CN103819553A

CN103819553A - 一种使用固相和液相组合技术制备利西拉来的方法

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Publication number: CN103819553A
Application number: CN201310731786.XA
Authority: CN
Inventors: 苏贤斌; 林山; 俞仑
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-12-27
Filing date: 2013-12-27
Publication date: 2014-05-28

Abstract

本发明涉及一种使用固相和液相组合技术制备利西拉来的方法，所述方法包括利用固相化学分别合成1-17，18-29和30-44三个肽中间体片段，然后利用液相化学缩合得到利西拉来。通过本发明路线制备利西拉来，操作步骤简短，后处理简单，副产物少，产率高，污染小，适合大规模的工业化生产。

Description

一种使用固相和液相组合技术制备利西拉来的方法

技术领域

本发明涉及多肽药物合成技术领域，具体涉及一种固相和液相组合技术制备利西拉来的方法。

背景技术

利西拉来(Lixisenatide，商品名Lyxumia，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)是由Zealand Pharma与Sanofi-Aventis公司合作开发的一种1日给药1次的II型糖尿病治疗药物，其结构是基于具有降糖活性的GLP-1类似物Exendin-4的氨基酸序列，去掉其38位的脯氨酸并在C端加上6个赖氨酸而得到的一种新型GLP-1类似物，能耐受体内二肽基肽酶IV(DPP4)的降解作用。体外研究表明，Lixisenatide与GLP-1受体的亲和力大于内源性GLP-1。II型糖尿病模型实验显示，本品可有效改善血糖水平，且对胰腺β细胞具有潜在保护作用。目前该药物在欧盟的上市申请已获得欧洲药品管理局(EMEA)的批准。

在目前市售的GLP-1受体激动剂类抗糖尿病药物中，只有诺和诺德公司(NovoNordisk)开发的Victoza(利拉鲁肽)为每天给药1次的产品。据Jefferies分析员预估，到2018年底，每天仅需给药1次的GLP-1受体激动剂的全球销售量将达到25亿美元，Lyxumia极有希望获得6.5亿美元的全球销售额或抢占GLP-1受体激动剂类药物市场份额的15％。

利西拉来可通过基因重组方法来制备，但基因重组方法存在制备技术复杂、成本高昂、非特异结构多、难以纯化等缺点，不适用于工业化生产。中国发明专利CA102558338A公布了一种常规的全固相合成方法来制备利西拉来。全固相合成操作简单，对于一些片段较短的肽链是一个快捷高效的方法。然而，随着肽链的延长，其中疏水性强的肽段形成β-折叠的可能性很大，固相合成方法往往导致出现困难序列。此外，固相肽合成中还存在肽链与树脂载体之间的分子集聚(aggregation)现象，这都会造成偶联和脱保护效率大大降低。很显然，对于含有44个氨基酸的利西拉来来说，这一合成途径需要重复几十步偶联和脱保护步骤，合成路线冗长，操作工艺繁琐；且随着肽链的延长和可能存在的二级结构的影响，缩合效率越来越差，导致杂质变多且难以分离，目标产物收率极低，成本很高，不适合工业化生产。

使用固相和液相结合的片段缩合技术，适合于合成含有较长氨基酸序列的多肽，其优点在于副产物较少且易于纯化，产物纯度高。然而，片段缩合策略有时会受阻于(i)有增加消旋的危险；(ii)大的保护片段溶解度差；(iii)片段间的低缩合率并伴有副反应发生的危险。为了消除或减少消旋，一般选择Gly或Pro作为片段的C端残基，如果不能实现这一点，则选择Ala或Arg作为C端残基，因为它们不易消旋。在应用片段缩合策略时，对目标序列进行合理的分段可以大大改善结果。除了合理选择C端残基，尽量减少消旋的风险，还应考虑在固相上合成的片段的纯度要高，溶解性要好；参与缩合的片段的C端和N端残基的空间位阻要小，以提高片段间的缩合率。

鉴于利西拉来重要的药学应用价值，有必要提供更有效的利西拉来合成方案，能够克服以上方法的缺陷并适合工业规模的生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种新的利西拉来的制备方法，该方法能够克服现有制备方法的不足与缺陷，并适合工业化生产。

