g HOAt，用520ml接肽试剂溶解，加入反应容器，0-5℃反应55分钟。
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干。
十七、制备Fmoc-Lue-Lys(Boc)-Leu-Lue-Leu-Lue-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu -Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加1000ml脱帽试剂，21-23℃反应18分钟，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF各洗涤三次，抽干。
2）取53.0g Fmoc-Leu-OH、57.0g HATU、20.5g HOAt，用520ml接肽试剂溶解，加入反应容器，0-5℃反应55分钟。
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干。
十八、制备Fmoc-Lue-Lue-Lys(Boc)-Leu-Lue-Leu-Lue-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc) -Leu -Leu-Leu- Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加1000ml脱帽试剂，21-23℃反应18分钟，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF各洗涤三次，抽干。
2）取53.0g Fmoc-Leu-OH、57.0g HATU、20.5g HOAt，用520ml接肽试剂溶解，加入反应容器，0-5℃反应55分钟。
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干。
十九、制备Fmoc-Lue-Lue-Lue-Lys(Boc)-Leu-Lue-Leu-Lue-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu- Lys(Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加1000ml脱帽试剂，21-23℃反应18分钟，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF各洗涤三次，抽干。
2）取53.0g Fmoc-Leu-OH、57.0g HATU、20.5g HOAt，用520ml接肽试剂溶解，加入反应容器，0-5℃反应55分钟。
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干。
二十、制备Fmoc-Lue-Lue-Lue-Lue-Lys(Boc)-Leu-Lue-Leu-Lue-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu- Lys(Boc)-Leu -Leu-Leu- Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加1000ml脱帽试剂，21-23℃反应18分钟，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF各洗涤三次，抽干。
2）取53.0g Fmoc-Leu-OH、57.0g HATU、20.5g HOAt，用520ml接肽试剂溶解，加入反应容器，0-5℃反应55分钟。
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干。
二十一、制备Fmoc-Lys(Boc)-Lue-Lue-Lue-Lue-Lys(Boc)-Leu-Lue-Leu-Lue-Lys(Boc)-Leu- Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加1000ml脱帽试剂，21-23℃反应18分钟，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF各洗涤三次，抽干。
2）取70.5g Fmoc-Lys(Boc)-OH、57.0g HATU、20.5g HOAt，用520ml接肽试剂溶解，加入反应容器，0-5℃反应55分钟。
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干。
4）加1000ml脱帽试剂，21-23℃反应18分钟，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF各洗涤三次，甲醇洗涤六次，抽干。
二十二、制备西那普肽粗品
将保护21肽树脂转移至2000ml反应器中，加入事先配制好并预冷至约-10到-7℃的试剂（TFA/TIS=932ml/68ml），13-16℃搅拌65分钟。减压除溶剂至小体积，加入1000ml冷无水乙醚，沉淀，过滤收集沉淀，用无水乙醚洗充分后，真空干燥。得西那普肽粗品84.5g（68.8mmol），收率98.3%。
二十三、分离纯化
将西那普肽粗品溶于8.1%乙酸中，过滤，滤液经C18柱纯化，流动相：0.122Mol/L 磷酸三乙胺/乙腈＝6.9/3.1；流速为870ml/min；制备型HPLC的检测波长为：230nm；用分析型HPLC跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后，减压除去溶剂。再上柱去除磷酸盐，冻干，约得41.2g白色块状物成品（MW：2469.5，33.56mmol），总收率47.9%（以树脂的50mmol计），HPLC测定纯度为：99.6%。
Claims (9)
1.一种西那普肽的多肽合成方法，其特征在于，包括如下步骤：以2-氯-三苯基氯树脂起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH进行缩合反应，获得保护二十一肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团，同步进行脱侧链保护基团；切肽，获得西那普肽粗品；纯化后制得西那普肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述按照固相合成的方法，获得保护二十一肽树脂，包括如下步骤：
一、制备Fmoc-Lys(Boc)-树脂
1）取2-氯-三苯基氯树脂用DMF浸泡，使树脂充分溶胀，加DIPEA，Fmoc-Lys(Boc)-OH，反应，再加甲醇，反应；
2）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
二、制备Fmoc-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应；
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干；
三、制备Fmoc-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应；
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干；
四、制备Fmoc-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应；
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干；
五、制备Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应；
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干；
六、制备Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Lys(Boc)-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，反应；
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
七、制备Fmoc-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应；
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干；
八、制备Fmoc-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应；
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干；
九、制备Fmoc-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应；