本发明中利西拉来的制备方法，采用的是固相合成片段和片段液相缩合的组合技术。首先利用固相化学在树脂载体上合成利西拉来的3个侧链保护的中间体片段肽：片段a(1-17)，片段b(18-29)，片段c(30-44)，然后在液相中将侧链保护的中间体片段肽缩合，最后脱除氨基端及侧链保护基得到利西拉来。本方法中选择了适宜的3个片段肽，通过常规固相合成法均可以高效率、高产率、高纯度的获得各个片段肽；各个片段肽在液相缩合体系中溶解度高，且参与缩合的片段的C端和N端空间位阻小，缩合产率高，产物易于纯化。

具体而言，本发明提供的利西拉来制备方法，包括以下步骤：

(1)以氨基树脂为载体，按照Fmoc固相合成方法，将具有侧链保护基团的氨基酸从肽链碳端到氮端依次偶联，获得侧链保护的肽中间体片段a(AA₃₀-AA₄₄)的氨基树脂。氨基树脂的实例为：9-Fmoc-氨基呫吨-3-氧基聚苯乙烯树脂[9-Fmoc-Aminoxanthen-3-yloxy-polystyrene(Sieber Amide树脂)]或9-Fmoc-氨基呫吨-3-氧基乙酰甲基树脂(9-Fmoc-Aminoxanthen-3-yloxy-acetamidomethyl Resin)。

(2)以三苯甲基树脂为载体，按照Fmoc固相合成方法，将具有侧链保护基团的氨基酸从肽链碳端到氮端依次偶联，获得侧链保护的肽中间体片段b(AA₁₈-AA₂₉)的三苯甲基树脂。

(3)以三苯甲基树脂为载体，按照Fmoc固相合成方法，将具有侧链保护基团的氨基酸从肽链碳端到氮端依次偶联，获得侧链保护的肽中间体片段c(AA₁-AA₁₇)的三苯甲基树脂。

步骤(2)、(3)中的三苯甲基树脂实例为2-氯-三苯甲基氯树脂(CTC树脂)，氯化三苯甲基树脂，4-甲基氯化三苯甲基树脂或4-甲氧基氯化三苯甲基树脂。片段合成采用常规固相合成肽的方法(SPPS)。例如，步骤(1)-(3)中可以采用在树脂上依肽序逐步偶联保护氨基酸，偶联体系为DIEA与HOBt，HOAt或Cl-HOBt中的任意一个或一个以上的组合与HBTU，HATU，PyBOP或PyAOP中的任意一个或一个以上的组合组成的偶联体系。

(4)将侧链保护的肽中间体片段a、b、c从树脂上裂解下来，在溶液中进行缩合反应，得到侧链保护肽(c-b-a)；

液相缩合的方法可以参考Shumpei Sakakibara的文献Chemical Synthesis of Proteinsin Solution(Biopolymers(Peptide Science)，.1999；51(4)：279-296)，例如所用的溶剂可以为NMP或DMF，偶联体系为DCC与HOBt，HOAt或Cl-HOBt中的任意一个或一个以上的组合，或者DIEA与HOBt，HOAt或Cl-HOBt中的任意一个或一个以上的组合与HBTU，HATU，PyBOP或PyAOP中的任意一个或一个以上的组合组成的缩合体系。

(5)脱除侧链保护肽(c-b-a)的氨基端保护基和侧链保护基，得到利西拉来粗肽；

(6)经纯化后得到利西拉来。

在上述步骤(4)中，片段a、b、c可以通过不同的顺序缩合。例如，可以缩合片段b和片段a，得到片段(b-a)，然后片段(b-a)再与片段c缩合得到侧链保护肽(c-b-a)：也可以先缩合片段c和片段b，得到片段(c-b)，然后再与片段a缩合得到侧链保护肽(c-b-a)。优选的方案是按照从C端到N端的顺序依次缩合。

具体实施方式

本发明包含但不局限于以下实施例。

试剂名称缩写

DMF：N，N-二甲基甲酰胺

NMP：N-甲基吡咯烷酮

DCC：二环己基碳二亚胺

TFA：三氟乙酸

DCM：二氯甲烷

TIS：三异丙基硅烷

DIEA：N，N-二异丙基乙胺

HOBt：1-羟基苯并三唑

HOAt：N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑

Cl-HOBt：6-氯-1-羟基苯并三氮唑

HBTU：苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐

HATU：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯

PyBOP：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷

PyAOP：(3H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基鏻六氟磷酸盐

实施例1：侧链保护的肽中间体片段a的制备

称取5g取代度为0.69mmol/g的Seiber Amide树脂于固相反应器中，加入DCM溶胀20min，随后加入20％哌啶/DMF溶液反应20min脱除Fmoc保护基，分别用DCM、MeOH与DMF洗涤多次，抽干。向固相反应器中加入Fmoc-Lys(Boc)-OH(12mmol)、HOBt(1.62g，12mmol)、DIC(1.9mL，12mmol)、DMF(50mL)，20℃反应1.5h。将树脂洗涤抽干，即得Fmoc-Lys(Boc)-树脂，测得树脂载量为0.55mmol/g。向树脂中加入封闭试剂10mL(醋酸酐(mmol)∶DIPEA(mmol)∶DMF＝I∶1∶8，反应1h，封闭剩余的氨基，分别用DCM、MeOH与DMF洗涤多次，抽干。加入20％哌啶/DMF溶液反应20min脱除Fmoc保护基，分别用DCM、MeOH与DMF洗涤多次，抽干，得H-Lys(Boc)-树脂。

取H-Lys(Boc)-树脂(2.0g)于固相反应器中，加入氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH(4mmol)、HOBt(0.324g，4.8mmol)、DIC(0.38mL，4.8mmol)、DMF(10mL)，30℃反应1h。偶联完成度可以使用Kaiser测试检测。由本领域公知，可选地，偶联试剂可选自HOBt、HOAt、HOOBt或Cl-HOBt中的任意一个或多个与DIC的组合。

检测通过后，用10mL20％PIP/DMF溶液室温反应10min脱除Fmoc保护基，分别用DCM、MeOH与DMF洗涤多次，抽干。

以此方法依次偶联剩余的氨基酸。偶联完成后，用DCM、MeOH与DMF洗涤多次，MeOH收缩抽干，即得侧链保护的肽中间体片段a(AA₃₀-AA₄₄)的Seiber Amide树脂。用2-5％的TFA/DCM溶液分三次把侧链保护的肽中间体片段a从树脂上洗脱下来。浓缩后用乙醚洗涤得白色固体12g。

实施例2：侧链保护的肽中间体片段b的制备

称取5g取代度为0.74mmol/g的CTC树脂于固相反应器中，加入DCM溶胀20min，随后加入20％哌啶/DMF溶液反应20min脱除Fmoc保护基，分别用DCM、MeOH与DMF洗涤多次，抽干。向固相反应器中加入Fmoc-Gly-OH(12mmol)、HOBt(1.62g，12mmol)、DIC(1.9mL，12mmol)、DMF(50mL)，20℃反应1.5h。将树脂洗涤抽干，即得Fmoc-Gly-树脂，测得树脂载量为0.65mmol/g。向树脂中加入封闭试剂10mL(醋酸酐(mmol)∶DIPEA(mmol)∶DMF＝I∶1∶8，反应1h，封闭剩余的氨基，分别用DCM、MeOH与DMF洗涤多次，抽干。加入20％哌啶/DMF溶液反应20min脱除Fmoc保护基，分别用DCM、MeOH与DMF洗涤多次，抽干，得H-Gly-树脂。

取H-Gly-树脂(2.0g)于固相反应器中，加入氨基酸Fmoc-Asn(Trt)-OH(4mmol)、HOBt(0.324g，4.8mmol)、DIC(0.38mL，4.8mmol)、DMF(10mL)，30℃反应1h。偶联完成度可以使用Kaiser测试检测。由本领域公知，可选地，偶联试剂可选自HOBt、HOAt、HOOBt或Cl-HOBt中的任意一个或多个与DIC的组合。