3）抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干；
十、制备Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(tBu)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应；
3）抽干，用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
十一、制备Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Lys(Boc)-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应；
3）抽干，用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
十二、制备Fmoc-Lue-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应；
3）抽干，用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
十三、制备Fmoc-Leu-Lue-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc) -树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应；
3）抽干，用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
十四、制备Fmoc-Leu-Lue-Lue-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu -Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应；
3）抽干，用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
十五、制备Fmoc-Leu-Lue-Leu-Lue-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu- Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应；
3）抽干，用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
十六、制备Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lue-Leu-Lue-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu- Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Lys(Boc)-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，反应；
3）抽干，用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
十七、制备Fmoc-Lue-Lys(Boc)Leu-Lue-Leu-Lue-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu -Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应；
3）抽干，用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
十八、制备Fmoc-Lue-Lue-Lys(Boc)Leu-Lue-Leu-Lue-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc) -Leu -Leu-Leu- Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应；
3）抽干，用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
十九、制备Fmoc-Lue-Lue-Lue-Lys(Boc)Leu-Lue-Leu-Lue-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu- Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu- Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应；
3）抽干，用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
二十、制备Fmoc-Lue-Lue-Lue-Lue-Lys(Boc)Leu-Lue-Leu-Lue-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu- Leu-Lys(Boc)-Leu -Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应；
3）抽干，用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
二十一、制备Fmoc-Lys(Boc)-Lue-Lue-Lue-Lue-Lys(Boc)-Leu-Lue-Leu-Lue-Lys(Boc)-Leu- Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂
1）加脱帽试剂，反应，抽干，用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
2）取Fmoc-Lys(Boc)-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，反应；
3）抽干，用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
4）加脱帽试剂，反应，抽干，用DMF、甲醇和DMF洗涤，抽干；
所述接肽试剂为：DIPEA∶DMF=1∶10，体积比；
所述脱帽试剂为：PIP∶DMF=24.5∶75.5，体积比；
所述接肽反应温度为：0-5℃；接肽时间为：55分钟；
所述脱帽反应温度为：21-23℃；脱帽时间18分钟。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述2-氯-三苯基氯树脂取代度为：0.45-0.55mmol/g。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脱去Fmoc-保护基团所用的脱帽试剂为PIP∶DMF=24.5∶75.5，体积比。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述进行缩合反应所用的接肽试剂为DIPEA∶DMF=1∶10，体积比。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述切肽所用的切肽试剂为：TFA/TIS=932ml/68ml。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述切肽包括如下步骤：
将所述保护二十一肽树脂：Fmoc-Lys(Boc)-Lue-Lue-Lue-Lue-Lys(Boc)-Leu-Lue-Leu-Lue-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂加入预冷至-10至-7℃的切肽试剂中，反应，收集切肽后的粗品；
所说的切肽试剂为：TFA/TIS=932ml/68ml；
所说的切肽反应温度为：13-16℃；
所说的切肽反应时间为：65分钟。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纯化具体实现为：将所述二十一肽粗品经C18柱分离纯化、除盐，冻干后，制得西那普肽。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纯化具体实现为：将西那普肽粗品溶于乙酸中，过滤，滤液经C18柱纯化，流速为800-900ml/min；检测波长为：230nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后除盐，除溶剂、冻干，获得成品；所述流动相为：0.122Mol/L 磷酸三乙胺/乙腈＝6.9/3.1。
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