以此方法依次偶联剩余的氨基酸。偶联完成后，用DCM、MeOH与DMF洗涤多次，MeOH收缩抽干，即得侧链保护的肽中间体片段b(AA₁₈-AA₂₉)的CTC树脂。用2％的TFA/DCM溶液分三次把侧链保护的肽中间体片段b从CTC树脂上洗脱下来。浓缩后用乙醚洗涤得白色固体8.4g。

实施例3：侧链保护的肽中间体片段c的制备

称取5g取代度为0.74mmol/g的CTC树脂于固相反应器中，加入DCM溶胀20min，随后加入20％哌啶/DMF溶液反应20min脱除Fmoc保护基，分别用DCM、MeOH与DMF洗涤多次，抽干。向固相反应器中加入Fmoc-Glu(OtBu)-OH(12mmol)、HOBt(1.62g，12mmol)、DIC(1.9mL，12mmol)、DMF(50mL)，20℃反应1.5h。将树脂洗涤抽干，即得Fmoc-Glu(OtBu)-树脂，测得树脂载量为0.65mmol/g。向树脂中加入封闭试剂10mL(醋酸酐(mmol)∶DIPEA(mmol)∶DMF＝1∶1∶8，反应1h，封闭剩余的氨基，分别用DCM、MeOH与DMF洗涤多次，抽干。加入20％哌啶/DMF溶液反应20min脱除Fmoc保护基，分别用DCM、MeOH与DMF洗涤多次，抽干，得H-Glu(OtBu)-树脂。

取H-Glu(OtBu)-CTC树脂(2.0g)于固相反应器中，加入氨基酸Fmoc-Glu(OtBu)-OH(4mmol)、HOBt(0.324g，4.8mmol)、DIC(0.38mL，4.8mmol)、DMF(10mL)，30℃反应1h。偶联完成度可以使用Kaiser测试检测。由本领域公知，可选地，偶联试剂可选自HOBt、HOAt、HOOBt或Cl-HOBt中的任意一个或多个与DIC的组合。

以此方法依次偶联剩余的氨基酸。偶联完成后，用DCM、MeOH与DMF洗涤多次，MeOH收缩抽干，即得侧链保护的肽中间体片段c(AA₁-AA₁₇)的CTC树脂。用2％的TFA/DCM溶液分三次把侧链保护的肽中间体片段c从CTC树脂上洗脱下来。浓缩后用乙醚洗涤得白色固体11.4g。

实施例4：片段(b-a)的制备

将3.12g片段b先在HOBt，DIEA和HBTU的DMF溶液中活化5分钟，然后加入3.31g片段a，进行偶联。反应完全后将混合物倒入冷水中，有沉淀析出，过滤洗涤得白色固体化合物5.83g，产率90.6％。

实施例5：片段(c-b-a)的制备

将3.22g片段(b-a)溶于20％的哌啶的DMF溶液中，待反应完全后将混合物倒入冷水中有沉淀析出，过滤洗涤得白色固体。将1.70g片段c先在HOBt，DIEA和HBTU的DMF溶液中活化5分钟，然后加入白色固体，进行偶联。反应完全后将混合物倒入冷水中，有沉淀析出，过滤洗涤得白色固体化合物4.42g，产率94.6％。

实施例6：利西拉来的制备

将2.10g侧链保护肽(c-b-a)溶解在苯酚(Phenol)∶TIS∶TFA＝2.5∶2.5∶95的体积比配置而成的20mL溶液中。反应2.5h后加入大量冷乙醚，有固体析出，过滤洗涤得利西拉来粗品。将利西拉来粗品用HPLC进行纯化：层析柱：SinoChrom ODS-BP(10um)；10mm×200mm。检测波长：220nm。梯度洗脱：B％：28％-48％(20分钟)，洗脱剂A：0.8％TFA/水，B：0.8‰TFA/乙腈。去除乙腈后冻干得到纯度大于99％的利西拉来1.06g，产率87.9％。

Claims

1.一种利用固相和液相组合技术制备利西拉来的方法，利西拉来的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，

所述方法包括以下步骤：

(1)以氨基树脂为载体，按照Fmoc固相合成方法，将具有侧链保护基团的氨基酸从肽链碳端到氮端依次偶联，获得侧链保护的肽中间体片段a(AA₃₀-AA₄₄)的氨基树脂；

(2)以三苯甲基树脂为载体，按照Fmoc固相合成方法，将具有侧链保护基团的氨基酸从肽链碳端到氮端依次偶联，获得侧链保护的肽中间体片段b(AA₁₈-AA₂₉)的三苯甲基树脂；

(3)以三苯甲基树脂为载体，按照Fmoc固相合成方法，将具有侧链保护基团的氨基酸从肽链碳端到氮端依次偶联，获得侧链保护的肽中间体片段c(AA₁-AA₁₇)的三苯甲基树脂；

(4)将侧链保护的肽中间体片段a、b、c从树脂上切割下来，在溶液中进行缩合反应，得到侧链保护肽(c-b-a)；

(5)脱除侧链保护肽(c-b-a)的侧链保护基和N端组氨酸上的α-氨基的Boc保护基，得到利西拉来粗肽；

(6)纯化后得到利西拉来；

所述具有保护基团的氨基酸中，N端第1位组氨酸的α-氨基的保护基为Boc，其余氨基酸的α-氨基的保护基为Fmoc，赖氨酸与色氨酸的侧链保护基团为Boc，组氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺的侧链保护基团为Trt，天冬氨酸与谷氨酸的侧链保护基团为OtBu，苏氨酸与丝氨酸的侧链保护基团为tBu，精氨酸的侧链保护基团为Pbf。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所用的氨基树脂为9-Fmoc-氨基呫吨-3-氧基聚苯乙烯树脂[9-Fmoc-Aminoxanthen-3-yloxy-polystyrene(Sieber Amide树脂)]或9-Fmoc-氨基呫吨-3-氧基乙酰甲基树脂(9-Fmoc-Aminoxanthen-3-yloxy-acetamidomethyl Resin)，优选Sieber Amide树脂。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)-(3)中所用的三苯甲基树脂为2-氯-三苯甲基氯树脂(CTC树脂)，氯化三苯甲基树脂，4-甲基氯化三苯甲基树脂或4-甲氧基氯化三苯甲基树脂，优选CTC树脂。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)-(3)偶联溶剂为DCM，DMF或NMP中的任意一个或一个以上的组合；偶联体系为HOBt、HOAt、HOOBt或Cl-HOBt中的任意一个或多个与DIC的组合，或为HOBt、HOAt、HOOBt或Cl-HOBt中的任意一个或多个与DPIEA或NMM中的任意一个或两个与HBTU、HATU、PyBOP或PyAOP中的任意一个或多个的组合。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)包括：

(4.1)将片段a从树脂上切割下来，脱除氨基Fmoc保护基；将片段b从树脂上切割下来，二者在溶液中缩合，得到片段(b-a)；

(4.2)脱除片段(b-a)的氨基Fmoc保护基，与从树脂上切割下来的c片段在溶液中缩合，得到侧链保护肽(c-b-a)。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所用的溶剂为NMP或DMF，缩合体系为DCC与HOBt，HOAt或Cl-HOBt中的任意一个或一个以上的组合，或者DIEA与HOBt，HOAt或Cl-HOBt中的任意一个或一个以上的组合与HBTU，HATU，PyBOP或PyAOP中的任意一个或一个以上的组合组成的缩合体系。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中把侧链保护的肽中间体片段a、b、c从树脂上切割下来所用的是含有1％-5％三氟乙酸的DCM溶液。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中脱除侧链保护肽(c-b-a)的侧链保护基和N端组氨酸上的α-氨基的Boc保护基所用的是三氟乙酸、1，2-乙二硫醇、水和三异丙基硅烷的混合溶液，其体积比为(90-95)∶(2-5)∶(2-5)∶(1-5)。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，脱除氨基Fmoc保护基的方法在含有20％哌啶的DMF或NMP的溶液中进行，脱保护反应温度为10-50℃，反应时间为5-60min。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，纯化步骤具体为：将利西拉来溶于乙酸水溶液中，过滤，滤液经C18或C8柱梯度洗脱，流动相为含有0.8‰三氟乙酸的水和乙腈溶液，冻干，即得利西拉来。